JP2005316383A - 蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、観察方法に依らず試料上の同一観察面の観察を可能とする蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【解決手段】蛍光物質で標識された試料（Ｏ）を励起光で照明するための第１照明光学系（３）と、前記励起光とは別の所定光で前記試料を照明するための第２照明光学系（４）と、前記試料と対物レンズとの距離を変える移動手段（２）と、前記励起光による蛍光観察時の前記対物レンズの焦点と、前記所定光による別の観察時の前記対物レンズの焦点とのずれ量の情報を記憶した記憶手段（８ｂ）と、前記蛍光観察時と前記別の観察時との間で、前記ずれ量に応じて前記移動手段を駆動する制御手段とを備えたことを特徴とする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、蛍光顕微鏡に関する。

従来、蛍光顕微鏡に適用されるオートフォーカス装置には、試料（標本）から発生する微弱な蛍光を用いて焦点検出をするものが提案されている（特許文献１）。
その一方で、蛍光観察に加えて位相差観察が可能な顕微鏡（蛍光位相差顕微鏡）が実用化されている。この蛍光顕微鏡によれば、試料（生細胞など）の特定物質の有無や局在を知るだけでなく、その試料の状態や形状を試料の色や濃度に依らず確認することができる。

このような蛍光顕微鏡にも前述したオートフォーカス装置を適用することが望まれる。
特開２００４−４６３４号公報

しかし、前述したオートフォーカス装置をこの蛍光顕微鏡にそのまま適用すると、共通の対物レンズを使用しているにも拘わらず、蛍光観察時に鮮明に結像していた試料上の特定の観察面が位相差観察時には鮮明に結像しないという不具合が発生する。
そこで本発明は、観察方法に依らず試料上の同一観察面の観察を可能とする蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

請求項１に記載の蛍光顕微鏡は、蛍光物質で標識された試料を励起光で照明するための第１照明光学系と、前記励起光とは別の所定光で前記試料を照明するための第２照明光学系と、前記試料と対物レンズとの距離を変える移動手段と、前記励起光による蛍光観察時の前記対物レンズの焦点と、前記所定光による別の観察時の前記対物レンズの焦点とのずれ量の情報を記憶した記憶手段と、前記蛍光観察時と前記別の観察時との間で、前記ずれ量に応じて前記移動手段を駆動する制御手段とを備えたことを特徴とする。

請求項２に記載の蛍光顕微鏡は、請求項１に記載の蛍光顕微鏡において、前記移動手段は、前記対物レンズを光軸方向に移動させる機構からなることを特徴とする。
請求項３に記載の蛍光顕微鏡は、請求項１に記載の蛍光顕微鏡において、前記移動手段は、前記試料を光軸方向に移動させる機構からなることを特徴とする。
請求項４に記載の蛍光顕微鏡は、請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の蛍光顕微鏡において、前記蛍光観察時の前記試料に対する前記対物レンズの焦点検出を行う焦点検出手段をさらに備えたことを特徴とする。

請求項５に記載の蛍光顕微鏡は、請求項４に記載の蛍光顕微鏡において、前記制御手段は、前記蛍光観察時には、前記焦点検出手段で検出した焦点に前記試料が位置するように前記移動手段を駆動し、前記別の観察時には、前記焦点検出手段で検出した焦点から前記ずれ量だけずれた位置に前記試料が位置するように前記移動手段を駆動することを特徴とする。

請求項６に記載の蛍光顕微鏡は、請求項１〜請求項５の何れか一項に記載の蛍光顕微鏡において、前記蛍光顕微鏡は、複数の対物レンズを有し、前記記憶手段は、前記複数種類の対物レンズの各々に関する前記ずれ量の情報を予め記憶し、前記制御手段は、光軸に配置された前記対物レンズの種類に応じた前記ずれ量を使用することを特徴とする。
請求項７に記載の蛍光顕微鏡は、請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の蛍光顕微鏡において、前記第１照明光学系は、前記対物レンズを介して前記試料を照明する落射照明光学系であり、前記第２照明光学系は、前記対物レンズを介さずに前記試料を照明する透過照明光学系であることを特徴とする。

請求項８に記載の蛍光顕微鏡は、請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の蛍光顕微鏡において、前記第２照明光学系は、位相差観察用の位相板を設けた照明光学系であり、前記対物レンズは、位相差観察用の位相板を設けた対物レンズであることを特徴とする。
請求項９に記載の蛍光顕微鏡は、請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の蛍光顕微鏡において、前記第２照明光学系は、輪帯状の断面を有した光束を生成する光学系と、前記対物レンズの像面側に配置され、かつ前記光学系からの前記光束を反射して前記対物レンズの瞳面の周縁領域へと入射させる反射面と、物体側の前記試料にて発生し前記対物レンズの前記瞳面の中央領域を通過した観察光を透過して前記対物レンズの像面へと入射させる開口とからなる中空の反射ミラー部材とを備えたことを特徴とする。

本発明によれば、観察方法に依らず試料上の同一観察面の観察を可能とする蛍光顕微鏡が実現する。

以下、図面に基づいて本発明の実施形態を説明する。
［第１実施形態］
図１、図２、図３、図４、図５、図６に基づいて本発明の第１実施形態を説明する。
本実施形態は、位相差観察可能な蛍光顕微鏡システム（蛍光位相差顕微鏡システム）の実施形態である。

