JP2018031798A - 生物学的サンプルの画像分析および測定 - Google Patents

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パンガルカール チンメイ
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Abstract

【課題】生物学的サンプルの光学的および画像分析および／または測定にとり有用である方法、機器、システム、および装置を提供すること。【解決手段】生物学的サンプルの測定の画像の分析のための方法、機器、システム、および装置が提供される。本明細書において開示される実施形態は、光学的試験、光学的測定、およ他の試験および測定のための、生物学的サンプルを含むサンプルを保持するために適したサンプルホルダーを含む。実施形態では、光学的に透過性部分および前記サンプルホルダー内で光の内部反射を提供するために構成された部分を有するサンプルホルダー提供される。実施形態では、内部反射は、光の部分内部反射および全体的内部反射を含み得る。【選択図】なし

Description

被験者からの生物学的サンプルの分析は、その被験者の健康関連の診断、監視、および／または治療にとって重要である。さまざまな方法が、生物学的サンプルの分析について知られている。しかしながら、被験者の診断、監視、および／または治療を提供するためには、生物学的サンプルの分析における改良が望まれる。
［参照による組み入れ］
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも、それぞれの刊行物、特許、および特許出願が、参照により組み込まれるために、具体的に、および個別に指示されるのと同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書において記載される方法、機器、システム、および装置は、生物学的サンプルの光学的および画像分析および／または測定にとり有用である。
本明細書において開示される実施形態は、光学的試験、光学的測定、およ他の試験および測定のための、生物学的サンプルを含むサンプルを保持するために適したサンプルホルダーを含む。実施形態では、光学的に透過性部分および前記サンプルホルダー内で光の内部反射を提供するために構成された部分を有するサンプルホルダー提供される。実施形態では、内部反射は、光の部分内部反射および全体的内部反射を含み得る。外部の光源から、およびサンプルホルダーの一側面から向かわされた入射光は、サンプルホルダー内のサンプルを複数の方向から照射するために効果的である。実施形態では、サンプルホルダーの外部で、一側面に配置された光源は、サンプルホルダー内のサンプルの落射照明を提供することができ；サンプルホルダー内のサンプルの徹照を提供することができ；および／またはサンプルホルダー内のサンプルの落射照明および徹照の両方を提供できる。
本明細書において開示される実施形態は、サンプルを保持するために適切なサンプルホルダーを含むシステムを含む。そのようなシステムは、例えば、光学的試験、光学的測定、および他の試験および測定を含む、生物学的サンプルを含むサンプルの試験および測定における使用において適切である。実施形態では、本明細書において開示されるシステムは、光学的に透過性部分およびサンプルホルダー内で光の内部反射を提供するために構成された部分を有するサンプルホルダーを含む。実施形態では、本明細書において開示されるシステムのサンプルホルダー内の内部反射は、光の部分内部反射を含むことができ、および全内部反射を含み得る。本明細書において開示されるシステムは、光源を含み得る。サンプルホルダーの外部の光源から、およびサンプルホルダーの一側面から向かわされた入射光は、サンプルホルダー内のサンプルを複数の方向から照射するために効果的である。実施形態では、サンプルホルダーの外部で、および一側面に配置された光源は、サンプルホルダー内のサンプルの落射照明を提供することができ；サンプルホルダー内のサンプルの徹照を提供することができ；および／またはサンプルホルダー内のサンプルの落射照明および徹照の両方を提供できる。本明細書において開示されるシステムは、検出器を含み得る；そのような検出器は、光学的検出器を含むことができ、および他の検出器を含み得る。そのような検出器は、サンプルホルダー内の、サンプルおよび被写体の測定、ならびにサンプルおよびサンプル中の被写体の特性に対して適切であり、ならびにそれらを行うために構成され；そのような測定定性的測定および定量的測定を含み得る。本明細書において開示されるシステムの実施形態は、フィルター、開口部、格子、レンズ、および他の光学的要素を含み得る。本明細書において開示されるシステムの実施形態は、本明細書で開示されるサンプルホルダー、光源、レンズ、フィルター、または他のシステムの要素または構成要素の位置付け、移動および調整のための機械的装置を含み得る。本明細書において開示されるシステムの実施形態は、サンプルの移転、等分、保持、加熱、混合、染色、調節、またはさもなければ調製、操作または変換のための構成要素および要素を含み得る。本明細書において開示されるシステムの実施形態は、サンプルホルダーの輸送、確保、装填、またはさもなければ操作のための構成要素および要素を含み得る。本明細書において開示されるシステムの実施形態は、サンプルの物理的操作および処理、ならびにサンプルホルダーの物理的操作のための構成要素および要素を含むことができ、そのような構成要素および要素は、制限なく、サンプル、サンプルまたはその一部分と使用するための、サンプルホルダー、ピペットチップ、容器、および試薬の移動および操作のためのピペット、ポンプ、遠心分離機、および他の機械的装置を含み得る。本明細書において開示されるシステムの実施形態は、サンプルまたはその一部分の核酸分析、タンパク質分析、一般化学分析、電気化学的分析、および他の分析を含む化学的分析のための構成要素および要素を含み得る。
臨床検査室、研究実験室、診療所、病院、医師の診察室、ポイント・オブ・サービス配置、および任意の他の適切な場所を含む任意の位置で、サンプルホルダーおよび本明細書において開示されるシステムは、使用されることができ、および本明細書において開示される方法が遂行され得る。本明細書において開示されるサンプルホルダーにより保持されるサンプル、および本明細書において開示されるシステムおよび方法を用いて試験されるサンプルは、任意の生物学的サンプルを含み、および少量の生物学的サンプルであり得る。実施形態では、サンプルは、少量の血液または尿サンプルであることができ、および約２５０μＬ未満、または約１５０μＬ未満、または約１００μＬ未満、または約５０μＬ未満、または約２５μＬ未満、または約１５μＬ未満、または指先穿刺から得られた血液の量以下の容積を有し得る。
一実施形態では、サンプル中の細胞集団の細胞の目的の構成要素の測定のための、以下のことを含む方法が提供される：ａ）前記サンプル中の細胞集団の細胞に存在するマーカーの定量的測定を得ること；ｂ）パートａ）の測定に基づき、コンピューターの支援の下に、前記サンプル中に存在する細胞集団中の細胞のおおむねの量を決定すること；ｃ）パートｂ）の結果に基づき、サンプルに加えるべき試薬の量を選択すること、この試薬は、前記細胞集団中の細胞の目的の構成要素に特異的に結合し、および容易に検出可能なように構成され；ｄ）パートｃ）の結果に基づき、選択された量の試薬をサンプルに加えること；ｅ）サンプル中で、前記目的の構成要素に結合した試薬のためにサンプル中の細胞を検定すること；およびｆ）前記目的の構成要素に結合した試薬の量に基づき、前記サンプル中の細胞集団の細胞中の目的の構成要素の量を決定すること。前記方法の一実施形態では、パートｃ）の試薬は抗体である。
出願人は、本明細書において、更に、サンプル中の細胞集団の細胞中の目的の構成要素の測定のための、以下のことを含む方法を開示する：ａ）前記サンプル中の細胞集団の細胞中に存在するマーカー、または細胞の性質の定量的測定を得ること；ｂ）パートａ）の測定に基づき、コンピューターの支援の下に、前記サンプル中に存在する細胞集団中の細胞のおおむねの量を決定すること；ｃ）細胞マーカーの量をサンプルに加えること、添加される前記細胞マーカーの量はパートｂ）の結果に基づき、および前記細胞マーカーは、細胞集団中の細胞中の目的の構成要素に特異的に結合し、および容易に検出可能なように構成され；ｄ）目的の構成要素に結合したマーカーのために細胞を検定すること；およびｅ）前記目的の構成要素に結合したマーカーの量に基づき、前記サンプル中の細胞集団の細胞中の目的の構成要素の量を決定すること。
別の実施形態では、以下のことを含む、顕微鏡の焦点を合わせる方法が提供される：ａ）サンプルおよび参照粒子を含む混合物を生成するために、顕微鏡的分析のための被写体を含むサンプルを、既知のサイズを有する参照粒子と混合すること；ｂ）ステップａ）の混合物を顕微鏡の光路中に位置付けること；ｃ）ステップａ）の混合物を参照粒子を可視化するために構成された光線に曝露すること；およびｄ）混合物中の参照粒子の位置に基づき、または参照粒子の画像の鮮明さに基づき顕微鏡の焦点を合わせること。
本明細書の更に別の実施形態では、複数の細胞を含むサンプル中の細胞を同定するための、以下のことを含む方法が提供される：ａ）複数の細胞中の細胞を、少なくとも以下の１つについて検定する：（ｉ）細胞表面抗原の存在；（ｉｉ）細胞表面抗原の量；または（ｉｉｉ）細胞のサイズ；ｂ）ａ）の細胞を以下の少なくとも１つについて検定すること：（ｉ）核のサイズ；または（ｉｉ）核の形状；およびｃ）ａ）およびｂ）の細胞を定量的細胞光散乱について検定すること、ステップａ）、ｂ）およびｃ）からの情報の組み合わせが、複数の細胞を含むサンプル中の細胞の同定に用いられる。
更に別の実施形態では、本明細書で提供されるものは、試験されるサンプルを保持するサンプルホルダーとともに用いられる検出器組立品を含むシステムである。１つの制限しない実施例では、このサンプルホルダーは、キュベットが係合され、１つの位置から検出器組立品まで移動されることを可能にする、特性および／または物質をその中に持つキュベットである。いくつかの実施形態では、前記検出器組立品は、検出器組立品からサンプルホルダー中のサンプルまでの光路において、２つの間のインターフェースが光学的干渉を起こさない様式で、サンプルホルダーの表面と係合するために構成された第一の表面を有する。一実施形態では、１つ以上のサンプルホルダーのために２つ以上の位置が検出器組立品上にあり得る。いくつかの実施形態同じサンプルホルダーを場所のそれぞれに有し得る。随意的に、いくつかの実施形態は、検出器組立品に付随する少なくともいくつかの位置のために異なるサンプルホルダーを有し得る。
本明細書に記載される一実施形態では、それが前記検出器組立品による分析のためのサンプルを保持することを可能にする一方で、それを前記検出器組立品からは物理的に別個に保ち直接的に接触しないために保つ、光学的性質、寸法、物質、および／または物理的特性を持つ、限定はされないが、キュベットなどのサンプルホルダーが提供される。これは、形状付けされた部材をその中に含むサンプルの流体に対して特に有用であり得る。
本明細書に記載される一実施形態では、前記検出器組立品は、サンプル中の細胞の形状、および物理的、光学的、および生化学的性質を、すべて同一機器内で、検出、取得または測定するために構成された多重チャネル顕微鏡ユニットであり得る。それは定量的情報、および記述的情報の両方を提供し得る。前記検出器組立品の１つの実施形態は、同じ色彩または波長の複数のマーカーを用いることができ、前記検出器組立品は、サンプル（例えば、サンプル中の細胞に結合した）中の、そのようなマーカー起源の信号をデコンボリュート（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ：畳み込みからもとの関数を求めること）ために構成され、スペクトル・チャネル数および前記組立品中に要求される光源の数の低下を可能にする。
本明細書のいくつかの実施形態は、限定はされないがキュベットなどのサンプルホルダーを含むことができ、このキュベットの材料の形状中に暗視野照明を増加させる物理的特性を持ち、いくつかの特性は、光反射（限定はされないが、キュベット内の光の反射率を含む）を提供するために構成され、およびいくつかの特性は、随意的に、機械的支持のために構成され；実施形態では、いくつかの特性は機械的支持および光反射率も提供し得ることを理解されたい。実施形態では、サンプルホルダーは、前記サンプルホルダー内の光の反射によるサンプルの徹照を提供するために構成される。実施形態では、サンプルホルダーは、前記サンプルホルダー内の光の反射によるサンプルの徹照を提供するために構成され；そのような反射率は、部分内部反射（ＰＩＲ）を含むことができ、およびそのような反射率は、全内部反射（ＴＩＲ）。実施形態では、サンプルホルダーは、前記サンプルホルダー内の光の反射によるサンプルの徹照を提供するために構成され、前記反射光源は、光の検出または測定に用いられる光学と、サンプルホルダーの同じ側に配設される（すなわち、前記光源は落射照明光源である）。
本明細書のシステムは、暗視野画像化において、落射（直接）照明および徹照（反射された）の両方を同時に用い得る。これは、両方のタイプの照明ではなく、および単一源または単一方向または位置からの両方のタイプの照明ではなく、落射照明、または徹照のいずれかを使用する従来の暗視野画像化とは異なる。従って、落射照明と同じ光源から徹照が由来する、本明細書において開示される落射および徹照の組み合わせは、既知のシステムとは異なる。随意的に、キュベットなどの形状付けされたサンプルホルダーの使用は、徹照を提供するために用いられ得る。実施形態では、形状付けされたサンプルホルダーは、光の反射による徹照を提供するために構成される。実施形態では、形状付けされたサンプルホルダーは、サンプルホルダー内の光の反射による徹照を提供するために構成される。実施形態では、形状付けされたサンプルホルダーの１つ以上のサイズ、形状、表面、物質、または他の特性は、形状付けされたサンプルホルダー内部の光の内部反射を提供するために効果的である。実施形態では、形状付けされたサンプルホルダーの１つ以上のサイズ、形状、表面、物質、または他の特性は、形状付けされたサンプルホルダー内部の光の部分内部反射（ＰＩＲ）を提供するために効果的である。実施形態では、形状付けされたサンプルホルダーの１つ以上のサイズ、形状、表面、物質、または他の特性は、形状付けされたサンプルホルダー内部の光の全内部反射（ＴＩＲ）を提供するために有効である。随意的に、徹照の強度は無視できない。実施形態では、形状付けされたサンプルホルダーは、徹照光強度を増大するために有効である反射面を含み得る。Ｔｈｅ暗視野光源は、所望の照明および／または励起波長を提供し得る、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー、または他の照明源であり得る。
一実施形態では、顕微鏡対物レンズおよび、限定はされないがリングライト（暗視野顕微鏡について）などの光源の組み合わせの間は、小型のサイズの前記検出器組立品を可能にする物理的距離にある。一実施形態では、所望の波長の、または所望の波長範囲の光だけがサンプルに向けられる。一実施形態では、前記光は非偏光である。別の実施形態では、前記光は偏光である。
更に別の実施形態では、サンプル調製フェーズから、および／または分析フェーズからの、いずれかからの血球計算検定からの情報が、二次的手順を導きおよび／または引き起こす。実施形態では、そのような二次的手順は、直接人間による検閲のための警報を提供するためのものであり得る。実施形態では、そのような二次的手順は、検定の遂行を導くために、サンプル調製ステップの手順の間に得られた見積もられた細胞計数または他の情報を用いるものであり得て、そのような検定は、前記手順の後のステップにおける検定、または別の手順での検定であり得る。
細胞を計数するための技法は、不揃いの形状および／またはチャンバー表面を持つサンプルホルダーを取り扱うための方法も提供し得る。１つの方法は：ａ）分析領域中にサンプルを導入するための、サンプルホルダー中のチャネルなどの容積測定チャネル（ｖｏｌｕｍｅ−ｍｅｔｅｒｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌ）技法の使用を含む。この方法は、サンプルホルダー中の全ての細胞の計数を含み得る。サンプル容積が知られているので、容積中の細胞の濃度もわかる（このことは、そのような表面を持つチャンバーを持つ疎水性コンテナ、キュベットまたはサンプルホルダー中で遂行され得る）。別の方法は、：ｂ）サンプルを既知の量のビーズと混合するための、比率に基づく計量技法であり、この方法は、観察されたビーズの数に基づいてサンプル中の細胞の濃度を計算するために用いられる。
本明細書に記載される更に別の実施形態では、限定はされないが、赤血球（ＲＢＣ）が実質的に球状形状をとることを引き起こし、および暗視野顕微鏡を用いてＲＢＣ容積を測定することによる血液サンプル中の（ＲＢＣ）容積の測定などの、形成された血液構成要素の測定を含む方法が提供される。
本明細書に記載される更に別の実施形態では、血小板容積を測定することを含む方法が提供される。この法は、血小板を蛍光性色素で標識すること、および観察された血小板のサイズを測定すること；既知のサイズのビーズをサンプルに加えること；ならびにサンプル中の血小板のサイズおよび血小板の容積を決定するために、ビーズをキャリブレーションとして用い、観察されたビーズの画像のサイズを観察された血小板の画像と比較することを含み得る。
本明細書に記載される更なる実施形態では、サンプル中の、細胞形態学；細胞数の測定；粒子の検出；粒子数の測定；結晶の検出；結晶数の測定；細胞凝集の検出；細胞凝集数の測定；および他のサンプルまたはサンプル中の性質および量を検出または測定する方法が提供される。
従って、出願人は本明細書において：
サンプルを分析するためのシステムであって、前記システムは：前記サンプルを保持するために構成されたサンプル・チャンバーを含むサンプルホルダーであって、少なくとも前記サンプルホルダーの一部分は、光学的に透過性の物質を含み、前記光学的に透過性の物質は、光学的に透過性の表面および反射面を含み；ならびに前記光学的に透過性の表面を照明し、および通過する光を提供するために構成される照明源を含むサンプルホルダーを含み；前記サンプルホルダーは、前記照明源からの光が同時に前記サンプルホルダー中のサンプルに、落射照明および徹照の両方を提供するために効果的に構成され、落射照明は、前記サンプルホルダーの光学的に透過性の物質表面で反射することなく、前記照明源から前記サンプルまで、移動する光を含み、および徹照は、前記光学的に透過性の物質の少なくとも１つの表面からの、少なくとも１回反射の後に、光学的に透過性物質内を移動し、サンプルまで移動する光を含む。実施形態では、本明細書において開示される特性を有するシステムのサンプルホルダーは、サンプルを保持するために構成された長いチャネルを有するキュベットを含み得る。実施形態では、前記サンプルホルダーは、１つ以上の光学的に非透過性の表面を有し得る。
本明細書において開示されるシステムの実施形態では、前記徹照は、少なくとも部分的には、表面での光の内部反射により提供されることができ、および少なくとも部分的には、キュベット内の光の全内部反射により提供されることができる。本明細書において開示されるシステムの実施形態では、前記徹照は、少なくとも部分的には、表面での光の部分内部反射により提供されることができ、および少なくとも部分的には、キュベット内の光の部分内部反射により提供されることができる。
実施形態では、サンプルホルダーは、サンプルを保持するための２つ以上のサンプル・チャンバーを有し得る。サンプルホルダー、例えば、本明細書において開示される特性を有するキュベットは、四角形の水平断面形状；円形の水平断面形状；鋸歯上の垂直断面形状；階段形状の垂直断面形状；または別の形状を有し得る。
実施形態では、サンプルホルダーは照明源に対して移動可能であることができ、および複数の位置へ移動可能であることができ、サンプルホルダーの光学的に透過性の表面は、それぞれの位置において照明源により照明され得る。
実施形態では、照明源はリングライトを含み得る。実施形態では、リングライトは、発光ダイオード（ＬＥＤ）に基づくリングライトおよびレーザーに基づくリングライトから選択され得る。
実施形態では、本明細書において開示されるシステムは、サンプルホルダーの光学的に透過性の表面と係合するために形状付けされた光学的に透過性の表面を有する支持構造を含み得る。
実施形態では、本明細書において開示されるシステムは、照明源による照明のために、所望の位置にサンプルホルダーを維持するために構成された圧縮機器を含み得る。
実施形態では、本明細書において開示されるシステムは、サンプルホルダー中のチャネルの少なくとも一部分を撮像するために構成された検出器を含み得る。
実施形態では、本明細書において開示されるサンプルホルダーは、少なくともサンプルの一部分を収容するために構成された細長いチャネルを含むことができ、および検出器は、サンプルホルダー中の細長いチャネル全体を撮像するために構成される。
実施形態では、本明細書において開示されるサンプルホルダーは、画像化の間に、サンプルを静的な流動しない様式で保持するために構成され；実施形態では、サンプルホルダーは、サンプルの一部分を静的な流動しない様式で保持し、および別の部分を、流動する様式で保持するために構成され得る。
実施形態では、本明細書において開示される照明源は、サンプルホルダーに対して移動可能であり得る。
実施形態では、本明細書において開示されるサンプルホルダーは、画像化の間、サンプルを流動しない様式で保持するために構成され得る。
実施形態では、本明細書において開示されるサンプルホルダーはサンプルホルダー中に完全に閉じ込められた流体回路を含むことができ、および前記サンプルは、前記サンプルが前記検出器から分離されるために効果的な、前記流体回路中に配置される。
実施形態では、本明細書において開示されるサンプルホルダーは、前記検出器に対して移動可能である。実施形態では、本明細書において開示される検出器は、サンプルホルダーに対して移動可能である。
実施形態では、本明細書において開示されるサンプルホルダーおよび照明源は、光学的分析ユニットの少なくとも一部分を含み、およびこのシステムは、サンプルの臨床分析を遂行するために構成された臨床分析ユニットを更に含む。
実施形態では、本明細書において開示されるシステムは、臨床分析ユニットおよび光学的分析ユニットがサンプルの一部分の光学的分析および臨床分析を同時に遂行し得ることで効果的であるために、光学的分析ユニットおよび臨床分析ユニットに、サンプルの等分を提供するために構成される。実施形態では、そのような臨床分析は、一般化学的分析、核酸分析、および酵素連結結合分析から選択され得る。
実施形態では、本明細書において開示されるシステムは、複数の臨床分析ユニットを含むことができ、それぞれの、そのような臨床分析ユニットは、一般化学的分析、核酸分析、および酵素連結結合分析から選ばれる臨床分析を提供するために構成される。
出願人は、サンプルを保持するために構成されたサンプル・チャンバーを含むキュベットを更に提供し、少なくとも前記キュベットの一部分は、光学的に透過性の物質を含み、前記光学的に透過性の物質は、光学的に透過性の表面および反射面を含み、前記光学的に透過性の表面および前記反射面は、光学的に透過性の表面を通過する光が、同時に落射照明および徹照を前記サンプル・チャンバー中のサンプルに提供するために効果的であるために構成され、落射照明は、前記サンプルホルダーの光学的に透過性の物質表面で反射することなく、前記照明源から前記サンプルまで、移動する光を含み、および徹照は、前記光学的に透過性の物質の少なくとも１つの表面からの、少なくとも１回の反射の後に、光学的に透過性物質内を移動し、サンプルまで移動する光を含む。
実施形態では、本明細書において開示されるキュベットは、細長いチャネルを含むサンプル・チャンバーを有する。実施形態では、本明細書において開示されるキュベットは、サンプルを保持するための２つ以上のサンプル・チャンバーを含む。
実施形態では、本明細書において開示されるキュベットは１つ以上の光学的に非透過性の表面を含む。
実施形態では、少なくとも部分的にキュベット中の光の内部反射による徹照が、本明細書で開示されるキュベット中に提供されることができる。実施形態では、少なくとも部分的にキュベットの表面での光の部分内部反射による徹照が、本明細書で開示されるキュベット中に提供されることができる。実施形態では、少なくとも部分的にキュベットの表面での光の全内部反射による徹照が、本明細書で開示されるキュベット中に提供されることができる。
実施形態では、本明細書において開示されるキュベットは、四角形の水平断面形状を有し得る；実施形態では、本明細書において開示されるキュベットは、円形の水平断面形状を有し得る。実施形態では、本明細書において開示されるキュベットは、鋸歯上の垂直断面形状を有し得る；実施形態では、本明細書において開示されるキュベットは、階段状に形状付けされた垂直断面形状を有し得る。
出願人は、本明細書において方法を開示する。例えば、出願人は、本明細書において、複数の細胞を含むサンプル中の細胞を同定する、以下のことを含む方法を開示する：（ａ）サンプルを、サンプルを保持するために構成された、サンプル・チャンバーを含むサンプルホルダー中に配置すること、少なくとも前記サンプルホルダーの一部分は、光学的に透過性の物質を含み、前記光学的に透過性の物質は、光学的に透過性の表面および反射面を含み；前記光学的に透過性の表面および反射面は、前記光学的に透過性の表面を通過する光が、同時に前記サンプル・チャンバー中のサンプルに、落射照明および徹照の両方を提供するために効果的に構成され、落射照明は、前記サンプルホルダーの光学的に透過性の物質表面で反射することなく、前記照明源から前記サンプルまで、移動する光を含み、および徹照は、前記光学的に透過性の物質の少なくとも１つの表面からの、少なくとも１回反射の後に、光学的に透過性物質内を移動し、サンプルまで移動する光を含み；（ｂ）サンプルの落射照明および徹照の両方を同時に提供するために効果的な前記サンプルホルダーを照射すること；および（ｃ）サンプル中の細胞を同定すること。実施形態では、本明細書において開示される方法は、前記同定することが、前記サンプル・チャンバーの少なくとも一部分を、撮像するために構成された検出器により、前記細胞を同定することを含む方法を含む。本明細書において開示される実施形態では、そのような方法において使用するためのサンプル・チャンバーは、細長いチャネルを含み得る。
出願人は更に本明細書において、以下のことを含む顕微鏡の焦点を合わせる方法を開示する：ａ）サンプルおよび参照粒子を含む混合物を生成するために、顕微鏡的分析のための被写体を含むサンプルを、サンプルおよび参照粒子を含む混合物を生成するために効果的な、既知のサイズを有する参照粒子と混合すること；ｂ）ステップａ）の混合物を顕微鏡の光路中に位置付けること；ｃ）ステップａ）の混合物を参照粒子を可視化するために構成された光線に曝露すること；およびｄ）混合物中の参照粒子の位置に基づき、または参照粒子の画像の鮮明さに基づき顕微鏡の焦点を合わせること。
出願人は更に本明細書において、以下のことを含む複数の細胞を含むサンプル中の細胞を同定する方法を開示する：ａ）複数の細胞中の細胞を、少なくとも以下の１つについて検定する：（ｉ）細胞表面抗原の存在；（ｉｉ）細胞表面抗原の量；または（ｉｉｉ）細胞のサイズ；ｂ）ａ）の細胞を以下の少なくとも１つについて検定すること：（ｉ）核のサイズ；または（ｉｉ）核の形状；およびｃ）ａ）およびｂ）の細胞を定量的細胞光散乱について検定すること、ステップａ）、ｂ）およびｃ）からの情報の組み合わせが、複数の細胞を含むサンプル中の細胞の同定に用いられる。
本明細書に記載される少なくとも１つの実施形態では、サンプルの画像化のためのシステムが提供され、このシステムは：サンプルを含むサンプル容器、光学的に透明な表面を持つサンプル容器の受器を有するステージ；サンプル中に形成された構成要素をステージを通過して照明するための光源を含み、サンプル容器は、サンプル容器受器の光学的に透明な表面と係合するために構成されたインターフェース表面を有し、それにより、前記インターフェース表面は、インターフェース表面を通過する光の顕著な収差なしで、光学的に透明な表面に一致する。
本明細書における実施形態は、１つ以上の以下の特性を含むために構成され得ることを理解されたい。例えば、前記サンプル容器のインターフェース表面は、ポリマー物質から形成され得る。随意的に、これは透明な物質であり得る。随意的に、前記サンプル容器のインターフェース表面は、サンプル容器の受器の光学的に透明な表面を形成するために用いられる物質よりも、柔らかな物質から形成される。随意的に、圧縮ユニットが、インターフェース表面を、サンプル容器受器の光学的に透明な表面に一致するために構成される形状に、一致させるために加圧するために提供される。随意的に、ステージへ、およびステージからサンプル容器の輸送を促進するために、およびサンプル容器の機械的剛性を増加させるために取扱いユニットが、サンプル容器に連結されるために構成され得る。随意的に、この取扱いユニットは、サンプル容器に連結されるために構成された光学的に不透明なユニットであり得る。随意的に、前記取扱いユニットは、ロボット・マニピュレーター、ピペットユニット、または他の機械的運送器との係合を促進するために物理的特徴、突起などを持つために形成され得る。随意的に、前記取扱いユニットは、係合および／または脱係合を促進するために、磁性、電磁性、または他の特性を持つために形成され得る。随意的に、サンプルの全ての画像化は、光が１つの表面を通過し、および検出器に対向する表面から外に出る、実質的な直線を通過することなく行われ得る。随意的に、前記光源は、サンプル容器の反対側の検出器へ、光を送達するために、サンプル容器の一側面上には配置されない。
本開示中の実施形態は、本開示中に記載された１つ以上の特性を有するために適合され得ることを理解されたい。
この要旨は、以下の「発明の詳細な説明」で更に記載される、概念の選択を、単純化された形態での紹介するために提供されている。この要旨は、請求される対象の、主要な特性または本質的特性を特定することを意図していないし、請求される対象の範囲を限定することも意図していない。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
サンプルを分析するためのシステムであって、このシステムは：
前記サンプルを保持するために構成されたサンプル・チャンバーを含むサンプルホルダーであって、前記サンプルホルダーの少なくとも一部分が光学的に透過性の物質を含み、前記光学的に透過性の物質は光学的に透過性の表面および反射面を含むサンプルホルダー；および
前記光学的に透過性の表面を照射し、及び透過する光を提供するために構成される照明源を含み；
前記サンプルホルダーは、前記照明源からの光が、同時に落射照明および徹照の両方を、サンプルホルダー中のサンプルに提供するために効果的であるために構成され、落射照明は、前記サンプルホルダーの光学的に透過性の物質の表面において反射することなく、前記照明源から前記サンプルに移動する光を含み、および徹照は、少なくとも１つの前記光学的に透過性の物質の表面からの、少なくとも１回の反射に続いて、光学的に透過性の物質内をサンプルまで移動する光を含む、システム。
（項目２）
前記サンプルホルダーが、サンプルを保持するために構成された細長いチャネルを有するキュベットを含む、項目１に記載のシステム。
（項目３）
前記サンプルホルダーが、１つ以上の光学的に非透過性の表面を含む、項目１または２に記載のシステム。
（項目４）
前記徹照が、少なくとも部分的に表面における光の全内部反射により提供される、項目１または２に記載のシステム。
（項目５）
前記徹照が、少なくとも部分的に、前記キュベット内の光の全内部反射により提供される、項目２に記載のシステム。
（項目６）
前記サンプルホルダー２つ以上のサンプルを保持するためのサンプル・チャンバーを含む、項目１に記載のシステム。
（項目７）
前記キュベットが、四角形の水平断面形状を有する、項目２に記載のシステム。
（項目８）
前記キュベットが円形の水平断面形状を有する、項目２に記載のシステム。
（項目９）
前記キュベットが鋸歯上の垂直断面形状を有する、項目２に記載のシステム。
（項目１０）
前記キュベットが、ステップ形状の垂直断面形状を有する、項目２に記載のシステム。
（項目１１）
前記サンプルホルダーが、前記照明源に対して複数の場所に移動可能であり、前記サンプルホルダーの光学的に透過性の表面が、前記場所のそれぞれにおいて前記照明源により照明され得る、項目１に記載のシステム。
（項目１２）
前記照明源が、リングライトを含む、項目１に記載のシステム。
（項目１３）
前記リングライトが発光ダイオード（ＬＥＤ）に基づくリングライトおよびレーザーに基づくリングライトから選択される、項目１２に記載のシステム。
（項目１４）
前記サンプルホルダーの光学的に透過性の表面と、係合するために形状付けされた、光学的に透過性の表面を含む支持構造を更に含む、項目１に記載のシステム。
（項目１５）
前記照明源による照明のために、前記サンプルホルダーを所望の位置に保持するために構成された圧縮機器を更に含む、項目１に記載のシステム。
（項目１６）
前記サンプルホルダー内のチャネルの、少なくとも一部分を撮像するために構成された検出器を更に含む、項目１に記載のシステム。
（項目１７）
前記サンプルホルダーが、前記サンプルの少なくとも一部分を収容するために構成された細長いチャネルを含み、および前記検出器が、前記サンプルホルダー内の細長いチャネル全体を撮像するために構成される、項目１６に記載のシステム。
（項目１８）
画像化の間、前記サンプルホルダーが、前記サンプルを静的な、非流動的な様式で保持するために構成される、項目１６に記載のシステム。
（項目１９）
画像化の間、前記サンプルホルダーが、前記サンプルの一部分を静的な、非流動的様式で保持し、および別の部分を流動的な様式で保持するために構成される、項目１６に記載のシステム。
（項目２０）
前記照明源が、前記サンプルホルダーに対して、移動可能な、項目１６に記載のシステム。
（項目２１）
画像化の間、前記サンプルホルダーが、前記サンプルを流動的な様式で保持するために構成される、前記いずれかの項目に記載のシステム。
（項目２２）
前記サンプルホルダーが、前記サンプルホルダーに完全に閉じ込められた流体回路を更に含み、および前記サンプルが、前記サンプルが、前記検出器から分離されるために効果的である、前記流体回路内に配置される、項目１６に記載のシステム。
（項目２３）
前記サンプルホルダーが前記検出器に対して移動可能な、項目２２に記載のシステム。
（項目２４）
前記検出器が前記サンプルホルダーに対して移動可能な、項目２２に記載のシステム。
（項目２５）
前記サンプルホルダーおよび前記照明源が、光学的分析ユニットの少なくとも一部分を含み、前記システムが、前記サンプルの臨床分析を遂行するために構成された、臨床分析ユニットを更に含む、項目１に記載のシステム。
（項目２６）
前記臨床分析ユニットおよび前記光学的分析ユニットが、同時にサンプルの一部分に対して、光学的分析および臨床分析を遂行し得るために効果的なように、前記システムが、前記光学的分析ユニットおよび前記臨床分析ユニットのそれぞれに、単一のサンプルの等分を提供するために構成される、項目２５に記載のシステム。
（項目２７）
前記臨床分析が、一般化学的分析、核酸分析、および酵素連結結合分析から選ばれる、項目２５に記載のシステム。
（項目２８）
複数の臨床分析ユニットを含み、前記複数の臨床分析ユニットのそれぞれの臨床分析ユニットは、一般化学的分析、核酸分析、および酵素連結結合分析から選ばれる臨床分析を提供するために構成される、項目２５に記載のシステム。
（項目２９）
サンプルを保持するために構成されたサンプル・チャンバーを含むキュベットであって、前記キュベットの少なくとも一部分は光学的に透過性の物質を含み、前記光学的に透過性の物質は、光学的に透過性の表面および反射面を含み、前記光学的に透過性の表面および前記反射面は、前記光学的に透過性の表面を通過する光が、同時に落射照明および徹照の両方を、前記サンプル・チャンバー中の前記サンプルに提供するために効果的であるために構成され、落射照明は、前記サンプルホルダーの光学的に透過性の物質の表面において反射することなく、前記照明源から前記サンプルに移動する光を含み、および徹照は、少なくとも１つの前記光学的に透過性の物質の表面からの、少なくとも１回の反射に続いて、光学的に透過性の物質内をサンプルまで移動する光を含む、キュベット。
（項目３０）
前記サンプル・チャンバーが細長いチャネルを含む、項目２９に記載のキュベット。
（項目３１）
１つ以上の光学的に非透過性の表面を更に含む、項目２９に記載のキュベット。
（項目３２）
前記徹照が、少なくとも部分的に、表面における光の部分的内部反射により提供される、項目２９に記載のキュベット。
（項目３３）
前記徹照が、少なくとも部分的に、表面における光の全内部反射により提供される、項目２９に記載のキュベット。
（項目３４）
前記サンプルホルダーが、２つ以上のサンプルを保持するためのサンプル・チャンバーを含む、項目２９に記載のキュベット。
（項目３５）
四角形の水平断面形状および円形の水平断面形状から選ばれる断面形状を含む、項目２９に記載のキュベット。
（項目３６）
鋸歯状垂直断面形状および階段形状の垂直断面形状から選ばれる、断面形状を有する項目２９に記載のキュベット。
（項目３７）
光学的に透過性のフロアを有するサンプル・チャンバーを含むキュベットであって、前記キュベットは、前記キュベットへの機械的支持を提供するために構成される、少なくとも１つの凹面または凸面構造を含む外表面を有するキュベット。
（項目３８）
前記少なくとも１つの凹面または凸面構造が、四角形、三角形、円形、および半円形から選ばれる断面形状を有する、項目３７に記載のキュベット。
（項目３９）
前記少なくとも１つの凹面または凸面構造が、前記キュベット内の内部反射光のための経路を提供するために構成される、項目３７に記載のキュベット。
（項目４０）
