JP7008029B2 - 源自己蛍光を低減させ、均一性を改良するための散乱を伴う撮像システムおよび方法 - Google Patents

Description

（関連出願）
本願は、米国仮出願第６２／３０１，７６０号（２０１６年３月１日出願）に対する優先権を主張し、上記出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

顕微鏡撮像システムは、細胞等の小物体を含むサンプルの画像を収集することができる。撮像システムは、異なる照明モードでサンプルの画像を収集するように装備され得る。例えば、システムは、サンプルを通過した光が検出される照明モードにおける照明画像と、サンプルからの蛍光放出が検出される落射照明モードにおける蛍光画像とを収集するように構成され得る。

照明および落射照明モードの同一撮像システムの中への組み込みは、課題を呈する。照明画像は、好ましくは、カラーであり、カラーは、コントラストを改良し、サンプル成分および特徴を区別するための染料の効果的使用を可能にする。それにもかかわらず、システムが１つのみのカメラを有する場合、モノクロカメラが、概して、従来のカラーカメラよりも弱蛍光を検出するためのそのより高い感度およびそのより高い空間分解能のために必要とされる。カラー照明画像は、対応する源からの赤色、緑色、および青色光を用いた別個の照明中に検出されるグレースケール画像からデジタル的に作成されることができる。しかしながら、３つの源の適切な整列は、問題となり得る。また、シャッタまたはフィルタ等の部品を移動させることが、照明モードの光学経路を互いに隔離するために、および落射照明モードから隔離するために必要とされ得る。

本開示は、源自己蛍光を低減させ、均一性を改良するための散乱を伴う撮像システムおよび方法を提供する。いくつかの実施形態では、システムは、拡散体が、照明光源から検査領域までの各光学経路内に存在したまま、照明光の異なる色で検査領域を照射するように構成されている複数の照明光源を含み得る。システムは、励起光で検査領域を照射するように構成されている励起光源も備え得る。システムは、照明光源の各々を用いて検査領域を照射するように構成され、随意に、照明光源からの光学経路のいずれか内に可動部品を伴わずに、励起光源を用いて検査領域を照射するように構成され得る。システムは、検査領域のグレースケール画像を検出するように構成されている画像検出器と、カラー照明画像をグレースケール画像から作成するように構成されているプロセッサとをさらに備え得る。
例えば、本願は以下の項目を提供する。
（項目１）
撮像システムであって、前記撮像システムは、
照明明光の異なる色で検査領域を照射するように構成されている複数の照明明光源と、
前記照明明光源から前記検査領域までの各光学経路内に存在する拡散体と、
励起光で前記検査領域を照射するように構成されている励起光源と、
前記検査領域のグレースケール画像を検出するように構成されている画像検出器と、
カラー照明画像をグレースケール画像から作成するように構成されているプロセッサと
を備え、
前記撮像システムは、前記照明光源の各々からの照明光で前記検査領域を照射し、前記照明光源から前記検査領域までの前記光学経路のいずれか内の１つ以上の部品を移動させずに、前記励起光源からの励起光で前記検査領域を照射するように構成されている、撮像システム。
（項目２）
前記複数の照明光源は、赤色の光源と緑色の光源と青色の光源とを含み、前記赤色の光源および前記青色の光源は、前記緑色の光源を通る中心光学軸に対してオフセットされており、前記赤色の光源および前記青色の光源からの照明光は、それぞれのオフセットされた光学経路をたどる、項目１に記載の撮像システム。
（項目３）
前記拡散体は、少なくともπステラジアンまたは約２πステラジアンの立体角にわたって実質的に等方的に前記励起光源および各照明光源からの光を散乱させるように構成されている、項目１に記載の撮像システム。
（項目４）
前記励起光源によって生産された励起光は、前記複数の照明光源を含む源アセンブリに進行することを可能にされるが、０．１％未満の効率を伴う、項目１に記載の撮像システム。
（項目５）
前記光源アセンブリは、１つ以上のフォトルミネセンス物質を含み、前記１つ以上のフォトルミネセンス物質からのフォトルミネセンスは、０．１％未満の効率を伴って前記画像検出器に伝送される、項目４に記載の撮像システム。
（項目６）
前記複数の照明光源の各々は、発光ダイオードを含み、各照明光源からの照明光は、前記照明光が前記照明光源から前記検査領域まで進行するにつれて、同一開口を２回通過する、項目５に記載の撮像システム。
（項目７）
前記複数の照明光源は、赤色光源、緑色光源、および青色光源を含む、項目６に記載の撮像システム。
（項目８）
前記プロセッサは、前記検査領域のグレースケール画像を組み合わせることによってカラー画像を作成するように構成され、前記検査領域のグレースケール画像は、他の照明光源の各々が光を実質的に生産していない間の前記照明光源の各々からの照明光での照射中に別個に検出される、項目１に記載の撮像システム。
（項目９）
前記撮像システムは、各照明光源から前記検査領域までの光学経路が変更されないままで、前記照明光源の各々からの照明光で前記検査領域を照射するように構成されている、項目１に記載の撮像システム。
（項目１０）
前記撮像システムは、前記システムの任意の光源または光学要素を移動させずに、前記照明光源の各々からの照明光で前記検査領域を照射するように構成されている、項目１に記載の撮像システム。
（項目１１）
前記撮像システムは、光源から前記検査領域までの任意の光学経路を変更せずに、照明モードから落射照明モードに切り替えるように構成され、落射照明モードから照明モードに切り替えるようにも構成されている、項目１に記載の撮像システム。
（項目１２）
撮像方法であって、前記方法は、
複数の照明光源によって生産された異なる色の照明光でサンプルを照射することであって、拡散体が、前記照明光源から前記検査領域までの各光学経路内に存在する、ことと、
励起光源からの励起光で前記サンプルを照射し、フォトルミネセンスを誘起することと、
前記サンプルのフォトルミネセンス画像を検出することと、
前記照明光源の異なるサブセットを用いた照射を表すグレースケール画像を検出することと、
複数の前記グレースケール画像からの画像データを使用して、カラー画像を作成することと
を含み、
両照射するステップは、前記照明光源から前記検査領域までの各光学経路が同一のままで行われる、方法。
（項目１３）
前記複数の照明光源は、赤色の光源と緑色の光源と青色の光源とを含み、前記照明光でサンプルを照射するステップは、前記赤色の光源および前記青色の光源が、前記緑色の光源を通る中心光学軸に対してオフセットされている間に行われ、前記赤色の光源および前記青色の光源からの照明光は、それぞれのオフセットされた光学経路をたどる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記照明光でサンプルを照射するステップは、前記拡散体を用いて各光源からの照明光を実質的に等方的に少なくともπステラジアンの立体角にわたって散乱させるステップを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記励起光で前記サンプルを照射するステップは、０．１％未満の効率を伴って、前記励起光源からの励起光を前記複数の照明光源を含む光源アセンブリに伝送するステップを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記励起光で前記サンプルを照射するステップは、０．１％未満の効率を伴って、フォトルミネセンスを前記光源アセンブリから画像検出器に伝送するステップを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記照明光でサンプルを照射するステップは、少なくとも３つの照明光源の各々を用いて、前記サンプルを別個に照射するステップを含み、前記カラー画像を作成するステップは、前記少なくとも３つの照明光源の各々を用いた照射の中に検出されたそれぞれのグレースケール画像を組み合わせるステップを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記照明光でサンプルを照射するステップは、前記照明光源の各々から生じる照明光を反射散乱させるステップを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１９）
前記照明光でサンプルを照射するステップは、前記照明光源の各々からの照明光を同一開口に２回通すステップを含む、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
前記カラー画像を作成するステップは、他の照明光源の各々が光を実質的に生産していない間の前記照明光源の各々からの照明光での照射中に別個に検出されたグレースケール画像を組み合わせるステップを含む、項目１２に記載の方法。

