CN112512557A - 用于浆细胞耗竭的抗bcma car-t-细胞 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于受控浆细胞耗竭、诸如用于治疗与浆细胞相关的各种疾病和病况的组合物和方法。

Description

用于浆细胞耗竭的抗BCMA CAR-T-细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年4月27日提交的美国临时专利申请号62/663,974和2018年11月29日提交的美国临时专利申请号62/773,058的优先权权益，所述美国临时专利申请各自的公开内容以其整体通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述ASCII拷贝，在2019年4月26日创建，命名为052984-515001WO_SL_ST25.txt，且大小为295,038字节。
领域
本公开涉及用于个体中的受控浆细胞耗竭的组合物和方法。具体而言，所述组合物包括用于生成允许控制T细胞的存活和/或增殖的生理功能的合成的化学诱导的信号复合物(CISC)的通用结构。进一步提供了使用此类组合物、诸如用于治疗各种疾病和病况的方法。
背景
嵌合抗原受体(CAR)是工程改造受体，其用于对用于过继细胞免疫疗法中的T细胞进行基因工程改造(参见Pule, M. 等人 (2003). Cytother., 5(3):211-226; Restifo,N. P. 等人 (2012). Nat. Rev. Immunol. 12(4):269-281)。抗原结合刺激CAR的细胞内区段上的信号传导结构域，由此活化信号传导途径。基于CAR的过继细胞免疫疗法已被用于治疗患有常规护理标准治疗难治的肿瘤的癌症患者(参见Grupp, S. A. 等人(2013). N. Engl. J. Med. 368(16):1509-1518; Kalos, M. 等人(2011). Sci. Transl. Med.3(95):95ra73)。
基于CAR的过继细胞免疫疗法也可以用于靶向参与疾病或病况的宿主细胞。例如，对产生抗体的浆细胞特异性的CAR T细胞可以潜在地用于治疗特征在于不良的抗体介导的免疫应答的疾病或病况，诸如自身免疫性疾病或器官移植物排斥。然而，在个体中施用靶向浆细胞的常规CAR T细胞将导致个体中的浆细胞的失控耗竭，这可能导致严重的不利影响，诸如无法对病原体感染应答。仍然需要新的组合物和方法，其允许控制浆细胞的耗竭以允许特征在于不良的抗体产生的疾病和病况的可行治疗。
概述
本文描述了对浆细胞细胞毒性的工程改造的T细胞，其中所述工程改造的T细胞包含允许所述工程改造的T细胞的受控存活和/或增殖的化学诱导的信号传导复合物(CISC)；制备和使用工程改造的T细胞的方法；以及可用于所述方法的组合物。
在一个方面，本文提供了工程改造的T细胞，其包含：a)内源T细胞受体α (TRA)基因，其被修饰以编码非功能性T细胞受体α恒定(TRAC)结构域；和b)编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体(CAR)可以识别B细胞成熟抗原(BCMA)。在一些实施方案中，可以通过调节与所述工程改造的T细胞接触的配体的量来控制所述工程改造的T细胞的存活和/或增殖。
在一些实施方案中，可以识别BCMA的CAR包含细胞外BCMA识别结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述细胞外BCMA识别结构域是可以特异性结合BCMA的抗体部分。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其包含来自SEQ ID NO:55的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2、HC-CDR3、轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。
在一些实施方案中，所述CAR跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述CAR共刺激结构域包含4-1BB和/或CD28共刺激结构域，和/或所述CAR细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，b)编码可以识别BCMA的CAR的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域，或b)编码可以识别BCMA的CAR的核酸被插入内源IL2RG基因。
在一些实施方案中，所述CISC的多肽组分包含：i)第一CISC组分，其包含第一细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分；和ii)第二CISC组分，其包含第二细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分；其中所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置为使得当表达时，它们在配体存在的情况下二聚化以产生有信号传导能力的CISC。
在一些实施方案中，所述第一CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基γ(IL2Rγ)细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述IL2Rγ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分。
在一些实施方案中，所述FKBP结构域包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或其与SEQID NO:47的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第二CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基β(IL2Rβ)细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述IL2Rβ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。
在一些实施方案中，所述FRB包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第一和第二CISC组分的跨膜结构域独立地包含IL-2受体跨膜结构域。
在一些实施方案中，1)一个或多个编码所述第一CISC组分的核酸被插入内源IL2RG基因，且一个或多个编码所述第二CISC组分的核酸被插入内源TRA基因的编码所述TRAC结构域的区域；或2)一个或多个编码所述第一CISC组分的核酸被插入内源TRA基因的编码所述TRAC结构域的区域，且一个或多个编码所述第二CISC组分的核酸被插入内源IL2RG基因。
在一些实施方案中，所述配体是雷帕霉素或雷帕霉素类似物(rapalog)。
在一些实施方案中，所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
在一些实施方案中，所述配体以0.05 nM至100 nM的量存在或提供。
在一些实施方案中，所述细胞进一步包含d)一种或多种编码嵌合受体的核酸，所述嵌合受体包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述嵌合受体跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述嵌合受体共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，和/或所述嵌合受体细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述嵌合受体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:65的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，d)一种或多种编码所述嵌合受体的核酸被插入内源TRA基因的编码所述TRAC结构域的区域，或d)一种或多种编码所述嵌合受体的核酸被插入内源IL2RG基因。
在一些实施方案中，所述细胞进一步包含g)编码可选择标志物的核酸。
在一些实施方案中，所述可选择标志物是截短的低亲和力神经生长因子受体(tLNGFR)多肽。
在一些实施方案中，所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码所述可选择标志物的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域，或编码所述可选择标志物的核酸被插入内源IL2RG基因。
在一些实施方案中，所述细胞进一步包含e)编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸。
在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽赋予对他克莫司(FK506)和/或环孢菌素A (CsA)的抗性。
在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型钙调神经磷酸酶(CN)多肽。
在一些实施方案中，突变型CN多肽赋予对他克莫司(FK506)和环孢菌素A (CsA)的抗性。
在一些实施方案中，所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQ ID NO:67)。
在一些实施方案中，所述编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域，或所述编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸被插入内源IL2RG基因。
在一些实施方案中，所述细胞进一步包含f)编码雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸。
在一些实施方案中，所述FRB结构域多肽在细胞内表达。
在一些实施方案中，所述FRB结构域多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸或与SEQID NO:68或69的氨基酸具有至少90%序列同源性的变体。
在一些实施方案中，编码所述FRB结构域多肽的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域，或编码所述FRB结构域多肽的核酸被插入内源IL2RG基因。
在另一个方面，本文提供了指导RNA (gRNA)，其包含与内源TRA基因中的编码所述TRAC结构域的区域内或附近的序列互补的序列。
在一些实施方案中，所述gRNA包含SEQ ID NO:1-3中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1-3中任一者具有至少85%同源性的变体。
在另一个方面，本文提供了指导RNA (gRNA)，其包含与内源IL2RG基因内或附近的序列互补的序列。
在一些实施方案中，所述gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:4-18中任一者具有至少85%同源性的变体。
在另一个方面，本文提供了系统，其包含：a)第一gRNA和/或第二gRNA，其中所述第一gRNA是根据上述实施方案中任一项的gRNA，且所述第二gRNA是根据上述实施方案中任一项的gRNA；且b) RNA-指导的核酸内切酶(RGEN)或编码RGEN的核酸。
在一些实施方案中，所述系统进一步包含：c)一种或多种供体模板，其包含编码以下的核酸：i)可以识别B细胞成熟抗原(BCMA)多肽的CAR；ii)第一CISC组分，其包含第一细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分或其功能衍生物；和iii)第二CISC组分，其包含第二细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分，其中所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置为使得当由T细胞表达时，它们在配体存在的情况下二聚化以产生能够促进T细胞的存活和/或增殖的有信号传导能力的CISC。
在一些实施方案中，所述可以识别BCMA的CAR包含细胞外BCMA识别结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述细胞外BCMA识别结构域是可以特异性结合BCMA的抗体部分。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其包含来自SEQ ID NO:55的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2、HC-CDR3、轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。
在一些实施方案中，所述CAR跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述CAR共刺激结构域包含4-1BB和/或CD28共刺激结构域，和/或所述CAR细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述第一CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基γ(IL2Rγ)结构域。
在一些实施方案中，所述IL2Rγ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分。
在一些实施方案中，所述FKBP结构域包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或其与SEQID NO:47的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第二CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基β(IL2Rβ)结构域。
在一些实施方案中，所述IL2Rβ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。
在一些实施方案中，所述FRB包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第一和第二CISC组分的跨膜结构域独立地包含IL-2受体跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述配体是雷帕霉素或rapalog。
在一些实施方案中，所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
在一些实施方案中，c)一种或多种供体模板进一步包含编码以下中的一种或多种的核酸：iv)包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域的嵌合受体；v)可选择标志物；vi)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；或vii)雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽。
在一些实施方案中，所述嵌合受体跨膜结构域包含CD8跨膜结构域多肽，所述嵌合受体共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，和/或所述嵌合受体细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述嵌合受体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:65的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述可选择标志物是截短的低亲和力神经生长因子受体(tLNGFR)多肽。
在一些实施方案中，所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型钙调神经磷酸酶(CN)多肽。
在一些实施方案中，所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQ ID NO:67)。
在一些实施方案中，所述FRB结构域多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸或与SEQID NO:68或69的氨基酸具有至少90%序列同源性的变体。
在一些实施方案中，所述RGEN选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1核酸内切酶或其功能衍生物。
在一些实施方案中，所述RGEN是Cas9。
在一些实施方案中，编码RGEN的核酸是核糖核酸(RNA)序列。
在一些实施方案中，所述编码RGEN的RNA序列经由共价键连接至所述第一gRNA或所述第二gRNA。
在一些实施方案中，所述系统包含腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒(AAV)载体包含一种或多种供体模板之一。
在一些实施方案中，所述AAV载体包含SEQ ID NO:19-46中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:19-46中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述系统包含所述第一gRNA和第一AAV载体以及所述第二gRNA和第二AAV载体，其中(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述系统包含： (A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述系统包含：(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:25的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ IDNO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:26的多核苷酸序列或其与SEQID NO:26的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:27的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:27的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述系统包含核糖核蛋白(RNP)复合物，所述核糖核蛋白(RNP)复合物包含RGEN和第一gRNA和/或第二gRNA。
在一些实施方案中，将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA分别以1:1至20:1之间的gRNA与RGEN的摩尔比预复合，以形成RNP。
在另一个方面，本文提供了载体，其包含SEQ ID NO:19-46中任一者的核酸序列或其与SEQ ID NO:19-46中任一者具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。
在另一个方面，本文提供了编辑细胞的基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供：a)第一gRNA和/或第二gRNA，其中所述第一gRNA是根据上述实施方案中任一项的gRNA，且所述第二gRNA是根据上述实施方案中任一项的gRNA；b) RGEN或编码RGEN的核酸；和c)一种或多种供体模板，其包含编码以下的核酸：i)可以识别BCMA多肽的CAR；ii)第一CISC组分，其包含第一细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分或其功能衍生物；和iii)第二CISC组分，其包含第二细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分，其中所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置为使得当由T细胞表达时，它们在配体存在的情况下二聚化以产生能够促进T细胞的存活和/或增殖的有信号传导能力的CISC。
在一些实施方案中，可以识别BCMA的CAR包含细胞外BCMA识别结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述细胞外BCMA识别结构域是可以特异性结合BCMA的抗体部分。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其包含来自SEQ ID NO:55的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2、HC-CDR3、轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。
在一些实施方案中，所述CAR跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述CAR共刺激结构域包含4-1BB和/或CD28共刺激结构域，和/或所述CAR细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述第一CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基γ(IL2Rγ)细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述IL2Rγ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分。
在一些实施方案中，所述FKBP结构域包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或其与SEQID NO:47的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第二CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基β(IL2Rβ)细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述IL2Rβ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。
在一些实施方案中，所述FRB结构域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其与SEQID NO:48的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述第一和第二CISC组分的跨膜结构域独立地包含IL-2受体跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
在一些实施方案中，c)一种或多种供体模板进一步包含编码以下中的一种或多种的核酸： iv)嵌合受体，其包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域；v)可选择标志物；vi)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；或vii)雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽。
在一些实施方案中，所述嵌合受体跨膜结构域包含CD8跨膜结构域多肽，所述嵌合受体共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，和/或所述嵌合受体细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述嵌合受体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:65的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述可选择标志物是截短的低亲和力神经生长因子受体(tLNGFR)多肽。
在一些实施方案中，所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型钙调神经磷酸酶(CN)多肽。
在一些实施方案中，所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQ ID NO:67)。
在一些实施方案中，所述FRB结构域多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列具有至少90%序列同源性的变体。
在另一个方面，本文提供了编辑细胞的基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在另一个方面，本文提供了编辑细胞的基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在另一个方面，本文提供了编辑细胞的基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:25的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQID NO:26的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:26的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:27的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:27的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述RGEN选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1核酸内切酶或其功能衍生物。
在一些实施方案中，所述RGEN是Cas9。
在一些实施方案中，编码RGEN的核酸是核糖核酸(RNA)序列。
在一些实施方案中，所述编码RGEN的RNA序列经由共价键连接至所述第一gRNA或所述第二gRNA。
在一些实施方案中，所述供体模板包含在AAV载体中。
在一些实施方案中，在提供给所述细胞之前，将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA预复合，形成RNP复合物。
在一些实施方案中，将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA分别以1:1至20:1之间的gRNA与RGEN的摩尔比预复合。
在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板被独立地插入所述细胞的基因组中。
在一些实施方案中，第一供体模板被插入TRA基因或基因调节元件处、内或附近，和/或第二供体模板被插入IL2RG基因或基因调节元件处、内或附近。
在一些实施方案中，编码i)所述第一CISC组分的核酸被插入内源IL2RG基因，和/或编码ii)所述第二CISC组分的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域；或编码i)所述第一CISC组分的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域；和/或编码ii)所述第二CISC组分的核酸被插入所述内源IL2RG基因。
在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞是CD8+细胞毒性T淋巴细胞或CD3+泛T细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞是源自多个供体的T细胞的合并物的成员。
在一些实施方案中，所述多个供体是人供体。
在一些实施方案中，所述细胞对浆细胞是细胞毒性的。
在另一个方面，本文提供了通过根据上述实施方案中任一项的方法产生的工程改造的细胞。
在一些实施方案中，所述工程改造的细胞对浆细胞是细胞毒性的。
在另一个方面，本文提供了治疗有此需要的受试者中的移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：将根据上述实施方案中任一项的工程改造的细胞施用于所述受试者。
在另一个方面，本文提供了治疗有此需要的受试者中的疾病或病况的方法，其中所述疾病或病况的特征在于不良的抗体产生，所述方法包括：a)根据上述实施方案中任一项的方法编辑T细胞的基因组，由此产生工程改造的T细胞；和b)将工程改造的T细胞施用于所述受试者。
在一些实施方案中，所述T细胞对所述受试者是自体的。
在一些实施方案中，所述T细胞对所述受试者是同种异体的。
在一些实施方案中，所述T细胞包含源自多个供体的T细胞的合并物。
在一些实施方案中，所述多个供体是人供体。
在另一个方面，本文提供了治疗有此需要的受试者中的疾病或病况的方法，其中所述疾病或病况的特征在于不良的抗体产生，所述方法包括根据上述实施方案中任一项的方法编辑所述受试者中的T细胞的基因组。
在一些实施方案中，所述T细胞包含CD8+细胞毒性T细胞或CD3+泛T细胞。
在一些实施方案中，所述受试者是人。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将雷帕霉素或rapalog施用于所述受试者。