先ず、本システムの構成を説明する。
本システムには、図１に示すように、顕微鏡本体（符号１〜７）、制御装置（請求項における制御手段に対応。）８、ディスプレイ９などが備えられる。
顕微鏡本体には、試料容器Ｏ’を支持するステージ２、落射蛍光照明装置３、透過照明装置４、結像レンズ５、撮像素子６、焦点検出装置７などが備えられ、また、対物レンズ１が不図示の機構を介して装着される。試料容器Ｏ’の側から、対物レンズ１、結像レンズ５、撮像素子６が順に配置される。

試料容器Ｏ’は、ウエルプレートなどの透明容器であり、その中の試料Ｏは、培養された生細胞などである。この試料Ｏは、特定の蛍光物質により予め標識されている。また、試料容器Ｏ’は、ステージ２により光軸ＡＸと垂直な面内を移動可能である。
対物レンズ１は、例えば、倍率１０倍、開口数０．３の対物レンズである。対物レンズ１には、位相差観察用の位相板１ａが予めセットされている。対物レンズ１は、不図示の機構（請求項の移動手段に対応。）により試料Ｏに対する焦点調節方向、すなわち光軸ＡＸの方向に移動可能である。

次に、顕微鏡本体内の各部の構成を説明する。
先ず、落射蛍光照明装置３は、対物レンズ１と結像レンズ５との間に、対物レンズ１を介して試料Ｏを照明するように組み込まれる。
落射蛍光照明装置３には、蛍光観察用の光源３ａ、レンズ３ｂ、視野絞り３ｄ、レンズ３ｅ、フィルタブロック３ｆが順に配置される。フィルタブロック３ｆが、対物レンズ１と結像レンズ５との間の光路に位置する。

フィルタブロック３ｆには、その光路に傾斜した姿勢で挿入されるダイクロイックミラー３ｆ−１、ダイクロイックミラー３ｆ−１のレンズ３ｅ側の光路に挿入される波長選択フィルタ３ｆ−２、ダイクロイックミラー３ｆ−１の結像レンズ５側の光路に挿入される波長選択フィルタ３ｆ−３が備えられる。
このフィルタブロック３ｆは、不図示の機構により、対物レンズ１と結像レンズ５との間の光路に対し挿脱可能である。

落射蛍光照明装置３の光源３ａは、高圧水銀ランプや高圧キセノンランプなどからなり、蛍光観察の励起光として使用可能な光（紫外線から可視光線を含む波長域の光）を出射する。
フィルタブロック３ｆの波長選択フィルタ３ｆ−２は、光源３ａからの射出光のうち、試料Ｏを標識した特定の蛍光物質を励起する特定の励起光（例えば、波長５０５ｎｍ以下の光）を選択的に透過する性質を有する。ダイクロイックミラー３ｆ−１は、波長選択フィルタ３ｆ−２から入射する特定の励起光を対物レンズ１の方向に反射すると共に、試料Ｏにて発生した蛍光を結像レンズ５の方向に透過する性質（例えば、波長５０５ｎｍ以下の光を反射し、かつ波長５０５ｎｍ以上の光を透過する性質）を有する。波長選択フィルタ３ｆ−３は、ダイクロイックミラー３ｆ−１を透過した蛍光を選択的に透過する性質を有する。

次に、透過照明装置４は、対物レンズ１の反対側から試料Ｏを照明するように配置される。
透過照明装置４には、透過観察用の光源４ａ、レンズ４ｂ、位相差観察用の開口絞り４ｄ、レンズ４ｅが順に配置される。光源４ａは、可視光を出射する。
次に、焦点検出装置７は、対物レンズ１を介して試料Ｏを照明すると共に、試料Ｏにて発生した蛍光を受光するように、対物レンズ１と結像レンズ５との間（以下、対物レンズ１と落射蛍光照明装置３との間とする。）に組み込まれる。

焦点検出装置７は、特許文献１に記載された何れかの焦点検出装置である。焦点検出装置７には、例えば、照明用の光学系として、焦点検出用の光源７ａ、波長選択フィルタ７ｂ、ダイクロイックミラー７ｃ、レンズ７ｄ、視野絞り７ｅ、レンズ７ｆ、偏向ミラー７ｇが順に配置される。その偏向ミラー７ｇが、対物レンズ１と落射蛍光照明装置３との間の光路に位置する。また、焦点検出装置７には、受光用の光学系として、波長選択フィルタ７ｈ、検出器７ｉが配置される。

焦点検出装置７の偏向ミラー７ｇは、不図示の機構により、対物レンズ１と落射蛍光照明装置３との間の光路に対し挿脱可能である。
焦点検出装置７の光源７ａは、焦点検出装置７内の他の光学素子に対し偏心して配置され、蛍光観察の励起光として使用可能な光（紫外線や可視光線を含む波長域の光）を出射する。波長選択フィルタ７ｂは、光源７ａからの射出光のうち、試料Ｏを標識した特定の蛍光物質を励起する特定の励起光を選択的に透過する性質を有する。ダイクロイックミラー７ｃは、波長選択フィルタ７ｂから入射する特定の励起光をレンズ７ｄの方向に反射すると共に、試料Ｏにて発生し、かつ偏向ミラー７ｇを介して焦点検出装置７に入射した蛍光を波長選択フィルタ７ｈの方向に透過する性質（例えば、波長５０５ｎｍ以下の光を反射し、かつ波長５０５ｎｍ以上の光を透過する性質）を有する。波長選択フィルタ７ｈは、ダイクロイックミラー７ｃを透過した蛍光を選択的に透過する性質を有する。なお、光源７ａの偏心量、及び視野絞り７ｅの開口の形状は、試料Ｏ上を照明する照明光が焦点検出に適した斜光照明となるよう設定されている。