図１Ａは、本開示の側面による、グレースケール画像検出器を用いて、検査領域の照明画像およびフォトルミネセンス画像を検出し、複数のグレースケール照明画像からカラー画像を作成するように構成される例示的撮像システムの概略図であり、システムは、照明光が、照明光源から拡散体、拡散体から検査領域、および検査領域から画像検出器に進行する照明モードで動作する。 図１Ｂは、本開示の側面による、図１Ａの撮像システムの別の概略図であり、システムは、励起光が、励起光源から検査領域に進行し、フォトルミネセンスを誘起し、順に、検査領域から画像検出器に進行する落射照明モードで動作する。 図２Ａ－２Ｃは、拡散体を伴わずに構築された図１Ａおよび１Ｂの撮像システムの照明のみの実施形態の概略簡略図であり、拡散体がないことが、どのように赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、および青色（Ｂ）照明光源からの照明光によって辿られるオフセット光学経路をもたらし得るかを図示する。 図３Ａ－３Ｃは、それぞれ、概して、図２Ａ－２Ｃの線３Ａ－３Ａ、３Ｂ－３Ｂ、３Ｃ－３Ｃに沿って得られた図２Ａ－２Ｃの撮像システムの図であり、図２Ａ－２Ｃのオフセット光学経路が検査領域の非均一照射をどのように生産し得るかを図示する。 図４Ａ－４Ｃは、拡散体を伴って構築された図１Ａおよび１Ｂの撮像システムの照明のみの実施形態の概略簡略図であり、図２Ａ－２Ｃと対照的に、拡散体の存在が、どのように赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、および青色（Ｂ）照明光源からの照明光によって辿られる光学経路を整列させ得るかを図示する。 図５Ａ－５Ｃは、それぞれ、概して、図４Ａ－４Ｃの線５Ａ－５Ａ、５Ｂ－５Ｂ、５Ｃ－５Ｃに沿って得られた図４Ａ－４Ｃの撮像システムの図であり、図４Ａ－４Ｃの整列させられた光学経路が各照明光源を用いて検査領域の均一照射をどのように生産し得るかを図示する。 図６は、拡散体を伴わずに構築された図１Ａおよび１Ｂの撮像システムの実施形態の概略図であり、励起光源からの励起光が、どのように照明光源のアセンブリに進行し、そこから自己蛍光を誘起し得、順に、画像検出器に進行し、背景を増加させ得るかを図示する。 図７は、図１Ａおよび１Ｂの撮像システムの概略図であり、図６と比較して、励起光源からの励起光が、どのように照明光源のアセンブリからあまり効率的にフォトルミネセンスを誘起せず、順に、画像検出器にあまり効率的に進行せず、あまり背景をもたらさないかを図示する。 図８は、図７の選択された部分の概略図であり、励起光が、励起光が殆ど照明光源に入射しないように、どのように拡散体によって散乱させられ得るかを図示する。 図９は、図７の選択された部分の別の概略図であり、照明光源からのフォトルミネセンスが、フォトルミネセンスが殆ど画像検出器に到達しないように、どのように拡散体によって散乱させられ得るかを図示する。 図１０は、画像自動焦点合わせ光源と、比色撮像光源の組とを含む照明部分を伴う図１Ａおよび１Ｂの撮像システムの実施形態の照明部分の概略図であり、比色撮像光源から検査領域までの光学経路を図示する。 図１１は、図１０の照明部分の別の概略図であり、画像自動焦点合わせ光源から検査領域までの光学経路を図示する。 図１２は、概して、図１０の線１２－１２に沿って得られた比色撮像光源を含む源アセンブリの図である。

