CN116322794A - 用于改善癌症t细胞免疫疗法的dna构建体 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于修饰人T细胞基因组的组合物和方法。
Description
在先相关申请
本申请要求2020年10月2日提交的美国临时申请号63/087,078的权益，将其通过引用其全部内容纳入本文。
背景技术
当前用于修饰针对治疗用途的离体或活体基因编辑细胞的技术集中于纠正现有突变，将治疗适用性限制在由导致基因功能失调的单突变引起的病症，或者整合全新的合成基因，这些技术需要广泛的研究和开发才能创造出新的能够用于治疗的合成DNA序列。因此，基因组修饰的选择有限。考虑到T细胞在过继性细胞疗法中的重要性，获得人T细胞并对其进行修饰以产生具有所需的一种或多种功能的经编辑的T细胞的能力可能有利于过继性T细胞疗法的开发和应用。
发明内容
本公开涉及用于修饰T细胞基因组的组合物和方法。发明人已发现，可以修饰人T细胞以改变T细胞特异性和功能。通过将编码多肽和异源性T细胞受体(TCR)或合成抗原受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的核酸插入T细胞基因组中的特定内源位点(例如，TCR基因座)，可以制备具有所需TCR或CAR抗原特异性和多肽功能的人T细胞。此外，本文所述的组合物和方法可用于产生特异性和功能改变的人T细胞，同时限制与T细胞疗法相关的副作用。
本文提供异源表达一种或多种多肽的人T细胞，其中一种或多种多肽由插入细胞TCR基因座的核酸构建体编码。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，Fas胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人Fas胞外结构域或其部分；(Fas-OX40)。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，TNFRSF12胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人TNFRSF12胞外结构域。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域。
在一些实施方式中，多肽是截短的人LTBR蛋白，其包含人LTBR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸。
在一些实施方式中，多肽是截短的人TNFRSF12蛋白，其包含人TNFRSF12胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人4-1BB胞内结构域(和任选地，LAG3胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LAG-3胞外结构域。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR5胞外结构域。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR4胞外结构域。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，TNFRSF1A胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人TNFRSF1A胞外结构域。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人IL-4RA胞外结构域。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人LAG3胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域的1-20个氨基酸)。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人CD28胞内结构域连接的人CTLA4胞外结构域或其部分(和任选地，CTLA4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人CD200R胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域或其部分)。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人CD28胞内结构域连接的人DR5胞外结构域或其部分(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)。
在一些实施方式中，多肽包括全长IL21R蛋白、LAT1蛋白、BATF蛋白、BATF3蛋白、BATF2蛋白、ID2蛋白、ID3蛋白、IRF8蛋白、MYC蛋白、POU2F1蛋白、TFAP4蛋白、SMAD4蛋白、NFATC1蛋白、EZH2蛋白、EOMES蛋白、SOX5蛋白、IRF2BP2蛋白、SOX3蛋白、PRDM1蛋白、IL2RA或RELB蛋白。
一些实施方式中，T细胞异源表达包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:103和SEQ ID NO:105。
一些实施方式中，T细胞包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的异源性核酸序列：SEQ ID NO:1-32、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:104。
在一些实施方式中，T细胞表达识别靶抗原的抗原特异性T细胞受体(TCR)或合成抗原受体。在一些实施方式中，T细胞是调节T细胞、效应T细胞、记忆T细胞或原初T细胞。在一些实施方式中，效应T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，效应T细胞是CD8+CD4+T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代细胞。
在一些实施方式中，靶插入位点位于TCR-α亚基恒定基因(TRAC)的外显子1中。在一些实施方式中，靶插入位点位于TCR-β亚基恒定基因(TRBC)的外显子1中。
在一些实施方式中，插入人T细胞的异源性核酸以下述顺序编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)第一异源性TCR亚基链，其中TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；(iii)第二自切割肽序列；(iv)如本文所述的异源性多肽；(v)第三自切割肽序列；(vi)第二异源性TCR亚基链的可变区；和(vii)内源性TCR亚基的N末端的部分，其中，如果细胞的内源性TCR亚基是TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中如果细胞的内源性TCR亚基为TCR-β亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。
在一些实施方式中，插入人T细胞的异源性核酸以下述顺序编码，(i)第一自切割肽序列；(ii)如本文所述的异源性多肽；(iii)第二自切割肽序列；(iv)第一异源性TCR亚基链，其中TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；(v)第三自切割肽序列；(vi)第二异源性TCR亚基链的可变区；和(vii)内源性TCR亚基的N末端的部分，其中，如果细胞的内源性TCR亚基为TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中如果细胞的内源性TCR亚基为TCR-β亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。
在一些实施方式中，核酸构建体以下述顺序编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)合成抗原受体；(iii)第二自切割肽序列；(iv)本文所述的异源性多肽；和(v)第三自切割肽序列或多聚A序列。
在一些实施方式中，核酸构建体以下述顺序编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)异源性多肽；(iii)第二自切割肽序列；(iv)合成抗原受体；和(v)第三自切割肽序列或多聚A序列。
在一些实施方式中，核酸构建体包含与选自下组的核酸序列至少95％相同的核酸序列：SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102和SEQID NO:104。
还提供了修饰人T细胞的方法，包括(a)向人T细胞引入(i)切割人T细胞TCR基因座中靶区域以在细胞基因组中产生靶插入位点的靶向核酸酶；和(ii)编码多肽的核酸构建体，多肽选自下组：包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，Fas胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人Fas胞外结构域或其部分的多肽；(Fas-OX40)；包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，TNFRSF12胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人TNFRSF12胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域的多肽；截短的人LTBR蛋白，其包含人LTBR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；截短的人TNFRSF12蛋白，其包含人TNFRSF12胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；截短的人BTLA蛋白，其包含人BTLA胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；包含通过跨膜结构域与人4-1BB胞内结构域(和任选地，LAG3胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LAG-3胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR5胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR4胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，TNFRSF1A胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人TNFRSF1A胞外结构域；包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域；包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人IL-4RA胞外结构域；包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人LAG3胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域的1-20个氨基酸)的多肽；包含通过跨膜结构域与人CD28胞内结构域连接的人CTLA4胞外结构域(和任选地，CTLA4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)的多肽，包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人CD200R胞外结构域(和任选地，CD200R胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)的多肽，包含与编码人ICOS的氨基酸129-199的多肽连接的人CD200R胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人CD28胞内结构域连接的人DR5胞外结构域(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)的多肽；；和包含IL21R蛋白、LAT1蛋白、BATF蛋白、BATF3蛋白、BATF2蛋白、ID2蛋白和ID3蛋白、IRF8蛋白、MYC蛋白、POU2F1蛋白、TFAP4蛋白、SMAD4蛋白、NFATC1蛋白、EXH2蛋白、EOMES蛋白、SOX5蛋白、IRF2BP2蛋白、SOX3蛋白、PRDM1蛋白、IL2RA或RELB蛋白的多肽；和(b)允许重组发生，从而将核酸构建体插入靶插入位点以产生修饰的人T细胞。
在一些方法中，多肽包含与选自下组的蛋白质至少95％相同的氨基酸序列：SEQID NO:33-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105。
在一些方法中，靶插入位点位于TCR-α(TCR-阿尔法)亚基恒定基因(TRAC)的外显子1中或TCR-β亚基恒定基因(TRBC)的外显子1中。
在一些方法中，通过将包含核酸构建体的病毒载体引入细胞中来插入核酸构建体。在一些实施方式中，靶向核酸酶选自RNA向导的核酸酶结构域，转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，锌指核酸酶(ZFN)和megaTAL。
在一些方法中，将靶向核酸酶、向导RNA和DNA模板作为核糖核蛋白复合物(RNP)-DNA模板复合物引入细胞中，其中RNP-DNA模板复合物包含：(i)RNP，其中RNP包含靶向核酸酶和向导RNA；和(ii)核酸构建体。
在一些方法中，T细胞表达识别靶抗原的抗原特异性T细胞受体(TCR)或合成抗原受体。在一些实施方式中，T细胞是调节T细胞、效应T细胞、记忆T细胞或原初T细胞。在一些实施方式中，效应T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，效应T细胞是CD8+CD4+T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代细胞。
还提供了通过本文所述的任何方法产生的经修饰的T细胞。
还提供了增强人对象免疫应答的方法，所述方法包括给予本文所述的任何T细胞。在一些实施方式中，T细胞表达识别对象中靶抗原的抗原特异性TCR。在一些实施方式中，人对象患有癌症并且靶抗原是癌症特异性抗原。在一些实施方式中，人对象患有自身免疫性疾病或过敏性疾病，并且抗原是与自身免疫性疾病或过敏性疾病相关的抗原。在一些实施方式中，对象患有感染并且靶抗原是与感染相关的抗原。在一些实施方式中，T细胞是自体同源的。在一些实施方式中，T细胞是同种异体的。在一些实施方式中，干细胞是诱导型多潜能干细胞(iPSC)衍生的T细胞。
附图简要说明
本申请包括下述附图。这些附图用于说明组合物和方法的某些实施方式和/或特征，并对组合物和方法的描述构成补充。附图并不旨在限制组合物和方法的范围，除非书面说明明确地表明是这类情况。
图1是合并敲入平台以及后续功能单刺激筛选(functional single stimulationscreen)的示意图。开关受体和包括NY-ESO-1特异性TCR的转录因子文库通过核糖核蛋白(RNP)电穿孔以非病毒性整合到原代人T细胞的TRAC位点中。将经编辑的T细胞库(pool)用于各种单刺激条件，输入与输出T细胞群的构建体丰度通过扩增子测序比较。
图2A-I显示了合并敲入文库的下一代测序(NGS)流程和质量控制指标。(A)每个构建体(“5'BC”和“3'BC”)的独特条码在侧接感兴趣基因(“基因X”)的接头序列中的简并碱基中编码。5'和3'BC能够通过不同的扩增策略对基因组DNA(gDNA)或cDNA进行测序。将DNA错配引入HDR模板的一个同源臂，只允许在gDNA测序策略中使用与内源同源臂序列结合的引物扩增中靶敲入。转录提取的RNA并使用对插入区具有特异性的引物对3'条码进行测序。(B)在敲入后7天获得指定分选群体中具有GFP或RFP条码的扩增子测序读数的百分比。双重敲入文库在指定阶段合并，(3')条码由cDNA测序。将针对合并敲入版本2(PoKI v2)的改进构建体设计与之前的合并敲入策略(PoKI v1，Roth等2020)进行比较。在组装状态下合并时，经分选的群体中正确分配条码的读取百分比相较于PoKI v1显著提高。针对n＝2成员试验文库(左下组图)和n>200成员文库(右下组图)计算了模板转换量，并再次与先前版本的合并KI平台(Roth等)进行比较。线条代表平均值。N＝2个个体供体。(C)计算了6个人供体中合并敲入文库的总读数百分比。将转录因子(TF)和开关受体(SR)文库作为一个大型文库敲入，并在计算上分成单独的文库用于分析。所有构建体条码始终如一地很好地代表了文库分布均匀(TF和SF Gini系数分别为0.23和0.20)。(D)在质粒库、HDR模板库和6个人供体的敲入读数中观察到构建体大小与文库表示之间存在弱负相关(分别为R2＝0.26、0.21和0.25)。即使是最大的文库成员(4.5kb插入)也有被很好地表示。HDR模板文库图中省略了四个高于1.5％的构建体，以保持坐标轴的一致性。(E)分析了技术和生物学重复间合并敲入的再现性。mRNA的3'BC测序在技术和生物学重复间具有高度可再现性(分别为R2＝0.99和0.96)。通过5'gDNA测序策略进行的生物学重复获得了相似的强相关性(R2＝0.99)。(F)分析了gDNA和mRNA BC测序策略之间的相关性。来自同一合并敲入实验供体的3'BC测序mRNA和5'BC测序gDNA具有良好的相关性(R2＝0.78)。(G)分析了覆盖范围内生物学重复之间的相关性。mRNA和gDNA测序策略均在降低测序覆盖率的情况下进行评估。还从刺激前(输入(Input))和刺激后(刺激(Stim))的细胞群中获得了相关性。如图2E中所述获得值。即使在低覆盖率(50X)下，供体在所有策略和实验条件下都高度相关。(H)对于具有UMI的敲入条码进行选择性DNA测序。转录后，来自单个细胞的TCR+基因X mRNA转录本使用基因特异性引物和通用分子标识符(UMI)进行逆转录。逆转录后，紧邻3'BC上游的引物结合产生包含3'条码和UMI的扩增子。对该扩增子的下一代测序能够关联UMI和BC计数。(I)3'BC+UMI扩增子的下一代测序揭示了UMI和BC计数之间的高度相关性(R2＝1.00)。