在一些实施方案中，所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
在一些实施方案中，所述雷帕霉素或rapalog以0.05 nM至100 nM的浓度施用。
在一些实施方案中，所述疾病或病况是移植物抗宿主病(GvHD)、抗体介导的自身免疫或轻链淀粉样变性。
在一些实施方案中，所述疾病或病况是GvHD，且所述受试者先前已经接受同种异体移植物。
在另一个方面，本文提供了试剂盒，其包含：使用说明书和a)根据上述实施方案中任一项的工程改造的细胞和/或根据上述实施方案中任一项的系统的一种或多种组分；和/或b)雷帕霉素或rapalog。
在一些实施方案中，所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
在另一个方面，本文提供了注射器，其包含：根据上述实施方案中任一项的工程改造的细胞或包含根据上述实施方案中任一项的系统的一种或多种组分的组合物。
在另一个方面，本文提供了导管，其包含：根据上述实施方案中任一项的工程改造的细胞或包含根据上述实施方案中任一项的系统的一种或多种组分的组合物。
在另一个方面，本文提供了根据上述的任何实施方案的工程改造的T细胞，其用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
在另一个方面，本文提供了根据上述的任何实施方案的工程改造的T细胞，其用于制备药物，所述药物用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
在另一个方面，本文提供了根据上述的任何实施方案的系统，其用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
在另一个方面，本文提供了根据上述的任何实施方案的系统，其用于制备药物，所述药物用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
在另一个方面，本文提供了根据上述的任何实施方案的一种或多种gRNA、一种或多种供体模板、试剂盒、注射器和/或导管，其用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
在另一个方面，本文提供了根据上述的任何实施方案的一种或多种gRNA、一种或多种供体模板、试剂盒、注射器和/或导管，其用于制备药物，所述药物用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
附图简述
图1显示供体模板构建体#1-#11的示意图，其描绘所述供体模板构建体中存在的元件(未按比例显示)及其相对位置。5’ HA：5’同源臂；3’ HA：3’同源臂；s pA：合成的聚A信号；SV40 pA：SV40聚A信号；pMSCV：鼠干细胞病毒(MSCV)启动子；CD8 sp：CD8信号肽；CD8tm：CD8跨膜结构域；CD28：CD28共刺激结构域；4-1BB：4-1BB共刺激结构域；CD3z：CD3-ζ细胞质信号传导结构域；WPRE3：土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE) 3；CISCβ：具有FRB结构域和IL2Rβ结构域的CISC亚基；tCISCγ：具有FKBP结构域和IL2Rγ结构域的片段的CISC亚基；β2M CR：β2-微球蛋白嵌合受体；FRB：裸露的FRB结构域多肽；P2A、T2A：自切割肽；ER：内质网信号序列；CNb30：突变型钙调神经磷酸酶多肽；tLNGFR：截短的低亲和力神经生长因子受体。
详述
本文描述了对浆细胞细胞毒性的工程改造的T细胞(其中所述工程改造的T细胞包含允许工程改造的T细胞的受控存活和/或增殖的化学诱导的信号复合物(CISC))，诸如表达赋予对表达BCMA的细胞细胞毒性的抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的工程改造的T细胞，制备和使用工程改造的T细胞的方法，以及可用于所述方法的组合物。
申请人已经开发了一系列新型的CRISPR/Cas系统，用于将编码抗BCMA CAR和/或CISC的异源核酸序列靶向整合至细胞基因组中的TRA基因和/或IL2RG基因中，其中CISC利用在编辑的细胞中整合功能抑制内源TCR和/或IL2RG表达的异源核酸序列，能够在结合雷帕霉素或雷帕霉素类似物后进行IL2R-样信号传导。针对靶上(on-target)和脱靶(off-target)切割分析具有靶向TRA或IL2RG的间隔区序列的指导RNA (gRNA)，并且发现其具有良好的概况，使其成为用于下游用途(例如在基于细胞的疗法中)的候选物。成功编辑原代人CD3+ T细胞以表达抗BCMA CAR和/或CISC，并且编辑的细胞显示内源TCR和/或IL2RG的表达减少。这些发现表明本文所述的CRISPR/Cas系统可用于治疗疾病，例如与表达BCMA的细胞相关的疾病。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文引用的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物都明确地通过引用以其整体并入，除非另有说明。在本文的术语存在多种定义的情况下，以本部分中的定义为准，除非另有说明。
如本文所用，“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可以意指一个/种或多个/种。
当根据说明书阅读时，“约”具有其平常和普通的含义，并且可以例如当指代可测量的值时使用，并且可以意指涵盖从指定值的±20%或±10%、±5%、±l%或±0.1%的变异。
如本文所用，“蛋白序列”是指作为蛋白的一级结构的氨基酸的多肽序列。如本文所用，“上游”是指多核苷酸上的位置的5'位置，以及朝向多肽上的位置的N-末端的位置。如本文所用，“下游”是指核苷酸上的位置的3'位置，以及朝向多肽上的位置的C-末端的位置。因此，术语“N-末端”是指多核苷酸上的元件或位置朝向多肽上的位置的N-末端的位置。
“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸，通过聚合酶链式反应(PCR)生成的片段，以及通过连接、切断、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任一种生成的片段。核酸分子可以由作为天然存在的核苷酸(诸如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合的单体构成。修饰的核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包括，例如，用卤素、烷基、胺和叠氮基替代一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。而且，整个糖部分可以被空间和电子上相似的结构、诸如氮杂糖和碳环糖类似物替代。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶，酰化的嘌呤或嘧啶或其他众所周知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类连接的类似物连接。磷酸二酯连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺基磷酸酯、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包含所谓的“肽核酸”，其包含与聚酰胺主链附接的天然存在的或修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链的。在一些实施方案中，提供了编码融合蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸是RNA或DNA。
本文使用“编码(Coding for)”或“编码(encoding)”，并且是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的核苷酸的特定序列充当用于合成其他大分子、诸如定义序列的氨基酸的模板的特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码该蛋白。
“编码多肽的核酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了核酸，其中所述核酸编码融合蛋白。
“载体”、“表达载体”或“构建体”是用于将异源核酸引入细胞的核酸，所述细胞具有调节元件以提供异源核酸在细胞中的表达。载体包括但不限于质粒、微环、酵母和病毒基因组。在一些实施方案中，所述载体是质粒、微环、酵母或病毒基因组。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，所述载体用于在细菌系统、诸如大肠杆菌中表达蛋白。如本文所用，术语“表达”或“蛋白表达”是指转录的RNA分子翻译成蛋白分子。蛋白表达可以通过其时间、空间、发育或形态学特性以及通过定量或定性标志来表征。在一些实施方案中，表达一种或多种蛋白，使得将蛋白定位用于在配体存在的情况下进行二聚化。
如本文所用，“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是通过接合两个或更多个最初编码单独蛋白或蛋白的一部分的基因而产生的蛋白。所述融合蛋白也可以由来自两个或更多个单独蛋白的特定蛋白结构域构成。该融合基因的翻译可以产生具有源自每个原始蛋白的功能特性的单个或多个多肽。重组融合蛋白可以通过重组DNA技术人工产生，用于生物学研究或治疗中。此类用于产生融合蛋白的方法是本领域技术人员已知的。一些融合蛋白组合整个肽，且因此可以含有原始蛋白的所有结构域，尤其是功能结构域。然而，其他融合蛋白，尤其是非天然存在的那些，仅组合编码序列的部分，且因此并不维持形成它们的亲本基因的原始功能。
如本文所用，术语“调节元件”是指具有基因调节活性的DNA分子，例如，具有影响可操作连接的可转录DNA分子的转录和/或翻译的能力的DNA分子。调节元件、诸如启动子、前导区、内含子和转录终止区是具有基因调节活性并在活细胞中基因的整体表达中发挥必需作用的DNA分子。因此，在植物中发挥功能的分离的调节元件，诸如启动子，可用于通过基因工程改造的方法修饰植物表型。
如本文所用，术语“可操作连接”是指接合至第二分子的第一分子，其中所述分子被布置为使得第一分子影响第二分子的功能。两个分子可以是单一连续分子的一部分，并且可以是相邻的。例如，如果启动子调节细胞中的可转录的目标DNA分子的转录，则该启动子可操作连接至可转录DNA分子。
“启动子”是起始特定基因的转录的DNA区域。启动子可以位于基因的转录起始位点附近，在同一条链上，和DNA上的上游(有义链的5’区域)。该启动子可以是条件型启动子、诱导型启动子或组成型启动子。该启动子可以对细菌、哺乳动物或昆虫细胞蛋白表达特异性的。在一些实施方案中，其中提供了编码融合蛋白的核酸，所述核酸进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，所述启动子对细菌、哺乳动物或昆虫细胞蛋白表达是特异性的。在一些实施方案中，所述启动子是条件型启动子、诱导型启动子或组成型启动子。在其他实施方案中，所述启动子是MND启动子。
如本文所用的“二聚的化学诱导的信号传导复合物”、“二聚的CISC”或“二聚体”是指CISC的两个组分，其可以是或可以不是接合在一起的融合蛋白复合物。“二聚化”是指将两个单独的实体接合在一起成为单个实体的过程。在一些实施方案中，配体或试剂刺激二聚化。在一些实施方案中，二聚化是指同源二聚化，或两个相同实体、诸如两个相同的CISC组分的接合。在一些实施方案中，二聚化是指异源二聚化，或两个不同实体、诸如两个不同和独特的CISC组分的接合。在一些实施方案中，所述CISC组分的二聚化导致细胞信号传导途径。在一些实施方案中，所述CISC组分的二聚化允许细胞或细胞群体的选择性扩增。额外的CISC系统可以包括CISC赤霉素CISC二聚化系统或SLF-TMP CISC二聚化系统。可以使用其他化学诱导的二聚化(CID)系统和组成部分。
如本文所用，“化学诱导的信号传导复合物”或“ CISC”是指工程改造的复合物，其将信号作为配体诱导的二聚化的直接结果而引发进入细胞内部。CISC可以是同源二聚体(两个相同组分的二聚化)或异源二聚体(两个不同组分的二聚化)。因此，如本文所用，术语“同源二聚体”是指本文所述的具有相同氨基酸序列的两个蛋白组分的二聚体。术语“异源二聚体”是指本文所述的不同氨基酸序列的两个蛋白组分的二聚体。
CISC可以是如本文更详细描述的合成复合物。如本文所用的“合成的”是指如本文所述的复合物、蛋白、二聚体或组合物，其不是天然的或在自然界中不存在。在一些实施方案中，IL2R-CISC是指涉及白介素-2受体组分的信号传导复合物。在一些实施方案中，IL2/15-CISC是指涉及由白介素-2和白介素-15共享的受体信号传导亚基的信号传导复合物。在一些实施方案中，IL7-CISC是指涉及白介素-7受体组分的信号传导复合物。因此，可以根据构成给定CISC的组分的组分部分来命名CISC。本领域技术人员将认识到，化学诱导的信号传导复合物的组分部分可以由可用于并入CISC的天然或合成的组分构成。因此，本文提供的实例并不意欲限制。
如本文所用，“细胞因子受体”是指识别并结合细胞因子的受体分子。在一些实施方案中，细胞因子受体涵盖修饰的细胞因子受体分子(例如，“变体细胞因子受体”)，包含具有对细胞因子受体氨基酸和/或核酸序列的取代、缺失和/或添加的那些。因此，意欲该术语涵盖野生型以及重组的、合成产生的和变体的细胞因子受体。在一些实施方案中，所述细胞因子受体是融合蛋白，其包含细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述受体的组分(即，受体的结构域)是天然的或合成的。在一些实施方案中，所述结构域是人衍生的结构域。
如本文所用的“FKBP”是FK506结合蛋白结构域。FKBP是指具有脯氨酰异构酶活性并且与亲环蛋白在功能上相关(尽管在氨基酸序列不相关)的蛋白家族。FKBP已经在从酵母至人的许多真核生物中鉴定到，并且作为含有脯氨酸残基的蛋白的蛋白折叠伴侣发挥功能。与亲环蛋白一起，FKBP属于抑免蛋白家族。术语FKBP包括例如FKBP12以及由基因AIP；AIPL1；FKBP1A；FKBP1B；FKBP2；FKBP3；FKBP5；FKBP6；FKBP7；FKBP8；FKBP9；FKBP9L；FKBP10；FKBP11；FKBP14；FKBP15；FKBP52；和/或LOC541473编码的蛋白；包括其同源物及其功能蛋白片段。
如本文所用的“FRB”作为FKBP雷帕霉素结合结构域。FRB结构域是多肽区域(蛋白“结构域”)，其配置为与FKBP蛋白及雷帕霉素或其rapalog形成三元复合物。FRB结构域存在于许多天然存在的蛋白、包括来自人和其他物种的mTOR蛋白(在文献中也称为FRAP、RAPT 1或RAFT)；酵母蛋白，包括Tor1和/或Tor2；和假丝酵母FRAP同源物。FKBP和FRB两者均为雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)信号转导中的主要成分。
“裸露的FKBP雷帕霉素结合结构域多肽”或“裸露的FRB结构域多肽”(其也可以成为“FKBP雷帕霉素结合结构域多肽”或“FRB结构域多肽”)是指仅包含FRB结构域或如下蛋白的氨基酸的多肽，其中所述蛋白的约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸是FRB结构域的氨基酸。所述FRB结构域可以表达为12 kDa可溶性蛋白(Chen, J.等人 (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92(11):4947-4951)。所述FRB结构域形成四个螺旋束，球状蛋白中常见的结构基序。其总体尺寸为30 Å X 45 Å X 30 Å，并且所有四个螺旋都具有与细胞色素b562折叠相似的短下手连接(underhand connection) (Choi,J. 等人 (1996). Science, 273(5272):239-242)。在一些实施方案中，裸露的FRB结构域包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的方法中使用的免疫调节性酰亚胺药物可以包括：沙利度胺(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。沙利度胺可以包括Immunoprin、Thalomid、Talidex、Talizer、Neurosedyn、α-(N-邻苯二甲酰亚胺基)戊二酰亚胺、2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-2,3-二氢-1H-异吲哚-1,3-二酮)；泊马利度胺(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。泊马利度胺可以包括Pomalyst、Imnovid、(RS)-4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮)；来那度胺(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。来那度胺可以包括Revlimid、(RS)-3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮)；或apremilast(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。Apremilast可以包括Otezla、CC-10004、N-{2-[(1S)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)乙基]-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基}乙酰胺)；或其任何组合。
如本文所用，术语“细胞外结合结构域”是指复合物的结构域，其在细胞外部，且被配置为结合特定的原子或分子。在一些实施方案中，CISC的细胞外结合结构域是FKBP结构域或其部分。在一些实施方案中，所述细胞外结合结构域是FRB结构域或其部分。在一些实施方案中，所述细胞外结合结构域被配置为结合配体或试剂，由此刺激两个CISC组分的二聚化。在一些实施方案中，所述细胞外结合结构域被配置为结合细胞因子受体调节剂。
如本文所用，术语“细胞因子受体调节剂”是指这样的试剂，其调节细胞因子受体的下游靶标的磷酸化，与细胞因子受体相关的信号转导途径的活化，和/或特定蛋白、诸如细胞因子的表达。这种试剂可以直接或间接地调节细胞因子受体的下游靶标的磷酸化，与细胞因子受体相关的信号转导途径的活化，和/或特定蛋白、诸如细胞因子的表达。因此，细胞因子受体调节剂的实例包括但不限于细胞因子、细胞因子的片段、融合蛋白和/或抗体或其结合部分，其免疫特异性结合细胞因子受体或其片段。此外，细胞因子受体调节剂的实例包括但不限于肽、多肽(例如，可溶性细胞因子受体)、融合蛋白和/或抗体或其结合部分，其免疫特异性结合细胞因子或其片段。
如本文所用，术语“活化”是指目标蛋白的至少一种生物学活性的增加。类似地，术语“活化”是指目标蛋白的状态处于增加的活性状态中。术语“可活化的”是指目标蛋白在信号、试剂、配体、化合物或刺激存在的情况下变得被活化的能力。在一些实施方案中，如本文所述的二聚体在信号、试剂、配体、化合物或刺激存在的情况下被活化，并变为有信号传导能力的二聚体。如本文所用，术语“有信号传导能力的”是指二聚体能够起始或维持下游信号传导途径的能力或构型。
如本文所用，术语“铰链结构域”是指将细胞外结合结构域与跨膜结构域连接并且可以为细胞外结合结构域赋予柔性的结构域。在一些实施方案中，所述铰链结构域将细胞外结构域定位为接近质膜，以使被抗体或其结合片段识别的潜能最小化。在一些实施方案中，所述细胞外结合结构域位于铰链结构域的N-末端。在一些实施方案中，所述铰链结构域可以是天然的或合成的。
如本文所用，术语“跨膜结构域”或“TM结构域”是指在膜中、诸如在细胞膜中稳定的结构域。本文还使用术语“跨膜跨越”、“整合蛋白”和“整合结构域”。在一些实施方案中，所述铰链结构域和所述细胞外结构域位于所述跨膜结构域的N-末端。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是天然或合成结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是IL-2受体跨膜结构域。
如本文所用，术语“信号传导结构域”是指融合蛋白或CISC组分的结构域，其参与细胞、诸如哺乳动物细胞内部的信号传导级联。信号传导结构域是指向细胞、诸如T细胞提供信号的信号传导部分，所述信号，除了由例如TCR/CD3复合物的CD3ζ链提供的主要信号以外，还介导细胞应答，诸如T细胞应答，包括但不限于活化、增殖、分化和/或细胞因子分泌。在一些实施方案中，所述信号传导结构域在所述跨膜结构域、铰链结构域和细胞外结构域的N-末端。在一些实施方案中，所述信号传导结构域是合成或天然的结构域。在一些实施方案中，所述信号传导结构域是连结的细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述信号传导结构域是细胞因子信号传导结构域。在一些实施方案中，所述信号传导结构域是抗原信号传导结构域。在一些实施方案中，所述信号传导结构域是白介素-2受体亚基γ (IL2Rγ或IL2RG)结构域。在一些实施方案中，所述信号传导结构域是白介素-2受体亚基β (IL2Rβ或IL2RB)结构域。在一些实施方案中，由于所述CISC组分的二聚化，试剂或配体与细胞外结合结构域的结合通过信号传导途径的活化经由信号传导结构域引起信号转导。如本文所用，术语“信号转导”是指通过配体或试剂与细胞外结构域的结合来活化信号传导途径。信号的活化是细胞外结构域与配体或试剂结合的结果，导致CISC二聚化。
如本文所用，术语“IL2RB”或“IL2Rβ”是指白介素-2受体亚基β。类似地，术语“IL2RG”或“IL2Rγ”是指白介素-2受体亚基γ，且术语“IL2RA”或“IL2Rα”是指白介素-2受体亚基α。IL-2受体具有三种形式或链，α、β和γ，其也是其他细胞因子的受体的亚基。IL2Rβ和IL2Rγ是I型细胞因子受体家族的成员。如本文所用的“IL2R”是指白介素-2受体，其参与T细胞介导的免疫应答。IL2R参与受体介导的内吞作用和来自白介素2的有丝分裂信号的转导。类似地，术语“IL-2/15R”是指IL-2和IL-15共享的受体信号传导亚基，并且可能包括亚基α (IL2/15Ra或IL2/15Rα)、β (IL2/15Rb或IL2/15Rβ或γ (IL2/15Rg或IL2/15Rγ)。
在一些实施方案中，化学诱导的信号传导复合物是包含两个组分的异源二聚化活化的信号传导复合物。在一些实施方案中，所述第一组分包含作为异源二聚化对的一部分的细胞外结合结构域，任选的铰链结构域，跨膜结构域和一个或多个连结的细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述第二组分包含作为异源二聚化对的另一部分的细胞外结合结构域，任选的铰链结构域，跨膜结构域和一个或多个连结的细胞质信号传导结构域。因此，在一些实施方案中，存在两个不同的修饰事件。在一些实施方案中，两个CISC组分在细胞、诸如哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，使所述细胞、诸如哺乳动物细胞或细胞群体、诸如哺乳动物细胞群体与引起异源二聚化的配体或试剂接触，由此引发信号。在一些实施方案中，同源二聚化对二聚化，由此单一CISC组分在细胞、诸如哺乳动物细胞中表达，并且CISC组分同源二聚化以引发信号。
如本文所用，术语“配体”或“试剂”是指具有期望的生物学效应的分子。在一些实施方案中，配体被细胞外结合结构域识别并结合，形成包含所述配体和两个结合CISC组分的三元复合物。配体包括但不限于蛋白分子，包括但不限于肽、多肽、蛋白、翻译后修饰的蛋白、抗体、其结合部分；小分子(小于1000道尔顿)、无机或有机化合物；和核酸分子，包括但不限于双链或单链DNA，或双链或单链RNA(例如，反义、RNAi等)，适体以及三螺旋核酸分子。配体可以源自或获得自任何已知生物体(包括但不限于动物(例如，哺乳动物(人和非人哺乳动物))、植物、细菌、真菌和原生生物或病毒)，或者合成分子的文库。在一些实施方案中，所述配体是蛋白、抗体或其部分、小分子或药物。在一些实施方案中，所述配体是雷帕霉素或雷帕霉素类似物(rapalog)。在一些实施方案中，所述rapalog包括雷帕霉素的变体，其相对于雷帕霉素具有以下修饰的一种或多种：在C7、C42和/或C29处的甲氧基的去甲基化、消除或替代；在C13、C43和/或C28处的羟基的消除、衍生化或替代；在C14、C24和/或C30处的酮的还原、消除或衍生化；用5-元脯氨酰基环替代6-元哌啶环(pipecolate ring)；和在环己基环上的替代取代或用取代的环戊基环替代环己基环。因此，在一些实施方案中，所述rapalog是依维莫司、merilimus、novolimus、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、奥莫莫司、佐他莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP23573或AP1903或其代谢物、衍生物和/或其组合。在一些实施方案中，所述配体是IMID类药物(例如沙利度胺、泊马度胺、来那度胺或相关类似物)。
因此，在一些实施方案中，本文所述的方法中用于化学诱导信号传导复合物的配体或试剂可以包括：雷帕霉素(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。雷帕霉素可以包括西罗莫司、Rapamune、(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E, 21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-十六氢-9,27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-23,27-环氧-3H-吡啶[2,1-c][1,4]氧杂氮杂-环三十一碳-1,5,11,28,29 (4H,6H,31H)-五酮)；依维莫司(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。依维莫司可以包括RAD001、Zortress、Certican、Afinitor、Votubia 、42-O-(2-羟乙基)雷帕霉素、(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]丙烷-2-基]-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.0(4,9)]三十六-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮)；merilimus (包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。Merilimus可以包括SAR943、42-O-(四氢呋喃-3-基)雷帕霉素(Merilimus-1)；42-O-(氧杂环丁-3-基)雷帕霉素(Merilimus-2)，42-O-(四氢吡喃-3-基)雷帕霉素(Merilimus-3)，42-O-(4-甲基, 四氢呋喃-3-基)雷帕霉素，42-O-(2,5,5 -三甲基, 四氢呋喃-3-基)雷帕霉素，42-O-(2,5-二乙基-2-甲基, 四氢呋喃-3-基)雷帕霉素，42-O-(2H-吡喃-3-基, 四氢-6-甲氧基-2-甲基)雷帕霉素或42-O-(2H-吡喃-3-基, 四氢-2,2-二甲基-6-苯基)雷帕霉素)；novolimus (包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。Novolimus可以包括16-O-去甲基雷帕霉素)；吡美莫司(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。吡美莫司可以包括Elidel，(3S,4R,5S,8R,9E,12S,14S,15R, 16S,18R,19R,26aS)-3-((E)-2-((1R,3R,4S)-4-氯-3-甲氧基-环己基)-1-甲基乙烯基)-8-乙基5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,26,26a十六氢-5,19-环氧-3H-吡啶并(2,1-c)(1,4)-氧杂氮杂环二十三碳-1,17,20,21(4H,23H)-四酮-33-表-氯-33-脱氧子囊霉素)；地磷莫司(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。地磷莫司可以包括AP23573、MK-8669、地福莫司(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-12-((1R)-2-((1S,3R,4R)-4-((二甲基膦酰基)氧基)-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙基)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂三环-(30.3.1.04,9)三十六碳-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮)；他克莫司(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。他克莫司可以包括FK-506、富士霉素、Prograf、Advagraf、protopic、3S-[3R*[E(1S*,3S*,4S*)], 4S*,5R*,8S*,9E,12R*,14R*,15S*,16R*,18S*,19S*,26aR*5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26a-十六氢-5,19-二羟基-3-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基] -14,16-二甲氧基-4,10,12,18-四甲基-8-(2-丙烯基)-15,19-环氧-3H-吡啶[2,1-c] [1,4]氧杂氮杂环二十三碳-1,7,20,21(4H,23H)-四酮，一水合物)；替西罗莫司(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。替西罗莫司可以包括CCI-779、CCL-779、Torisel、(1R,2R,4S)-4-{(2R)-2-[(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,27-二羟基-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-1,5,11,28,29-五氧代-1,4,5,6,9,10,11,12,13,14,21, 22,23,24,25,26,27,28,29,31,32,33,34,34a-二十四氢-3H-23,27-环氧吡啶并[2,1-c][1,4]-氧杂氮杂环三十一碳-3-基]丙基}-2-甲氧基环己基3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸酯)；奥莫莫司(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。奥莫莫司可以包括Biolimus、Biolimus A9、BA9、TRM-986、42-O-(2-乙氧基乙基)雷帕霉素)；佐他莫司(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐；佐他莫司可以包括ABT-578、(42S)-42-脱氧-42-(1H-四唑-1-基)-雷帕霉素；C20-甲代烯丙基雷帕霉素(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。C20-甲代烯丙基雷帕霉素可以包括C20-Marap)；C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素(包括类似物，衍生物和药学上可接受的盐。C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素可以包括C16-iRap。AP21967(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。AP21967可以包括C-16-(S)-7-甲基吲哚雷帕霉素)；霉酚酸钠(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。霉酚酸钠可以包括CellCept、Myfortic、(4E)-6-(4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)-4-甲基己-4-烯酸)；盐酸贝尼地平(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。盐酸贝尼地平可以包括贝尼地平、Coniel)；或AP1903(包括类似物、衍生物，且包括其药学上可接受的盐。AP1903可以包括Rimiducid、[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[3-[2-[2-[[2-[3-[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羰基[氧基丙基]-苯氧基]-乙酰基]氨基]乙基氨基]-2-氧代乙氧基]苯基]丙基](2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基-苯基)丁酰基]哌啶-2-甲酸酯)；或其任何组合。