本開示は、源自己蛍光を低減させ、均一性を改良するための散乱を伴う、撮像システムおよび方法を提供する。いくつかの実施形態では、システムは、拡散体が照明光源から検査領域までの各光学経路内に存在したまま、照明光の異なる色で検査領域を照射するように構成されている複数の照明光源を含み得る。システムは、励起光で検査領域を照射するように構成される励起光源も備え得る。システムは、照明光源の各々を用いて、随意に、励起光源を用いて、照明光源からの光学経路のいずれか内の１つ以上の部品を移動させずに、検査領域を照射するように構成され得る。システムは、検査領域のグレースケール画像を検出するように構成される画像検出器と、カラー照明画像をグレースケール画像から作成するように構成されるプロセッサとをさらに備え得る。

本開示のシステムおよび方法は、従来の撮像システムに優る種々の利点をもたらし得る。照明光源に入射する励起光は、これらの光源の近傍またはその中の蛍光体／燐光体から背景蛍光／燐光を励起させることができる。この光放出は、本明細書では、源「自己蛍光」として説明される。放出される光の一部は、少なくとも、概して、照明光源から画像検出器までの光学経路のうちの１つ以上のものを辿り、それは、雑音を検出された蛍光画像内で増加させ得る。本開示のシステムおよび方法は、シャッタまたはフィルタの代わりに、拡散体を利用し、励起光が照明光源に到達する効率を低減させ、それによって、源自己蛍光を減少させる。拡散体はまた、源自己蛍光によって放出される光が画像検出器に進行する効率を低減させる。拡散体は、さらに、または代替として、検査領域における赤色、緑色、および青色照明光ビームの均一性および重複を増加させ、グレースケール検出器を用いた比色撮像を可能にし得る。いくつかの実施形態では、拡散体は、照明光源が、赤色、緑色、および青色光を生産するダイのアレイを有する４チャネルＬＥＤによって提供されることを可能にし得る。拡散体は、照明光源が、システムの光学の再整列の必要なく、異なる照明光源（例えば、紫外線および／または赤外線光源）に変更されることも可能にし得る。拡散体は、システムが、より少ない可動部品を伴って、よりコンパクトであることも可能にし得る。

本開示のさらなる側面が、以下の節：（Ｉ）散乱を伴う比色撮像システムの概要、（ＩＩ）比色撮像システムの概略比較、および（ＩＩＩ）実施例に説明される。

（Ｉ．散乱を伴う比色撮像システムの概要）
本節は、照明（例えば、明視野）比色撮像および落射照明（例えば、フォトルミネセンス）撮像のための例示的顕微鏡撮像システム５０の概要を提供する。図１Ａおよび１Ｂを参照されたい。システム５０は、図１Ａでは、照明モードで、図１Ｂでは、落射照明モードで動作している。

撮像システム５０は、照明部分５２と、落射照明部分５４とを含み、各々は、光で検査領域５６を照射するように構成され、検出部分５８も含み、検出部分５８は、検査領域からの光を収集および検出するように構成される。部分５２および５４の各々は、モジュールまたはアセンブリとして説明され得る。用語「照射」および「照明」ならびにそれらの対応する派生語は、本開示では、同義的に使用される。用語「光」は、本明細書で使用される場合、任意の好適な波長の光学放射を含み得る。故に、光は、可視放射、紫外線放射、赤外線放射、または任意のそれらの組み合わせであり得る。

照明および落射照明部分５２および５４の各々は、光を生産し、光の一部を検査領域に向かわせることによって、検査領域を照射する。照明部分５２は、比色源６０、６２、および６４等の複数の照明光源を含み得、落射照明部分は、励起光源６６等の少なくとも１つの落射照明光源を含み得る。照明光源は、互いから異なるスペクトル帯域および／または異なる色を表す光を発生させる２つ以上の光源を含み得る。例えば、描写される実施形態では、照明部分５２は、３つの可視光源、すなわち、赤色（Ｒ）光源６０と、緑色（Ｇ）光源６２と、青色（Ｂ）光源を含む。いくつかの実施形態では、システムは、各色の複数の照明光源、例えば、２つ以上の赤色光源６０、２つ以上の緑色光源６２、および／または２つ以上の青色光源６４を含み得る。各光源は、発光ダイオード、水銀灯、レーザ等の任意の好適なタイプであり得る。

検出部分５８は、画像検出器６８を備えていることにより、特に、サンプルホルダ７２によって保持されるサンプル７０が検査領域内に存在する間、検査領域５６の画像を検出する。サンプル７０は、検査領域によって画定された試料平面７４、概して、水平平面（ｘｙ平面とも呼ばれる）内に配置され得る。サンプルホルダ７２は、ステージ７６によって、検査領域５６内に支持され得る。

画像検出器は、グレースケール（モノクロ）画像検出器またはカラー画像検出器であり得る。グレースケール画像検出器は、グレースケール画像を検出し、各画像ピクセルは、強度情報のみを運ぶ一方、カラー画像検出器は、カラー画像を検出し、各画像ピクセルは、強度および波長／色情報（例えば、３つのそれぞれの波長／色のための３つの強度）を運ぶ。画像検出器６８は、サンプルの画像（および／または検査領域）を収集するための任意のデバイスであり得る。例示的画像検出器は、電荷結合素子（ＣＣＤ）センサ、能動ピクセルセンサ（例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサ、Ｎ型金属酸化物半導体（ＮＭＯＳ）センサ等）等のアレイ検出器である。