图3A-B显示了单刺激丰度筛选后最高阳性和阴性命中的识别。(A)编辑原代人T细胞以表达开关受体(左组图)或转录因子(右组图)文库加上NY-ESO TCR。在不同的刺激条件之前和之后进行扩增子测序，以确定输出与输入群体中构建体丰度的log2倍数变化。热图识别不同单刺激条件下的最高阴性(蓝色，耗竭)以及最高阳性(红色，富集)命中。N＝6个个体供体。(B)如图3A中所述编辑原代人T细胞，并在过度CD3/CD28刺激(珠:细胞比5：1)之前和之后评估T细胞构建体的丰度。对6个个体供体进行的下一代测序将BATF(log2倍数变化1.05，q值0.000009)、BATF3(1.05，0.000017)、MYC(0.99，0.000012)、ID2(0.72，0.00008)和ID3(0.89，0.000001)识别为该刺激条件下的最高阳性命中。显示了相对输入群体的平均log2倍数变化。使用Benjamini-Krieger-Yekutieli方法计算错误发现率。N＝6个个体供体。
图4A-E提供了多重刺激筛选的特征以识别耗竭抗性T细胞构建体。(A)显示了多刺激筛选的示意图。如图1A左组图所示编辑T细胞，然后每两天用A375细胞刺激，总共进行五次刺激。在每个时间点进行扩增子测序和蛋白质表达分析(流式细胞术)以评估T细胞构建体的丰度和耗竭标志物的表达。(B)对对照T细胞(NY-ESO TCR+NGFRt)进行图4A中所述的多重刺激筛选。敲入百分比(NGFR+)在测定过程中通过流式细胞术确定并与未刺激的T细胞比较。使用富含敲入阳性细胞的靶细胞进行多次刺激(刺激前为13.8％，相对于五次刺激后为83.7％)证明该测定能够对合并的敲入细胞群施加选择性压力。N＝4个个体供体，显示了平均值+SEM。(C)整个测定过程中分化的T细胞通过多重刺激测定(流式细胞术)前后的CD45RA和CD62L表面表达测量。大多数经编辑的T细胞(54.5％)在用靶细胞进行五次刺激后显示出效应记忆表型(CD45RA-/CD62L)。N＝4个个体供体，显示了平均值。(D)T细胞的胞内TOX表达通过流式细胞术分析并在整个测定过程中增加，暗示T细胞中的耗竭诱导(exhaustioninduction)。N＝4个个体供体，显示了平均值+SEM。(E)在测定过程中通过流式细胞术分析表面耗竭分子LAG-3、PD-1、TIM-3和CD39的表达。虽然PD-1表达在多重刺激测定期间更早达到峰值，但是其他耗竭标志物在五次刺激后仍保持高表达。
图5A-C显示了多重刺激丰度筛选后最高阳性和阴性命中的识别。(A-B)编辑原代人T细胞以表达NY-ESO TCR和开关受体(A)和转录因子(B)文库。如图4A中所述，对构建体进行多重刺激筛选。显示了在多重刺激测定的各时间点，相较于输入群体，构建体丰度的平均log2倍数变化。热图识别不同单刺激条件下的最高阴性(蓝色，耗竭)以及最高阳性(红色，富集)命中。N＝4个个体供体。(C)随着时间评估了最高阳性和最高阴性命中以及对照GFP和RFP的丰度，并显示了BATF和BATF3的丰度增加，而最高阴性命中、Eomes和NFATC1的丰度减少。N＝4个个体供体，显示了平均值+SEM。
图6A-D显示了了四种示例性构建体的阵列丰度测定。针对对照敲入构建体(NY-ESO特异性TCR+NGFR)和各个示例性敲入(NY-ESO特异性TCR联合(A)IRF8、(B)BATF、(C)JUN或(D)Eomes)，设置了50/50共培养。在多重刺激测定过程中检测到丰度的变化并标准化至输入丰度。如在合并敲入筛选中预测的那样，IRF8和BAT的丰度随着时间推移增加，而JUN保持稳定且Eomes减少。
图7A-D证实了多重刺激筛选中识别的最高命中之一(IRF8)改善了靶细胞的体外杀伤。A375靶细胞与T细胞共培养，所述T细胞经工程改造以表达与不同E/T比例的对照构建体(NGFR)或感兴趣的构建体(IRF8)联合的NY-ESO特异性TCR。不含T细胞的A375细胞作为对照。(A)和(B)显示了未经预刺激的测定，(C)和(D)显示了T细胞接受多重刺激测定后的测定。
图8A-B显示了相较于对照细胞，NY-ESO/IRF8细胞的细胞因子释放增加。NY-ESO/IRF8和NY-ESO/NGFR对照T细胞经一次刺激
(CD3/CD28/CD2)(A)或在它们通过多重刺激测定后再刺激(CD3/CD28/CD2)(B)。通过流式细胞术分析效应细胞因子IFN-g、IL-2和TNF-a的胞内表达。
图9显示了在多重刺激测定结束时NY-ESO/IRF8相较于NY-ESO/NGFR对照T细胞的上清液中效应细胞因子的水平。使用基于流的测定分析细胞因子浓度并证实NY-ESO/IRF8T细胞中效应细胞因子释放增加。
图10A-B描述了经过多重刺激测定然后经再刺激(CD3/CD28/CD2)后，NY-ESO/IRF8相较于NY-ESO/NGFR对照细胞上活化标志物(A)和耗竭标志物(B)的表达。表达水平通过流式细胞术分析，显示出NY-ESO/IRF8细胞上活化标志物CD69水平较高且耗竭标志物TIM-3水平较低。
图11A-E显示了人T细胞敲入实验的结果。(A)将强直信号转导(tonic signaling)GD2CAR和TFAP4或对照(NGFR)单敲入到原代人T细胞中。TFAP4和NGFR GD2CAR T细胞以50/50的比例共培养，并随时间评估丰度水平。(B)将TFAP4或对照T细胞与表达GD2的靶细胞共培养。使用Incucyte(E:T比例为1:4)分析GFP阳性靶细胞的数量。TFAP4过表达增加了GD2CART细胞的杀伤能力。(C)在(B)中描述的测定中分析了膜联蛋白+细胞的数量，并显示了不同E:T比例间TFAP4条件中膜联蛋白+细胞水平增加。(D)NSG小鼠经0.5M表达GD2的Nalm-6细胞IV攻击，并在三天后用2M具有或没有TFAP4过表达的抗GD2CAR T细胞处理。通过荧光素酶试验测量，在两个个体供体(每组每个供体n＝5只小鼠)中，具有TFAP4敲入的抗GD2CAR T细胞改善白血病控制。(E)通过流式细胞术测量的TFAP4过表达增加T细胞上的CD25水平。
图12A-B显示了合并敲入平台和后续功能单刺激筛选的示意图。开关受体和包括NY-ESO-1特异性TCR的转录因子文库通过核糖核蛋白(RNP)电穿孔以非病毒方式整合到原代人T细胞的TRAC基因座中。将经编辑的T细胞库用于各种单刺激条件并通过扩增子测序比较输入与输出T细胞群的构建体丰度。
图13A-B提供了在TCR/CAR设置(NY-ESO TCR相较CD19CAR相较强直信号转导GD2CAR)中无靶细胞刺激、单靶细胞刺激或多次靶细胞刺激的不同筛选的概览。当比较电穿孔后第16天和第4天的丰度水平时，将TFAP4识别为强直信号转导GD2CAR测定中的最高命中。显示了Log2倍数变化。
定义
本说明书和所附权利要求书中，单数形式“一”和“所述”包括复数含意，除非另有明确说明。
术语“核酸”或“核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参比核酸相似的结合特性，并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则具体核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，直系同源物，SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代形式(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“基因”可以表示参与产生或编码多肽链的DNA区段。它可以包括编码区之前和之后的区域(前导区和尾区)以及个体编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。或者，术语“基因”可以表示涉及产生或编码非翻译的RNA，如rRNA、tRNA、向导RNA(例如，单向导RNA)或微小RNA的DNA区段。
如本文所用，关于细胞中的核酸(例如基因)或蛋白质的术语“内源(性)”是在自然界中发现的特定细胞中出现的核酸或蛋白质，例如，在其天然基因组位置或基因座。此外，“内源性表达”核酸或蛋白质的细胞表示在自然界中发现的核酸或蛋白质。
本文所用短语“异源(性)”指通常不天然存在的物质。术语“异源(性)核苷酸序列”指通常不天然存在于给定细胞的核苷酸序列。因此，异源性核苷酸序列可以是：(a)对其宿主细胞而言是外来的(即，对所述细胞而言为外源性的)；(b)天然存在于宿主细胞中(即，内源性的)，但以非量存在于细胞中(即，比宿主细胞中天然存在的量大或少)；或(c)天然存在于宿主细胞中但位于其天然基因座外。
“启动子”定义为指导核酸转录的一种或多种核酸控制序列。如本文所用，启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如聚合酶II型启动子的TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻抑物元件，其可位于距转录起始位点多达几千个碱基对处。
当将核酸置于与另一核酸序列的功能性关系中时，其是“操作性连接”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，那么启动子或增强子操作性地连接编码序列；或者如果将核糖体结合位点定位以便于翻译，那么核糖体结合位点操作性地连接编码序列。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。本文中，这些术语涵盖任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
如本文所用，术语“互补”或“互补性”指核苷酸之间或核酸之间特定的碱基配对。互补核苷酸通常是A和T(或A和U)以及G和C。本文所述的向导RNA可以包含序列，例如，与基因组序列完美互补或基本互补(例如，具有1-4个错配)的DNA靶向序列。
“CRISPR/Cas”系统是指用于防御外来核酸的一类广泛的细菌系统。CRISPR/Cas系统存在于广泛的真细菌和古细菌生物体中。CRISPR/Cas系统包括I、II和III亚型。野生型II型CRISPR/Cas系统利用RNA介导的核酸酶(例如Cas9，)与向导和活化RNA形成复合物，识别和裂解外来核酸。本领域也已知具有向导RNA和活化RNA活性的向导RNA。在一些情况中，这类双活性向导RNA称之为单向导RNA(sgRNA)。
Cas9同源物存在于多种真细菌，包括但不限于，下述分类学组的细菌：放线菌(Actinobacteria)、产水菌(Aquificae)、拟杆菌-绿菌(Bacteroidetes-Chlorobi)、衣原体-疣微菌(Chlamydiae-Verrucomicrobia)、绿屈挠菌(Chlroflexi)、蓝藻细菌(Cyanobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)、变形菌(Proteobacteria)、螺旋体(Spirochaetes)、和热孢菌(Thermotogae)。示例性的Cas9蛋白是酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白。其他Cas9蛋白和其同源物述于，例如，Chylinksi,等,RNA Biol.2013年5月1日；10(5):726–737；Nat.Rev.Microbiol.2011年6月；9(6):467-477；Hou,等,Proc Natl Acad Sci U S A.2013年9月24日；110(39):15644-9；Sampson等,Nature.2013年5月9日；497(7448):254-7；和Jinek,等,Science.2012年8月17日；337(6096):816-21。本文所提供的任何Cas9核酸酶的变体可以经优化以在宿主细胞中提供高效活性或增强稳定性。因此，还考虑了工程改造的Cas9核酸酶。参见例如，“Slaymaker等,“特异性改善的合理工程改造的Cas9核酸酶(Rationally engineered Cas9nucleaseswith improved specificity)”Science 351(6268):84-88(2016))。
本文所用术语“Cas9”指RNA介导的核酸酶(例如，来自细菌或古细菌来源，或由其衍生)。示例性的RNA介导的核酸酶包括前述的Cas9蛋白及其同源物。其他RNA介导的核酸酶包括Cpf1(参见，例如Zetsche等，Cell，第163卷，第3期，p759-771，2015年10月22日)及其同源物。如本文所用，术语“核糖核蛋白”复合物等术语指靶向核酸酶(例如Cas9)，和crRNA(例如，向导RNA或单向导RNA)之间的复合物，Cas9蛋白和反式活化crRNA(tracrRNA)之间的复合物，Cas9蛋白和向导RNA之间的复合物，或其组合(例如，包含Cas9蛋白、tracrRNA或crRNA向导RNA的复合物)。应当理解的是，在本文所述的任何实施方式中，Cas9核酸酶可以用Cpf1核酸酶或其他向导核酸酶替代。
本文所用短语“修饰”在修饰细胞的基因组的上下文中指在靶基因组区域处诱导基因组序列的结构改变。例如，修饰可以采取将核苷酸序列插入细胞基因组的形式。例如，编码多肽的核苷酸序列可以插入T细胞TCR基因座的基因组序列。如全文所用，“TCR基因座”是基因组中编码TCRα亚基、TCRβ亚基、TCRγ亚基或TCRδ亚基的基因所在的位置。
这类修饰可以例如通过诱导靶基因组区域内的双链断裂，或位于相对链且侧接靶基因组区域的单链切口对进行。在靶基因组区域处或其中诱导单链或双链断裂的方法包括使用Cas9核酸酶结构域或其衍生物和针对靶基因组区域的向导RNA或向导RNA对。
如本文所用，在引入核酸或包含核酸的复合物，例如RNP-DNA模板复合物的上下文中，短语“引入”是指核酸序列或RNP-DNA模板复合物从细胞外部到细胞内部的易位。在一些情况中，引入指核酸或复合物从细胞外到细胞核内的易位。考虑了这类易位的各种方法，包括但不限于，电穿孔，与纳米线或纳米管接触，受体介导的内化，经由细胞穿透肽的易位，脂质体介导的易位等。
如本文所用，术语“选择性标志物”指允许选择包含标志物的宿主细胞例如T细胞的基因。选择性标志物包括但不限于：荧光标志物，发光标志物和药物选择性标志物、细胞表面受体等。在一些实施方式中，选择可以是阳性选择；也就是，由群体分离表达标志物的细胞，例如，以产生表达该选择性标志物的富集的细胞群。可以通过适用于所用选择性标志物的任何常规分离技术进行分离。例如，如果使用荧光标志物，那么可以通过荧光激活细胞分选来分离细胞，然而如果已经插入了细胞表面标志物，那么可以通过亲和分离技术，例如，磁性分离，亲和色谱，使用与固体基质连接的亲和试剂“淘选(panning)”，荧光激活细胞分选或其他常规技术将细胞从异质性群体分离细胞。
如本文所用，“细胞”可以是人T细胞或能够分化成T细胞的细胞，例如，表达TCR受体分子的T细胞。这些包括造血干细胞和源自造血干细胞的细胞。
本文所用短语“造血干细胞”指可以产生血细胞的干细胞类型。造血干细胞可以产生髓系或淋巴谱系细胞或其组合。造血干细胞主要存在于骨髓中，虽然它们可以分离自外周血或其部分。各种细胞表面标志物可以用于鉴定/识别、分选或纯化造血干细胞。在一些情况中，将造血干细胞鉴定/识别为c-kit+和lin-。在一些情况中，将人造血干细胞鉴定/识别为CD34+，CD59+，Thy1/CD90+，CD38低/-，C-kit/CD117+，lin-。在一些情况中，将人造血干细胞鉴定/识别为CD34-，CD59+，Thy1/CD90+，CD38低/-，C-kit/CD117+，lin-。在一些情况中，将人造血干细胞鉴定/识别为CD133+，CD59+，Thy1/CD90+，CD38低/-，C-kit/CD117+，lin-。在一些情况中，将小鼠造血干细胞鉴定/识别为CD34低/-，SCA-1+，Thy1+/低，CD38+，C-kit+，lin-。在一些情况中，造血干细胞是CD150+CD48-CD244-。
本文所用短语“造血细胞”指源自造血干细胞的细胞。造血细胞可以通过从生物体、系统、器官或组织(例如血液或其部分)分离而获得或提供。或者，可以分离造血干细胞，并且通过分化干细胞获得或提供造血细胞。造血细胞包括分化成其他细胞类型潜能有限的细胞。这类造血细胞包括但不限于，多能祖细胞、谱系限制性祖细胞、常规髓系祖细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞或巨核细胞-红细胞祖细胞。造血细胞包括淋巴和髓系谱系的细胞，例如淋巴细胞、红细胞、粒细胞、单核细胞和血小板。在一些实施方式中，造血细胞是免疫细胞，例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。在一些实施方式中，细胞是先天免疫细胞。
本文所用短语“T细胞”指表达T细胞受体分子的淋巴细胞。T细胞包括人αβT细胞和人γδT细胞。T细胞包括但不限于，原初T细胞，刺激性T细胞，原代T细胞(例如，未经培养的T细胞)，经培养的T细胞，永生T细胞，辅助T细胞，细胞毒性T细胞，记忆T细胞，调节T细胞，自然杀伤T细胞，其组合或其亚群。T细胞可以是CD4+，CD8+或CD4+和CD8+。T细胞也可以是CD4-，CD8-或CD4-和CD8-.。T细胞可以是辅助细胞，例如，TH1、TH2、TH3、TH9、TH17或TFH型辅助细胞。T细胞可以是细胞毒性T细胞。调节T细胞可以是FOXP3+或FOXP3-。T细胞可以是α/βT细胞或γ/δT细胞。在一些情况中，T细胞是CD4+CD25高CD127低调节T细胞。在一些情况中，T细胞是选自下组的调节T细胞：1型调节(Tr1)、TH3、CD8+CD28-、Treg17和Qa-1限制性T细胞或其组合或其亚群。在一些情况中，T细胞是FOXP3+T细胞。在一些情况中，T细胞是CD4+CD25低CD127高效应T细胞。在一些情况中，T细胞是CD4+CD25低CD127高CD45RA高CD45RO-原初T细胞。T细胞可以是经遗传操纵的重组T细胞。
