NO145176B - Anordning ved vaeskestroemsfotometer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en anordning som kombinerer

to funksjoner i et væskestrømsfotometer

1) å måle lysspredningssignalet fra partiklene som strømmer gjennom fotometeret, for derved å oppnå informasjon om partiklenes størrelse og struktur,

2) å måle den lysintensitet hvormed partiklene belyses,

for derved automatisk å korrigere de fotometriske signaler fra fotometeret for variasjon i denne lysintensitet.

Væskestrømsfotometri er en måleteknikk som finner stadig større anvendelse på en rekke områder innenfor cellebiologi, medisin og fysikalsk-kjemiske målinger av ikke-levende partikler av nær sagt ethvert materiale. I et væskestrømsfotometer måles fotometriske signaler fra enkeltpartikler av mikroskopisk størrelse idet de, båret av en laminær væskestrøm, passerer enkeltvis gjennom et fokus for eksitasjonslys av høy intensitet. Partiklene er sentrert i væskestrømmen ved såkalt hydrodynamisk fokusering. De typer av fotometriske signaler en kan registrere,

er: 1) partiklenes fluorescens, 2) den lysspredning partiklene forårsaker og 3) lysabsorbsjon forårsaket av partiklene. Særlig de to førstnevnte av disse signaltyper har vist seg meget informative.

Som et typisk eksempel på en anvendelse av væskestrømsfotometri

kan nevnes måling av enkeltcellers innhold av forskjellige komponenter som f.eks. DNA eller protein. Cellene farges for dette formål med et fluorescerende fargestoff som binder seg spesifikt og kvantitativt til vedkommende komponent. Hver celle som passerer gjennom fotometrets eksitasjonsfokus, vil dermed gi opphav til en puls av fluorescenslys. Dette lys oppfanges av en dertil egnet optikk og registreres av en lysdetektor.

Signalet fra denne, som er proporsjonalt med cellenes innhold av fargestoff og dermed av vedkommende cellekomponent, måles og lagres etter sin størrelse i en elektronisk hukommelse - en såkalt mangekanals pulshøyde analysator. En kan på denne måten måle flere tusen celler pr. sekund med meget stor nøyaktighet.

Det fremkommer derved et histogram over antall celler som funksjon

av cellenes innhold av vedkommende cellekomponent.

Det eksitasjonslys cellen sprer idet den passerer fotometrets fokus, kan registreres av en annen detektor. Avhengig av spredningsvinkelen gir dette signal informasjon om cellens tverrsnitt eller volum, samt om dens indre struktur og tetthet.

I de fleste typer væskestrømsfotometere frembringes éksitasjons-lyset av en laser. Væskestrømmen som bærer partiklene, passerer gjennom laserstrålen. Partiklenes fluorescens og lysspredning registreres gjennom to adskilte optiske systemer plassert til side for laserstrålen. I visse typer slike væskestrømsfoto-metere foreligger væskestrømmen som en fri stråle (jet) i luft.

I andre går væskestrømmen gjennom et lukket kammer.

Ovennevnte typer væskestrømsfotometere er komplisert oppbygget, hvilket gjør dem meget kostbare og tungvinte i bruk. Vi har nylig patentsøkt en ny type væskestrømsystem (Patentsøknad nr. 791229, 1979), som kan anvendes som en tilsats til et standard fluorescensmikroskop. Utstyrt med en passende lysdetektor omgjøres mikroskopet derved til et væskestrømsfotometer som hva fluorescensdeteksjon angår har vist seg på høyde med de langt mere kostbare laser-baserte instrumenter, samtidig som det er meget enkelt i bruk.

Som beskrevet i ovennevnte patentsøknad, frembringes i dette væskestrømssystem en hydrodynamisk fokusert strøm av partikler i en laminær væskestråle av en dyse. Dysen er plassert slik at væskestrålen faller i skrå vinkel inn på et dekkglass og dermed omformes til en flat laminær strøm som beveger seg langs dekk-glassets overflate. Partiklene vil, fordi de er sentrert i væskestrålen , derved strømme enkeltvis over glasset innenfor en smal sektor. Dekkglasset er slik plassert i forhold til mikroskopets objektiv at partikkelstrømmen på glasset passerer gjennom objektivets fokus, dvs. mikroskopets måleområde.

Mikroskopet har Epi-illuminasjon, dvs. at eksitasjonslyset fokuseres på måleområdet gjennom det samme objektiv som oppfanger fluorescensen. Objektivet er fortrinnsvis av oljeimmersjonstype for å oppnå maksimal numerisk apertur og dermed stor følsomhet. Slik som dette væskastrømsfotometeret er beskrevet i ovennevnte patentsøknad, kan det bare måle partiklers fluorescens. En annen begrensning ved dette instrument er at kilden for eksitasjonslyset er en konvensjonell høytrykk Hg- eller Xe-lampe. Lysintensiteten fra slike lamper kan variere noe, dels fordi lampens lysbue ikke er fullstendig stabil, og dels fordi lysutbyttet fra lampen generelt avtar med lampens brukstid.

Disse variasjoner reduserer målingenes reproduserbarhet.

Den foreliggende oppfinnelse er en anordning ved et mikroskop-basert væskestrømsfotometer som beskrevet ovenfor som 1) muliggjør måling av partixlenes lysspredningsGignal og 2) måler eksitasjonslysets intensitet i fotometrets måleområde og benytter dette signal til å korrigere de øvrige fotometriske signaler, dvs. fluorescens og lysspredning, for variasjoner i denne intensitet.