図１Ａおよび１Ｂにそれぞれ示される照明および落射照明モードは、照射および収集／検出が実施される試料平面７４の側に従って画定される。図１Ａの照明モードでは、照射と収集／検出とは、試料平面の反対側で生じる一方、図１Ｂの落射照明モードでは、照射と収集／検出とは、試料平面の同じ側で生じる。例えば、描写される実施形態では、照明光源６０、６２、および６４は、試料平面７４の上方に配置され、画像検出器６８は、試料平面の下方に配置される。対照的に、励起光源６６および画像検出器６８は両方とも、試料平面の下方に配置される。他の実施形態では、システムは、照明光源が試料平面の下方に位置し、励起光源および画像検出器が試料平面の上方に位置するように反転され得る。

図１Ａおよび１Ｂにおける破線矢印によって示される光は、各光源から検査領域まで照射光学経路に沿って進行し、検査領域から画像検出器６８まで検出光学経路に沿って進行する。各照射光学経路は、同じｚ－軸等、ｚ－軸に沿ってサンプル７０に接近し得る。各照射光学経路は、光源と１つ以上の光学要素から成る動作可能に関連付けられた光学とによって決定される。

光学要素は、光を収集し、向かわせ、および／または集中させ、ならびに／もしくは少なくとも部分的に光を遮断する、任意のデバイスまたは構造であり得る。光学要素は、とりわけ、光を反射すること、屈折させること、散乱させること、回折すること、吸収すること、および／またはフィルタ処理する等を行う任意の好適な機構によって機能し得る。例示的光学要素は、レンズ、ミラー、拡散体、格子、プリズム、フィルタ、開口、マスク、ビームスプリッタ、透過ファイバ（光ファイバ）等を含む。各光学要素は、単一光学経路に専用であるか、または２つ以上の光学経路によって共有され得る。システム５０の光学要素は、任意の好適な画像拡大度を提供し得る。

図１Ａは、緑色光源６２のみが活性化されている照明モードで動作する撮像システム５０を示す。源６２によって発生させられた照明光（λ_Ｔ）は、光学経路上で、光学開口７８、透過拡散体８０、集光レンズ８２、別の光学開口８４、別のレンズ８６を通して、検査領域まで進行し得る。光は、サンプルを通過する間、サンプル７０と相互作用し、次いで、対物レンズ８８およびビームスプリッタ９０を通過し、ビームスプリッタの下流に光学的に位置付けられる画像検出器６８の感光性エリアに入射する。画像検出器は、伝送される光を検出することによって、サンプル７０の画像を収集する。照明モードで取得された画像は、照明画像または明視野画像と同義的に呼ばれ得る。

サンプル７０（および／または検査領域５６）と対物レンズ８８との互いに対する位置関係は、システムの焦点位置（焦点とも呼ばれる）を画定する。サンプルからのｚ－軸に沿った対物レンズの距離は、焦点位置を調節可能に変化させ、サンプルが画像検出器の画像平面内で焦点が合っているか、焦点がはずれているかを決定する。焦点位置は、サンプル７０、対物レンズ８８、または両方を移動させることによって、調節され得る。例示的実施形態では、焦点位置は、対物レンズを移動させることによって調節される。対物レンズは、ステージ７６（およびサンプル７０）が静止したまま、対物レンズに動作可能に接続される駆動機構９２によって、ｚ－軸に沿って移動させられ得る。他の実施形態では、駆動機構９２は、対物レンズが静止したまま、ｚ－軸に沿ったステージの位置が調節されるように、ステージ７６に動作可能に接続され得る。ステージ水平駆動機構９４も、ステージ７６と動作可能に関連付けられ、試料平面７４と平行な２つの次元においてステージ（およびサンプル７０）を移動させ得る。

照明光は、サンプルの上流の位置における拡散体８０によって散乱させられ、それは、光を均質化し、視野内の検査領域の照射の均一性を改良する。拡散体は、少なくともπステラジアンまたは約２πステラジアンの立体角等、任意の好適な立体角にわたって、光を各照明光源（および励起光源）から実質的に等方的に散乱させるように構成され得る。以下により詳細に説明されるように、拡散体は、源の各々からの光が拡散体からサンプルまで同一光学経路を辿るように、光源６０、６２、および６４の光学経路を互いに融合するようにも機能し得る。光源は、アレイ内に配置され得、光源６０、６２、および６４（集合的に考慮される）から検査領域まで延びている中心光学軸に対して横方向に互いからオフセットされ得る。拡散体８０による光学経路の融合は、検査領域における源６０、６２、および６４からの光ビームの互いとの整列を改良し得る（重複を増加させる）。

拡散体８０は、任意の好適な構造および性質を有し得る。拡散体は、実質的にランバート反射、すなわち、視野の任意の角度において実質的に同じ見掛け明るさである放射輝度を生産し得る。システム５０の拡散体は、光が拡散体を通して伝送されるにつれて光を散乱させる、透過拡散体である。例示的透過拡散体は、とりわけ、ホログラフィック拡散体、オパールガラス拡散体、研磨ガラス拡散体、および艶消しガラス拡散体を含む。他の実施形態では（例えば、実施例１参照）、拡散体は、光が拡散体によって反射されるにつれて、光を散乱させる反射拡散体であり得る。例示的反射拡散体は、不規則反射表面を含む。