本文所用短语“原代”在原代细胞的上下文中指尚未经转化或永生化的细胞。可以培养、继代培养或传代有限次数(例如，培养0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次)这类原代细胞。在一些情况中，原代细胞可以适应体外培养条件。在一些情况中，原代细胞分离自生物体、系统、器官或组织，任选地，经分选，并在不存在培养或继代培养的情况下直接使用。在一些情况中，可以刺激、激活或分化原代细胞。例如，通过与CD3、CD28激动剂、IL-2、IFN-γ或其组合接触(例如，在其存在的情况下培养)可以激活原代T细胞。
“治疗”指对疾病、病症或紊乱的治疗或缓解或预防的各种成功表现，包括各种客观或主观参数，例如症状的减轻、消退、消除或使病症对患者而言更可耐受，减慢退行或衰退的速度，或使退行终点不那么衰弱。
本文所用术语“同源定向修复”或HDR指这样的细胞过程，其中DNA链的切割或切口端通过同源模板核酸的聚合反应修复。因此，原始序列被模板的序列替代。在一些情况中，可以引入外源性模板核酸，例如DNA模板，以在靶点获得特定的HDR诱导的序列改变。以此方式，可以在切割位点引入特定突变，例如，由靶向核酸酶产生的切割位点。细胞可以将单链DNA模板或双链DNA模板用作模板，用于编辑或修饰细胞的基因组，例如通过HDR。通常，单链DNA模板或双链DNA模板具有与靶位点同源的至少一个区域。在一些情况中，单链DNA模板或双链DNA模板具有两个同源区域，例如5'端和3'端，其侧接包含待插入靶切割或插入位点的DNA模板的区域。
术语“基本相同性”或“基本相同的”在多核苷酸或多肽序列的上下文中指与参比序列具有至少60％序列同一性的序列。另外，相同性百分比可以是60到100％之间的任何整数。示例性实施方式包括相较于使用本文所述程序的参比序列，优选使用如下所述的标准参数的BLAST的参比序列，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。本领域技术人员将意识到的是考虑密码子简并性，氨基酸相似性，阅读框定位等，可以适当地调节这些值以确定由两条核苷酸序列编码的蛋白质的相应相同性。
对于序列比较，一般将一条序列作为参比序列，测试序列则与之比较。当使用序列比较算法时，将测试和参比序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或者可指定替代性的参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列同一性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括对于选自20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150个的多个连续位置中的任何一个的区段的参考，其中，在两个序列最佳比对后，可以将序列与连续位置的相同数目的参比序列进行比较。比对序列用于比较的方法是本领域熟知的。可进行最优序列比对以作比较，通过Smith和Waterman Add.APL.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)的相似性搜索法，通过计算机执行这些算法(例如BLAST)，或通过手工比对和目测。
适合测定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法分别是BLAST和BLAST2.0算法，描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1977)NucleicAcids Res.25:3389-3402。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(NCBI)网站公开获得。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中(word hit)用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。然后，沿各序列在两个方向上延伸该字命中，直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言，采用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比其最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定该比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下：字长(W)28，期望值(E)10，M＝1，N＝-2，以及比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长(W)为3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
BLAST算法也对两条序列间的相似性进行统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小概率和(P(N))，它表明两条核苷酸或氨基酸序列之间偶尔发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参比核酸比较时的最小概率和小于约0.01，更优选小于约10-5，最优选小于约10-20，那么认为该核酸与参比序列相似。
具体实施方式
以下描述列举了本发明组合物和方法的各个方面和实施方式。任一特定实施方式都不意在限定组合物和方法的范围。相反，实施方式仅提供了至少包括在所公开的组合物和方法范围内的各种组合物和方法的非限制性示例。应当从本领域普通技术人员的角度阅读该描述；因此，并不一定包括技术人员众所周知的信息。
本公开涉及用于修饰T细胞基因组的组合物和方法。发明人已发现，可以修饰人T细胞以改变T细胞特异性和功能。
组合物
本文提供异源表达一种或多种多肽的人T细胞，其中一种或多种多肽由插入细胞TCR基因座的核酸构建体编码。本文所述的任何多肽都可以在人T细胞中异源表达。在一些示例中，两种或多种、三种或多种、四种或多种或五种或多种本文所述的多肽在人T细胞中异源表达。在一些示例中，一种或多种多肽由一种或多种核酸构建体编码。
示例性的多肽包括但不限于如SEQ ID No:33-64所示的氨基酸序列。包含与如SEQID No:33-64所示的任一氨基酸序列至少80％、85％、90％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽也可以在人T细胞中表达。可以异源表达的其他多肽包括包含如SEQ ID No：65-97所示的氨基酸序列的多肽。包含与如SEQ ID No:65-97所示的任一氨基酸序列至少80％、85％、90％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽也可以在人T细胞中异源表达。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，Fas胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人Fas胞外结构域或其部分。在一些实施方式中，跨膜结构域是人Fas跨膜结构域或人OX40跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:33或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，TNFRSF12胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人TNFRSF12胞外结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是TNFRSF12跨膜结构域或人OX40跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:34或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是LTBR跨膜结构域或人OX40跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQID NO:35或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽是截短的人LTBR蛋白，其包含人LTBR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:36或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽是截短的人TNFRSF12蛋白，其包含人TNFRSF12胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:37或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人4-1BB胞内结构域(和任选地，LAG3胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LAG-3胞外结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是LAG-3跨膜结构域或4-1BB跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQID NO:40或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR5胞外结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是人IL-4R跨膜结构域或人DR5跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQID NO:41或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR4胞外结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是人IL-4R跨膜结构域或人DR4跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQID NO:42或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，TNFRSF1A胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人TNFRSF1A胞外结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是人TNFRSF1A或人IL-4R跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:43或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是人LTBR或人IL-4R跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:44或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人IL-4RA胞外结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是人ICOS或人IL-4R跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:45或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人LAG3胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域的1-20个氨基酸)。在一些实施方式中，跨膜结构域是人ICOS或人LAG3跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:46或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人CD28胞内结构域连接的人CTLA4胞外结构域或其部分(和任选地，CTLA4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)。在一些实施方式中，跨膜结构域是人CTLA4或人CD28跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:99或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人CD28胞内结构域连接的人DR5胞外结构域或其部分(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)。在一些实施方式中，跨膜结构域是人DR5或人CD28跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQ IDNO:103或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人CD200R胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域或其部分)。在一些实施方式中，跨膜结构域是人CD200R或人ICOS跨膜结构域。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:101或由其组成。在一些实施方式中，相关结构域包含与表1中所示序列至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多肽包含全长IL21R蛋白、LAT1蛋白、BATF蛋白、BATF3蛋白、BATF2蛋白、ID2蛋白、ID3蛋白、IRF8蛋白、MYC蛋白、POU2F1蛋白、TFAP4蛋白、SMAD4蛋白、NFATC1蛋白、EZH2蛋白、EOMES蛋白、SOX5蛋白、IRF2BP2蛋白、SOX3蛋白、PRDM1蛋白或RELB蛋白，
表1
本文所述核酸序列(例如SEQ ID No:1-32)和编码本文所述任何多肽的核酸序列可以插入T细胞TCR基因座。在一些实施方式中，将编码SEQ ID No:33-97或106-114中任一个的核酸序列插入T细胞TCR基因座。在一些实施方式中，将与SEQ ID No:1-32中所示任一核酸序列，SEQ ID NO:98、100、102或104中所示任一核酸序列，或编码SEQ ID No:33-97或106-114中任一项的核酸序列至少80％、85％、90％、99％或100％相同的核酸序列插入T细胞TCR基因座。
可以要求保护本文所述的任何多肽序列、核酸序列、包含多肽或核酸序列的T细胞或使用本文所述T细胞、多肽或核酸序列的方法。
将异源性编码序列插入TCR基因座意味着异源性蛋白的表达将由内源性TCR启动子控制，并且在一些实施方式中，将表达为具有TCR多肽的较大融合蛋白的部分，随后经切割以形成单独的TCR和异源性多肽。TCR多肽可以是内源性的，也可以将其添加到TCR基因座，以提供对T细胞的新型TCR亲和力(例如，但不限于对癌症抗原)。在一些实施方式中，将核酸构建体插入TCR-α亚基恒定基因(TRAC)的外显子1中的靶插入位点。在一些实施方式中，将核酸构建体插入TCR-β亚基恒定基因(TRBC)的外显子1中的靶插入位点，例如TRBC1基因外显子1或TRBC2基因外显子1中。在将核酸构建体插入细胞的TCR基因座后，该构建体受控于内源性TCR启动子，例如TRAC1启动子或TRBC启动子。如下所述，本文提供的核酸构建体编码与多肽共表达的TCR或合成抗原受体。一旦构建体通过HDR掺入T细胞的基因组并受控于内源性启动子，那么T细胞可以在允许插入的构建体转录成编码融合多肽的单个mRNA序列的条件下培养，所述融合多肽后续经加工成为单独的异源性多肽(例如，通过切割连接多肽的肽序列)。插入本文所述编码异源性T细胞受体和异源性多肽组分的任何核酸构建体将产生具有异源性TCR受体特异性和异源性多肽功能的T细胞。在一些实施方式中，T细胞表达识别靶抗原的抗原特异性TCR。在一些实施方式中，T细胞以HLA非依赖性方式表达结合抗原的抗原特异性TCR，即独立于肿瘤细胞HLA概况(profile)而识别表面表位的TCR(参见，例如，国际专利申请公开号WO2019157454)。类似地，插入本文所述编码合成抗原受体和异源性多肽的任何核酸构建体将产生具有异源性TCR受体特异性和异源性多肽功能的T细胞。在一些实施方式中，T细胞表达识别靶抗原的合成抗原受体。在一些实施方式中，合成抗原受体是CAR。在一些实施方式中，合成抗原受体是SynNotch受体。在一些实施方式中，合成抗原受体是合成膜内蛋白水解受体(SNIPR)。参见例如，Zhu等,“用于治疗细胞中定制基因调控的合成膜内蛋白水解受体的设计和模块化组装(Design and modular assembly ofsynthetic intramembrane proteolysis receptors for custom gene regulation intherapeutic cells),”bioRxiv 2021.05.21.445218；doi:https://doi.org/10.1101/2021.05.21.445218。