制御装置８には、ＣＰＵ８ａ、ＣＰＵ８ａの動作に用いられるメモリ８ｂ、透過照明装置４の光源４ａを駆動するための駆動回路Ｄ４ａ、ステージ２を駆動する（光軸ＡＸと垂直な面内で移動させる）ための駆動回路Ｄ２、対物レンズ１を駆動する（光軸ＡＸの方向に移動させる）ための駆動回路Ｄ１、焦点検出装置７の偏向ミラー７ｇを駆動する（光路に対し挿脱する）ための駆動回路Ｄ７ｇ、焦点検出装置７の検出器７ｉを駆動するための駆動回路Ｄ７ｉ、焦点検出装置７の光源７ａなどを駆動するための駆動回路Ｄ７ａ、落射蛍光照明装置３の光源３ａを駆動するための駆動回路Ｄ３、落射蛍光照明装置３のフィルタブロック３ｆを駆動する（光路に対し挿脱する）ための駆動回路Ｄ３ｆ、撮像素子６を駆動するための駆動回路Ｄ６などが備えられる。これらの駆動回路は、ＣＰＵ８ａから与えられる信号に応じて動作する。

ＣＰＵ８ａは、オペレータから不図示の入力器を介して入力される指示の内容を認識する。指示の種類には、焦点調節の指示、蛍光観察の指示、位相差観察の指示などがある。
ＣＰＵ８ａは、それらの各指示に応じて、駆動回路Ｄ４ａ、Ｄ２、Ｄ１、Ｄ７ｇ、Ｄ７ｉ、Ｄ７ａ、Ｄ３、Ｄ３ｆ、Ｄ６のうち必要なものに対し必要な信号を与え、本システムを動作させる。

メモリ８ｂには、図２に示すように、後述する蛍光観察時に試料Ｏにて発生する蛍光ＬＡに対する対物レンズ１の焦点ｆＡ（図２（ａ））と、後述する位相差観察時に試料Ｏを透過する透過光ＬＢに対する対物レンズ１の焦点ｆＢ（図２（ｂ））との光軸ＡＸの方向のずれ量Δを示す情報が予め格納されている。このずれ量Δは、測定又はシミュレーションにより求められたものであり、対物レンズにより異なる。さらに、蛍光観察では、染色した細胞内小器官（例えば、ミトコンドリア、核など）によってもずれ量Δが異なる。

因みに、ずれ量Δは、対物レンズ１の倍率が１０倍、かつ開口数が０．３である場合に、１０μｍ程度となる。このずれ量Δは、この対物レンズ１の焦点深度６．１μｍよりも大きい。このため、従来は、蛍光観察時に鮮明に結像していた試料Ｏ上の特定の観察面が、位相差観察時には鮮明に結像しないという不具合が発生していた。
なお、以上の構成の本システムにおいて、焦点検出装置７が請求項の焦点検出手段に対応し、落射蛍光照明装置３が請求項の第１照明光学系に対応し、透過照明装置４が請求項の第２照明光学系に対応し、メモリ８ｂが請求項の記憶手段に対応する。

次に、ＣＰＵ８ａによる本システムの動作（焦点検出、焦点調節、蛍光観察、位相差観察）を説明する。
（焦点検出）
焦点検出は、焦点調節の指示が入力されると自動的に行われる。
焦点検出では、ＣＰＵ８ａは、駆動回路Ｄ７ｇに対し必要な信号を与えて焦点検出装置７の偏向ミラー７ｇを光路に対し挿入すると共に、駆動回路Ｄ７ａ，Ｄ７ｉに対し必要な信号を与えて焦点検出装置７の光源７ａ及び検出器７ｉを駆動する。このとき、図３に示すような、焦点検出装置７から対物レンズ１を経由して試料Ｏに至る光路が形成される。

なお、このとき、落射蛍光照明装置３のフィルタブロック３ｆは、光路に挿入されていても離脱されていてもよい。また、落射蛍光照明装置３の光源３ａはオフされる。或いは、落射蛍光照明装置３からの射出光はシャッタなどにより遮光される。また、透過照明装置４の光源４ａはオフされる。或いは、透過照明装置４からの射出光はシャッタなどにより遮光される。

この状態で、光源７ａからの射出光は波長選択フィルタ７ｂに入射する。その射出光のうち、試料Ｏを標識した特定の蛍光物質を励起する特定の励起光は、波長選択フィルタ７ｂを透過してダイクロイックミラー７ｃに入射する。
その励起光は、そのダイクロイックミラー７ｃにて反射してレンズ７ｄに入射し、視野絞り７ｅの開口部を透過する。その後、励起光はレンズ７ｆに入射した後、偏向ミラー７ｇにて対物レンズ１の方向に反射し、対物レンズ１の後側焦点面に集光され、対物レンズ１を介して試料Ｏの一部を斜光照明する。

試料Ｏの照明領域では蛍光が発生し、その蛍光は、対物レンズ１を介して焦点検出装置７に入射し、偏向ミラー７ｇ、レンズ７ｆ、視野絞り７ｅ、レンズ７ｄを順に経由してダイクロイックミラー７ｃに入射するとそのダイクロイックミラー７ｃを透過し、波長選択フィルタ７ｈを介して検出器７ｉに入射する。
その検出器７ｉからは、試料Ｏからの蛍光量に比例した信号が出力される。この信号が、試料Ｏに対する対物レンズ１の焦点のずれを表す。