如本文所用，术语“赤霉素”是指二萜酸的合成或天然存在的形式，其通过质体中的萜类途径合成，且然后在内质网和胞质溶胶中被修饰，直至它们达到其生物活性形式。赤霉素可以是天然赤霉素或其类似物，包括例如衍生自对映-赤霉烷骨架或经由对映-贝壳杉烯(ent-kauren)合成的赤霉素，包括赤霉素1 (GA1), GA2, GA3 . . . GA136及其类似物和衍生物。在一些实施方案中，赤霉素或其类似物或衍生物用于CISC二聚化。
如本文所用，“SLF-TMP”或“与甲氧苄啶连接的FKBP的合成配体”是指用于CISC二聚化的二聚化剂。在一些实施方案中，所述SLF部分结合第一CISC组分，且TMP部分结合第二CISC组分，引起CISC二聚化。在一些实施方案中，SLF可以结合例如FKBP，且TMP可以结合大肠杆菌二氢叶酸还原酶(eDHFR)。
如本文所用，术语“同时结合”是指配体被两个或更多个CISC组分同时或在一些情况下实质上同时结合，以形成包含CISC组分和配体组分的多组分复合物，且导致随后的信号活化。同时结合需要将CISC组分在空间上配置以结合单一配体，并且还需要将两个CISC组分配置为结合相同配体，包括结合相同配体上的不同部分。
如本文所用，术语“选择性扩增”是指期望的细胞、诸如哺乳动物细胞或期望的细胞群体、诸如哺乳动物细胞群体扩增的能力。在一些实施方案中，选择性扩增是指已经经历两个基因修饰事件的纯细胞群体、诸如哺乳动物细胞的生成或扩增。二聚化CISC的一个组分是一种修饰的部分，且另一组分是另一种修饰。因此，异源二聚化CISC的一个组分与每个基因修饰相关。将细胞暴露于配体允许仅选择性扩增具有两种期望修饰的细胞、诸如哺乳动物细胞。因此，在一些实施方案中，将能够响应于与配体接触的唯一细胞，诸如哺乳动物细胞，是表达异源二聚化CISC的两个组分的那些。
如本文所用，“宿主细胞”包括易于用核酸构建体或载体转化、转染或转导的任何细胞类型，诸如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞，诸如哺乳动物细胞，是T细胞或T调节细胞(Treg)。在一些实施方案中，所述宿主细胞，诸如哺乳动物细胞，是造血干细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是CD3+、CD8+或CD4+细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是CD8+ T细胞毒性淋巴细胞，其选自幼稚CD8+ T细胞、中央记忆CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和主体CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是CD4+ T辅助淋巴细胞，其选自幼稚CD4+ T细胞、中央记忆CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和主体CD4+ T细胞。如本文所用，术语“细胞群体”是指细胞、诸如哺乳动物细胞的组，其包含多于一个细胞。在一些实施方案中，制造细胞，诸如哺乳动物细胞，其中所述细胞包含如本文所述的蛋白序列或编码如本文所述的蛋白序列的表达载体。
如本文所用，术语“转化的”或“转染的”是指已经向其中引入外源多核苷酸分子、诸如构建体的细胞，诸如哺乳动物细胞、组织、器官或生物体。引入的多核苷酸分子可以整合至受体细胞、诸如哺乳动物细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得引入的多核苷酸分子被随后的后代遗传。“转基因的”或“转染的”细胞，诸如哺乳动物细胞或生物体，还包括所述细胞或生物体的后代，以及从采用这种转基因生物作为杂交中的亲本的育种程序产生且表现出由外源多核苷酸分子的存在导致的改变的表型的后代。术语“转基因”是指含有一种或多种异源多核酸分子的细菌、真菌或植物。“转导”是指病毒介导的基因转移至细胞、诸如哺乳动物细胞中。
术语“工程改造的细胞”是指包含本发明的构建体的细胞，无论该细胞是否被“直接”工程改造(例如，该细胞在物理上从原始或野生型条件改变)，还是遗传自如此修饰的细胞。因此，“工程改造的细胞”包括直接修饰的细胞及其后代。
如本文所用，“受试者”是指作为治疗、观察或实验的对象的动物。“动物”包括冷血和温血的脊椎动物和无脊椎动物，诸如鱼，贝壳动物，爬行动物，和尤其是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马、灵长类，诸如猴、黑猩猩和猿，和尤其是人。在某些替代方案中，所述受试者是人。
在一些实施方案中，用于诱导二聚化的配体的有效量是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 nM或由在上面提及的值中的任何两个限定的范围内的浓度的量。
如本文所述的“标志物序列”编码蛋白，所述蛋白用于选择或追踪蛋白或具有目标蛋白或细胞、诸如哺乳动物细胞。在本文所述的实施方案中，提供的融合蛋白可以包含可以在实验、诸如流式细胞术中选择的标志物序列。
如本文所用的“嵌合受体”或“嵌合抗原受体”是指合成设计的受体，其包含抗体或其他蛋白序列的配体结合结构域，其结合与疾病或病症相关的分子，并且经由间隔区结构域连接至T细胞或其他受体的一个或多个细胞内信号传导结构域，诸如共刺激结构域。在一些实施方案中，制造细胞，诸如哺乳动物细胞，其中所述细胞包含编码融合蛋白的核酸，并且其中所述细胞包含嵌合抗原受体。
如本文所用的“细胞毒性T淋巴细胞”(CTL)是指在其表面上表达CD8的T淋巴细胞(例如，CD8+ T细胞)。在一些实施方案中，此类细胞是经历抗原的“记忆” T细胞(TM细胞)。在一些实施方案中，提供了用于融合蛋白分泌的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细胞毒性T淋巴细胞。如本文所用的“中央记忆” T细胞(或“TCM”)是指经历抗原的CTL，其在其表面上表达CD62L、CCR-7和/或CD45RO，并且与幼稚的细胞相比，不表达CD45RA或具有降低的CD45RA表达。在一些实施方案中，提供了用于融合蛋白分泌的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是中央记忆T细胞(TCM)。在一些实施方案中，与幼稚细胞相比，所述中央记忆细胞对CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和/或CD95的表达呈阳性，并且可能具有降低的CD54RA表达。如本文所用的“效应记忆” T细胞(或“TEM”)是指与中央记忆细胞相比在其表面上不表达CD62L或具有降低的CD62L表达的经历抗原的T细胞，并且与幼稚细胞相比，不表达CD45RA或具有降低的CD45RA表达。在一些实施方案中，提供了用于融合蛋白分泌的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是效应记忆T细胞。在一些实施方案中，与幼稚细胞或中央记忆细胞相比，效应记忆细胞对CD62L和/或CCR7的表达呈阴性，并且可以具有可变的CD28和/或CD45RA的表达。
如本文所用的“幼稚T细胞”是指未经历抗原的T淋巴细胞，与中央或效应记忆细胞相比，其表达CD62L和/或CD45RA，并且不表达CD45RO-。在一些实施方案中，提供了用于融合蛋白分泌的细胞，诸如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞，诸如哺乳动物细胞，是幼稚T细胞。在一些实施方案中，幼稚CD8+ T淋巴细胞的特征在于幼稚的T细胞的表型标志物(包括CD62L、CCR7、CD28、CD127和/或CD45RA)的表达。
如本文所用的“效应” T细胞是指经历抗原的细胞毒性T淋巴细胞，与中央记忆或幼稚T细胞相比，其不表达CD62L、CCR7和/或CD28或具有降低的CD62L、CCR7和/或CD28的表达，并且对颗粒酶B和/或穿孔蛋白呈阳性。在一些实施方案中，提供了用于融合蛋白分泌的细胞，诸如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞，诸如哺乳动物细胞，是效应T细胞。在一些实施方案中，与中央记忆或幼稚T细胞相比，所述细胞，诸如哺乳动物细胞，不表达CD62L、CCR7和/或CD28或具有降低的CD62L、CCR7和/或CD28的表达，并且对颗粒酶B和/或穿孔蛋白呈阳性。
如本文所用的“表位”是指被包含抗体、T细胞和/或B细胞的免疫系统识别的抗原或分子的一部分。表位通常具有至少7个氨基酸，并且可以是线性或构象表位。在一些实施方案中，提供了表达融合蛋白的细胞，诸如哺乳动物细胞，其中所述细胞进一步包含嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含可以识别癌细胞上的表位的scFv。当用于描述本文公开的各种多肽或核酸时，“分离”或“纯化”是指已经从其天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的多肽或核酸。在一些实施方案中，分离的多肽或核酸不与其天然缔合的所有组分缔合。其自然环境的污染组分是通常会干扰多肽或核酸的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白性溶质。在一些实施方案中，提供了一种方法，其中所述方法包括将本文所述的实施方案中任一项的核酸或本文所述的实施方案中任一项的表达载体递送至细菌细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞，使细胞在培养物中生长，诱导融合蛋白的表达和纯化融合蛋白用于治疗。
关于本文鉴定的CISC序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”被定义为在比对序列和(如果必要)引入空位以达到最大百分比序列同一性且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，对于细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或信号传导结构域中的每一个，候选序列中的与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以本领域技术内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，使用WU-BLAST-2计算机程序(Altschul, S. F. 等人(1996). Methods in Enzymol., 266:460-480)生成的%氨基酸序列同一性值使用几种搜索参数，其中大多数被设置为默认值。未设置为默认值(例如，可调节参数)的那些将被设置具有以下值：重叠范围= 1，重叠分数= 0.125，词阈值(T)= 11和评分矩阵= BLOSUM62。在CISC的一些实施方案中，所述CISC包含细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域，其中每个结构域包含天然结构域的天然、合成、或突变或截短形式(诸如ILRβ信号传导结构域的截短形式)。在一些实施方案中，任何给定结构域的突变或截短形式包含与本文提供的序列中所述的序列具有100%、95%、90%、85%序列同一性或在由上面提及的百分比中的任何两个限定的范围内的百分比序列同一性的氨基酸序列。
如本文所用的“CISC变体多肽序列”或“CISC变体氨基酸序列”是指如下所定义的蛋白序列，其与本文提供的蛋白序列或其特异性衍生的片段、诸如细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或信号传导结构域的蛋白序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%氨基酸序列同一性(或在由前面提及的百分比中的任何两个限定的范围内的百分比氨基酸序列同一性)。通常，CISC变体多肽或其片段将与所述氨基酸序列或其衍生片段具有至少80%氨基酸序列同一性、至少81%氨基酸序列同一性、至少82%氨基酸序列同一性、至少83%氨基酸序列同一性、至少84%氨基酸序列同一性、至少85%氨基酸序列同一性、至少86%氨基酸序列同一性、至少87%氨基酸序列同一性、至少88%氨基酸序列同一性、至少89%氨基酸序列同一性、至少90%氨基酸序列同一性、至少91%氨基酸序列同一性、至少92%氨基酸序列同一性、至少93%氨基酸序列同一性、至少94%氨基酸序列同一性、至少95%氨基酸序列同一性、至少96%氨基酸序列同一性、至少97%氨基酸序列同一性、至少98%氨基酸序列同一性或至少99%氨基酸序列同一性。变体不涵盖天然蛋白序列。
如本文所用的“T细胞”或“T淋巴细胞”可以来自任何哺乳动物、物种，包括但不限于猴、狗、灵长类动物和人。在一些实施方案中，所述T细胞与受体受试者是同种异体的(来自相同的物种、但不同的供体)。在一些实施方案中，所述T细胞是自体的(供体和受体是相同的)。在一些实施方案中，所述T细胞是同基因的(供体和受体是不同的，但是是相同的双胞胎)。
如本文所用的“RNA-指导的核酸内切酶”、“RGEN”、“Cas核酸内切酶”或“Cas核酸酶”包括但不限于例如与CRISPR(聚类规则间隔的短回文重复)适应性免疫系统相关的RNA-指导的DNA核酸内切酶。在本文中，“RGEN”或“Cas核酸内切酶”是指天然存在的和重组的Cas核酸内切酶。
如在本说明书中所用，无论是在过渡性短语中还是在权利要求的主体中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”均应被解释为具有开放式含义。也就是说，所述术语应与短语“至少具有”或“至少包含”同义地解释。当在过程的上下文中使用时，术语“包含”意指该过程至少包括所述的步骤，但可以包括额外的步骤。当在化合物、组合物或装置的上下文中使用时，术语“包含”意指所述化合物、组合物或装置至少包含所述的特征或组分，但也可以包括额外的特征或组分。
用于受控浆细胞耗竭的系统
在一个方面，本文提供了用于生成用于个体中的浆细胞的受控耗竭的工程改造的细胞(例如，工程改造的T细胞)的系统。所述系统包含：a)用于整合至细胞(例如，T细胞)的基因组中的核酸，其编码i)能够为细胞赋予对浆细胞的细胞毒性的抗浆细胞构建体，和ii)二聚化-可活化的化学诱导的信号传导复合物(CISC)的多肽组分，其中有信号传导能力的CISC能够在促进细胞的存活和/或增殖的信号传导途径中产生刺激信号，和b)基因组编辑元件，其用于将所述核酸整合至细胞的基因组中，以产生表达所述抗浆细胞构建体和所述CISC的工程改造的细胞。通过调节与工程改造的细胞接触的CISC二聚化所需的配体的量，CISC允许控制工程改造的细胞的存活和/或增殖。在一些实施方案中，所述CISC包含第一CISC组分和第二CISC组分，其中所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置为使得当由工程改造的细胞表达时，它们在配体存在的情况下二聚化以产生有信号传导能力的CISC。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞在配体不存在的情况下不能存活和/或增殖。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞在参与细胞的存活和/或增殖的内源信号传导途径中是缺陷的，且所述有信号传导能力的CISC能够补充缺陷的内源信号传导途径，使得所述工程改造细胞可以存活和/或增殖。
抗浆细胞构建体
在一些实施方案中，本文所述的系统包含编码抗浆细胞构建体的核酸。在一些实施方案中，所述抗浆细胞构建体是抗浆细胞嵌合抗原受体(CAR)。所述抗浆细胞CAR识别浆细胞的表面上存在的抗原。在一些实施方案中，所述抗浆细胞CAR识别浆细胞的表面上选择性表达的抗原。在一些实施方案中，所述浆细胞是非恶性浆细胞。在一些实施方案中，所述抗浆细胞CAR识别CD27(肿瘤坏死因子受体超家族，成员7，TNFRSF7)、CD126(白介素-6受体，IL6R)、CD138 (粘结蛋白聚糖 1)、CD269 (B细胞成熟抗原，BCMA)或CD319(SLAM家族成员7，SLAMF7)。在一些实施方案中，所述抗浆细胞CAR是抗BCMA CAR。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR识别野生型BCMA。对BCMA特异性的抗体部分是本领域中已知的，且所述抗BCMACAR可以包含任何这些抗BCMA抗体部分。例如，在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含源自所述抗BCMA抗体C11D5.3的抗体部分。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含抗BCMASCFV，所述抗BCMA SCFV包含源自抗BCMA抗体C11D5.3的重链和轻链CDR3。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含抗BCMA scFv，其中所述抗BCMA scFv CDR各自源自抗BCMA抗体C11D5.3。在一些实施方案中，所述抗BCMA scFv包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列或其与SEQID NO:55的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含编码抗BCMA CAR的核酸。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含细胞外BCMA识别结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞外BCMA识别结构域是可以特异性结合BCMA的抗体部分。在一些实施方案中，所述抗体部分是抗BCMA scFv。在一些实施方案中，所述抗BCMA scFv包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2和HC-CDR3，且所述轻链可变结构域(VL)包含轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述CDR中的一些源自抗BCMA抗体。在一些实施方案中，所述HC-CDR3和所述LC-CD3源自所述抗BCMA抗体。在一些实施方案中，所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3源自所述抗BCMA抗体。在一些实施方案中，所述抗BCMA抗体是C11D5.3。在一些实施方案中，所述抗BCMA scFv包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在一些实施方案中，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR共刺激结构域包含4-1BB和/或CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述4-1BB共刺激跨膜结构域包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CD3-ζ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列或其与SEQID NO:60或61的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
CISC
在一些实施方案中，本文所述的系统包含编码二聚CISC的核酸，所述二聚CISC包含第一CISC组分和第二CISC组分。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含第一细胞外结合结构域或其部分、第一跨膜结构域和第一信号传导结构域或其部分。在一些实施方案中，所述第一CISC组分进一步包含第一铰链结构域。在一些实施方案中，所述第二CISC组分包含第二细胞外结合结构域或其部分、第二跨膜结构域和第二信号传导结构域或其部分。在一些实施方案中，所述第二CISC组分进一步包含第二铰链结构域。在一些实施方案中，所述第一和第二CISC组分可以被配置为使得当表达时，它们在配体存在的情况下二聚化。在一些实施方案中，所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分，且所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。在一些实施方案中，所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分，且所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。在一些实施方案中，所述配体是雷帕霉素或rapalog。在一些实施方案中，所述第一信号传导结构域是源自IL2Rγ的信号传导结构域，和/或所述第一跨膜结构域是源自IL2Rγ的跨膜结构域，且所述第二信号传导结构域是源自IL2Rβ的信号传导结构域，和/或所述第二跨膜结构域是源自IL2Rβ的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述第二信号传导结构域是源自IL2Rγ的信号传导结构域，和/或所述第二跨膜结构域是源自IL2Rγ的跨膜结构域，且所述第一信号传导结构域是源自IL2Rβ的信号传导结构域，和/或所述第一跨膜结构域是源自IL2Rβ的跨膜结构域。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含编码二聚CISC的核酸，所述二聚CISC包含第一CISC组分和第二CISC组分，其中所述CISC包含IL2Rγ和IL2Rβ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含IL2Rγ的包括信号传导结构域的部分，且所述第二CISC组分包含IL2Rβ的包括信号传导结构域的部分，或所述第二CISC组分包含IL2Rγ的包括信号传导结构域的部分，且所述第一CISC组分包含IL2Rβ的包括信号传导结构域的部分。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含IL2Rγ的部分，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二CISC组分包含IL2Rβ的部分，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体，或所述第二CISC组分包含IL2Rγ的部分，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一CISC组分包含IL2Rβ的部分，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分，且所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。在一些实施方案中，所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分，且所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。在一些实施方案中，所述FKBP结构域包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述FRB包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一和第二CISC组分在雷帕霉素或rapalog存在的情况下二聚化以形成有信号传导能力的CISC。在一些实施方案中，所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
在其他实施方案中，包含IL2Rβ信号传导结构域的CISC组分包含截短的细胞内IL2Rβ结构域。所述截短的IL2Rβ结构域保留在与包含IL2Rγ信号传导结构域的CISC组分异源二聚化后活化下游IL2信号传导的能力。在一些实施方案中，所述截短的IL2Rβ结构域包含如SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:76的截短的IL2Rβ结构域缺乏任何1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个N-末端氨基酸。在一些实施方案中，包含截短的细胞内IL2Rβ结构域的CISC组分包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一些实施方案中，根据本文所述的包含IL2Rβ信号传导结构域的任何CISC组分，所述CISC组分可以被包含截短的细胞内IL2Rβ结构域的CISC组分取代。例如，在一些实施方案中，本文所述的包含IL2Rβ信号传导结构域的CISC组分被包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CISC组分取代。
抗细胞毒性T细胞构建体
在一些实施方案中，本文所述的系统进一步包含编码抗细胞毒性T细胞构建体的核酸。在一些实施方案中，所述抗细胞毒性T细胞构建体能够为表达所述构建体的编辑的细胞赋予对将编辑的细胞识别为外来的细胞毒性T细胞的细胞毒性，而编辑的T细胞对不将编辑的细胞识别为外来的细胞毒性T细胞无细胞毒性。在一些实施方案中，所述抗细胞毒性T细胞构建体是包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域的嵌合受体。在一些实施方案中，所述细胞外β2-微球蛋白结构域包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体跨膜结构域包含CD8跨膜结构域多肽。在一些实施方案中，所述嵌合受体CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，所述嵌合受体4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合受体CD3-ζ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