在一些实施方式中，插入人T细胞的异源性核酸以下述顺序编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)第一异源性TCR亚基链，其中TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；(iii)第二自切割肽序列；(iv)如本文所述的异源性多肽；(v)第三自切割肽序列；(vi)第二异源性TCR亚基链的可变区；和(vii)内源性TCR亚基的N末端的部分，其中，如果细胞的内源性TCR亚基为TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中如果细胞的内源性TCR亚基是TCR-β亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。
在一些实施方式中，插入人T细胞的异源性核酸以下述顺序编码，(i)第一自切割肽序列；(ii)如本文所述的异源性多肽；(iii)第二自切割肽序列；(iv)第一异源性TCR亚基链，其中TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；(v)第三自切割肽序列；(vi)第二异源性TCR亚基链的可变区；和(vii)内源性TCR亚基的N末端的部分，其中，如果细胞的内源性TCR亚基是TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中如果细胞的内源性TCR亚基是TCR-β亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。
在本文所述的组合物和方法中，如果内源性TCR亚基是TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链。在一些方法中，如果内源性TCR亚基是TCR-β亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。
如通篇所用，术语“内源性TCR亚基”是由引入核酸构建体的细胞内源性表达的TCR亚基，例如TCR-α或TCR-β。如上所述，本文所述的核酸构建体编码多个氨基酸序列，这些氨基酸序列以多顺反子序列表达，所述多顺反子序列经加工(即自切割)以产生两个或多个氨基酸序列，例如TCR-α亚基，TCR-β亚基和由构建体编码的多肽，或合成抗原受体(例如CAR(参见，例如Guedan等“嵌合抗原受体的工程改造和设计(Engineering and Design ofChimeric Antigen Receptors),”Mol.Ther.Methods&Clinical Development 12:145-156(2019))或SynNotch受体(参见例如Cho等“工程改造Axl特异性CAR和SynNotch受体用于癌症治疗(Engineering Axl specific CAR and SynNotch receptor for cancertherapy),”Nature Scientific Reports 8,文章编号:3846(2018))和构建体编码的多肽。
在一些核酸构建体中，编码内源性TCR亚基N端部分的核酸的大小将取决于TRAC外显子1或TRBC外显子1的起始与靶向的插入位点之间的内源性TRAC或TRBC核酸序列中核苷酸的数目。例如，如果TRAC外显子1的起始和插入位点之间的核苷酸数目小于或大于25个核苷酸，那么构建体中可具有小于或大于25个核苷酸的编码内源性TCR-α亚基N端部分的核酸。
在上述示例中，转录自构建体的mRNA序列的翻译导致一种蛋白质的表达，所述蛋白质自切割成4个独立的多肽序列，即缺少跨膜结构域的无活性内源性可变区肽，(例如其在翻译后可在内质网中降解或分泌)，全长异源性抗原特异性TCR-β链或TCR-α链，本文所述的多肽序列，和全长异源性抗原特异性TCR-α链或TCR-β链。全长抗原特异性TCR-β链和全长抗原特异性TCR-α链形成具有所需抗原特异性的TCR。在一些实施方式中，多肽增强或赋予T细胞所需的一种或多种功能。转录自本文所述的任何其他核酸构建体的mRNA在T细胞中经类似地加工。
在一些实施方式中，核酸构建体以下述顺序编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)第一异源性TCR亚基链，其中TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；(iii)第二自切割肽序列；(iv)第二异源性TCR亚基链，其中TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；(v)第三自切割肽序列；(vi)本文所述的异源性多肽；和(vii)第四自切割肽序列或多聚A序列，其中如果内源性TCR亚基是TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中如果内源性TCR亚基是TCR-β亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。
在一些实施方式中，核酸构建体以下述顺序编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)合成抗原受体；(iii)第二自切割肽序列；(iv)本文所述的异源性多肽；和(v)第三自切割肽序列或多聚A序列。
在一些实施方式中，核酸构建体以下述顺序编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)异源性多肽；(iii)第二自切割肽序列；(iv)合成抗原受体；和(v)第三自切割肽序列或多聚A序列。
自切割肽的实例包括但不限于自切割病毒2A肽，例如猪捷申病毒-1(P2A)肽，明脉扁刺蛾病毒(T2A)肽，马鼻炎A病毒(E2A)肽，或口蹄疫病毒(F2A)肽。自切割2A肽能够由单个构建体表达多个基因产物。(参见，例如Chng等，“在CHO细胞中裂解高效2A肽用于高水平的单克隆抗体表达(Cleavage efficient 2A peptides for high level monoclonalantibody expression in CHO cells)”MAbs 7(2)：403-412(2015))。在一些实施方式中，核酸构建体包含两个或更多自切割肽。在一些实施方式中，两个或更多个自切割肽都是相同的。在其他实施方式中，两个或更多个自切割肽中的至少一个是不同的。
在一些实施方式中，一个或多个接头序列分隔核酸构建体的组分。接头序列的长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸或更长。
在一些实施方式中，核酸构建体包含与人TCR基因座具有同源性的侧接同源臂序列。在本文所述的组合物和方法中，一个或两个同源臂序列的长度为至少约50、100、150、200、250、300、350、400或450个核苷酸。在一些情况下，与基因组序列同源的核苷酸序列与基因组序列至少80％、90％、95％、99％或100％互补。在一些实施方式中，一个或两个同源臂序列任选地包含相较于在TCR基因座中侧接插入位点的TCR基因座中基因组序列中的同源序列错配的核苷酸序列。
在一些实施方式中，核酸构建体任选地编码选择性标志物，其可用于分离或隔离经修饰的T细胞亚群。在一些实施方式中，核酸构建体任选地包含指示多肽身份的条码序列。
本文所述的任何多肽可以由本文所述的任何核酸构建体编码。在一些实施方式中，由异源性核酸构建体编码的多肽序列与选自SEQ ID NO:33-64的氨基酸序列至少95％相同。
还提供了与SEQ ID NO 33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46至少95％相同的多肽。本文还提供了编码这些多肽的核酸。
还提供了包含本文所述任何核酸序列的人T细胞。还提供了包含本文所述任何核酸序列的人T细胞群(例如，多个)。
编码本文所述任何多肽的任何核酸构建体可用于制备经修饰的T细胞。在一些实施方式中，该方法包括：(a)向人T细胞中引入(i)靶向核酸酶，其切割人T细胞TCR基因座中的靶区域以在细胞的基因组中产生靶插入位点；和(ii)编码本文所述任何多肽的核酸构建体，例如，
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，Fas胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人Fas胞外结构域或其部分的多肽；(Fas-OX40)；
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，TNFRSF12胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人TNFRSF12胞外结
构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域的多肽；
截短的人LTBR蛋白，其包含人LTBR胞外结构域、跨膜结构域和胞
内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；
截短的人TNFRSF12蛋白，其包含人TNFRSF12胞外结构域、跨膜结
构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；
包含通过跨膜结构域与人4-1BB胞内结构域(和任选地，LAG3胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人LAG-3胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR5胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR4胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，TNFRSF1A胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人TNFRSF1A胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人IL-4RA胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人LAG3胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域的1-20个氨基酸)的多肽；
包含IL21R蛋白、LAT1蛋白、BATF蛋白、BATF3蛋白、BATF2蛋白、ID2蛋白、ID3蛋白、IRF8蛋白、MYC蛋白、POU2F1蛋白、TFAP4蛋白、SMAD4蛋白、NFATC1蛋白、EZH2蛋白、EOMES蛋白、SOX5蛋白、IRF2BP2蛋白、SOX3蛋白、PRDM1蛋白或RELB蛋白的多肽；和
(b)允许发生重组，从而将核酸构建体插入靶插入位点以产生经修饰的人T细胞。
在一些实施方式中，通过向T细胞中引入以下来将核酸插入T细胞中：(a)切割TCR-α亚基恒定基因(TRAC)的外显子1中的靶区域以在T细胞的基因组中产生插入位点的靶向核酸酶；和(b)核酸构建体，其中所述核酸构建体通过同源定向修复(HDR)掺入插入位点。在一些实施方式中，通过向T细胞中引入下述内容来将核酸构建体插入T细胞：(a)靶向核酸酶，其切割TCR-β亚基恒定基因(TRBC)(例如TRBC1或TRBC 2)外显子1中靶区域以在T细胞基因组中产生插入位点；和(b)核酸构建体，其中所述核酸序列通过同源定向修复(HDR)掺入插入位点。
在一些实施方式中，通过将包含核酸构建体的病毒载体引入细胞中来插入核酸构建体。病毒载体的实例包括但不限于腺相关病毒(AAV)载体，逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方式中，慢病毒载体是整合酶缺陷型慢病毒载体。
在一些实施方式中，通过将包含核酸构建体的非病毒载体引入细胞中来插入核酸构建体。在非病毒递送方法中，核酸可以是裸DNA，或在非病毒质粒或载体中。对于非病毒递送方法，可以使用基于Cas9穿梭系统和阴离子聚合物的非病毒基因组靶向方案来插入DNA模板。也可以使用基于转座子的基因转移。参见例如，Tipanee等“基于转座子的基因治疗的临床前和临床进展(Preclinical and clinical advances in transposon-based genetherapy),”Biosci Rep.37(6):BSR20160614(2017)。
在一些情况下，将核酸序列作为线性DNA模板引入细胞中。在一些情况中，将核酸序列作为双链DNA模板引入细胞中。在一些情况中，DNA模板是单链DNA模板。在一些情况中，单链DNA模板是纯单链DNA模板。如本文所用，述及“纯单链DNA”表示基本上没有DNA的其他或相对链的单链DNA。述及“基本上没有”表示纯单链DNA的一条DNA链比另一条DNA链少至少100倍。在一些情况下，DNA模板是双链或单链质粒或微环(mini-circle)。
在一些实施方式中，靶向核酸酶选自RNA向导的核酸酶结构域，转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，锌指核酸酶(ZFN)和megaTAL(参见，例如，Merkert和Martin，“人多能干细胞的位点特异性基因组工程改造(Site-Specific Genome Engineering in HumanPluripotent Stem Cells)”，Int.J.Mol.Sci.18(7):1000(2016))。在一些实施方式中，RNA向导的核酸酶是Cas9核酸酶，并且该方法还包括将与细胞基因组中的靶区域(例如T细胞中TRAC基因外显子1中的靶区域)特异性杂交的向导RNA引入细胞。在其他实施方式中，RNA向导的核酸酶是Cas9核酸酶，并且该方法还包括将与TRBC基因外显子1中的靶区域特异性杂交的向导RNA引入细胞。
如通篇所用，向导RNA(gRNA)序列是与位点特异性或靶向核酸酶相互作用并与细胞基因组内的靶核酸特异性结合或杂交的序列，从而使gRNA和靶向核酸酶共定位于细胞基因组中的靶核酸。每个gRNA包含长度约为10至50个核苷酸的DNA靶向序列或原型间隔子序列，该序列与基因组中的靶DNA序列特异性结合或杂交。例如，DNA靶向序列的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方式中，gRNA包含crRNA序列和反式激活crRNA(tracrRNA)序列。在一些实施方式中，gRNA不包含tracrRNA序列。
通常，将DNA靶向序列设计为与靶DNA序列互补(例如，完美互补)或基本上互补。在一些情况中，DNA靶向序列可以掺入摆动或简并碱基以结合多个遗传元件。在一些情况中，结合区3'或5'端的19个核苷酸与一个或多个靶遗传元件完美互补。在一些情况中，可以改变结合区以增加稳定性。例如，可以掺入非天然核苷酸以增加RNA对降解的抗性。在一些情况中，可以改变或设计结合区，以避免或减少结合区中的二级结构形成。在一些情况中，可以设计结合区以优化G-C含量。在一些情况中，G-C含量优选约40％至约60％(例如40％、45％、50％、55％、60％)。在一些实施方式中，Cas9蛋白质可以处于激活的内切核酸酶形式，因此当与靶核酸结合作为具有向导RNA的复合物的部分或者具有DNA模板的复合物的部分时，双链断裂被导入靶核酸。在本文提供的方法中，可以将Cas9多肽或编码Cas9多肽的核酸引入细胞。可以用HDR修复双链断裂以将DNA模板插入细胞的基因组中。本文所述方法可以利用各种Cas9核酸酶。例如，可以利用这样的Cas9核酸酶，所述Cas9核酸酶需要紧邻向导RNA靶向的区域3'的NGG原型间隔子邻近基序(PAM)。这类Cas9核酸酶可以靶向例如包含NGG序列的TRAB外显子1或TRAC外显子1中的区域。又例如，具有正交PAM基序要求的Cas9蛋白可以用于靶向不具有邻近的NGG PAM序列的序列。具有正交PAM序列特异性的示例性Cas9蛋白包括但不限于在Esvelt等,Nature Methods 10:1116–1121(2013)中所述的那些。
在一些情况中，Cas9蛋白是切口酶，因此在与靶核酸结合作为与向导RNA的复合物的部分时将单链断裂或切口引入靶核酸。各自结合结构不同的向导RNA的一对Cas9切口酶可以靶向靶基因组区域的2个近端位点，并且因此将一对近端单链断裂导入靶基因组区域，例如，TRAC基因外显子1或TRBC基因外显子1。切口酶对可以提供增强的特异性，因为脱靶作用有可能导致单一切口，这通常通过碱基切除修复机制在无损伤的情况下修复。示例性Cas9切口酶包含具有D10A或H840A突变的Cas9核酸酶(参见例如，Ran等“用于增强基因组编辑特异性的通过RNA向导的CRISPR Cas9形成的双切口(Double nicking by RNA-guidedCRISPR Cas9for enhanced genome editing specificity),”Cell 154(6):1380-1389(2013))。
在一些实施方式中，将Cas9核酸酶、向导RNA和核酸序列作为核糖核蛋白复合物(RNP)-核酸序列(例如DNA模板)复合物引入细胞中，其中RNP-核酸序列复合物包含：(i)RNP，其中RNP包含Cas9核酸酶和向导RNA；和(ii)核酸序列或构建体。
在一些实施方式中，RNP与DNA模板的摩尔比可以为约3:1至约100:1。例如，摩尔比可以为约5:1至10:1，约5:1至约15:1，5:1至约20:1；5:1至约25:1；约8:1至约12:1；约8:1至约15:1，约8:1至约20:1，或约8:1至约25:1。
在一些实施方式中，RNP-DNA模板复合物中的DNA模板的浓度为约2.5pM至约25pM。在一些实施方式中，DNA模板的量为约1μg至约10μg。
在一些实施方式中，通过用DNA模板与RNP在约20℃-约25℃的温度孵育不到约1分钟-30分钟形成RNP-DNA模板复合物。在一些实施方式中，在将RNP-DNA模板复合物导入细胞之前混合RNP-DNA模板复合物和细胞。