前記少なくとも１つの凹面または凸面構造が、表面を含み、および前記表面は、前記キュベット内の光を反射するために構成される、項目３７に記載のキュベット。
（項目４１）
複数の細胞を含むサンプル中の細胞を同定する方法であって、：
（ａ）前記サンプルを保持するために構成されたサンプル・チャンバーを含むサンプルホルダー中のサンプルを配置することであって、少なくとも前記サンプルホルダーの一部分は、光学的に透過性の物質を含み、前記光学的に透過性の物質は光学的に透過性の表面および反射面を含み、前記光学的に透過性の表面および前記反射面は、前記光学的に透過性の表面を通過する光が、前記サンプル・チャンバー中の前記サンプルに、落射照明および徹照の両方を同時に提供するために効果的であるために構成され、落射照明は、前記サンプルホルダーの光学的に透過性の物質の表面において反射することなく、前記照明源から前記サンプルに移動する光を含み、および徹照は、少なくとも１つの前記光学的に透過性の物質の表面からの、少なくとも１回の反射に続いて、光学的に透過性の物質内をサンプルまで移動する光を含み；
（ｂ）前記サンプルの落射照明および徹照の両方を同時に提供するために効果的であるために前記サンプルホルダーを照射すること；および
（ｃ）サンプル中の細胞を同定することを含む、方法。
（項目４２）
前記同定することが、前記サンプル・チャンバーの少なくとも一部分を撮像するために構成された検出器により、前記細胞を同定することを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記サンプル・チャンバーが細長いチャネルを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４４）
サンプル中の細胞集団の細胞中の目的の構成要素を測定するための方法であって：
ａ）前記サンプル中の細胞集団の細胞に存在するマーカーの定量的測定を得ること；
ｂ）パートａ）の測定に基づいて、コンピュータの支援により、前記サンプル中に存在する細胞集団中の細胞のおおよその量を決定すること；
ｃ）細胞マーカーのある量を前記サンプルに加えることであって、加えられる前記細胞マーカーの量はパートｂ）の結果に基づき、および前記細胞マーカーは前記細胞集団の細胞中の目的の構成要素に特異的に結合し、および容易に検出可能であるために構成され；
ｄ）サンプル中の細胞を、前記目的の構成要素に結合したマーカーについて検定すること；および
ｅ）前記サンプルの細胞集団の細胞中の目的の構成要素の量を、前記目的の構成要素に結合したマーカーの量に基づいて決定することを含む方法。
（項目４５）
前記サンプルホルダーが、項目２９に記載のサンプルホルダーおよび項目３７に記載のサンプルホルダーから選ばれるサンプルホルダーを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
顕微鏡の焦点を合わせるための方法であって：
ａ）顕微鏡的分析のための対象を含むサンプルを、サンプルおよび参照粒子を含む混合物を生成するために効果的な既知のサイズを有する参照粒子と混合すること；
ｂ）ステップａ）の混合物を顕微鏡の光路内に位置決付けること；
ｃ）ステップａ）の混合物を前記参照粒子を可視化するために構成された光線に曝露すること；および
ｄ）前記混合物中の前記参照粒子の位置に基づいて、または前記参照粒子の画像の鮮明さに基づいて顕微鏡の焦点調節を行うことを含む方法。
（項目４７）
前記サンプルおよび参照粒子を含む混合物が、項目２９に記載のサンプルホルダーおよび項目３７に記載のサンプルホルダーから選ばれるサンプルホルダー内に保持される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
複数の細胞を含む、サンプル中の細胞を同定する方法であって：
（ａ）（ｉ）前記細胞表面抗原の存在；（ｉｉ）前記細胞表面抗原の量；または（ｉｉｉ）細胞サイズの少なくとも１つについて、前記複数の細胞の細胞を検定すること；
（ｂ）（ａ）の細胞を：（ｉ）核サイズ；または（ｉｉ）核形状の少なくとも１つについて検定すること；および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の細胞を、定量的な細胞の光散乱について検定することを含み、前記ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）からの情報の組み合わせが複数の細胞を含む前記サンプル中の細胞の同定のために用いられる方法。
（項目４９）
前記複数の細胞が、項目２９に記載のサンプルホルダーおよび項目３７に記載のサンプルホルダーから選ばれるサンプルホルダー内に保持される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
サンプルの画像化のためのシステムであって：
サンプルホルダー、
前記サンプルホルダー内に保持される対象を照明するための光源、
前記サンプルホルダー内に保持される対象から散乱された光を収集し、および焦点を合わせるために構成された対物レンズであって、前記散乱光は、複数の散乱角において散乱された光を含む対物レンズ、
前記対物レンズからの光を通過させるための光学的開口部、および
前記対物レンズからの光を前記光学的開口部上に焦点を合わせるために構成された更なるレンズであって、前記光学的開口部は、前記対物レンズにより焦点を合わされた光の部分だけが前記開口部を通過することを許容するために構成され、それにより前記開口部を通過することを許容された前記光の部分が、前記複数の散乱角の部分により散乱された光のみにより構成される更なるレンズを含むシステム。
（項目５１）
サンプルの画像化のためのシステムであって：
前記サンプルを含むサンプル容器、
光学的に透明な表面を持つサンプル容器の受器を有するステージ；
形成されたサンプル中の構成要素を、前記ステージを通して照明するための光源を含み、前記サンプル容器は、前記サンプル容器の受器の光学的に透明な表面と係合するために構成されたインターフェース表面を有し、それによりこのインターフェース表面は、このインターフェース表面を通過する光の有意な収差なしで、前記光学的に透明な表面に適合する。
（項目５２）
前記サンプル容器のインターフェース表面が、ポリマー物質から形成された、項目５１に記載のシステム。
（項目５３）
前記サンプル容器のインターフェース表面が、前記サンプル容器受器の、光学的に透明な表面を形成するために用いられる物質よりも、やわらかい物質により形成された、項目５１に記載のシステム。
（項目５４）
前記インターフェース表面を前記サンプル容器の受器の光学的に透明な表面に、適合するために構成された形状に一致させるために、圧力を加えるための、圧縮ユニットを更に含む、項目５１に記載のシステム。
（項目５５）
サンプル容器を前記ステージの上に、またはそこから外へ輸送することを促進するために、および前記サンプル容器の機械的剛性を増大させるための、サンプル容器に連結されるために構成された取扱いユニットを更に含む、項目５１に記載のシステム。
（項目５６）
前記サンプル容器に連結されるために構成された不透明な取扱いユニットを更に含む、項目５１に記載のシステム。
（項目５７）
前記サンプルの全ての画像化が、１つの表面から対向する表面の外へ、実質的に直線の光を検出器まで通過させることなく行われる、項目５１に記載のシステム。
（項目５８）
前記光源が、前記サンプル容器の反対側にある検出器に光を送達するために、前記サンプル容器の一つの側面には配置されない、項目５１に記載のシステム。
図１は以下を示す：（Ａ）側方散乱強度（ｘ−軸）対ＣＤ１６を認識する蛍光バインダーで標識されたナチュラルキラー細胞および好中球を含む細胞混合物の蛍光強度のプロット；（Ｂ）ナチュラルキラー細胞（“ＮＫ”）および好中球（“Ｎｅｕ”）の核領域対全細胞領域の比を示す棒グラフ；（Ｃ）抗ＣＤ１６抗体で染色されたナチュラルキラー細胞（左カラム）および核染色（右カラム）；（Ｄ）抗ＣＤ１６抗体で染色した好中球（左カラム）および核染色（右カラム）。 図１は以下を示す：（Ａ）側方散乱強度（ｘ−軸）対ＣＤ１６を認識する蛍光バインダーで標識されたナチュラルキラー細胞および好中球を含む細胞混合物の蛍光強度のプロット；（Ｂ）ナチュラルキラー細胞（“ＮＫ”）および好中球（“Ｎｅｕ”）の核領域対全細胞領域の比を示す棒グラフ；（Ｃ）抗ＣＤ１６抗体で染色されたナチュラルキラー細胞（左カラム）および核染色（右カラム）；（Ｄ）抗ＣＤ１６抗体で染色した好中球（左カラム）および核染色（右カラム）。 図１は以下を示す：（Ａ）側方散乱強度（ｘ−軸）対ＣＤ１６を認識する蛍光バインダーで標識されたナチュラルキラー細胞および好中球を含む細胞混合物の蛍光強度のプロット；（Ｂ）ナチュラルキラー細胞（“ＮＫ”）および好中球（“Ｎｅｕ”）の核領域対全細胞領域の比を示す棒グラフ；（Ｃ）抗ＣＤ１６抗体で染色されたナチュラルキラー細胞（左カラム）および核染色（右カラム）；（Ｄ）抗ＣＤ１６抗体で染色した好中球（左カラム）および核染色（右カラム）。
図２は以下を示す：（Ａ）蛍光的にコンジュゲートされたＣＤ４１およびＣＤ６１抗体により標識された血小板（明るい点）；（Ｂ）蛍光的に標識された血小板の画像の強度分布１０Ｘ（左）および２０Ｘ（右）倍率；（Ｃ）測定された強度を示す蛍光的に標識された血小板の画像の強度分布（薄い灰色）および測定された強度に適合する曲線（暗い灰色）。
図３は：・ｍ単位での標準粒子の公称直径（ｘ−軸）および原子単位での蛍光強度に基づくサイズ測定（ｙ−軸）の間の関係を示すプロット曲線を示す。この図は、曲線に沿った異なる点での代表的なビーズも示す。
図４は：キュベット中で、（Ａ）落射照明のみが可能な暗視野顕微鏡および（Ｂ）落射および徹照の混合が可能な暗視野顕微鏡により画像化された球状化された赤血球画像を示す。
図５は以下を示す：（Ａ）抗ＣＤ１６抗体で染色された推定桿状核球好中球および核染色；（Ｂ）抗ＣＤ１６抗体で染色された推定分葉核好中球および核染色。
図６Ａは、本明細書で開示される機器またはシステムの一部として適切な、および本明細書において開示される、例示的光学（例えば、リングライトとして示される光源および被写体）、キュベット、および画像化のためにキュベットを保持および位置づけるために構成された支持構造を含む方法において使用するために適切な光学的システムの実施形態を示す。この実施形態では、前記キュベットは四角形の水平断面形状を有する。
図６Ｂは、本明細書で開示される機器またはシステムの一部として適切な、および本明細書において開示される、例示的光学（例えば、リングライトとして示される光源および対物レンズ）、キュベット、および画像化のためにキュベットを保持および位置づけるために構成された支持構造を含む方法において使用するために適切な光学的システムの実施形態を示す。この実施形態では、前記キュベットは円形の水平断面形状を有する。
図７Ａは、本明細書で開示される機器またはシステムにおいての使用および本明細書において開示される方法においての使用に適切な光学的システムの要素の実施形態を示す。
図７Ｂは、本明細書で開示される機器またはシステムにおいての使用、および本明細書において開示される方法においての使用に適切な、更なるレンズおよび検出器に到達した散乱光の角度範囲を制限するために適切な開口部を含む光学的システムの要素の実施形態を示す。
図８Ａは、サンプル画像化のためにキュベットを保持する支持構造を含む光学的システムの実施形態の図であり、リングライト照明システムからの光が直接サンプル上に落ちる（落射照明）、および光が、徹照を提供するために、その上にキュベットの特性から反射もする。この実施形態では、前記キュベットは階段状に形状付けされた垂直断面形状を有する。
図８Ｂは、サンプル画像化のためにキュベットを保持する支持構造を含む光学的システムの実施形態の図であり、リングライト照明システムからの光が直接サンプル上に落ちる（落射照明）、および光が、徹照を提供するために、その上にキュベットの特性から反射もする。示されるように、入射光は、表面において完全に反射されることができる（全内部反射、ＴＩＲ）か、または入射光の一部分だけが表面で反射され得る（部分内部反射、ＰＩＲ）。この実施形態では、前記キュベット鋸歯上の垂直断面形状を有する。
図８Ｃは、本明細書で開示される機器またはシステムの一部として適切な、および本明細書において開示される、例示的光学（例えば、リングライトとして示される光源および被写体）、キュベット、および画像化のためにキュベットを保持および位置づけるために構成された支持構造を含む方法において使用するために適切な光学的システムの実施形態を示す。この実施形態では、前記キュベットは、キュベットを照明する光の経路に影響する特性を含み、およびサンプルはキュベット内にある。
図８Ｄは、本明細書で開示される機器またはシステムの一部として適切な、および本明細書において開示される、例示的光学（例えば、横軸方向から光を向ける光源）、キュベット、および画像化のためにキュベットを保持および位置づけるために構成された支持構造を含む方法において使用するために適切な光学的システムの実施形態を示す。この実施形態では、前記キュベットは、キュベットを照明する光の経路に影響する特性を含み、およびサンプルはキュベット内にある。
図８Ｅは、キュベットのサンプル調製位置から光学的検出器（“Ｄ”と標識された）の近くのサンプル観察位置までの輸送の表現の模式図を提供する。
図８Ｆは、キュベットをサンプル調製位置から光学的検出器の近くのサンプル観察位置までの輸送するための輸送機構を含むシステムの更なる詳細な模式的表現を提供する。
図９は、全血から取られた血液細胞の、異なる画像化技法および染料による表示画像を示す複合画像である。図９Ａは暗視野画像である；図９Ｂは、単球に付着した標識された抗ＣＤ１４抗体からの蛍光を示す画像である；図９Ｃは、好塩基球に付着した標識された抗ＣＤ１２３抗体からの蛍光を示す画像である；図９Ｄは、好中球に付着した標識された抗ＣＤ１６抗体からの蛍光を示す画像である；図９Ｅは、白血球に付着した標識された抗ＣＤ４５抗体からの蛍光を示す画像である；図９Ｆは、核染色ＤＲＡＱ５（登録商標）により染色された白血球および血小板細胞を示す画像である（核を欠く、赤血球は、ＤＲＡＱ５（登録商標）により染色されない）。
図１０は、全血から取られた血液細胞の、表示画像を示す複合画像であり、単球、リンパ球、好酸球、および好中球を示している。
図１１は、異なるマーカー（異なる細胞表面または他のマーカーに向けられた標識された抗体）で標識された細胞で検出された蛍光のプロットを示す；そのような複数の標識は、細胞の同定にとり有用である。図１１Ａは、ＣＤ１４標識強度（ＦＬ−１７）対散乱強度（ＦＬ−９）のプロッティングによる単球の同定を示す。図１１Ｂは、ＣＤ１２３強度（ＦＬ−１９）対ＣＤ１６強度（ＦＬ−１５）のプロッティングによる好塩基球の同定を示す。図１１Ｃは、ＣＤ１６強度（ＦＬ−１５）対ＣＤ４５強度（ＦＬ−１１）のプロッティングによるリンパ球の同定を示す。図１１Ｄは、ＣＤ１６強度（ＦＬ−１５）対散乱強度（ＦＬ−９）のプロッティングによる好中球および好酸球の同定を示す。
図１２は、本発明の方法、および他の方法（市販の血液分析器を用いる）により測定された細胞計数（同じ血液サンプルのアリコットから測定された）の比較を示す。図１２Ａは、本発明の方法により得られた白血球計数対市販の血液分析器により得られた白血球計数をプロットしている。図１２Ｂは、本発明の方法により得られた赤血球計数対市販の血液分析器により得られた赤血球計数をプロットしている。図１２Ｃは、本発明の方法により得られた血小板計数対市販の血液分析器により得られた血小板計数をプロットしている。図１２Ｄは、本発明の方法により得られた好中球計数対市販の血液分析器により得られた好中球計数をプロットしている。図１２Ｅは、本発明の方法により得られた単球計数対市販の血液分析器により得られた単球計数をプロットしている。図１２Ｆは、本発明の方法により得られたリンパ球計数対市販の血液分析器により得られたリンパ球計数をプロットしている。
本明細書において開示される、機器、システム、および方法の全範囲ならびに利点の理解を助け得る記載および開示は、例えば米国特許第７，８８８，１２５号；米国特許第８，０８８，５９３号；米国特許第８，１５８，４３０号；米国特許第８，３８０，５４１号；２０１３年２月１８日に出願された米国特許出願第１３／７６９，７９８号；２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／８０２，１９４号；２０１３年２月１８日に出願された米国特許出願第１３／７６９，７７９号；２０１１年９月２６日に出願された米国特許出願第１３／２４４，９４７号；２０１２年９月２５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１２／５７１５５号；２０１１年９月２６日に出願された米国特許出願第１３／２４４，９４６号；２０１１年９月２６日に出願された米国特許出願第１３／２４４，９４９号；および２０１１年９月２６日に出願された米国特許出願第６１／６７３，２４５号において見出されることができ、全ての特許および特許出願の開示は、参照によりその全体が組み込まれる。
前述の一般的記述および以下の詳細な記載は例示的および説明的に限られ、主張されるように本発明を制限するものではないことを理解されたい。。明細書およびそれに付属する請求項において、単数形、「ａ（１つの）」「ａｎ（１つの）」「ｔｈｅ（前記の）」は、文脈において明白に示さない限り、複数の指示対象を含むことに注意されたい。従って、例えば、“ａ ｍａｔｅｒｉａｌ”への参照は物質の混合物を含むことができ、“ａ
化合物”への参照は複数の化合物を含み得るなどである。本明細書において引用される参照は、本明細書において明確に説明される教示と矛盾しない範囲において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書およびそれに続く請求項において、以下の意味を持つとして定義される一連の用語への参照がなされる：
「随意的な」（“ｏｐｔｉｏｎａｌ”）または「随意的に」（“ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ”）は、この記載が、後続して記載される状況が、生じる場合および生じない場合を含むことができるために、生じても生じなくてもよいことを意味する。例えば、機器が随意的にサンプル収集ユニットのための特性を含む場合、このことは、このサンプル収集ユニットが、存在しても、存在しなくてもよく、および、従って、この記述は機器がサンプル収集ユニットを保有する構造、およびサンプル収集ユニットを保有しない構造の両方を含む。
本明細書において用いられる、用語「十分な」（“ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ”）は、「最小限の」または「わずかな」量より多いことを意味し；および「十分に」（“ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ”）は、「最小限に」、または「わずかに」を意味する。従って、例えば、本明細書において用いられる語句「十分に異なる」（“ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ”）は、当業者が、２つの数値の間の差を、その値により測定される特性の文脈内で、統計的に有意であると見なすことができるような、２つの数値の間に、十分に高い程度の差異が存在することを意味する。従って、互いに十分に異なる２つの値の間の差異は、参照値またはコンパレータ値の関数として、典型的には約１０％より大きい、および約２０％より大きい、約３０％より大きい、約４０％より大きい、または約５０％より大きいことができる。
本明細書において使用される、“内部反射”は、第一の物質および別の物質（第二の物質）の間の境界での、物質（第一の物質）の中での光の反射を指す。例えば、第一の物質は、ガラスまたはプラスチックなどの固体、および第二の物質は、例えば、空気であり得る。内部的に反射される光は、それが反射される前に第一の物質内を移動している。内部反射は、部分的（部分内部反射：ＰＩＲ）または全体的（全内部反射：ＴＩＲ）であり得る。従って、内部反射で、表面に入射する光が全て第一の物質内で反射して返される場合がＴＩＲである一方、内部反射ｗｈｅｒｅ全ての表面に入射する光の全てではない光が物質内で反射して返される場合がＰＩＲである。（ＰＩＲでは、いくらかの光は、境界を通過でき、およびいくらかの光は、表面で反射されて物質内に返される。）内部反射の程度を決定する、入射の角度は重要なファクターである；これは境界表面に垂直な線に対して測定される入射光線の角度である。ＴＩＲが生じるか否かは第一および第二の物質の間の境界における表面に対する光の入射の角度に依存する；第一の物質屈折率；第二の物質の屈折率；および他の因子（例えば、屈折率は典型的には波長により変化するために、光の波長がＴＩＲに影響し得る）。光がすべて内部的に反射される角度は、臨界角（ｃｒｉｔｉｃａｌ ａｎｇｌｅ）と称される。臨界角よりも大きな入射角を有する入射光は、内部的に全て反射される（物質内にとどまる：ＴＩＲ）。しかしながら、ＰＩＲでは、臨界角未満の入射角度を有する入射光の一部も内部的に反射される（残りの光は屈折され、および第一の物質を通過して出て第二の物質に入る）。
本明細書において使用される、“サンプル”は、限定はされないが、血液サンプル、または尿サンプル、または他の生物学的サンプルであり得る。サンプルは、例えば、血液サンプル（例えば、指先穿刺から得られたサンプル、またはｆｒｏｍ静脈穿刺、または動脈血液サンプル、および全血、血清、血漿、または他の血液サンプルであり得る）、尿サンプル、生検サンプル、組織切片、便サンプル、または他の生物学的サンプル；水サンプル、土壌サンプル、食品サンプル、空気サンプル；または他のサンプル（例えば、鼻の拭い液または鼻咽頭洗液、唾液、尿、涙、胃液、脊髄液、粘液、汗、耳垢、脂、腺分泌物、脳脊髄液、組織、精液、子宮頚管粘液、膣液、滑液、咽頭拭い液、呼気、毛髪、指の爪、皮膚、生検、胎盤液、羊水、臍帯血、リンパ液、体腔液、痰、粘液、膿、微生物叢サンプル、胎便、母乳および／または他の排泄物）であり得る。
従って、本明細書において使用される、“サンプル”は、血液、尿、または他の生物学的サンプルの一部分を含み、任意の適切なサイズまたは容積のものであることができ、および好適には小さなサイズまたは容積である。本明細書において開示されるシステム、検定および方法のいくつかの実施形態では、測定は小さな容積の血液サンプル、またはただの小さな容積の血液サンプルの一部を用いて行われることができ、ここで小さな容積は、たかだか約５ｍＬを含み；またはたかだか約３ｍＬを含み；またはたかだか約２ｍＬを含み；またはたかだか約１ｍＬを含み；またはたかだか約５００μＬを含み；またはたかだか約２５０μＬを含み；またはたかだか約１００μＬを含み；またはたかだか約７５μＬを含み；またはたかだか約５０μＬを含み；またはたかだか約３５μＬを含み；またはたかだか約２５μＬを含み；またはたかだか約２０μＬを含み；またはたかだか約１５μＬを含み；またはたかだか約１０μＬを含み；またはたかだか約８μＬを含み；またはたかだか約６μＬを含み；またはたかだか約５μＬを含み；またはたかだか約４μＬを含み；またはたかだか約３μＬを含み；またはたかだか約２μＬを含み；またはたかだか約１μＬを含み；またはたかだか約０．８μＬを含み；またはたかだか約０．５μＬを含み；またはたかだか約０．３μＬを含み；またはたかだか約０．２μＬを含み；またはたかだか約０．１μＬを含み；またはたかだか約０．０５μＬを含み；またはたかだか約０．０１μＬを含む。
実施形態では、指先穿刺により採取されるサンプルの容積は、例えば、約２５０μＬ以下、または約２００μＬ以下、または約１５０μＬ以下、または約１００μＬ以下、または約５０μＬ以下、または約２５μＬ以下、または約１５μＬ以下、または約１０μＬ以下、または約１０μＬ以下、または約５μＬ以下、または約３μＬ以下、または約１μＬ以下であり得る。
本明細書において使用される、用語“ポイント・オブ・サービスの位置”は、被験者がサービス（例えば検査、監視、治療、診断、ガイダンス、サンプル収集、ＩＤ確認、医療サービス、非医療サービス等）を受けることのできる場所を含むことができ、および、制限なく、被験者の自宅、被験者の勤務先、ヘルスケア提供者（例えば、医師）の場所、病院、緊急治療室、手術室、診療所、ヘルスケア専門家の執務室、臨床検査室、小売店［例えば薬局（例えば、小売り薬局、臨床薬局、病院薬局）、ドラッグストア、スーパーマーケット、食品雑貨店、等］、運搬用車両（例えば自家用車、ボート、トラック、バス、航空機、バイク、救急自動車、移動ユニット、消防車／トラック、救命救急車、司法遂行車両、警察車両、又は前記被験者を一点から他へ移動するよう設定されている車両等）、移動医療ケアユニット、可動ユニット、学校、デイケアセンター、手荷物検査場、戦場、健康支援生活住居、政府のオフィス、オフィスビルディング、テント、体液サンプル取得施設（例えば血液収集センター）、被験者がアクセスを望み得る位置の入り口の場所またはその近くの場所、被験者がアクセスを望み得る機器上またはその近くの場所、被験者がアクセスを望み得る場所またはその近くの場所（例えば、被験者がコンピュータにアクセスしたい場合には、そのコンピュータの位置）、サンプル処理機器がサンプルを受け取る位置、または本明細書の別の場所に記載される任意の他のポイント・オブ・サービス位置を含み得る。
生物学的サンプルの文脈において用いられる用語“細胞”は、一般的に個々の細胞が同様のサイズを持つものであって、限定されはされないが、小胞（リポソームなどの）、細胞、ビリオン、及びビーズなどの小粒子に結合された物質、ナノ粒子、又はマイクロスフェアを含むサンプルを包含する。
本明細書において使用される、「結合する」（“ｂｉｎｄｓ”）は、２つの物質の間の反応、または相互作用であって、それら２つの物質の緊密な組み合わせを導くものを指す；例えば、リガンドが堅く受容体に連結する、リガンドおよび受容体の間の反応は、結合の例を提供する。抗体とその標的の抗原との組み合わせ、および内因子とＢ１２などの担体タンパク質とその積荷は、１つの物質が別の物質と結合する反応の更なる例である。
本明細書において使用される用語「バインダー」（“バインダー”）は、標的に堅くまたは特異的に結合する抗体などの任意の化合物または巨大分子を指す。バインダーは、限定はされないが、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル、抗体フラグメント、イムノアドヘシン、および他のそのような抗体の変異およびミミック）、天然結合タンパク質（例えば、内因子タンパク質はビタミンＢ１２に特異的である）、標的受容体に結合するリガンド、特定の酵素に結合する基質、アビジンおよびビオチンなどの結合ペア、標的分子に堅くおよび特異的に結合する小分子などを含む。バクテリア、ウイルス、合成足場（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ）、および特異的な標的に結合、または接着する他の物体および物質は、バインダーとして用い得る。バインダーは、染料、蛍光色素分子または他の検出可能な基などのマーカーであり得るか、それらを含み得るか、またはそれらに連結され得る。
本明細書において使用される「マーカー」（“ｍａｒｋｅｒ”）は、その存在が標的を可視化するか、さもなければ検出可能にするか、またはその位置または場所における存在が、その位置または場所における標的の存在を示す検出可能な物質である。マーカーは、細胞、構造、粒子、または他の標的を標識するために用いられ得て、およびサンプル中の標的または性質の検出、存在の決定、位置決め、同定、定量またはさもなければ測定するために有用である。マーカーは、制限なく、特異的な標的または場所に結合するか、または局在化する染色剤、染料、リガンド、抗体、粒子、および他の物質を含み得て；特異的な標的または場所で成長するか、または局在化するバクテリア、ウイルスまたは細胞もマーカーとして用い得る。細胞または他の標的の検出可能な属性または性質はマーカーとして用い得る。
本明細書において使用される用語“染色”および“染料”（“ｓｔａｉｎ”および“ｄｙｅ”）は、互換可能であることができ、および対象またはサンプルの構成要素を染色または染料による処理がない場合に比べてより検出可能にする要素、化合物、および巨大分子を指す。例えば、血液サンプルのヨウ化プロビジウムなどのＤＮＡ染料による処理は、核のある細胞の核をより可視的にして、および核を持たない細胞（例えば、赤血球）の存在下でさえ、そのような細胞の検出および定量化を、他の場合より容易にする。
本明細書において使用される「検出器」（“ｄｅｔｅｃｔｏｒ”）は、サンプルなどの標的に関係する信号、画像、または他の情報から導出される情報を提供する任意の機器、計器、またはシステムであり得る。検出可能な信号および情報は、例えば、光学的、電気的、機械的、化学的、物理的、または他の信号を含み得る。検出器は、例えば、光学的検出器、または電気的検出器、または化学的検出器、または電気化学的検出器、または音響検出器、または温度検出器、または機械的検出器、または他の検出器であり得る。
本明細書において使用される、「光学的検出器」（“ｏｐｔｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｏｒ”）電磁性放射（例えば、光）を検出する。光学的検出器は、画像を検出するか、もしくは画像とともに用いられることができ、または画像に関わりなく光強度を検出できるか、もしくはその両方である。光学的検出器は、光強度を検出、または測定し得る。いくつかの光学的検出器は、特定の波長または波長範囲に感受性があり得るか、それらにより制限され得るか、それらを検出し得るか、またはそれらを測定し得る。例えば、光学的検出器は、例えば、光ダイオード検出器、光電子増倍管、電荷結合機器、レーザーダイオード、分光光度計、カメラ、顕微鏡、または光強度（単一の波長の、複数の波長の、または範囲の、または複数の範囲の、光の波長の）、画像から、または両方から測定する他の機器を含み得る。
本明細書において使用される用語「倍数性」（“ｐｌｏｉｄｙ”）は、細胞中のＤＮＡの量、およびサンプル中の細胞ＤＮＡ含有量の検定および測定を指す。倍数性の測定は、細胞、または細胞の集団が、正常または異常な量のＤＮＡを有するか否か、または、ＤＮＡは細胞分割および増殖の間に複製されるために、異常な数の集団中の細胞が増殖しているか否かの測定を提供する。倍数性測定は、サンプル中の核を有する細胞をＤＮＡに特異的な染料で染色したのちに画像化技法により行われ得る。
定量的顕微鏡法
いくつかの実施形態では、定量的顕微鏡法びための方法、システム、および機器が本明細書で提供される。定量的顕微鏡法は、１つ以上の細胞の属性を測定するための定量的蛍光顕微鏡法、定量的暗視野顕微鏡法、定量的明視野顕微鏡、および定量的位相コントラスト顕微鏡方法の１つ以上を含み得る。これらのいかなる方法も細胞に関する形態学的情報を提供し得る。そのような情報は、定量的に測定され得る。いくつかの実施形態では、定量的顕微鏡法について、サンプルは、定量的蛍光顕微鏡法、定量的暗視野顕微鏡法、定量的明視野顕微鏡法、および定量的位相コントラスト顕微鏡法の２つ以上により定量され得る。定量的顕微鏡法は、顕微鏡により得られた画像を処理するための、画像分析技法および／または統計的知識および分類方法の使用を含み得る。
複数の異なる細胞の属性が、定量的顕微鏡法の間に測定され得る。測定され得る細胞の属性は、制限なく以下のものを含む：
物理的属性：例えば細胞サイズ、容積、伝導度、小および大角度散乱、および密度。他の測定および／または定量され得る物理的属性は、制限なく、細胞または粒子の真円度；細胞または粒子のアスペクト比；細胞または粒子の周囲の長さ；細胞または粒子の凸性；細胞または粒子の粒度；細胞または粒子の画像の強度；細胞または粒子の高さ（例えば、サイズいくつかの焦点面を通過する）；胞または粒子の平坦性；および他の物理的属性。
形態属性：例えば細胞形状、領域、サイズ、および小葉をもっているという特性；核の形状領域、サイズ、および小葉をもっているという特性；ミトコンドリア形状、領域、サイズ、および小葉をもっているという特性；および核容積対細胞容積の比。
細胞内の属性：例えば核の重心／細胞重心の距離（すなわち、距離核の中心から細胞の中心までの距離）、核葉中心距離（すなわち、異なる核葉までの距離）、細胞中のタンパク質（例えばアクチン、チュブリン、等）の分布、細胞中のオルガネラ（例えばリソソーム、ミトコンドリア等）の分布、タンパク質の他のタンパク質またはオルガネラとの共局在化、および他の属性。
生化学的属性：例えば細胞のタンパク質の発現レベル、細胞表面タンパク質、細胞質性タンパク質、核タンパク質、細胞の核酸、細胞表面核酸、細胞質性核酸、核核酸、細胞炭水化物、細胞表面炭水化物、細胞質性炭水化物、および核炭水化物。
いくつかの実施形態では、サンプル中の細胞の２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多い属性の定量的測定のための方法、システム、および機器が本明細書で提供され、前記属性は、物理的属性、形態属性、細胞内のの属性、および生化学的属性から選択される。いくつかの実施形態では、サンプル中の細胞の２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多い属性の定量的測定のための方法、システム、および機器が本明細書で提供され、前記属性は：細胞サイズ、細胞容積、細胞伝導度、細胞小角光散乱、細胞大角光散乱、細胞密度、細胞形状、細胞領域、細胞の小葉をもっているという特性、核の形状、核の領域、核のサイズ、核小葉をもっているという特性、ミトコンドリアの形状、ミトコンドリアの領域、ミトコンドリアのサイズ、ミトコンドリアの小葉をもっているという特性、核容積の細胞容積に対する比率、核中心／細胞中心距離、核葉中心距離、細胞中のタンパク質の分布（例えばアクチン、チュブリン等）、細胞中のオルガネラの分布（例えばリソソーム、ミトコンドリア等）、細胞のタンパク質の発現レベル、細胞表面タンパク質の発現レベル、細胞質性タンパク質の発現レベル、核タンパク質の発現レベル、細胞の核酸の発現レベル、細胞表面核酸の発現レベル、細胞質性核酸の発現レベル、核の核酸の発現レベル、発現レベルｏｆａ細胞の炭水化物、細胞表面炭水化物の発現レベル、細胞質性炭水化物の発現レベル、および核の炭水化物の発現レベルから選択される。
いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の細胞の２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多い属性の顕微鏡による定量的測定のための方法が提供され、この方法は、１つ以上の以下のステップまたは要素を含み得る。定量的に測定される細胞の属性は、このパラグラフのすぐ上に一覧されている属性から選ばれ得る。前記生物学的サンプルは、顕微鏡法に先立ち前処理され得る。前処理は、顕微鏡法によるサンプルの分析を支援するための、以下のものを含む任意の手順を含み得る：顕微鏡法のために目的の細胞を富化するためのサンプルの処理、顕微鏡法に干渉し得るサンプル中の構成要素の低下のためのサンプルの処理、および顕微鏡法によるサンプルの分析を促進するための物質の添加（例えば希釈剤、細胞への染料の非特異的な結合を低下させるための分子の阻害等）。随意的に、顕微鏡法に先立ち、サンプルは、細胞の構成要素に特異的に結合する１つ以上のバインダーに接触され得る。バインダーは、そのバインダーの可視化のために染料または他の粒子に直接に連結され得る。サンプルは、細胞の構成要素に結合した前記バインダーと結合する二次的なバインダーとも接触され得る。二次的なバインダーは、そのバインダーの可視化のために染料または他の粒子に直接に連結され得る。顕微鏡法に先立ち、サンプルは分光光度計で検定され得る。顕微鏡法については、顕微鏡的分析の対象を含むか、または含むことが疑われる生物学的サンプルがスライドまたはキュベットなどのサンプルホルダー中に導入される。このサンプルを含むサンプルホルダーは、サンプルの定量的顕微鏡法を遂行するために構成された機器中に導入され得る。顕微鏡は、顕微鏡対物レンズから生成された画像を捕捉するための画像センサーと連結され得る。この機器では、複数のサンプル画像が顕微鏡法により取得される。定量的蛍光顕微鏡、定量的暗視野顕微鏡、定量的明視野顕微鏡、および定量的位相コントラスト顕微鏡のうちの任意の１つ以上が、サンプルの画像を取得するために用いられ得る。随意的に、サンプルホルダー中のサンプル全体の画像が顕微鏡法により取得され得る。サンプルホルダー中のサンプルの全体を捕捉するには顕微鏡の複数の視野が要求され得る。前記サンプルホルダーは、顕微鏡に対して移動し得るか、またはサンプルホルダー中のサンプルの異なる部分を分析するために、異なる視野を生成するために、顕微鏡が前記サンプルホルダーに対して移動し得る。サンプルホルダー中のサンプルの同じ視野での複数の画像が取得され得る。随意的に、同じタイプの顕微鏡、およびサンプルの同じ視野で、サンプルに関する異なる情報を含む、同じサンプルの異なる画像を取得するために複数のフィルターが使用され得る。使用され得るフィルターは、制限なく帯域通過およびロングパスフィルターを含み得る。フィルターは、光の特定の波長の通過を許容することができ、および他のものの通過を阻止する。随意的に、複数のタイプの顕微鏡（例えば蛍光、暗視野、明視野など）が、サンプルに関する異なる情報を含む、同じサンプルの異なる画像を取得するために、サンプルの同じ視野の画像を取得するために用いられ得る。随意的に、ビデオが顕微鏡画像を収集するために用いられ得る。随意的に、顕微鏡画像は３−Ｄで収集される。本明細書に記載されるように遂行される顕微鏡法について、その機器またはシステムは、サンプルの１つの画像中の細胞に関する情報を、サンプルの異なる画像中の同じ細胞にリンクするために構成され得る。同じサンプルの異なる画像および／または同じ細胞に基づき、サンプル中の細胞の複数の属性が決定され得る。いくつかの態様では、サンプル中の細胞についての情報の複数の属性／複数の片の組み合わせが、臨床的決断に達するために、および／または細胞の単一の属性だけからの情報に基づいては不可能である、細胞に関する結論を出すために、用いられ得る。
いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の細胞の２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多い属性の定量的測定の機器およびシステムが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、顕微鏡または血球計算器および分光光度計の両方を含む機器またはシステムが提供される。前記機器またはシステムは、サンプルを分光光度計および顕微鏡または血球計算器の間を移動させるために構成された流体取扱い装置を更に含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法を遂行するための機器およびシステムは、米国特許出願第１３／２４４，９４７号および米国特許出願第１３／７６９，７７９号に記載されるように構成され、これらの出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前述のことは細胞の文脈において記載されているが、前述のことのうちのいくつか、または前述のことの全てが、サンプル中に見出される、結晶、粒子、フィラメント、または他の細胞のサイズを持つ対象にも適用されることも理解されたい。
動的希釈
いくつかの実施形態では、細胞を含むサンプルの動的希釈のための方法、システム、および機器が本明細書で提供される。
非限定的な例として、サンプルの動的希釈のための方法は、サンプル中の細胞または対象の所望の数または濃度が決定され、およびこの情報が下流のサンプル処理の調整において因子として使用されるために、以下のステップまたは要素の１つ以上を含み得る。この非限定的な例では、１つ以上の染色剤または染料が、細胞を含む生物学的サンプルに加えられる。染色剤およびサンプルのこの混合物は、インキュベートされ得る。この染色剤およびサンプル混合物中の細胞は、過剰の（結合されていない）染色剤を除去するために洗浄され得る。この染色され、洗浄された細胞は、更なる分析のために所望の容積に調製される。この染色され、洗浄された細胞は、サンプル、またはその一部分中の細胞の概算数または濃度またはを決定するために分析され得る。サンプルまたはその一部分中の染色された細胞の数または濃度に基づき、更なる分析のための細胞の所望の数または濃度が得られるように、更なる分析のためにサンプルの容積が取得されることができる。いくつかの実施形態では、サンプル米国特許出願第１３／３５５，４５８号に記載されるようにい希釈されることができ、この出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される一実施形態では、細胞計数器を用いる代わりに細胞濃度を見積もるために細胞を数えるために、限定はされないが蛍光に基づく方法などの別の検出技法を提供することが望ましい。この見積もりが記載されるのは、正確および再現性のある患者サンプルの染色のために、細胞の特異的な数／濃度のために、しばしば染色（ＤＮＡ染料／抗体／バインダー／など）が最適な力価を持つことが望ましいからである。例えば、既知の染色剤の濃度が細胞の特異的な数に適用される（例えば、１０００個の白血球（ＷＢＣ）に対して０．２マイクログラムの染色剤）。インキュベーション期間の後、サンプルは、過剰の（結合されていない）染色剤を除去するために洗浄され、適切な細胞密度に調製され、および撮像される。
この非限定的な例では、標的の細胞のタイプの細胞濃度を見積もるために、サンプルは、血球計算検定のためのサンプル処理を正確に遂行するために、限定はされないが分光光度計などの、血球計算に用いられたものとは、異なる撮像手段により非破壊的に測定される。この方法は、目的の細胞集団に特有な別のマーカーを選択することを含み得る。１つの制限しない実施例では、Ｂ−細胞に対して、ＣＤ２０を選択し得る。このプロセスは、サンプルを、ＣＤ５とは異なる色彩の蛍光色素分子とコンジュゲートされた抗ＣＤ２０バインダーにより標識することを含む。次いで、限定はされないが蛍光分光光度計などの機器を用いて、このサンプルの蛍光信号を、非破壊的におよび迅速に測定する。校正を用いて、見積もりを提供するために、Ｂ−細胞の濃度を限定された正確性で予測することが可能である。１つの制限しない実施例では、この校正は、信号強度をそのタイプの信号についての細胞数に関連付けることができる。これらの校正曲線の作成は、細胞または対象の数を見積もるために使用され得る。限定はされないが光学的、電気的、音響学的などの全体の信号強度に基づいて細胞数を見積もるための他の技法は除外されない。Ｂ−細胞のおおよその濃度に基づいて、ＣＤ５発現およびＣＤ５蛍光の間の比例的関係が維持されるために、前記システムは、適切な抗ＣＤ５バインダーの量および濃度を見積もることができる。この様式で、特定の細胞数について、染色剤および染色手順が最適化／正規化され得る。
患者のサンプル（例えば、指先穿刺から得られた約１２０μＬ以下の容積を有する血液などの低容積サンプルであり得る）の使用を最大化するために、それにより血液の所定の容積の中に含まれるＷＢＣ数を計数できる方法を開発することが望ましい（例えば、決定されるＷＢＣ／μＬ濃度）。これは染色剤を加える前に、ＷＢＣ数が決定されるか、または少なくとも見積もられることを可能にする。一旦決定されると、所望の細胞数が、既知の濃度の染色剤とのインキュベーションのために等分され、細胞亜集団の最適な解像度を生じる。
細胞の倍数性の測定が望まれる適用では、サンプル中の細胞は、ＤＮＡ染料により染色され、および次いで染色の強度が定量化され得る（「染色の強度」は、染料に起因する光学的信号の強度を意味する）。そのような染色に起因する染料の信号強度は、ＤＮＡ／染料の比に依存する（すなわち、染料により染色されたＤＮＡの量の加えられた染料の量に対する比）。サンプルの特性に関わりなく、この量の染料がサンプル毎に加えられると、低い細胞濃度を持つサンプルと比較して、非常に高い細胞濃度を持つサンプルはそれぞれ明るさが少なくなる。この状況は、各細胞中のＤＮＡの量の定量化を複雑化する。本明細書で開示される、染料を加える前に、サンプル中の核を有する細胞の数の見積もりを得ることは、ＤＮＡおよびサンプル中の細胞当たりのＤＮＡの量の定量化が遂行されることができるように、染料の量を調節することを可能にする。従って、例えば、サンプル、またはサンプルの等分が、定量されるべき細胞を示す細胞表面マーカーを指向する、染色剤または染料により処理されることができ、およびサンプル中の細胞の濃度を非破壊的に見積もるためにその表面マーカーを用いることができる。この見積もられた濃度が、後続する測定のために常に一貫したＤＮＡ：染料比率（モル対モル）を保てるように、次いでサンプルに加えられる必要のある染料の量を計算するために用いられる。
細胞を計数するための、蛍光に基づく方法の第一の実施例では、方法は、細胞の倍数性を決定することを含み得る（例えば、蛍光色素分子にコンジュゲートされた抗体の染色により細胞を計数する）。この非限定的な例では、ＷＢＣの特異的な数が、あらかじめ決められた濃度のＤＮＡ染料（例えば、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、または１，５−ビス｛［２−（ジ−メチルアミノ）エチル］アミノ｝−４、８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（ＤＲＡＱ５（登録商標））、またはヨウ化プロピジウム、または他のＤＮＡ−染色染料）により染色されるために、血液サンプル中のＷＢＣを計数することが望ましい。この実施例の方法は、蛍光色素分子にコンジュゲートされた抗体および分光光度計を用いてＷＢＣを計数することを含む。細胞数のＤＮＡ染料濃度（細胞＃：［ＤＮＡ染料］）に対する比が、比較可能なおよび一貫性のあるデータを生成するために望まれる場合に、このアプローチは、細胞をＤＮＡ染料で染色して、および倍数性を決定するときに有用であり得ることを理解されたい。健康な集団内で、血液のマイクロリットル当たりの細胞数が変化することを考えば、典型的には、倍数性のために染色を試みる前にマイクロリットル当たりのＷＢＣの数を決定することが望ましい。
実施形態では、前記手順は、第一に、蛍光色素分子にコンジュゲートされた抗体（この抗体は好適には、ＣＤ４５などの普遍的に発現した抗原、またはＴ細胞に対するＣＤ３などの亜集団に特異的な抗原を指向する）か、または全ての細胞を標識する蛍光染料（例えば、エオシンなどの膜または細胞質性染色剤、またはレクチンまたは他の染色剤または染料）によりにより染色された細胞を用いることを含み、この蛍光色素分子からの蛍光の波長は、前記ＤＮＡ染料の発光波長とは、スペクトル的に区別可能である（および好適には遠く離れている）。インキュベーション期間の後に、このサンプルは過剰の（結合されていない）抗体を除くために洗浄され、適切な容積に調製され、および分光光度計により分析される。結果のデータは、血液の特異的な容積が等分され（特定の／所望の数のＷＢＣを生じさせる）およびＤＮＡ染料で染色され得るための血液サンプル中のＷＢＣの数の測定を可能にする。結果のデータは、記載したように蛍光色素分子−コンジュゲートされた抗体を用いて決定されたＷＢＣの数に従い、サンプルの染色に用いられるＤＮＡ染料の量を計算し、および適合するために有用である。
更なる実施形態は、細胞表面の染色に先立ち、細胞数（ＤＮＡ染色により）を決定することを含む。追加的な詳細は、本明細書の以下の細胞の計数のセクションにおいて見出し得る。抗体の最適濃度により、特異的なＷＢＣの数が染色され得るために、ときには血液サンプル中のＷＢＣを計数することが望ましい。一実施形態では、前記方法は、例えば、上述のようにＤＮＡ染料および分光光度計を用いてＷＢＣを計数することを含む。
代替的に、もしマイクロリットル当たりの細胞数が、染色に先立ち決定されることができれば、次いでその知られた数の細胞は等分され、および（ｉ）健康な集団内での変動および（ｉｉ）疾患状態に無関係に、それぞれのサンプルが染色される。マイクロリットルの血液当たりの細胞数を決定するために、ＤＡＰＩ、ＤＲＡＱ５（登録商標）、またはヨウ化プロピジウムなどのＤＮＡ染料を使用し得る。随意的に、結合されていない染料は、洗浄により除去される。分光光度計が、マイクロリットルの血液当たりの核のある細胞数（例えば、ＤＲＡＱ５（登録商標）陽性）の決定に用いられ得る。
血液の等しいサイズの等分中の白血球（ＷＢＣ）の数および濃度は、被験者ごとに変化し得る。しかしながら、血液サンプル中のＷＢＣの適切な分析のために、十分な量の試薬（特定のＷＢＣに特異的な抗原を標的とする抗体などの）が加えられることができ、および十分な量は、血液サンプル中のＷＢＣの数および濃度に依存する。“動的希釈”と称される手順は、十分な抗体試薬がサンプルに加えれらることを確実にするために用いられ得る。１つの制限しない実施例では、前記手順は、細胞の完全な染色を提供するために、サンプルとともに用いられるべき適正な試薬（例えば、白血球（ＷＢＣ）染色のための抗体カクテル）の量を評価するための、暫定的な細胞計数を得るために血液細胞を処理する。この手順では、前記細胞は、後続するステップまたは検定で用いられる蛍光色素分子にコンジュゲートした抗体の発光からスペクトル的に区別でき／遠く離れたＤＮＡ染料（例えば、ＤＡＰＩ、ＤＲＡＱ５（登録商標）、またはヨウ化プロピジウム）により染色される。随意的に、前記サンプルは、インキュベーション期間の後に、過剰の（結合されていない）ＤＮＡ染料を除去するために洗浄され得る。インキュベーション期間の後に、前記サンプルは適切な容積に調製され、および分光光度計を用いて撮像されるか、または測定される。結果として生じるデータは、血液の特定の容積が等分され（特定の／所望の数のＷＢＣを産生し）および適正な量の抗体により染色される（すなわち、ＤＮＡ染料を用いて決定された見積もられたＷＢＣの数に基づき所望の抗体染色の飽和を提供するために要求される抗体の量が決定され得る）ために、既知の容積のサンプル中のＷＢＣの数が、計数／決定されることを可能にする。従ってＤＮＡ染色により提供される前記見積もりは、サンプル等分中のＷＢＣの数に対して要求される抗体染料の適正な量の計算および添加を可能にする。
動的希釈手順：
一実施形態では、動的希釈手順は、サンプル分析に必要なＷＢＣを標的とする抗体を含む試薬の量を見積もるために白血球を含む血液サンプルの等分を取ることを含む。
この非限定的な例では、血液サンプルの既知の容積が取られる。核染料の既知の量（例えば、ヨウ化プロピジウム、ＤＡＰＩ、またはＤｒａｑ５（登録商標）などのＤＮＡ染色染料）が、この既知の容積サンプルに加えられる。この混合物は、次いで２５°Ｃ〜４０°Ｃの温度で２〜１０分インキュベートされる。
次に、赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液が加えられる。この非限定的な例では、この混合物は、次いで２５°Ｃ〜４０°Ｃの温度で２〜１０分インキュベートされる（より低温も用いられ得る）。適切な溶解緩衝液は、例えば、低張の生理食塩水溶液；低張のショ糖溶液；等張の塩化アンモニウム溶液；サポニンなどの温和な界面活性剤を含む等張の溶液；またはＲＢＣがその中で溶解する、他の緩衝液であり得る。実施形態では、そのような溶解緩衝液は、ＷＢＣの安定化を支援するためのパラホルムアルデヒドなどの固定剤を含む。サポニンなどの界面活性剤は、多数の穴が細胞膜中に形成されることを引き起こす。赤血球は、それらに特有の膜の性質に起因して、特にこの穴の形成を受け易く、および完全に溶解し、それらの内容物は、周囲の液体中に漏出する。固定剤の存在は白血球の意図しない溶解を防止する。血小板も、溶解されずに残存する。このステップの目的は、赤血球の数が、白血球に対して約１０００：１の多数になるために、前記混合物から赤血球を除去することである。血小板は、画像化を干渉せず、および従ってこのプロセスでは考慮の対象ではない。実施形態では、溶解緩衝液は、既知の濃度非蛍光ビーズも含み；これらのビーズは、サイズおよび／または濃度マーカーとして機能し得る。ＲＢＣの溶解は、この手順の後続するステップとともに、実質的に、ＷＢＣの画像化または光学的測定に対する全てのＲＢＣの干渉を除去する。
次に、前記の処理されたサンプルが分離され、この分離は、限定はされないが、処理されたサンプルを遠心分離機で、１２００ｘｇで３分間スピンするなどの任意の適切な方法により遂行される。
分離（例えば、遠心分離）に続き、上澄みが除去される；残りのペレットが、次いで再懸濁される。実施形態では、前記ペレットは、前記上澄みの一部またはすべてに再懸濁される。再懸濁されたペレットを含む既知の容積の溶液は、このステップに由来する。
所望であれば、更なる分離ステップ、および更なる再懸濁ステップ、が遂行され得る。これらのステップは、おおよそ１０倍に濃縮された、濃縮された細胞を持つサンプルを提供する（各ステップでの細胞のロスを無視して）。
再懸濁された、濃縮されたサンプル中のＤＮＡ染色染料の量が、次いで測定される。例えば、ＤＲＡＱ５（登録商標）などの蛍光ＤＮＡ染色染料からの蛍光が分光光度計において測定され得る。実施形態では、前記サンプルは、６３２ｎｍ（ＤＲＡＱ５（登録商標）の励起波長）の波長の光により照射されることができ、細胞懸濁物から放射された光は、６５０ｎｍのロングパスフィルターによりフィルターにかけられることができ、および次いで放射された光が、分光光度計において測定され得る。この発光測定は、次いでおおよその細胞懸濁物中の白血球濃度を見積もるために、あらかじめ作成された校正曲線に相関づけられる。典型的には、細胞濃度は、マイクロリットル当たり約１０００細胞〜マイクロリットル当たり約１００，０００細胞の範囲にわたる。この方法で得られたＷＢＣ数の見積もりは、サンプル中の細胞濃度が、後続する定量的測定において使用されるときに、あらかじめ定義された標的濃度の周囲の一定範囲内（例えば、２倍または他の範囲）に拘束されることを確実にするための適切な希釈因子の計算のために用いられ得る。前記サンプルは、次いで、所望の濃度範囲内のＷＢＣ濃度を持つサンプルを提供するために、計算された希釈因子に従って希釈される。
この“動的希釈”ステップの目的は、サンプル中のＷＢＣが、高すぎるかまたは低すぎる濃度で存在しないことを確実にするためである。もし細胞濃度が高すぎると、画像処理アルゴリズムの正確度が損なわれ、およびもし細胞濃度が低すぎると、不十分な細胞数がサンプル化される。本明細書において開示される濃縮されたサンプルの希釈が、所望の範囲内のＷＢＣ濃度を提供し、および分析中のサンプルからの信号が検出および分析のための最適範囲に入ることを確実にする。
加えて、この方式でのＷＢＣの数の見積もりは、サンプル中のＷＢＣの数は変化し得るが、様々な検定に必要な試薬の量は、検定されるべきサンプル中のＷＢＣの数に依存するために、サンプルに適用される更なる検定および方法のステップに必要な試薬の量の計算（小さな範囲内での）を可能にする。例えば、動的希釈手順によるＷＢＣ数の見積もりの後に、加えられるべき試薬は、異なるタイプのＷＢＣに見出される特異的な抗原を標的とする抗体を含むか、または、もしこれらの抗原が複数のタイプのＷＢＣで見出され、異なるタイプのＷＢＣに異なる量で存在する場合。サンプル中のＷＢＣの数のそのような見積もりがない場合、所定の量の染料および他の試薬が、サンプルの後続する検定において用いられなければならず、試薬の不適正な量、および不正確な、または不完全な検定結果を導く。従って、この動的希釈手順は、患者からの血液サンプルの完全な評価において、重要かつ有用な初期のステップとして機能し、これが可能でない場合に比べて、より的確かつ正確な測定が行われることを可能にする。
動的染色
本明細書のいくつかの実施形態では、細胞を含むサンプルの動的染色のための方法、システム、および機器が提供される。
細胞集団の細胞中の目的の構成要素の測定
一実施形態では、細胞サンプルを動的に染色するための方法は、サンプル中の細胞集団の細胞中の目的の構成要素の測定のための方法に関係する。
本明細書において使用される、「目的の構成要素」は、細胞中に存在し得る任意のタイプの分子を指す。「目的の構成要素」としてはタンパク質、炭水化物、および核酸が挙げられる。典型的には、「目的の構成要素」は、特定の抗原などの分子の特定の種である。細胞の「目的の構成要素」の非限定的な例は：ＣＤ５タンパク質、ＣＤ３タンパク質、などを含む。
本明細書において使用される、「細胞の集団」は、１つ以上の共通の特性に基づく任意の細胞の集団を指す。「細胞の集団」は、任意の程度の幅を有することができ、および大きな数の細胞または小さな数の細胞のみを含み得る。「細胞の集団」の非限定的な例は：赤血球（ＲＢＣ）、白血球、Ｂ−細胞、ＣＤ３４＋Ｂ細胞などを含む。
状況次第では、患者からのサンプル中の特定の細胞集団の細胞の、目的の構成要素を定量的に測定することが望ましいことがあり得る。例えば、慢性リンパ球性白血病を有する被験者からの、細胞のサンプル中のＢ−細胞（「細胞の集団」）中のＣＤ５（「目的の構成要素」）の発現の程度を測定することが望ましいことがあり得る。目的の構成要素のレベルの検出および／または測定は、抗体または単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ｓｃＦｖ）などの、特定の目的の構成要素に親和性を有するバインダー分子を含み得る。バインダー分子の使用を含む方法において、細胞中の特定の目的の構成要素のレベルを正確に測定するために、前記バインダー分子と、標的である目的の構成要素の、特定の比率または比率の範囲において、前記細胞をバインダー分子に対して曝露することが有利であり得る。例えば、細胞中の目的の構成要素の量および細胞中の目的の構成要素に結合するバインダーの量の間に線形の関係があるために、細胞のコレクションに、バインダーの量を提供することが望ましいことがあり得る。例えば、少なすぎるバインダーを提供すること（細胞中の目的の構成要素の全てに結合するためには、バインダーが不十分であるような）か、または多すぎるバインダーを有すること（バインダーが非特異的に細胞に結合するような）は、好ましくないことがあり得る。
従来の方法を用いて、前記サンプル中の細胞集団中の目的の構成要素の量を正確に測定するために、適切なレベルのバインダーをサンプルに提供することは、サンプル中の細胞集団および／または目的の構成要素のサイズが、異なるサンプルの間で大幅に変動し得るという事実により困難な場合があり得る。対照的に、本明細書で提供されるものは、広い範囲の細胞集団および目的の構成要素を含むサンプルを適応させるための、細胞サンプルを動的に染色するための方法、機器、およびシステムである。
一実施形態では、サンプル中の細胞集団中の細胞中の目的の構成要素の測定のための方法が提供される。この方法は、限定はされないが１つ以上の以下のステップを含み得る。
第一に、細胞集団の細胞中に存在するマーカーの定量的なまたは半定量的測定を得ることができる。このマーカーは、目的の細胞集団中に存在する任意のマーカーであってよく、およびそれは、目的の細胞集団にのみ存在するマーカーであり得る（すなわち、サンプル中のいかなる他の細胞のタイプには存在しない）。マーカーの測定は、その方法がサンプルを破壊しない前提で、任意の方法であることができ、および任意のシステムまたは機器を用い得る。このマーカーを認識し得るバインダーがサンプルと混合され得る。このバインダーは、バインダーの検出を促進するために結合された分子を有し得る（例えば蛍光マーカー）。一例では、このマーカーは、蛍光分光測光により検出および／または測定され得る。バインダーが蛍光標識を有し、およびマーカーが蛍光分光測光により測定される実施形態では、蛍光分光測光が、個々の細胞からの蛍光を測定するよりはむしろ、サンプルまたはその部分からのバルクの蛍光を測定するために用いられることができる。
第二に、細胞集団の細胞中に存在するマーカーの定量的なまたは半定量的測定に基づき、前記サンプル中に存在する細胞集団の細胞の、おおよその量または濃度が決定され得る。この前記サンプル中に存在する細胞集団の細胞のおおよその数または濃度は、例えば、校正曲線の使用により決定され得る。校正曲線は作成されることができ、および／または異なるマーカー／バインダーの組み合わせに対して利用可能であり得る。校正曲線は、例えば、特定のマーカーを有し、および特定のバインダーに結合した既知の数の細胞からの信号の測定により展開され得る。いくつかの実施形態では、前記サンプル中に存在する細胞集団の細胞の、おおよその量または濃度は、コンピュータの支援により決定され得る。いくつかの態様では、前記サンプル中に存在する細胞集団中の細胞の、おおよその数または濃度は、真の濃度から、たかだか約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、または５００％離れた濃度で決定され得る。
第三に、前記サンプル中に存在する細胞集団中の細胞の決定された量または濃度に基づき、サンプルに加えられるべき試薬の量を選択することができ、この試薬は、細胞集団の細胞中の目的の構成要素に特異的に結合する。この試薬は、目的の構成要素に特異的に結合する任意の分子であり得るか、またはそれを含み得る。例えば、この試薬は、抗体などのバインダーであり得る。この試薬は、それが容易に検出され得るために（例えば蛍光または発光により）および／または少なくともいくつかの状況下では、それが検出可能な信号を生成するように構成され得る。いくつかの実施形態では、この試薬は、試薬の検出を促進するために、分子に結合され得る。サンプルに加えられる試薬の量は、任意の量であってよい。いくつかの実施形態では、個々の細胞集団の細胞中の目的の構成要素のレベルおよび個々の細胞集団の細胞中の目的の構成要素に結合した試薬により生成される信号との間におおよその直線関係があるように試薬の量が、サンプルに加えられ得る。
第四に、サンプルに加える試薬の量が選択された後に、選択された試薬の量が、サンプルに加えられ得る。
第五に、目的の構成要素に結合した試薬に対してサンプル中の細胞が検定され得る。
第六に、目的の構成要素に結合した試薬の量に基づき、サンプルの細胞集団の細胞中の目的の構成要素の量が決定され得る。
いくつかの実施形態では、目的の構成要素に結合した試薬の量の測定が、サンプルの細胞集団の細胞中の目的の構成要素の量を同定するために十分であるように、第五および第六のステップが一緒に遂行され得る。
他の実施形態では、本明細書で提供されるものは、サンプルの動的染色のためのシステムおよび機器である。これらのシステムおよびは、制限なく、分光光度計および蛍光顕微鏡を含み得る。実施形態では、サンプルの動的染色のためのシステムまたは方法は、米国特許出願第１３／２４４，９４７号または１３／３５５，４５８に記載されるように構成されることができ、これらの出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、前記システムおよび機器は、細胞集団の細胞中に存在するマーカーの量の測定に基づいて、サンプル中の細胞集団の細胞中の目的の構成要素の量を決定するために、サンプルに加える試薬の量を決定するために、自動化されることができる。別の実施形態では、前記システムおよび機器は、サンプル中の細胞集団の細胞中の第二の目的の構成要素の測定に基づいて、サンプル中の細胞集団の細胞中の第一の目的の構成要素を決定するために、サンプルに加える試薬の量を決定するために、自動化されることができる。
コンテクストに基づく自動焦点
いくつかの実施形態では、コンテクストに基づく顕微鏡の自動焦点のための方法、システム、および機器が本明細書で提供される。
生物学的サンプル中の多くの臨床的に関連性のある対象のサイズ（例えば、長さ、高さ、または他の寸法）は、広い範囲に亘る。例えば、バクテリアは、通常約長さにおいて１μｍ、赤血球は、通常長さにおいて約６〜８μｍ、白血球は通常長さにおいて約μｍ１０〜１２、上皮細胞は長さにおいて約１００μｍであることができ、および円柱および結晶は長さにおいて約２００〜３００μｍであり得る。加えて、長さにおいて約１０〜４００μｍの範囲に亘り得るストランドまたはフィラメントとして存在する尿滲出液などの多くの不定形の要素がある。
顕微鏡における課題は、上述したような、様々なサイズの対象の未知および任意の成分を含む視野の的確な画像を取得することである。多くの顕微鏡対物レンズの焦点の深さは限定される（典型的には約１〜１０・ｍ）ために、視野内のさまざまな要素の正確な鮮明な画像を取得するためには、様々なサイズの要素を含む所定の視野について、所定の視野のための複数の焦点面が取得される必要があり得る。多くの従来の自動焦点方法に伴う問題は、支配的な特性の鮮明さが最大化され得るために、それらが、視野中の支配的な特性に焦点を合わせるために設計されておいることである。そのような方法は、サンプル中の様々なサイズの要素の捕捉のためには効果的ではない。
一実施形態では、顕微鏡のために、既知のサイズの参照粒子をサンプルと混合することを含むコンテクストに基づく顕微鏡の自動焦点のための方法が提供される。実施形態では、２つ以上の参照粒子がサンプルに加えられる；好適には、そのような参照粒子のすべて、または実質的に全ての、同じ既知のサイズである。実施形態では、サンプルの特定の容積に加えられる参照粒子の数は既知である。この参照粒子は、顕微鏡法の間に検出されることができ、および焦点調節を達成するために用いられる。焦点合わせを達成するための参照粒子の使用により、焦点面は、全体の画像組成から独立して選択され得る。一態様では、前記方法は、未知の要素の組成を有するサンプルへの焦点調節を達成するために有用である。別の態様では、前記方法は、顕微鏡または顕微鏡に関連するハードウエアの的確性とは無関係に、的確な焦点面の生成を支援できる。例えば、焦点面が視野内の参照粒子の鮮明さからのフィードバックに基づいて選ばれるとき、焦点調節ハードウエアの正確性または的確性のレベルに無関係に、サンプル中の様々な要素への的確な焦点調節が達成されることができる、［例えば顕微鏡対物レンズの作動、サンプルホルダーの形状（例えばキュベットまたはスライド）、またはサンプルホルダーの不均一性］。
実施形態では、参照粒子は、顕微鏡法の間粒子の検出を容易にする分子を含むか、またはそれにより標識され得る。一実施例では、参照粒子は蛍光分子により標識されるか、またはそれを含むことができる。この蛍光分子は、光の第一の波長で光を吸収し、および光の第一の波長の吸収に応えて、それは第二の波長の光を放出する。実施形態では、参照粒子と混合されたサンプルは、目的の参照粒子中の蛍光分子を励起する能力のある光の波長に曝露されることができ、および蛍光分子から放射される光が測定され得る。参照粒子からの特異的な蛍光は、参照粒子を検出するために用いられることができ、および検出されたサンプル中の参照粒子からの情報は、自動焦点調節に用いられ得る。
参照粒子は、球状または直方体などの任意の形状であり得る。参照粒子は、制限なく、ビーズおよびマイクロスフェアであってよい。参照粒子は約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μｍの直径または長さなどの任意のサイズであり得る。参照粒子は、ポリスチレン、ポリエチレン、ラテックス、アクリル、またはガラスなどの任意の適切な物質から形成されるか、またはそれらを含み得る。例えば、参照粒子はポリスチレン・ビーズ、例えば約０．１μｍ〜約５０μｍ；または約１μｍ〜約２０μｍ；または約５μｍ〜約１５μｍ；の直径を有するか、または約１０μｍの直径を有するポリスチレン・ビーズであってよい。
一実施形態では、顕微鏡の焦点調節のための方法が提供され、この方法は以下のステップの１つ以上を含み得る。第一に、顕微鏡的分析のための対象（例えばバクテリア、赤血球、など）を含むサンプルが参照粒子と混合され得る。この参照粒子は、前記粒子の検出を容易にする蛍光色素分子などの分子を含むか、またはそれにより標識され得る。第二に、前記参照粒子およびサンプルを含む混合物が、顕微鏡の光路内の、例えばキュベットまたはスライド中にに位置付けられることができる。随意的に、前記参照粒子は、キュベットまたはスライドの、サンプルに当接している最も低い表面の上で休止するように、キュベットまたはスライド中のサンプルの底まで沈むことができる。前記顕微鏡は、蛍光顕微鏡を含む任意のタイプのものであり得る。第三に、前記混合物は、参照粒子を可視化するために構成された光線に曝露され得る。前記光線は任意のタイプでよく、および参照粒子に対して任意の配向であってよい。例えば、この光線は、参照粒子内の、またはそれに結合した蛍光色素分子を励起させる能力のある波長であることができる。参照粒子の光線への曝露は、例えば、参照粒子からの特定の波長にある光の生成、および放射および／または参照粒子からの光の散乱を生じ得る。第四に、前記参照粒子から放射または散乱された光は、顕微鏡により検出されることができ、およびこの情報は、参照粒子の混合物内での位置の決定および／または顕微鏡の焦点を合わせるために用いられ得る。随意的に、この顕微鏡は、参照粒子と同様のサイズの対象に適した焦点面中に、焦点を合わせることができる。顕微鏡からの画像は、画像センサーにより取得され得る。この画像は保存されおよび／または画像分析のために用いられる。
いくつかの実施形態では、複数の参照粒子がサンプルに加えられることができる。この参照粒子はすべて同じサイズであり得るか、またはそれらは異なるサイズであってよい。いくつかの実施形態では、異なるサイズの参照粒子が、異なる蛍光色素分子を含む。異なる蛍光色素分子は、異なる吸収波長、異なる放射波長、または両方を持つことができる。
実施形態では、２つ以上の既知のサイズの参照粒子を顕微鏡法のためのサンプルと混合することを含み、少なくとも参照粒子の２つは異なるサイズであり、および異なる蛍光色素分子を含む、顕微鏡の焦点調節のための方法が提供される。この方法は、以下のステップの１つ以上を含み得る。第一に、顕微鏡的分析のための対象を含むサンプルを２つ以上の参照粒子と混合させることができ、少なくとも参照粒子の２つは異なるサイズであり、および異なる蛍光色素分子を含む（すなわち、“第一の参照粒子”および“第二の参照粒子”）。第二に、前記参照粒子およびサンプルを含む混合物を顕微鏡の光路内に位置付けることができる。前記顕微鏡は、蛍光顕微鏡を含む任意のタイプのものであり得る。第三に、前記混合物は、第一の参照粒子を可視化するために構成された光線に曝露され得る。前記光線は任意のタイプでよく、および第一の参照粒子に対して任意の配向であってよい。例えば、この光線は、第一の参照粒子内の、またはそれに結合した蛍光色素分子を励起させる能力のある波長であることができる。第一の参照粒子の光線への曝露は、例えば、参照粒子からの特定の波長にある光の生成、および放射および／または第一の参照粒子からの特定の波長の光の散乱を生じ得る。第四に、前記第一の参照粒子から放射または散乱された光は、顕微鏡により検出されることができ、およびこの情報は、第一の参照粒子の混合物内での位置の決定および／または顕微鏡の焦点を第一の参照粒子と同様のサイズの対象に適した第一の焦点面に合わせるために用いられ得る。随意的に、第一の焦点面の画像は画像センサーにより取得され得る。この画像は保存されおよび／または画像分析のために用いられる。第五に、前記混合物は、第二の参照粒子を可視化するために構成された光線に曝露され得る。前記光線は任意のタイプでよく、および第二の参照粒子に対して任意の配向であってよい。第二の参照粒子の光線への曝露は、例えば、参照粒子からの特定の波長にある光の生成、および放射および／または第二の参照粒子からの特定の波長の光の散乱を生じ得る。第六に、前記第二の参照粒子から放射または散乱された光は、顕微鏡により検出されることができ、およびこの情報は、第二の参照粒子の混合物内での位置の決定および／または顕微鏡の焦点を第二の参照粒子と同様のサイズの対象に適した第二の焦点面に合わせるために用いられ得る。随意的に、第二の焦点面の画像は画像センサーにより取得され得る。この画像は保存されおよび／または画像分析のために用いられる。
他の実施形態では、本明細書で提供されるものは、コンテクストに基づく顕微鏡の自動焦点のためのシステムおよび機器である。このシステムおよび機器は、制限なく、蛍光顕微鏡を含み得る。実施形態では、このシステムおよび機器は、混合物を形成するために、既知のサイズを有する参照粒子を顕微鏡的分析のためのサンプルに加えるために、この混合物を顕微鏡の光路内に位置付けするために、この混合物を、参照粒子を可視化するために構成された光線に曝露するために、混合物内の参照粒子の位置を決定するために、および／または混合物内の参照粒子の位置に基づいて、顕微鏡の焦点を合わせるために、自動化され得る。実施形態では、コンテクストに基づく顕微鏡自動焦点のためのシステムまたは方法は、米国特許出願第１３／２４４，９４７号または１３／３５５，４５８に記載されるように構成されることができ、これらの出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
サンプルホルダーの位置付け
いくつかの実施形態では、サンプルホルダー、またはその部分、もしくはその上の指示マークの位置を決定するための、方法、システム、および機器が本明細書で提供される。そのような決定は、好適には的確な決定であり、およびサンプルホルダーが除去されるか、または視野が変更された（例えば、焦点を変更することにより、またはサンプルホルダー中の異なる領域の検査により）後でさえ、サンプルホルダー中の視野内の細胞、粒子、または他の対象を同定するために有用である。
実施形態では、画像に基づくフィードバック機構が、キュベット内の特定の位置、例えば、チャネル内またはサンプルを含む他の領域（例えば、図７および８に示される分析領域６０８を参照）を、正確におよび的確に決定するために用いられることができる。そのような決定は、特にサンプルホルダーが移動され、および次いで元の場所に戻される場合、そのような移動の前および移動の後に取得された画像および光学的測定の比較のために重要である。複数のソースからの変動性は、画像化システムの軸に対するサンプルの位置に影響することができ；例えば、キュベット部分内の変動性、キュベット組立品内の変動性、画像化システム上のキュベットの位置調整における変動性、および他の可能な変動性の源が、前記サンプルホルダー内の同じ位置にサンプルがとどまっていてさえも、画像化システムに関するサンプルの位置に影響を与え得る。画像化システムに関するサンプルホルダーの位置の同定および特徴化のための方法が本明細書において開示される。例えば、正確におよび再現可能にキュベット中の目的の領域を撮像するために、キュベット登録プログラムが作動する。実施形態では、そのようなプログラムは、あらかじめ定義されたサンプルホルダー中の位置で撮影された画像を分析することにより開始するが、あらかじめ定義された位置は、視野内の登録特性または基準マーカーに近く、またはさもなければプログラムにより検出可能である。キュベット登録プログラムは、画像処理プログラムを含み、画像処理プログラムが、画像中の基準マーカーの存在を探索し、およびはい／いいえ（検査された領域内で、基準マーカーが見出されたか否かに関する）のいずれかの回答、またはマーカーが画像内にある可能性を返す。基準マーカーが検査された領域内に見出されない例では、次いでサンプルホルダー上またはサンプルホルダー内の異なる位置に、検査領域を移動して、および画像化を繰り返す検索アルゴリズムが使用される。このプロセスは、プログラムが基準マーカーを見出すまで（すなわち、検査された領域内に基準マーカーが見出された否かの質問に対して「はい」を得るまで、またはマーカーがその領域内にある可能性を最大化するまで）繰り返される。いったん基準マーカーの位置が同定されると、サンプルホルダーの寸法およびレイアウトが既知であるために、サンプルホルダー内またはサンプルホルダー上の全ての他の位置が決定され得る。従って、基準マーカーの位置の同定に続き、従って目的のポイントの位置も既知になるために（すなわち、基準マーカーからの距離および配向が知られ、および基準マーカーの位置が知られているために、目的の点も知られるので）画像化のための任意の目的のポイントが見出され、および撮像され得る。実施形態では、基準マーカーは、前記キュベット自身の上の、任意の所望の許容範囲内で、各部品に対して同じ位置に製造されることのできる、特別に改変された特性（例えば、孔、突起、印刷もしくは成形されたパターン、または他の特性）であるか、またはそれらを含むことができる。実施形態では、基準マーカーは、目的の点から常に固定された距離にある前記キュベットの特性（例えば、チャネルの端）であり得るか、またはそれを含み得る（例えば、この基準マーカーが、チャネルの端にある場合、この基準マーカーは、常に、チャネルの中心軸から固定距離にある）。