可选择标志物
在一些实施方案中，本文所述的系统进一步包含编码可选择标志物的核酸。在一些实施方案中，所述可选择标志物能够为表达所述可选择标志物的编辑的细胞赋予在选择条件下、诸如在毒素存在的情况下或在营养物不存在的情况下存活的能力。在一些实施方案中，所述可选择标志物是允许选择表达所述可选择标志物的细胞的表面标志物。在一些实施方案中，所述可选择标志物是截短的低亲和力神经生长因子受体(tLNGFR)多肽。在一些实施方案中，所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
钙调神经磷酸酶抑制剂抗性
在一些实施方案中，本文所述的系统进一步包含编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述多肽能够为表达所述多肽的编辑的细胞赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性。在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽赋予对他克莫司(FK506)和/或环孢菌素A (CsA)的抗性。在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型钙调神经磷酸酶(CN)多肽。在一些实施方案中，突变型CN多肽赋予对他克莫司(FK506)和环孢菌素A (CsA)的抗性。在一些实施方案中，所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQ ID NO:67)。
雷帕霉素抗性
尽管有用，但观察到与rapalog AP21967实现的增殖量相比，暴露于雷帕霉素的CISC表达细胞经历更少的增殖。雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)是在人中由MTOR基因编码的激酶。mTOR是蛋白激酶的磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶家族的成员。该蛋白是一种生长调节剂，其通过将控制合成代谢过程(诸如脂质合成和mRNA翻译)的底物磷酸化以及延迟分解代谢过程(诸如自噬)来刺激细胞生长。不受理论的束缚，据信雷帕霉素/FKBP复合物与mTOR的FRB结构域的结合阻断或减少mTOR-介导的细胞内信号传导，导致mRNA翻译和细胞生长减少。
在一些实施方案中，本文所述的系统进一步包含编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述多肽能够为表达所述多肽的编辑的细胞赋予对雷帕霉素的抗性。在一些实施方案中，所述肽是雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽。在一些实施方案中，所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
基因组编辑元件
在一些实施方案中，本文所述的系统包含基因组编辑元件，其用于将核酸整合至细胞的基因组中，以产生表达本文所述的抗浆细胞构建体和CISC的工程改造的细胞。在一些实施方案中，所述基因组编辑元件能够将编码本文所述的各种多肽的核酸插入内源TRA基因和/或内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述基因组编辑元件包含CRISPR系统，所述CRISPR系统包含：a)靶向内源TRA基因的第一gRNA和/或靶向内源IL2RG基因的第二gRNA；和b) RNA-指导的核酸内切酶(RGEN)或编码RGEN的核酸。在一些实施方案中，所述第一gRNA靶向编码TRAC结构域的区域内或附近的内源TRA基因。如果在gRNA靶标位点处的整合能够破坏TRAC结构域表达和/或功能(通常在侧接或相邻序列中)，则该靶标位点在编码TRAC结构域的区域“附近”。在一些实施方案中，所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1-3中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1-3中任一者具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:4-18中任一者具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述RGEN选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1核酸内切酶或其功能衍生物。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含基因组编辑元件，所述基因组编辑元件包含：a)靶向内源TRA基因的第一gRNA和/或靶向内源IL2RG基因的第二gRNA；和b) RNA-指导的核酸内切酶(RGEN)或编码RGEN的核酸。在一些实施方案中，所述第一gRNA靶向编码TRAC结构域的区域内或附近的内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一gRNA包含SEQ IDNO:1-3中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1-3中任一者具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:4-18中任一者具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述RGEN是Cas9。在一些实施方案中，编码RGEN的核酸是核糖核酸(RNA)序列。在一些实施方案中，所述编码RGEN的RNA序列经由共价键连接至所述第一gRNA或所述第二gRNA。在一些实施方案中，所述系统包含一种或多种供体模板，所述供体模板包含编码本文描述的抗浆细胞构建体和CISC的核酸。在一些实施方案中，所述抗浆细胞构建体是根据本文所述的任何实施方案的抗BCMA CAR。在一些实施方案中，根据本文所述的任何实施方案，所述一种或多种供体模板进一步包含编码抗细胞毒性T细胞构建体、可选择标志物、赋予钙调神经磷酸酶抑制剂抗性的多肽和赋予对雷帕霉素的抗性的多肽中的一种或多种的核酸。在一些实施方案中，所述抗细胞毒性T细胞构建体是包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域的嵌合受体。在一些实施方案中，所述系统包含用于插入内源TRA基因的第一供体模板和/或用于插入内源IL2RG基因的第二供体模板。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含一种或多种供体模板，所述供体模板包含编码以下系统组分的核酸：i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；iv)可选择标志物；v)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vi)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分或其片段。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码抗浆细胞构建体的核酸和编码所述第一CISC组分的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述可选择标志物的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在第一多顺反子表达盒的上游包含合成的聚A序列，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码盒的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。如果细胞不能表达功能性天然的(未修饰的)T细胞受体，则细胞中的TRAC结构域是无功能的。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#4-#7。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:28-39中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:101-104中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQ IDNO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#8。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQ IDNO:40-43中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ ID NO:105的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQ ID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:40-43中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-43中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:105的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:105的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何供体模板，所述供体模板包含编码抗浆细胞构建体的核酸。在一些实施方案中，所述抗浆细胞构建体是抗BCMA CAR。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含细胞外BCMA识别结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞外BCMA识别结构域是可以特异性结合BCMA的抗体部分。在一些实施方案中，所述抗体部分是抗BCMA scFv。在一些实施方案中，所述抗BCMA scFv包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2和HC-CDR3，且所述轻链可变结构域(VL)包含轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述CDR中的一些源自抗BCMA抗体。在一些实施方案中，所述HC-CDR3和所述LC-CD3源自所述抗BCMA抗体。在一些实施方案中，所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3源自所述抗BCMA抗体。在一些实施方案中，所述抗BCMA抗体是C11D5.3。在一些实施方案中，所述抗BCMA scFv包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在一些实施方案中，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR共刺激结构域包含4-1BB和/或CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述4-1BB共刺激跨膜结构域包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CD3-ζ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列或其与SEQID NO:60或61的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何供体模板，所述供体模板包含编码包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分的核酸。在一些实施方案中，所述第一CISC组分的第一细胞外结合结构域包含FRB结构域。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何供体模板，所述供体模板包含编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽是FRB结构域多肽。在一些实施方案中，所述FRB结构域多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何供体模板，所述供体模板包含编码可选择标志物的核酸。在一些实施方案中，所述可选择标志物是tLNGFR多肽。在一些实施方案中，所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何供体模板，所述供体模板包含编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型CN多肽。在一些实施方案中，所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQ ID NO:67)。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何供体模板，所述供体模板包含编码包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第二CISC组分的第二细胞外结合结构域包含FKBP结构域。在一些实施方案中，所述第二CISC组分包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述供体模板包含编码包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体的第二CISC组分的片段的核酸。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何供体模板，所述供体模板包含MSCV启动子。在一些实施方案中，所述MSCV启动子包含SEQ ID NO:75的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:75的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何供体模板，所述供体模板包含MND启动子。在一些实施方案中，所述MND启动子包含SEQ ID NO:74的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:74的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何供体模板，所述供体模板在相邻的系统组分编码核酸之间包含编码2A自切割肽的核酸。在一些实施方案中，所述供体模板在相邻的系统组分编码核酸各自之间包含编码2A自切割肽的核酸。例如，在一些实施方案中，所述供体模板以5’至3’的顺序包含编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码2A自切割肽的核酸、编码可选择标志物的核酸、编码2A自切割肽的核酸、编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸、编码2A自切割肽的核酸和编码第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述2A自切割肽各自独立地是T2A自切割肽或P2A自切割肽。在一些实施方案中，所述T2A自切割肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述P2A自切割肽包含SEQID NO:73的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含一种或多种供体模板，所述供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；v)可选择标志物；vi)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vii)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分或其片段。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸和编码所述第一CISC组分的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述抗细胞毒性T细胞构建体的核酸、编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述可选择标志物的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在第一多顺反子表达盒的上游包含合成的聚A序列，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码盒的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#4-#7。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:28-39中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:101-104中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQ ID NO:82和83或SEQID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#9。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQ ID NO:44的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ ID NO:106的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQ ID NO:88和89或SEQ IDNO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:44的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:44的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:106的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:106的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何供体模板，所述供体模板包含编码抗细胞毒性T细胞构建体的核酸。在一些实施方案中，所述抗细胞毒性T细胞构建体能够为表达所述构建体的编辑的T细胞赋予对将编辑的T细胞识别为外来的细胞毒性T细胞的细胞毒性，而编辑的T细胞对不将编辑的T细胞识别为外来的细胞毒性T细胞无细胞毒性。在一些实施方案中，所述细胞毒性T细胞构建体是包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域的嵌合受体。在一些实施方案中，所述细胞外β2-微球蛋白结构域包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体跨膜结构域包含CD8跨膜结构域多肽。在一些实施方案中，所述嵌合受体CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或其与SEQID NO:63的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，所述嵌合受体4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合受体CD3-ζ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含一种或多种供体模板，所述供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；iv)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和v)包含IL2Rγ信号传导结构域或其片段的第二CISC组分。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸、编码所述第一CISC组分的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子的上游包含合成的聚A序列，使得所述编码抗浆细胞构建体的核酸的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码序列的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#1和#2。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:19-24中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:98-99中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQ ID NO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#10。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQ ID NO:45的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ ID NO:107的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQ ID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:19-24中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:19-24中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQID NO:98-99中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:98-99中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:107的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:107的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含一种或多种供体模板，所述供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；v)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vi)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分或其片段。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码抗浆细胞构建体的核酸和编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述第一CISC组分的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在第一多顺反子表达盒的上游包含合成的聚A序列，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码盒的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#3。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:25-27中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:100的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQ ID NO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#11。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQ ID NO:46的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ ID NO:108的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQ ID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:25-27中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:25-27中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:100的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:100的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:108的多核苷酸序列或其与SEQID NO:108的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含一种或多种供体模板和一种或多种gRNA。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板，且所述一种或多种gRNA包含第一gRNA和第二gRNA。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一gRNA包含SEQID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:25的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:26的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:26的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:27的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:27的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一gRNA包含SEQ IDNO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的包含供体模板的任何系统，所述供体模板包含编码盒，且所述供体模板被配置为使得所述编码盒能够通过同源性引导的修复(HDR)被整合至被所述系统中的gRNA靶向的基因组基因座中。在一些实施方案中，所述编码盒在两侧侧接对应于靶向的基因组基因座中的序列的同源臂。在一些实施方案中，所述同源臂对应于靶向的基因组基因座中的序列，其包括系统中的gRNA的靶标位点。在一些实施方案中，所述同源臂中的一个或两个包含对应于所述系统中的gRNA的靶标位点的序列。在一些实施方案中，所述同源臂被配置为使得所述编码盒至基因组基因座中的整合除去gRNA的基因组靶标位点，或者以其他方式修饰基因组靶标位点，使得其不再是gRNA的靶标。在一些实施方案中，对应于靶标位点的同源性臂中的序列包含靶标位点的PAM序列的变化，使得其不是gRNA的靶标。在一些实施方案中，所述同源臂之一包含对应于所述靶标位点的部分的序列，且另一个同源臂包含对应于所述靶标位点的其余部分的序列，使得所述编码序列至基因组基因座的整合中断基因组基因座中的靶标位点。在一些实施方案中，所述同源臂长度为至少或至少约0.2 kb(诸如至少或至少约0.3 kb、0.4 kb、0.5 kb、0.6 kb、0.7 kb、0.8 kb、0.9 kb、1 kb或更大中任一者)。示例性同源臂包括来自所述供体模板的同源臂，其具有SEQID NO:19-46中任一者的序列。在一些实施方案中，所述供体模板被编码在腺相关病毒(AAV)载体中。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV6载体。
在一些实施方案中，根据本文所述的包含供体模板的任何系统，所述供体模板包含编码盒，且所述供体模板被配置为使得所述编码盒能够通过非同源末端连接(NHEJ)被整合至被所述系统中的gRNA靶向的基因组基因座中。在一些实施方案中，所述编码盒在一侧或两侧侧接gRNA靶标位点。在一些实施方案中，所述编码盒在两侧侧接gRNA靶标位点。在一些实施方案中，所述gRNA靶标位点是所述系统中的gRNA的靶标位点。在一些实施方案中，所述供体模板的gRNA靶标位点是所述系统中的gRNA的细胞基因组gRNA靶标位点的反向互补物。在一些实施方案中，所述供体模板被编码在腺相关病毒(AAV)载体中。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV6载体。