在一些实施方式中，通过电穿孔将核酸序列或RNP-DNA模板复合物引入细胞。用于电穿孔细胞以导入RNP-DNA模板复合物的方法、组合物和装置可以包括本文实施例中所述的那些。用于电穿孔细胞以导入RNP-DNA模板复合物的其他或另外的方法、组合物和装置可以包括述于WO/2006/001614或Kim,J.A.等Biosens.Bioelectron.23,1353–1360(2008)中的那些。用于电穿孔细胞以导入RNP-DNA模板复合物的其他或另外的方法、组合物和装置可以包括述于美国专利申请公开号2006/0094095；2005/0064596；或2006/0087522中的那些。用于电穿孔细胞以导入RNP-DNA模板复合物的其他或另外的方法、组合物和装置可以包括述于Li,L.H.等Cancer Res.Treat.1,341–350(2002)；美国专利号6,773,669；7,186,559；7,771,984；7,991,559；6485961；7029916；和美国专利申请公开号2014/0017213和2012/0088842中的那些。用于电穿孔细胞以导入RNP-DNA模板复合物的其他或另外的方法、组合物和装置可以包括述于Geng,T.等J.Control Release 144,91–100(2010)；和Wang,J.,等Lab.Chip 10,2057–2061(2010)中的那些。
在一些实施方式中，在阴离子聚合物存在的情况下将RNP递送至细胞。在一些实施方式中，阴离子聚合物是阴离子多肽或阴离子多糖。在一些实施方式中，阴离子聚合物是阴离子多肽(例如聚谷氨酸(PGA)、聚天冬氨酸或聚羧基谷氨酸)。在一些实施方式中，阴离子聚合物是阴离子多糖(例如透明质酸(HA)、肝素、硫酸肝素或糖胺聚糖)。在一些实施方式中，阴离子聚合物是聚(丙烯酸)(PAA)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(苯乙烯磺酸)或聚磷酸盐/酯。在一些实施方式中，阴离子聚合物的分子量为至少15kDa(例如介于15kDa与50kDa之间)。在一些实施方式中，阴离子聚合物和Cas蛋白的摩尔比分别介于10:1和120:1之间(例如10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110:1或120:1)。在该方面的一些实施方式中，sgRNA:Cas蛋白的摩尔比在0.25:1和4:1之间(例如0.25:1、0.5:1、1:1、1.2:1、1.4:1、1.6:1、1.8:1、2:1、2.2:1、2.4:1、2.6:1、2.8:1、3:1、3.2:1、3.4:1、3.6:1、3.8:1或4:1)。
在一些实施方式中，供体模板包含同源定向修复(HDR)模板和一个或多个DNA结合蛋白靶序列。在一些实施方式中，供体模板具有一个DNA结合蛋白靶序列和一个或多个原型间隔子邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)。含有DNA结合蛋白(例如RNA向导的核酸酶)、供体gRNA和供体模板的复合物可以使供体模板穿梭至所需胞内位置(例如细胞核)，无需切割DNA结合蛋白靶序列，这样使得HDR模板可以整合到经切割的靶核酸中。在一些实施方式中，DNA结合蛋白靶序列和PAM位于HDR模板的5'末端。特别地，在一些实施方式中，PAM可以位于DNA结合蛋白靶序列的5'末端。在其他实施方式中，PAM可以位于DNA结合蛋白靶序列的3'末端。在一些实施方式中，DNA结合蛋白靶序列和PAM位于HDR模板的3'端。特别地，在一些实施方式中，PAM可以位于DNA结合蛋白靶序列的5'末端。在其他实施方式中，PAM位于DNA结合蛋白靶序列的3'末端。在一些实施方式中，供体模板具有两个DNA结合蛋白靶序列和两个PAM。特别地，在一些实施方式中，第一DNA结合蛋白靶序列和第一PAM位于HDR模板的5'末端，第二DNA结合蛋白靶序列和第二PAM位于HDR模板的3'末端。在一些实施方式中，第一PAM位于第一DNA结合蛋白靶序列的5'末端，第二PAM位于第二DNA结合蛋白靶序列的5'。在其他实施方式中，第一PAM位于第一DNA结合蛋白靶序列的5'末端，第二PAM位于第二DNA结合蛋白靶序列的3'。在其他一些实施方式中，第一PAM位于第一DNA结合蛋白靶序列的3'末端，第二PAM位于第二DNA结合蛋白靶序列的5'。在其他一些实施方式中，第一PAM位于第一DNA结合蛋白靶序列的3'末端，第二PAM位于第二DNA结合蛋白靶序列的3'。
在一些实施方式中，将核酸序列或RNP-DNA模板复合物引入约1×105至约2×106个细胞T细胞中。例如，可以将核酸序列或RNP-DNA模板复合物引入约1×105个细胞至约5×105个细胞，约1×105个细胞至约1×106个细胞，1×105个细胞至约1.5×106个细胞，1×105个细胞至约2×106个细胞，约1×106个细胞至约1.5×106个细胞或约1×106个细胞至约2×106个细胞。
在本文提供的方法和组合物中，人T细胞可以是原代T细胞。在一些实施方式中，T细胞是调节T细胞、效应T细胞、记忆T细胞或原初T细胞。在一些实施方式中，效应T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD4+细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD4+CD8+T细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD4-CD8-T细胞。在一些实施方式中，T细胞是表达TCR受体或分化成表达TCR受体的T细胞。
治疗方法
本文所述任何方法和组合物可用于修饰获自人对象的T细胞。本文所述任何方法和组合物可用于修饰获自人对象的T细胞以增强对象的免疫应答。本文所述的任何方法和组合物可用于修饰获自人对象的T细胞以治疗或预防疾病(例如，癌症、传染病、自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主病或对象中的其他炎症紊乱)。
如本文所用，对象意指个体。对象可以是成人对象或儿科对象。儿科对象包括年龄从出生到十八岁的对象。
本文提供了增强人对象中免疫应答的方法，其包括给予本文所述任何经修饰的T细胞，即异源表达本文所述多肽的T细胞，例如，
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，Fas胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人Fas胞外结构域或其部分的多肽；(Fas-OX40)；
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，TNFRSF12
胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人TNFRSF12胞外结
构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域的多肽；
截短的人LTBR蛋白，其包含人LTBR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；
截短的人TNFRSF12蛋白，其包含人TNFRSF12胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；
包含通过跨膜结构域与人4-1BB胞内结构域(和任选地，LAG3胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人LAG-3胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR5胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR4胞外结构域的多肽；包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，TNFRSF1A胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人TNFRSF1A胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人IL-4RA胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人LAG3胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域的1-20个氨基酸)的多肽；或
包含IL21R蛋白、LAT1蛋白、BATF蛋白、BATF3蛋白、BATF2蛋白、ID2蛋白、ID3蛋白、IRF8蛋白、MYC蛋白、POU2F1蛋白、TFAP4蛋白、SMAD4蛋白、NFATC1蛋白、EZH2蛋白、EOMES蛋白、SOX5蛋白、IRF2BP2蛋白、SOX3蛋白、PRDM1蛋白或RELB蛋白的多肽。
在一些实施方式中，T细胞获自对象并使用本文提供的任何方法修饰以表达抗原特异性TCR或合成抗原受体，然后将经修饰的T细胞给予对象。在一些实施方式中，对象患有癌症并且靶抗原是癌症特异性抗原。在一些实施方式中，对象患有自身免疫病症并且抗原是与自身免疫病症相关的抗原。在一些实施方式中，对象患有感染并且靶抗原是与感染相关的抗原。
还提供了治疗人对象癌症的方法，包括：a)从对象获得T细胞；b)使用本文提供的任何方法修饰T细胞以表达抗原特异性TCR或识别对象中靶抗原的合成抗原受体；和c)将经修饰的T细胞给予对象，其中人对象患有癌症并且靶抗原是癌症特异性抗原。如全文所用，短语“癌症特异性抗原”意指癌细胞独有的抗原或在癌细胞中比在非癌细胞中表达更丰富的抗原。在一些实施方式中，癌症特异性抗原是肿瘤特异性抗原。
如本文所用，癌症是以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。在一些实施方式中，癌症是实体瘤。在一些实施方式中，癌症是血液或血液癌症。示例性癌症包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病(例如，急性髓系白血病)、骨髓瘤、肺癌等。应当理解的是，本文提供的方法也可用于靶向循环癌细胞，例如实体瘤脱落到对象血流中的细胞。
在一些实施方式中，用于治疗癌症的T细胞表达包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与LAG3/4-1BB(SEQ ID NO:40)、DR5-IL-4R(SEQ ID NO:41)、DR4-IL-4R(SEQ ID NO:42)、TNFRSF1A-IL-4R(SEQ ID NO:43)、LTBR-IL-4R(SEQ ID NO:44)、IL-4RA-ICOS(SEQ IDNO:45)、LAG-3ICOS(SEQ ID NO:46)、NFATC1(SEQ ID NO:57)、EZH2(SEQ ID NO:58)、EOMES(SEQ ID NO:59)、SOX5(SEQ ID NO:60)、IRF2BP2(SEQ ID NO:61)、SOX3(SEQ ID NO:62)、PRDM1(SEQ ID NO:63)或RELB(SEQ ID NO:64)至少95％相同。在用于治疗癌症的一些实施方式中，T细胞表达与SEQ ID NO:99、101、103或105至少95％相同的多肽。
在一些实施方式中，用于治疗癌症的T细胞表达包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与Fas-OX40(SEQ ID NO:33)、TNFRSF12-OX40(SEQ ID NO:34)、LTBR-OX40(SEQ IDNO:35)、LTBRtrunc(SEQ ID NO:36)、TNFRSF12trunc(SEQ ID NO:37)、IL-21R(SEQ ID NO:38)、LAT1(SEQ ID NO:39)BATF(SEQ ID NO:47)、BATF3 9(SEQ ID NO:48)、BATF2(SEQ IDNO:49)、ID2(SEQ ID NO:50)、ID3(SEQ ID NO:51)、IRF8(SEQ ID NO:52)、MYC(SEQ ID NO:53)、POU2F1(SEQ ID NO:54)、TFAP4(SEQ ID NO:55)或
SMAD4(SEQ ID NO:56)至少95％相同。
在一些实施方式中，肿瘤浸润淋巴细胞是一种异质性和癌症特异性T细胞群，其获自癌症对象并经离体扩增。患者癌症的特征决定了定制的细胞修饰组，并且使用本文所述任何方法将这些修饰应用于肿瘤浸润淋巴细胞。
本文还提供了治疗人对象自身免疫性疾病、过敏性疾病或移植排斥的方法，包括：a)从对象获得T细胞；b)使用本文提供的任何方法修饰T细胞以表达抗原特异性TCR或识别对象中靶抗原的合成抗原受体；和c)将经修饰的T细胞给予对象，其中人对象患有自身免疫病症并且靶抗原是与自身免疫病症相关的抗原。在一些实施方式中，T细胞是调节T细胞。
如本文所用，自身免疫性疾病是免疫系统无法区分对象自身细胞和外来细胞，从而导致免疫系统错误地攻击体内健康细胞的疾病。自身免疫病症的示例包括但不限于：炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、格雷夫斯氏病、1型糖尿病、干燥综合征、自身免疫性甲状腺疾病和乳糜泻。
在一些用于治疗自身免疫病症、过敏性疾病或移植排斥的实施方式中，T细胞表达多肽，所述多肽与LAG3/4-1BB(SEQ ID NO:40)、DR5-IL-4R(SEQ ID NO:41)、DR4-IL-4R(SEQID NO:42)、TNFRSF1A-IL-4R(SEQ ID NO:43)、LTBR-IL-4R(SEQ ID NO:44)、IL-4RA-ICOS(SEQ ID NO:45)、LAG-3ICOS(SEQ ID NO:46)、NFATC1(SEQ ID NO:57)、EZH2(SEQ ID NO:58)、EOMES(SEQ ID NO:59)、SOX5(SEQ ID NO:60)、IRF2BP2(SEQ ID NO:61)、SOX3(SEQ IDNO:62)、PRDM1(SEQ ID NO:63)或RELB(SEQ ID NO:64)至少95％相同。在用于治疗自身免疫性疾病、过敏性疾病或移植排斥的一些实施方式中，T细胞表达与SEQ ID NO:99、101、103或105至少95％相同的多肽。
本文还提供了治疗人对象感染的方法，包括：a)从对象获得T细胞；b)使用本文提供的任何方法修饰T细胞以表达抗原特异性TCR或识别对象中靶抗原的合成抗原受体；和c)将经修饰的T细胞给予对象，其中对象患有感染并且靶抗原是与对象中的感染相关的抗原。
在一些用于治疗感染的实施方式中，T细胞表达包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与Fas-OX40(SEQ ID NO:33)、TNFRSF12-OX40(SEQ ID NO:34)、LTBR-OX40(SEQ IDNO:35)、LTBRtrunc(SEQ ID NO:36)、TNFRSF12trunc(SEQ ID NO:37)、IL-21R(SEQ ID NO:38)、LAT1(SEQ ID NO:39)BATF(SEQ ID NO:47)、BATF3 9(SEQ ID NO:48)、BATF2(SEQ IDNO:49)、ID2(SEQ ID NO:50)、ID3(SEQ ID NO:51)、IRF8(SEQ ID NO:52)、MYC(SEQ ID NO:53)、POU2F1(SEQ ID NO:54)、TFAP4(SEQ ID NO:55)或
SMAD4(SEQ ID NO:56)至少95％相同。
在一些实施方式中，T细胞是自体同源的(即来自将接受经修饰的细胞的同一对象)或同种异体的(即来自与将接受经修饰的细胞的对象不同的对象)。在一些实施方式中，T细胞是iPSC衍生的T细胞。参见例如Nagano等Mol.Therapy Methods&ClinicalDevelopment 16:126-135(2020)。本文提供的任何治疗方法还可以包括在修饰T细胞之前扩增T细胞群。本文提供的任何治疗方法还可以包括在T细胞经修饰之后和给予对象之前扩增T细胞群。
在此公开的材料、组合物以及组分可用于在此公开的方法和组合物、可与在此公开的方法和组合物联用、可用于制备在此公开的方法和组合物，或者是在此公开的方法和组合物的产物。本文公开了以上及其他材料，应理解的是，在公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，既便没有明确具体指向这些化合物的多种个体或各别组合和集合性组合以及排列组合中的每一种，这每一种都是本文所具体涵盖和具体描述的。例如，如果公开和论述了一种方法，并且论述了可对该方法中一个或多个分子实施的多种改变，则于是具体涵盖了所述改变的和所述方法的每一种和所有可能的组合与排列，除非特别说明并非如此。同样地，还特别考虑和公开了这些的任何子集或组合。这一概念适用于本申请所有方面的内容，包括但不限于采用本文所述组合物的方法的步骤。这样，如果有多种可执行的其他步骤，则应认为，这些其他步骤中的每一个都可与本文所述方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合联合执行，并且就此具体涵盖并视为公开了此类组合或组合子集中的每一个。
本文引用的出版物及其中援引相关的材料都具体通过引用整体纳入本文。
实施例
原代人T细胞的分离和培养
如前所述进行T细胞分离和培养(Roth等,Nature 559:405-409(2018)；and Roth等,Cell 181:728-744(2020))。简言之，从新鲜全血，Trima Apheresis(Vitalant公司，加利福尼亚州旧金山市)后的白细胞减少(leukoreduction)腔室的残留物或来自健康供体的外周血(PB)白细胞去除术包(干细胞公司(STEMCELL))分离人T细胞。使用SepMate管(干细胞公司)通过Lymphoprep离心(干细胞公司)从全血样品中分离出外周血单核细胞(PBMC)。使用EasySep人T细胞分离试剂盒(干细胞公司)通过磁性负选择由所有细胞来源的PBMC中分离出T细胞。根据UCSF人研究委员会批准的方案(CHR#13-11950)从健康的人供体采集新鲜血液。