細胞の計数／細胞の数え上げ
いくつかの実施形態では、サンプル中の細胞を数え上げるための方法、システム、および機器が、本明細書で提供される。
細胞を含むサンプル染色のための特定の従来の方法は、サンプル（例えば血液）の特定の容積を染色剤の特定の濃度または量で染色することを含む。これは「容量染色」（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｓｔａｉｎｉｎｇ）と称される。容量染色は、以下を含む多数の欠点を有する：（ｉ）異なる被験者の間の細胞亜集団における正常な変異（例えば異なる健常被験者は、大きく異なる数のＣＤ３＋Ｔ細胞などの細胞の亜集団を有することができる（ここで“ＣＤ３＋”は、Ｔ細胞がＣＤ３マーカーを発現することを示す））に取り組むことに失敗している、および（ｉｉ）健常サンプルに比較すると、病理学的サンプルが劇的に異なる細胞の組成を有し得る（例えば血液中のＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセントおよび数は、Ｔ細胞白血病の患者では健常被験者のパーセントおよび数よりも大幅に上昇する）ことに取り組むのに失敗している。
細胞を含むサンプルの正確でおよび再現性のある染色のために、細胞の染色剤（例えばＤＮＡ染料、抗体、バインダー、など）の特異的な量を細胞の特異的な数または濃度に加えることが望ましい。例えば、白血球のための特定の染色剤の０．２マイクログラムを、サンプル中の１０００個の白血球当たりに加えることが望ましい。染料と細胞のインキュベーション期間の後に、過剰の（結合されていない）染料を除くためにサンプルは洗浄されることができ、顕微鏡法のための適切な細胞密度に調製され、および撮像される。この様式で、特定の細胞数について、染色剤および染色手順が最適化または正規化され得る。
一実施形態では、サンプル中の目的の細胞の数を数え上げるための方法が提供される。この方法は、以下のステップまたは要素の１つ以上を含み得る。サンプル中の目的の細胞に結合する第一の染色剤が、サンプルに加えられることができる。第一の染色剤およびサンプルの混合物はインキュベートされ得る。第一の染色剤およびサンプルの混合物中の細胞は、過剰の（結合されていない）染色を除くために洗浄され得る。洗浄された第一の染色剤で染色された細胞は、更なる分析のために、所望の容積に調製され得る。洗浄された第一の染色剤で染色された細胞は、分光光度計により分析され得る。分光光度計からのデータは、サンプル中のおおよその細胞数を数えるために用いられ得る。例えば、第一の染色剤は核酸に結合する蛍光染料であることができ、および前記分光光度計は、前記蛍光染料の励起波長の光を放射する光源、および前記蛍光染料の放射波長の光を検出できる光センサーを含むことができる。この実施例では、染料からの蛍光信号に基づき、サンプル中の核酸のおおよその量が計算されることができ、およびこのサンプル中の核酸のおおよその量から、サンプル中の細胞のおおよその数が決定され得る。サンプル中の細胞数に基づき、サンプル中の目的の細胞に結合する第二の染色剤がサンプルに加えられることができる。実施形態では、サンプルに加えられる第二の染色剤の量は、第一の染色剤を用いて決定されたおおよその細胞数を考慮して決定され得る。実施形態では、細胞当たりの第二の染色剤の所望の比率を得るために、サンプルに加えられる第二の染色剤の量は、第一の染色剤を用いて決定された細胞数を用いて計算され得る。第二の染色剤およびサンプルの混合物はインキュベートされ得る。第二の染色剤およびサンプルの混合物中の細胞は、過剰の染色剤を除去するために洗浄され得る。洗浄された第二の染色剤で染色された細胞は、更なる分析のために、所望の容積に調製され得る。洗浄された第二の染色剤で染色された細胞は、顕微鏡法により分析され得る。
細胞の倍数性の決定に先立つサンプル中の細胞の数え上げ
一実施形態では、細胞の倍数性の決定に先立って、サンプル中の細胞を数え上げる方法が提供され、この方法は、以下のステップまたは要素の１つ以上を含む。サンプル中の目的細胞に結合しおよびＤＮＡ染料の発光からスペクトル的に区別できる第一の染色剤がサンプルに加えられ得る。この目的の細胞は、例えば、白血球であり得る。前記第一の染色剤は、例えば、蛍光分子にコンジュゲートされた抗体であり得る。蛍光分子にコンジュゲートされた抗体は、例えば、広範に発現された抗原（例えばＣＤ４５）に結合できるか、または細胞の特異的な亜集団（例えばＴ細胞に対するＣＤ３）により発現される抗原に結合し得る。第一の染色およびサンプルの混合物はインキュベートされ得る。第一の染色剤およびサンプルの混合物中の細胞は、過剰の（結合されていない）染色剤を除去するために洗浄され得る。洗浄された第一の染色剤で染色された細胞は、更なる分析のために、所望の容積に調製され得る。洗浄された第一の染色剤で染色された細胞は、分光光度計により分析され得る。分光光度計からのデータは、サンプル中のおおよその細胞数を数えるために用いられ得る。サンプル中の細胞数に基づき、サンプル中の目的の細胞に結合する第二の染色剤がサンプルに加えられることができる。第二の染色剤はヨウ化プロピジウムまたは４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（“ＤＡＰＩ”）などのＤＮＡ染料であり得る。実施形態では、サンプルに加えられる第二の染色剤の量は、第一の染色剤を用いて決定されたおおよその細胞数を考慮して決定され得る。実施形態では、細胞当たりの第二の染色剤の所望の比率を得るために、サンプルに加えられる第二の染色剤の量は、第一の染色剤を用いて決定された細胞数を用いて計算され得る。第二の染色剤およびサンプルの混合物はインキュベートされ得る。第二の染色剤およびサンプルの混合物中の細胞は、過剰の染色剤を除去するために洗浄され得る。洗浄された第二の染色剤で染色された細胞は、更なる分析のために、所望の容積に調製され得る。洗浄された第二の染色剤で染色された細胞は、倍数性について顕微鏡法により分析され得る。
細胞の倍数性の決定のための方法では、細胞の倍数性に関する正確および一貫したデータを生成するために、倍数性分析のための所定の細胞数をＤＮＡ染色剤の特定の量または濃度と組み合わせることが重要である。一実施例では、血液の容積当たりの白血球数は、健康な集団中で変動でき、および従って、倍数性分析のために白血球の染色を試みる前に血液の容積中の白血球数を決定することが望ましい。
上記で提供される細胞の倍数性の決定のための方法は、細胞の核酸含量に関係する属性を決定する前に、サンプル中の細胞を数えることが望ましい任意の方法のためにも遂行されることができる。例えば、上記の方法は、細胞の核の形態学、細胞の核のサイズ、核領域の全体の細胞領域に対する比率などを決定するのに先立ち、サンプル中の細胞を数えることを含む方法と用いることができる。
細胞表面染色に先立つサンプル中の細胞の数え上げ
一実施形態では、細胞 表面 染色に先立ちサンプル中の細胞を数える方法が提供され、 この方法は、以下の ステップまたは要素の１つ以上を含む。 サンプル中の目的細胞に結合しおよびＤＮＡ染料の発光からスペクトル的に区別できる目的の細胞表面の染色に用いられる、第一の染色剤がサンプルに加えられ得る。この目的の細胞は、例えば、白血球であり得る。第一の 染色 剤は、 例えば、 ＤＮ染料 （例えば ヨウ化プロピジウム、 ＤＲＡＱ５（登録商標）またはＤＡＰＩ）であり得る。 第一の染色およびサンプルの混合物はインキュベートされ得る。第一の染色剤およびサンプルの混合物中の細胞は、過剰の（結合されていない）染色剤を除去するために洗浄され得る。洗浄された第一の染色剤で染色された細胞は、更なる分析のために、所望の容積に調製され得る。洗浄された第一の染色剤で染色された細胞は、分光光度計により分析され得る。分光光度計からのデータは、サンプル中のおおよその細胞数を数えるために用いられ得る。サンプル中の細胞数に基づき、サンプル中の目的の細胞に結合する第二の染色剤がサンプルに加えられ得る。実施形態では、サンプルに加えられる第二の染色剤の量は、第一の染色剤を用いて決定されたおおよその細胞数を考慮して決定され得る。実施形態では、細胞当たりの第二の染色剤の所望の比率を得るために、サンプルに加えられる第二の染色剤の量は、第一の染色剤を用いて決定された細胞数を用いて計算され得る。第二の染色剤は例えば、蛍光分子にコンジュゲートされた抗体であり得る。蛍光分子にコンジュゲートされた抗体は、例えば、広範に発現された抗原（例えばＣＤ４５）に結合できるか、または細胞の特異的な亜集団（例えばＴ細胞に対するＣＤ３）により発現される抗原に結合し得る。第二の染色剤およびサンプルの混合物はインキュベートされ得る。第二の染色剤およびサンプルの混合物中の細胞は、過剰の染色剤を除去するために洗浄され得る。洗浄された第二の染色剤で染色された細胞は、更なる分析のために、所望の容積に調製され得る。洗浄された第二の染色剤で染色された細胞は、細胞表面抗原について顕微鏡法により分析され得る。
細胞の細胞表面抗原染色のための方法では、細胞表面の内容物に関する正確および一貫したデータを生成するために、分析のための所定の細胞数を細胞表面抗原染色剤の特定の量または濃度と組み合わせることが重要である。一実施例では、健康な集団において血液の容積当たりの白血球数が変化することができ（健常被験者からの血液は、典型的にはμＬ当たり約３０００〜１０，０００のＷＢＣを有する）、および従って、細胞表面抗原のために白血球を染色するに先立ち血液の容積中の白血球の数を決定することが望ましい。別の例では、血液の容積当たりの白血球数は、健常および病気の被験者の間で異なることができ（例えば、リンパ腫患者はμＬの血液当たり最大１００，０００ＷＢＣを有し得る）、および従って、細胞表面抗原のために白血球の染色を試みる前に血液の容積中の白血球数を決定することが望ましい。
従って、理論的な例として、健康な患者がマイクロリットルの血液当たり５０００細胞を有することができ、およびこれらの５００がＣＤ３＋Ｔ細胞であり、一方リンパ腫患者がマイクロリットルの血液当たり５０，０００細胞を有することができ、およびこれらの４５，０００がＣＤ３＋Ｔ細胞。もし１００マイクロリットルの血液が従来法により染色されると、従って健常被験者からのサンプルは約５００，０００の全細胞を含み、そのうち約５０，０００細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞である。リンパ腫被験者からの１００マイクロリットルのサンプルは、約５，０００，０００の全細胞を含み、そのうち約４，５００，０００細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞である。個の理論的な例では、前記病理学的サンプルは、健常被験者からのサンプルと比べた時に、１０倍の数の全細胞および９０倍の数の数ｏｆＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。もし病理学的サンプルが、健常被験者からのサンプルに対して最適化された従来の「容量染色」アプローチで染色される場合、リンパ腫被験者からのサンプルは不十分に染色され得る。このため、例えば、サンプル中の細胞数の事前の見積もりがサンプルに適用される染料の量の調節のために用いられる本発明の方法は、従来の容量染色方法に優る利点を提供する。
従って、本明細書で提供される方法は、サンプルに関する正確なおよび／または一貫したデータを生成するために、細胞染色の前に、サンプル中の細胞を数えるために用いられることができる。
方法の速度
本明細書で提供される方法、システム、および機器は、サンプル分析結果の迅速な取得を支援し得る。方法本明細書で提供される方法は、分析結果を方法の開始から、例えば、約６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、４５分、３０分、１５分、１０分、または５分未満で提供し得る。
迅速な分析結果は、患者の治療、診断、または監視に関係するリアルタイムの情報を提供するために用いられ得る。例えば、迅速な分析結果は、患者を手術する外科医の治療決断を導くために用いられ得る。手術の間、外科医は、分析のために、患者から生物学的サンプルを取得できる。本明細書において提供される方法により、サンプルの迅速な分析を受け取ることにより、外科医は、手術のコースの間に治療決断を下し得る。
別の例では、本明細書で提供される方法、システム、および機器により提供される迅速な分析結果は、ポイント・オブ・サービスにいる患者により提供される生物学的サンプルに関する情報を、患者が生物学的サンプルを提供したポイント・オブ・サービス位置を訪問している間に、患者が受け取ることを支援する。
例えば、出願人は、本明細書において、複数のマーカーおよび細胞タイプの存在のための、白血球の分析のための全血のサンプルを調製するために用いられ得る迅速な検定について記載する。そのような検定は、画像化分析のための全血のサンプルの調製のために有用である；このサンプルは、約２０分未満、または約１５分未満で画像化のための準備ができている。
迅速な全血からの白血球検定
この検定は、血球計算の白血球の分析のための全血サンプルを、約１５分未満または約２０分未満で調製する。血球計算のＷＢＣ分析が全血から約３０分以下遂行され得るように、そのような調製された細胞の自動化された血球計算の分析も迅速になされ得る。加えて、この検定は、小さな容積の血液サンプルのみを用いるので、資源を消費しないで済み、およびより多くの容積の血液を要する検定よりも、被験者への不便さが少なく、または不快さが少ない。
この検定で用いられる試薬は：リン酸緩衝生理食塩水、Ｌｙｓｅ Ｆｉｘ緩衝液、ビーズ、再懸濁緩衝液、および染料および染料にコンジュゲートされた抗体を含む試薬カクテルを含む。この抗体は特異的なＷＢＣマーカーを指向する。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：１３７ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＫＣｌ、８ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨはｐＨｔｏ７．２〜ｐＨ７．４に調整される（ＨＣｌにより）。
再懸濁物緩衝液（ＲＳＢ）：５％ウシ血清アルブミンＰＢＳ溶液。
Ｌｙｓｅ Ｆｉｘ緩衝液：１０％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含む０．０２６６％サポニンＰＢＳ溶液であり、“％”はグラム／１００ｍＬ（最終比率はおおよそ１３：１サポニンＰＢＳ：ＰＦＡ）。
試薬カクテル１：０．２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中のＤＲＡＱ５（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｌｕｅＴＭ染料にコンジュゲートされた抗ＣＤ１４抗体、Ｆｃブロック（例えば、マウスＩｇＧなどのイムノグロブリン）。
試薬カクテル２：１５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中の、フィコエリトリン（ＰＥ）染料にコンジュゲートされた抗ＣＤ１６抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７染料にコンジュゲートされた抗ＣＤ４５抗体、ＰＥＣｙ５染料にコンジュゲートされた抗ＣＤ１２３抗体、Ｆｃブロック（例えば、イムノグロブリン）。
検定ステップは以下を含む：
被験者から全血を得る。
５０μＬの全血をチューブに配置する。所望の場合、この血液サンプルは、直接チューブへ取得され得る。ここで、５０μＬは、被験者から採取された血液の全量であり、次いでサンプル全量がチューブに加えられるかチューブに取得され；５０μＬを超える量が被験者から採取されるときは、この５０μＬはサンプルの等分になる。
サンプルを１２００ｘｇで３分間遠心分離する。
チューブから２０μＬの血漿を取り除く。
チューブをヒートブロック上に配置する（温度を３７°Ｃに上昇させるために）、２０μＬのＲＳＢを加え、および完全に混合する。
カクテル１（おおよそ５μＬ）を加える。（実施形態では、カクテル１は直接全血に加えられることができ、および遠心分離の前のステップである、血漿の等分の除去およびＲＳＢによる置換は省略され得る。）
サンプルを３７°Ｃで２分間、インキュベートする。
Ｌｙｓｅ Ｆｉｘ緩衝液（（Ｌｙｓｅ Ｆｉｘ緩衝液）対（染色された血液）の６：１の比率で；おおよそ３００〜３５０μＬ）を加える。焦点調節のための標的（参照粒子）を提供するために、およびサンプル濃度の校正を提供するために（例えば、「コンテクストに基づく自動焦点」の項目で上述のように）、既知の濃度のビーズが、Ｌｙｓｅ Ｆｉｘ緩衝液に含まれ得る。約１ミクロン〜約３０ミクロンの直径を有する、ポリスチレンまたは他のビーズが用いられ得る。例えば、マイクロリットル当たり約１００ビーズ〜約２０００ビーズの濃度の１０ミクロンのポリスチレンビーズが用いられ得る。
Ｌｙｓｅ Ｆｉｘ緩衝液を３７°Ｃで合計３分間インキュベートする；前記緩衝液の添加の約１．５分後に、この溶液を上下に５回ピペッティングして混合する。
サンプル混合物を１２００ｘｇで３分間遠心分離する。
上澄み液（おおよそ３５０μＬ）を除去する。上澄み液を、後続するステップで容積を調整する必要がある場合には保存する。
最終混合物を提供するためにカクテル２（おおよそ１５μＬ）を加える。
最終混合物をあらかじめ暖められた画像化キュベット（３７°Ｃ）上に充填する。
画像化の前に、前記キュベットを３７°Ｃで５分インキュベートする。
サンプルを撮像する。
従って、サンプルは約１５分未満で画像化の準備ができる。実施形態では、ステップのいくつかは短縮され得る（例えば、代替的な実施形態では、遠心分離ステップまたはインキュベーション・ステップが短縮され得る）。上記で開示された方法は、複数の染料を含むカクテルを用いてサンプルを調製するので、いくつかの細胞タイプのマーカーの存在についての、これらのサンプルの分析も単一の視野内で、遂行されることができ、努力の最小限の重複を伴う効率的なサンプルの画像化を提供する。これらの同じ視野の光散乱画像は、サンプル画像分析のいくつかのモードのために別個のサンプルまたは別個の視野を必要とすることなく、効率的に適用され得る、分析の更に別の態様を提供する。既知のサイズの参照粒子の包含は、自動的焦点調節の使用を可能にすることにより、更に画像化を支援し、および、参照粒子の濃度が既知であるために、各画像中のサンプル希釈および細胞濃度の独立した測定を提供する。
調製されたサンプルの画像化も迅速に行われ得る；本明細書、および例えば、米国特許出願第１３／２４４，９４７号、米国特許出願第１３／７６９，７７９号、および関連する出願において記載される特性を有する自動的機器により、そのような画像化は、例えば、約１０分（典型的には約２分〜約１２分で）で遂行され得る。従って、実施形態では、血液サンプルの調製および調製されたサンプルの画像化を含む全体の分析は、約３０分以下で遂行され得る。
上記で議論された方法（および以下で議論される同様の方法）により調製されたサンプルから得られた画像および画像分析は、全血からＷＢＣの異なる集団を同定するために適切である。同じサンプルに対する、そのような同定および定量化は、異なる波長の光によるサンプルの照明（例えば、順次の）、ならびに結果として生成する画像および光強度の記録および分析により迅速になされる。そのような方法は、例えば、図９、１０、および１１に示される、本明細書において開示される方法（例えば、上記および下記の両方で議論される方法）を用いて調製される、画像およびプロットを提供するために適切である。図１２に示される比較は、これらの方法が正確でおよび信頼性のあること、ならびに他の方法（例えば、図１２に示される参照分析機器である、Ａｂｂｏｔｔ ＣＥＬＬ−ＤＹＮ
Ｒｕｂｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、アメリカ合衆国イリノイ州レークフォレスト（Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ）））と良好に相関することを実証する。
病理学 サンプルの分析
方法本明細書で提供されるいかなる方法も、細胞を含む病理学サンプルを分析するために用いられ得る。病理学サンプルが組織サンプルである場合、そのサンプルは、組織の細胞を本明細書において提供される方法による分析のための、個別の細胞に分離するために処理され得る。
方法本明細書で提供されるいかなる方法による、病理学サンプルの分析も、迅速な病理学分析、および病理学分析結果の患者のための治療決断への迅速な統合を支援し得る。
分析結果への対応における追加的な手順
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される機器およびシステムは、本明細書において提供される分析方法により得られる結果への対応における追加的な手順を引き起こすために構成され得る。
一実施例では、機器またはシステムは、結果が予測範囲の外側にある場合に、ユーザーに警告を提供するためにプログラムされ得る。この警告は、ユーザーまたは医療関係者に、例えば、手動でサンプルを分析する、正常作動のために機器またはシステムを点検するなどを促す。
別の例では、機器またはシステムは、結果が特定の範囲の中または外にある場合にサンプルについて１つ以上の追加的な試験を自動的に行うためにプログラムされ得る。いくつかの実施例では、本明細書で提供される機器およびシステムは、複数の異なる検定を遂行する能力があり、およびこの機器またはシステムは、本明細書において提供される方法により生成される結果の確認または更なる調査のために、追加検定を行い得る。
非特異的な染料を用いる分析
画像化を加速するための１つの非限定的な例は、細胞が非常に高い濃度の染料で標識されるときに「最も明るい」（ｈｉｇｈ ｌｉｇｈｔ）状況を用いることである。本発明の実施形態では、ＤＮＡ、膜、または細胞の他の部分を標識する非特異的な染料が用いられる。この実施例は、特異的およびまれなタンパク質または他のマーカーを標的とする抗体染料は使用しない。
非特異的な染料により、分離ステップ（例えば、遠心分離による分離または物理的分離を遂行することによるなどの）を必要とすることなく細胞の情報を得ることが可能である。この分離ステップなしで、より迅速に、限定はされないが、ａ）赤血球（ＲＢＣ）などの非標的細胞、およびｂ）白血球（ＷＢＣ）などの標的細胞または目的の対象の両方を含むことができる、細胞のより大きな領域の画像化などのサンプルの画像化に直接移動することができる。従って、血液サンプルの画像化の１つの制限しない実施例では、血液サンプル中の５００万のＲＢＣおよび５千または他の数のＷＢＣを画像化し得るにおいて。標的とされる細胞は、限定はされないが細胞核の形状などの、細胞の内容物に基づいて識別され得る。一実施形態では、核染色が、サンプル中の細胞の核を染色するために用いられ、および特定の細胞が有する染色の種類および量に基づき（例えば、核染色の存在、または染色された核の形状、または他の特性）、この染色に基づいて、この染料が非特異的であってさえ、その細胞タイプを決定することができる。他の実施例では、細胞の他の内部形状（例えば、細胞質が微小体またはその中の他の対象を有するか否かなどの）が、指示的または特性的であることができ、およびサンプル中の細胞の同定および定量のために用いられ得る。尿サンプルについて、サンプルに存在するなんらかの細胞、および結晶形状が、サンプルの同定および異常が見出されるかいなかを決定するために用いられ得る。この様式で、非特異的な染料の使用は、細胞を要望通りに決定するために用いられ得る様式において、迅速に細胞を画像化するために用いられ得る。
複数の励起および／または検出チャネルを用いる分析
血球計算のために、更に少ない量のサンプル容積を用いる文脈において、先進的な血球計算検定の実施形態では、追加的な励起および／または検出波長が用いられ得る。例えば、リンパ球のサブセット検定におけるＷＢＣの分類のために、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｋ細胞、および他の細胞などの様々な細胞が計数される。この場合では、２つのマーカーを、ただ単にその細胞がリンパ球であることを同定するために用いる。血液サンプル中の細胞を更に亜分類するために、例えば、再び２つのマーカーを用いる。従って、２つの色だけを同時に検出できるシステムがあれば、それは分析のための波長の数には不十分である。
一実施形態では、２つの別々のサンプル部分を作成し、および次いで、１つの部分において１つの組み合わせを画像化し、およびシステムの別の部分において別の組み合わせを画像化し、サンプルの異なる部分を使用するために、サンプルを等分し得る。残念なことに、このことは、容積および時間を２倍にすることを引き起こす。システムの中に構築されるチャネルはより独立しているほど、使用されるこれらのサンプル部分または容積の数はより少なくなる。
細胞処理
実施形態では、画像化、検査、および分析のために生物学的サンプルを処理することが、しばしば有用である。例えば、画像化、検査、および分析のために細胞を含む生物学的サンプルを処理することが、しばしば有用である。
生物学的サンプルの処理は、前処理（例えば、後続する処理または測定のためのサンプルの調製）、処理（例えば、元のまたは以前の状態から異なることができるようなサンプルの変更）、および後処理（例えば、その測定または使用後にサンプルの全部または一部の廃棄）を含み得る。生物学的サンプルは、血液または尿サンプルの等分など、または薄切りにする、刻む、もしくは組織サンプルを２つ以上の片に分割するなど、部分に分割され得る。血液サンプルなどの生物学的サンプルの処理は、混合、撹拌、超音波処理、均一化、またはサンプルもしくはサンプルの一部分の他の処理を含み得る。血液サンプルなどの生物学的サンプルの処理は、サンプルまたはその部分の遠心分離を含み得る。血液サンプルなどの生物学的サンプルの処理は、サンプルの構成要素が分離または沈殿するための時間を提供することを含むことができ、およびろ過（例えば、サンプルまたはその部分をフィルターを通して通過させる）を含み得る。血液サンプルなどの生物学的サンプルの処理は、血液サンプルが凝集することを可能にするか、または引き起こすことを含み得る。血液サンプルなどの生物学的サンプルの処理は、ペレットおよび上澄み液を提供するために、サンプルまたはサンプルの一部分（例えば、血液サンプルまたは組織サンプルからの組織のホモジネートを含む溶液の沈降もしくは遠心分離により）の濃縮を含むことができる。血液サンプルなどの生物学的サンプルの処理は、サンプルの一部分の希釈を含み得る。希釈は、サンプルからのペレットまたは上澄み液の希釈を含む、サンプル、またはサンプルの一部分の希釈を含み得る。生物学的サンプルは、水または緩衝化生理食塩水溶液などの生理食塩水溶液により希釈され得る。生物学的サンプル固定剤（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、またはタンパク質を架橋する他の薬剤）を含んでも、または含まなくてもよい溶液により希釈され得る。生物学的サンプルは、細胞容積が変更されるための、効果的な浸透勾配を、細胞の周囲の溶液および内部、または内部の区画の間に生成するために効果的な溶液により希釈され得る。例えば、希釈後に、結果として生成する溶液の濃度が、細胞の内部または細胞内部の区画の効果的な濃度未満であると、そのような細胞の容積は増加する（すなわち、この細胞は膨張する）。生物学的サンプルは、浸透圧調節物質（例えば、グルコース、ショ糖、または他の糖；ナトリウム、カリウム、アンモニウムまたは他の塩などの塩；または他の浸透圧的に活性な化合物または構成要素）を含んでも、または含まなくてもよい溶液により希釈され得る。実施形態では、浸透圧調節物質は、細胞の周囲の溶液および内部、または内部の区画の間の可能な浸透勾配を安定化または低下させることにより、サンプル中の細胞の完全性を維持するために効果的であり得る。実施形態では、浸透圧調節物質は、細胞が少なくとも部分的に崩壊する（細胞の内部または内部区画が、周囲の溶液よりも少なく濃縮されている）ために効果的な、または細胞が膨張する（細胞の内部または内部区画が、周囲の溶液よりも濃縮されている）ために効果的な、細胞の周囲の溶液および内部、または内部の区画の間の浸透勾配を提供、または増大させるために効果的であり得る。
生物学的サンプルは、サンプル中の細胞膜を破壊し得るか、または細胞の形態学に他の効果を有し得る、界面活性剤を含む溶液と接触させられることができる。例えば、ＲＢＣを低濃度の界面活性剤と接触させることは、ＲＢＣがディスク様形状を失いおよびより球状の形状を取ることを引き起こす。
生物学的サンプルは染色され得るか、またはマーカーがサンプルに加えられ得るか、またはサンプルは、さもなければサンプル、サンプルの一部分、サンプルの構成要素部分、またはサンプル内の細胞または構造の部分の、検出、可視化または定量化のために調製され得る。例えば、生物学的サンプルは、染料を含む溶液と接触させられ得る。染料は細胞、もしくは細胞の一部分、もしくはサンプル中の細胞に付随する物質もしくは分子を染色し得るか、またはさもなければ可視化し得るか。染料は、元素、化合物、またはサンプルの他の構成要素に結合し得るか、それらにより変化され得る；例えば染料は、色を変化させ得るか、またはさもなければそれが存在する溶液のｐＨにおける変化または差分に応答して、その光学的性質を含む１つ以上のその性質を変化させ得る；例えば染料は、色を変化させ得るか、またはさもなければ、染料が存在する溶液中に存在する、元素または化合物（例えば、ナトリウム、カルシウム、ＣＯ２、グルコース、または他のイオン、元素、または化合物）の濃度における変化または差分に応答して、その光学的性質を含む１つ以上のその性質を変化させ得る。例えば、生物学的サンプルは、抗体または抗体フラグメントを含む溶液に接触させられ得る。例えば、生物学的サンプルは、粒子を含む溶液に接触させられ得る。生物学的サンプルに加えられた粒子は、標準として機能し得る（例えば、粒子のサイズまたはサイズ分布が既知の場合はサイズ標準として、または粒子の数、量、もしくは濃度が既知の場合は、濃度標準として機能する）か、またはマーカーとして機能する（例えば、粒子が特定の細胞または細胞のタイプ、特定の細胞マーカーまたは細胞の区画に結合または接着する場合、または粒子がサンプル中の細胞の全てに結合する場合）。
血球計算は、細胞数、細胞タイプ、細胞表面マーカー、細胞内部のマーカー、および目的の細胞の他の特性の、定性的および定量的観察および測定を含む、赤血球、血小板、白血球などの細胞の観察および測定を含む。生物学的サンプルが、血液サンプルを含むか、または血液サンプルである場合、このサンプルは部分に分割され、および希釈され得る（例えば、取扱いの容易さのためにより大きな容積を提供するために、所望の希釈された密度、濃度、もしくは細胞数またはこれらの範囲を提供するために、サンプル中の細胞の構成要素の密度または濃度を変更するために、など）。前記サンプルは、凝集に影響する薬剤により処理されることができるか、またはサンプル構成要素を濃縮または沈殿させるために、処理または取り扱われ得る（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはヘパリンが前記サンプルに加えられ得るか、または前記サンプルは遠心分離されるか、または細胞が沈降することを許容される）。サンプル、またはサンプルの一部分、特定の細胞または特定の細胞の構成要素と反応し、および標識を付ける、染料または他の試薬を加えることにより処理され得る。例えば、細胞核を標識する染料（例えば、ヘマトキシリン染料、シアニン染料、Ｄｒａｑ５（登録商標）などのＤｒａｑ染料および他の染料）；細胞の細胞質を標識する染料（例えば、フルオレセイン染料を含むエオシン染料、およびその他）が、細胞の可視化、同定、および定量化を援助するために、個別または組み合わせて用いられ得る。細胞表面タンパク質、細胞内のタンパク質および区画などの細胞の標的、および他の標的に特異的な抗体および抗体フラグメントを含む、より特異的なマーカーも、血球計算において有用である。
生物学的サンプルは、例えば、光強度（単一波長の、複数波長の、または範囲の、光の波長の）を測定するか、画像を形成するか、またはその両方を行う、光ダイオード検出器、光電子増倍管、電荷結合機器、レーザーダイオード、分光光度計、カメラ、顕微鏡、または他の機器を含む光学的手段を有する血球計算を用いて測定および分析され得る。検出器を用いて、サンプル、またはサンプルの一部分を含む視野が撮像される得るか、またはスキャンされる得るか、またはその両方をされ得る。生物学的サンプルは、処理、希釈、分離、遠心分離、凝集、または他の変更に先立って、血球計算により測定および分析され得る。生物学的サンプルは、サンプルの処理、希釈、分離、遠心分離、凝集、または他の変更の間に、またはそれらに続いて、血球計算により測定および分析され得る。例えば、生物学的サンプルは、サンプルの受領に続いて、直ちに血球計算により測定および分析され得る。他の実施例では、生物学的サンプルは、サンプルの処理、希釈、分離、遠心分離、凝集、または他の変更の間に、またはそれらの後に血球計算により測定および分析され得る。
例えば、血液サンプルまたはその一部分は、沈降または遠心分離により血球計算のために調製され得る。そのようなサンプルの沈降された、すなわちペレット部分は、血球計算の分析に先立ち、最適な緩衝液中に再懸濁され得る（例えば、吸引、撹拌、超音波分解、または他の処理により）。血球計算の分析に先立って、生物学的サンプルは、水、または緩衝化生理食塩水溶液などの生理食塩水溶液により希釈される得るか、それらに再懸濁され得る。そのような希釈または再懸濁に用いられる溶液は、固定剤（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、またはタンパク質を架橋する他の薬剤）を含んでいても、またはいなくてもよい。そのような希釈または再懸濁に用いられる溶液は、周囲の溶液およびサンプル中の細胞内部、または内部の区画の間に、サンプル中の細胞のいくつか、またはすべての細胞容積が変更されるために効果的な浸透勾配を提供し得る。例えば、希釈後に、結果として生成する溶液の濃度が、細胞の内部または細胞内部の区画の効果的な濃度未満であると、そのような細胞の容積は増加する（すなわち、この細胞は膨張する）。生物学的サンプルは、浸透圧調節物質（例えば、グルコース、ショ糖、または他の糖；ナトリウム、カリウム、アンモニウムまたは他の塩などの塩；または他の浸透圧的に活性な化合物または構成要素）を含んでも、または含まなくてもよい溶液により希釈され得る。実施形態では、浸透圧調節物質は、細胞の周囲の溶液および内部、または内部の区画の間の可能な浸透勾配を安定化または低下させることにより、サンプル中の細胞の完全性を維持するために効果的であり得る。実施形態では、浸透圧調節物質は、細胞が少なくとも部分的に崩壊する（細胞の内部または内部区画が、周囲の溶液よりも少なく濃縮されている）ために効果的な、または細胞が膨張する（細胞の内部または内部区画が、周囲の溶液よりも濃縮されている）ために効果的な、細胞の周囲の溶液および内部、または内部の区画の間の浸透勾配を提供、または増大させるために効果的であり得る。
例えば、生物学的サンプルは、サンプルの一部分の染料を含む溶液による希釈に続いて測定されるか、または分析され得る。例えば、生物学的サンプルは、サンプルの一部分の抗体または抗体フラグメントを含む溶液による希釈に続いて測定されるか、または分析され得る。例えば、生物学的サンプルは、サンプルの一部分の粒子を含む溶液による希釈に続いて測定されるか、または分析され得る。生物学的サンプルに加えられた分析され得る粒子は、標準として機能し得る（例えば、粒子のサイズまたはサイズ分布が既知の場合はサイズ標準として、または粒子の数、量、もしくは濃度が既知の場合は、濃度標準として機能する）か、またはマーカーとして機能する（例えば、粒子が特定の細胞または細胞のタイプ、特定の細胞マーカーまたは細胞の区画に結合または接着する場合、または粒子がサンプル中の細胞の全てに結合する場合）。
例えば、生物学的サンプルは、１つ以上のタイプの細胞を別の細胞のタイプから分離し得る処理に続いて測定されるか、または分析され得る。そのような分離は、重力（例えば、沈降）；遠心分離；ろ過；基質との接触（例えば、別の細胞タイプに優先して１つの細胞タイプに結合または接着し得る、抗体、レクチン、または他の構成要素を含む、壁またはビーズなどの表面）；または他の手段により達成され得る。分離は、細胞のタイプの変更により支援されるか、達成され得る。例えば、サンプル中の細胞のいくつかか、またはすべてが膨張することを引き起こす溶液が、血液サンプルなどの生物学的サンプルに加えられることができる。１つのタイプの細胞が別のタイプの細胞よりも早く膨張する場合、溶液の添加に続いてサンプルを観察するか、または測定することにより細胞のタイプを区別し得る。そのような観察および測定は、応答（例えば、サイズ、容積、内部濃度、または膨張により影響される他の性質）における違いを際立たせるために、および観察および測定の感度および正確性を増加させるために選ばれ、１回、または複数回行われ得る。ある場合には、細胞のタイプは、そのような膨張に反応して破裂することがあり、サンプル中の残存する細胞タイプの改善された観察および測定を可能にする。
生物学的サンプルの血球計算による観察、測定および分析は、例えば、光ダイオード、光電子増倍管、レーザーダイオード、分光光度計、電荷結合機器、カメラ、顕微鏡、または他の手段または機器を用いる光度計測定を含む。血球計算は、生物学的サンプル中の細胞の画像の調製および分析（例えば、２次元画像）を含むことができ、細胞は標識され（例えば、蛍光的、化学発光滴、酵素的、または他の標識により）および板状にされ（例えば、基板上で沈降を許容され）およびカメラにより撮像される。このカメラレンズを含むことができ、および顕微鏡に取り付けられるか、または連動して使用される。細胞は、２次元画像において、それらに取り付けられた標識により（例えば、標識により放射される光から）同定され得る。