在一些实施方案中，本文所述的系统包含核糖核蛋白(RNP)复合物，所述核糖核蛋白(RNP)复合物包含RGEN和第一gRNA和/或第二gRNA。在一些实施方案中，将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA分别以1:1至20:1之间的gRNA与RGEN的摩尔比预复合，以形成RNP。
工程改造的细胞
在一些方面，本文提供了工程改造的细胞，诸如工程改造的哺乳动物细胞(例如，T细胞)，其包含编码以下的核酸：i)如本文所示和所述的能够为所述工程改造的细胞赋予对浆细胞的细胞毒性的抗浆细胞构建体，和ii)如本文所示和所述的二聚化可活化的化学诱导的信号传导复合物(CISC)的多肽组分，其中有信号传导能力的CISC能够在促进所述工程改造的细胞的存活和/或增殖的信号传导途径中产生刺激信号。通过调节与工程改造的细胞接触的CISC二聚化所需的配体的量，CISC允许控制工程改造的细胞的存活和/或增殖。在一些实施方案中，所述CISC包含第一CISC组分和第二CISC组分，其中所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置为使得当由工程改造的细胞表达时，它们在配体存在的情况下二聚化以产生有信号传导能力的CISC。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞在配体不存在的情况下不能存活和/或增殖。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞在参与细胞的存活和/或增殖的内源信号传导途径中是缺陷的，且所述有信号传导能力的CISC能够补充缺陷的内源信号传导途径，使得所述工程改造细胞可以存活和/或增殖。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞是工程改造的T细胞。在一些实施方案中，包含如本文所述的抗浆细胞CAR、诸如例如抗BCMA CAR的工程改造的T细胞在其靶标抗原存在的情况下或与其靶标抗原接触后脱粒。在一些实施方案中，所述工程改造的T细胞在个体中定位至浆细胞肿瘤性肿瘤、诸如例如多发性骨髓瘤的部位。在一些实施方案中，所述工程改造的T细胞定位至体内浆细胞驻留的部位，例如，定位至骨髓和肠。在一些实施方案中，所述工程改造的T细胞是人的。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的细胞包含编码抗浆细胞构建体的核酸。在一些实施方案中，所述抗浆细胞构建体是抗浆细胞嵌合抗原受体(CAR)。所述抗浆细胞CAR识别浆细胞的表面上存在的抗原。在一些实施方案中，所述抗浆细胞CAR识别浆细胞的表面上选择性表达的抗原。在一些实施方案中，所述浆细胞是非恶性浆细胞。在一些实施方案中，所述抗浆细胞CAR识别CD27(肿瘤坏死因子受体超家族，成员7，TNFRSF7)、CD126(白介素-6受体，IL6R)、CD138 (粘结蛋白聚糖 1)、CD269 (B细胞成熟抗原，BCMA)或CD319(SLAM家族成员7，SLAMF7)。在一些实施方案中，所述抗浆细胞CAR是抗BCMA CAR。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR识别野生型BCMA。对BCMA特异性的抗体部分是本领域中已知的，且所述抗BCMA CAR可以包含任何这些抗BCMA抗体部分。例如，在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含源自所述抗BCMA抗体C11D5.3的抗体部分。在一些实施方案中，所述抗BCMACAR包含抗BCMA SCFV，所述抗BCMA SCFV包含源自抗BCMA抗体C11D5.3的重链和轻链CDR3。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含抗BCMA scFv，其中所述抗BCMA scFv CDR各自源自抗BCMA抗体C11D5.3。在一些实施方案中，所述抗BCMA scFv包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的细胞包含编码抗BCMA CAR的核酸。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含细胞外BCMA识别结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞外BCMA识别结构域是可以特异性结合BCMA的抗体部分。在一些实施方案中，所述抗体部分是抗BCMA scFv。在一些实施方案中，所述抗BCMA scFv包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2和HC-CDR3，且所述轻链可变结构域(VL)包含轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述CDR中的一些源自抗BCMA抗体。在一些实施方案中，所述HC-CDR3和所述LC-CD3源自所述抗BCMA抗体。在一些实施方案中，所述HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3源自所述抗BCMA抗体。在一些实施方案中，所述抗BCMA抗体是C11D5.3。在一些实施方案中，所述抗BCMA scFv包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在一些实施方案中，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR共刺激结构域包含4-1BB和/或CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述4-1BB共刺激跨膜结构域包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CD3-ζ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列或其与SEQID NO:60或61的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何工程改造的细胞，编码所述抗浆细胞构建体的外源核酸被插入所述工程改造的细胞的基因组。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源TRA基因。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述外源核酸的插入导致无功能的TRAC结构域。如果所得细胞不能表达功能性天然的(未修饰的)T细胞受体，则所述TRAC结构域是无功能的。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源IL2RG基因，使得所述抗浆细胞构建体的表达在一种或多种内源IL2RG调节元件的控制下。在一些实施方案中，所述外源核酸进一步包含与编码所述抗浆细胞构建体的外源核酸的部分可操作连接的启动子，使得所述工程改造的细胞中的所述抗浆细胞构建体的表达在所述启动子的控制下。在一些实施方案中，所述启动子是骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性控制区域缺失、dl587rev引物-结合位点取代的(MND)启动子。在一些实施方案中，所述MND启动子包含SEQ ID NO:74的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:74的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的细胞包含编码二聚CISC的核酸，所述二聚CISC包含第一CISC组分和第二CISC组分。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含第一细胞外结合结构域或其部分、第一跨膜结构域和第一信号传导结构域或其部分。在一些实施方案中，所述第一CISC组分进一步包含第一铰链结构域。在一些实施方案中，所述第二CISC组分包含第二细胞外结合结构域或其部分、第二跨膜结构域和第二信号传导结构域或其部分。在一些实施方案中，所述第二CISC组分进一步包含第二铰链结构域。在一些实施方案中，所述第一和第二CISC组分可以被配置为使得当表达时，它们在配体存在的情况下二聚化。在一些实施方案中，所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分，且所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。在一些实施方案中，所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分，且所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。在一些实施方案中，所述配体是雷帕霉素或rapalog。在一些实施方案中，所述第一信号传导结构域是源自IL2Rγ的信号传导结构域，和/或所述第一跨膜结构域是源自IL2Rγ的跨膜结构域，且所述第二信号传导结构域是源自IL2Rβ的信号传导结构域，和/或所述第二跨膜结构域是源自IL2Rβ的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述第二信号传导结构域是源自IL2Rγ的信号传导结构域，和/或所述第二跨膜结构域是源自IL2Rγ的跨膜结构域，且所述第一信号传导结构域是源自IL2Rβ的信号传导结构域，和/或所述第一跨膜结构域是源自IL2Rβ的跨膜结构域。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的细胞包含编码二聚CISC的核酸，所述二聚CISC包含第一CISC组分和第二CISC组分，其中所述CISC包含IL2Rγ和IL2Rβ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含IL2Rγ的包括信号传导结构域的部分，且所述第二CISC组分包含IL2Rβ的包括信号传导结构域的部分，或所述第二CISC组分包含IL2Rγ的包括信号传导结构域的部分，且所述第一CISC组分包含IL2Rβ的包括信号传导结构域的部分。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含IL2Rγ的部分，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二CISC组分包含IL2Rβ的部分，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体，或所述第二CISC组分包含IL2Rγ的部分，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第一CISC组分包含IL2Rβ的部分，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其与SEQID NO:51的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分，且所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。在一些实施方案中，所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分，且所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。在一些实施方案中，所述FKBP结构域包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述FRB包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一和第二CISC组分在雷帕霉素或rapalog存在的情况下二聚化以形成有信号传导能力的CISC。在一些实施方案中，所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何工程改造的细胞，编码所述第一CISC组分或其部分的第一外源核酸被插入所述工程改造的细胞的基因组，和/或编码所述第二CISC组分或其部分的第二外源核酸被插入所述工程改造的细胞的基因组。在一些实施方案中，所述第一外源核酸被插入内源TRA基因，和/或所述第二外源核酸被插入内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域，和/或所述第二外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，外源核酸的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第一外源核酸被插入内源IL2RG基因，和/或所述第二外源核酸被插入内源IL2RG基因。在一些实施方案中，编码包含IL2Rγ的部分的CISC组分的外源核酸被插入内源IL2RG基因。在一些实施方案中，编码包含IL2Rγ的部分的CISC组分的外源核酸被插入内源IL2RG基因，使得所述CISC组分的表达在一种或多种内源IL2RG调节元件的控制下。在一些实施方案中，编码包含IL2Rγ的部分的CISC组分的N-末端片段的外源核酸被插入内源IL2RG基因，使得i)所述CISC组分的表达在一种或多种内源IL2RG调节元件的控制下，且ii)编码所述CISC组分的N-末端片段的外源核酸与内源IL2RG基因符合读框地插入，且所述CISC组分的剩余C-末端部分由所述内源IL2RG基因的编码序列的C-末端部分编码。在一些实施方案中，所述第一外源核酸进一步包含与编码所述第一CISC组分或其部分的外源核酸的部分可操作连接的第一启动子，使得所述工程改造的细胞中的所述第一CISC组分的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二外源核酸进一步包含与编码所述第二CISC组分或其部分的外源核酸的部分可操作连接的第二启动子，使得所述工程改造的细胞中的所述第二CISC组分的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，编码所述第一CISC组分或其部分和所述第二CISC组分或其部分的单一外源核酸被插入所述工程改造的细胞的基因组。在一些实施方案中，所述单一外源核酸进一步包含与编码所述第一和第二CISC组分或其部分的外源核酸的部分可操作连接的单一启动子，使得所述工程改造的细胞中的所述第一和第二CISC组分的表达在所述单一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一、第二和/或单一启动子是骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性控制区域缺失、dl587rev引物-结合位点取代的(MND)启动子。在一些实施方案中，所述MND启动子包含SEQ ID NO:74的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:74的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，所述工程改造的细胞是T细胞或能够分化为T细胞的前体细胞。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞是CD3+、CD8+和/或CD4+ T淋巴细胞。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞是CD8+ T细胞毒性淋巴细胞，其可以包括幼稚的CD8+ T细胞、中央记忆CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞或主体CD8+ T细胞(bulk CD8+ T cell)。
淋巴细胞(T淋巴细胞)可以根据已知技术收集，并通过已知技术、诸如与抗体的亲和力结合、诸如流式细胞术和/或免疫磁性选择来富集或耗竭。在富集和/或耗竭步骤之后，可以根据已知技术或其本领域技术人员显而易见的变型实施期望的T淋巴细胞的体外扩增。在一些实施方案中，所述T细胞是获得自患者的自体T细胞。
例如，期望的T细胞群体或亚群可以通过如下扩增：在体外将初始T淋巴细胞群体添加至培养基，且然后向所述培养基中添加饲养细胞，诸如非分裂的外周血单核细胞(PBMC)(例如，使得对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得的细胞群体含有至少5、10、20或40或更多个PBMC饲养细胞)；和孵育所述培养物(例如，持续足以扩增T细胞的数量的时间)。所述非分裂的饲养细胞可以包含γ-辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，所述PBMC用3000至3600 rad的范围内的γ射线辐射以防止细胞分裂。在一些实施方案中，所述PBMC用3000、3100、3200、3300、3400、3500或3600 rad或任何所列值的任何两个端点之间的任何值的rad的γ射线辐射以防止细胞分裂。如果期望，可以颠倒向培养基中添加T细胞和饲养细胞的顺序。通常可以在适合于T淋巴细胞的生长的温度等条件下孵育培养物。对于人T淋巴细胞的生长，例如，温度将通常为至少25℃、至少30℃或至少37℃。在一些实施方案中，用于人T淋巴细胞的生长的温度是22、24、26、28、30、32、34、36、37℃或任何所列值的任何两个端点之间的任何其他温度。
在分离T淋巴细胞之后，可以在扩增之前或之后将细胞毒性T细胞和辅助性T淋巴细胞两者分选为幼稚、记忆和效应T细胞亚群。
CD8+细胞可以通过使用本领域中已知的方法获得。在一些实施方案中，通过鉴定与那些类型的CD8+细胞各自相关的细胞表面抗原，将CD8+细胞进一步分选为幼稚、中央记忆和效应记忆细胞。在一些实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群两者中。在用抗CD8和抗CD62L抗体染色之后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和CD62L+CD8+级分。在一些实施方案中，中央记忆TCM的表型标志物的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127，并且对于颗粒酶B是阴性或低的。在一些实施方案中，中央记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+和/或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，效应TE对于CD62L、CCR7、CD28和/或CD127是阴性的，并且对于颗粒酶B和/或穿孔蛋白是阳性的。在一些实施方案中，幼稚CD8+ T淋巴细胞的特征在于幼稚T细胞的表型标志物(包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和/或CD45RA)的表达。
是否选择细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群体(诸如哺乳动物细胞的群体)用于扩增取决于所述细胞或细胞群体是否已经经历两个不同的基因修饰事件。如果细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群体(诸如哺乳动物细胞群体)已经经历一个或更少的基因修饰事件，则配体的添加将不导致二聚化。然而，如果细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群体(诸如哺乳动物细胞群体)已经经历两个基因修饰事件，则配体的添加将导致CISC组分的二聚化和随后的信号传导级联。因此，细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群体(诸如哺乳动物细胞群体)可以基于其对与配体的接触的应答来选择。在一些实施方案中，所述配体可以0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、or 100 nM或由上面提及的值中的任何两个限定的范围内的浓度的量添加。
在一些实施方案中，基于由信号转导途径导致的标志物的表达，细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群体(诸如哺乳动物细胞群体)对于二聚的CISC是阳性的。因此，二聚的CISC阳性的细胞群体可以通过流式细胞术使用用针对表面标志物的特异性抗体和同型匹配的对照抗体进行染色来测定。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的细胞进一步包含编码抗细胞毒性T细胞构建体的核酸。在一些实施方案中，所述抗细胞毒性T细胞构建体能够为工程改造的细胞赋予对将工程改造的细胞识别为外来的细胞毒性T细胞的细胞毒性，其中编辑的T细胞对不将工程改造的细胞识别为外来的细胞毒性T细胞无细胞毒性。在一些实施方案中，所述细胞毒性T细胞构建体是包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域的嵌合受体。在一些实施方案中，所述细胞外β2-微球蛋白结构域包含SEQID NO:62的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体跨膜结构域包含CD8跨膜结构域多肽。在一些实施方案中，所述嵌合受体CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，所述嵌合受体4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合受体CD3-ζ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的包含编码抗细胞毒性T细胞构建体的核酸的任何工程改造的细胞，编码所述抗细胞毒性T细胞构建体的外源核酸被插入所述工程改造的细胞的基因组。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源TRA基因。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述外源核酸的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源IL2RG基因，使得所述抗细胞毒性T细胞构建体的表达在一种或多种内源IL2RG调节元件的控制下。在一些实施方案中，所述外源核酸进一步包含与编码所述抗抗细胞毒性T细胞构建体的外源核酸的部分可操作连接的启动子，使得所述工程改造的细胞中的所述抗细胞毒性T细胞构建体的表达在所述启动子的控制下。在一些实施方案中，所述启动子是骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性控制区域缺失、dl587rev引物-结合位点取代的(MND)启动子。在一些实施方案中，所述MND启动子包含SEQ ID NO:74的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:74的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的细胞进一步包含编码可选择标志物的核酸。在一些实施方案中，所述可选择标志物能够为所述工程改造的细胞赋予在选择条件下、诸如在毒素存在的情况下或在营养物不存在的情况下存活的能力。在一些实施方案中，所述可选择标志物是允许选择表达所述可选择标志物的细胞的表面标志物。在一些实施方案中，所述可选择标志物是截短的低亲和力神经生长因子受体(tLNGFR)多肽。在一些实施方案中，所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的包含编码可选择标志物的核酸的任何工程改造的细胞，编码所述可选择标志物的外源核酸被插入所述工程改造的细胞的基因组。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源TRA基因。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述外源核酸的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源IL2RG基因，使得所述可选择标志物的表达在一种或多种内源IL2RG调节元件的控制下。在一些实施方案中，所述外源核酸进一步包含与编码所述可选择标志物的外源核酸的部分可操作连接的启动子，使得所述工程改造的细胞中的所述可选择标志物的表达在所述启动子的控制下。在一些实施方案中，所述启动子是骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性控制区域缺失、dl587rev引物-结合位点取代的(MND)启动子。在一些实施方案中，所述MND启动子包含SEQ ID NO:74的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:74的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的细胞进一步包含编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽赋予对他克莫司(FK506)和/或环孢菌素A (CsA)的抗性。在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型钙调神经磷酸酶(CN)多肽。在一些实施方案中，突变型CN多肽赋予对他克莫司(FK506)和环孢菌素A (CsA)的抗性。在一些实施方案中，所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQID NO:67)。
在一些实施方案中，根据本文所述的包含编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸的任何工程改造的细胞，编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的外源核酸被插入工程改造的细胞的基因组。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源TRA基因。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述外源核酸的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源IL2RG基因，使得所述可选择标志物的表达在一种或多种内源IL2RG调节元件的控制下。在一些实施方案中，所述外源核酸进一步包含与编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的外源核酸的部分可操作连接的启动子，使得所述工程改造的细胞中的所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的表达在所述启动子的控制下。在一些实施方案中，所述启动子是骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性控制区域缺失、dl587rev引物-结合位点取代的(MND)启动子。在一些实施方案中，所述MND启动子包含SEQ ID NO:74的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:74的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的细胞进一步包含编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述肽是雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽。在一些实施方案中，赋予雷帕霉素抗性的多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的包含编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸的任何工程改造的细胞，编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的外源核酸被插入工程改造的细胞的基因组。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源TRA基因。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述外源核酸的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述外源核酸被插入内源IL2RG基因，使得所述可选择标志物的表达在一种或多种内源IL2RG调节元件的控制下。在一些实施方案中，所述外源核酸进一步包含与编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的外源核酸的部分可操作连接的启动子，使得所述工程改造的细胞中的所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的表达在所述启动子的控制下。在一些实施方案中，所述启动子是骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性控制区域缺失、dl587rev引物-结合位点取代的(MND)启动子。在一些实施方案中，所述MND启动子包含SEQ ID NO:74的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:74的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何工程改造的细胞，所述工程改造的细胞包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；iv)可选择标志物；v)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vi)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第一编码盒的核酸和包含第二编码盒的核酸。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸和编码所述第一CISC组分的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述可选择标志物的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第一多顺反子表达盒的核酸，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是外源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入内源基因的第一外源核酸，其中所述第一外源核酸包含在所述第一多顺反子表达盒上游的合成的聚A序列。在一些实施方案中，所述外源启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一启动子是第一内源基因的内源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入所述第一内源基因的第一外源核酸，其中所述第一外源核酸包含在所述第一编码盒上游的编码2A自切割肽的核酸。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一外源核酸的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第二多顺反子表达盒的核酸，所述第二多顺反子表达盒包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是外源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入第二内源基因的第二外源核酸，其中所述第二外源核酸包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二外源核酸包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段，且所述第二外源核酸被插入内源IL2RG基因中，使得编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，且与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分。在一些实施方案中，所述第一多顺反子表达盒包含来自SEQ ID NO:28-39中任一者的连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述第二多顺反子表达盒包含来自SEQ ID NO:40-43中任一者的连续核苷酸的序列。
