WO2009142312A1 - 顕微鏡装置 - Google Patents

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WO2009142312A1
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optical
optical system
illumination
microscope apparatus
objective lens
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English (en)
French (fr)
Inventor
二星俊明
Original Assignee
株式会社ニコン
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the present invention relates to a microscope apparatus. Background art
  • Confocal microscopes and total reflection fluorescence microscopes are widely used as methods for observing living cells, etc., and both are common in that they use a laser light source.
  • microscopes that can be used for confocal microscopes and total reflection fluorescence microscopes. It has been proposed (see, for example, Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 5-1 2 1 7 96). Disclosure of the invention
  • the present invention provides an objective lens, an illumination optical system that irradiates a specimen with a laser beam from a laser light source through the objective lens, and a fluorescence detection optical system that detects fluorescence from the specimen.
  • a fluorescent cube that guides the laser beam to the specimen, and an optical unit that can be inserted into and removed from the laser light source side of the fluorescent cube, and the optical unit transmits the chief ray of the laser beam to the illumination optical system.
  • a first optical member that is substantially parallel to the optical axis of the first optical member, and a second optical member that condenses the laser beam at a predetermined position away from the optical axis of the pupil position of the objective lens,
  • a microscope apparatus is provided in which the first optical member and the second optical member are movable in the illumination optical system. Provide.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a microscope apparatus according to an embodiment.
  • FIG. 2 shows an optical system of the microscope apparatus according to the embodiment.
  • FIG. 3 shows the optical system of the microscope apparatus when the optical system of the microscope apparatus according to the embodiment is switched to the total reflection microscope.
  • FIG. 4A is a diagram for explaining a confocal scanning illumination state or an epi-illumination state in the operation of the imaging position converting optical means in the microscope apparatus according to the embodiment.
  • FIG. 4B is a diagram for explaining a total reflection illumination state in the operation of the imaging position converting optical means in the microscope apparatus according to the embodiment.
  • FIG. 4C is a diagram for explaining the action of the eyelid prism in the operation of the imaging position converting optical means in the microscope apparatus according to the embodiment.
  • FIG. 5A is an explanatory diagram when the movement amount is “(1 + ⁇ !” In the operation of the imaging position converting optical means according to the embodiment.
  • FIG. 5 (b) is an explanatory diagram when the movement amount is “d” in the operation of the imaging position converting optical means according to the embodiment.
  • FIG. 5C is an explanatory diagram when the imaging position converting means is moved “D” in the optical axis direction with respect to FIG. 5B in the operation of the imaging position converting optical means according to the embodiment.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a microscope apparatus according to an embodiment.
  • Figure 2 shows the optical system of the microscope apparatus according to the embodiment.
  • Figure 3 shows the optical system of the microscope device when switched to the total reflection microscope.
  • 4A to 4C are diagrams for explaining the operation of the imaging position converting optical means.
  • FIG. 4A shows the confocal scanning illumination state or the epi-illumination state
  • FIG. 4B shows the total reflection illumination state
  • FIG. 6 is a diagram for explaining the operation of a wedge prism.
  • FIG. 5A′5C is a diagram for explaining the operation of the imaging position converting optical means according to the embodiment.
  • a transmission illumination optical system to be described later is omitted.
  • the microscope apparatus 1 includes an inverted fluorescent microscope main body 2 (hereinafter simply referred to as a microscope) and a personal computer for controlling various apparatuses mounted on the microscope 2. It consists of a control device 3 (hereinafter referred to as PC).
  • PC a control device 3
  • the microscope 2 illuminates the specimen 1 2 placed on the stage 1 1 with the light from the transmission illumination light source 1 3 through the transmission illumination optical system 1 4, and transmits the light transmitted through the specimen 1 2 to the reporva 1 5. Light is collected with the mounted objective lens 16.
  • the light collected by the objective lens 16 is imaged on the primary image plane 1 7 a via the imaging lens 1 8 of the imaging optical system 1 7 and the mirror M 1. .
  • the image of the specimen 1 2 imaged on the primary image plane 1 7 a is passed through the relay lens 1 7 b, the mirror M 2, the relay lens 1 7 c, and the lens 1 9 a of the eyepiece tube 1 9
  • the image is formed on the next image plane 1 8 b and observed by an observer through an eyepiece (not shown).
  • the fluorescent cube 21 in the fluorescent tube holder 20 shown in FIG. 1 is removed from the optical path of the imaging optical system 17.
  • the prism 2 2 is exchangeably disposed in the optical path of the imaging optical system 17, and is removed from the optical path when the transmission image of the specimen 12 is observed.
  • the microscope apparatus 1 can be used as a transmission microscope.
  • a confocal scanning observation system 3 1 and an epi-illumination system 4 1 are arranged via a common illumination optical system 51.
  • the microscope apparatus 1 is a scanning microscope (scanning fluorescence microscope, confocal scanning microscope) Will be described with reference to FIG.