（焦点調節）
焦点調節は、焦点検出に続いて行われる。
焦点調節では、ＣＰＵ８ａは、対物レンズ１を移動させながら、検出器７ｉから出力される信号を駆動回路Ｄ７ｉを介して取り込み、その信号が示す蛍光量を最大にするのに必要な対物レンズ１の光軸ＡＸの方向の座標ＳＡを求める。ＣＰＵ８ａは、駆動回路Ｄ１に対し必要な信号を与えて対物レンズ１をその座標ＳＡに配置する。

その後、ＣＰＵ８ａは、駆動回路Ｄ７ｇに必要な信号を与えて偏向ミラー７ｇを光路から離脱する。また、ＣＰＵ８ａは、このときの対物レンズ１の光軸ＡＸの方向の座標ＳＡを示す情報を駆動回路Ｄ１等を介して取り込み、メモリ８ｂに格納する。
（蛍光観察）
蛍光観察は、蛍光観察の指示に応じて行われる。

蛍光観察では、ＣＰＵ８ａは、駆動回路Ｄ３ｆに対し必要な信号を与えて落射蛍光照明装置３のフィルタブロック３ｆを光路に対し挿入すると共に、駆動回路Ｄ３，Ｄ６に対し必要な信号を与えて落射蛍光照明装置３の光源３ａ及び撮像素子６を駆動する。このとき、図４に示すような、落射蛍光照明装置３から対物レンズ１を経由して試料Ｏに至る光路、及び試料Ｏから対物レンズ１、フィルタブロック３ｆ、結像レンズ５を経由して撮像素子６に至る光路が形成される。

なお、このとき、透過照明装置４の光源４ａがオフされるか、或いは、透過照明装置４からの射出光がシャッタなどにより遮光されることが望ましい。
また、ＣＰＵ８ａは、メモリ８ｂに格納された情報を参照して座標ＳＡを認識し、駆動回路Ｄ１に対し必要な信号を与えて対物レンズ１を図６（ａ）に示すとおり座標ＳＡに配置する。

この状態で、光源３ａから射出した光は、レンズ３ｂ、視野絞り３ｄ、レンズ３ｅを順に経由して波長選択フィルタ３ｆ−２に入射する。その光に含まれる特定の励起光は、波長選択フィルタ３ｆ−２を透過してダイクロイックミラー３ｆ−１に入射する。
その励起光は、そのダイクロイックミラー３ｆ−１にて反射して対物レンズ１を介して試料Ｏを照明する。

試料Ｏの照明領域では蛍光が発生し、その蛍光は、対物レンズ１を介してダイクロイックミラー３ｆ−１に入射するとそのダイクロイックミラー３ｆ−１を透過し、波長選択フィルタ３ｆ−３を介して結像レンズ５に入射し、結像レンズ５の作用により試料Ｏの蛍光像Ｉを撮像素子６上に形成する。
撮像素子６からは、蛍光像Ｉを示す画像信号が出力される。画像信号は、駆動回路Ｄ６を介してディスプレイ９に送出され、ディスプレイ９上に蛍光像Ｉが表示される。

（位相差観察）
位相差観察は、位相差観察の指示に応じて行われる。
位相差観察では、ＣＰＵ８ａは、透過照明装置４の光源４ａ、及び撮像素子６を駆動する。このとき、図５に示すような、透過照明装置４から試料Ｏ、対物レンズ１、結像レンズ５を経由して撮像素子６に至る光路が形成される。

なお、このとき、落射蛍光照明装置３のフィルタブロック３ｆは、光路から離脱されることが望ましい。また、落射蛍光照明装置３の光源３ａがオフされるか、或いは、落射蛍光照明装置３からの射出光がシャッタなどにより遮光されることが望ましい。
また、ＣＰＵ８ａは、メモリ８ｂに格納された情報を参照してずれ量Δ及び座標ＳＡを認識し、駆動回路Ｄ１に対し必要な信号を与えて対物レンズ１を図６（ｂ）に示すとおり座標ＳＡ−Δ（＝ＳＢ）に配置する。

この状態で、光源４ａから射出した光は、レンズ４ｂ、開口絞り４ｄ、レンズ４ｅを順に経由して試料Ｏに入射する。
試料Ｏの照明領域にて発生した光は、対物レンズ１を介して結像レンズ５に入射し、結像レンズ５の作用により試料Ｏの位相差像Ｉ’を撮像素子６上に形成する。
撮像素子６からは、位相差像Ｉ’を示す画像信号が出力される。画像信号は、駆動回路Ｄ６を介してディスプレイ９に送出され、ディスプレイ９上に位相差像Ｉ’が表示される。

次に、本システムの効果を説明する。
上述したとおり、本システムのメモリ８ｂには、ずれ量Δを示す情報が予め格納されている。また、本システムの焦点検出装置７は、試料Ｏにて発生する蛍光により対物レンズ１の焦点検出をする。その焦点検出の結果に基づき、ＣＰＵ８ａは、蛍光観察時には対物レンズ１の座標を試料Ｏに焦点の合った座標ＳＡに設定し、位相差観察時には対物レンズ１の座標を、座標ＳＡからΔだけずれた座標ＳＡ−Δ（＝ＳＢ）に設定する。