在一些实施方案中，根据本文所述的包含多顺反子表达盒的任何工程改造的细胞，所述多顺反子表达盒在相邻的系统组分编码核酸之间包含编码2A自切割肽的核酸。在一些实施方案中，所述多顺反子表达盒在相邻的系统组分编码核酸各自之间包含编码2A自切割肽的核酸。例如，在一些实施方案中，所述多顺反子表达盒以5’至3’的顺序包含编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码2A自切割肽的核酸、编码可选择标志物的核酸、编码2A自切割肽的核酸、编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸、编码2A自切割肽的核酸和编码第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述2A自切割肽各自独立地是T2A自切割肽或P2A自切割肽。在一些实施方案中，所述T2A自切割肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述P2A自切割肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或其与SEQID NO:73的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何工程改造的细胞，所述工程改造的细胞包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；v)可选择标志物；vi)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vii)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第一编码盒的核酸和包含第二编码盒的核酸。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸和编码所述第一CISC组分的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述抗细胞毒性T细胞构建体的核酸、编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述可选择标志物的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第一多顺反子表达盒的核酸，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是外源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入内源基因的第一外源核酸，其中所述第一外源核酸包含在所述第一多顺反子表达盒上游的合成的聚A序列。在一些实施方案中，所述外源启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一启动子是第一内源基因的内源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入所述第一内源基因的第一外源核酸，其中所述第一外源核酸包含在所述第一编码盒上游的编码2A自切割肽的核酸。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一外源核酸的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第二多顺反子表达盒的核酸，所述第二多顺反子表达盒包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是外源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入第二内源基因的第二外源核酸，其中所述第二外源核酸包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二外源核酸包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段，且所述第二外源核酸被插入内源IL2RG基因中，使得编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，且与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分。在一些实施方案中，所述第一多顺反子表达盒包含来自SEQ ID NO:28-39中任一者的连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述第二多顺反子表达盒包含来自SEQ ID NO:44的连续核苷酸的序列。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何工程改造的细胞，所述工程改造的细胞包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；iv)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和v)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第一编码盒的核酸和包含第二编码盒的核酸。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸、编码所述第一CISC组分的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第一多顺反子表达盒的核酸，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是外源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入内源基因的第一外源核酸，其中所述第一外源核酸包含在所述第一多顺反子表达盒上游的合成的聚A序列。在一些实施方案中，所述外源启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一启动子是第一内源基因的内源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入所述第一内源基因的第一外源核酸，其中所述第一外源核酸包含在所述第一编码盒上游的编码2A自切割肽的核酸。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一外源核酸的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第二多顺反子表达盒的核酸，所述第二多顺反子表达盒包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是外源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入第二内源基因的第二外源核酸，其中所述第二外源核酸包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二外源核酸包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段，且所述第二外源核酸被插入内源IL2RG基因中，使得编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，且与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分。在一些实施方案中，所述第一多顺反子表达盒包含来自SEQ ID NO:19-24中任一者的连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述第二多顺反子表达盒包含来自SEQ ID NO:45的连续核苷酸的序列。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何工程改造的细胞，所述工程改造的细胞包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；v)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vi)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第一编码盒的核酸和包含第二编码盒的核酸。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码抗浆细胞构建体的核酸和编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述第一CISC组分的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第一多顺反子表达盒的核酸，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是外源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入内源基因的第一外源核酸，其中所述第一外源核酸包含在所述第一多顺反子表达盒上游的合成的聚A序列。在一些实施方案中，所述外源启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一启动子是第一内源基因的内源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入所述第一内源基因的第一外源核酸，其中所述第一外源核酸包含在所述第一编码盒上游的编码2A自切割肽的核酸。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一外源核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一外源核酸的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞含有包含第二多顺反子表达盒的核酸，所述第二多顺反子表达盒包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是外源启动子，且所述工程改造的细胞包含插入第二内源基因的第二外源核酸，其中所述第二外源核酸包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二外源核酸包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段，且所述第二外源核酸被插入内源IL2RG基因中，使得编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，且与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分。在一些实施方案中，所述第一多顺反子表达盒包含来自SEQ IDNO:25-27中任一者的连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述第二多顺反子表达盒包含来自SEQ ID NO:46的连续核苷酸的序列。
编辑基因组的方法
在一些实施方案中，本文公开了编辑细胞的基因组、特别是编辑细胞基因组以允许表达以下的方法：i)能够为细胞赋予对浆细胞的细胞毒性的抗浆细胞构建体，和ii)二聚化-可活化的化学诱导的信号传导复合物(CISC)的多肽组分，其中有信号传导能力的CISC能够在促进所述细胞的存活和/或增殖的信号传导途径中产生刺激信号。
在一个方面，本文提供了编辑细胞的基因组以产生工程改造的细胞的方法，所述方法包括向所述细胞提供：a)根据本文所述的任何实施方案的第一gRNA和/或第二gRNA，b)根据本文所述的任何实施方案的RGEN或编码RGEN的核酸，和c)根据本文所述的任何实施方案的一种或多种供体模板，所述供体模板包含编码以下的核酸：i)能够为工程改造的细胞赋予对浆细胞的细胞毒性的抗浆细胞构建体；和ii)二聚化-可活化的化学诱导的信号传导复合物(CISC)的多肽组分，其中有信号传导能力的CISC能够在促进所述工程改造的细胞的存活和/或增殖的信号传导途径中产生刺激信号。在一些实施方案中，所述CISC包含第一CISC组分和第二CISC组分，其中所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置为使得当由工程改造的细胞表达时，它们在配体存在的情况下二聚化以产生有信号传导能力的CISC。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞在配体不存在的情况下不能存活和/或增殖。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞在参与细胞的存活和/或增殖的内源信号传导途径中是缺陷的，且所述有信号传导能力的CISC能够补充缺陷的内源信号传导途径，使得所述工程改造细胞可以存活和/或增殖。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含IL2Rβ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述第一CISC组分的第一细胞外结合结构域包含FRB结构域。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:54的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二CISC组分包含IL2Rγ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述第二CISC组分的第二细胞外结合结构域包含FKBP结构域。在一些实施方案中，所述第二CISC组分包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板进一步包含编码以下中的一种或多种的核酸：iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)可选择标志物；v)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；或vii)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽。在一些实施方案中，所述抗浆细胞构建体是抗BCMACAR。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列或其与SEQID NO:60或61的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一CISC组分的第一细胞外结合结构域包含FRB结构域。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽是FRB结构域多肽。在一些实施方案中，所述FRB结构域多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述可选择标志物是tLNGFR多肽。在一些实施方案中，所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型CN多肽。在一些实施方案中，所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQ ID NO:67)。在一些实施方案中，所述第二CISC组分的第二细胞外结合结构域包含FKBP结构域。在一些实施方案中，所述第二CISC组分包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞，诸如细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞前体，诸如能够分化为细胞毒性T细胞的细胞。
在一些实施方案中，根据编辑本文所述的细胞的基因组的任何方法，所述一种或多种供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；iv)可选择标志物；v)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vi)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分或其片段。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸和编码所述第一CISC组分的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述可选择标志物的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在第一多顺反子表达盒的上游包含合成的聚A序列，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码盒的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#4-#7。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:28-39中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ IDNO:101-104中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQ ID NO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#8。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQ ID NO:40-43中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ ID NO:105的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQ ID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列及其与SEQID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:40-43中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-43中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:105的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:105的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据编辑本文所述的细胞的基因组的任何方法，所述一种或多种供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；v)可选择标志物；vi)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vii)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分或其片段。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸和编码所述第一CISC组分的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述抗细胞毒性T细胞构建体的核酸、编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述可选择标志物的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在第一多顺反子表达盒的上游包含合成的聚A序列，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码盒的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#4-#7。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:28-39中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:101-104中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQ ID NO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#9。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQ ID NO:44的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ ID NO:106的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQ ID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:44的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:44的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:106的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:106的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据编辑本文所述的细胞的基因组的任何方法，所述一种或多种供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；iv)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和v)包含IL2Rγ信号传导结构域或其片段的第二CISC组分。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸、编码所述第一CISC组分的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子的上游包含合成的聚A序列，使得所述编码抗浆细胞构建体的核酸的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码序列的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#1和#2。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:19-24中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:98-99中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQID NO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#10。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQID NO:45的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ IDNO:107的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:19-24中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:19-24中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:98-99中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:98-99中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ IDNO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:107的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:107的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据编辑本文所述的细胞的基因组的任何方法，所述一种或多种供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；v)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vi)第二CISC组分，其包含IL2Rγ信号传导结构域或其片段。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码抗浆细胞构建体的核酸和编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述第一CISC组分的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在第一多顺反子表达盒的上游包含合成的聚A序列，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码盒的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#3。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:25-27中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:100的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQ ID NO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#11。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQ ID NO:46的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ ID NO:108的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQ ID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ IDNO:25-27中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:25-27中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:100的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:100的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:108的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:108的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据编辑本文所述的细胞的基因组的任何方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据编辑本文所述的细胞的基因组的任何方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ IDNO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据编辑本文所述的细胞的基因组的任何方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:25的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:26的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:26的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:27的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:27的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的编辑细胞的基因组的任何方法，所述RGEN选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1核酸内切酶或其功能衍生物。在一些实施方案中，所述RGEN是Cas9。在一些实施方案中，编码RGEN的核酸是核糖核酸(RNA)序列。在一些实施方案中，所述编码RGEN的RNA序列经由共价键连接至所述第一gRNA或所述第二gRNA。在一些实施方案中，在提供给所述细胞之前，将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA预复合，形成RNP复合物。在一些实施方案中，将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA分别以1:1至20:1之间的gRNA与RGEN的摩尔比预复合。