  • the confocal scanning observation system 3 1 guides laser light from a laser light source (not shown) by an optical fiber 3 2, and laser emitted from the end face of the optical fiber 3 2 by a collector lens 3 3
  • the light is converted into a laser beam substantially parallel to the optical axis and is incident on a two-dimensional scanner 34 that scans the sample 1 2 two-dimensionally.
  • the laser light emitted from the two-dimensional scanner 3 4 is imaged on the image plane I P 1 by the pupil relay lens 3 5.
  • the laser beam emitted from the image plane I P 1 is made into a laser beam substantially parallel to the optical axis by the imaging lens 52 of the illumination optical system 51 and is incident on a mirror (not shown) arranged to be exchangeable in the optical path.
  • the mirror (not shown) is configured to be switchable with the fluorescent cubes 2 1 and 6 1.
  • the dichroic mirror 4 4 detachably disposed in the optical path of the illumination optical system 51 used in the epi-illumination system 4 1 described later is used for illumination optics.
  • System 5 1 is out of the optical path.
  • the laser light incident on a mirror (not shown) is reflected in the direction of the objective lens 16, enters the objective lens 16, and is collected on the sample 12.
  • the fluorescence excited by the light and expressed in the sample 1 2 is collected by the objective lens 16, reflected by a mirror (not shown), and travels back through the illumination optical system 51 and enters the two-dimensional scanner 3 4. Then, it is reflected by the dichroic mirror 36 and enters the light receiving element 39 such as PMT through the imaging lens 37 and the pinhole 38.
  • P C 3 is generated as a two-dimensional image based on the intensity of each point received by the light receiving element 39 and displayed on a monitor 3 a or the like.
  • the microscope apparatus 1 can be used as a confocal scanning microscope.
  • the light from the light source (not shown) of the epi-illumination system 4 1 is guided by the optical fiber 4 2, and the light emitted from the end face of the optical fiber 4 2 by the collector lens 4 3 is the position of the field stop 4 5 position. It is focused on.
  • the light emitted from the field stop 4 5 is inserted into the illumination optical system 5 1.
  • Removably arranged dichroic mirror 4 4 is incident and reflected, condensed by the imaging lens 5 2 of the illumination optical system 51, and exchanged in the optical path as light substantially parallel to the optical axis.
  • the incident light enters the fluorescent cube 2 1.
  • a light source not shown
  • a laser light source, a high-pressure mercury lamp, a xenon lamp, or the like can be used.
  • the fluorescent cube 21 includes a wavelength selection filter 21a, a dichroic mirror 21b, and an emission filter 21c.
  • the light incident on the fluorescent cube 21 is selected by the wavelength selection filter 2 1 a and the dichroic mirror 2 1 b, reflected in the direction of the objective lens 16, and incident on the objective lens 16. And collected on sample 1 2.
  • the fluorescence excited by this light and expressed in the specimen 1 2 is collected by the objective lens 16 and incident on the fluorescence cube 21, and the predetermined fluorescence is selectively transmitted through the emission filter 2 1 c of the fluorescence cube 2 1,
  • An image is formed on the image sensor 23 through the prism 22 arranged detachably on the imaging lens 18 and the imaging optical system 17, and a fluorescent image is taken.
  • the image picked up by the image sensor 23 is subjected to image processing by PC 3 shown in FIG. 1 and displayed on the monitor 3a.
  • the microscope apparatus 1 can be used as an epifluorescence microscope.
  • the fluorescent image picked up by the image pickup device 23 and the confocal image formed from the signal received by the light receiving device 39 are superposed on the monitor 3a for observation. Is possible.
  • the illumination for use as a total reflection microscope uses the laser light of the confocal scanning observation system 31 described above.
  • an imaging position conversion optical means 70 described later for achieving total reflection illumination is inserted into the optical path between the imaging lens 52 and the fluorescent cube 61 to achieve a total reflection microscope. .
  • laser light from a laser light source (not shown) of the confocal scanning observation system 3 1 is guided by an optical fiber 3 2 and is collected from an end face of the optical fiber 3 2 by a collector lens 3 3.
  • the laser beam emitted from the laser beam is made into a laser beam substantially parallel to the optical axis and is incident on the two-dimensional scanner 3 4.
  • the XY mirrors of the two-dimensional scanner 3 4 are tilted in order to focus the laser light in the total reflection condition area away from the optical axis at the pupil position P of the objective lens 16.
  • the laser beam after the optical axis shift emitted from the two-dimensional scanner 3 4 is imaged on the image plane IP 1 by the pupil relay lens 35, and the image forming position via the imaging lens 5 2 of the illumination optical system 51.
  • the light enters the conversion optical means 70.
  • the imaging position converting optical means 70 converts the optical axis of the laser beam after the optical axis shift into a light beam that is condensed at the pupil position P of the objective lens 16 after shifting the optical axis by a distance d from the optical axis of the illumination optical system 51. Convert.
  • the converted laser light then enters the fluorescent cube 61.