在补充有5％胎牛血清(FBS)、50μM 2-巯基乙醇和10mM N-乙酰基L-胱氨酸的XVivo15培养基(隆撒公司(Lonza))中培养新鲜分离的原代细胞。在核转染之前，使用抗人CD3/CD28Dyna珠(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))以100万个细胞/mL培养基的密度刺激T细胞44至52小时，珠与细胞的比例为1:1。细胞还在含有IL-2(500U ml-1；UCSF药物公司(UCSF Pharmacy))、IL-7(5ng ml-1；赛默飞世尔科技公司)和IL-15(5ng ml-1；生命技术公司(Life Tech))的XVivo15培养基中培养。核转染后，T细胞在含有IL-2(500U ml-1)的XVivo15培养基中培养，并维持在约100万个细胞/ml培养基。每2-3天用额外的培养基和新鲜的IL-2(终浓度为500Uml-1)补充细胞。
为合并敲入生成质粒文库
合并敲入文库中包含的229个构建体是使用Twist Bioscience密码子优化工具设计，并经商业合成和克隆(扭转生物科学公司(Twist Bioscience))到含有NY-ESO-1TCR替代HDR序列的定制pUC19质粒中。并将对各文库成员独有的两个条码引入紧邻单个基因插入区域5'和3'的简并碱基中。通过将单个构建体质粒汇集到相应的文库(转录因子，100个成员；开关受体，129个成员)或一个完整的库中并敲入对照创建。
CAR质粒库通过从上述TCR质粒库中扩增构建体作为DNA模板以合并组装方式创建。PCR扩增(Kapa热启动聚合酶)产生合并的扩增子文库，其具有与包含CD19/4-1BB或GD2/CD28CAR HDR序列的pUC19质粒同源的小突出端。该扩增子库经Dpn1限制酶(NEB)处理以去除残余环状TCR质粒，经SPRI纯化(1.0X)，并洗脱到H2O中。然后使用吉布森组装(GibsonAssemblies)(NEB公司)构建质粒库，其中包含所有229个文库成员和敲入对照，以及新的CAR序列。CAR质粒库如前所述进行SPRI纯化，并转化到Endura电感受态细胞(Lucigen公司)和Maxiprepped(Zymo公司)中以供进一步使用。
图1和12是合并敲入平台以及后续功能单刺激筛选的示意图。
HDR模板生成
HDR模板如前所述产生(Roth等，2018，Roth等，2020)。简言之，将TCR或CAR质粒池用作高输出PCR扩增(Kapa热启动聚合酶)的模板。由此产生的扩增子被认为是双链同源定向修复DNA模板(HDRT)，其包含这样的库：229个新的/合成的DNA插入以及敲入对照，侧接约300bp同源臂和穿梭序列(Nguyen等，2019年)。HDRT经SPRI纯化(1.0x)并洗脱到H2O中。将洗脱的HDRT浓度标准化为1ug/μL。在1.0％琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳确认HDRT扩增。研究中使用的所有DNA序列都列在表S1中。
Cas9RNP电穿孔
通过将双组分gRNA与Cas9复合来产生RNP。所述双组分gRNA由crRNA和tracrRNA组成，两者都是化学合成的(Dharmacon公司和IDT公司)和冻干的。在到达后，将冻干的RNA重悬于浓度为160μM的无核酸酶缓冲液中，并在-80℃下等分保存。聚(L-谷氨酸)(PGA)MW 15-50kDa(西格玛公司(Sigma))在水中重悬至100mg/mL，经无菌过滤，并在-80℃下等分保存。Cas9-NLS(QB3Macrolab公司)经重组生产，纯化并以40μM储存在20mM HEPES-KOH，pH 7.5，150mM KCl，10％甘油，1mM DTT中。
为了产生RNP，将crRNA和tracrRNA等分试样解冻，按体积1:1混合，并通过在37℃下孵育30分钟退火以形成80uM gRNA溶液。接下来，将PGA与新鲜制备的gRNA以0.8:1体积比混合，然后与Cas9蛋白复合，gRNA:PGA:Cas9最终体积比为1:0.8:1。将其在37℃下孵育15分钟，以形成14.3μM RNP溶液。
在电穿孔之前，将RNP和HDRT与T细胞混合。将批量T细胞离心，重悬于电穿孔缓冲液P3(隆撒公司)中，然后在96孔板中以750M个细胞/20μl接种各孔。将混合物转移到电穿孔板(隆撒公司)并用编码EH115脉冲。
流式细胞术和FACS
对于流式细胞术分析，将T细胞或细胞系以300g离心5分钟并重悬于含有相应抗体混合物的流动缓冲液(PBS/2％FCS)中。将细胞在室温下染色10分钟，洗涤一次并在AttuneNxT流式细胞仪(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)上分析。对于离体骨髓的分析，将材料过滤(40um，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)，离心并在ACK裂解缓冲液(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)中以室温孵育2分钟。通过添加含有2mM EDTA的流动缓冲液终止反应，并将细胞洗涤一次。将沉淀重悬于流动缓冲液/2mMEDTA+FcR阻断剂，小鼠(美天旎公司(Miltenyi Biotec)，德国格拉德巴赫)。在RT下孵育15分钟后，添加抗体。将细胞在冰上染色45分钟，洗涤一次，重悬于流动缓冲液/2mM EDTA+CountBright绝对计数珠(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)，并在BDLSRFortessa(BD生物科技公司(BD Biosciences)，美国加利福尼亚州圣何塞)上进行分析。在BD FACSAria(BD生物科技公司，美国加利福尼亚州圣何塞)上进行分选。
胞内细胞因子染色
用ImmunoCult人CD3/CD28/CD2T细胞激活剂(25uL/ml)以T细胞浓度为1M/ml再刺激经遗传工程改造以表达NY-ESO特异性TCR和感兴趣的构建体的T细胞4小时。在多次刺激测定之前或测定的第5次刺激之后进行再刺激。添加布雷菲德菌素A溶液1,000X(白乐津公司(Biolegend)，加利福尼亚州圣迭戈)以抑制蛋白质转运。使用FIX&PERM细胞固定和透化试剂盒(赛默飞世尔科技公司)通过流式细胞术分析胞内细胞因子。
体外单刺激筛选
在设置筛选的前一天，将2.5e6个A375接种到各T75烧瓶中的完全RPMI培养基(RPMI+NEAA，谷氨酰胺，Hepes，Pen/Strep，丙酮酸钠(所有均来自赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)和10％FCS(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，美国密苏里州圣路易斯))假设它们在24小时内翻倍。一天后(＝电穿孔后7天)，对经编辑的T细胞库进行计数并洗涤一次。将10e6个T细胞转移到TRI试剂(西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)，代表扩增子测序的输入群体。将各筛选条件的10e6个T细胞转移到T75烧瓶中的补充有5％FCS，2-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)和30U/ml IL-2(阿地白介素)的20ml的X-VIVO 15(隆萨公司，瑞士巴塞)中。对于A375条件，去除cRPMI，并用20ml的X-VIVO 15+添加剂和10e6个T细胞填充烧瓶。对于Nalm-6条件，对Nalm-6细胞进行计数并向各T75烧瓶添加5e6个Nalm-6细胞。在刺激条件下，T细胞用Dyna珠CD3/CD28CTS(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)以1:1珠:细胞比(“刺激”)或5:1的比例(“过度刺激”)进行刺激。对于仅CD3刺激(“无共刺激”条件)，T细胞与NY-ESO-1特异性dextramer(Immudex公司，丹麦哥本哈根)在RT下下孵育12分钟(1:50稀释)，洗涤一次并转移至T75烧瓶。两天后，将10ml的X-VIVO 15添加到所有条件中，包括补充剂和30U/ml IL-2。另外两天后，对细胞进行计数并将10e6个细胞转移到TRI试剂用于RNA分离和扩增子测序。
体外多重刺激筛选
在多重刺激筛选开始前一天，对A375细胞进行计数并转移至24孔板(1ml完全RPMI培养基中50,000个细胞/孔)，假设它们在24小时内翻倍。一天后，对经编辑的T细胞库进行计数，并将10e6个细胞冷冻在TRI试剂中用于扩增子测序(输入群)。去除A375细胞的培养基。将100,000个经编辑的T细胞(NY-ESO多聚体阳性，效应物:靶标比约为1:1)转移到24孔板的各孔中，并与A375细胞在2ml含有补充剂+50U/ml IL-2的X-VIVO 15中共培养。24小时后，如上所述将新鲜A375细胞铺板。一天后，去除新的A375板的培养基并替换为1ml新鲜X-VIVO 15加上来自第一个板的1ml T细胞悬浮液，包括按各孔总体积计算的50U/ml IL-2。对剩余的T细胞进行计数，并将10e6个细胞转移至TRI试剂进行扩增子测序。每隔一天重复进行该过程，共进行5次靶细胞刺激。
体外GD2CAR筛选
如上所述，原代人T细胞用GD2CAR文库进行电穿孔。由于GD2CAR提供强直信号转导/慢性刺激，因此在不添加靶细胞的情况下培养T细胞。在电穿孔后第16天和第4天对细胞进行分选，如前所述进行扩增子测序并计算log2倍数变化(第16天/第4天)。细胞在含有补充剂+50U/ml IL-2的X-Vivo 15中培养。
TOX染色
根据供应商的信息，使用eBioscience Foxp3/转录因子染色缓冲液组(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)试剂盒进行胞内转录因子染色。
体外增殖测定
对于增殖测定，根据供应商的信息，使用CellTrace CFSE或CTV细胞增殖试剂盒(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)对T细胞进行染色。简言之，将多达20e6个细胞以1e6个细胞/ml PBS重悬，并与1X CTV或CFSE溶液在37℃下孵育20分钟。添加30ml培养基终止反应。在37℃孵育额外5分钟后，洗涤细胞并用于验证测定。
体外杀伤测定
对于基于流的杀伤测定，如上所述用CellTrace CFSE或CTV细胞增殖试剂盒(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)标记靶细胞。在圆底96孔板中使用20,000个靶细胞/孔+各种效应物:靶标比例的T细胞(X-VIVO 15+补充剂和30U/ml IL-2)进行测定。为了读数，在测量前立即添加1X碘化丙啶溶液(白乐津公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥)。通过排除碎片、对单细胞、活细胞(PI阴性)然后对CFSE/CTV阳性靶细胞进行门控来计算各孔的靶细胞数。通过将实验条件下活靶细胞数与仅靶标对照中的活靶细胞数进行比较来计算杀伤的靶细胞百分比。
对于IncuCyte测定，RFP转导的A375细胞在测定开始前一天在光学96孔平底板中铺板(各孔1,500个A375细胞)。一天后，以不同的效应物:靶标比例添加T细胞(完全RPMI，500U/mL IL-2，1X葡萄糖溶液(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆))。使用IncuCyte活细胞分析系统(埃森生物科学公司(Essen BioScience)，美国密歇根州安娜堡)每6小时分析细胞计数(RFP+)，总共进行3-6天。
对于GD2CAR IncuCyte测定，96孔平底板用0.01％聚-L-鸟氨酸(PLO)溶液(西格玛公司)涂覆。在环境温度下1小时后，去除PLO并干燥板。分选的抗GD2CART细胞与GFP阳性GD2阳性Nalm-6细胞共培养。根据供应商的信息添加IncuCyte膜联蛋白V红试剂(埃森生物科学公司)。
体外竞争测定
为了评估单个构建体随着时间变化的丰度，经遗传工程改造以表达NY-ESO特异性TCR和感兴趣的构建体的T细胞与对照T细胞(NY-ESO-TCR+NGFR)以1:1的比例共培养。混合的T细胞群在多重刺激测定期间与A375靶细胞共培养，并通过流式细胞术分析不同T细胞构建体的丰度。刺激前，将相对丰度标准化为50/50输入丰度。
LEGENDplex分析
多重刺激测定结束时，收获与A375共培养的T细胞的上清液，并根据供应商的信息(白乐津公司)使用LEGENDplex人CD8/NK组13-重分析细胞因子浓度。
异种移植小鼠模型
NSG小鼠通过尾静脉注射接种0.5M GFP/荧光素酶阳性GD2阳性Nalm-6细胞。三天后，静脉注射2M抗GD2CAR阳性细胞(尾静脉)。使用体内成像系统(IVIS Lumina)每周分析1-2次白血病信号。
为组合敲入生成质粒文库
GD2CAR/pUC19骨架通过PCR扩增。插入物1和2通过PCR使用两个不同的引物对从合并的文库扩增，所述两个不同的引物对去除了构建体的恒定序列并添加了特定的组合突出端，如图12A所示。在使用NEBuilder HiFi DNA组装主混物(NEB)创建组合文库前，PCR产物经DpnI消化、凝胶和珠纯化(骨架)或仅珠纯化(插入物库1/2)。Gibson产物经珠纯化，转化为Endura电感受态细胞(鲁慈根公司(Lucigen))并大量制备以供进一步使用。HDR模板如上所述生成。
结果
使用上述方法，进行可再现的敲入筛选。如图2A所示，每个构建体(“5'BC”和“3'BC”)的独特条码在侧接感兴趣基因(“基因X”)的接头序列中的简并碱基中编码。5'和3'BC能够通过不同的扩增策略对基因组DNA(gDNA)或cDNA进行测序。将DNA错配引入HDR模板的一个同源臂，只允许在gDNA测序策略中使用与内源同源臂序列结合的引物扩增中靶敲入。转录提取的RNA并使用对插入区具有特异性的引物对3'条码进行测序。
图2B显示了双重敲入文库在指定阶段合并，(3')条码由cDNA测序。将针对合并敲入版本2(PoKI v2)的改进构建体设计与之前的合并敲入策略(PoKI v1，Roth等2020)进行比较。在组装状态下合并时，经分选的群体中正确分配条码的读取百分比相较于PoKI v1显著提高。
如图2C所示，将转录因子(TF)和开关受体(SR)文库作为一个大型文库敲入，并在计算上分成单独的文库用于分析。所有构建体条码始终如一地很好地代表了文库分布均匀(TF和SF Gini系数分别为0.23和0.20)。
图2D显示了在质粒库、HDR模板库和6个人供体的敲入读数中观察到构建体大小与文库表示之间存在负相关(分别为R2＝0.26、0.21和0.25)。即使是最大的文库成员(4.5kb插入)也有被很好地表示。HDR模板文库图中省略了四个高于1.5％的构建体，以保持坐标轴的一致性。
图2E显示了技术和生物重复间合并敲入的再现性。mRNA的3'BC测序在技术和生物学重复间具有高度可再现性(分别为R2＝0.99和0.96)。通过5'gDNA测序策略进行的生物学重复获得了相似的强相关性(R2＝0.99)。
图2F显示了gDNA和mRNA BC测序策略之间的相关性。来自同一合并敲入实验供体的3'BC测序mRNA和5'BC测序gDNA具有良好的相关性(R2＝0.78)。
图2G显示了覆盖范围内生物学重复之间的相关性。mRNA和gDNA测序策略均在降低测序覆盖率的情况下进行评估。还从刺激前(输入)和刺激后(刺激)的细胞群中获得了相关性。如图2E中所述获得值。即使在低覆盖率(50X)下，供体在所有策略和实验条件下都高度相关。
图2H显示了对于具有UMI的敲入条码进行的选择性DNA测序。转录后，来自单个细胞的TCR+基因X mRNA转录本使用基因特异性引物和通用分子标识符(UMI)进行逆转录。逆转录后，紧邻3'BC上游的引物结合产生包含3'条码和UMI的扩增子。对该扩增子的下一代测序能够关联UMI和BC计数。
图2I显示了3'BC+UMI扩增子的下一代测序的结果，揭示了UMI和BC计数之间的高度相关性(R2＝1.00)。
如图3A-B所示，许多阳性和阴性命中在单刺激丰度筛选后被识别。还使用多重刺激筛选鉴定了耗竭抗性T细胞构建体(图4A-E)。如图5A-C所示，许多阳性和阴性命中在多重刺激丰度筛选后被识别。
在单刺激筛选和多重刺激筛选中识别的命中的核酸和多肽序列列于表2中。
将来自单刺激和多重刺激丰度筛选的许多阳性和阴性命中分别电穿孔并进一步分析。如图6A-D所示，最高阳性命中(即IRF8和BATF)以及中性构建体(即JUN)和最高阴性命中(即EOMES)与对照构建体(NGFR)相比，在相对丰度方面表现如筛选所预测。
将多重刺激丰度筛选中的最高命中之一IRF8单独进行电穿孔并在功能测定中进一步评估。如图7A-D所示，杀伤试验证实，相较于NY-ESO/NGFR细胞，无论是未经预刺激(A、B)又或是经过多重刺激测定后(C、D)，NY-ESO/IRF8细胞针对A375靶细胞的细胞毒性更强。
图8A-B显示在经CD3/CD28/CD2刺激后，无论是未经预刺激(A)又或是经过多重刺激测定(5次预刺激，B)，NY-ESO/IRF8T细胞的细胞因子释放增加。
图9显示了在多重刺激测定结束时与A375共培养的NY-ESO/IRF8T细胞的上清液中的细胞因子水平增加。
图10A-B显示了在多重刺激测定结束时再刺激后，NY-ESO/IRF8T细胞中活化标志物CD69的表达增加且耗竭标志物TIM-3的表达降低。图13A-B显示了在未经靶细胞刺激、经靶细胞单刺激或经靶细胞多重刺激的TCR/CAR设置(NY-ESO TCR相较CD19CAR相较强直信号转导GD2CAR)中进行数个不同的筛选后，将TFAP4识别为比较电穿孔后第16天和第4天丰度水平时的强直信号转导GD2CAR测定中的最高命中。