図６（ａ），（ｂ）は、蛍光観察時と位相差観察時の試料（生細胞）Ｏの周辺の様子を拡大して示したものである。図６（ａ），（ｂ）において、符号Ｏ”は溶液、符号Ｏ”’は試料容器（ウエルプレート）Ｏ’の底部を示す。図６（ａ），（ｂ）において、試料（生細胞）Ｏのサイズは誇張してある。
図６（ａ），（ｂ）に示すように、本実施形態によると、蛍光観察時と位相差観察時とでは、対物レンズ１の座標がΔだけずれている。

このずれ量Δは、蛍光観察時の対物レンズ１の焦点ｆＡ（図２（ａ））と、位相差観察時の対物レンズ１の焦点ｆＢ（図２（ｂ））とのずれ量に相当する。
よって、蛍光観察時の対物レンズ１の焦点ｆＡが図６（ａ）に示すごとく試料Ｏ上の或る断面Ａ上に存在していたとすると、位相差観察時の対物レンズ１の焦点ｆＢも図６（ｂ）に示すごとく試料Ｏ上の同じ断面Ａ上に存在することになる。

したがって、蛍光観察時に形成される蛍光像Ｉと、位相差観察時に形成される位相差像Ｉ’とは、試料Ｏ上の同一断面Ａを示す。言い換えると、従来の位相差観察時には鮮明に結像しなかった断面Ａが、鮮明に結像する。
よって、観察方法が蛍光観察と位相差観察との間で切り換えられても、オペレータは、確実に試料Ｏ上の同一面を観察することができる。

また、本システムにおいては、メモリ８ｂに格納される座標ＳＡの情報が、焦点調節の動作が実行される毎に更新されるので、オペレータは、試料Ｏと対物レンズ１との位置関係がずれる毎に（つまり、試料Ｏ上の観察ポイントをずらしたり、試料Ｏを交換したりする毎に）焦点調節の指示を本システムに与えるだけで、前述した効果を持続させることができる。

なお、本実施形態では、位相差観察の際に、対物レンズ１の位置を蛍光観察の位置から下げた（試料Ｏから離した）例を示したが、対物レンズによっては逆の場合もある。
また、本実施形態では、対物レンズ１を移動して焦点の調節を行ったが、試料Ｏを載せたステージ２を上下して焦点の調節を行っても構わない。
［第２実施形態］
図７に基づいて本発明の第２実施形態を説明する。

本実施形態は、蛍光顕微鏡システムの実施形態である。ここでは、第１実施形態との相違点についてのみ説明する。
先ず、本システムの構成を説明する。
図７は、本実施形態の蛍光顕微鏡システムの構成図である。図７では、本システムの主要部、及び第１実施形態の蛍光顕微鏡システムとの相違点を表し、それ以外の部分は省略した。以下、相違点についてのみ説明する。

先ず、本システムには、複数（ここでは３つ）の対物レンズ１−１，１−２，１−３が装着されている。
複数の対物レンズ１−１，１−２，１−３は、切り換え機構（請求項の装着手段に対応。）１’を介して顕微鏡本体に装着されており、光路中に設定される対物レンズ１−ｉは、切り換え機構１’により、対物レンズ１−１，１−２，１−３の間で切り換え可能である。

なお、切り換え機構１’は、制御装置８’内の駆動回路Ｄ１’によって駆動される。駆動回路Ｄ１’は、他の駆動回路と同様、制御装置８’内のＣＰＵ８ａ’からの信号に応じて動作する。
また、これらの対物レンズ１−１，１−２，１−３は、制御装置８’内の駆動回路Ｄ１により、試料Ｏに対する焦点調節方向、すなわち光軸ＡＸの方向に移動可能である。

また、対物レンズ１−１，１−２，１−３の各々には、位相差観察用の位相板が予めセットされている。但し、対物レンズ１−１，１−２，１−３の種類（倍率又は開口数）は、互いに異なる。例えば、対物レンズ１−１は４０倍対物レンズ、対物レンズ１−２は２０倍対物レンズ、対物レンズ１−３は１０倍対物レンズである。
このとき、ずれ量（＝蛍光観察時の対物レンズの焦点ｆＡと位相差観察時の対物レンズの焦点ｆＢとのずれ量）Δは、対物レンズ１−１，１−２，１−２にそれぞれ固有の値Δ１，Δ２，Δ３となる。

このため、制御装置８’内のメモリ８ｂ’は、これらのずれ量Δ１，Δ２，Δ３の情報を予め格納する。これらのずれ量Δ１，Δ２，Δ３は、測定又はシミュレーションによって求められる。
また、本システムに対しオペレータから入力される指示の種類には、焦点調節の指示、蛍光観察の指示、位相差観察の指示の他に、対物レンズ切換の指示がある。

制御装置８’内のＣＰＵ８ａ’は、対物レンズ切換の指示に応じて駆動回路Ｄ１’に対し必要な信号を与え、光路中に設定される対物レンズ１−ｉを対物レンズ１−１，１−２，１−３の間で切り換える。
ここで、対物レンズ１−ｉが切り換えられると焦点調節の必要が生じるので、本システムのオペレータは、焦点調節の指示を本システムに与える。