  • the imaging position converting optical means 70 includes a wedge prism 7 2 and a condensing lens 7 such as a convex lens 7
  • the optical system 51 is configured so that it can be inserted into and removed from the optical path of the illumination optical system 51 shown in FIG.
  • the wedge prism 72 and the condensing lens 73 have an optical axis I1 that is the optical axis I1 of the laser beam after the optical axis shift, as shown in FIGS. 3 and 4B. It is possible to shift the distance by “d”. This distance “d” corresponds to the position on the pupil plane that is the total reflection condition when the object to be examined is illuminated through the objective lens 16.
  • the laser beam incident on the imaging position converting optical means 70 is shifted by the distance “d” from the optical axis I 1 to the optical axis of the illumination optical system 51 by the wedge prism 7 2. It becomes laser light and is condensed by the condensing lens 73 on the annular total reflection condition region at the pupil position P of the objective lens 16.
  • the laser beam condensed in the total reflection condition region is incident on the sample 12 at an angle at which it is totally reflected from the objective lens 16 at the boundary surface between the sample 1 2 and the glass substrate supporting the sample 1 2. .
  • Laser light incident on the interface with the substrate supporting sample 1 2 at a total reflection angle generates an evanescent wave at the interface, and fluorescence excited by the evanescent wave is generated near the interface of sample 1 2 To do. Since the wavelength of the laser beam is selected by a laser light source (not shown), the wavelength selection filter shown in Fig. 2 is not necessary at this time. The .
  • the fluorescence excited by the evanescent wave and expressed in the sample 1 2 is collected by the objective lens 16 and incident on the fluorescence cube 61, and the predetermined fluorescence is selectively transmitted through the emission filter 2 1c of the fluorescence cube 61.
  • the image is formed on the image sensor 2 3 through the prism 2 2 detachably arranged on the optical axis of the image forming lens 1 8 and the image forming optical system 17, and a fluorescence image is captured by the image sensor 2 3. .
  • the image captured by the image sensor 23 is subjected to image processing by P C 3 shown in FIG. 1 and displayed on the monitor 3 a.
  • the microscope apparatus 1 inserts the imaging position converting optical means 70 into the optical path of the illumination optical system 51, and the optical axis I1 of the laser light is separated from the optical axis of the illumination optical system 51 by “ d '' only by moving it approximately parallel through the two-dimensional scanner 34 and the wedge prism 72, and forming an image at a predetermined position on the pupil plane P of the objective lens 16 with the imaging lens 73. It can be used as an emission fluorescence microscope.
  • Fig. 4A shows the state of illumination light when used as a scanning microscope or an epi-illumination microscope.
  • the optical axis I1 of the laser beam is shifted by a distance "d" upward from the optical axis of the illumination optical system 51 on the paper surface of Figs. 4A to 4C. ing. Further, the laser light emitted from the imaging lens 52 is incident with the optical axis I 1 of the laser light inclined at an angle ⁇ with respect to the optical axis of the illumination optical system 51 as shown in FIG. 4C.
  • the wedge prism 72 converts the optical axis of the illumination optical system 51 and the optical axis I1 of the laser light so that they are substantially parallel to each other by a distance “d” with the inclination angle being made substantially zero.
  • the laser beam is condensed by the condenser lens 73 and the annular total reflection line at the pupil position P of the objective lens 16. Focused on the subject area. As a result, total reflection illumination is possible.
  • ⁇ is the refractive index of the medium constituting the wedge prism 72.
  • a wedge prism 7 2 ⁇ having an apex angle ⁇ 5 corresponding to the inclination angle ⁇ of the optical axis I 1 of the laser light corresponding to the numerical aperture ( ⁇ ) of the objective lens 16, and a condensing light with a focal length f Total reflection illumination can be easily achieved by inserting the imaging position conversion optical means 70 combined with the lens 73 between the imaging lens 52 of the illumination optical system 51 and the fluorescent cube 61. become.
  • the wedge prism 7 2 and the imaging lens 7 3 of the imaging position converting optical means 70 inserted into the optical path of the illumination optical system 51 are shown in FIGS.
  • the illumination optical system 51 is configured to be movable in the optical path.
  • the wedge prism ⁇ 2 and the imaging lens 73 are integrally formed in a direction orthogonal to the optical axis of the illumination optical system 51, or the optical axis of the illumination optical system 51.
  • the wedge prism 72 and the imaging lens 73 can be configured to move individually.
  • the imaging position converting means 70 After moving the imaging position converting means 70 in a direction perpendicular to the optical axis of the illumination optical system 51, only the imaging lens 73 is moved along the optical axis of the illumination optical system 51. It is also possible to configure. With this configuration, it is easy to focus on the total reflection region at the pupil position P of the objective lens 16 after the optical axis of the laser beam is shifted by d.
  • the positions of the wedge prism 7 2 and the imaging lens 73 in the illumination optical system 51 can be adjusted.
  • the laser beam can be focused on the total reflection illumination area corresponding to the objective lens 16.