光源６０、６２、および６４は、グレースケール画像検出器６８を用いて、比色撮像を可能にするように構成され得る。各光源は、異なるスペクトル帯域（または波長領域）を表す光を生産し得、それは、サンプルによって異なって吸収され得る。サンプルが光源６０、６２、および６４（別個に、Ｒ、Ｇ、およびＢ）の各々からの光で別個に照射されている間に別個に収集されるグレースケール画像からの画像データの組み合わせは、カラー画像が作成されることを可能にする。より一般的には、カラー画像は（Ｒ、Ｒ＋Ｇ、およびＲ＋Ｇ＋Ｂ）、（Ｒ＋Ｇ、Ｒ＋Ｂ、およびＧ＋Ｂ）等、Ｒ、Ｇ、およびＢ光源の異なるサブセット／組み合わせを用いてサンプルを順次照射する間に検出されたグレースケール画像から作成されることができる。

照明部分５２は、光源６０、６２、および６４から検査領域までの光学経路のいずれか内の１つ以上の部品を移動させずに、光源を連続的に、または異なる組み合わせで制御（例えば、活性化）することによって、光源６０、６２、および６４（および／または異なるそれらの組み合わせ）を用いてサンプル７０（および／または検査領域５６）の連続比色照射を可能にするように構成され得る。言い換えると、連続放射は、光源６０、６２、および６４から検査領域までの光学経路の各々が、同一のまま（可能である場合のステージを垂直に移動させることによる焦点の任意の調節を無視する）、行われ得る。

システム５０は、プロセッサ９６を含み得、プロセッサ９６は、システム５０の任意の好適な組み合わせのデバイスと通信し得、および／または、その動作を制御し得、システムの動作を自動化するための任意の好適なアルゴリズムを装備し得る。プロセッサは、画像データを画像検出器６８から受信し、処理し得、画像検出のタイミング等の画像検出器の動作を制御し得る。プロセッサは、カラー画像も画像検出器によって検出されたグレースケール画像から作成し得る。プロセッサ９６は、対物レンズおよびステージ駆動機構９２、９４をさらに制御し得る。駆動機構９２、９４の制御は、システムが、複数のサンプルおよび／または同一サンプル内の複数の場所の撮像を自動化することを可能にし得る。プロセッサは、照明光源間、および／または、照明モードと落射照明モードとの間、したがって、明視野画像の収集とフォトルミネセンス画像の収集との間の切り替えも制御し得る。

プロセッサ９６は、コンピューティングシステムまたはコンピュータ９８によって提供され得る。コンピュータは、ディスプレイ１００と、ユーザインターフェース１０２と、アルゴリズムおよびデータを記憶するためのメモリと等を含み得る。

図１Ｂは、励起光源６６によって生産された励起光（λ_Ｘ）でのサンプル７０の落射照明の間の撮像システム５０を示す。（光源６０、６２、および６４は、活性化されない。）励起光は、サンプル中の蛍光物質（例えば、蛍光性色素）を励起させ得、それは、蛍光発光すること、すなわち、画像検出器６８によって検出される放出光（λ_Ｍ）を発生させることを蛍光物質に行わせる。画像検出器は、サンプル７０（および／または検査領域５６）のフォトルミネセンス画像を検出する。フォトルミネセンスは、蛍光、燐光等、光の任意の光誘起放出を含む。

励起光および放出光は、部分的に重複する光学経路に沿って進行し得る。励起光は、励起光源６６から、集光レンズ１０４、スペクトルフィルタ、ビームスプリッタ９０、および対物レンズ８８等の１つ以上の光学要素を介してサンプル７０まで進行し得る。放出光は、画像検出器に到達する前、対物レンズ８８、ビームスプリッタ９０、およびスペクトルフィルタを通過し得る。

システム５０は、光源６０、６２、および６４と検査領域との間の各光学経路が開放したまま、落射照明モードで動作し得る。故に、一部の励起光は、光源６０、６２、６４の各々を含む源アセンブリに到達し、源アセンブリ内に存在する１つ以上のフォトルミネセンス物質によって、背景自己蛍光を誘起し得る。しかしながら、励起光が源アセンブリに入射する効率および源アセンブリからのフォトルミネセンスが画像検出器６８に到達する効率は、以下により詳細に説明されるように、部分的に、拡散体８０の存在に起因して、非常に低い。

システム５０は、一方向または両方向（すなわち、照明から落射および／または落射から照明）に、光源６０、６２、および６４から検査領域５６までの光学経路のいずれか内の任意の部品を移動させずに、随意に、励起光源６６から検査領域５６までの光学経路内の任意の部品を移動させずに、図１Ａおよび１Ｂの照明および落射照明モード間で切り替わり得る。

サンプル７０は、任意の好適な材料、物質、分離株、抽出物、粒子等であり得る。サンプルは、撮像されるべき生物学的細胞および／または組織を含み得る。生物学的細胞は、真核性または原核性であり得、生存していることも、死滅していることもある（例えば、固定される）。例示的生物学的細胞は、確立された細胞（細胞株）、一次細胞、組織サンプルからの細胞、臨床サンプルからの細胞（例えば、血液サンプル、流体吸引物、組織断片等）、細菌細胞等を含む。細胞は、フォトルミネセンス物質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を生成し得るか、またはフォトルミネセンス物質で染色され得る（例えば、細胞が固定された後）。