本明細書において開示される血球計算器により、調製され、および分析される細胞の画像は、０個の細胞、１個の細胞、または複数の細胞を含み得る。本明細書で開示される血球計算器の画像中の細胞は、上記で開示されるように標識され得る。本明細書で開示される細胞または血球計算器の画像中の細胞は、上記で開示されるように、画像およびそのサンプルがどの被験者から採取されたかを同定するために効果的であるために標識をされることができる。
いくつかの実施形態では、前記検定システムは、血球計算検定を遂行するために構成される。血球計算検定は、典型的には、光学的に、電気的に、または音響学的に個々の細胞の特性を測定するために用いられる。本開示の目的のために、「細胞」は、限定はされないが小嚢（リポソームなどの）、細胞の小さなグループ、ウイルス粒子、バクテリア、原虫、結晶、脂質の凝集により形成された物体および／またはタンパク質、およびビーズまたはマイクロスフェアなどの小さな粒子に結合した物質を含む、一般的に個々の細胞と同様のサイズの、非細胞のサンプルを包含し得る。そのような特性は、限定はされないがサイズ；形状；粒度；光散乱パターン（または光学的屈折率楕円体）；細胞膜が無傷であるか；限定はされないがタンパク質内容物、タンパク質修飾物、核酸内容物、核酸修飾物、オルガネラ内容物、核構造、核内容物、内部細胞構造、小嚢内部の内容物（ｐＨを含む）、イオン濃度、およびステロイドまたは薬剤などの他の小分子の存在；およびタンパク質、脂質、炭水化物、およびそれらの修飾物を含む細胞表面（細胞の膜および細胞壁の両方）マーカーを含む細胞内内容物の濃度、形態学および時空的分布を含む。純粋な形態または、他の分子とコンジュゲートされた、またはナノまたはミクロ粒子中に固定化されたか、またはそれらに結合した、適切な染料、染色剤、または他の標識分子を用いることにより、血球計算は、特異的なタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、または他の分子の存在、量、および／または修飾を決定するために用いられ得る。血球計算により測定され得る性質は、細胞の分泌、内部および表面分子の発現の変化、他の分子への結合、細胞または基質への結合、小分子の能動輸送、有糸分裂または減数分裂；タンパク質翻訳、遺伝子転写、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、タンパク質分泌、アポトー薬物応答、感染力、および特異的な経路または酵素の活性の測定も含む。血球計算は、限定はされないが細胞計数、全体の集団のパーセント、およびサンプル集団での任意の上述の特性の変異を含む細胞の集団についての情報を決定するためにも用いられ得る。本明細書において記載される検定は、各細胞について、上記の特性の１つ以上を測定するために用いられることができ、異なる特性の間の相関または他の関係を決定するために有利であり得る。本明細書において記載される検定は、例えば異なる細胞株に対して特異的な抗体と混合された細胞集団の標識により、細胞の複数の集団を独立して測定するためにも用いられ得る。顕微鏡モジュールは、機器による組織学、病理学、および／または形態分析の遂行を可能にすることができ、および物理的および化学的特性の両方に基づいて、対象の評価の促進もする。組織は、均質化され、洗浄され、キュベットまたはスライド上に被覆され、乾燥され、染色され（抗体によるなど）、インキュベートされ、および次いで撮像される。本明細書の別の部分において記載されるデータ送信技術と組み合わされた時に、これらの革新はＣＭＯＳ／ＣＤＤまたは同様の検出器から、例えば、フローサイトメトリーのみを遂行する従来の機器では不可能であった、資格を有する病理学者にレビューのための画像の送信を促進する。前記血球計算器は、細胞形態学と同様に、表面抗原も測定でき；表面抗原は、従来の血液学臨床検査機器と比較して、より感度が高くおよび特異的な試験を可能にする。細胞の検定の解釈は、１つ以上の測定をゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）することにより自動化され得る；ゲーティング閾値は専門家により設定されることができ、および／またはトレーニングのデータからの統計的方法に基づき学習されることができ；ゲーティングの規則は個々の被験者および／または被験者の集団について特異的であり得る。
いくつかの実施形態では、血球計算器モジュールのポイント・オブ・サービス機器への組み込みは、典型的には共通の臨床検査機器により測定され、ならびに臨床検査室で古典的な訓練を受けた医療従事者により解釈され、およびレビューされる、細胞の属性の測定を提供し、速度および／または臨床的決断決定の質を改善する。ポイント・オブ・サービス機器は従って、血球計算の分析のために構成され得る。
実施例１
ナチュラルキラー細胞および好中球を含む血液白血球を含む細胞のサンプルが得られた。このサンプルは、ナチュラルキラー細胞および好中球の両方に結合する、蛍光的に標識された識別（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）バインダー（抗ＣＤ１６バインダー）により処理された。このサンプルは、核染料（ＤＲＡＱ５）によっても処理された。このサンプルは蛍光顕微鏡および暗視野顕微鏡により撮像された。蛍光のレベルおよびサンプル中の異なる細胞の光側方散乱が記録されおよび分析された。抗ＣＤ１６バインダー信号を含む分割された画像は、各細胞の蛍光強度（ＣＤ１６発現レベルに対応する）、および各細胞のサイズについても定量的情報を提供した。前記暗視野画像は、各細胞の散乱の性質についての定量的情報を提供した。前記ＤＮ染料の信号を含む画像は、蛍光強度、サイズ、および核の形状を決定するために分割された。
図１Ａに示されるように、２つの主要な細胞の集団が、異なる細胞のＣＤ１６蛍光および光散乱の測定に基づき同定された。明るい／高いＣＤ１６蛍光信号および高い散乱（図１Ａ、右の円形）を持つ細胞のグループは好中球である。中間的なＣＤ１６蛍光信号および低い散乱（図１Ａ、左の円形）を持つ細胞のグループはナチュラルキラー細胞である。異なる細胞の蛍光および光散乱の測定が、サンプル中のほとんどの細胞を、ナチュラルキラー細胞または好中球のいずれかに分類するために十分な情報を有する一方、いくつかの細胞については、これらの属性の測定は、その細胞を高い程度の正確性で分類するための十分な情報を提供しない。例えば、細胞の蛍光および光散乱の測定は、図１Ａ中の最も小さい円形の中の細胞の小さなグループ（すなわち、真ん中の円形）を正確に分類するための十分な情報を提供しない。最小の円形の中の細胞がナチュラルキラー細胞か、または好中球であるかを同定するためには、これらの核（ＤＲＡＱ５）、および全細胞（抗ＣＤ１６）の染色の画像が検査された。核の面積および細胞の全細胞面積の定量的測定が得られ、および核の面積の全細胞面積に対する比率が決定された。図１Ｂに示されるように、核面積の全細胞面積に対する比率においては、ナチュラルキラー細胞（“ＮＫ”）および好中球（“Ｎｅｕ”）の間に明白な差がある。従って、サンプル中の細胞の、複数の属性を検査するための、定量的顕微鏡法の使用は、細胞の曖昧ではない分類を可能にするために用いられた。図１Ｃは、図１Ａの最小の円形からのナチュラルキラー細胞の画像を示す。全ての画像は、同じ長さの尺度を有する。左の画像は、全細胞面積（抗ＣＤ１６）のために染色された細胞であり、および右の画像は核染色（ＤＲＡＱ５）だけされた同じ細胞である。一番上の画像および下の列はナチュラルキラー細胞の異なる実施例である。図１Ｄは、図１Ａの最小の円形からの好中球の画像である。全ての画像は、同じ長さの尺度を有する。左の画像は、全細胞面積のために染色された細胞、および右の画像は、核染色だけされた同じ細胞である。一番上の画像および下の列はナチュラルキラー細胞の異なる実施例である。
加えて、好中球の核は、区別可能な多葉性の形状を有する一方、ナチュラルキラー細胞（および他のリンパ球）の核は円形、均一および滑らかである。画像の分割アルゴリズムが、核自身の形状に基づき細胞の同定および分類に使用され得る。
実施例２
血小板を含むサンプルが取得された。この血小板は、蛍光的にコンジュゲートされた抗ＣＤ４１および抗ＣＤ６１抗体により標識された。３μｍの直径を有するビーズもサンプルに加えられた。このサンプルは１０ｘおよび２０ｘの倍率で撮像された（図２Ａ）。個々の血小板の蛍光の強度分布が測定され（両方の抗体から）、およびガウス分布の形状を有することが決定された（図２Ｂ）。個々の血小板の蛍光の測定値がプロットされ、および強度分布についての一致が決定された（図２Ｃ）。図２Ｃでは、灰色の線が個々の血小板に対して測定された蛍光強度であり、および黒い線が一致である。ガウス分布の平均、分散、容積、幅、および基部の面積などの一致のパラメーターは、血小板容積の予知因子として評価され得る。ガウス分布の容積および一致の幅が、平均血小板容積と緊密に相関づけるために測定された。
上記の測定に対して、前記３μｍのビーズは、最良の焦点面の正確な決定において分散を制御するために、およびこの分散が容積の測定に与える影響を制御するための、参照および基準として機能した。
加えて、２Ｄモデルの一致に基づいて見積もられた血小板のサイズは、正常範囲内にあるために構成されることができる（図３）。
実施例３
赤血球（“ＲＢＣ”）を含むサンプルが取得された。このＲＢＣは、低濃度の界面活性剤（ＤＤＡＰＳまたはＳＤＳ）で処理され、ＲＢＣが球体様の形状をとることを引き起こした。このＲＢＣは、２つの異なるキュベット中で暗視野顕微鏡により撮像された：（Ａ）純粋な落射照明のみを許容するキュベット（図４Ａ）；および（Ｂ）落射照明および徹照の両方の混合を許容するキュベット（図４Ｂ）。このＲＢＣは、落射照明および徹照の両方の混合を許容したキュベット中で、純粋な落射照明のみを許容したキュベットよりも、はるかに可視的であった（図４）。
実施例４
好中球を含むサンプルが取得された。好中球では、核の形状およびクロマチンの形態学は、未成熟な「桿状核球」好中球またはであるか、または成熟した「分葉核」好中球であるかを示すことができる。桿状核球好中球は、最近骨髄から発生した未成熟な好中球である。桿状核球好中球の比率の増加は、進行中の感染または炎症を示す。
このサンプルは、蛍光的に標識された、好中球の細胞表面受容体であるＣＤ１６を認識する、抗ＣＤ１６抗体と混合された。このサンプルは、蛍光核染料によっても染色された。このサンプルは、細胞から核染色およびＣＤ１６染色データの両方を得るために、蛍光顕微鏡により撮像された。桿状核球好中球は、一般的に成熟した分葉核好中球と同様のＣＤ１６発現レベルを有し、および従ってＣＤ１６染色単独からの蛍光強度に基づいては区別できない。
画像分割を含む画像分析が、核染色ならびに桿状核球好中球および分葉核好中球の形態学を認識するために用いられ、それにより細胞の分類が可能になる。細胞の核のサイズ、形状、および蛍光強度が検査された。加えて、この核は、分葉の数（核領域内での強度のピーク）、核の分葉間の距離、および核の輪郭の屈曲における変化（二次導関数）を決定するために分析された。図５Ａは、桿状核球好中球の代表的な画像を示す。これらの画像では、核は薄い灰色として見え、および細胞の細胞質は、より濃い灰色として見える。好中球は骨髄細胞系列を経て分化するので、それらは完全な成熟に至る前に、特徴的な“Ｕ”形状の核を発現させる。図５Ｂは、分葉核好中球の代表的な画像を示す。これらの画像では、核は薄い灰色として見え、および細胞の細胞質は、濃い灰色として見える。分葉核好中球の核は、複数の区画／葉（典型的には約３〜５）を有する。従って、この分析は、血液中の好中球の異なる亜集団の同定および定量化を支持する。
実施例５
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に罹患した被験者からの細胞のサンプルを取得する。この目的は、被験者からのＢ細胞上のＣＤ５発現の程度を定量することである。抗ＣＤ２０抗体がＢ細胞のバインダーとして選択される。第一の色の蛍光色素分子で標識された抗ＣＤ２０抗体がこのサンプルと混合される。適切なインキュベーション時間の後に、このサンプルは洗浄され、および結合されていない抗ＣＤ２０抗体が除去される。このサンプルは、第一の蛍光色素分子を励起させる能力のある光源に曝露され、および蛍光信号が分光光度計を用いて測定される。蛍光信号に基づき、サンプル中のＢ細胞のおおよその濃度が決定される。この決定されたおおよそのＢ細胞の濃度は、実際に、サンプル中のＢ細胞の真の濃度の１．５倍以内である。
サンプル中のＢ細胞のおおよその濃度に基づき、ＣＤ５発現およびＣＤ５蛍光の間の比例的関係が維持され得るように、抗ＣＤ５バインダーの適切な量がサンプルに加えられる。この抗ＣＤ５バインダーは、第一の蛍光色素分子（抗ＣＤ２０バインダーに結合された）とは、異なるピーク励起波長を有する第二の蛍光色素分子と連結される。この抗ＣＤ５抗体がサンプルに加えられ、および次いでサンプルの個々の細胞が、第二の蛍光色素分子を励起させる能力のある光源に曝露され、および個々の細胞からの蛍光信号が測定される。細胞からの蛍光信号に基づき、サンプル中のＢ細胞中のＣＤ５の平均量が決定される。
この実施例はＣＤ５コのンテクストで記載されているが、後続するステップにおいて使用するために、物質の所望の量の添加を導くために、おおよその計数を取得するこの概念は、ＣＤ５に限定されるものではなく、および他のタイプの細胞、検体、または対象での、この概念の使用が除外されないことを理解されたい。
実施例６
本明細書において開示される方法に従い、血液細胞が撮像され、同定され、および定量化され得る。例えば、細胞が標識され（例えば、蛍光的、化学発光滴、酵素的または他の標識）およびおよび板状にされ（例えば、基板上で沈降を許容され）およびカメラにより撮像される、生物学的サンプル中の細胞の２次元画像が、本実施例で記載される通りに、調製されおよび分析され得る。このカメラレンズを含むことができ、および顕微鏡に取り付けられるか、または連動して使用される。細胞は、２次元画像において、それらに取り付けられた標識により（例えば、標識により放射される光から）同定され得る。
指先穿刺により取得された８０マイクロリットルの全血が、あらかじめ２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡが入った、キャップの付いたサンプル容器に充填された。この例では、封入されたサンプル容器が使用された（取り除き可能か、または突き刺し可能なキャップ）；そのような小さな容積のサンプルを保持できる、限定はされないが、キャップ付きの容器またはキャップの付いていない容器を含む、任意の適切な容器が使用され得ることが理解されるであろう。血液の血漿から血液細胞を分離するために、このサンプル容器は１２００ｘｇで５分間遠心分離された。サンプル容器の遠心分離は、このサンプル容器中の血液サンプルの２つの主要な構成要素（サンプル容器の頂部から底部）への分離を生じた：１）血液の血漿および２）濃縮血球パック。このプロセスは、血液の液滴が分離されないままで残らないが、液体の本体に融合することを確実にする。加えて、このプロセスは、細胞を血漿の要素から分離し、従って代謝を低下させ、およびサンプルのより長期の保存を可能にする。
遠心分離される サンプル 容器 が、複数の流体的に分離された試薬、 チップ、および血球計算キュベットを含むカートリッジに充填された。 このカートリッジは、検定に必要な試薬全てを含んでいた。 この カートリッジは、少なくとも遠心分離機、 ピペットおよびキュベットを充填するためのプラットフォームを備えた機器内に充填された。機器 内のピペットは複数のノズルを有し、 いくつかの ノズルはいくつかの他の ノズルと異なるサイズを有していた。
機器の内部では、ピペット上のノズルはキュベット・キャリヤ・ツールの上に下され、それがこのキャリヤ・ツールの対応する孔に係合することをもたらしている。このツールは、その後に、カートリッジに移動され、および血球計算器キュベット上に下げられる。ツール上のピンは、次いでキュベット上の対応する孔に係合することができ、およびそれを吊り上げた。前記キュベットは、機器内の他の場所の充填ステーションに移転された。
次に、機器の内部では、前記ピペットのより大きなノズルが、前記カートリッジ中に保存されるピペットチップと係合するためにカートリッジ内に下げられた。前記ピペットおよびチップは、次いで一緒に、ピペットチップをサンプル容器内のサンプル中に配置して、チップ中へ物質を吸引し、チップからその物質を分注することを繰り返すことにより、サンプル容器中の細胞および血漿を混合するために用いられる。全血サンプルが完全に混合されるために、細胞が血漿中に再懸濁されるとすぐに、５マイクロリットルの混合された全血が、血液サンプルの性質の測定のための等分を提供するために吸引される。この５マイクロリットルの等分は、サンプル中の赤血球および血小板を指向する測定のために用いられた。下記で議論するように、この５マイクロリットルの等分を取り除いた後の、サンプルの残りの部分は、サンプル中の白血球を指向する測定に用いられた。
この５マイクロリットルの全血は、全血を２０倍に希釈するために（１００マイクロリットルの希釈されたサンプルを生成する）、リン酸緩衝化生理食塩水および２重量％のウシ血清アルブミンの混合物を含む容器内に分注された。力強く混合した後に、このサンプルの５マイクロリットルは、標識抗体試薬のカクテル：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＡＦ６４７）にコンジュゲートされた抗ＣＤ２３５、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ４１および抗ＣＤ６１抗体を含む別の容器に移転された。この混合物は５分間インキュベートされた。その後に、この混合物の１０マイクロリットルが、９０マイクロリットルの＜０．１重量％の両性イオン性界面活性剤を含む緩衝液と混合された。この界面活性剤分子は、赤血球膜の屈曲する性質を、全ての細胞が安定な球状形状を取るように変更する。緩衝液が細胞質と等張であるために、この変換は等容性であり；従って浸透圧的に駆動される流体の交換が全細胞膜を通じて生じ得る。これを別の２分間インキュベートした後に、この溶液の３０マイクロリットルを、固定剤であるグルタルアルデヒドおよび１０μｍの直径の非蛍光ビーズを含む溶液と混合した。混合物はマイクロリットル当たり、０．１％グルタルアルデヒドおよび１０００ビーズの最終濃度を有した。グルタルアルデヒドは、迅速に細胞を固定し、従って細胞の溶解および他の能動的な生物学的プロセスを防止した。
この非限定的な例では、前記ピペットは、次いで前記カートリッジ中のチップと係合し、上記混合物を７マイクロリットル吸引し、およびその７マイクロリットルを、キャリヤ・ツールを持つプラットフォーム上に配置された前記キュベット内のチャネル内に充填する。混合物がキュベット中に充填された後に、前記ピペットは、前記カートリッジ中の容器から１０マイクロリットルの鉱油を吸引し、およびこの鉱油の油滴をキュベットの充填されたチャネルの両方の開放端に配置した。ヘキサデカンが、充填されたキュベットチャネルからの、液体の蒸発を防止するために開放チャネルの端に加えられた（鉱油もそのように作用する）。次に、前記機器レベルのサンプル取扱い装置が、前記キュベット・キャリヤ／キュベットの組み合わせに係合し、および前記キュベット・キャリヤ／キュベットの組み合わせを、前記カートリッジを含むモジュールから、前記機器の血球計算モジュールまで運搬した。この血球計算モジュールでは、前記機器レベルのサンプル取扱い装置が、キュベット・キャリヤ／キュベットの組み合わせを血球計算モジュールの顕微鏡ステージ上に配置した。２分間の待ち時間を加えた、これらの操作に必要な時間は、画像化に先立ち前記キュベットの床に膨張した細胞が沈降することを可能にする。
前記キュベット・キャリヤ／キュベットが顕微鏡ステージ上に配置された後、血球計算器の光学的システムが、サンプルを含むチャネルの１つの端を見通すことができるように、このステージは所定の位置に移動された。この場所において前記光学的システムは、リングライトからの暗視野照明により取得された、サンプルの画像を中継した。前記キュベットの平面に垂直な軸上の、光学的システムの作動と連結されたこれらの画像は、最良の焦点面を見出すために用いられた。一旦焦点が合わされると、前記光学的システムは、使用されている蛍光色素分子に相応の異なる波長でのサンプルの蛍光画像を取得するために用いられた。例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でコンジュゲートされた抗ＣＤ２３５抗体で標識された赤血球を見るためには、赤い（６３０ｎｍの波長）光源が、サンプルを励起するために用いられ、および６５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長が画像前記サンプルの撮像に用いられた。多色性鏡および帯域通過発光フィルターの組み合わせが、光学的信号から、望ましくない波長をフィルターで除去するために用いられた。前記細胞はキュベットの床に沈降したため、単一の焦点面における画像領域内の全細胞を可視化するために十分であった。
画像からのデータはサンプル処理機器に付随する制御装置により処理された。ここで用いられた画像処理アルゴリズムは、細胞の蛍光画像適応閾値化およびエッジ検出の組み合わせを用いて、細胞を検出した。局所濃淡および強度勾配に基づき、目的の領域（ＲｏＩ）が、各細胞の周囲に生成された。暗視野画像を用いて、サンプル中のビーズも同定され、およびＲｏＩが、そのビーズの周囲に生成された。各視野の中の全てのＲｏＩが数え上げられ、およびその視野の各画像におけるそれらの強度が計算された。画像処理アルゴリズムによる情報の出力は、各ＲｏＩについての形状または形態学的測定ならびに蛍光および暗視野強度により構成される。この情報は、各対象が、赤血球（ＣＤ２３５ａに対して陽性だが、ＣＤ４１／Ｃ６１に対しては陰性）、血小板（ＣＤ４１／ＣＤ６１に対して陽性、およびＣＤ２３５ａに対して陰性）またはビーズのいずれであるかを分類するために、統計的方法を用いて分析された。周囲の長さ、直径および真円度などの形状記述子が、それぞれの赤血球および血小板の容積を計算するために用いられた。ビーズは既知の濃度において加えられたために、全チャネルに亘るビーズ対細胞の平均比率が、細胞／マイクロリットルの単位での細胞濃度の計算に用いられた。サンプル処理のために遂行されるステップに基づき、元の全血サンプル中の細胞濃度に到達するために、この濃度は希釈について修正された。以下の定量はサンプルから計算された：１）キュベット中の赤血球数；２）キュベット中の赤血球の平均容積；３）キュベット中の赤血球の赤血球分布幅（ＲＤＷ）；４）キュベット中の血小板数；および５）キュベット中の血小板の平均容積。これらの計算に基づき、元の血液サンプルについて以下が計算された。
ＲＢＣおよび血小板の情報の分析に用いられた５マイクロリットルの等分を取り除いた後、残りのサンプルの７５マイクロリットルは、全血サンプルの白血球集団を分析するために用いられた。残りのサンプルの７５マイクロリットルも、同じ容器内のサンプルをピペットにより、繰り返し吸引と分注を行うことにより混合された。残りの７５マイクロリットルの混合された全血の、おおよそ４０マイクロリットルがピペットチップ内に吸引され、およびこのピペットによりカートリッジ中の遠心分離機チューブへ移転された。血液サンプルを含む遠心分離機チューブは、ピペットにより係合され、および前記モジュール内の遠心分離機中の揺動バケットに移動されその中に正確に置かれた。この遠心分離機は、３分間１２００ｘｇを提供するために回転され、この血液は、ＥＤＴＡを含む血漿を上澄み液として、およびペレット中の血中血球に分離された。
遠心分離後に、前記遠心分離機チューブは遠心分離機から取り除かれ、およびカートリッジに戻される。前記血漿上澄み液は、ピペットにより取り除かれ、およびカートリッジ中の別の反応容器に移動された。容器カートリッジ中の試薬から、再懸濁緩衝液の１６マイクロリットルが、ピペットにより吸引され、および遠心分離チューブ中の細胞ペレットに加えられた。このピペットは、次いで遠心分離チューブ中の混合物を繰り返し吸引し分注することにより再懸濁緩衝液中の細胞ペレットを再懸濁した。次に、このピペットは、再懸濁された全血の２１マイクロリットルを吸引し、およびそれを、２マイクロリットルの抗ＣＤ１４抗体−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅＴＭおよびＤＲＡＱ５（登録商標）、を含む別の容器に加え、混合し、および２分間インキュベートした。２０マイクロリットルのこの混合物は、次いで８０マイクロリットルの溶解緩衝液に加えられた。この溶解緩衝液は、パラホルムアルデヒドなどの固定剤と組み合わされたサポニンなどの温和な界面活性剤の溶液である。この洗剤は細胞膜に多数の孔が形成されることを引き起こす。その独特の膜の性質により、特に赤血球は、この孔形成を蒙りやすく、および完全に溶解し、それらの内容物は周囲の液体中に漏出する。固定剤の存在は、白血球の意図しない溶解を防止する。血小板も溶解しないで残る。このステップの目的は、赤血球が白血球に対して約１０００：１と多いために、赤血球を混合物から取り除くことである。血小板は画像化を妨害しないために、このプロセスには関係しない。溶解緩衝液は、１０μＭの非蛍光ビーズを既知の濃度で含んでいた。
５分間のインキュベート後に、この容器は、１２００ｘｇで３分間回転された。その上澄み液は、ピペットチップで吸引され、赤血球ゴーストおよび他の破片を除去し、およびカートリッジ中の廃棄物領域に置いた。充填された白血球を含むおおよそ１５マイクロリットルの液体が前記細胞ペレット中に存在した。
細胞ペレット中に存在する白血球のおおよその近似値を決定するために、このピペットは最初に容器中の白血球を再懸濁し、および次いで分光光度計へ検査のために移動するために吸引した。この白血球懸濁物は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７染料およびＤＲＡＱ５（登録商標）の励起波長である６３２ｎｍの波長の光により照射された。細胞懸濁物により放射された光は、６５０ｎｍのロングパスフィルターでフィルターされ、および分光光度計で測定された。この測定は、あらかじめ生成された校正曲線により、細胞懸濁物中のおおよその白血球濃度に相関付けられた。典型的には、細胞濃度は、マイクロリットル当たり、約１０００細胞〜約１００，０００細胞の範囲にわたった。前記キュベット中の細胞濃度が、あらかじめ定義された標的濃度の約２倍の範囲に収まることを確実にするための、適切な希釈因子を計算するためにこの見積が用いられた。このステップの目的は、前記キュベット上に、細胞が高すぎる密度、または低すぎる密度で存在しないことを確実にすることである。もし、細胞密度が高すぎると、画像処理アルゴリズムの正確性が損なわれ、およびもし細胞密度低すぎると、不十分な細胞数がサンプル化される。
上記のステップで計算された希釈因子に基づき、ＣＤ４５（汎白血球マーカー）、ＣＤ１６（好中球マーカー）およびＣＤ１２３（好塩基球マーカー）に対する標識された抗体を含む希釈剤が細胞懸濁物に加えられて混合された。
前記キュベット・キャリヤと複合したキュベットが、前記キュベット・キャリヤのブロックに配置されるとすぐに、血球計算緩衝液中に再懸濁された白血球混合物の１０マイクロリットルが、前記キュベット中の２つのチャネルのそれぞれの中に充填される。前記キュベットのチャネルの中に充填された後に、前記ピペットは、容器カートリッジ中から１０μｌのヘキサデカンを吸引し、および鉱油の油滴を、白血球が充填された前記キュベット中の、両方のチャネルの両方の開放端の上に配置した。
次に、機器レベルのサンプル取扱い装置は、前記キュベット・キャリヤ／キュベット組み合わせに係合され、および前記キュベット・キャリヤ／キュベット組み合わせを、前記カートリッジを含むモジュールから、機器の血球計算モジュールへ輸送した。血球計算モジュールでは、機器レベルのサンプル取扱い装置は、前記キュベット・キャリヤ／キュベット組み合わせを血球計算モジュールの顕微鏡ステージ上に配置した。前記キュベット・キャリヤ／キュベットが顕微鏡ステージ上に配置された後に、白血球を含む前記キュベットの２つのチャネルは、ＲＢＣ／血小板の混合物について上記に記載されたように、撮像された。
白血球の暗視野画像は、視野の中の細胞の数を計数するために用いられた（図９Ａに示されるように）。細胞表面マーカーは、画像中の個々の白血球の細胞タイプを決定するために用いられ；例えば、ＣＤ１４は単球を標識し；ＣＤ１２３は好塩基球を標識し；ＣＤ１６は好中球を標識し；およびＣＤ４５−ＡＦ６４７は全ての白血球を標識するために用いられた（図９Ｂ−９Ｅ）。核染色剤Ｄｒａｑ５は、細胞核を標識するために、および核のある細胞（白血球などの）を、核を持たない成熟した赤血球から区別するために用いられるた（図９Ｆ）。
ここで用いられた画像処理アルゴリズムは、細胞の蛍光画像の適応閾値化およびエッジ検出の組み合わせを用い細胞検出した。局所濃淡および強度勾配に基づき、目的の領域（ＲｏＩ）が、各細胞の周囲に生成された。
暗視野画像を用いて、サンプル中のビーズも同定され、およびＲｏＩ境界が、そのビーズの周囲に生成された。各視野の中の全てのＲｏＩが数え上げられ、およびその視野の各画像におけるそれらの強度が計算された。画像処理アルゴリズムによる情報の出力は、各ＲｏＩについての形状または形態学的測定ならびに蛍光および暗視野強度により構成される。
この情報は、各対象が、リンパ球、単球、好塩基球、好酸球、好中球またはビーズのいずれであるかを分類するために、統計的方法を用いて分析された。異なるタイプの細胞の計数に基づいて、対応するビーズの計数、およびサンプル処理の間に実行された希釈比率、元の全血のマイクロリットル当たりの細胞の絶対濃度が計算された。これは全ての白血球およびそれぞれのサブタイプについて計算され、および絶対濃度（マイクロリットル当たりの細胞）および比率（％）の両方として報告された。
そのような測定の画像および結果のプロットの例は、図９、１０、および１１中に提示される。
図９は、全血サンプルからの血液細胞の代表的な画像を示す；これらの画像は異なる画像化技法および染料を用いて撮像された。図９Ａに示される画像は暗視野照明を用いて全血からの細胞を撮影した。図９Ｂに示される画像はＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ染料で標識された抗ＣＤ１４抗体からの蛍光を示す全血からの細胞から撮影された；この蛍光細胞は単球である。図９Ｃに示される画像は、ＰＥＣｙ５染料により標識された抗ＣＤ１２３抗体からの蛍光を示す全血からの細胞から撮影された；この蛍光細胞は好塩基球である。図９Ｄに示される画像は、ＰＥ染料で標識された抗ＣＤ１６抗体からの蛍光を示す全血からの細胞を撮影された；この蛍光細胞は好中球である。図９Ｅに示される画像は、ＡＦ６４７染料で標識された抗ＣＤ４５抗体からの蛍光を示す全血からの細胞から撮影された；これらの条件下では全ての白血球が蛍光を発する。図９Ｆに示される画像は、細胞核を染色するためのＤＲＡＱ５（登録商標）により染色された全血からの細胞から撮影され、従って、白血球および血小板が染色され、およびこれらの条件下で蛍光を発するが、赤血球（核を持たない）は染色されず、および蛍光を発しない。
図１０は、本明細書において開示される方法に従い取得された画像からの全血中の細胞タイプの代表的な複合画像を示す。単球の画像（標識され、および図の上の左象限に見られる、青紫の環により取り囲まれた赤っぽい中心）、リンパ球（標識され、および図の中心にみられる、より薄暗い赤い環により取り囲まれた明るい赤い中心）、好酸球（標識され、および図の左下の象限に見られる、赤い境界により囲まれた緑色の中心）、および好中球（標識され、および図の下の右の象限に見られる、黄色および緑の境界で囲まれた緑色の中心）が図に示されている。
そのような血液サンプル中に見出される様々な細胞タイプを同定し、および定量することに興味が持たれる。そのような分類プロセスにアプローチするには複数の方法があり得るが、いくつかの実施形態では、多次元分類のための統計的問題であると考慮され得る。この分野の広範囲の様々な方法が、これらのタイプの分類問題を解決するために利用可能であることが理解されるであろう。そのような分析の特定の実施形態は以下に提供される。
図１１は、この実施例で記載される血球計算の検定により同定され、および定量化された様々な細胞タイプのプロットを示す。図１１Ａは、単球を同定するための、マーカーＦＬ−１７の強度（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ染料で標識された抗ＣＤ１４抗体）対ＦＬ−９の強度（暗視野散乱信号）によるスポットのプロット（細胞）を示す。図１１Ｂは、好塩基球を同定するための、マーカーＦＬ−１９の強度（ＰＥ−ＣＹ５染料で標識された抗ＣＤ１２３抗体）対マーカーＦＬ−１５の強度（ＰＥ染料で標識された抗ＣＤ１６抗体）によるスポットのプロット（細胞）を示す。図１１Ｃは、リンパ球を同定するための、マーカーＦＬ−１５の強度（ＰＥ染料標識された抗ＣＤ１６）対マーカーＦＬ−１１の強度（ＡＦ６４７染料で標識された抗ＣＤ４５抗体）によるスポットのプロット（細胞）を示す。図１１Ｄは好中球および好酸球を同定するための、マーカーＦＬ−１５の強度（ＰＥ染料で標識された抗ＣＤ１６）対ＦＬ−９の強度（暗視野散乱信号）によるスポットのプロット（細胞）を示す。
最初の単球の同定（図１１Ａに示されるように９．６％）は、後続する好塩基球（図１１Ｂに示されるように０．６８％）の同定を導くために用いられる。図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、単球および好塩基球の同定は、後続する好中球および好酸球の同定（図１１Ｄに示されるようにＷＢＣの６８％が好中球、３．２％が好酸球）を導くために用いられる。最終的に、図１１Ｃに示されるように、リンパ球が同定された（図１１Ｃ中のプロットされたＷＢＣの９３％であり、元のサンプル中の細胞の１８％に相当する）。
本発明の方法は他の方法と相関付けられる。白血球、赤血球、および血小板の計数はＥＤＴＡ抗凝固処理全血のサンプルから作られる。この白血球は、更にサンプル中の好中球、単球、およびリンパ球の数を決定するために計数される。図１２に示される測定では、ＥＤＴＡ抗凝固処理全血サンプルが２つに分割され、およびその１つのサンプルの部分は、本明細書において開示される方法を用いる、本明細書において開示されるシステムで試験される。サンプルの他の部分は、市販の多重パラメータの自動化された血液学分析器である、Ａｂｂｏｔｔ ＣＥＬＬ−ＤＹＮ Ｒｕｂｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、アメリカ合衆国イリノイ州レイクフォレスト（Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ））により試験された。両方の方法で得られた結果の比較が図１２に示される。
図１２Ａ〜１２Ｃに示されるように、本発明の方法により測定された、白血球（“ＷＢＣ”、図１２Ａ）、赤血球（“ＲＢＣ”、図１２Ｂ）および血小板（図１２Ｃ）の数は、本発明の方法で測定されたものと同じサンプルの対応する等分において、他の方法により測定されたＷＢＣ、ＲＢＣ、および血小板の数と良好に相関づけられた。図１２Ｄ〜１２Ｆに示されるように、両方の方法で測定された好中球、単球、およびリンパ球の数は大変類似しており、および互いに良好に相関づけられた。
本明細書において使用される用語の態様において、用語「血球計算」“ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”は、生物学的サンプルの細胞に関する、観察、分析、方法、および結果を指し、この細胞は流体中または基板上で実質的に休止している。血球計算により検出され、および測定された細胞は、任意の光学的、電気的または音響的検出器により検出され、ならびに測定され得る。血球計算は、生物学的サンプル中の、またはそれからの細胞の調製および画像（例えば、２次元画像）の分析を含み得る。この細胞は標識されることができ（例えば、蛍光的に、化学発光的に、酵素的に、または他の標識により）および板状化され（例えば、基板上に沈殿することを許容され）、ならびに典型的には、カメラにより撮像され得る。顕微鏡は、血球計算における細胞の画像化のために使用され得る；例えば、細胞は、カメラおよび顕微鏡により、例えば、顕微鏡を用いて画像を形成するカメラにより撮像されることができる。血球計算により形成され、および血球計算のために使用される画像は、典型的には２つ以上の細胞を含む。
光学的システム
図６Ａおよび６Ｂを参照して、本明細書においての使用に適切な光学的システムの実施形態について記載する。これらのシステムの実施形態は、血球計算を遂行可能なコンテクストにおいて記載されるが、このシステムの実施形態は、血球計算を超えた用途および能力も有し得ることを理解されたい。例として、および限定なしに、本明細書において開示されるシステムの画像化および画像処理能力は、血球計算以外の用途を含む、数多くの用途のために使用され得る。分析されるサンプルの画像が捕捉され、および画像情報は、典型的には定量的測定のために、システム内に連結または関係づけられるので、さもなければ報告されない画像中の臨床的情報を集めるために、定量的情報に関係づけられた画像をさらに分析できる。
例えば、血球計算または他の光学的または画像化手段により、分析されるサンプルは、分析のためにサンプルホルダー中に保持され得る。例えば、キュベットは、そのようなサンプルホルダーとして機能し得る。図６Ａに示される実施形態は、分析のためのサンプルまたはその一部分を受け入れるための複数の開口部６０２を有する、キュベット６００の透視図を示す。図６Ａの実施形態の水平断面形状は、四角形の水平断面形状である。このシステムは、キュベットのコンテクストで記載されるが、他のサンプル保持機器も、前記キュベット６００の代わりに、またはそれと組み合わせて用いられ得ることを理解されたい。