  • the operation of the imaging position converting optical means 70 when the movement amount “d” and the pupil position change will be described.
  • Fig. 5A from the objective lens 16 with the movement amount “d + A o;" and pupil position "P 1", the movement amount shown in Fig. 5B and Fig. 5C is "d” and the pupil position
  • the case where is replaced with “P” objective lens 16 will be explained.
  • the amount of movement of the optical axis I 1 of the laser beam is changed from + to “d”, and the tilt of each XY mirror of the two-dimensional scanner 3 4 is controlled via the control unit of the PC 3 shown in FIG.
  • the position converting optical means 70 is moved in a direction perpendicular to the optical axis of the illumination optical system 51, and the optical axis I1 of the light beam emitted from the wedge prism 72 is substantially parallel to the optical axis of the illumination optical system 51. (See Fig. 5B).
  • the optical axis I 1 is set to the distance “d” from the optical axis of the illumination optical system 51.
  • the imaging position converting optical member 70 is moved along the optical axis of the illumination optical system 51 by the movement amount “D” (see FIG. 5B), and the laser beam is moved to the pupil position “P” of the objective lens 16. Position the imaging lens 73 so that it is focused (see Figure 5C).
  • the movement control of the imaging position conversion optical means 70 or The movement control of each of the wedge prism 72 and the imaging lens 73 can be configured to drive each driving unit (not shown) via the control unit of the PC 3.
  • the laser beam is illuminated by controlling the two-dimensional scanner 3 4 of the confocal scanning observation system 3 1 to a predetermined inclination.
  • the image forming position converting optical means 70 is inserted into the optical path of the illumination optical system 51, and the positions of the wedge prism 7 2 and the image forming lens 73 are adjusted so as to be totally reflected. Fluorescence observation can be enabled.
  • the laser beam is shifted from the optical axis of the illumination optical system 51 by controlling the two-dimensional scanner 34 of the confocal scanning observation system 31 to a predetermined inclination. Thereafter, total reflection fluorescence observation can be made possible by adjusting the positions of the wedge prism 7 2 and the imaging lens 7 3 of the imaging position converting optical means 70.
  • Microscopes such as confocal scanning observation, scanning fluorescence observation, epifluorescence observation, and transmission observation
  • a microscope apparatus 1 that can also be used as a mirror can be provided.

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Abstract