图11A-11E显示了将强直信号转导GD2CAR和TFAP4或对照(NGFR)单次敲入原代人T细胞的结果。如图11B所示，TFAP4过表达增加了GD2CART细胞的杀伤能力。图11C显示了在(B)中描述的测定中分析的膜联蛋白+细胞在不同E:T比例间TFAP4条件中膜联蛋白+细胞水平增加。图11D显示了在NSG小鼠经0.5M GD2表达Nalm-6细胞IV攻击并用2M抗GD2CART细胞处理后，三天后具有或没有TFAP4过表达，通过荧光素酶测定测量，在两个个体供体(n＝5只小鼠/供体/组)中，具有TFAP4敲入的抗GD2CART细胞显示出改善白血病控制。图11E显示了通过流式细胞术所测量的TFAP4过表达增加T细胞上的CD25水平。
结构域序列(表1)
SEQ ID NO:65:
MLGIWTLLPLVLTSVARLSSKSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGL
HHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSSKCRR
CRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCTKCEHGIIKE
CTLTSNTKCKEEGSRSN
SEQ ID NO:66:
LGWLCLLLLPIPLIVWV
SEQ ID NO:67:
KRKEVQKTCRKHRKENQGSHESPTLNPETVAINLSDVDLSKYITTIAGVMTL
SQVKGFVRKNGVNEAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYD
TLIKDLKKANLCTLAEKIQTIILKDITSDSENSNFRNEIQSLV
SEQ ID NO:68:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRA
SEQ ID NO:69:
VAAILGLGLVLGLLGPLAILL
SEQ ID NO:70:
ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:71:
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQ
SEQ ID NO:72:
IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV
SEQ ID NO:73:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:74:
MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQ
FKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHS
HANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLK
SEQ ID NO:75:
FWLPIGCAAFVVVCILGCILI
SEQ ID NO:76:
CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
SEQ ID NO:77:
MARGSLRRLLRLLVLGLWLALLRSVAGEQAPGTAPCSRGSSWSADLDKCMDCASCRARPHSDFCLGCAAAPPAPFRLLWP
SEQ ID NO:78:
ILGGALSLTFVLGLLSGFLVW
SEQ ID NO:79:
RRCRRREKFTTPIEETGGEGCPAVALIQ
SEQ ID NO:80:
MLLPWATSAPGLAWGPLVLGLFGLLAASQPQAVPPYASENQTCRDQEKEYYEPQHRICCSRCPPGTYVSAKCSRIRDTVCATCAENSYNEHWNYLTICQLCRPCDPVMGLEEIAPCTSKRKTQCRCQPGMFCAAWALECTHCELLSDCPPGTEAELKDEVGKGNNHCVPCKAGHFQNTSSPSARCQPHTRCENQGLVEAAPGTAQSDTTCKNPLEPLPPEMSGTMLM
SEQ ID NO:81:
LAVLLPLAFFLLLATVFSCIW
SEQ ID NO:82:
KSHPSLCRKLGSLLKRRPQGEGPNPVAGSWEPPKAHPYFPDLVQPLLPIS
GDVSPVSTGLPAAPVLEAGVPQQQSPLDLTREPQLEPGEQSQVAHGTNGIHV
TGGSMTITGNIYIYNGPVLGGPPGPGDLPATPEPPYPIPEEGDPGPPGLSTPHQ
EDGKAWHLAETEHCGATPSNRGPRNQFITHD
SEQ ID NO:83:
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHL
SEQ ID NO:84:
LLFLILGVLSLLLLVTGAFGF
SEQ ID NO:85:
HLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL
SEQ ID NO:86:
MEQRGQNAPAASGARKRHGPGPREARGARPGPRVPKTLVLVVAAVLLLVSAESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEVPAVEETVTSSPGTPASPCS
SEQ ID NO:87:
LSGIIIGVTVAAVVLIVAVFV
SEQ ID NO:88:
CKSLLWKKVLPYLKGICSGGGGDPERVDRSSQRPGAEDNVLNEIVSILQPTQVPEQEMEVQEPAEPTGVNMLSPGESEHLLEPAEAERSQRRRLLVPANEGDPTETLRQCFDDFADLVPFDSWEPLMRKLGLMDNEIKVAKAEAAGHRDTLYTMLIKWVNKTGRDASVHTLLDALETLGERLAKQKIEDHLLSSGKFMYLEGNADSAMS
SEQ ID NO:89:
MGWLCSGLLFPVSCLVLLQVASSGNMKVLQEPTCVSDYMSISTCEWKMNGPTNCSTELRLLYQLVFLLSEAHTCIPENNGGAGCVCHLLMDDVVSADNYTLDLWAGQQLLWKGSFKPSEHVKPRAPGNLTVHTNVSDTLLLTWSNPYPPDNYLYNHLTYAVNIWSENDPADFRIYNVTYLEPSLRIAASTLKSGISYRARVRAWAQCYNTTWSEWSPSTKWHNSYREPFEQH
SEQ ID NO:90:
LLLGVSVSCIVILAVCLLCYVSIT
SEQ ID NO:91:
KIKKEWWDQIPNPARSRLVAIIIQDAQGSQWEKRSRGQEPAKCPHWKNCLTKLLPCFLEHNMKRDEDPHKAAKEMPFQGSGKSAWCPVEISKTVLWPESISVVRCVELFEAPVECEEEEEVEEEKGSFCASPESSRDDFQEGREGIVARLTESLFLDLLGEENGGFCQQDMGESCLLPPSGSTSAHMPWDEFPSAGPKEAPPWGKEQPLHLEPSPPASPTQSPDNLTCTETPLVIAGNPAYRSFSNSLSQSPCPRELGPDPLLARHLEEVEPEMPCVPQLSEPTTVPQPEPETWEQILRRNVLQHGAAAAPVSAPTSGYQEFVHAVEQGGTQASAVVGLGPPGEAGYKAFSSLLASSAVSPEKCGFGASSGEEGYKPFQDLIPGCPGDPAPVPVPLFTFGLDREPPRSPQSSHLPSSSPEHLGLEPGEKVEDMPKPPLPQEQATDPLVDSLGSGIVYSALTCHLCGHLKQCHGQEDGGQTPVMASPCCGCCCGDRSSPPTTPLRAPDPSPGGVPLEASLCPASLAPSGISEKSKSSSSFHPAPGNAQSSSQTPKIVNFVSVGPTYMRVS
SEQ ID NO:92:
MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGGGRGALPTSMGQHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVVGVLLQVVPSSAATIKLHDQSIGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHPGACNRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKSDEEERSPCTTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSRGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGNGHN
SEQ ID NO:93:
IWVILVVTLVVPLLLVAVLIVCC
SEQ ID NO:94:
CIGSGCGGDPKCMDRVCFWRLGLLRGPGAEDNAHNEILSNADSLSTFVSEQQMESQEPADLTGVTVQSPGEAQCLLGPAEAEGSQRRRLLVPANGADPTETLMLFFDKFANIVPFDSWDQLMRQLDLTKNEIDVVRAGTAGPGDALYAMLMKWVNKTGRNASIHTLLDALERMEERHAREKIQDLLVDSGKFIYLEDGTGSAVSLE
SEQ ID NO:95:
MGWLCSGLLFPVSCLVLLQVASSGNMKVLQEPTCVSDYMSISTCEWKMNGPTNCSTELRLLYQLVFLLSEAHTCIPENNGGAGCVCHLLMDDVVSADNYTLDLWAGQQLLWKGSFKPSEHVKPRAPGNLTVHTNVSDTLLLTWSNPYPPDNYLYNHLTYAVNIWSENDPADFRIYNVTYLEPSLRIAASTLKSGISYRARVRAWAQCYNTTWSEWSPSTKWHNSYREPFEQH
SEQ ID NO:96:
LLLGVSVSCIVILAVCLLCYVSIT
SEQ ID NO:97:
KIKKEWWDQIPNPARSRLVAIIIQDAQGSQWEKRSRGQEPAKCPHWKNCLTKLLPCFLEHNMKRDEDPHKAAKEMPFQGSGKSAWCPVEISKTVLWPESISVVRCVELFEAPVECEEEEEVEEEKGSFCASPESSRDDFQEGREGIVARLTESLFLDLLGEENGGFCQQDMGESCLLPPSGSTSAHMPWDEFPSAGPKEAPPWGKEQPLHLEPSPPASPTQSPDNLTCTETPLVIAGNPAYRSFSNSLSQSPCPRELGPDPLLARHLEEVEPEMPCVPQLSEPTTVPQPEPETWEQILRRNVLQHGAAAAPVSAPTSGYQEFVHAVEQGGTQASAVVGLGPPGEAGYKAFSSLLASSAVSPEKCGFGASSGEEGYKPFQDLIPGCPGDPAPVPVPLFTFGLDREPPRSPQSSHLPSSSPEHLGLEPGEKVEDMPKPPLPQEQATDPLVDSLGSGIVYSALTCHLCGHLKQCHGQEDGGQTPVMASPCCGCCCGDRSSPPTTPLRAPDPSPGGVPLEASLCPASLAPSGISEKSKSSSSFHPAPGNAQSSSQTPKIVNFVSVGPTYMRVS
SEQ ID NO:106:
MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
SEQ ID NO:107:
FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT
SEQ ID NO:108:
AVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN
SEQ ID NO:109:
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
SEQ ID NO:110:
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO:111:
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO:112:
MLCPWRTANLGLLLILTIFLVAASSSLCMDEKQITQNYSKVLAEVNTSWPVKMATNAVLCCPPIALRNLIIITWEIILRGQPSCTKAYRKETNETKETNCTDERITWVSRPDQNSDLQIRPVAITHDGYYRCIMVTPDGNFHRGYHLQVLVTPEVTLFQNRNRTAVCKAVAGKPAAQISWIPEGDCATKQEYWSNGTVTVKSTCHWEVHNVSTVTCHVSHLTGNKSLYIELLPVPGAKKSAKL
SEQ ID NO:113:
YIPYIILTIIILTIVGFIWLL
SEQ ID NO:114:
KVNGCRKYKLNKTESTPVVEEDEMQPYASYTEKNNPLYDTTNKVKAS EALQSEVDTDLHTL
所附权利要求中，术语“一个”或“一种”旨在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。
Claims (47)
1.一种异源表达一种或多种选自下组的多肽的人T细胞：
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，Fas胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人Fas胞外结构域或其部分的多肽；
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，TNFRSF12胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人TNFRSF12胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域的多肽；
截短的人LTBR蛋白，其包含人LTBR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；
截短的人TNFRSF12蛋白，其包含人TNFRSF12胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；
包含通过跨膜结构域与人4-1BB胞内结构域(和任选地，LAG3胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人LAG-3胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR5胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR4胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，TNFRSF1A胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人TNFRSF1A胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人IL-4RA胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人LAG3胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域的1-20个氨基酸)的多肽；
包含通过跨膜结构域与人CD28胞内结构域连接的人CTLA4胞外结构域或其部分(和任选地，CTLA4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)的多肽；
包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人CD200R胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域或其部分)的多肽；
包含通过跨膜结构域与人CD28胞内结构域连接的人DR5胞外结构域或其部分(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)的多肽；
包含IL21R蛋白、LAT1蛋白、BATF蛋白、BATF3蛋白、BATF2蛋白、ID2蛋白、ID3蛋白、IRF8蛋白、MYC蛋白、POU2F1蛋白、TFAP4蛋白、SMAD4蛋白、NFATC1蛋白、EZH2蛋白、EOMES蛋白、SOX5蛋白、IRF2BP2蛋白、SOX3蛋白、PRDM1蛋白或RELB蛋白的多肽，
其中所述一种或多种多肽由插入所述细胞靶基因组基因座中的异源性核酸构建体编码，任选地，其中所述靶基因组基因座是细胞的T细胞受体(TCR)基因座，任选地，其中所述异源性核酸构建体以非病毒的方式插入。
2.如权利要求1所述的人T细胞，其中，所述T细胞异源表达包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:99、SEQID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105。
3.如权利要求1或2所述的人T细胞，其中，靶插入位点位于TCR-α亚基恒定基因(TRAC)的外显子1中。
4.如权利要求1或2所述的人T细胞，其中，靶插入位点位于TCR-β亚基恒定基因(TRBC)的外显子1中。
5.如权利要求4所述的人T细胞，其中，所述TRBC是TRBC1或TRBC2。
6.如权利要求1-4中任一项所述的人T细胞，其中，所述异源性核酸构建体包含与选自SEQ ID NO:1-32、98、100、102和104的核酸序列至少95％相同的核酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的人T细胞，其中，所述T细胞表达识别靶抗原的抗原特异性T细胞受体(TCR)或合成抗原受体。