在一些实施方案中，根据本文所述的编辑细胞的基因组的任何方法，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是CD8+细胞毒性T淋巴细胞或CD3+泛T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是源自多个供体的T细胞的合并物的成员。在一些实施方案中，所述多个供体是人供体。在一些实施方案中，所述细胞对浆细胞是细胞毒性的。
治疗方法
在一些实施方案中，本文公开了治疗有此需要的受试者中的疾病或病况的方法，其中所述疾病或病况的特征在于不利的抗体产生，所述方法包括： 1)根据本文所述的任何方法编辑T细胞的基因组，由此产生工程改造的T细胞并将工程改造的T细胞施用于受试者；或2)根据本文所述的任何方法编辑受试者中的T细胞的基因组，由此产生受试者中的工程改造的T细胞。在一些实施方案中，a)的T细胞对所述受试者是自体的。在一些实施方案中，a)的T细胞对所述受试者是同种异体的。在一些实施方案中，a)的T细胞包含源自多个供体的T细胞的合并物。在一些实施方案中，所述多个供体是人供体。在一些实施方案中，所述T细胞包含CD8+细胞毒性T细胞或CD3+泛T细胞。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述疾病或病况是移植物抗宿主病(GvHD)、抗体介导的自身免疫、浆细胞肿瘤或轻链淀粉样变性。在一些实施方案中，所述浆细胞肿瘤是浆细胞骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)。在一些实施方案中，所述疾病或病况是GvHD，且所述受试者先前已经接受器官移植。
在一些实施方案中，根据本文所述的治疗疾病或病况的任何方法，编辑T细胞的基因组以产生工程改造的T细胞包括向所述T细胞提供：a)根据本文所述的任何实施方案的第一gRNA和/或第二gRNA，b)根据本文所述的任何实施方案的RGEN或编码RGEN的核酸，和c)根据本文所述的任何实施方案的一种或多种供体模板，所述供体模板包含编码以下的核酸：i)能够为工程改造的细胞赋予对浆细胞的细胞毒性的抗浆细胞构建体；和ii)二聚化可活化化学诱导的信号传导复合物(CISC)的多肽组分，其中有信号传导能力的CISC能够在促进所述工程改造的细胞的存活和/或增殖的信号传导途径中产生刺激信号。在一些实施方案中，所述CISC包含第一CISC组分和第二CISC组分，其中所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置为使得当由工程改造的细胞表达时，它们在配体存在的情况下二聚化以产生有信号传导能力的CISC。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞在配体不存在的情况下不能存活和/或增殖。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞在参与细胞的存活和/或增殖的内源信号传导途径中是缺陷的，且所述有信号传导能力的CISC能够补充缺陷的内源信号传导途径，使得所述工程改造细胞可以存活和/或增殖。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含IL2Rβ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述第一CISC组分的第一细胞外结合结构域包含FRB结构域。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二CISC组分包含IL2Rγ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述第二CISC组分的第二细胞外结合结构域包含FKBP结构域。在一些实施方案中，所述第二CISC组分包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述抗浆细胞构建体是抗BCMA CAR。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板进一步包含编码以下中的一种或多种的核酸：iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)可选择标志物；v)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；或vi)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽。在一些实施方案中，所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽是FRB结构域多肽。在一些实施方案中，所述FRB结构域多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述可选择标志物是tLNGFR多肽。在一些实施方案中，所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型CN多肽。在一些实施方案中，所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQID NO:67)。
在一些实施方案中，根据本文所述的治疗疾病或病况的任何方法，所述一种或多种供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；iv)可选择标志物；v)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vi)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分或其片段。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸和编码所述第一CISC组分的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述可选择标志物的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在第一多顺反子表达盒的上游包含合成的聚A序列，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码盒的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#4-#7。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:28-39中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:101-104中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQ ID NO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#8。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQ ID NO:40-43中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ ID NO:105的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQID NO:86和87、SEQ ID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:40-43中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-43中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:105的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:105的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的治疗疾病或病况的任何方法，所述一种或多种供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；v)可选择标志物；vi)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vii)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分或其片段。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸和编码所述第一CISC组分的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述抗细胞毒性T细胞构建体的核酸、编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述可选择标志物的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在第一多顺反子表达盒的上游包含合成的聚A序列，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码盒的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#4-#7。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:28-39中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:101-104中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQ ID NO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#9。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQ ID NO:44的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ ID NO:106的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQ ID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28-39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:101-104中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:44的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:44的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:106的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:106的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的治疗疾病或病况的任何方法，所述一种或多种供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；iv)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和v)包含IL2Rγ信号传导结构域或其片段的第二CISC组分。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码所述抗浆细胞构建体的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸、编码所述第一CISC组分的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子的上游包含合成的聚A序列，使得所述编码抗浆细胞构建体的核酸的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码序列的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#1和#2。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:19-24中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:98-99中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQID NO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#10。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQID NO:45的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ IDNO:107的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:19-24中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:19-24中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:98-99中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:98-99中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ IDNO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:107的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:107的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的治疗疾病或病况的任何方法，所述一种或多种供体模板包含编码以下系统组分的核酸： i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；v)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vi)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分或其片段。在一些实施方案中，所述一种或多种供体模板包含第一供体模板和第二供体模板。在一些实施方案中，所述第一供体模板被配置为插入第一内源基因，且所述第二供体模板被配置为插入第二内源基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含第一编码盒，且所述第二供体模板包含第二编码盒。在一些实施方案中，所述第一编码盒包含编码抗浆细胞构建体的核酸和编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述第二编码盒包含编码赋予对雷帕霉素的抗性的多肽的核酸、编码所述第一CISC组分的核酸和编码所述第二CISC组分或其片段的核酸。在一些实施方案中，所述第一供体模板在第一多顺反子表达盒的上游包含合成的聚A序列，所述第一多顺反子表达盒包含与所述第一编码盒可操作连接的第一启动子，使得所述第一多顺反子表达盒的表达在所述第一启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第一启动子是鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含编码第一多顺反子表达盒的部分的核酸，其包含在所述第一编码盒的上游的编码2A自切割肽的核酸，其中所述第一供体模板被配置为使得当插入所述第一內源基因时，所述第一多顺反子表达盒的部分与所述第一內源基因的序列连接，且与所述第一內源基因的序列连接的所述第一多顺反子表达盒的部分一起构成所述第一多顺反子表达盒。在一些实施方案中，所述第一内源基因是内源TRA基因。在一些实施方案中，所述第一供体模板被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域。在一些实施方案中，所述第一供体模板的插入导致无功能的TRAC结构域。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含第二多顺反子表达盒或其部分，其包含与所述第二编码盒可操作连接的第二启动子，使得所述第二多顺反子表达盒的表达在所述第二启动子的控制下。在一些实施方案中，所述第二启动子是MND启动子。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因。在一些实施方案中，所述第二内源基因是内源IL2RG基因，所述第二供体模板包含所述第二多顺反子表达盒的部分，其含有包含编码所述第二CISC组分的核酸的片段的核酸，且所述第二供体模板被配置为使得当插入所述内源IL2RG基因时，编码所述第二CISC组分的核酸的片段与内源IL2RG基因序列连接，与所述内源IL2RG基因序列连接的编码所述第二CISC组分的核酸的片段一起编码所述第二CISC组分，且与所述内源IL2RG基因序列连接的所述第二多顺反子表达盒的部分一起构成所述第二多顺反子表达盒。所述第一供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#3。在一些实施方案中，所述第一供体模板包含来自SEQ ID NO:25-27中任一者的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第一供体模板包含SEQ ID NO:100的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一供体模板被对应于所述TRA基因中的序列的同源臂侧接。所述第一供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:80和81、SEQ ID NO:82和83或SEQ ID NO:84和85的多核苷酸序列的同源臂。所述第二供体模板的示例性配置显示于图1，供体模板构建体#11。在一些实施方案中，所述第二供体模板包含来自SEQ ID NO:46的连续核苷酸的序列。例如，在一些实施方案中，所述第二供体模板包含SEQ ID NO:108的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第二供体模板被对应于所述IL2RG基因中的序列的同源臂侧接。所述第二供体模板的示例性同源臂包括具有SEQ ID NO:86和87、SEQ ID NO:88和89或SEQ ID NO:90和91的多核苷酸序列的同源臂。在一些实施方案中，所述第一供体模板是第一AAV载体和/或所述第二供体模板是第二AAV载体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:25-27中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:25-27中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:100的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:100的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:108的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:108的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的治疗疾病或病况的任何方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ IDNO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的治疗疾病或病况的任何方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的治疗疾病或病况的任何方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:25的多核苷酸序列或其与SEQID NO:25的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:26的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:26的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ IDNO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:27的多核苷酸序列或其与SEQID NO:27的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
在一些实施方案中，根据本文所述的治疗疾病或病况的任何方法，所述RGEN选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1核酸内切酶或其功能衍生物。在一些实施方案中，所述RGEN是Cas9。在一些实施方案中，编码RGEN的核酸是核糖核酸(RNA)序列。在一些实施方案中，所述编码RGEN的RNA序列经由共价键连接至所述第一gRNA或所述第二gRNA。在一些实施方案中，在提供给所述细胞之前，将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA预复合，形成RNP复合物。在一些实施方案中，将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA分别以1:1至20:1之间的gRNA与RGEN的摩尔比预复合。
在一些实施方案中，根据本文所述的治疗疾病或病况的任何方法，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是CD8+细胞毒性T淋巴细胞或CD3+泛T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是源自多个供体的T细胞的合并物的成员。在一些实施方案中，所述多个供体是人供体。在一些实施方案中，所述细胞对浆细胞是细胞毒性的。
在一些实施方案中，本文所述的治疗疾病或病况的方法进一步包括将雷帕霉素或rapalog施用于所述受试者。在一些实施方案中，所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。在一些实施方案中，所述雷帕霉素或rapalog以0.05 nM至100 nM的浓度施用。
在另一个方面，本文提供了根据本文所述的任何实施方案的工程改造的T细胞，其用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
在另一个方面，本文提供了根据本文所述的任何实施方案的工程改造的T细胞，其用于制备药物，所述药物用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
在另一个方面，本文提供了根据本文所述的任何实施方案的系统，其用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
在另一个方面，本文提供了根据本文所述的任何实施方案的系统，其用于制备药物，所述药物用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
在另一个方面，本文提供了根据本文所述的任何实施方案的一种或多种gRNA、一种或多种供体模板、试剂盒、注射器和/或导管，其用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
在另一个方面，本文提供了根据本文所述的任何实施方案的一种或多种gRNA、一种或多种供体模板、试剂盒、注射器和/或导管，其用于制备药物，所述药物用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病或特征在于不利的抗体产生的疾病或病况。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病是抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是轻链淀粉样变性。
组合物
本文提供了组合物，其包含如本公开中所示制备的基因修饰的细胞，诸如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞，诸如哺乳动物细胞，包括如本文实施方案中所述的蛋白序列。在一些实施方案中，所述组合物包括具有CISC的T细胞，所述CISC包含细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CISC是IL2R-CISC。在其他实施方案中，所述组合物进一步包含细胞(诸如哺乳动物细胞)制剂，其包含具有CISC的CD8+ T细胞，所述CISC包含细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CISC组分在配体(例如，雷帕霉素或rapalog)存在的情况下二聚化，其可以同时或依次发生。在一些实施方案中，这些群体各自可以与彼此或其他细胞类型组合以提供组合物。
在一些实施方案中，所述组合物的细胞是CD8+细胞。所述CD8+细胞可以是T细胞毒性淋巴细胞、幼稚CD8+ T细胞、中央记忆CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和/或主体CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中央记忆T细胞，其中所述中央记忆T细胞包括CD45RO+、CD62L+和/或CD8+ T细胞。在还有其他实施方案中，所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中央记忆T细胞。
在一些实施方案中，所述组合物包含T细胞前体。在一些实施方案中，所述组合物包含造血干细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自幼稚CD8+ T细胞、中央记忆CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和主体CD8+ T细胞的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞和第二宿主细胞，其中所述第二宿主细胞是前体T细胞。在一些实施方案中，所述前体T细胞是造血干细胞。