　対物レンズ１６と、レーザ光源３２，４２からのレーザ光束を前記対物レンズ１６を介して標本１２に照射する照明光学系５１と、前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、前記レーザ光束を前記標本へ導く蛍光キューブ６１と、前記蛍光キューブの前記光源側に挿脱可能な光学手段７０とを有し、前記光学手段は、前記レーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行にする第１光学部材７２と、前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の光軸から離れた所定の位置に集光する第２光学部材７３とを有し、前記第１光学部材と前記第２光学部材は、前記照明光学系内で移動可能である顕微鏡装置１。

Description

明 細 書
発明の名称
技術分野
本発明は、 顕微鏡装置に関する。 背景技術
共焦点顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡は、 生体細胞等の観察方法として広く使用さ れており、 共にレーザ光源を使用する点で共通しており、 共焦点顕微鏡と全反射 蛍光顕微鏡に使用できる顕微鏡が提案されている （例えば、 特開 2 0 0 5— 1 2 1 7 9 6号公報参照） 。 発明の開示
従来の顕微鏡では、 共焦点顕微鏡から全反射顕微鏡への切り替え、 或いは全反 射顕微鏡において対物レンズを切替えた際に、 対物レンズの瞳位置の全反射条件 領域にレーザ光を集光させるための光学部材をその都度交換する必要があり、 切 替え交換作業が煩雑であるという問題がある。
上記課題を解決するため、 本発明は、 対物レンズと、 レーザ光源からのレーザ 光束を前記対物レンズを介して標本に照射する照明光学系と、 前記標本からの蛍 光を検出する蛍光検出光学系と、 前記レーザ光束を前記標本へ導く蛍光キューブ と、 前記蛍光キューブの前記レーザ光源側に挿脱可能な光学手段とを有し、 前記 光学手段は、 前記レーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行に する第 1光学部材と、 前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の光軸から離れ た所定の位置に集光する第 2光学部材とを有し、 前記第 1光学部材と前記第 2光 学部材は、 前記照明光学系内で移動可能であることを特徴とする顕微鏡装置を提 供する。
本発明によれば、 共焦点顕微鏡から全反射蛍光顕微鏡に切換え可能であると共 に、 全反射照明時の対物レンズの切替えにも対応が容易な顕微鏡装置を提供する ことができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。
図 2は、 実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を示す。
図 3は、 実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を全反射顕微鏡に切換えた際 の顕微鏡装置の光学系を示す。
図 4 Aは、 実施の形態にかかる顕微鏡装置における結像位置変換光学手段の作 用における、 共焦点走査照明状態または落射照明状態を説明する図。
図 4 Bは、 実施の形態にかかる顕微鏡装置における結像位置変換光学手段の作 用における、 全反射照明状態を説明する図。
図 4 Cは、 実施の形態にかかる顕微鏡装置における結像位置変換光学手段の作 用における、 禊プリズムの作用を説明する図。
図 5 Aは、 実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作において、 移動量 が 「(1 + Δ θ!」 の場合の説明図。
図 5 Βは、 実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作において、 移動量 が 「d」 の場合の説明図。
図 5 Cは、 実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作において、 図 5 B に対して結像位置変換手段を光軸方向に 「D」 移動した場合の説明図。 発明の実施の形態
以下、 本発明の一実施の形態にかかる顕微鏡装置について図面を参照しつつ説 明する。 図 1は、 実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。 図 2は実施の形 態にかかる顕微鏡装置の光学系を示す。 図 3は全反射顕微鏡に切換えた際の顕微 鏡装置の光学系を示す。 図 4 A〜 4 Cは結像位置変換光学手段の作用を説明する 図であり、 図 4 Aは共焦点走査照明状態または落射照明状態を、 図 4 Bは全反射 照明状態を、 図 4 Cは楔プリズムの作用をそれぞれ説明する図である。 図 5 A ' 5 Cは、 実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作を説明する図である。 なお、 図 2、図 3では、 後述する透過照明光学系を省略している。
図 1から図 4 A〜 4 Cにおいて、顕微鏡装置 1は、倒立型蛍光顕微鏡本体 2 (以 後、 単に顕微鏡と記す） と顕微鏡 2に搭載されている各種装置を制御するパーソ ナルコンピュータ等からなる制御装置 3 (以後、 P Cと記す） とから構成されて いる。
顕微鏡 2は、 ステージ 1 1に載置された標本 1 2を、 透過照明光源 1 3からの 光で透過照明光学系 1 4を介して照明し、 標本 1 2を透過した光をリポルバ 1 5 に搭載された対物レンズ 1 6で集光する。
対物レンズ 1 6で集光された光は、 図 2に示すように、 結像光学系 1 7の結像 レンズ 1 8とミラ一 M lを介して一次像面 1 7 aに結像される。 一次像面 1 7 a に結像された標本 1 2の像は、 リレーレンズ 1 7 b、 ミラ一 M 2、 リレーレンズ 1 7 c、 および接眼鏡筒 1 9のレンズ 1 9 aを介して二次像面 1 8 bに結像され、 不図示の接眼レンズを介して観察者に観察される。 この際、 図 1に示す蛍光キュ —ブホルダ 2 0中の蛍光キューブ 2 1は結像光学系 1 7の光路から外されてい る。 また、 プリズム 2 2は結像光学系 1 7の光路に交換可能に配置されており、 標本 1 2の透過像を観察するときには光路から外されている。 このように、 顕微 鏡装置 1は透過型顕微鏡として使用することができる。
また、 図 2に示すように顕微鏡 2には、 共焦点走査観察系 3 1と落射照明系 4 1とが共通の照明光学系 5 1を介して配置されている。
以下、顕微鏡装置 1を走査型顕微鏡（走査型蛍光顕微鏡、共焦点走査型顕微鏡） として使用する場合について図 2を参照しつつ説明する。