焦点調節の指示があると、本システムにおいても第１実施形態と同様に焦点検出及び焦点調節が行われる。また、蛍光観察、位相差観察の指示があると、蛍光観察及び位相差観察が行われる。但し、位相差観察において、対物レンズ１−ｉの配置の動作については、第１実施形態におけるそれと異なる。
配置に当たり、本システムのＣＰＵ８ａ’は、駆動回路Ｄ１’を介して切り換え機構１’の状態を参照するなどして設定中の対物レンズ１−ｉが対物レンズ１−１，１−２，１−３の何れであるのかを認識する。

続いてＣＰＵ８ａ’は、メモリ８ｂ’に格納された情報を参照し、認識した対物レンズ１−ｉに対応するずれ量Δｉ、及び座標ＳＡを認識し、駆動回路Ｄ１に対し必要な信号を与え、対物レンズ１−ｉの光軸ＡＸの方向の座標を、ＳＡ−Δｉ（＝ＳＢ）に設定する。
この設定により、位相差観察時に形成される位相差像Ｉ’と、蛍光観察時に形成された蛍光像Ｉとが、試料Ｏ上の同一断面を示すことになる。

以上、本システムでは、メモリ８ｂ’に格納されたずれ量Δ１，Δ２，Δ３の情報が、設定中の対物レンズ１−ｉが対物レンズ１−１，１−２，１−３の何れであるのかに応じて使い分けられる。その結果、対物レンズ１−ｉの切り換えに拘わらず第１実施形態と同じ効果が持続して得られる。
［その他］
なお、上記した焦点検出装置７は、照明系と受光系との双方に兼用されているが、焦点検出装置７を受光系に特化させ、その代わりに落射蛍光照明装置３を焦点検出装置７の照明系に兼用してもよい。その場合、前記した焦点検出装置７と同様の斜光照明を実現するために、落射蛍光照明装置３の開口絞り及び視野絞りの開口部形状は、可変とされる。

また、上記した焦点検出装置７の光源７ａは偏心して配置されているが、傾斜して配置されても上記したものと同等の斜光照明を実現できる。
また、上記した焦点検出装置７には、特許文献１に記載されたその他の焦点検出装置を適用することもできる。
また、上記した蛍光顕微鏡システムの一部を手動にすることもできる。

また、前述した測定又はシミュレーションでは、蛍光観察時の対物レンズ１の焦点ｆＡと位相差観察時の対物レンズ１の焦点ｆＢとが完全に一致するよう、試料Ｏを培養する試料容器（ウエルプレート）Ｏ’の底部Ｏ”’の厚さや屈折率まで考慮してずれ量Δの算出精度を高めてもよい。
また、上記した蛍光顕微鏡システムは、蛍光位相差顕微鏡に本発明を適用したものであるが、位相差観察以外の他の観察方法と蛍光観察とが組み合わされた他の蛍光顕微鏡に本発明を適用してもよい。例えば、微分干渉観察と蛍光観察とが組み合わされた顕微鏡に適用してもよい。但し、位相差観察時の対物レンズの焦点は、他の観察時の対物レンズの焦点と比較して蛍光観察時の対物レンズの焦点と間のずれ量が大きいので、蛍光位相差顕微鏡に適用することが最も有意と考えられる。以下、暗視野観察が組み合わされた蛍光顕微鏡に本発明を適用したものを第３実施形態として説明する。

［第３実施形態］
図８、図９、図１０に基づいて本発明の第３実施形態を説明する。
本実施形態は、暗視野観察が組み合わされた蛍光顕微鏡システムの実施形態である。ここでは、簡単のため、第１実施形態と同様に対物レンズの数を１とし、第１実施形態との相違点のみ説明する。

図８は、本システムの光学系部分の構成図である。図８に示すとおり、本システムには、対物レンズ１’と結像レンズ５との間に、第１実施形態と同じ落射蛍光照明装置３と、落射暗視野照明装置１１３とが組み込まれる。なお、本システムの対物レンズ１’は、位相板１ａや暗視野照明用の光路などを備えていない一般的な対物レンズである。また、本システムでは透過照明装置４は省略されている。

落射蛍光照明装置３は、本システムの蛍光観察に利用される。この蛍光観察は、第１実施形態において説明したとおりである。
落射暗視野照明装置１１３は、本システムの暗視野観察に利用されると共に、本システムの焦点検出及び焦点調節に利用される。
落射暗視野照明装置１１３には、光源１１１、コリメートレンズ１１２、輪帯状の集光レンズ１２１、中空の全反射ミラー１２２などが備えられる。中空の全反射ミラー１２２を備えたブロックＢが、対物レンズ１’と結像レンズ５との間の光路に位置する。このブロックＢは、不図示の機構により、その光路に対し挿脱可能である。

このブロックＢが光路に挿入され、かつ落射蛍光照明装置３のフィルタブロック３ｆが光路から離脱された状態で、落射暗視野照明装置１１３による暗視野観察、焦点検出、及び焦点調節が行われる。蛍光観察時には、このブロックＢは光路から離脱される。
（暗視野観察）
図９は、暗視野観察時に形成される光路（特に照明光の光路）を説明する図である。

落射暗視野照明装置１１３の光源１１１は、試料Ｏ（ここでは蛍光物質により標識された生細胞など）にダメージを与えにくい可視光又は赤外光からなる照明光を出射する。この照明光のうち、図９において点ハッチングで示した照明光Ｌ１が、試料Ｏにまで到達し得る有効な光である。この照明光Ｌ１の断面形状は、図９中にも示す通り、輪帯状である。