サンプルホルダ７２は、少なくとも１つのサンプルまたは空間的に隔離されたサンプルの任意のアレイを保持するための任意のデバイスであり得る。サンプルホルダは、サンプルの生物学的細胞または組織が、置かれる、および／または取り付けられ得る少なくとも１つの水平の上向きに面した表面領域（場所）を有する、基板を提供し得る。サンプルホルダは、細胞／組織取り付けのための１つのみの表面領域または互いから分離される複数の表面領域もしくはコンパートメントを有し得る。各表面領域は、細胞／組織取り付けを促すためのコーティングを含み得る。コーティングは、例えば、ポリリジン、コラーゲン等であり得る。コーティングは、とりわけ、透明プラスチックまたはガラスから形成され得るサンプルホルダの本体上に位置し得る。例示的サンプルホルダは、スライド、培養皿、マルチウェルプレート（例えば、とりわけ、４、６、８、１２、２４、３２、４８、または９６ウェルを有する）等を含む。

（ＩＩ．比色撮像システムの概略比較）
本節は、拡散体の有無によって互いに異なる例示的撮像システムの概略比較を説明し、拡散体によってもたらされる潜在的利点を図示する。図２Ａ－２Ｃ、３Ａ－３Ｃ、４Ａ－４Ｃ、５Ａ－５Ｃ、および６－９を参照されたい。

図２Ａ－２Ｃおよび３Ａ－３Ｃは、拡散体８０を伴わずに構築された撮像システム５０の照明のみの実施形態１１０の概略簡略図を示す。拡散体８０がないことは、検査領域５６内のサンプル７０まで、赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、および青色（Ｂ）照明光源６０、６２、および６４からの照明光によって辿られるオフセット光学経路をもたらす。より具体的には、図２Ａおよび２Ｃでは、光源６０からの赤色光ビームおよび光源６４からの青色光ビームは、それぞれ、光源６２からの緑色光ビームに対して、サンプル７０において左右にオフセットされる。これらのオフセットの結果は、検出器６８の感光性エリア１１２に対して図３Ａ－３Ｃに示される。赤色、緑色、および青色光ビーム１１４、１１６、および１１８は、互いからオフセットされてエリア１１２に入射し、緑色光ビーム１１６のみエリア１１２上において中心に置かれる。

図４Ａ－４Ｃおよび５Ａ－５Ｃは、撮像システム５０の別の照明のみの実施形態１２０の概略簡略図を示すが、システム１１０との比較のために、拡散体８０を用いて構築された。図４Ａ－４Ｃは、拡散体８０において、赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、および青色（Ｂ）照明光源６０、６２、および６４からの照明光によって辿られる光学経路を融合する拡散体８０の能力を図示する。図４Ａ－４Ｃでは、光源６０からの赤色光ビームおよび光源６４からの青色光ビームは、ここでは、サンプル７０および検出器６８において光源６２からの緑色光ビームと整列させられる（システム１１０と比較して）。図５Ａ－５Ｃでは、赤色、緑色、および青色光ビーム１１４、１１６、および１１８の各々は、エリア１１２上で中心に置かれ、システム１１０におけるより均一照明を提供する。

図６は、照明光源６０、６２、および６４からの光学経路の各々が開放されたまま、拡散体８０を伴わずに構築され、落射照明モードで動作する図１Ａおよび１Ｂの撮像システム５０の１３０の実施形態を示す。言い換えると、光学経路の各々は、光が対応する源から検査領域に進行することを可能にするその照明構成にある。図１Ａおよび１Ｂに存在するサンプルホルダおよびサンプルは、ここでおよび図７では省略され、光源６０、６２、および６４を含む源アセンブリ１３２から生じるサンプルから独立した源自己蛍光に関する議論に焦点を当てる。源アセンブリ１３２は、光源６６からの励起光で照射されると、光を放出する少なくとも１つのフォトルミネセンス物質１３４を含み得る。物質１３４は、例えば、光源自体（例えば、ドープ剤）、光源を支持体に搭載する接着剤、支持体、および／または同等物中に存在し得る。故に、励起光源６６からの励起光は、源アセンブリ１３２に進行し、自己蛍光を誘起し得る。結果として生じる放出光１３６（λ_Ｍ－背景）は、概して、照明光学経路のうちの１つ以上のものに沿ってステージ７６に、次いで、画像検出器６８に進行し、望ましくなく、検出される背景光のレベルを増加させ得る。

図７は、図６との比較のために、その落射照明モードにあり、サンプルまたはサンプルホルダを伴わないシステム５０を示す。励起光源６６からの励起光は、源アセンブリ１３２に入射する。しかしながら、拡散体８０は、励起光を散乱させることによって、源アセンブリ１３２が光源６６によって照射される効率を低減させる。（開口７８も、散乱させられた励起光の一部を遮断し、源アセンブリへの結合をさらに低減させる。）故に、背景光１３６は、破線矢印の代わりに、点線矢印によって示されるように、自己蛍光によって殆ど生産されない（図６と比較して）。開口７８および拡散体８０は、背景光１３６が概して照明経路に沿って画像検出器に進行する効率も低減させ、殆ど背景をもたらさない。

図８および９は、それぞれ、図７の励起および放出経路の部品を図式的に示す。（源アセンブリ１３２の光源６２のみが提示を簡略化するために示される。）源アセンブリ１３２の照射を低減させることにおける開口７８および拡散体８０の役割（図８）と、画像検出器への放出光１３６の伝搬を低減させることにおける開口７８および拡散体８０の役割（図９）とが、描写される。

（ＩＩＩ．実施例）
以下の実施例は、光を散乱させるための拡散体を含む例示的比色撮像システムおよび方法のさらなる側面を説明する。これらの実施例は、例証のために意図され、本開示の範囲全体を定義または限定するべきではない。