走査型顕微鏡として使用する場合、 共焦点走査観察系 3 1は、 不図示のレーザ 光源からのレーザ光を光ファイバ 3 2で導き、 コレクタレンズ 3 3で光ファイバ 3 2の端面から射出されたレーザ光を光軸にほぼ平行なレーザ光にし、 標本 1 2 上で二次元に走査する二次元スキャナ 3 4に入射する。 二次元スキャナ 3 4から 射出されたレーザ光は、 瞳リレーレンズ 3 5で像面 I P 1に結像される。 像面 I P 1を出射したレーザ光は、 照明光学系 5 1の結像レンズ 5 2で光軸に略平行な レーザ光にされ光路に交換可能に配置された不図示のミラーに入射する。 不図示 のミラーは、 蛍光キューブ 2 1、 6 1と切換え可能に構成されている。 なお、 共 焦点走査観察系 3 1を使用する場合、 後述する落射照明系 4 1で使用する照明光 学系 5 1の光路に揷脱可能に配置されているダイクロイツクミラー 4 4は、 照明 光学系 5 1の光路から外されている。
不図示のミラーに入射したレーザ光は、 対物レンズ 1 6方向に反射され、 対物 レンズ 1 6に入射して標本 1 2に集光される。
一方、 —ザ光で励起され標本 1 2で発現した蛍光は、 対物レンズ 1 6で集光 され、 不図示のミラ一で反射され照明光学系 5 1を逆行し二次元スキャナ 3 4に 入射してデスキャンされ、 ダイクロイツクミラー 3 6で反射されて結像レンズ 3 7とピンホール 3 8を介して P MT等の受光素子 3 9に入射する。 P C 3は受光 素子 3 9で受光された各点の強度を基に二次元画像に生成しモニタ一 3 a等で 表示する。 このように、 顕微鏡装置 1は共焦点走査型顕微鏡として使用すること ができる。
次に、 顕微鏡装置 1を落射蛍光顕微鏡として使用する場合について図 2を参照 しつつ説明する。
図 2において、 落射照明系 4 1の不図示の光源からの光は、 光ファイバ 4 2で 導かれ、 コレクタレンズ 4 3で光ファイバ 4 2の端面から射出された光が、 視野 絞り 4 5位置に集光される。 視野絞り 4 5を射出した光は、 照明光学系 5 1に挿 脱可能に配置されたダイクロイツクミラー 4 4に入射して反射され、 照明光学系 5 1の結像レンズ 5 2で集光され、 光軸に略平行な光として光路中に交換可能に '配置された蛍光キューブ 2 1に入射する。 なお、 不図示の光源は、 レーザ光源、 高圧水銀ランプ、 あるいはキセノンランプ等が使用可能である。 蛍光キューブ 2 1は、 波長選択フィルタ 2 1 a、 ダイクロイツクミラー 2 1 b及びェミッション フィル夕 2 1 cが内蔵されている。
蛍光キューブ 2 1に入射した光は、 波長選択フィルタ 2 1 aとダイクロイツク ミラー 2 1 bで所定の励起波長の光が選択され、 対物レンズ 1 6方向に反射され、 対物レンズ 1 6に入射して標本 1 2に集光される。
この光で励起され標本 1 2で発現した蛍光は、 対物レンズ 1 6で集光され蛍光 キューブ 2 1に入射し、 蛍光キューブ 2 1のェミッションフィルタ 2 1 cで所定 の蛍光が選択透過され、 結像レンズ 1 8と結像光学系 1 7に揷脱可能に配置され たプリズム 2 2を介して撮像素子 2 3に結像され蛍光像が撮像される。 撮像素子 2 3で撮像された画像は、 図 1に示す P C 3で画像処理されモニター 3 aに表示 される。 このようにして、 顕微鏡装置 1は落射蛍光顕微鏡として使用することが できる。 また、 顕微鏡装置 1では、 撮像素子 2 3で撮像された蛍光画像と、 受光 素子 3 9で受光された信号から形成された共焦点画像をモニター 3 aに重ねて 表示させるなどして観察することが可能である。
次に、 顕微鏡装置 1を全反射顕微鏡として使用する場合について図 3を参照し つつ説明する。
全反射顕微鏡として使用する際の照明は、 上述の共焦点走査観察系 3 1のレー ザ光を使用する。 また、 全反射照明を達成するための後述する結像位置変換光学 手段 7 0を結像レンズ 5 2と蛍光キューブ 6 1との間の光路に揷入し全反射顕 微鏡を達成している。
図 3に示すように、 共焦点走査観察系 3 1の不図示のレーザ光源からのレーザ 光は、 光ファイバ 3 2で導かれ、 コレクタレンズ 3 3で光ファイバ 3 2の端面か ら射出されたレーザ光を光軸にほぼ平行なレーザ光にして二次元スキャナ 3 4 に入射される。 また、 対物レンズ 1 6の瞳位置 Pの光軸から離れた全反射条件領 域にレ一ザ光を集光するために二次元スキャナ 3 4の X Y各ミラーの傾斜が図
1に示す P C 3の制御部により制御される。 二次元スキャナ 3 4から射出された 光軸シフト後のレーザ光は、 瞳リレーレンズ 3 5で像面 I P 1に結像され、 照明 光学系 5 1の結像レンズ 5 2を介して結像位置変換光学手段 7 0に入射する。 結 像位置変換光学手段 7 0は、 光軸シフト後のレーザ光の光軸を照明光学系 5 1の 光軸から距離 dずらしたのち、 対物レンズ 1 6の瞳位置 Pに集光する光束に変換 する。 変換されたレーザ光はその後蛍光キューブ 6 1に入射する。
結像位置変換光学手段 7 0は、 楔プリズム 7 2と凸レンズなどの集光レンズ 7
3から構成されている。 そして図 1に示す照明光学系 5 1の光路に挿脱可能に構 成されている。 なお、 楔プリズム 7 2と集光レンズ 7 3は、 光軸 I 1が図 3及び 図 4 Bに示すように、 光軸シフト後レーザ光の光軸 I 1を照明光学系 5 1の光軸 から距離 「d」 だけずらすことを可能にしている。 この距離 「d」 は、 対物レン ズ 1 6を介して被検物体を照明する場合の全反射条件となる瞳面上の位置に対 応している。
このように結像位置変換光学手段 7 0に入射したレーザ光は、 楔プリズム 7 2 で光軸 I 1を照明光学系 5 1の光軸に対して主光線が距離 「d」 だけずらされた レーザ光となり、 集光レンズ 7 3で対物レンズ 1 6の瞳位置 Pの輪帯状の全反射 条件領域に集光される。 この、 全反射条件領域に集光されたレーザ光は、 対物レ ンズ 1 6から標本 1 2と標本 1 2を支持するガラス基板との境界面で全反射さ れる角度で標本 1 2に入射する。
全反射角で標本 1 2を支持する基板との境界面に入射したレーザ光は、 境界面 にエバネッセント波を発生し、 標本 1 2の境界面近傍でこのェパネッセント波に より励起された蛍光が発生する。 なお、 レーザ光の波長は、 不図示のレーザ光源 で選択されているため、 このとき図 2に示す波長選択フィル夕 2 1 aは不要であ る。 .