輪帯状の照明光Ｌ１は、コリメートレンズ１１２を介して平行光となり、輪帯状の集光レンズ１２１を介して集光され、中空の全反射ミラー１２２に入射する。
中空の全反射ミラー１２２は、輪帯状の集光レンズ１２１の中心軸１２Ｂ（コリメートレンズ１２の光軸と一致）に対して４５度に傾けて、かつ、対物レンズ１’の光軸ＡＸに対して４５度に傾けて、双方の軸上に配置されている。

中空の全反射ミラー１２２の反射面は輪帯状であり、輪帯状の集光レンズ１２１の中心軸１２Ｂの方向（または対物レンズ１’の光軸ＡＸの方向）から見ると円形状、正面から見ると楕円形状となっている。また、中空の全反射ミラー１２２の中空部分（開口部１２Ａ）も、同様に、輪帯状の集光レンズ１２１の中心軸１２Ｂの方向（または対物レンズ１’の光軸ＡＸの方向）から見ると円形状、正面から見ると楕円形状となっている。開口部１２Ａの反射面側の中心１２Ｃは、輪帯状の集光レンズ１２１の中心軸１２Ｂと対物レンズ１’の光軸ＡＸとの交点に一致する。

中空の全反射ミラー１２２の開口部１２Ａには、絞り部材１２３が設けられている。この絞り部材１２３は、対物レンズ１’の光軸ＡＸに対して回転対称な開口形状を有する円筒状の部材であり、開口部１２Ａに嵌め込まれている。また、絞り部材１２３の長さ（光軸ＡＸに沿った長さ）は、輪帯状の集光レンズ１２１側から中空の全反射ミラー１２２に入射する輪帯状の照明光Ｌ１を遮断しないよう適切な長さに設定されている。

中空の全反射ミラー１２２は、輪帯状の集光レンズ１２１からの輪帯状の照明光Ｌ１を全反射して、対物レンズ１’の瞳面１１６の周縁の輪帯状領域に導く。このとき、輪帯状の集光レンズ１２１の作用によって、対物レンズ１’の瞳面１１６には、光源１１１の輪帯状の像が形成される。
瞳面１１６内の周縁の輪帯状領域に導かれた照明光Ｌ１は、対物レンズ１’の各レンズ素子を通って対物レンズ１’の先端から物体面側に出射した後、中空の円錐状の照明光Ｌ１となる。そして斜め方向から試料Ｏに入射する。これにより、試料Ｏに対する反射型の暗視野照明が実現する。暗視野照明された試料Ｏからは回折光や散乱光が発生し、それらの光が観察光として対物レンズ１’に入射する。

図１０は、暗視野観察時に形成される光路（特に観察光の光路）を説明する図である。
試料Ｏで発生した観察光のうち、図１０に点ハッチングで示した観察光Ｌ２が、撮像素子６に到達し得る有効な光である。観察光Ｌ２は、対物レンズ１’の各レンズ素子を通った後、対物レンズ１’の瞳面１１６の光軸を含む中央の円形領域に到達する。この円形領域は、前述した輪帯状領域の内側の領域である。

観察光Ｌ２は、中空の全反射ミラー１２２に設けられた開口部１２Ａ（および絞り部材１２３）を通過し、結像レンズ５の方向に向かって射出すると、結像レンズ５を介して撮像素子６に到達し、試料Ｏの暗視野像（微細な構造を表す。）を形成する。この暗視野像は、暗い背景中に試料Ｏの微細な構造をコントラストで表すものである。この暗視野像は、第１実施形態で説明した蛍光像や位相差像と同様にしてディスプレイに表示される。

（焦点検出・焦点調節）
試料Ｏに対する対物レンズ１’の焦点ずれは、前述した暗視野像のコントラストに現れる。よって、本システムは、前述した暗視野観察時と同様の設定下で、第１実施形態と同様に対物レンズ１’を移動させながら、そのときの撮像素子６の出力信号を参照し、その信号が示す暗視野像のコントラストを最大にするのに必要な対物レンズ１’の光軸ＡＸ方向の座標ＳＡを求める。そして、第１実施形態と同様にして対物レンズ１’をその座標ＳＡに配置する。また、そのときの対物レンズ１’の座標ＳＡは、第１実施形態と同様に、本システムのメモリに格納される（以上、焦点検出・焦点調節）。

そして、本システムの暗視野観察では、この焦点検出・焦点調節と同じく落射暗視野照明装置１１３が用いられるので、対物レンズ１’が配置されるのは、その座標ＳＡである。
一方、本システムの蛍光観察では、この焦点検出・焦点調節とは異なり落射蛍光照明装置３用いられるので、対物レンズ１’が配置されるのは、座標ＳＡから所定のずれ量Δだけずれた座標である。

このずれ量Δは、蛍光観察時における対物レンズ１’の焦点と、暗視野観察時における対物レンズ１’の焦点とのずれ量である。このずれ量Δは、予めの測定又はシミュレーションによって求められ、予めメモリに格納される。
したがって、本システムにおいても、観察方法が蛍光観察と暗視野観察との間で切り換えられても、オペレータは、確実に試料Ｏ上の同一面を観察することができる。

なお、本システムの落射暗視野照明装置１１３においては、中空の全反射ミラー１２２、絞り部材１２３、輪帯状の集光レンズ１２１を１つのブロックとし、そのブロック全体を、非中空のハーフミラーのみからなるブロックと交換可能に構成すれば、暗視野観察と明視野観察との切り替えをすることも可能である。