図６Ａの実施形態に見られるように、開口部６０２は、サンプル取扱いシステム（示されていない）または他の送達システムが、サンプルを前記キュベット中の、そこでサンプルが分析され得る、分析領域６０８に接続されることができ、およびそこへ通じている開口部６０２の中に置くことを可能にする。一つの非限定的な実施例では、分析領域６０８はチャンバーであってよい。別の非限定的な実施例では、分析領域６０８はチャネルであり得る。実施形態では、チャネルとして構成された分析領域６０８は、２つの入り口ポート６０２を接続させ得る。更なる非限定的な実施例では、分析領域６０８は、その中でサンプルが非流動的な様式で保持されるチャネルであることができる。本明細書におけるいかなる実施形態においても、前記システムは、分析の間にサンプルを非流動的な様式で保持し得る。随意的に、いくつかの代替的な実施形態は、分析の前に、間にまたは後にサンプルが分析領域を通じて流れることを可能にするために構成され得る。いくつかの実施形態では、分析後に、サンプルは、前記キュベット６００から抽出され、および次いで別のステーション（複数のステーションを有するシステムにおいて）へ、更なる処理および／または更なる処理および／または分析のために、送達される。いくつかの実施形態はサンプルの流れを制御するためにシステム内でゲートを用い得る。
図６Ａは、キュベット６００のいくつかの実施形態では、キュベット６００が複数の開口部６０２を有し得ることを示す。サンプルは、入り口ポート６０２を経由してサンプルホルダーに加えられ得る。開口部６０２は、動作可能に（例えば、流体連続性により）分析領域６０８に接続され得る。分析領域６０８は動作可能に（例えば、流体連続性により）複数の開口部６０２に接続され得る。いくつかの実施形態は、前記キュベット６００中に、より多くの、またはより少ない開口部６０２を有し得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態は、選択されたペアーまたは他の開口部６０２のセットが同じチャネル（例えば、チャネルとして構成された分析領域６０８）にアクセスできるように、特定の（複数の）開口部６０２を連結させ得る。非限定的な例として、分析領域６０８の各端に開口部６０２があってよい。随意的に、分析領域６０８の一端に２つ以上の開口部６０２があってよい。
キュベット６００の実施形態は、サンプル取扱いシステムがキュベット６００に係合し、およびそれを輸送することを可能にする構造６１０を有し得る。図６Ａおよび図６Ｂに図示されたキュベット６００は、要素６１０を介してサンプル取扱いシステムにより係合されることができ、前記キュベット６００が、一つの位置から別の位置に輸送され得るために効果的である。要素６１０は、キュベット６００を所望の場所に固定するためにも用いられることができ、例えば、ある位置（光学的画像化および分析のための検出器を越えてなど）への輸送に先立ち、またはその後に、キュベットは、要素６１０、またはキュベット６００を適正な位置に固定するために要素６１０を用いる、ツールまたは機器により適正な位置に保持される。一つの非限定的な実施例では、この構造６１０は、ピペットまたは他の細長い部材が前記キュベット６００に係合し、およびそれを所望の場所可能にするに輸送することを可能にするキュベット６００中の開口部であり得る。随意的に、前記開口部の代わりに、またはそれとの組み合わせにおいて、構造６１０は、または突起、フック、磁石、磁化可能な要素、金属要素、および／またはキュベットを輸送機器に係合するために使用され得る他の特性であるか、それを含むことができる。実施形態では、力（例えば、圧縮、または他の力）がキュベット６００に加えられることができ；例えば、圧縮がキュベット６００を、キュベット６００が表面と効果的な光学的接触に位置させるために、効果的な基板または表面（例えば、基部サポート６２０の表面）に押し付けるために加えられることができる。実施形態では、そのような力（例えば、圧縮）は、キュベット６００および基部サポート６２０の間に良好な接触を提供するなどの所望の光学的性質を提供することを支援でき、界面において有意な収差なしで、または界面において有意な反射なしで光の通過を可能にし、または他の所望の光学的性質を可能にするために効果的である。実施形態では、そのような力（例えば、圧縮）が、少なくとも部分的に、構造６１０または複数の構造６１０を介して加えられ得る。
図６Ｂ（透視図において）に示されるように、キュベット６００は円形の水平断面形状を持ち得る。開口部６０２（または同様の実施形態において存在し得る複数の開口部６０２、図には示されていない）は、サンプル取扱いシステムまたは他の送達システムが、サンプルが分析され得る前記キュベット中の分析領域６０８に通じ得る、開口部６０２の中にサンプルを配置することを可能にし得る。適切な分析領域６０８の非限定的な実施例は、チャンバーを含む分析領域６０８、およびチャネルを含む分析領域を含む。実施形態では、そのような分析領域６０８は、図６Ｂに示される環状の構造６０４などの環状の構造内に配置され得る。実施形態では、開口部６０２は、分析領域６０８に接続され得る。実施形態では、構造６０４内部の分析領域６０８は、開口部６０２から流出する２つの方向のいずれかの方向が、チャンバー中に流れ込むことを可能にするために効果的であるために、開口部６０８と接続する連続的な環形状のチャンバーを形成できる。実施形態では、構造６０４内の分析領域６０８は、開口部６０２からの１つの流出方向のみがチャンバーに流れ込むことを可能にするために効果的であるために、一つの端が開口部６０８に接続する、環状形状のチャネルまたはチャンバーを形成でき、および別の端部は開口部６０２から分離されるか、または遮断される。実施形態では、そのような一方向の環状形状のチャネルまたはチャンバーは、通気孔または他の開口部を、開口部６０２の遠位の位置に有し得る。更なる非限定的な実施例では、前記分析領域は、チャネルであり得るか、それを含むことができ、サンプルは非流動的な様式で保持され；サンプルは環状形状のチャネルを含む分析領域６０８中に非流動的な様式で保持され、環状形状のチャネルは２方向から開口部６０２に接続されるか、または環状形状のチャネルは、開口部６０２に１方向からのみ接続されるかのいずれかである。本明細書における実施形態のいずれにおいても、前記システムは、分析の間サンプルを非流動的な様式で保持し得る。随意的に、いくつかの代替的な実施形態は、分析の前に、その間に、またはその後にサンプルが分析領域を流れることを可能にするために構成され得る。いくつかの実施形態では、分析後に、サンプルは前記キュベット６００から抜き出され、および次いで別のステーション（複数のステーションを有するシステムにおいて）へ、更なる処理および／または更なる処理および／または分析のために、送達される。いくつかの実施形態はサンプルの流れを制御するためにシステム内でゲートを用い得る。
図６Ｂは、単一の環状の構造６０４を示す；しかしながら、図６Ｂに図示されるように形状づけられたキュベット６００の更なる実施形態では、キュベット６００は、複数の環状の構造６０４を有し得ることが理解されるであろう。例えば、複数の環状の構造６０４を有するキュベット６００は、外側の環状の構造６０４が、１つ以上の内側の環状の構造６０４を取り囲む、異なるサイズの同心の環状構造６０４を有することができる。そのような環状の構造６０４は、それぞれの環状の構造６０４内に、分析領域６０８を含み得る。図６Ｂは、単一の開口部６０２のみを示している；しかしながら、図６Ｂに示されるように形状付けされたキュベット６００の更なる実施形態では、キュベット６００は、複数の開口部６０２を有することが理解されるであろう。例えば、複数の環状の構造６０４を有する（例えば、複数の同心の環状の構造６０４を有する）キュベット６００は、複数の開口部６０２を有し得る（例えば、それぞれの環状の構造６０４が、少なくとも１つの開口部６０２を有し得る）。実施形態はより多くの、またはより少ない、開口部６０２をキュベット６００中に有し得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態は、開口部６０２の選択されたペアー、または他のセットが同じチャネルまたはチャンバーにアクセスできるように（複数の）特定の開口部６０２を連結させ得る。非限定的な実施例として、分析領域のそれぞれの端に開口部６０２があってよい。随意的に、６０２分析領域６０８の１つの端に２つ以上の開口部があることができる。
図６Ａおよび６Ｂに図示されるいくつかのキュベットの実施形態はキュベット６００の選択領域上に構造６０４を提供し得る。一実施形態では、この構造６０４は、制御された厚さを有するために選択された（例えば、領域６１３）前記キュベットの領域に構造的支持を提供する肋材である。例えば、この厚さは、前記キュベット６００内での反射前および反射後にたどる所望の光の経路を含む、所望の光学的性質を提供するために選択され得る。そのような反射は、部分内部反射（ＰＩＲ）または全内部反射（ＴＩＲ）であることができる。そのような反射が生じるか否かは、光の波長；表面に達する光の入射角；物質の組成（領域６１３の、および領域６１３の境界の外側の環境または物質）；および他の因子を含む多くの因子に依存する。図６Ａに示される実施形態では、構造６０４は形状において四角形であり、および四角形の断面を有する。図６Ｂに示される実施形態では、構造６０４は形状において環状であり、および四角形の断面、もしくは台形の断面、または他の形状付けされた断面を有し得る。そのような構造は、任意の適切な断面形状を有し得る。図８Ｂに図示されるように、そのような構造６０４は三角形の断面を有し得る（例えば、複数の肋材が存在する場合には、鋸歯上に形状付けされた断面を形成する）。そのような構造６０４は、同様に他の形状および断面を有することができ（例えば、半円形、楕円形、不規則、または他の形状）、および、実施形態では、２つ以上の形状が同じシステム内に存在し得る（例えば、キュベットは、四角形、三角形、または他の形状付けされた構造を含み得る）ことが理解されるであろう。この構造６０４は、前記制御された厚さの領域６１３が、キュベットの特定の領域に比較して低下した厚さを持つ場合に使用されることができ、および従って構造６０４により提供される機械的支持からの利益を受けることができる。
構造的支持を提供することに加えて、構造６０４は、キュベット６００内の光の内部反射のための物質および経路を提供するために有用である。図８Ａ〜８Ｄに示されるように、キュベット６００内部で反射した光は、構造６０４内部で反射した光のための経路を含み得る（例えば、図に示される、肋材、または三角形の断面を有する構造、または円形または半円形断面、または他の断面形状などの任意の他の形状）。構造６０４は、従って、キュベット６００の表面６１４から外側に延伸する凸面特性を提供し得るか；またはキュベット６００の表面６１４から内向きに延伸する凹面特性を提供し得るか；またはキュベット６００の表面６１４から、凹面および凸面特性の両方を提供し得る。従って構造６０４は、キュベット６００に機械的支持を提供することができ、光学的経路を含む所望の光学的性質をキュベット６００に提供でき、および本明細書で開示される他の望ましいおよび有用な特性ならびに能力をキュベット６００に提供し得る。
支持構造６０４は、従って、例えば剛性を含む構造的支持をキュベット６００に提供するために有用であり得る。キュベット６００の光学的性質は、分析領域６０８中のサンプルおよび細胞、粒子、およびそのようなサンプルの他の構成要素の光学的画像化ならびに他の光学的測定における、それらの使用にとり、重要であり得る。基部の部分６０６またはａ表面６１４または６１８の平坦性の維持を含む、キュベット６００表面の適正な平坦性の維持；キュベット６００の適正な配向および形状の維持（例えば、ねじれ、屈曲、または他の収差なしで）；およびキュベット６００の適正な位置決めの維持（例えば、基部支持６２０、または光学的設定内で）は、前記キュベット６００を用いて取得される光学的測定ならびに画像の完全性にとり重要であり得る。従って、例えば、支持構造６０４および基部部分６０６の設計ならびに構築は、キュベット６００の適正な光学的性質の提供および維持において重要な因子であり得る。適正な距離および分析領域６０８の上面および下面（または側壁）の相対的角度の維持を含む、分析領域６０８の適正な寸法の維持は、分析領域６０８内のサンプルに正しい、および一貫した照明を提供するために重要であり得る。分析領域６０８の適正な寸法の維持も、分析領域６０８の容積、従って分析領域６０８内のサンプル容積が正しいことを保証するために重要であり得る。本明細書において議論されるように、適正な平坦性、またはねじれもしくは収差の低下を更に保証するために、またはさもなければ使用中のキュベットの適正な形状、サイズ、および配向を保証するために、キュベット６００に力（例えば、圧縮）を加え得る。使用中のキュベットのそのような適正な平坦性および適正な形状、サイズ、および配向を保証するために圧縮が不要であり得ることが理解されるであろう。例えば、実施形態では、構造６０４単独で、キュベット６００が、使用中に適正な平坦性および適正な形状、サイズ、および配向を有することを支援または保証するために十分であり得る。加えて、実施形態では、圧縮単独で、キュベット６００が、使用中に適正な平坦性および適正な形状、サイズ、および配向を有することを支援または保証するために十分であり得ることが理解されるであろう。実施形態では、構造６０４および圧縮の組み合わせが、使用中のキュベットの適正な平坦性および適正な形状、サイズ、および配向を支援または保証し得ることが理解されるであろう。
支持構造６０６およびカバー部分６１２を含むキュベット６００は、適切な光学的性質を有する任意の物質により形成され得る。実施形態では、支持構造６０６およびカバー部分６１２を含むキュベット６００は、ガラス（例えば、石英、またはホウケイ酸ガラス、またはアルミノけい酸ガラス、またはナトリウムけい酸ガラス、または他のガラス）で形成され得る。実施形態では、カバー部分６１２または基部支援物６２０は、アクリル、または透明なポリマー（例えば、環状オレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレンポリウレタン、塩化ポリビニル、または他のポリマーまたは共重合体）、または他の透明な物質から形成され得る。そのような物質の光学的性質に加えて、その物理的性質（例えば、硬度、剛性、融点、機械加工性、および他の性質）、他の物質との互換性、コスト、および他の因子がキュベット６００を製作するために用いられる物質の選択に影響する。上記で議論したように、構造６０４の存在、圧縮の利用可能性（例えば、構造６１０を介して加えられ得るもの、または支持構造６０６およびカバー部分６１２の少なくとも一部分に直接に加えられるもの）、および他の因子が、例えば、石英より硬さが少ない物質の利用を可能にすることができ、本明細書において開示されるシステム方法における使用のための必須の光学的および機械的性質を、それでもまだ提供し得る。加えて、構造６０４の存在、圧縮の利用可能性、および他の因子が、構造、圧縮、および他の因子が欠如していては不可能な（例えば、変形または他の因子の可能性に起因して）、製造技法の使用および耐性を可能にし得る。加えて、構造６０４の存在、圧縮の利用可能性、および他の因子は、そのような構造、圧縮、および他の因子が欠如している場合に使用されるものより価格の低い物質を含む物質の使用を可能にし得る。
従って、適正な設計、構築、ならびに支持構造６０４および基部部分６０６のための材料は、キュベット６００およびその使用のために重要である。
いくつかの実施形態では、これらの制御された厚さの領域６１３（例えば、図８Ａ、８Ｂ、および８Ｄを参照されたい）は、分析領域６０８の上に位置決めされるために選択される。いくつかの実施形態では、これらの制御された厚さの領域６１３は、特定の光学的性質を分析領域の上または近傍に与え得る。いくつかの実施形態は、前記キュベット６００を通過する光にも光学的性質与えるために、構造６０４を構成し得る。随意的に、いくつかの実施形態では、構造６０４は、前記キュベット６００の光学的性質に影響を与えないために構成され得る。そのような実施形態では、構造６０４は、１つ以上の光学的に吸収性の表面を有するために構成され得る。例えば、制限なく、特定の表面は黒色であり得る。随意的に、いくつかの実施形態は光を吸収する物質から形成された構造６０４を有し得る。随意的に、構造６０４は、機械的支持を提供するが、分析領域の近くで、キュベット６００の光学的性質に相互作用をしないために構成され得る。
例えば、制御された厚さの領域６１３の表面６１４、および構造６０４の表面６１８を含む特定の表面は、黒または他の色のコーティングで被覆され得る。そのようなコーティングは、１つの層を含むことができ、および複数の層を含み得る。例えば、表面６１４または６１８の適切なコーティングは、２、３、４、５、６、７、またはそれより多い層を含み得る。実施形態では、例えば、構造６０４の表面（例えば、表面６１８）または表面６１４は、３または５層のコーティングで被覆され得る。そのようなコーティングは、染料、インク、塗料、表面処理、着色テープ、または他のコーティングまたは表面処理を含み得る。実施形態では、黒または他の色のマーカー（例えば、ＰａｐｅｒＭａｔｅ（登録商標）、またはＳｈａｒｐｉｅ（登録商標）、またはＭａｇｉｃマーカー（登録商標）、または他のマーカー）が、制御された厚さの領域６１３の表面６１４または構造６０４の表面６１８の被覆に用いられ得る。例えば、特大の黒マーカーが、表面６１４または構造６０４の外部表面６１８に、光学的に吸収性の表面を提供し、およびキュベット６００光学的性質を改善するために、複数の黒インクの被覆を塗布するために用いられることができる。実施形態では、表面６１４または６１８は、表面での反射率（ＰＩＲまたはＴＩＲのいずれか）に影響を与えるか、または低下させるために、被覆または処理され得る。表面での反射率の減少は、表面からの背景照明に影響し得る（例えば、減少させ得る）。
実施形態では、制御された厚さの領域６１３の表面６１４、および構造６０４の表面６１８を含む特定の表面は、その表面での反射率を増強する物質で被覆または覆われることができる。表面での反射率は、例えば、表面のコーティングにより、または表面に物質を貼り付けることにより増加させることができ；反射率を増大させるための適切な物質としては、アルミニウム、銀、金、および誘電物質（例えば、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウム、または他の塩または金属酸化物；または他の反射性または誘電物質）が挙げられる。そのようなコーティングまたは被覆は、１つの層を含むことができ、および複数の層を含み得る。例えば、表面６１４または６１８の適切なコーティングおよび被覆は、２、３、４、５、６、７、またはより多い層を含み得る。表面での反射率の増大は表面からの徹照に影響し得る（例えば、増加させ得る）。表面での反射率の増大は分析領域６０８内のサンプルの画像化を支援もしくは増強することができ、または分析領域６０８内のサンプル光学的分析を支援もしくは増強することができる。
前記キュベット６００が典型的には光学的に透明な、または光学的に透過性の物質から形成されることを理解されたい。随意的に、前記キュベット６００の選択された部分だけが（例えば、分析領域または分析領域に付随する領域など）光学的に透明または光学的に透過性であることができる。随意的に、前記キュベット６００中の、選択された層または領域、非光透過性であるために構成され得る。キュベットの部分または領域は、光吸収性になるように、覆われるかまたは被覆され得る；例えば、表面（またはその一部分）は、暗色、または光吸収性の、染料またはインクにより被覆され得る。更なる実施例では、表面（またはその一部分）は、例えば、テープ、または布、または紙、またはゴム、またはプラスチックなどの暗色または光吸収性物質などの、暗色、または光吸収性のコーティングで覆われることができる。
図６Ａ、６Ｂ、および８Ａ〜８Ｄは、前記キュベット６００が、基部支持物６２０の上に休止し、いくつかまたはすべての基部支持物６２０が、光学的に透明または透過性の物質から形成されている実施形態を図示している。いくつかの実施形態では、この光学的に透明または透過性部分は、分析領域内のサンプルの光学的な監視を可能にするために、前記キュベット６００の分析領域と一列に並ぶために構成される。一つの非限定的な実施例では、画像化のために、前記キュベット６００を所望の位置に移動するために、基部支持物６２０はＸ、Ｙ、および／またはＺ軸方向に移動可能であることができる。いくつかの実施形態では、基部支持物６２０は、軸方向の内の２つの軸内のみに移動できるプラットフォームまたはステージを含む。随意的に、いくつかの支持構造は、単一の軸内でのみ移動できる。前記キュベット６００は、摩擦、機械的連結または構成要素の一つまたは両方に取り付けられた保持用部材によりにより、支持構造６００と作動可能に連結するために構成されることができる。実施形態では、適切な接触およびキュベット６００および基部支持物６２０の間の適正な嵌合のために圧縮、または他の力が、キュベット６００または基部支持物６２０、または両方に加えられることができる。実施形態では、そのような圧縮は、キュベット６００の光学的に透過性の表面、もしくは基部支持物６２０、またはその両方のそのような表面が、光学的に平坦であり、および実質的に収差を含まないことを確実にするために支援できる。例えば実施形態では、キュベット６００の光学的表面における不完全性または異常により引き起こされ得るいかなる可能な光学的収差も低下させるか、または未然に防ぐために、キュベット６００は、基部支持物６２０に対して押圧され得る。実施形態では、そのような力（例えば、圧縮）は、力を加えなければ生成され得るインターフェースの収差を、光が通過することを可能にするために効果的な、所望の光学的性質を提供することを支援し得る。実施形態では、少なくとも部分的に、構造６１０を介するか、または複数の構造６１０を介してそのような力（例えば、圧縮）が加えられることができる。
図６Ａ、６Ｂ、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄは、暗視野および／または明視野の観察のための照明が、装置を前記キュベット６００の水準より下部に配置するために、基部支持物６２０の下に配置された照明源６５０（限定はされないが、示されているリングライトなどの）から提供され得る、実施形態を更に示している。この構成は、前記キュベット６００の上部領域をピペット、サンプル取扱い装置、または他の装置が、前記キュベット６００の最上面の開口部または他の特性に阻害されないアクセスを有するために、利用可能なように残しておく。随意的に、いくつかの実施形態は、照明源６６０（極めて細い線で示される）を、底面照明（例えば、示されるような底面照明源６５０）の代わりに、またはそれとの単一もしくは複数の組み合わせとして用いるために、前記キュベット６００の上に配置し得る。対物レンズ６７０は、照明されているサンプルを観察するために、示さていれるように、または他の構成中に、位置決めされることができる。前記キュベット６００ならびに光学的部分６５０および６７０の間の相対的な運動は、システムが前記キュベット６００中の異なる分析領域を可視化することを可能にするために用いられ得ることを理解されたい。随意的に、前記キュベット６００の異なる領域を監視するために、そのような構成要素の内の１つのみが移動される。
図７Ａを参照し、適切な画像化システム１つの実施形態が、より詳細に記載される。図７Ａは、基部支持物６２０の下に配置された、様々な構成要素の模式的な断面図を示す。この断面は、図６Ａ中の折り曲げられた矢印７で示される領域に沿っている。
図７Ａは、前記キュベット６００が、カバー部分６１２により画成された、基部部分６０６および分析領域６０８を含む実施形態を示す。随意的に、この分析領域６０８は、単一片内部に画成され得る。随意的に、分析領域６０８は、限定はされないが、分析領域６０８のそれぞれの別々のカバー片などの２以上の片を用いて画成され得る。一実施形態では、層６０６は、限定はされないが、より優れた光学的構成要素および用途を提供する、環状オレフィンポリマーなどの熱可塑性物質の光学的に透明なプラスチックを含む。いくつかはガラス、アクリル、透明なポリマー、または他の透明な物質からの１つ以上の層または構成要素を形成し得る。図７Ａに図示されたキュベット６００は、５つの個別の分析領域６０８を含み；これらの領域は図の中の断面に示され；そのような断面を有する分析領域６０８は、四角形、または正方形、または他の形状であり得る。例えば、分析領域６０８は、それを通してサンプルが観察され得る、比較的大きな量の表面積を有する浅いチャンバーを提供する細長いチャネルを有し得る。キュベット６００が、単一の分析領域６０８を含み得るか；または２つの分析領域６０８を含み得るか；または３つの分析領域６０８を含み得るか；または４つの分析領域６０８を含み得るか；またはまたは５つの分析領域６０８（図７Ａに示されるように）を含み得るかもしくはそれよりおおい分析領域６０８を有し得ることが理解されるであろう。
この非限定的な実施例では、検査されるべきサンプルは、その全体または一部が領域６０８に収納され得る。非限定的な例として、基部支持物６２０以下の光学系は、ドーナッツ状反射器６５２および光源６５４を含むリングライト６５０を含み得る。暗視野照明に適切な他の照明の構成要素も用いられ得る；従ってこの光学系は、他の照明源を単独、またはそのようなリングライトとの組み合わせで含み得る。いくつかの実施形態は鏡を用い得る。いくつかの実施形態は被覆された反射面を用い得る。いくつかの実施形態は、前記の図に示されるものとは異なる反射器を用い得る（例えば、サンプルの照明においてドーナッツ型反射を用いないことができる）。いくつかの実施形態はパラボラ型反射器を用い得る。いくつかの実施形態は、楕円形放物面の形状のパラボラ型反射器を用い得る。いくつかの実施形態は複数の個別の反射器片を用い得る。いくつかの実施形態は反射器をまったく用いないことができる。いくつかの実施形態は１つ以上の外部の反射器からの更なる支援とともに、または支援なしで、光を向けるために位置決めされた、角度付けされた光源の使用により斜照明を取得する。
図７Ａに図示された実施形態は、限定はされないが、分析領域６０８中のサンプルに光を向けるために取り付けられた、特異的な波長のレーザー・ダイオードなどの、励起エネルギー源６８０、６８２、および６８４を示している。小型の包装を促進するための一つの非限定的な実施例では、エネルギー源６８０、６８２、および６８４は、２色性の要素６９０（例えば、２色性の鏡またはビーム分割器）に光を向けることができ、この２色性の要素６９０は、次いでこの励起波長を分析領域６０８中に向ける。この励起波長は、サンプル中のマーカー中の蛍光色素分子、染料、および／または他の物質から蛍光波長が発光されることを引き起こす。発光された蛍光波長は、対物レンズ６７０を通過し、２色性の要素６９０を通過し、随意的なフィルター・ホイール６９２を通過し、および限定はされないがカメラシステムなどの検出器７００中に流れ込む。非限定的な実施例として、前記２色性の要素６９０は、励起波長を反射するが、光学的観察のために望まれる蛍光波長および任意の波長を通過させるために構成される。
一実施形態では、全ての蛍光励起波長が、分析領域６０８内のサンプルを同時に照射する。例えば、検出器７００は、捕捉された信号および／または画像を撮影し、およびどの波長がどの蛍光を発する蛍光色素分子に関係するかを分解する、プログラム可能なプロセッサ７１０に連結され得る。いくつかの実施形態では、励起源は、サンプルを順次に、すなわち励起源の全体数のサブセットにおいて（翻訳者注記：励起源が個々に順次点灯して）照射する。もちろん、このシステムは、サンプル中の蛍光色素分子の蛍光に基づく励起にのみ限定されず、および他の検出技法および励起技法がその代わりに用いられ単独または複数の組み合わせで用いられ得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態は暗視野照明の散乱情報を蛍光検出との同時の又は順次の組み合わせにおいて収集することもできる。
サンプルホルダー内のサンプル中の対象（例えば、細胞、またはビーズ、または結晶）により散乱された光は、複数の散乱角で散乱され、この散乱角は、光源から対象を通過する入射光の光線に関して測定される。そのような複数の散乱角は、散乱角の範囲を含む。そのようなサンプルホルダーは、本明細書で開示される特性を有することができ、および内部光反射の経路を提供するために構成され得る。光が検出器を通過させられ得る場所で、対象を画像化するために構成された対物レンズは、散乱光を集めて、焦点を調節する。そのような対物レンズおよび検出器により焦点調節された光は、前記検出器の上に光点を形成し得る。実施形態では、前記対物レンズから前記検出器を通過する光は、更なるレンズにより焦点を合わせられることができ；そのような焦点調節は、前記検出器上に形成された光点のサイズを低下させ得る。検出器上に焦点をあわされた光は、更なるレンズを通過するか否かに関わらず、前記サンプルホルダー内の対象から複数の散乱角で散乱された光を含む。
出願人は、本明細書において、さもなければ可能でない、散乱角のより小さな範囲の検出を可能にする、方法、システム、および機器（例えば、サンプルホルダー）を開示し、それにより、サンプルおよびサンプル中の対象のより大きな解像度およびよりよい画像化を提供する。出願人は、本明細書において、例えば、ＰＩＲおよびＴＩＲを経由してサンプルに入射する光線の、散乱光が測定される場所における角度を制御するために効果的な角度および強度を制御するために用いられ得る、キュベットのための設計特性を開示する。
多くのシステム（例えば面積的な、またはシステムを通過する光の拡散範囲）の画像化のための光学以外のものにより課せられた制約により、検出器に到達する光の散乱角は所望のものよりも広い。例えば、ＬＥＤを光源として用いる、いくつかのリングライトとキュベット組み合わせでは、サンプルにぶつかる光線は正準角の周囲の少なくとも２０度外側に広がり得る。言い換えると、主光線が、サンプルに６０度の角度でぶつかる場合、光線の束の他の光線は、サンプルに、約５０度〜約７０度の散乱角でぶつかり得る。対象により収集される光の散乱角の円錐の広がりは、レンズの開口数に依存することが理解されるであろう。そのような場合には、対物レンズ（例えば、４０度の開口数を有す）により収集される光は、約３０〜７０度の円錐体の中にある。従って、そのようなシステムは、サンプルにより散乱されたすべての光を、６０度の中心の周囲＋／−４０度の大きな円錐体中で測定する。しかしながら、本明細書で開示される、いくつかの用途は、より狭い散乱角の範囲、例えば、非常に狭い角度の範囲（例えば６０＋／−５度）での光の検出を必要とする。出願人は本明細書において、この、より狭い範囲内からの光の測定を提供するために、開口部は対物レンズのフーリエ（または後焦点）面（またはこの平面と共役した任意の平面）に配置され得ることを開示する。フーリエ面では、角度情報は、空間的にコードされる。従って、この開口部の形状およびサイズに依存して、サンプルから特定の角度で来る光は、前記検出器に到達することを防止できる（例えば、阻止されるか、またはフィルターで除去される）。環状の開口部は、内側の角度（例えば６０＋／−３０度）を阻止またはフィルターで除去する。結果として生じる測定は、従って所望の角度に合わせることができる。
実施形態では、開口部は、対物レンズからの光が検出器に接触する前に、そこを通過するために提供され得る。実施形態では、開口部は、（対物レンズを通過後に）更なるレンズからの光が検出器に接触する前に、そこを通過するために提供され得る。開口部は、前記検出器まで通過する光を制限するために構成される一方、通過する光は、そのような開口部がない場合に通過する光よりも、より少ない散乱角からの光に減らされ、およびより小さな散乱角の範囲からの光に減らされる。実施形態では、そのような開口部は、円形孔などの単一の孔を含み得る。実施形態では、そのような開口部は、そこを光が通過する円形の環、およびそこを光が通過しない中心領域（例えば、円形の領域）を有するものなどの、単一の環帯を含み得る。実施形態では、そのような開口部は、２、または３、またはそれより多い、そこを光が通過する同心円の環帯を含むことができ、およびそこを光が通過しない中心領域（例えば、円形領域）を含み得る。実施形態では、そのような開口部は、円形または環状の形状以外の他の形状を有し得る。
対象および検出器の間に配設される、例えば更なるレンズおよび検出器（光が対物レンズを通過して、更なるレンズを通過する前）の間に配設されるそのような開口部は、サンプルから散乱された光のより鮮明な区別の利点を提供し、サンプルから得られる光散乱画像（例えば、暗視野画像）の解像度を改善する。光強度が因子であり得る実施形態では、加えられる光の強度（例えば、光源から、または複数の光源から）は、本明細書で開示される開口部を有する構成において、本明細書で開示される開口部を欠く構成に比べて、増大される。
システムは、本明細書において議論され、および記載される特性を有するサンプルホルダー、光源、２色性の鏡、および図７Ａに示される他の要素を含み得る。図７Ｂに図示されるように、システム同様の（例えば、図７Ａおよび本明細書の中の他の図において示されるものと同様の）特性を有するシステムは、サンプルホルダー６００、光源６５０（例えば、光源６５４、または励起源６８０、または両方）、対物レンズ６７０、開口部６９４、更なるレンズ６９６、およびフーリエレンズ６９８を含み得る。開口部６９４は、光が検出器７００まで通過することを許容する単一の通路を有し得る。検出器７００は、作動可能にプロセッサ（例えば、プログラム可能なプロセッサ）７１０と連結され得る。実施形態では、開口部６９４は、光が検出器７００まで通過することを許容する２つの通路を含み得る。実施形態では、光が検出器７００まで通過することを許容する３つの通路を含み得る。実施形態では、開口部６９４は、光が検出器７００まで通過することを許容する４つ以上の通路を含み得る。実施形態では、開口部６９４内の通路は、光が検出器７００まで通過することを許容する円形の孔を含み得る。実施形態では、開口部６９４内の通路は、光が検出器７００まで通過することを許容する２つ、３つ、または４つ以上の円形の孔を含み得る。実施形態では、開口部６９４内の通路は、検出器７００まで光が通過することを許容するために構成された円環を含むことができ。および検出器７００まで光が通過することを許容しない中心部分を含み得る。実施形態では、開口部６９４内の通路は、そのそれぞれが検出器７００まで光が通過することを許容する、２つ以上の円環（例えば、実施形態では、同心の円環）を含むことができ；およびそのような開口部６９４は、検出器７００まで光が通過することを許容しない中心部分を含み得る。そのような円環は、円形、または楕円形、または他の環状の形状を有し得る。
従って、出願人は、サンプルの画像化のためのシステムであって、サンプルホルダー、前記サンプルホルダー内に保持された対象を照明するための光源、前記サンプルホルダー内に保持された対象により散乱された光を収集し、焦点調節をするために構成された対物レンズを含み、前記散乱光は、複数の散乱角で散乱された光を含み、前記対物レンズからの光を通過させるための光学的開口部、および前記対物レンズからの光を、前記光学的開口部上に焦点を合わせるために構成された更なるレンズを含み、前記光学的開口部は、前記対物レンズにより焦点を合わされた光の部分だけが開口部を通過することを許容するために構成され、それにより、前記開口部を通過することを許容された光の部分は、前記複数の散乱角の部分だけによって散乱された光から成るシステムを開示する。
本明細書において使用される、用語「落射」（ｅｐｉ）および「落射照明」（ｅｐｉ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）は、対象またはサンプルの観察または画像化のために使用される他の光学的要素から、一般的に遠ざかる方向に移動する光によるサンプルの照明を指す。従って、蛍光の不在下では、落射照明により照明されたサンプル画像は、サンプルにより反射または散乱された光により形成される（光源からサンプルまで移動する光、および観察、画像化、または測定のための光学的要素まで、サンプルにより反射または散乱されて戻される光）。本明細書において使用される、用語「徹」（ｔｒａｎｓ）および「徹照」（ｔｒａｎｓ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）は、一般的に、対象または対象の観察または画像化に用いられる他の光学的要素に、近づく方向に移動する光（光源からサンプルまで、およびそれを通過し、および観察、画像化、または測定のための光学的要素まで継続して移動する光）によるサンプルの照明を指す。従って、蛍光の不在下では、徹照により照明されたサンプルの画像は、サンプルを通過するか、またはサンプルにより散乱された光により形成される。
サンプルに対して、対物レンズまたはサンプルの観察もしくは撮像のために用いられる他の光学的要素と同じ側に、光源が配設される場合には、光源からの光はサンプルまで直接移動し、およびサンプルは従って典型的には落射照明により観察または撮像される。しかしながら、サンプルに対して、対物レンズまたは光学的要素と同じ側に、唯一の光源が配設される場合でも、本明細書において開示されるサンプルホルダーは、サンプルの落射照明に加えて徹照を提供できる。従って、両方向の照明が、サンプルの両側に光源を配置する必要なく可能にされる。そのような構成は小型であり、資源を無駄にせずに、および、光源および他の光学的要素が、サンプルホルダーの一つの側にのみ配設されるので、この構成は、光学的要素による干渉なしでサンプルホルダーの側面への妨げられないアクセスを許容する。従って、そのような構成は、光学的画像化または測定、または光学的画像化または測定に用いられる装置および要素への干渉なしでの、サンプルホルダー中のサンプルおよび試薬の、充填、混合および除去を可能にする。