エバネッセント波で励起され標本 1 2で発現した蛍光は、 対物レンズ 1 6で集 光され蛍光キューブ 6 1に入射し、 蛍光キューブ 6 1のェミッションフィル夕 2 1 cで所定の蛍光が選択透過され、 結像レンズ 1 8と結像光学系 1 7の光軸に揷 脱可能に配置されたプリズム 2 2を介して撮像素子 2 3に結像され、 撮像素子 2 3で蛍光像が撮像される。 撮像素子 2 3で撮像された画像は、 図 1に示す P C 3 で画像処理されモニタ一 3 aに表示される。
このように、 顕微鏡装置 1は、 照明光学系 5 1の光路中に結像位置変換光学手 段 7 0を挿入し、 レーザ光の光軸 I 1を照明光学系 5 1の光軸から距離 「d」 だ け二次元スキャナ 3 4と楔プリズム 7 2を介して略平行に移動させ、 かつ結像レ ンズ 7 3で対物レンズ 1 6の瞳面 Pの所定位置に結像させることによって全反 射蛍光顕微鏡として使用することができる。
図 4 A〜4 C、 図 5 A〜5 Cを参照して、 全反射照明への移行について詳説す る。
図 4 Aは、 走査型顕微鏡あるいは落射蛍光顕微鏡として使用する場合の照明光 の状態を示している。 上記顕微鏡の場合、 結像レンズ 5 2に入射レた破線で示す (+ ) 最大画角光束） 、 実線で示す像中心光束、 及び粗い破線で示す （一） 最大 画角光束のいずれの場合も、 対物レンズ 1 6の瞳位置 Pでは、 集光されていない 略平行光束である。
一方、 図 Bに示す、 全反射顕微鏡としての照明状態では、 レーザ光の光軸 I 1が照明光学系 5 1の光軸から図 4 A~ 4 Cの紙面では上方に距離 「d」 シフト されている。 また、 結像レンズ 5 2から射出するレーザ光は、 レーザ光の光軸 I 1が、 図 4 Cに示すように照明光学系 5 1の光軸に対して角 α傾斜して入射する。 楔プリズム 7 2はこの傾斜角 をほぼゼロにして照明光学系 5 1の光軸とレー ザ光の光軸 I 1とが距離 「d」 だけ離れてほぼ平行になるように変換する。 その 後、 レーザ光は集光レンズ 7 3で対物レンズ 1 6の瞳位置 Pの輪帯状の全反射条 件領域に集光される。 この結果、 全反射照明が可能となる。
図 4 Cに示すように、 傾斜角 aと楔プリズム 7 2の頂角 <5の関係は、 = (n 一 1 ) Χ δで示される。 ここで ηは、 楔プリズム 7 2を構成する媒質の屈折率で ある。
このように、 対物レンズ 1 6の開口数 (ΝΑ) に応じたレーザ光の光軸 I 1の 傾斜角 αに対応する頂角 <5を有する楔プリズム 7 2·と、 焦点距離 f の集光レンズ 7 3を組み合わせた結像位置変換光学手段 7 0を照明光学系 5 1の結像レンズ 5 2と蛍光キューブ 6 1との間に挿入することで容易に全反射照明を達成する ことが可能になる。
また、 実施の形態にかかる顕微鏡 1では、 照明光学系 5 1の光路に揷入される 結像位置変換光学手段 7 0の楔プリズム 7 2と結像レンズ 7 3は、 図 5 A〜 5 C に示すように照明光学系 5 1の光路中で移動可能に構成されている。 なお、 図 5 A〜 5 Cでは、 楔プリズム Ί 2と結像レンズ 7 3とが一体的に、 照明光学系 5 1 の光軸に対して直交する方向、 或いは照明光学系 5 1の光軸に沿った方向に移動 する場合を示しているが、 楔プリズム 7 2と結像レンズ 7 3を個別に移動するよ うに構成することもできる。 例えば、 結像位置変換手段 7 0を照明光学系 5 1の 光軸に対して直交する方向に移動後、 結像レンズ 7 3のみを照明光学系 5 1の光 軸に沿って移動するように構成することも可能である。 このように構成すること で、 レーザ光の光軸を dずらしたのちに対物レンズ 1 6の瞳位置 Pの全反射領域 に集光することが容易になる。
これにより、 対物レンズ 1 6が交換されて、 N Aと瞳位置 Pが変わった場合で も、 照明光学系 5 1内での楔プリズム 7 2と結像レンズ 7 3の位置を調整するこ とで、 対物レンズ 1 6に応じた全反射照明領域にレーザ光を集光することができ る。
図 5 A〜5 Cを参照して、 移動量 「d」 と瞳位置が変化した場合の結像位置変 換光学手段 7 0の作用について説明する。 図 5 Aに示すように、 移動量が 「d + A o;」 、 瞳位置 「P 1」 の対物レンズ 1 6から、 図 5 B、 図 5 Cに示す移動量が 「d」 、 瞳位置が 「P」 の対物レンズ 1 6に交換された場合について説明する。