（反射拡散体を伴う比色撮像システム）
本実施例は、一対の反射拡散体８０ａ、８０ｂを有する例示的比色撮像システム１４０を説明する。図１０－１２を参照されたい。

図１０および１１は、システム１４０の照明部分のみを示す。システムはシステム５０（例えば、図１Ａおよび１Ｂ参照）に関して上で説明されるように、ステージ７６の下方に位置する落射照明部分５４および検出部分５８の両方を有する。より一般的には、システム１４０は、第Ｉ節の撮像システム５０内に存在する要素および特徴の任意の好適な組み合わせを有し得る。

システム１４０は、検査領域の照明のために、照明源アセンブリ１４２と、別個の画像自動焦点合わせ源１４４とを含む（図１０および１２参照）。源アセンブリ１４２は、赤色、緑色、および青色光源６０、６２、および６４のアレイ（図１２参照）を含む源アセンブリ１３２（図７参照）に関して上で説明される要素および特徴のいずれかを有し得る。白色光源１４６も、源アセンブリ１４２によって提供され得る。源６０、６２、６４、および１４６の各々は、ダイ（チップとも呼ばれる）によって形成される発光ダイオードであり得る。ここでは長方形として示される各ダイは、同一支持体１４８上に搭載され得る。ダイは、とりわけ、示されるように、２×２アレイ等の２次元アレイで配置され得るか、またはラインで配列され得る。ダイは、集合的に、支持体１４８に取り付けられるポリマーカバー下に配置され、および／またはその中に埋め込まれ得る。ポリマーカバーは、ダイを保護し、ダイからの光を源アセンブリ１４２から伝送する光学要素として機能し得る。いくつかの実施形態では、源アセンブリ１４２が、画像自動焦点合わせ源１４４の代わりに、自動焦点合わせのために使用される照明光を生産し得る。

図１０は、源アセンブリ１４２から検査領域５６まで光によって辿られる光学経路を示す。提示を簡略化するために、源アセンブリ１４２は、ここでは、単一光源として図示される。比色撮像のための照明光は、源アセンブリから反射拡散体８０ａまで進行し、反射拡散体は、拡散体の不規則反射表面に入射する光を反射散乱させる。光を反射する、反射表面のサイズは、拡散体８０ａと動作可能に関連付けられた開口画定マスク１５０によって制限され得る。反射された光は、順に、半球集光レンズ１５２、開口画定要素１５４を通過し、ビームスプリッタ１５６に進行し得る。ビームスプリッタは、光の一部のみが一対のレンズ１５８、１６０によって形成される集光器に反射され、順に、光を検査領域５６に伝送するように、部分的に反射性（Ｒ）および部分的に透過性（Ｔ）（例えば、７０％Ｒ、３０％Ｔ）であり得る。源アセンブリ１４２からの光線は、互いに平行に検査領域５６を通過し、Ｋｏｈｌｅｒ照明を提供し得る。光は、次いで、上で説明されるように、画像検出器上に収集および集中させられる。

図１１は、画像自動焦点合わせ源１４４から検査領域５６までの光によって辿られる光学経路を示す。画像自動焦点合わせのための照明光は、源１４４からミラー１６２まで進行し、それは、光をビームスプリッタ１５６に向かって反射する。光の一部は、ビームスプリッタ１５６によって反射拡散体８０ｂに向かって反射され、それは、拡散体の不規則反射表面で受け取られた光を反射散乱させる。光を反射する反射表面のサイズは、拡散体８０ｂと動作可能に関連付けられた開口画定マスクによって制限されることも、そうでないこともある（拡散体８０ａに関してのように）。反射され、散乱させられた光の一部は、ビームスプリッタ１５６、レンズ１５８、１６０、および検査領域５６を通過し得る。光は、次いで、上で説明されるように、画像検出器上に収集および集中させられる。

システム１４０内に含まれ得る、画像自動焦点合わせのさらなる側面は、２０１５年１０月１９日に出願された米国特許出願第１４／８８６，９９８号に説明され、参照することによって本明細書に組み込まれる。

上記に記載される本開示は、独立した有用性を伴って、１つ以上の明確に異なる発明を包含し得る。これらの発明の各々は、その好ましい形態で開示されている。本明細書に開示および図示されるようなその具体的実施形態を含むこれらの好ましい形態は、多数の変形例が可能性として考えられるので、限定的意味と見なされることを意図するものではない。本発明の主題は、本明細書に開示される種々の要素、特徴、機能、および／または性質の全ての新規および非明白な組み合わせならびに副次的組み合わせを含む。

Claims (20)