図４Ａおよび４Ｂの画像により説明されるように、暗視野画像に徹照を加えることは、画像を格段に増強し、およびこの画像から利用可能な情報を格段に増強する。本明細書において開示される方法およびシステムは、単一方向からの照明を用いることにより、および、実施形態では、単一の光源のみからの、落射照明および徹照の両方を組み合わせることにより、そのような格段に増強された画像を提供しする。
本明細書で開示される、キュベット６００などのサンプルホルダー（例えば、図８Ａ〜８Ｄに図示されるような）は、キュベット６００の分析領域６０８に保持されるサンプルが、直接光（落射照明；例えば、経路８３０に沿って移動する光）および間接的な反射光（徹照；例えば、経路８２０または８２５に沿って移動する光）によっても照射されるために、光源からの光の内部反射（ＰＩＲまたはＴＩＲのいずれか）を許要するために構成される。本明細書で開示される、キュベット６００に対して光学的要素６７０、６９０、７００などと同じ側に配設された光源からの光は、、サンプルの落射および徹照の両方を提供し得る。
図８Ａ〜８Ｄを参照し、まだ更なる実施形態について記載する。図８Ａ〜８Ｄは、キュベット６００および限定はされないが図６Ａおよび６Ｂに示されるリングライト６５０などの暗視野散乱照明源の部分の模式的な断面図を示す。基部支持物６２０も図８Ａ〜８Ｄに示されている。図８Ａ〜８Ｄは、括弧および構造または構造の一部分を示す矢印を含み；例えば、６００と標識された括弧は、図中に示されるキュベット６００全体を示し；６１２と標識された括弧は、前記キュベット６００のカバー部分６１２を示す。図８Ａの６２１〜６２６の矢印は、カバー部分６１２の示された部分に対する寸法を示す。これらの寸法は、キュベット６００の異なる実施形態で変化することができ、およびそのような変動は、キュベット６００の構築および使用に関するサイズ、用途、材料、光学的波長、サンプル、および他の要素および因子に依存し得ることが理解され得るであろう。例えば、実施形態では、支持構造６０４の間の距離６２１は、約０．１ミリメートル（ｍｍ）〜約１センチメートル（ｃｍ）であることができ、および実施形態では約１ｍｍ〜約１００ｍｍ、または約１．５ｍｍ〜約５０ｍｍ、または約２ｍｍ〜約２０ｍｍの間であることができる。更なる実施形態では、支持構造６０４の間の距離６２１は、約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍ、または約１ｍｍ〜約５ｍｍであることができる。実施形態では、支持構造６０４の高さ６２２は、約０．１ｍｍ〜約１００ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約５０ｍｍ、または約１ｍｍ〜約２５ｍｍであることができる。更なる実施形態では、支持構造６０４の高さ６２２は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、または約１ｍｍ〜約５ｍｍであることができる。同様に、実施形態では、前記制御された厚さの領域６１３の高さ６２３は、約０．１ｍｍ〜約１００ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約５０ｍｍ、または約１ｍｍ〜約２５ｍｍであることができる。更なる実施形態では、前記制御された厚さの領域６１３の高さ６２３は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、または約１ｍｍ〜約５ｍｍであることができる。実施形態では、層８００の厚さ６２４は、約０．０１ｍｍ〜約１０ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約０．５ｍｍであることができる。実施形態では、分析領域６０８の幅６２５は、約０．０５ｍｍ〜約１００ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約５０ｍｍ、または約１ｍｍ〜約２５ｍｍであることができる。更なる実施形態では、分析領域６０８の幅６２５は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、または約１ｍｍ〜約５ｍｍであることができる。実施形態では、支持構造６０４の幅６２６は、約０．１ｍｍ〜約１００ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約５０ｍｍ、または約１ｍｍ〜約２５ｍｍであることができる。更なる実施形態では、支持構造６０４の幅６２６は、約０．０５ｍｍ〜約１０ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約５ｍｍであることができる。
本明細書の任意の１つの図に図示される、照明のための、励起のための、発光の観察のためなどの、光学的な構成要素および配列は、そのような特定の構成要素または配列が明示的にそれぞれの図に示されていなくとも、他の図の実施形態に適応され得る構成要素および配列を示唆する。例えば、リングライト６５０または他の照明源６５０が図８Ｄに含まれていなくとも、示される任意の実施形態において、および他の実施形態においては、リングライト６５０または他の照明源６５０（例えば、図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃを参照されたい）が、分析領域６０８（分析領域６０８は図８Ａおよび８Ｂに示されている）を照明するために用いられ得る。キュベット６００とともに使用するのに適切な光学的構成要素の例として、リングライト構成要素６５２および６５４が図８Ａ、８Ｂ、および８Ｄに示され；実施形態では、他のまたは他の数の、照明の構成要素が用いられ得る。例えば、光源６５４は白色光または限定はされないが特異的ｄｘｃな波長出力または出力範囲を持つ発光ダイオード（ＬＥＤ）またはレーザー・ダイオードなどの光源であり得る。随意的に、光源６５４の環は、光の環（例えば、多くの接合部を持った）を提供するために構成される光ファイバーであり得る。随意的に、光源６５４は、反射器により制御される特定の狭い発散角を有するＬＥＤであり得る。リングライトからの発散角を光源の選択および／または反射器の設計を介して制御することが望ましい。
非制限的な実施例として、狭い光パターンを提供するために、光源６５４はレーザー照明を用うことができ、存在する落射形式の照明構成の中で、より低い徹照をもたらす（照明の構成要素の全てが、サンプルに対して１つの側にある）。なぜならば光源は：光の狭いスポットを提供し（サンプル分析領域６０８中に向けられる）；狭いスペクトル幅の光を提供し（例えば、特定の主波長の周りを中心とする狭い範囲内の波長の光）；およびコヒーレントな源であるからである。随意的に、ＬＥＤの照明源６５４としての使用も、小さなスポットのサイズも提供し得て（例えば、分析領域６０８内での小さなスポットのサイズ）、およびそのために、レーザー光源により達成されるいくつかの有益な性質を提供する。これらの、および他の理由に対して、レーザー光源（小さなスポットのサイズを提供するＬＥＤ）は、他の照明構成に比較して、バックグラウンド信号レベルを低下させるために効果的である。レーザー照明は、典型的にはより広がった光源で生じるものよりも、散乱光を減少させることができ、従って隣接するチャネル（例えば、隣接する第二の分析領域６０８）からの、チャネル内に入る散乱された光を低下させることにより、１つのチャネルでのバックグラウンドを低下させることができる（例えば、第一の分析領域６０８内で）。従って、レーザー照明は、より広がった光源による照明から予期されるものよりもより少ない徹照のバックグラウンドをもたらし得る。もちろん、バックグラウンドにおける、より大幅な減少が、より区別できる信号をもたらす場合には、徹照における減少がバックグラウンドにおける減少よりも少ないことが望ましい。随意的に、照明源６５４としてのＬＥＤの使用が、増加されたバックグラウンドおよび増加された徹照を持った、より広がった光パターンを提供する。もちろん、徹照における増加がバックグラウンドにおける増加よりも大きいことが望ましい。
いくつかのキュベットの実施形態は、一緒に接着された複数の個別の層から形成されたキュベットを有することができ、前記キュベットは１つ以上の物質から成形され、および／または単一または複数の内部反射（例えば、ＴＩＲまたはＰＩＲ）を増強するために、前記キュベットの異なる表面に付加された反射層を有する。
実施形態では、本明細書において開示されるシステム、キュベット、および光学的要素は、蛍光との組み合わせで作動することができ、そのようなシステムおよびキュベットでは、単なる光照明ではなく暗視野照明と使用されることが望ましい。しかしながら、例えば、蛍光検出が暗視野および／または明視野顕微鏡との組み合わせで使用されない場合には。いくつかの実施形態は単なる白色光を用い得る。
図８Ａおよび８Ｂは、いくつかの実施形態では、機器が前記キュベット６００内に光学的に非透過性な層８００などの層を有し得ることを示している。このことは、光源６５４が広がり、および光が特異的な場所に向かわない実施形態では有用である。層８００は、所望の角度および／または場所において前記キュベット６００に入射しない光を遮断し得る。層８００は、分析領域６０８の下の領域を通過する以外の照明を防止するために位置決めされるために構成され得る。いくつかは分析領域６０８に一番近接して黒塗りされる（ｂｌａｃｋｅｄ ｏｕｔ）特異的な領域のみを有し得る。いくつかの実施形態は遮断される、または非透過性の物質を２つ以上の層に有し得る。いくつかは、限定はされないが１つが水平で、もう１つが垂直または非水平などの異なる配向にある、遮断されるか、または非透過性の物質の物質を有し得る。
実施形態では、層８００は光学的に透過性であり得ることが理解されるであろう。例えば、図８Ｄは、層８００が光学的に透過性である実施形態を表す。いくつかの実施形態では、層８００は、制御された厚さの領域６１３、または基部支持物６２０、またはその両方と異なる屈折率を有する光学的に透過性の物質を含み得る。いくつかの実施形態では、層８００は、制御された厚さの領域６１３、または基部支持物６２０、またはその両方と同じ屈折率を有する光学的に透過性の物質を含み得る。
図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃでは、光源がキュベット６００の下に配置される（光学系６５２および６５４の近傍）、および基部部分６０６の下部から向かわされる光が提供されることを示す。そのような光源が、図８Ｄに図示される実施例においても同様に所定の場所にあることが理解され得る。これらの図に示されるように、光源６５０は、リングライト６５４およびドーナッツ型の反射器６５２を含み得る。制限なしに、レンズ、フィルター、格子、鏡および他の反射面、光ファイバー、プリズム、および他の要素を含む他の要素が含まれ得る。実施形態では、光源は、レーザー、またはＬＥＤ、または他の光源を含むことができ；およびそのような光源から別の場所に光を運搬し、および／または光を光学的要素に向ける光ファイバーを含み得る。光学的システムのための１つの設計基準は光源からの光の発散、または発散角であり；低い発散を有する幅Ｄの光源は、高い発散を有する幅Ｄの光源よりも、光源から所定の距離において、所定の距離において、より小さなスポットを提供する。一般的に、低い発散を有する光を提供する光源６５０が好適である。そのような光学的要素および構成は、実質的に視準の合った（平行な）光を提供するために設計されることができ、例えば、ほとんどまたは全ての光が、サンプルに向かって（例えば、分析領域６０８に向かって）実質的に平行な経路に沿って向かわせられる。しかしながら、拡散または散乱光が好適である実施形態では、高い発散を有する光源６５０が使用され得る。
図８Ｃに示されるように、本明細書において開示される機器またはシステムの一部として適切な光学的システムの実施形態は、光学系（例えば、図８Ｃに示されるような、リングライト６５４のような、光源６５０，および対物レンズ６７０）、キュベット６００、および画像化のためにキュベットを保持および位置決めするために構成された基部支持物６２０を含み得る。図８Ｃに示される実施形態では、基部支持物６２０は、光源６５０からの光の経路を屈折させる（または回折、またはさもなければ経路を変更する）ために構成された光学的特性８０２を含み得る。図８Ｃに図示されるように、光学的特性８０２は、小型レンズを含み得る。光学的特性８０２が、任意の適切な光学的特性を有し得ることが理解されるであろう。実施形態では、光学的特性８０２は、小型レンズ、または回折格子、またはフレネル（Ｆｒｅｓｎｅｌ）レンズ、または凸面、または凹面、または屈折、回折または光を変更するか、もしくはそれらを組み合わせる他の形状および特性を有し得る。実施形態では、そのような光学的特性８０２は、基部支持物６２０とは異なる物質を含むことができ、および基部支持物６２０とは、異なる屈折率を有し得る、例えば、光学的特性８０２により影響された光は、直接的にか、または本明細書において開示される方法における使用に適切な、例えば分析領域６０８中のサンプルに落射照明および徹照の両方を提供するための反射（例えば、内部反射）を介して間接的にかの、いずれかにより分析領域６０８に向かわされることができる。図８Ｃに示される実施形態において図示されるように、そのような実施形態は、光学的特性８０２を迂回する光の経路も含み得る。そのような光の経路は、光学的特性８０２を介した画像化を要する経路よりも、分析領域６０８内のサンプルの画像化にとってより適切である。実施形態では、両方のタイプの光の経路（すなわち、光学的特性８０２を迂回するもの、および光学的特性８０２を通過するもの）が、同時に提供されることができ、従ってキュベット６００に対して同側に位置する光源６５０からの落射照明および徹照の両方により照明される、サンプルの画像分析のために適切な光学を提供する。
前記キュベット６００は、キュベットおよびキュベット内のサンプルを照明する光の経路に影響する特性を含み得る。そのような徹照は、キュベット６００内で反射された光により達成され得る（例えば、表面６１２、表面６０４、または他の表面または表面の組み合わせからの部分内部反射（ＰＩＲ）または全内部反射（ＴＩＲ）を含むか、主にそれらによる内部反射）。他のＴＩＲを受ける光の経路は、例えば、図８Ａ、８Ｂ、および８Ｄに示される。
図８Ｄに図示されるように、実施形態では、本明細書で開示され、および本明細書において開示される方法において使用されるために適切な機器またはシステムの光学的システムのキュベット６００は、前記キュベット６００の内部部分を照明する、分析領域６０８およびキュベット６００の分析領域６０８内のサンプルを照明する光などの光の経路に影響する特性を含み得る。図８Ｄに示されるように、層８００は、分析領域６０８に入射する光の経路を屈折、回折またはさもなければそれに影響するか、それを変更する特性を含み得る。そのような光の経路の変更は、分析領域６０８内のサンプルの照明に影響を与え、および改善し得る。図８Ｄに示される実施例では、光は、層８００に横軸方向から入射し；この光の経路は、層８００の形状（および物質の性質）により変更され、および所望の通りに分析領域６０８内に向かわせられる。例えば、層８００の外部の表面平坦であるか（例えば、外部の表面６７４）、または曲面であることができる（例えば、外部の表面６７６）。例えば、層８００の内部表面は平坦であることができ（図８Ｄには示されていない）；しかしながら、図８Ａおよび８Ｂ内のそのような表面（図８Ａおよび８Ｂ中の層８００は光学的に透過性ではないが、これらの表面は平坦である）か、または曲面である（例えば、図８Ｄに示される内部表面６７８）。実施形態では、このような光の経路変更は、分析領域６０８中のサンプルに、落射照明および徹照の両方を提供するために効果的である。
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄは、サンプルホルダー内の光の経路を示し、上表面６１４におけるカバー部分６１２、および／または支持構造６０４における表面６１８内でのＴＩＲおよびＰＩＲの例を提供する。キュベット６００などのサンプルホルダーは、光が透過できる光学的に透過性の表面を有することができ；実施形態では、そのような光学的に透過性の表面は、有意の収差または光強度の減少なしで光が通過することを許容し得る。キュベット６００などのサンプルホルダーは、光が前記サンプルホルダー内を通過し得るために効果的な、光学的に透過性の物質から形成され得る。サンプルホルダーが少なくとも部分的に光学的に透過性の物質から形成される実施形態では、光はサンプルホルダーの光学的に透過性の表面を通過することができ、および前記サンプルホルダー内を移動し得る。実施形態では、サンプルホルダー内を移動する光は、１つ以上の表面において反射されることができ、およびサンプルホルダー内の反射経路に沿って移動する。サンプルホルダーの外部に配設された、光源からの光が、サンプルホルダーの光学的に透過性の表面を通過して、サンプルホルダーに入射する場合、そのような光は、前記サンプルホルダー内を光源から遠ざかる方向に移動することができ、および反射された後に反射光が光源に向かう方向に移動できるために、サンプルホルダーの表面で反射され得る。このような反射はＰＩＲまたはＴＩＲによることができる。
すなわち、キュベット６００内を通過する光は、表面で反射する（例えば、表面６１４または表面６１８）。そのような内部反射は、分析領域６０８内のサンプルを間接的な光で照射するために効果的であることができ；直接的な照明（サンプルに衝突する前に光が反射されない）との組み合わせにおいて、このサンプルは、このような方法で落射照明（光学的検出要素と同側からの照明）および徹照（光学的検出要素とは反対側からの照明）を受ける。
ＰＩＲを促進または増強する、光の波長、物質、表面、および構成またはＴＩＲを促進または増強するためには適切または効果的でないことがあり得ることが理解されるであろう。ＴＩＲを促進または増強する、光の波長、物質、表面、および構成またはＰＩＲを促進または増強するためには適切または効果的でないことがあり得ることが理解されるであろう。従って、どちらかが無い場合に、ＰＩＲおよびＴＩＲのどちらか一方が促進される設計および構築がある。実施形態では、ＰＩＲおよびＴＩＲの両方が促進される設計および構築がある。実施形態では、ＰＩＲおよびＴＩＲのどちらも促進されない設計および構築がある。
図８Ａに図示されるように、支持構造６０４は四角形または正方形の断面を有し得る。支持構造６０４は、例えば、図８Ｂに示されるように、三角形の断面形状などの四角形または正方形以外の他の断面形状を有することができ；他の断面形状（例えば、円形または半円形、またはギザギザの、または不規則な）も本明細書において開示されるシステムおよびキュベットとの使用に適切であり得ることが理解されるであろう。ＰＩＲおよびＴＩＲは、前記キュベット６００のために使用される物質、コーティング、金属被覆、または塗布される被膜、および形状および／または前記キュベット６００の制御された厚さの領域６１３の厚さに基づいて選択され得る調節可能な特性である。実施形態では、ＰＩＲが好適であることができ、および光、物質、および構成がＰＩＲを増強するために選択され得る。
実施形態では、ＴＩＲが好適であり得る。実施形態では、光源６５０からの光の波長がＴＩＲを増強するために選択され得る。実施形態では、キュベット６００の材料、厚さ、表面構成、および他の特性が、ＴＩＲを増強するために選択され得る。例えば、制御された厚さの領域６１３の高さ（層８００と接触するカバー部分６１２の基部から測定されるもの）は、分析領域６０８に到達する光がＴＩＲにより反射される角度および強度に影響する。サンプルの斜めの角度の照明（サンプルの上から来る照明）を可能にする、前記キュベット内での光のＴＩＲを可能にするためのキュベット６００の構成が、特に暗視野顕微鏡について望ましい。いくつかの実施形態では、サンプルの上からのＴＩＲを最大化することが望ましい。随意的に、いくつかの実施形態ではキュベット６００は、分析領域６０８の上の表面からのみのＴＩＲを提供するために構成され得る。随意的に、いくつかの実施形態は、制御された厚さの領域６１３の上の表面（例えば、図８Ａおよび８Ｂに示される実施形態では、おおむね分析領域６０８の上）からのみのＴＩＲを提供するために構成され得る。随意的に、いくつかの実施形態では、キュベット６００は、前記キュベット６００内の他の表面からの光のＴＩＲを提供するために構成されることができ；例えば、前記キュベット６００内の他の表面からの光のＴＩＲは、分析領域６０８に光を戻して向かわされるために効果的な、光を斜めの角度に散乱するために、提供され得る。
キュベット６００を構築するために使用される設計および材料は、光のＴＩＲを提供するために選択および構成され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＴＩＲを提供する、または増加または増強された量のＴＩＲを提供する構成は、制限なく：制御された厚さの領域６１３の寸法が、ＴＩＲに適合するか、またはＴＩＲを増強する構成；表面６１４または表面６１８の角度（例えば、入射光に関して）が、ＴＩＲに適合するか、またはＴＩＲを増強する構成；形状、テクスチャ、または表面６１４または表面６１８の被覆が、ＴＩＲに適合するか、またはＴＩＲを増強する構成；制御された厚さの領域６１３を形成する材料の屈折率、および制御された厚さの領域６１３の境界を形成する表面６１４に接触する物質または空間の屈折率との差が、ＴＩＲに適合するか、またはＴＩＲを増強する構成；支持構造６０４を形成する物質の屈折率および支持構造６０４の境界を形成する表面６１８と接触する物質または空間の屈折率との差が、ＴＩＲに適合するか、またはＴＩＲを増強する構成；および他の構成および設計を含む。ＴＩＲを増強するために、光がその中で（内部的に）反射される第一の物質は、光が内部的に反射されない場合に、光がその中を通過する第二の物質よりも高い屈折率を持たなければならない；というのは、この第二の物質は通常は、ほぼ１に近い屈折率を持つ空気であり、このことを確実にすることは通常困難ではないためである。臨界角よりも大きくなければならない。例えば、図８に示される実施形態を参照して、制御された厚さの領域６１３および構造６０４を形成する物質（例えば、表面６１４および６１８の外側の領域）は、空気より大きな屈折率を持たなければならない。層８００内でのＴＩＲが望まれる実施形態では、図８Ａ、８Ｂ、および８Ｄに図示された壁においてＴＩＲが生じることを確実にするために、層８００の材料は制御された厚さの領域６１３よりも低い屈折率を持たなけらばならない。代替的な実施形態では、層８００の材料は、分析領域６０８内のサンプルに向けられる光の、徹照の構成要素を最適化するために、角度および物質が調整されることができるために効果的な境界（層８００および制御された厚さの領域６１３の間）においてＴＩＲを生成する、制御された厚さの領域６１３の材料よりも高い屈折率を持たなければならない。
実施形態では、表面６１４または６１８は、表面での反射率（ＰＩＲであれ、またはＴＩＲであれ）に影響するか、または低下させるために被覆または処理され得る。実施形態では、表面６１４または６１８は、表面の外への光の漏えいを減少させるために、被覆または処理され得る。例えば、表面６１４または６１８がＴＩＲ適合するか、またはＴＩＲの量を増強する場合でも、いくらかの光は、表面６１４または６１８の外へ伝送または屈折される。キュベット６００から漏出する迷光の量を減少させるために、光吸収コーティングまたは物質が、そのような表面６１４または６１８、またはその一部に配置または塗布されることができる。そのような光吸収コーティングは、例えば、染料、インク、塗料、表面処理、黒色または着色テープ、または他のコーティングまたは表面処理であり得る。実施形態では、光学的に吸収性の表面を提供するために、黒色または他の光吸収性固体物質が、表面６１４または６１８に対して、または隣接して配置され得る。
随意的に、いくつかの実施形態では、キュベット６００は、キュベットの一部分から光のＴＩＲを提供しない（またはわずかな量のＴＩＲのみを提供する）ために、またはＰＩＲを提供しないために（またはわずかな量のＰＩＲを提供するために）構成され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キュベット６００は、支持構造６０４から光のＴＩＲまたはＰＩＲを提供しないために（またはわずかな量のＴＩＲまたはＰＩＲを提供するために）構成され得る。随意的に、いくつかの実施形態では、キュベット６００は、表面６１８から光のＴＩＲまたはＰＩＲを提供しないために（またはわずかな量のＴＩＲまたはＰＩＲを提供するために）構成され得る。ＴＩＲまたはＰＩＲを提供しない構成、またはわずかな量のＴＩＲまたはＰＩＲのみを提供する構成は、制限なく：制御された厚さの領域６１３の寸法が、ＴＩＲまたはＰＩＲに適合しないか、またはＴＩＲまたはＰＩＲを増強しない構成；表面６１４または表面６１８の角度（例えば、入射光に関して）が、ＴＩＲまたはＰＩＲに適合しないか、またはＴＩＲまたはＰＩＲを増強しない構成；形状、テクスチャ、または表面６１４または表面６１８の被覆が、ＴＩＲまたはＰＩＲに適合しないか、またはＴＩＲまたはＰＩＲを増強しない構成；制御された厚さの領域６１３を形成する材料の屈折率、および制御された厚さの領域６１３の境界を形成する表面６１４に接触する物質または空間の屈折率との差が、ＴＩＲまたはＰＩＲに適合しないか、またはＴＩＲまたはＰＩＲを増強しない構成；支持構造６０４を形成する物質の屈折率および支持構造６０４の境界を形成する表面６１８と接触する物質または空間の屈折率との差が、ＴＩＲまたはＰＩＲに適合しないか、またはＴＩＲまたはＰＩＲを増強しない構成；および他の構成および設計を含む。
随意的に、いくつかの実施形態では反射性物質が、表面６１４および／または表面６１８に配置されるか、または取り付けられる。そのような反射性物質は、例えば、銀、または金、またはアルミニウムなどの金属であることができ；マグネシウムまたはフッ化カルシウム、または他の塩または金属酸化物などの誘電体であることができ；または他の反射性物質であることができる。典型的には、そのような反射性コーティングは非常に薄いことができ（例えば、約０．１ミクロン未満、または最大約１００ミクロンの厚さであることができる）。随意的に、反射性物質（例えば、反射性コーティング）は、表面６１４にのみ配置、または取り付けられ得る。随意的に、反射性物質は、表面６１８にのみ配置、または取り付けられ得る。随意的に、表面６１８は、光吸収性になるために黒色になるために処理され得る。他の実施形態では、表面６１４は、光吸収性になるために黒色になるために処理され得る。いくつかの実施形態は、制御された厚さの領域６１３の幅を、分析領域６０８よりも広くなるように選択できる。いくつかのレーザー照明を用いる実施形態について、分析領域６０８の間に黒塗り（ｂｌａｃｋｏｕｔ）が必要ないために、レーザー照明が、十分に焦点を合わされるために、層８００は除去されるか、または光透過性であることができる。
例および限定しないものとして、ＰＩＲ、ＴＩＲ、または両方の使用は、隣接する領域から経路８２０に沿って移動する光が、分析領域６０８の中に向かわされることを可能にする。図８Ａ、８Ｂ、および８Ｄに示されるように、経路８２０に沿って移動する光は分析領域６０８に向かって反射され、および経路８２５に沿って移動する光は、キュベット６００内および最終的に分析領域６０８を移動するに連れて複数の反射を受ける。示されるように、経路８２０ｉｎ図８Ｂ中の経路８２０に沿って移動する光は、キュベット６００内および最終的に分析領域６０８を移動するに連れて複数の反射を受ける。図８Ｂに図示されるように、そのような反射はＰＩＲであり得るかまたはＴＩＲであり得る。従来の用語では、図８Ａに経路８２０および８２５に沿って移動する光により示される照明、および図８Ｂに経路８２０に沿って移動する光により示される照明は徹照である。図８Ａおよび８Ｂに、経路８３０に沿って移動する光により示される照明は、リングライトから直接来る光を示し、およびＴＩＲを経由してではなく：これは落射照明である。サンプルの下（またはサンプルに対する一つだけの側）に配置された光源からの光構成要素の両方のタイプの組み合わせは、照明構成要素のただ一つだけを提供する光源に比べて、改善された性能を可能にする。これは特に暗視野顕微鏡について有用である。
図８Ａ〜８Ｄに示される実施形態の使用の制限しない例は、ンプル中の細胞の散乱性質を測定するための暗視野照明である。暗視野顕微鏡は、コントラストを増強する技法として主に用いられる確立された方法である。暗視野顕微鏡では、サンプルにより散乱された光または反射された光だけが撮像されるために、画像のバックグラウンドは、完全に暗い。定量的暗視野顕微鏡は、フローサイトメトリーにおける従来の「側方散乱」パラメータに匹敵する様式で、細胞の散乱性を測定するためには用いられていない。
ハードウエアの視点からは、暗視野顕微鏡のための照明は、斜めであることが望ましく、すなわち、全ての照明光源からの光線は、サンプルに第一に接触するすることなく、対象に入射するべきではない。例としておよび限定ではなく、照明は、サンプル中に既に存在する、いかなる他の蛍光色素分子をも励起しない波長でなければならない。随意的に、この照明は、画像化のために、高い開口数（ＮＡ）のレンズの使用を可能にする。例としておよび限定ではなく、光学的顕微鏡に付随する従来のレンズサイズについては、このＮＡは少なくとも約０．３であることができる。随意的に、このＮＡは少なくとも０．４であることができる。随意的に、このＮＡは少なくとも０．５であることができる。随意的に、いくつかの実施形態は、特にレンズサイズが特定のレベル以下に限定される場合に、所望のＮＡを得るために、油浸対物レンズを用い得る。
暗視野照明のための従来の方法は徹照を用いており、画像化レンズおよび暗視野光源の間にサンプルがある。従って、この従来の配列においては、検出および照明の構成要素はサンプルとは同側にない。この従来の落射照明方法（画像化レンズ／対物レンズおよび光源が、サンプルと同じ側にある）は、特別に製造された対物の使用を要求し、および典型的には高いＮＡの対物の使用を許容せず、従って全システムの能力を制限する。
それに反して、本明細書において記載される、少なくともいくつかの暗視野照明システムの実施形態は以下の属性を有する。ハードウエアに関しては、図８Ａ〜８Ｄの実施形態のスキームは暗視野照明に用いられるリングライトは、サンプルに対して、対物レンズと同じ側にある「落射」（ｅｐｉ）である。これはシステム的な視点からは望ましいが、光源が他の側にある代替的な実施形態が、単独で、または本明細書に記載される実施形態との組み合わせにおいて使用され得る。一つの非限定的な実施例では、前記リングライトは、光源６５４のＬＥＤおよび／またはレーザーのすべて同じ平面にあり、および同じ配向を有する（光源は同じ水平面にありおよび光を上向きに向かわせているように設計され得る）。いくつかの実施形態は、サンプル平面に光を有するが、光を、限定はされないが円錐形の様式などの、非平行の様式で向ける。いくつかの実施形態は光を異なる平面に有するが、光を同じ配向に向ける。いくつかの実施形態は、光を異なる平面に有するが、光を、限定はされないが円錐形の様式などの、非平行的な様式で向ける。いくつかの実施形態では、サンプルの斜めの照明を達成するために、光はドーナッツ型の鏡６５２により反射される。
リングライトおよびドーナッツ型の反射器光学的性質に加えて、図８Ａ〜８Ｄの実施形態に示される前記キュベット６００の光学的性質も暗視野照明に顕著に影響する。この実施形態では、血球計算キュベット６００は、リングライト６５０から来る光がサンプルに直接落ちるように設計されるが；これに加えて、徹照を模倣するために光は前記キュベットの特性からサンプル上で「反射」もされる。この反射はＴＩＲおよび／または真の反射によることができる。
いかなる徹照配置もサンプルからの前方散乱光の測定を可能にする一方で、落射配置は、サンプルからの後方散乱光のみの測定を可能にすることに注意されたい。前方散乱光は一般的に強度において後方散乱光よりも２桁強い。従って、徹照の使用ははるかに低い照明強度の使用、およびサンプルへの有害な副次的影響を軽減することを可能にする。
図８Ａの実施形態に見られるように、リングライト６５０（または他の照明源）およびキュベット６００は、徹照および落射照明の強度が従来の落射照明よりも改善された性能のためにチューニングされ得るシステムを提供する。同様に、リングライト６５０（または他の照明源）およびキュベット６００は、徹照および落射照明の強度が従来の落射照明よりも改善された性能のためにチューニングされ得る、図８Ｂの実施形態におけるシステムを提供する。このチューニングは、選択される材料（例えば、それらの光学的性質）および角度および全内部反射の程度を制御するためのキュベット形状の設計に基づいて達成され得る。
図８Ｃに示されるように、特性８０２は入射光の経路を変更でき、およびそのために、徹照および落射照明の両方を増強するために用いられる。図８Ｄに示されるように、表面６７４、６７６、および６７８の形状および構成が入射光の経路（例えば横断する照明）を変更することができ、そのために徹照、落射照明、もしくはその両方を提供または増強するために用いられる。
図８Ｅは、サンプル調製位置から、光学的検出器Ｄ近傍のサンプル観察位置までの、キュベット６００の輸送の模式的な表現を提供する。図に示されるように、サンプルホルダー６００は、１つの位置から、検出器Ｄに隣接した位置またはその上に移動され得る。検出器Ｄは、キュベット６００を受け取り、保持しおよび位置決めをするために構成されたステージを含み得る。サンプルは、サンプルホルダーに、入り口ポート６０２（例えば、６つの入り口ポート６０２が図８Ｅの実施例に示されている）、および次いで図８Ｅに示されるキュベット６００の（例えば、支持構造６０４の表面に対して内部の）分析領域６０８（示されていない）内の光学的観察および測定のための位置内にあることができる。分析領域６０８内に保持されるサンプルは照明されることができ、および検出器Ｄにより検出され得る。実施形態では、検出器Ｄは、定性的観察または撮像を行うために構成されることができ、および実施形態では検出器Ｄは、定量的観察または撮像を行うために構成されることができる。
図８Ｅに示される検出器Ｄは、血球計算ユニットまたは血球計算モジュールを含み得るか、またはその一部であり得る。そのような血球計算ユニットまたは血球計算モジュールは、サンプル分析のための独立したユニットまたはモジュールを含み得る。実施形態では、他の分析能力および機器は検出器Ｄに含まれることができるか、もしくはそれと共に収納されることができるか、または検出器Ｄと連結して、使用されるために構成され得る。実施形態では、本明細書において開示されるサンプル分析のためのシステムは、例えばキュベット６００中のサンプルを分析するために用いられる検出器Ｄを含む、そのような血球計算ユニットまたは血球計算モジュールを含み得る。例えば、実施形態では、本明細書において開示されるサンプル分析のためのシステムは、キュベット６００中のサンプルを分析するために用いられる検出器Ｄに加えて、他の分析能力および機器を提供する、そのような血球計算ユニットまたは血球計算モジュールおよび他のユニットまたはモジュールを含み得る。そのようなシステムにおいては、そのような他のユニットまたはモジュールは、検出器Ｄと共に収納されるか、または検出器Ｄと連結して使用されるために構成され得る。そのような他の分析能力および機器はサンプルに適用されることができ；例えば、そのような分析能力および機器は、キュベット６００中に存在するサンプルまたはサンプルの一部分を分析するために用いられることができる。実施形態では、そのような分析能力および機器は、キュベット６００中に存在するサンプルの異なる部分を分析するために用いられ得る（例えば、サンプルが２つ以上の等分に分割されることができ、１つの等分がキュベット６００に血球計算の分析のために配置され、および１つ以上の他の等分が血球計算ユニットまたは血球計算モジュールの中に収納される、もしくはその近傍の、またはそれと連結して作動される他の機器により分析される）。従って、例えば、そのような血球計算モジュールにより遂行される分析とは独立して、サンプル（またはその一部分）は、化学的分析ユニット、または核酸分析ユニット、またはタンパク質分析ユニット（例えば、サンプルを分析するために抗体または特異的に結合する他の分子を用いるユニット）、または他のそのようなユニット、またはユニットおよび能力の組み合わせにおいて測定および／または分析され得る。そのような分析は、サンプル中に存在する小分子および要素のための分析（例えば、一般化学ユニットによる）；サンプル中に存在する核酸分子のための分析（例えば、核酸ユニットによる）；サンプル中に存在するタンパク質および／または抗体反応性抗原のための分析（例えば、酵素免疫吸着法検定（ＥＬＩＳＡ）ユニットによる）；またはこれらの組み合わせによる分析を含み得る。加えて図８Ｅに示されおよび本明細書において議論されるシステムは、ユニットまたはモジュールの１つ以上における作動を制御し、それらの予定を決めるための制御装置を含み得る。
図８Ｆは、キュベットをサンプル調製位置から光学的検出器Ｄの近傍のサンプル観察位置まで輸送するための輸送機構を含むシステムの更なる詳細な表現を提供する。図８Ｆに示される実施形態のシステムなどのシステムは、独立して作動するために構成され得るか、または実施形態では共に作動するために構成され得る、複数のサンプル分析モジュールを含み得る。図８Ｆに示される、このシステムは、検出器Ｄを持つ単一の血球計算ユニット７０７を含み；実施形態では、分析モジュール７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、および７０６のいずれか、またはすべてにより分析されたサンプル（またはその一部分）は、検出器Ｄによる観察および測定のために血球計算モジュール７０７へ輸送され得る。血球計算モジュール７０７により遂行される分析とは独立して、サンプル（またはその一部分）は、化学的分析ユニット７１５において測定および／または分析され得る。そのような分析は、サンプル中に存在する小分子および要素のための分析（例えば、一般化学ユニットによる）；サンプル中に存在する核酸分子のための分析（例えば、核酸ユニットによる）；サンプル中に存在するタンパク質および／または抗体反応性抗原のための分析（例えば、酵素免疫吸着法検定（ＥＬＩＳＡ）ユニットによる）；またはこれらの組み合わせによる分析を含み得る。