まず、 レーザ光の光軸 I 1の移動量を + から 「d」 に、 図 1に示す P C 3の制御部を介して二次元スキャナ 3 4の XY各ミラーの傾きを制御する と共に、 結像位置変換光学手段 7 0を照明光学系 5 1の光軸に直交する方向に移 動して、 楔プリズム 7 2から射出する光束の光軸 I 1が照明光学系 5 1の光軸に 略平行になるようにする （図 5 B参照） 。 これで、 光軸 I 1が照明光学系 5 1の 光軸から 「d」 の距離に設定される。
次に、結像位置変換光学部材 7 0を照明光学系 5 1の光軸に沿って移動量「D」 (図 5 B参照） 移動し対物レンズ 1 6の瞳位置 「P」 にレーザ光が集光するよう に結像レンズ 7 3を位置付けする （図 5 C参照） 。 以上の操作で、 対物レンズ 1 6力 S変更された場合の、 移動量 「d j と瞳位置 「P J への集光調整が完了する。 なお、 結像位置変換光学手段 7 0の移動制御、 或いは楔プリズム 7 2、 結像レン ズ 7 3それぞれの移動制御は、 P C 3の制御部を介して、 不図示のそれぞれの駆 動部を駆動するように構成することもできる。
以上述べたように、 実施の形態にかかる顕微鏡装置 1によれば、 共焦点走査観 察系 3 1の二次元スキャナ 3 4を所定の傾きに制御することでレーザ光を照明 光学系 5 1の光軸からシフトさせた後、 結像位置変換光学手段 7 0を照明光学系 5 1の光路中に挿入し、 楔プリズム 7 2、 結像レンズ 7 3の位置を調整すること によつて全反射蛍光観察を可能にすることができる。
また、 対物レンズ 1 6が交換された場合でも、 共焦点走査観察系 3 1の二次元 スキャナ 3 4を所定の傾きに制御してレーザ光を照明光学系 5 1の光軸からシ フトさせた後、 結像位置変換光学手段 7 0の、 楔プリズム 7 2、 結像レンズ 7 3 の位置を調整することによって全反射蛍光観察を可能にすることができる。
また、 共焦点走査型観察、 走査型蛍光観察、 落射蛍光観察、 透過観察等の顕微 鏡としても使用可能な顕微鏡装置 1を提供することができる。
なお、 上述の実施の形態は例に過ぎず、 上述の構成や形状に限定されるもので はなく、 本発明の範囲内において適宜修正、 変更が可能である。

Claims

請 求 の 範 囲 請求項 1
対物レンズと、
レーザ光源からのレーザ光束を前記対物レンズを介して標本に照射する照明 光学系と、
前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記レーザ光束を前記標本へ導く蛍光キューブと、
前記蛍光キューブの前記レーザ光源側に挿脱可能な光学手段とを有し、 前記光学手段は、 前記レ一ザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略 平行にする第 1光学部材と、 前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の光軸か ら離れた所定の位置に集光する第 2光学部材とを有し、
前記第 1光学部材と前記第 2光学部材は、 前記照明光学系内で移動可能である ことを特徴とする顕微鏡装置。 請求項 2
前記第 1光学部材と前記第 2光学部材は、 前記照明光学系の光軸に略直交する 方向に移動可能であることを特徴とする請求項 1に記載の顕微鏡装置。 請求項 3
前記第 1光学部材と前記第 2光学部材は、 前記照明光学系の光軸に沿つて移動 可能であることを特徴とする請求項 1または 2に記載の顕微鏡装置。 請求項 4
前記第 2光学部材のみが前記照明光学系の光軸に沿って移動可能であること を特徴とする請求項 1または 2に記載の顕微鏡装置。 請求項 5
前記第 1光学部材は、 楔プリズムを含むことを特徴とする請求項 1または 2に 記載の顕微鏡装置。 請求項 6
前記第 2光学部材は、 結像レンズを含むことを特徴とする請求項 1または 2に 記載の顕微鏡装置。 請求項 7
前記所定の位置に集光された前記レ一ザ光束は、 前記対物レンズから前記標本 に対する入射角が全反射角以上で射出することを特徴とする請求項 1に記載の 顕微鏡装置。 請求項 8
前記照明光学系は、 落射照明光学系を更に有することを特徴とする請求項 1に 記載の顕微鏡装置。
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