Den foreliggende oppfinnelses formål er således å utvide det ovennevnte mikroskopbaserte væskestrømsfotometer til også å omfatte måling av partiklers lysspredning, samt å gjøre dette instrumentet uavhengig av variasjoner i intensiteten av eksitasjonslyset. Denne anordning omfatter en modifikasjon av mikroskopets objektiv (1) ved at det er plassert en obskurasjon (2) i objektivets reelle fokalplan. Denne obskurasjon gir

opphav til en konisk formet sektor (3) innenfor belysningsfeltet bak (over) mikroskopets måleområde (13) og med sin<p>oiss i dette som, hvis obskurasjonen er perfekt opak, ikke inneholder eksitasjonslys, men bare fluorescens og spredt lys fra partikler som passerer gjennom måleområdet. Et sekundært objektiv (5) er plassert bak (over) mikroskopets måleområdet og slik at dets lysåpning (6) i sin helhet faller innenfor den koniske, mørke sektor og dermed oppfanger bare fluorescens og spredt lys. Fluorescensen elimineres ved et passende lysfilter (7) i det sekundære objektivets lysvei. Det lys som faller inn på en lysdetektor (8) plassert bak dette filteret, vil derfor bare være spredt lys fra partiklene.

Ved den foreliggende anordning er nevnte obskurasjon ikke fullstendig opak, men har en meget svak lystransmisjon. Ved dette oppnås at ovennevnte mørke, koniske sektor kommer til å inneholde en meget svak komponent av direkte eksitasjonslys som også faller inn på lysdetektoren (8).

Variasjoner i eksitasjonslysets intensitet forårsakes blant annet

av at lysbuen i eksitasjonslyskilden flakker, dvs. forandrer posisjon. Fordi lysbuen er avbildet i mikroskopets objektplan, vil disse variasjoner ikke være de samme over hele dette planet. I billed-planet for det sekundære objektiv er det derfor plassert en still-

bar lysåpning (9) hvormed det lysfelt som detekteres av detektoren (8) begrenses til den del av objektplanet der partiklenes fluorescens og lysspredning måles.

Partiklenes fluorescens oppfanges av objektivet (1) som har en lysdetektor, fortrinnsvis i form av et fotomultiplikatorrør,

nær sitt billedplan. #Fluorescenslyspulsene omformes derved til elektriske spenningspulser som ledes til pulsforsterkeren (10).

Det lys som spredes av partiklene foreligger som korte pulser, mens det direkte eksitasjonslyset bare varierer relativt langsomt med tiden. Signalet fra lysdetektoren (8) bak det sekundære objektiv vil derfor inneholde to komponenter: 1) en AC-komponent i form av korte pulser som representerer partiklenes lysspredning, og 2) en DC-komponent som representerer intensiteten av det direkte eksitasjons- • lys. For å adskille disse to komponenter brukes en forsterker (12) med to separate utganger: en AC-koplet utgang (16) med en tidskonstant som tilsvarer pulslengden i AC-komnonenten,

dvs. 1 visec, og en DC-koplet utgang (15) med en tidskonstant som er meget større enn dette, dvs. ca. 1 msec.

Signalet fra forsterkerutgangen (15) som representerer den nevnte DC-komponent, er ført som en styrespenning til pulsforsterkerne for fluorescens (10) og lysspredning (11). Disse forsterkere er slik innrettet at forsterkningsgraden er omvendt proporsjonal med denne styrespenning. Da de pulser som kommer inn til disse forsterkere,

og som representerer henholdsvis partiklenes fluorescens og lysspredning, er proporsjonale med intensiteten av eksitasjonslyset og derfor med nevnte styrespenning, vil pulsene som kommer ut fra forsterkerne være uavhengige av denne lysintensiteten, hvilket er den ene av foreliggende oppfinnelses hensikter.

Claims (1)

1) Anordning ved væskestrømsfotometer for måling av fluorescens og for måling av det lys som spredes av de partikler som passerer gjennom fotometrets måleområde, samt for måling av intensiteten av eksitasjonslyset i dette måleområdet og korreksjon av de fotometriske signaler for variasjoner i denne intensitet, for benyttelse i forbindelse med et generelt utformet mikroskop,karakterisert vedat den omfatter a) et objektiv (1) som fokuserer eksitasjonslyset i fotometrets måleområde hvorigjennom strømmer partikler, samt oppfanger fluorescens-lyset fra disse, modifisert ved en semitransparent obskurasjon (2) plassert i objektivets reelle fokalplan, b) et sekundært objektiv (5) plassert med sitt objektplan i fotometrets måleområde og med sin lysåpning (6) i sin helhet innenfor den sektor (3) av belysningsfeltet som skyldes obskurasjonen (2), c) et fi].ter (7) i det sekundære objektivets lysvei som absorberer fluorescens fra partiklene, d) en stillbar lysåpning (9) i det sekundære objektivets billedplan som avgrenser dette objektivets billedfelt til den del av objektplanet der partiklenes fluorescens og lysspredning måles, e) en lysdetektor (8) som måler lysintensiteten innenfor dette billedfelt, f) en elektronisk forsterker (12) med separate utganger for henholdsvis en langsomt varierende (DC) komponent (15), proporsjonal med intensiteten av eksitasjonslyset, og en pulset (AC) komponent (16) som skyldes det spredte lyset fra partiklene, av signalet fra detektoren (8), g) elektroniske pulsforsterkere (10) og (11) for henholdsvis fluorescens- og lysspredningssignal, som begge styres av signalet (15) fra forsterkeren (12) på en slik måte at forsterkningen er omvendt proporsjonal med størrelsen av dette signal.