図８Ｆに図示されるシステムは、モジュール７０１−７０７の１つ以上における作動を制御し、それらの予定を決めるための制御装置を含み得る。図８Ｅに示される実施例に図示されるように、サンプルは、サンプルホルダーまたはシステム中の分析のための他の要素に装填され得る。そのようなシステム、およびそのようなシステムのモジュールは、例えば、サンプル取扱いシステム７０８；サンプルの取得、移動、および等分のための吸入型ピペット７１１および容積式ピペット７１２ピペットを含むピペット；遠心分離機７１３；分光光度計７１４；化学的分析ユニット７１５；光電子増倍管（ＰＭＴ）７１６；例えば、ピペットチップおよび他のチップなどの使い捨ての必需品およびツールを保持するためのカートリッジ７１７；および他の要素を含む。モジュールおよび他の要素は、ラック７０９または他の支持構造により支持され得る。サンプル、使い捨て品、ツール、および他の要素は、モジュール内に輸送されることができ、およびモジュール間で輸送され得る（例えば、モジュール７０１〜７０６および血球計算モジュール７０７の間で）。
図８Ｅおよび８Ｆは、キュベット６００などのサンプルホルダーが、１つの位置（サンプル調製が行われ得る場所などの）から、および次いで別の位置（図８Ｅおよび８Ｆに見られる前記検出器Ｄなどの）へ輸送され得ることを示す。前記キュベット６００は、流体を前記検出器Ｄ内に、またはその上に放出しないが、その代わりに、サンプルの全てをその中に保つ自己完結型のユニットである。サンプルの信号の検出を行い得るための、透明なインターフェースを提供するために、前記キュベット６００または他のサンプルホルダーが、透明な表面と係合できる場所が、前記検出器Ｄの上、またはその近傍に、１つ以上の、２つ以上の、または３つ以上存在し得る。図８Ｆの要素ならびにそのような要素および使用に関する更なる開示は、米国特許出願第１３／７６９，７７９号に見出され、この出願は参照により完全に本明細書に組み込まれる。
暗視野
少なくともいくつかの本明細書における実施形態は、暗視野照明源およびキュベットを含む。前記キュベット６００の関連する特性は、キュベットの寸法および光学的物質および形状の設計に関係する。前記キュベットは、反射を介して暗視野照明の程度を増加させる（例えば、ＴＩＲ、またはＰＩＲ、またはその両方を介して）。一実施形態では、このシステムは、サンプルの暗視野徹照および暗視野落射照明を同時に使用し得る。
本明細書において開示されるいくつかの実施形態では、光源６５０と組み合わされた前記キュベット６００は、落射構成（すなわち、サンプルに対して光源および対物レンズが同側にある）の物理的システムを用いて徹照および落射照明を可能にする。基本的なキュベットは、生物学的サンプルを収容するため、およびそれを可視化のために提示するため設計される。実施形態では、カバー部分６１２は、特異的な設計を有し得る。異なる物質が異なる屈折率を有することは周知であり；所望の屈折率を有する物質が、カバー部分６１２もしくは基部支持物６２０、またはキュベット６００の他の要素および構成要素ならびに付随する要素および構成要素の製造での使用のために選択されることができる。例えば、いくつかの実施形態では、カバー部分６１２または基部支持物６２０ガラスで形成され得る。例えば、いくつかの実施形態では、カバー部分６１２または基部支持物６２０は水晶で形成され得る。例えば、いくつかの実施形態では、カバー部分６１２または基部支持物６２０アクリル、または透明なポリマー（例えば、環状オレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレンポリウレタン、塩化ポリビニル、または他のポリマーもしくは共重合体）、または他の透明な物質により形成され得る。
カバー部分６１２の材料を、照明および画像収集を促進するために設計し得る。実施形態では、サンプルを照明するために、光源６５０はリングライト６５０であることができ（すなわち、円形であることができ）、光源６５４の位置を、分離した、または連続的なパターン中に有することができ、および光をサンプルに向けるために、曲面の反射器６５２を用い得る。
暗視野顕微鏡では、サンプルは斜めの光線により照明される。暗視野顕微鏡では、顕微鏡光学系に入る光は、サンプルにより散乱された光であり、サンプル中の細胞、粒子、および他の対象および構造の散乱性の測定を可能にする。サンプル中に、細胞、粒子、構造、または他の対象が存在しない場合、暗視野画像は黒色である。
本発明の非限定的な実施例では、反射器６５２およびリングライト６５０のＬＥＤ６５４は、最小の率の光が、非特異的なバックグラウンドとして、対物レンズに直接に戻って入ることができるように、光を反射するために設計される。このシステムは、キュベット表面におけるＴＩＲによる光が、分析領域６０８中に戻るように向けられるために設計される。表面から反射された光は、ＴＩＲによるかまたは他の反射によるかに関わらず、従って分析領域６０８中のサンプルを照明するために向けられる。分析領域６０８中のサンプル中の細胞、粒子、および構造は、リングライトからの光を直接細胞の下部から受ける（すなわち、落射照明を介して）。加えて、本明細書で開示される、頂面（反射された）から来る光も、分析領域６０８に向けられる（すなわち、徹照）。
従って、本明細書において開示されるシステムおよび方法に従うと、リングライト６５０が同じ位置にある場合に、光は、単一のリングライト源から、分析領域６０８を２つの方向から照明するために向けられることができる（落射照明および徹照の両方）。実施形態では、この照明全て斜めの照明である。２つの光の構成要素の相対的な強さを、キュベットの設計およびキュベットに用いられる物質により制御できる。
この暗視野照明は、従来の暗視野とは異なる。例えば、本明細書において開示される実施形態では、暗視野照明は、キュベット表面においてＴＩＲにより反射される光により提供される。非制限的な実施例として、実施形態では、本明細書において開示されるシステムは、光の全てを反射するために、カバー部分６１２の特定の表面の背面上に反射層を用い得る。非制限的な実施例として、実施形態では、本明細書において開示されるシステムは、光の全てを反射するために、キュベット６００の特定の表面の背面上に反射層を用い得る。いくつかの実施形態は、完全に反射性か、または選択的に反射性のバックグラウンドを用い得る。
例えば、実施形態では、暗視野照明を保つ、斜めの角度での光を向けることが望ましい。いくつかの実施形態では光源６５４は、ある角度の光を向け、および従って反射器６５２を必要としないか、または使用しないことができる。反射器６５２は、全ての光が同一平面上にあり、同一方向に向けられるために、光源６５４の製造可能性を改善し得る。随意的に、角度の付いた光源６５４も、反射器の代わりに、またはそれと組み合わせて用いられ得る。
照明の徹照の構成要素の光強度が、例えば、対応する落射照明構成要素の１０分の１の弱さであってさえ、徹照に起因する、サンプル中の細胞または他の対象からの散乱された光の強度が２００倍強いことを理解されたい。すなわち、ある量の落射照明からの散乱が、同じ量の徹照からの散乱に比較された場合、徹照に起因して散乱された光の強度は、サンプル中の細胞または他の対象の落射照明により散乱された光よりも２００倍強くあることができる。従って、小量の徹照が、細胞からの光散乱を顕著に増強できる。
落射照明単独では、対物レンズにより収集される光はサンプルから反射された光のみである。しかしながら、回折は、散乱の実質的な構成要素であり、および徹照の使用は、いくらかの量の回折を提供する（例えば、サンプルから散乱された光。しかしながら、落射照明から収集された光は、サンプルから回折された光を含まない（回折に続いて、光源に向かって戻る光の反射がない）。従って、徹照および落射照明を用いる場合、対物レンズにより収集される光に対する反射性、屈折性、および回折性構成要素がある。従来の方法は、サンプルの両方の側に光学的構成要素配置するために、構成するために大きな量の空間を必要とする暗視野徹照明を用いる。対照的に、本明細書において開示されるシステムおよび方法は、落射照明単独のために構成される光学的要素を使用して落射照明および徹照の両方を提供する。本明細書において開示される実施形態は、落射照明構成において空間の節約を得ることができる一方で、そのサンプル落射および徹照の両方の利益を提供する。
サンプルホルダーおよび光源を共に設計することは、落射照明構成が、サンプルの徹照の量、特に均一な徹照の量を増加させることを可能にする。いくつかの実施形態は鏡面仕上げの表面を用い得る。いくつかの実施形態は、暗視野照明のための分析領域６０８中へ、均一な徹照および斜めの徹照を含む、所望の徹照を生成させるためにチューンされ得るＴＩＲを用い得る。キュベット６００は、分析領域６０８の、反射、例えば、ＴＩＲまたはＰＩＲ、またはその両方を、用いる落射照明構成中の光源からのみの徹照を提供するために構成され得る。一つの非限定的な実施例では、より厚いカバー部分６１２が、光が標的領域６０８に反射して戻るために、光がＴＩＲ（またはＰＩＲ、もしくはその両方）を受けることを許容する。追加的に、および本明細書において開示されるシステム方法は、ＴＩＲ（またはＰＩＲ、もしくはその両方）に起因して、分析領域６０８に反射で戻される光を提供するばかりではなく、分析領域６０８に均一に戻る光を提供する。図８Ａ、８Ｂ、および８Ｄの実施形態は、分析領域６０８に均一的に戻る光が、分析領域６０８中のサンプルの均一な徹照を提供するために効果的であるために、特定の角度にある特定の表面を有し、特定の黒色の表面、および特定の反射面を有する。随意的に、完全に反射性の面を頂部（限定はされないが図７Ａおよび７Ｂに示される平坦なカバー部分６１２などの上に、および随意的に図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃの領域６１３の選択された頂部領域の上に）に置くことができるであろう。対照的に、従来のハードウエアの中を移動する光は、ＴＩＲ（またはＰＩＲ、もしくはその両方）による可能性のある、いくらかの反射を受けることができるが、その光は、領域６０８中にもどることはない。
非制限的な実施例として、本明細書において開示される実施形態は、例えば１６レーザー光源を有する、高度に複雑および高価なシステムを使用する代わりに、プラットフォームに基づくを画像を撮影することができ、ならびに本発明の実施形態は、サンプル中の細胞およびタイプの差異の撮像および同定を可能にするためのより統合された検出システムを活用する。
一つの非限定的な実施例では、全てのこれらの異なるタイプの情報の組み合わせは、分析の所望の目標を達成するために有用、および効果的である。このことは、定量的測定および／または定量的測定にリンクされた定性的測定、または定量的測定にリンクされた画像を含む。本明細書において開示される方法およびシステムは、それぞれのチャンネルが、１つ以上の標的とされる特異的な分子的マーカー（すなわち、定量的情報）を有することができる、蛍光の異なるチャネルを提供する。本明細書において開示される方法およびシステムは、顕微鏡を含むか、またはそれと使用されることができ、本明細書における実施形態は、染色が細胞内部で形成するバックグラウンド（例えば、それが細胞質の中であるか、表面または核もしくは他の場所に濃縮されているか）を観察および測定する能力を提供し、これらの能力は、生成された画像および／または定性的情報を、生成された定量的測定に連結することができる。この様式で、定量的測定が警告を引き起こすか、または更なる分析が望まれることを示唆する閾値を満たすことになる場合に、更なる分析のために、定量的結果を生成したオリジナルの画像の連結が利用可能になる。本明細書における実施形態は、分析領域６０８内のサンプル中の細胞中に染色が生成したバックグラウンド画像および情報を監視し得る。そのような画像および情報は、染色が細胞中、例えば、細胞質中、核中、膜中、または他のオルガネラまたは他の細胞の場所にあるか否かの決定を可能にする。
本明細書において開示される方法およびシステムのいくつかの実施形態では、定量的な細胞の散乱性質、細胞の形状、および／または細胞のサイズの組み合わせが観察され、および測定されることができ、ならびにサンプルの同定および／または特性化に用いられ得る。本明細書において開示される、方法およびシステムのいくつかの実施形態では、サンプルまたはその一部分の、物理的性質、光学的性質、および生物／生化学的性質が、同じ機器において同時に測定され得る。全ての、そのような測定および観察は、検定の目標（例えば、検定の臨床的な目標）を達成するために、様々なタイプの情報を連結させるために、プログラム可能なプロセッサまたは他の処理システム中で組み合わせられ得る。
従来の機器は、観察または測定のどれか一方に対して適切であり得るが、単一の光源からの落射照明および徹照の両方については適切ではなく；そのような異なるタイプの情報の間の連結もない。例えば、定量的測定を生成した画像情報が検索可能である、本明細書において開示されるいくつかの実施形態では、そのシステムおよび方法は、組織形態学的測定のために用いられ得る。随意的に、このシステムは、従来の細胞学に、より類似した子宮頸部細胞診に応用され得る。それは、従来の顕微鏡を用いてなされること全てに拡張され得る。尿では、少なくとも本発明の実施形態は細胞のみならず、尿中の結晶を見ておよび分析することができる。無機塩の結晶、およびグラフの一部分での特定の定量的読み取りを形成した尿サンプルからの化学物質を見ることができる。加えて、限定はされないが、データの異なる領域が丸で囲まれている図１Ａの中に見られるものなどの、血液細胞の異なるタイプおよび集団の分析を含め、血液中の細胞および粒子を見ておよび分析することができる。特定のデータ領域についての画像情報は、グラフまたはチャート上にプロットされた測定を生成した基底にある細胞画像を更に分析するために、検索することができる。
本明細書におけるいくつかの実施形態は、画像化特性を病理学特性と組み合わせる。例えば、組織の調製は、本明細書において開示される光学的要素を含むために構成された機器またはシステムの内部で生じることができ（システムは、例えば、サンプルの光学的なおよび他の分析のために構成された、モジュールまたは複数のモジュールであり得るか、またはそれを含むことができ）、およびそのような調製された物質は、このプラットフォーム内で撮像され得る。次いでこの画像または分析は、画像分析、診断、または病理学者がサンプルを分析することを支援するか、または可能にすることに効果的なデジタル病理学を行うためにサーバーに送られることができる。
例えば、図８Ｃおよび８Ｄに図示されるシステムおよび機器を含む、本明細書で開示される方法、システムおよび機器の実施形態は、サンプルの分析に共に適用され得る、広範囲の血球計算能力を提供する。そのような血球計算能力は、典型的には顕微鏡に制限されるような、血球計算の画像化を含み；そのような生物学的サンプルの顕微鏡的画像化および画像分析は、本明細書において開示される機器、システム、および方法により提供される。加えて、本明細書において開示されるシステムおよび機器は、生物学的サンプルの分光測光分析を提供するために構成される。そのような画像分析は、暗視野、明視野、および他の画像分析を含む。血液サンプルのより敏感なおよび正確な画像および分析を可能にする、落射照明および徹照の両方を単一の光源から与えるための、新規のおよび改善された方法が開示される。本明細書において開示される方法と連結して、ＲＢＣ、ＷＢＣ、およびこれらのサブカテゴリーに関する別個の測定を得ることができる。本明細書において開示される画像および分光測光分析は、血液サンプルの特性化および多くの臨床的状態の診断のために有用な、ＷＢＣの異なる集団の同定および定量に用いられることができる。本明細書において開示される機器およびシステムは、一般化学的分析情報、核酸に基づく分析情報、抗体−（またはタンパク質または抗原決定機）に基づく分析情報、分光測光分析情報を含む臨床的報告を提供するために有用であることができ、および加えて、分析される細胞およびサンプルの画像を提供するために有用であり得る。画像と同様に他の臨床的情報を含む、そのような情報を生成し、およびそのような報告を提供する能力は、新規なおよび予期されない能力および結果を提供すると考えられる。
加えて、この情報、およびこれらの報告は、短時間（例えば、１時間未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、または他の短時間）で作成されることができる。加えて、この情報、およびこれらの報告は、例えば、血液または尿の少量のサンプルなどの少量のサンプルから作成され得る。そのような少量のサンプルは、たかだか約５００μＬ、約２５０μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約４０μＬ未満、約２０μＬ未満、約１０μＬ未満、または他の少量の容積のサイズを有し得る。サンプルが血液サンプルである実施形態では、そのような少量のサンプルは指先穿刺により採取され得る。典型的には、たであ少量の血液が指先穿刺から採取され得る（例えば、血液の量は、約２５０μＬ以下、または約２００μＬ以下、または約１５０μＬ以下、または約１００μＬ以下、または約５０μＬ以下、または約２５μＬ以下、または他の少量であり得る）。
本明細書において開示される、（画像、散乱プロット、および他の光学的および画像化情報を含む）血球計算の情報および画像、および一般化学的分析情報、核酸に基づく分析情報、抗体（またはタンパク質または抗原決定基）に基づく分析情報、および分光測光分析情報も含む臨床的報告は、診断および多くの臨床的状態の特性化のために有用な広範かつ臨床的に豊かな情報を提供し、および当技術分野に利点を提供すると考えられる。そのような報告は、ポイント・オブ・サービス（またはポイント・オブ・ケア）の場所において迅速に調製されることができ、および分析および解釈のために病理学者または他の臨床専門家に迅速に通信され得る（例えば、無線により電子的に、固定電話により、光学ファイバー、または他の通信リンクにより）。そのような専門的分析および解釈は、次いで迅速に（例えば、無線により電子的に、固定電話により、光学ファイバー、または他の通信リンクにより）被験者をケアする臨床医、またはポイント・オブ・サービス（またはポイント・オブ・ケア）の場所、またはその両方に、迅速なフィードバックのために返送される。そのような迅速なフィードバックは、ポイント・オブ・サービスまたはポイント・オブ・ケアの場所で取得され得るか、分析され得るか、またはその両方であるサンプルに基づいて必要であり得る情報および分析を提供することにより、必要な場合にはタイムリーな治療を可能にし、または不要な治療を防止する。そのような迅速な分析、報告、およびフィードバックは、時間を消費する方法に対する利点を提供し、および、タイムリーな治療および不要な治療を防止することにより、より効果的な、より効率的な、およびより安価な臨床的サービスおよび治療を提供できる。本明細書において開示される機器、システムおよび方法により除去され得る、そのようなより時間消費的な方法としては、限定はされないが：被験者の自宅から、または被験者によりケアで信頼される臨床医から、遠隔にある臨床検査室または診療所への移動のために要求される被験者による遅延および不便さ；サンプルの収集位置から、それが分析され得る位置までの輸送に起因する、遅延およびサンプルの分解の可能性；そのような分析結果の病理学者または他の専門家への送信に起因する遅延；被験者または臨床医への専門家の意見の送信に起因する遅延；臨床医への専門家の意見の送信に続く、臨床医による被験者の診断および治療の送信の遅延を含む。これらの遅延、不便、および可能なサンプルの分解は、本明細書において開示される方法、機器、およびシステムの使用により軽減または除去される。
図６Ａ、６Ｂ、７、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄ、および他の図に図示される、ならびに本明細書で開示されるシステムの実施形態および機器は、１つ以上の他のサンプル分析能力と共に使用するための小型の形式を含む、小型の形式における血球計算能力を提供する。出願人は、本明細書において、本明細書において開示される機器およびシステムにおける新規な血球計算能力とともに他のサンプル分析能力を含む、新規な機器およびシステムを開示する。例えば、出願人は、本明細書において、一般化学ユニットによるサンプル分析のための機器およびシステムと連結して；核酸分析ユニットによるサンプル分析のための機器およびシステムと連結して；抗体検定（例えば、ＥＬＩＳＡ）ユニット）を用いるサンプル分析のための機器およびシステムと連結して；およびこれらの組み合わせによるサンプル分析のための機器およびシステムと連結して、本明細書において開示される新規な血球計算能力を提供する、機器およびシステムを開示する。従って、本明細書において開示されるサンプル処理機器は、サンプルに対して複数の検定を遂行するために構成され得る。そのようなサンプルは少量のサンプルであり得る。
実施形態では、全てのサンプル検定行為、またはステップは単一のサンプルびついて遂行される。実施形態では、全てのサンプル検定行為またはステップは、単一の機器またはシステムにより遂行され、および単一の機器の筐体内で遂行され得る。そのような血球計算、特に特に単一のユニット内での画像分析と同様に分光測光または他の光学的分析を提供する血球計算を含むシステムおよび機器は、新規でありおよび予期されなかったものと考えられる。血球計算、特に特に単一のユニット内での画像分析と同様に分光測光または他の光学的分析を提供する血球計算を含むシステムおよび機器を提供することは、当技術分野では以前には利用不可能であった利点を提供するものと考えられる。
図６Ａ、６Ｂ、７、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄ、および他の図に図示される、ならびに本明細書で開示されるシステムの実施形態および機器は、携帯可能な形式において血球計算能力を提供し、そのような機器およびシステムは、１つの位置から別の位置に容易に持ち運ぶために、十分な小ささの筐体中に収納され得る。例えば、そのような機器およびシステムは、ポイント・オブ・ケア位置（例えば、医師の診察室、診療所、病院、臨床検査室、または他の場所）における使用のために容易に持ち運び得る。例えば、そのような機器およびシステムは、ポイント・オブ・サービス位置（上記で議論されたようなポイント・オブ・ケアの場所に加えて、例えば、薬局、スーパーマーケット、または他の小売りまたはサービス場所）での使用のために容易に持ち運び得る。ポイント・オブ・サービス位置としては、例えば、被験者がサービス（例えば検査、監視、治療、診断、ガイダンス、サンプル収集、ＩＤ確認、医療サービス、非医療サービス、など）を受けることができる任意の位置が挙げられる。ポイント・オブ・サービス場所としては、制限なく、被験者の自宅、被験者の勤務先、ヘルスケア提供者（例えば、医師）の位置、病院、緊急治療室、手術室、診療所、医療従事者のオフィス、臨床検査室、小売業者［例えば薬局（例えば、小売り薬局、臨床薬局、病院薬局）、ドラッグストア、スーパーマーケット、食品雑貨店など］、輸送車両（例えば自家用車、ボート、トラック、バス、航空機、バイク、救急自動車、移動ユニット、消防自動車／トラック、救命救急車、司法遂行車両、警察車両または前記被験者を一点から他へ移動するよう設定されている車両など）、移動医療ケアユニット、移動ユニット、学校、デイケアセンター、手荷物検査場所、戦場、健康支援生活住居、政府のオフィス、オフィス・ビルディング、テント、体液サンプル取得施設（例えば血液収集センター）、被験者がアクセスを望み得る位置の入り口の場所またはその近くの場所、被験者がアクセスを望み得る機器上またはその近くの場所、被験者がアクセスを望み得る場所またはその近くの場所（例えば、被験者がコンピュータにアクセスしたい場合には、そのコンピュータの位置）、サンプル処理機器がサンプルを受け取る位置、または本明細書の別の場所に記載される任意の他のポイント・オブ・サービス位置を含み得る。
難解な（Ｅｓｏｔｅｒｉｃ）血球計算および特殊な血球計算マーカー
多くの従来の先進的なまたは難解な血球計算の検定は、細胞上の多数のマーカーの測定のために従来のシステムを必要とし；典型的には、これらのマーカー同時に測定される。当分野での一般的なアプローチは、これらのマーカーを同時に測定するために、例えば、６個以上のレーザーおよび１８個の異なるＰＭＴチューブを含む高度の能力の機器に結び付けられている。しかしながら、多くの臨床的設定では複数のマーカーの同時測定は要求されない。多くの臨床的要件においては、例えば、いくつの細胞が１つのマーカーに対して陽性であるか、または２もしくは３個のマーカーの組み合わせ、または他のいくつかのマーカーそのような組み合わせについていくつが陽性であるか、を見ることにに興味を有する。本明細書におけるいくつかの実施形態は、染色スキームの複数の組み合わせを提供し、そこでは１つが、例えば、１０組のマーカーを有することができ、そこではそれらを、３〜４個のまたは５〜６個のマーカーの組み合わせに組み合わせることができ、そこではそれらを、同じ色である２個のマーカーにさえ組み合わせることができ、本発明のシステムのいくつかの実施形態は、どのマーカーからどの信号が来たかを決定するために、画像および情報をデコンボリュートできる。このことは、本発明のいくつかのシステムの実施形態が、光源の数、サンプル分析に用いられるチャネル数、ならびに他の単純化および効率に関して、ハードウエア要件を低下させることを可能する。従って、マーカーの数のサブセットを用いること、またはあらかじめ決定したペアーにおいて、マーカーを非同時的な様式で使用または測定することは、難解な血球計算を可能にするために有用である。例えば、いくつかのマーカーは「ゲーティング」マーカーとみなされることができ；そのようなマーカーは最初に測定され、およびそのような最初の測定の結果が陰性である場合（例えば、サンプル中にマーカーが存在しないか、または少量のみ存在する）、次いで、他の後続のマーカーを用いる測定は必要ではない。実施形態ではそのような非同時的な方法およびシステムは、サンプル容積を減少させることができ、および分析に要するマーカーの量を減少させ得る（例えば、典型的に後続のマーカーが、分析されるサンプルのごく少部分に対して使われる場合）。
血液または尿サンプルなどのサンプルの血球計算的分析のための画像化の使用は、実際の細胞計数を得ることを可能にし、および従ってそのような測定を含まない従来の血球計算方法よりも正確であり得ることを理解されたい。サンプル中の細胞（および粒子または構造）の画像化を含むサンプルの画像化は、従来のフローサイトメトリーなどの他の方法よりも実際により正確であることができる。例えば、従来のフローサイトメトリー・ゲーティング実際の計数を可能にしない。フローサイトメトリーにおけるゲーティングは、主観的であり、および従ってこれは、システム毎に変動し得る。加えて、従来のフローサイトメトリーは、サンプル中の細胞の画像を提供しない。
本明細書におけるいくつかの実施形態も、ゲートすることができるが、このゲートは、アルゴリズム的に、限定はされないが患者の健康を含む、さまざまな因子に基づく。分類手段は、自分たちが健康かまたは罹患しているかを知っている患者集団に向けられる。本発明のいくつかの実施形態は、異常な患者にフラッグを立てることができ、従ってその患者のサンプルの再検査のために警告を与える。自己学習ゲーティングは、患者の健康に関して伝達された情報に基づいて、異なるゲーティングが望まれるかどうかを、決定し得る。従って、本明細書において開示されるいくつかの実施形態のサンプルのためのゲーティングは、場合によりプログラム可能なプロセッサにより、アルゴリズム的に行われ、およびこのゲーティングは患者の健康に基づいて変化する。
画像化のための方法およびシステムの実施形態では、必要なハードウエアの量および複雑性を最小化することが望まれ、および必要なサンプル容積を最小化するために、可能であれば、サンプルのいくらか、または全部を再使用することが望まれる。従って、サンプルの画像化から、より多くの能力を引き出せるほど、および可能な場合にはより少量のサンプルから得られる情報を最大化する点に関して、より良い。従って、最少数の画像から、異なる細胞タイプを差別化するために、より多くの情報を得られるほど、要求されるサンプル容積を最小化させ得る。
随意的に、１つの制限しない実施例では、顕微鏡ステージにおいて使用するための前記キュベットは、以下のように構成され得る（図７、８Ａ、および８Ｂに示される実施形態および要素の参照と共に）。中間のチャネル層は、感圧接着剤（ｐｓａ）をその両側に有するプラスチック膜８００のコアを含む。１つの側面は窓の層６０６に接着し、および他の側面は成形された頂層カバー部分６１２に接着する。このコアは、主に、異なる液体チャネル間の光散乱および光学的なクロストークを防止する光学的理由により、色において黒色の押し出された薄層である。このコアの膜の厚さは、好適には長さおよび幅に沿って均一であり、および、例えば、黒色ＰＥＴまたは黒色ＨＤＰＥ（ポリエチレン）の押し出された薄膜から形成される。その両側面にある、このｐｓａの亜層は、全体の液体チャネル（例えば、分析領域６０８）の緊密および均一な寸法を維持するために、可能な限り薄いことが好ましいが、好適には液体チャネルの周囲に良好な流体的密封を提供するために十分くてよい。実施形態では、そのようなサンプルホルダーのために有用なこのｐｓａ接着剤は、実際はアクリルであり、および低表面エネルギーのプラスチックに対して強い接着強度を有する。この中間層上の液体チャネル、ポートおよび他の配列特性は、レーザー切削または打ち抜き加工により製造され得る。
この実施形態は、限定はされないが、パックもしくは円盤、または金属パックもしくは円盤などの磁石により保持され得る磁性要素が前記キュベットもに取り込まれ得ることも示している。例えば、そのような磁性要素は、前記サンプルホルダーの成形された頂層、またはキュベット中に含まれ得るか、またはそれらを含み得る。磁性要素は、キュベットを輸送するハードウエアを単純化するために用いられ得る。例えば、この取扱いシステムは、前記キュベット中の磁性特性を、それを追加的なサンプル取扱い機器を追加する必要なく運送するために従事させ得る。
本発明が、その特定の実施形態を参照して記載され、および図示されてきたが、当業者には、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、手順およびプロトコルの、さまざまな翻案、変化、修飾、置換、削除、または追加を行い得ることを理解するであろう。例えば、キュベット中の異なる反射面または光学的システム中の光経路に沿った他の表面を作成するために異なる材料を用い得る。随意的に、この反射面は、その反射が拡散性のみであるために選択される。随意的に、この反射面は、その反射正反射性のみであるために選択される。いくつかの実施形態は、Ｃｏｕｍａｎｓ，Ｆ．Ａ．Ｗ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌ，Ｅ．，＆ Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ， Ｌ．Ｗ．Ｍ．Ｍ．（２０１２），Ｆｌａｔ−ｔｏｐ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ａｎ ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｂｙ ｄｕａｌ ｍｉｃｒｏｌｅｎｓ ａｒｒａｙｓ．（二重ミクロレンズ・アレイによる、落射蛍光顕微鏡におけるフラットトップ照明のプロファイル）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， ８１Ａ： ３２４〜３３１．ｄｏｉ： １０．１００２／ｃｙｔｏ．ａ．２２０２９に説明される、フラットトップ照明配置を用いることができ、この参照文献は引用により、全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
加えて、濃度、量および他の数値データは、本明細書においては範囲のフォーマットで示され得る。そのような範囲のフォーマットは、単に便宜および簡潔さのために使用され、および範囲の限界として明示的に列挙された数値のみならず、あたかもそれぞれ明示的に提示されるかのように、その範囲内に包含される、全ての個別の数値およびサブ範囲が、含まれると、柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。例えば、約１ｎｍから約２００ｎｍまでという粒径範囲は、約１ｎｍおよび約２００ｎｍの明示的に提示された範囲だけでなく、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍなどの個々のサイズを、および１０ｎｍから５０ｎｍ、２０ｎｍから１００ｎｍ、などのサブ範囲も含むように解釈されるべきである。
明細書において議論され、または引用された刊行物は、単に本出願の出願日に先立つ開示として提供される。本明細書中の何物も、先行発明の理由で、そのような刊行物に先立つ資格がないことの承認と解釈されるべきではない。更に、提供されている刊行日は、個々に確認される必要のある実際の刊行日と異なることがある。本明細書において言及される全ての刊行物は、構造および／または方法のいずれに前記刊行物が引用されているかを開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。以下の出願も参照により全ての目的で本明細書に組み込まれる：米国特許第７，８８８，１２５号；米国特許第８，００７，９９９号；米国特許第８，０８８，５９３号；米国特許第８，０８８，５９号３；米国特許第８，３８０，５４１号；米国特許公開第ＵＳ２０１２０３０９６３６号；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５７１５５号；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／５３１８８号；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５３１８９号；米国特許出願第１３／７６９，７７９号；米国特許出願第１３／２４４，９４６号；米国特許出願第１３／２４４，９４７号；米国特許出願第１３／２４４，９４９号；米国特許出願第１３／２４４，９５０号；米国特許出願第１３／２４４，９５１号；米国特許出願第１３／２４４，９５２号；米国特許出願第１３／２４４，９５３号；米国特許出願第１３／２４４，９５４号；米国特許出願第１３／２４４，９５６号；米国特許出願第１３／７６９，７９８号；米国特許出願第１３／７６９，８２０号；米国特許出願第６１／７６６，１１３号；米国特許出願第６１／６７３，２４５号；米国特許出願第６１／７８６，３５１号；米国特許出願第６１／６９７，７９７号；および米国特許出願第６１／７３３，８８６号、それらの全ての特許および特許出願の開示は、参照により全ての目的で、その全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１２年７月２５日に出願された米国特許出願第６１／６７５，８１１号；２０１２年７月２６日に出願された米国特許出願第６１／６７６，１７８号；２０１３年２月１８日に出願された米国特許出願第６１／７６６，１１６号；および２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／８０２，１９４号による優先権を主張し、それらの全ての特許出願の開示は、参照により全ての目的で、その全体が本明細書に組み込まれる。
この文書は著作権保護の対象になる資料を含む。例えば、本明細書において示された図は、全て著作権により保護されるものである。それらが米国特許商標局の特許ファイル又は記録に現われるので、版権所有者（本明細書における特許申請人）は、特許文献及び開示の複製に反対しないが、そうでなければ何であるかに関わらず、全て著作権を保有する。以下の注意が適用される：著作権２０１２〜２０１３年 テラノス社
上述のことは、本発明の好適な実施例の完全な記載であるが、様々な代替物、修正およびなど価物を使用することが可能である。従って、現在の発明の範囲は、上記の記載を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲、およびそれらのなど価物の完全な範囲を参照して決定されるべきである。好適であるか、またはないかに関わらず、任意の特徴が、好適であるか、またはないかに関わらず、他の特徴と組み合わされ得る。「ｍｅａｎｓ ｆｏｒ（ための手段）」の語句を使用して、所定の請求項が明確に言明されていない限り、添付された請求項は、手段プラス機能の限定を含むものとは解釈されない。本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、「ａ（１つ）」「ａｎ（１つ）」「ｔｈｅ（前記の）」は、文脈において明白に示さない限り、複数の意味を含むことを理解されたい。更に、本明細書の記載、および以下の特許請求の範囲の全体を通して用いられる、「ｉｎ（〜の中に）」の意味は、文脈で明白に示されない限り、「ｉｎ（〜の中に）」、および「ｏｎ（〜の上に）」を含む。最後に、更に、本明細書の記載、および以下の特許請求の範囲の全体を通して用いられる、「および（および）」、「ｏｒ（または）」の意味は、文脈で明白に示されない限り、接続詞および離接的接続詞を含み、交換可能に使用され得る。従って、文脈で明白に指示しない限り、文脈の中で「および（および）」、または「ｏｒ（または）」という用語が使用される場合、そのような接続の使用法は「および／ｏｒ（および／または）」を除外しない。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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