第１実施形態の蛍光顕微鏡システムの構成図である。 （ａ）は、蛍光観察時に試料Ｏにて発生する蛍光ＬＡに対する対物レンズ１の焦点ｆＡを示す図であり、（ｂ）は、位相差観察時に試料Ｏにて発生する透過光ＬＢに対する対物レンズ１の焦点ｆＢを示す図である。 焦点検出時に形成される光路を示す図である。 蛍光観察時に形成される光路を示す図である。 位相差観察時に形成される光路を示す図である。 （ａ）は、蛍光観察時における対物レンズ１の座標ＳＡ及びその焦点ｆＡを示す図であり、（ｂ）は、位相差観察時における対物レンズ１の座標ＳＢ及びその焦点ｆＢを示す図である。 第２実施形態の蛍光顕微鏡システムの構成図である。 第３実施形態の蛍光顕微鏡システムの光学系部分の構成図である。 暗視野観察時に形成される光路（特に照明光の光路）を説明する図である。 暗視野観察時に形成される形成される光路（特に観察光の光路）を説明する図である。

符号の説明

Ｏ 試料
１，１’ 対物レンズ
１ａ 位相板
２ ステージ
３ 落射蛍光照明装置
３ａ，４ａ，７ａ，１１１ 光源
３ｂ，３ｅ，４ｂ，７ｄ，７ｆ，４ｅ レンズ
３ｄ，７ｅ 視野絞り
３ｆ フィルタブロック
３ｆ−１，７ｃ ダイクロイックミラー
３ｆ−２，３ｆ−３ 波長選択フィルタ
４ 透過照明装置
４ｄ 開口絞り
５ 結像レンズ
６ 撮像素子
７ 焦点検出装置
７ｂ 波長選択フィルタ
７ｇ 偏向ミラー
７ｈ 波長選択フィルタ
７ｉ 検出器
８ 制御装置
８ａ，８ａ’ ＣＰＵ
８ｂ，８ｂ’ メモリ
９ ディスプレイ
Ｄ４ａ，Ｄ２，Ｄ１，Ｄ１’，Ｄ７ｇ，Ｄ７ｉ，Ｄ７ａ，Ｄ３，Ｄ３ｆ，Ｄ６ 駆動回路
１１３ 落射暗視野照明装置
１１２ コリメートレンズ
１２１ 輪帯状の集光レンズ
１２２ 中空の全反射ミラー
１２３ 絞り部材
Ｂ ブロック

Claims (9)

1. 蛍光物質で標識された試料を励起光で照明するための第１照明光学系と、
   前記励起光とは別の所定光で前記試料を照明するための第２照明光学系と、
   前記試料と対物レンズとの距離を変える移動手段と、
   前記励起光による蛍光観察時の前記対物レンズの焦点と、前記所定光による別の観察時の前記対物レンズの焦点とのずれ量の情報を記憶した記憶手段と、
   前記蛍光観察時と前記別の観察時との間で、前記ずれ量に応じて前記移動手段を駆動する制御手段と
   を備えたことを特徴とする蛍光顕微鏡。
2. 請求項１に記載の蛍光顕微鏡において、
   前記移動手段は、
   前記対物レンズを光軸方向に移動させる機構からなる
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
3. 請求項１に記載の蛍光顕微鏡において、
   前記移動手段は、
   前記試料を光軸方向に移動させる機構からなる
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
4. 請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の蛍光顕微鏡において、
   前記蛍光観察時の前記試料に対する前記対物レンズの焦点検出を行う焦点検出手段をさらに備えた
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
5. 請求項４に記載の蛍光顕微鏡において、
   前記制御手段は、
   前記蛍光観察時には、前記焦点検出手段で検出した焦点に前記試料が位置するように前記移動手段を駆動し、
   前記別の観察時には、前記焦点検出手段で検出した焦点から前記ずれ量だけずれた位置に前記試料が位置するように前記移動手段を駆動する
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
6. 請求項１〜請求項５の何れか一項に記載の蛍光顕微鏡において、
   前記蛍光顕微鏡は、複数の対物レンズを有し、
   前記記憶手段は、
   前記複数種類の対物レンズの各々に関する前記ずれ量の情報を予め記憶し、
   前記制御手段は、
   光軸に配置された前記対物レンズの種類に応じた前記ずれ量を使用する
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
7. 請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の蛍光顕微鏡において、
   前記第１照明光学系は、
   前記対物レンズを介して前記試料を照明する落射照明光学系であり、
   前記第２照明光学系は、
   前記対物レンズを介さずに前記試料を照明する透過照明光学系である
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
8. 請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の蛍光顕微鏡において、
   前記第２照明光学系は、
   位相差観察用の位相板を設けた照明光学系であり、
   前記対物レンズは、
   位相差観察用の位相板を設けた対物レンズである
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
9. 請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の蛍光顕微鏡において、
   前記第２照明光学系は、
   輪帯状の断面を有した光束を生成する光学系と、
   前記対物レンズの像面側に配置され、かつ前記光学系からの前記光束を反射して前記対物レンズの瞳面の周縁領域へと入射させる反射面と、物体側の前記試料にて発生し前記対物レンズの前記瞳面の中央領域を通過した観察光を透過して前記対物レンズの像面へと入射させる開口とからなる中空の反射ミラー部材と
   を備えたことを特徴とする蛍光顕微鏡。
   

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