1. 撮像システムであって、前記撮像システムは、
   照明光の異なる色で検査領域を照射するように構成されている複数の光学構成要素を含む複数の照明光源と、
   前記複数の照明光源から前記検査領域までの各光学経路内に存在する拡散体と、
   励起光で前記検査領域を照射するように構成されている励起光源と、
   前記検査領域の複数のグレースケール画像を検出するように構成されている画像検出器と、
   前記複数のグレースケール画像からカラー画像を作成するように構成されているプロセッサと
   を備え、
   前記撮像システムは、前記複数の照明光源の各々からの照明光で前記検査領域を照射し、前記複数の照明光源から前記検査領域までの前記光学経路のいずれか内の１つ以上の部品を移動させることなく、前記励起光源からの励起光で前記検査領域を照射するように構成されており、
   前記拡散体は、前記画像検出器によって検出された前記複数の光学構成要素からの背景自己蛍光を低減させ、前記複数の照明光源の各々から照明光が伝送され、前記検査領域を通過する、撮像システム。
2. 前記複数の照明光源は、赤色の光源と緑色の光源と青色の光源とを含み、前記赤色の光源および前記青色の光源は、前記緑色の光源を通る中心光学軸に対してオフセットされており、前記赤色の光源および前記青色の光源からの照明光は、それぞれのオフセットされた光学経路をたどる、請求項１に記載の撮像システム。
3. 前記拡散体は、少なくともπステラジアンまたは約２πステラジアンの立体角にわたって実質的に等方的に前記励起光源および前記複数の照明光源の各々からの光を散乱させるように構成されている、請求項１に記載の撮像システム。
4. 前記励起光源によって生成された励起光は、前記複数の照明光源を含む光源アセンブリに伝送されるが、０．１％未満の効率を伴う、請求項１に記載の撮像システム。
5. 前記光源アセンブリは、１つ以上のフォトルミネセンス物質を含み、前記１つ以上のフォトルミネセンス物質からのフォトルミネセンスは、０．１％未満の効率を伴って前記画像検出器に伝送される、請求項４に記載の撮像システム。
6. 前記複数の照明光源の各々は、発光ダイオードを含み、前記複数の照明光源の各々からの照明光は、前記照明光が前記複数の照明光源の各々から前記検査領域まで進行するにつれて２つの開口を通過する、請求項５に記載の撮像システム。
7. 前記複数の照明光源は、赤色光源と緑色光源と青色光源とを含む、請求項６に記載の撮像システム。
8. 前記複数のグレースケール画像の各々は、前記複数の照明光源の各々からの照明光を用いる別個の照射中に検出され、前記カラー画像は、前記複数のグレースケール画像を互いに組み合わせることによって作成される、請求項１に記載の撮像システム。
9. 前記撮像システムは、前記複数の照明光源の各々から前記検査領域までの光学経路が変更されないままで、前記複数の照明光源の各々からの照明光で前記検査領域を照射するように構成されている、請求項１に記載の撮像システム。
10. 前記撮像システムは、前記撮像システムの任意の光源または光学要素を移動させることなく、前記複数の照明光源の各々からの照明光で前記検査領域を照射するように構成されている、請求項１に記載の撮像システム。
11. 前記撮像システムは、光源から前記検査領域までの任意の光学経路を変更することなく、照明モードから落射照明モードに切り替えるように構成されており、落射照明モードから照明モードに切り替えるようにも構成されており、
    前記照明モードにおいて、前記複数の照明光源の各々から照明光が伝送され、前記検査領域を通過し、前記落射照明モードにおいて、前記励起光源から前記検査領域に励起光が伝送されることにより、前記検査領域のフォトルミネセンスを誘起する、請求項１に記載の撮像システム。
12. 撮像の方法であって、前記方法は、
    複数の光学構成要素を含む複数の照明光源によって生成された異なる色の照明光でサンプルを照射することであって、前記複数の照明光源から前記サンプルまでの各光学経路内に拡散体が存在する、ことと、
    励起光源からの励起光で前記サンプルを照射することにより、フォトルミネセンスを誘起することと、
    画像検出器が、前記サンプルのフォトルミネセンス画像を検出することと、
    前記画像検出器が、前記複数の照明光源の異なるサブセットを用いた照射を表す複数のグレースケール画像を検出することと、
    前記複数のグレースケール画像からの画像データを使用して、カラー画像を作成することと
    を含み、
    照射するステップの両方は、前記複数の照明光源から前記サンプルまでの各光学経路が同一のままで行われ、
    前記拡散体は、前記画像検出器によって検出された前記複数の光学構成要素からの背景自己蛍光を低減させ、前記複数の照明光源の各々から照明光が伝送され、前記サンプルを通過する、方法。
13. 前記複数の照明光源は、赤色の光源と緑色の光源と青色の光源とを含み、前記照明光でサンプルを照射するステップは、前記赤色の光源および前記青色の光源が、前記緑色の光源を通る中心光学軸に対してオフセットされている間に行われ、前記赤色の光源および前記青色の光源からの照明光は、それぞれのオフセットされた光学経路をたどる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記照明光でサンプルを照射するステップは、前記拡散体を用いて前記複数の照明光源の各々からの前記照明光を実質的に等方的に少なくともπステラジアンの立体角にわたって散乱させるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記励起光で前記サンプルを照射するステップは、０．１％未満の効率を伴って、前記励起光源からの励起光を前記複数の照明光源を含む光源アセンブリに伝送するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
16. 前記励起光で前記サンプルを照射するステップは、０．１％未満の効率を伴って、フォトルミネセンスを前記光源アセンブリから画像検出器に伝送するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記照明光でサンプルを照射するステップは、少なくとも３つの照明光源の各々を用いて、前記サンプルを別個に照射するステップを含み、前記カラー画像を作成するステップは、前記少なくとも３つの照明光源の各々を用いた照射中に検出されたそれぞれのグレースケール画像を組み合わせるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
18. 前記照明光でサンプルを照射するステップは、前記複数の照明光源の各々から生じる照明光を反射散乱させるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
19. 前記照明光でサンプルを照射するステップは、前記複数の照明光源の各々からの照明光が２つの開口を通過するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
20. 前記複数のグレースケール画像の各々は、前記複数の照明光源の各々からの照明光を用いる別個の照射中に検出され、前記カラー画像は、前記複数のグレースケール画像を互いに組み合わせることによって作成される、請求項１２に記載の方法。
    

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