8.如权利要求7所述的人T细胞，其中，所述合成抗原受体是CAR或SynNotch受体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的人T细胞，其中，所述T细胞是调节T细胞、效应T细胞、记忆T细胞或原初T细胞。
10.如权利要求9所述的人T细胞，其中，所述效应T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
11.如权利要求10所述的人T细胞，其中，所述效应T细胞是CD8+CD4+T细胞。
12.如权利要求1-11中任一项所述的人T细胞，其中，所述T细胞是原代细胞。
13.如权利要求1-12中任一项所述的人T细胞，其中，所述核酸构建体编码：
(i)第一自切割肽序列；
(ii)第一异源性TCR亚基链，其中所述TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；
(iii)第二自切割肽序列；
(iv)与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列：SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105；
(v)第三自切割肽序列；
(vi)第二异源性TCR亚基链的可变区；和
(vii)内源性TCR亚基的N末端的部分，其中，如果细胞的内源性TCR亚基为TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链且第二异源性TCR亚基链为异源性TCR-α亚基链，并且其中，如果细胞的内源性TCR亚基是TCR-β亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。
14.如权利要求1-12中任一项所述的人T细胞，其中，所述异源性核酸构建体编码：
(i)第一自切割肽序列；
(ii)与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列：SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105；
(iii)第二自切割肽序列；
(iv)第一异源性TCR亚基链，其中所述TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；
(v)第三自切割肽序列；
(vi)第二异源性TCR亚基链的可变区；和
(vii)内源性TCR亚基的N末端的部分，其中，如果细胞的内源性TCR亚基为TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中，如果细胞的内源性TCR亚基为TCR-β亚基，那么第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。
15.如权利要求1-12中任一项所述的人T细胞，其中，所述核酸构建体以下述顺序编码：
(i)第一自切割肽序列；
(ii)与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列：SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105；
(iii)第二自切割肽序列；
(iv)合成的抗原受体；和
(v)第三自切割肽序列或多聚A序列。
16.如权利要求1-12中任一项所述的人T细胞，其中，所述核酸构建体以下述顺序编码：
(i)第一自切割肽序列；
(ii)合成的抗原受体；
(iii)第二自切割肽序列；
(iv)与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列：SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105；和
(v)第三自切割肽序列或多聚A序列。
17.如权利要求15或16所述的人T细胞，其中，所述合成抗原受体是CAR或SynNotch受体。
18.一种包含编码多肽的核酸序列的核酸，所述多肽包含与选自下组的蛋白质至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:40、SEQID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
19.如权利要求18所述的核酸，其中，所述核酸包含与人TCR基因座具有同源性的侧接同源臂序列。
20.一种包含权利要求18或权利要求19所述核酸的人T细胞。
21.一种以下述顺序编码的核酸构建体：
(i)第一自切割肽序列；
(ii)第一异源性TCR亚基链，其中所述TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；
(iii)第二自切割肽序列；
(iv)与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列：SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105；
(v)第三自切割肽序列；
(vi)第二异源性TCR亚基链的可变区；和
(vii)内源性T细胞TCR亚基的N末端的部分，其中，如果内源性TCR亚基为TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，则第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中，如果内源性TCR亚基是TCR-β亚基，则第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。
22.如权利要求21所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含与选自下组的核酸序列至少95％相同的核酸序列：SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:32、98、100、102和104。
23.一种修饰人T细胞的方法，包括：
(a)向所述人T细胞引入：
(i)切割人T细胞TCR基因座中靶区域以在细胞基因组中产生靶插入位点的靶向核酸酶；和
(ii)编码选自下组的一种或多种多肽的核酸构建体：
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，Fas胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人Fas胞外结构域或其部分的多肽；
包含通过跨膜结构域与人OX40胞内结构域(和任选地，TNFRSF12胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人TNFRSF12胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人OX44胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域的多肽；
截短的人LTBR蛋白，其包含人LTBR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；
截短的人TNFRSF12蛋白，其包含人TNFRSF12胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；
截短的人BTLA蛋白，其包含人BTLA胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的约1-10个(例如7个)氨基酸；
包含通过跨膜结构域与人4-1BB胞内结构域(和任选地，LAG3胞内结构域的1-10个(例如，7个)氨基酸)连接的人LAG-3胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR5胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，DR4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人DR4胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，TNFRSF1A胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人TNFRSF1A胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人IL-4R胞内结构域(和任选地，LTBR胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)连接的人LTBR胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人IL-4RA胞外结构域的多肽；
包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人LAG3胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域的1-20个氨基酸)的多肽；
包含通过跨膜结构域与人CD28胞内结构域连接的人CTLA4胞外结构域或其部分(和任选地，CTLA4胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)的多肽；
包含通过跨膜结构域与人ICOS胞内结构域连接的人CD200R胞外结构域或其部分(和任选地，ICOS胞外结构域或其部分)的多肽；
包含通过跨膜结构域与人CD28胞内结构域连接的人DR5胞外结构域或其部分(和任选地，DR5胞内结构域的1-10个(例如7个)氨基酸)的多肽；
包含IL21R蛋白、LAT1蛋白、BATF蛋白、BATF3蛋白、BATF2蛋白、ID2蛋白和ID3蛋白、IRF8蛋白、MYC蛋白、POU2F1蛋白、TFAP4蛋白、SMAD4蛋白、NFATC1蛋白、EXH2蛋白、EOMES蛋白、SOX5蛋白、IRF2BP2蛋白、SOX3蛋白、PRDM1蛋白、IL2RA或RELB蛋白的多肽；
(b)允许发生重组，从而将核酸构建体插入靶插入位点以产生经修饰的人T细胞。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述多肽包含与选自下组的蛋白质至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述核酸构建体是权利要求22所述的核酸构建体。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中，所述靶插入位点位于TCR-α亚基恒定基因(TRAC)的外显子1中或TCR-β亚基恒定基因(TRBC)的外显子1中。
27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中，所述核酸构建体通过将包含所述核酸构建体的病毒载体引入细胞插入。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述靶向核酸酶选自RNA向导的核酸酶结构域，转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，锌指核酸酶(ZFN)和megaTAL。
29.如权利要求28所述的方法，其中，将所述靶向核酸酶、向导RNA和DNA模板作为核糖核蛋白复合物(RNP)-DNA模板复合物引入细胞中，其中所述RNP-DNA模板复合物包含：
(i)所述RNP，其中所述RNP包含所述靶向核酸酶和所述向导RNA；和
(ii)所述核酸构建体。
30.如权利要求22-29中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是调节T细胞、效应T细胞、记忆T细胞或原初T细胞。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述效应T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述效应T细胞是CD8+CD4+T细胞。
33.如权利要求22-32中任一项所述的方法，其中，所述细胞是原代细胞。
34.一种通过权利要求22-33中任一项所述的方法产生的经修饰的T细胞。
35.一种增强人对象免疫应答的方法，包括向所述对象给予权利要求1-16、20或34中任一项所述的T细胞。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述T细胞表达识别所述对象中靶抗原的抗原特异性TCR或合成抗原受体。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中，所述人对象患有癌症并且所述靶抗原是癌症特异性抗原。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述人对象患有实体瘤。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中，所述T细胞表达包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与Fas-OX40(SEQ ID NO:33)、
TNFRSF12-OX40(SEQ ID NO:34)、LTBR-OX40(SEQ ID NO:35)、LTBRtrunc(SEQ ID NO:36)、TNFRSF12trunc(SEQ ID NO:37)、IL-21R(SEQ ID NO:38)、LAT1(SEQ ID NO:39)BATF(SEQ ID NO:47)、BATF3 9(SEQ ID NO:48)、BATF2(SEQ ID NO:49)、ID2(SEQ ID NO:50)、ID3(SEQ ID NO:51)、IRF8(SEQ ID NO:52)、MYC(SEQ ID NO:53)、POU2F1(SEQ ID NO:54)、TFAP4(SEQ ID NO:55)或SMAD4(SEQ ID NO:56)至少95％相同。
40.如权利要求37或38所述的方法，其中，所述T细胞表达包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与LAG3/4-1BB(SEQ ID NO:40)、DR5-IL-4R(SEQ ID NO:41)、DR4-IL-4R(SEQ IDNO:42)、TNFRSF1A-IL-4R(SEQ ID NO:43)、LTBR-IL-4R(SEQ ID NO:44)、IL-4RA-ICOS(SEQID NO:45)、LAG-3ICOS(SEQ ID NO:46)、NFATC1(SEQ ID NO:57)、EZH2(SEQ ID NO:58)、EOMES(SEQ ID NO:59)、SOX5(SEQ ID NO:60)、IRF2BP2(SEQ ID NO:61)、SOX3(SEQ ID NO:62)、PRDM1(SEQ ID NO:63)或RELB(SEQ ID NO:64)至少95％相同。
41.如权利要求35或36所述的方法，其中，所述人对象患有感染。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述T细胞表达包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与Fas-OX40(SEQ ID NO:33)、TNFRSF12-OX40(SEQ ID NO:34)、LTBR-OX40(SEQ IDNO:35)、LTBRtrunc(SEQ ID NO:36)、TNFRSF12trunc(SEQ ID NO:37)、IL-21R(SEQ ID NO:38)、LAT1(SEQ ID NO:39)BATF(SEQ ID NO:47)、BATF3 9(SEQ ID NO:48)、BATF2(SEQ IDNO:49)、ID2(SEQ ID NO:50)、ID3(SEQ ID NO:51)、IRF8(SEQ ID NO:52)、MYC(SEQ ID NO:53)、POU2F1(SEQ ID NO:54)、TFAP4(SEQ ID NO:55)或SMAD4(SEQ ID NO:56)至少95％相同。
43.如权利要求35或36所述的方法，其中，所述人对象患有自身免疫性疾病并且所述抗原是与自身免疫性疾病、过敏性疾病或移植排斥相关的抗原。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述T细胞表达包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与LAG3/4-1BB(SEQ ID NO:40)、DR5-IL-4R(SEQ ID NO:41)、DR4-IL-4R(SEQ ID NO:42)、TNFRSF1A-IL-4R(SEQ ID NO:43)、LTBR-IL-4R(SEQ ID NO:44)、IL-4RA-ICOS(SEQ IDNO:45)、LAG-3ICOS(SEQ ID NO:46)、NFATC1(SEQ ID NO:57)、EZH2(SEQ ID NO:58)、EOMES(SEQ ID NO:59)、SOX5(SEQ ID NO:60)、IRF2BP2(SEQ ID NO:61)、SOX3(SEQ ID NO:62)、PRDM1(SEQ ID NO:63)或RELB(SEQ ID NO:64)至少95％相同。
45.如权利要求35-44中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是自体同源的。
46.如权利要求35-44中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是同种异体的。
47.如权利要求35-44中任一项所述的方法，其中所述T细胞是iPSC衍生的T细胞。
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