在一些组合物中，所述细胞是NK细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是CD8+。在一些实施方案中，所述细胞是选自幼稚CD8+ T细胞、中央记忆CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和主体CD8+ T细胞的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，所述细胞是前体T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是造血干细胞或NK细胞。在一些实施方案中，所述细胞进一步包含嵌合抗原受体。
本文还提供了试剂盒和系统，其包括本文提供和描述的细胞、表达载体和蛋白序列。因此，例如，本文提供了试剂盒，其包含以下中的一种或多种：如本文所述的蛋白序列；如本文所述的表达载体；和/或本文所述的细胞。还提供了用于选择性活化信号进入细胞内部的系统，所述系统包含如本文所述的细胞，其中所述细胞包含如本文所述的表达载体，所述表达载体包含编码如本文所述的蛋白序列的核酸。
制备表达二聚的CISC组分的细胞的方法
在本文所述的一些实施方案中，可能期望将蛋白序列或表达载体引入宿主细胞、诸如哺乳动物细胞、例如淋巴细胞，以用于药物调节的细胞因子信号传导和/或用于表达二聚的CISC组分的细胞的选择性扩增。例如，二聚的CISC可以允许具有引入的CISC组分的细胞中的细胞因子信号转导，用于在与配体接触后将信号传递至细胞、诸如哺乳动物细胞的内部。另外，如本文所述，可以控制细胞、诸如哺乳动物细胞的选择性扩增，以仅选择已经经历两个特定基因修饰事件的那些细胞。这些细胞的制备可以根据本领域技术人员基于本公开显而易见的已知技术实施。
在一些实施方案中，提供了制备携带CISC的细胞、诸如哺乳动物细胞的方法，其中所述细胞表达二聚的CISC。所述方法可以包括向细胞、诸如哺乳动物细胞递送本文所述的实施方案或实施方案中任一项的蛋白序列或本文所述的实施方案或实施方案的表达载体，和递送至所述细胞、诸如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述蛋白序列包含第一和第二序列。在一些实施方案中，所述第一序列编码包含第一细胞外结合结构域、铰链结构域、指定长度(其中所述长度任选地被优化)的接头、跨膜结构域和信号传导结构域的第一CISC组分。在一些实施方案中，所述第二序列编码包含第二细胞外结合结构域、铰链结构域、指定长度(其中所述长度任选地被优化)的接头、跨膜结构域和信号传导结构域的第二CISC组分。在一些实施方案中，所述间隔区为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长度或由上面提及的长度中的任何两个限定的范围内的长度。在一些实施方案中，所述信号传导结构域包含白介素-2信号传导结构域，诸如IL2RB或IL2RG结构域。在一些实施方案中，所述细胞外结合结构域是结合雷帕霉素或rapalog的结合结构域，其包含FKBP或FRB或其部分。在一些实施方案中，所述细胞是CD8+细胞。在一些实施方案中，所述细胞是选自幼稚CD8+ T细胞、中央记忆CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和主体CD8+ T细胞的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，所述细胞是前体T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是NK细胞。
活化细胞内部的信号的方法
在一些实施方案中，本文所述的方法采用活化细胞、诸如哺乳动物细胞的内部的信号的步骤。所述方法可以包括提供如本文所述的细胞、诸如哺乳动物细胞，其中所述细胞包含如本文所示的蛋白序列或如本文所示的表达载体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括表达编码如本文所述的二聚的CISC的蛋白序列，或表达如本文所述的载体。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞、诸如哺乳动物细胞与配体接触，所述配体引起第一和第二CISC组分二聚化，其将信号转导至细胞的内部。在一些实施方案中，所述配体是雷帕霉素或rapalog。在一些实施方案中，有效量的用于诱导二聚化的配体以0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 nM或由上面提及的值中的任何两个限定的范围内的浓度的量提供。
在一些实施方案中，这些方法中使用的配体是雷帕霉素或rapalog，包括例如依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP23573或AP1903或其代谢物、衍生物和/或其组合。额外有用的rapalog可以包括，例如，雷帕霉素的变体，其相对于雷帕霉素具有以下修饰的一种或多种：在C7、C42和/或C29处的甲氧基的去甲基化、消除或替代；在C13、C43和/或C28处的羟基的消除、衍生化或替代；在C14、C24和/或C30处的酮的还原、消除或衍生化；用5-元脯氨酰基环替代6-元哌啶环(pipecolate ring)；和/或在环己基环上的替代取代或用取代的环戊基环替代环己基环。额外有用的rapalog可以包括novolimus、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、奥莫莫司或佐他莫司或其代谢物、衍生物和/或组合。
在一些实施方案中，可以通过检测作为信号传导途径的结果的标志物的方法来实现检测细胞、诸如哺乳动物细胞内部的信号。因此，例如，可以通过Western印迹、流式细胞术或其他蛋白检测和定量方法的过程，通过测定细胞、诸如哺乳动物细胞中的Akt或其他信号传导标志物的水平来检测信号。用于检测的标志物可以包括例如JAK、Akt、STAT、NF-κ、MAPK、PI3K、JNK、ERK或Ras或指示细胞信号传导事件的其他细胞信号传导标志物。
在一些实施方案中，信号的转导影响细胞因子信号转导。在一些实施方案中，信号的转导影响IL2R信号转导。在一些实施方案中，信号的转导影响细胞因子受体的下游靶标的磷酸化。在一些实施方案中，活化信号的方法诱导表达CISC的细胞、诸如哺乳动物细胞中的增殖和未表达CISC的细胞中的伴随的抗增殖。
为了发生细胞信号转导，不仅细胞因子受体必须二聚化或异源二聚化，而且它们必须呈适当的构型以发生构象变化(Kim, M. J. 等人 (2007). J. Biol. Chem., 282(19):14253-14261)。因此，与信号传导结构域的正确构象定位相关联的二聚化是用于适当信号传导的期望过程，因为单独的受体二聚化或异源二聚化不足以驱动受体活化。本文所述的化学诱导的信号传导复合物通常呈正确的取向用于发生下游信号传导事件。
选择性扩增细胞群体的方法
在一些实施方案中，本文所述的方法采用选择性扩增细胞、诸如哺乳动物细胞的群体的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括提供如本文所述的细胞、诸如哺乳动物细胞，其中所述细胞包含如本文所示的蛋白序列或如本文所示的表达载体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括表达编码如本文所述的二聚的CISC的蛋白序列，或表达如本文所述的载体。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞、诸如哺乳动物细胞与配体接触，所述配体引起第一和第二CISC组分二聚化，其将信号转导至细胞的内部。在一些实施方案中，所述配体是雷帕霉素或rapalog。在一些实施方案中，提供用于诱导二聚化的配体的有效量是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 nM或由上面提及的值中的任何两个限定的范围内的浓度的量。在一些实施方案中，在所述配体是rapalog的情况下，提供用于诱导二聚化的配体的有效量是100 nM、200 nM、300 nM、400nM、500 nM、600 nM、700 nM、800 nM、900 nM、1000 nM或更大或由上面提及的值中的任何两个限定的范围内的浓度的量。
在一些实施方案中，使用的配体是雷帕霉素或rapalog，包括例如依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平或AP23573、AP1903或其代谢物、衍生物和/或其组合。额外有用的rapalog可以包括，例如，雷帕霉素的变体，其相对于雷帕霉素具有以下修饰的一种或多种：在C7、C42和/或C29处的甲氧基的去甲基化、消除或替代；在C13、C43和/或C28处的羟基的消除、衍生化或替代；在C14、C24和/或C30处的酮的还原、消除或衍生化；用5-元脯氨酰基环替代6-元哌啶环(pipecolate ring)；和/或在环己基环上的替代取代或用取代的环戊基环替代环己基环。额外有用的rapalog可以包括novolimus、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、奥莫莫司或佐他莫司或其代谢物、衍生物和/或组合。
在一些实施方案中，仅当已经发生两个不同的基因修饰事件时，才发生细胞、诸如哺乳动物细胞的群体的选择性扩增。一个基因修饰事件是二聚的化学诱导的信号传导复合物的一种组分，且另一个基因修饰事件是二聚的化学诱导的信号传导复合物的另一种组分。当两个事件均在细胞群体、诸如哺乳动物细胞群体内发生时，化学诱导的信号传导复合物组分在配体存在的情况下二聚化，导致活性的化学诱导的信号传导复合物和进入细胞内部的信号的生成。
核酸
靶向基因组的核酸或指导RNA
本发明提供了靶向基因组的核酸，其可以指导有关多肽(例如，定点多肽或DNA核酸内切酶)对靶标核酸内的特定靶标序列的活性。在一些实施方案中，所述靶向基因组的核酸是RNA。靶向基因组的RNA在本文中被称为“指导RNA”或“gRNA”。指导RNA至少具有与目标靶标核酸序列杂交的间隔区序列和CRISPR重复序列。在II型系统中，所述gRNA也具有被称为tracrRNA序列的第二种RNA。在II型指导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交以形成双链体。在V型指导RNA(gRNA)中，crRNA形成双链体。在两种系统中，所述双链体结合定点多肽，使得指导RNA和定点多肽形成复合物。所述靶向基因组的核酸通过它与定点多肽的结合为所述复合物提供靶标特异性。所述靶向基因组的核酸因此指导所述定点多肽的活性。
在一些实施方案中，所述靶向基因组的核酸是双分子指导RNA。在一些实施方案中，所述靶向基因组的核酸是单分子指导RNA。双分子指导RNA具有两条RNA链。第一链在5'至3'方向具有任选的间隔区延伸序列、间隔区序列和最小CRISPR重复序列。第二链具有最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3' tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。在II型系统中的单分子指导RNA (sgRNA)在5' 至3'方向具有任选的间隔区延伸序列、间隔区序列、最小CRISPR重复序列、单分子指导接头、最小tracrRNA序列、3' tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。所述任选的tracrRNA延伸可以具有给指导RNA贡献另外的功能性(例如，稳定性)的元件。所述单分子指导接头连接最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列以形成发夹结构。所述任选的tracrRNA延伸具有一个或多个发夹。V型系统中的单分子指导RNA (sgRNA)在5'至3'方向上具有最小的CRISPR重复序列和间隔区序列。
示例性的靶向基因组的核酸描述于WO2018/002719中。
供体DNA或供体模板
定点多肽，诸如DNA核酸内切酶，可以在核酸、例如基因组DNA中引入双链断裂或单链断裂。所述双链断裂可以刺激细胞的内源性DNA-修复途径(例如，同源性依赖性的修复(HDR)或非同源末端连接或替代非同源末端连接(A-NHEJ)或微同源性介导的末端连接(MMEJ)]。NHEJ可以修复经切割的靶标核酸，无需同源模板。这有时可以导致在靶标核酸中在切割位点处的小缺失或插入(插入/缺失(indel))，并且可以导致基因表达的破坏或改变。当同源修复模板或供体可得到时，可以发生也称为同源重组(HR)的HDR。
所述同源供体模板具有与侧接靶标核酸切割位点的序列同源的序列。姐妹染色单体通常被细胞用作修复模板。然而，为了基因组编辑的目的，所述修复模板经常作为外源核酸(诸如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或病毒核酸)来供给。使用外源供体模板，通常在同源性的侧接区域之间引入另外的核酸序列(诸如转基因)或修饰(诸如单个或多个碱基变化或缺失)，使得另外的或改变的核酸序列也变成并入靶标基因座中。MMEJ导致与NHEJ类似的基因结果，因为小缺失和插入可以发生在切割位点处。MMEJ利用侧接切割位点的几个碱基对的同源序列来驱动有利的末端连接DNA修复结果。在一些情况下，基于在核酸酶靶标区域中的潜在微同源性分析，有可能预测出可能的修复结果。
因此，在一些情况下，使用同源重组将外源多核苷酸序列插入靶标核酸切割位点中。一种外源多核苷酸序列在本文中被称为“供体多核苷酸”(或供体或供体序列或多核苷酸供体模板)。在一些实施方案中，将所述供体多核苷酸、所述供体多核苷酸的一部分、所述供体多核苷酸的拷贝或所述供体多核苷酸的拷贝的一部分插入靶标核酸切割位点中。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸是外源多核苷酸序列，即，不天然地存在于靶标核酸切割位点处的序列。
当在其中发生双链断裂的细胞核内以足够的浓度提供外源DNA分子时，外源DNA可以在NHEJ修复过程期间被插入在双链断裂处，且因此变为对于基因组的永久添加。在一些实施方案中，这些外源DNA分子被称为供体模板。如果供体模板含有本文所述的一种或多种系统组分的编码序列任选地连同相关的调节序列、诸如启动子、增强子、聚A序列和/或剪接受体序列，则可以从基因组中整合的核酸表达一种或多种系统组分，导致细胞生命中的永久表达。此外，当细胞分裂时，供体DNA模板的整合核酸可以被传递至子细胞。
在足够浓度的供体DNA模板(其含有与双链断裂的任一侧的DNA序列具有同源性的侧接DNA序列(称为同源臂))存在的情况下，所述供体DNA模板可以经由HDR途径整合。所述同源臂充当供体模板和双链断裂的任一侧的序列之间的同源重组的底物。这可以导致供体模板的无错误插入，其中双链断裂的任一侧的序列与未修饰的基因组中的序列相比没有改变。
用于通过HDR编辑的供给供体显著地变化，但是通常含有预期的序列，其具有小或大侧接同源性臂以允许与基因组DNA退火。侧接引入的基因变化的同源区域可以是30个碱基对或更小，或大至可以含有启动子、cDNA等的几千碱基的盒。可以使用单链和双链寡核苷酸供体。这些寡核苷酸的大小范围为从小于100个核苷酸至超过许多kb，尽管还可以制备和使用更长的ssDNA。经常使用双链供体，包括PCR扩增子、质粒和小型环。一般而言，已经发现，AAV载体是递送供体模板的非常有效的方式，尽管单个供体的包装限制是<5kb。供体的活性转录使HDR增加3倍，从而指示启动子的包含可以增加转化。相反，供体的CpG甲基化可以减少基因表达和HDR。
在一些实施方案中，可以给供体DNA供给核酸酶，或独立地通过多种不同的方法，例如通过转染、纳米颗粒、显微注射或病毒转导。在一些实施方案中，可以使用一系列栓系选择来增加供体对于HDR的可用性。实例包括将供体连接至核酸酶，连接至结合在附近的DNA结合蛋白，或连接至参与DNA末端结合或修复的蛋白。
除了通过NHEJ或HDR进行基因组编辑以外，可以进行使用NHEJ途径和HR的位点特异性的基因插入。组合方法可能适用于某些设置，可能包括内含子/外显子边界。NHEJ可以证明对内含子中的连接有效，而无错误的HDR可以更适合于编码区域中。
在实施方案中，意欲插入基因组的外源序列包含一种或多种本文所述的系统组分。在一些实施方案中，所述外源序列包含编码以下中的一种或多种的核酸：i)抗浆细胞构建体；ii)包含IL2Rβ信号传导结构域的第一CISC组分；iii)抗细胞毒性T细胞构建体；iv)赋予对雷帕霉素的抗性的多肽；v)可选择标志物；vi)赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；和vii)包含IL2Rγ信号传导结构域的第二CISC组分或其片段。在一些实施方案中，所述抗浆细胞构建体是抗BCMA CAR。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述第一CISC组分的第一细胞外结合结构域包含FRB结构域。在一些实施方案中，所述第一CISC组分包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:54的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述细胞毒性T细胞构建体是包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域的嵌合受体。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述赋予对雷帕霉素的抗性的多肽是FRB结构域多肽。在一些实施方案中，所述FRB结构域多肽包含SEQID NO:68或69的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:68或69的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述可选择标志物是tLNGFR多肽。在一些实施方案中，所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。在一些实施方案中，所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型CN多肽。在一些实施方案中，所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQ ID NO:67)。在一些实施方案中，所述第二CISC组分的第二细胞外结合结构域包含FKBP结构域。在一些实施方案中，所述第二CISC组分包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
编码定点多肽或DNA核酸内切酶的核酸
在一些实施方案中，基因组编辑的方法和组合物因此可以使用编码定点多肽或DNA核酸内切酶的核酸序列。编码定点多肽的核酸序列可以是DNA或RNA。如果编码定点多肽的核酸序列是RNA，则其可以与gRNA序列共价连接或作为分开的序列存在。在一些实施方案中，可以使用所述定点多肽或DNA核酸内切酶的肽序列代替其核酸序列。
载体
在另一个方面，本公开提供了具有编码本公开的靶向基因组的核酸、本公开的定点多肽和/或实施本公开的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白性分子的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，这样的核酸是载体(例如，重组表达载体)。
预见到的表达载体包括、但不限于基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和从逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽造白细胞组织增生病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒衍生出的载体)的病毒载体和其他重组载体。为真核靶标细胞预见到的其他载体包括、但不限于载体pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40 (Pharmacia)。对于真核靶标细胞预见到的额外载体包括，但不限于，载体pCTx-1、pCTx-2和pCTx-3。可以使用其他载体，只要它们与宿主细胞相容。
在一些实施方案中，载体具有一个或多个转录和/或翻译控制元件。取决于利用的宿主/载体系统，在表达载体中可以使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。在一些实施方案中，所述载体是失活病毒序列或CRISPR机制的组分或其他元件的自失活载体。
合适的真核启动子(即，在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性实例包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40的那些，来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)，人延伸因子-1启动子(EF1)，具有与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂合构建体，鼠干细胞病毒启动子(MSCV)，磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)，和小鼠金属硫蛋白-I。
为了表达小RNA，包括与Cas核酸内切酶关联使用的指导RNA，多种启动子诸如RNA聚合酶III启动子(包括例如U6和H1)可以是有利的。关于增强这样的启动子的应用的描述和参数是本领域已知的，且另外的信息和方案正在定期描述中；参见，例如，Ma, H. 等人(2014). Mol. Ther. - Nucleic Acids 3:e161, doi:10.1038/mtna.2014.12。
所述表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。所述表达载体还可以包括用于放大表达的适当序列。所述表达载体还可以包括编码与定点多肽融合的非天然标签(例如，组氨酸标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生融合蛋白。
在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子(例如，热激启动子、四环素-调节型启动子、类固醇-调节型启动子、金属-调节型启动子、雌激素受体-调节型启动子等)。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子(例如，CMV启动子、UBC启动子)。在一些实施方案中，所述启动子是空间上受限的和/或时间上受限的启动子(例如，组织特异性的启动子、细胞类型特异性的启动子等)。在一些实施方案中，如果基因在其被插入基因组中之后将在基因组中存在的内源性启动子下表达，则该载体不具有用于待在宿主细胞中表达的至少一种基因的启动子。
定点多肽或DNA核酸内切酶
由NHEJ和/或HDR引起的靶标DNA的修饰可以导致，例如，突变、缺失、改变、整合、基因校正、基因替换、基因加标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。将非天然核酸整合到基因组DNA中的方法是基因组编辑的实例。
定点多肽是在基因组编辑中用于切割DNA的核酸酶。所述定点多肽可以作为一种或多种多肽或一种或多种编码所述多肽的核酸施用于细胞或患者。
在CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统的背景下，定点多肽可以结合指导RNA，所述指导RNA又指定所述多肽所针对的靶标DNA中的位点。在本文的CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统的实施方案中，所述定点多肽是核酸内切酶，诸如DNA核酸内切酶。这种RNA-指导的定点多肽在本文中也称为RNA-指导的核酸内切酶或RGEN。
示例性的定点多肽描述于WO2018/002719中。
靶标序列选择
在一些实施方案中，相对于特定参考基因座在5'边界和/或3'边界的位置中的转移被用于促进或增强基因编辑的特定应用，这部分地取决于为所述编辑选择的核酸内切酶系统，如在本文中进一步描述和举例说明的。
在这样的靶标序列选择的第一个非限制性方面，许多核酸内切酶系统具有指导初步选择潜在靶标位点用于切割的规则或标准，诸如在CRISPR II型或V型核酸内切酶的情况下在邻近DNA切割位点的特定位置对PAM序列基序的要求。
在靶标序列选择或优化的另一个非限制性方面，相对于靶上活性的频率评估关于靶标序列和基因编辑核酸内切酶的特定组合的“脱靶”活性频率(即在选择的靶标序列以外的位点处发生的DSB的频率)。在一些情况下，已经在期望的基因座处正确地编辑的细胞可以具有相对于其他细胞的选择性优点。选择性优点的示例性的但是非限制性的实例包括属性的获得，诸如增强的复制速率、持久性、对某些条件的抗性、增强的成功植入的比率或引入患者中之后的体内持久性、和与维持或增加的此类细胞的数目或生存力有关的其他属性。在其他情况下，通过一种或多种用于鉴定、分选或以其他方式选择已经被正确地编辑的细胞的筛选方法，可以正向地选择已经在期望的基因座处正确地编辑的细胞。选择性优点和定向选择方法可以利用与校正有关的表型。在一些实施方案中，可以将细胞编辑两次或更多次以便建立第二个修饰，其产生用于选择或纯化预期的细胞群体的新表型。通过添加用于可选择的或可筛选的标志物的第二种gRNA，可以建立这样的第二个修饰。在一些情况下，使用含有cDNA以及可选择标志物的DNA片段，可以在期望的基因座处正确地编辑细胞。
在一些实施方案中，不论任何选择性优点是否适用或任何定向选择是否应用于特定情况，还通过脱靶频率的考虑来指导靶标序列选择，以便增强应用的有效性和/或减小在期望的靶标以外的位点处的不希望的改变的可能性。如在本文中和在本领域中进一步描述和举例说明的，脱靶活性的发生受许多因素影响，包括靶标位点和各种脱靶位点之间的相似性和不同性、以及使用的特定核酸内切酶。辅助预测脱靶活性的生物信息学工具是可得到的，且这样的工具经常还可以用于鉴定脱靶活性的最可能位点，然后可以将其在实验场合中评估以评价脱靶活性与靶上活性的相对频率，由此允许选择具有较高相对靶上活性的序列。这样的技术的示例性实例提供在本文中，且其他是本领域已知的。
靶标序列选择的另一个方面涉及同源重组事件。共享同源性区域的序列可以充当导致间插序列缺失的同源重组事件的焦点。这样的重组事件发生在染色体和其他DNA序列的正常复制过程中，并且也发生在当合成DNA序列时的其他时间，诸如在修复双链断裂(DSB)的情况下，所述双链断裂(DSB)在正常细胞复制周期中定期发生，但是也可以被不同事件(诸如紫外线和DNA断裂的其他诱导物)的发生或某些试剂(诸如不同的化学诱导物)的存在而增强。许多这样的诱导物引起DSB在基因组中无差别地发生，并且DSB定期在正常细胞中被诱导和修复。在修复过程中，可以以完全保真度重构原始序列，然而，在一些情况下，在DSB位点处引入小插入或缺失(被称为“插入/缺失”)。
也可以在特定位置特异性地诱导DSB，如在本文所述的核酸内切酶系统的情况下，其可以用于在选择的染色体位置处引起定向或优先基因修饰事件。在许多情况下可以利用同源序列在DNA修复(以及复制)的背景下发生重组的趋势，并且是基因编辑系统(诸如CRISPR)的一种应用的基础，其中使用同源性引导的修复将目标序列(其通过使用“供体”多核苷酸提供)插入期望的染色体位置。
还可以使用在特定序列(其可以是小的“微同源性”的区域，其可以具有少至10个碱基对或更少)之间的同源性区域来实现期望的缺失。例如，将单个DSB引入在表现出与附近序列的微同源性的位点处。在这样的DSB的正常修复过程中，以高频率发生的结果是间插序列的缺失，其原因是DSB和伴随的细胞修复过程促进了重组。
然而，在一些情况下，选择在同源性区域内的靶标序列也可以引起大得多的缺失，包括基因融合(当缺失是在编码区中时)，其在特定情况下可以是或不是期望的。
本文提供的实例进一步举例说明了选择不同靶标区域用于建立DSB(其被设计成插入本文所述的一种或多种系统组分)，以及选择这样的区域内的特定靶标序列(其被设计成相对于靶上事件使脱靶事件最小化)。
靶向整合
在一些实施方案中，本文提供的方法是在靶标细胞(例如，T细胞)的基因组中的特定位置处整合编码本文所述的一种或多种系统组分的核酸，这被称为“靶向整合”。在一些实施方案中，通过使用序列特异性核酸酶在基因组DNA中生成双链断裂来实现靶向整合。
在一些实施方案中使用的CRISPR-Cas系统具有以下优点：可以快速筛选大量基因组靶标以鉴定最佳的CRISPR-Cas设计。所述CRISPR-Cas系统使用称为单一指导RNA(sgRNA)的RNA分子，其将相关的Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)靶向至DNA中的特定序列。这种靶向通过sgRNA和sgRNA的近似20 bp靶向序列内的基因组序列之间基于Watson-Crick碱基配对而发生。一旦结合在靶标位点处，所述Cas核酸酶将切割基因组DNA的两条链，产生双链断裂。用于设计sgRNA以靶向特定DNA序列的唯一要求是，靶标序列必须在sgRNA序列的3'末端包含与基因组序列互补的原间隔区相邻基序(PAM)序列。在来自化脓性链球菌的Cas9核酸酶的情况下，所述PAM序列是NRG(其中R是A或G，且N是任何碱基)，或更受限的PAM序列NGG。因此，可以通过将20 bp序列定位成与所有PAM基序相邻，在计算机芯片上设计靶向基因组的任何区域的sgRNA分子。PAM基序在真核生物的基因组中平均每15 bp出现。然而，通过计算机芯片上方法设计的sgRNA将在细胞中以不同的效率生成双链断裂，并且不可能使用计算机芯片上方法预测一系列sgRNA分子的切割效率。由于sgRNA可以在体外快速合成，这使得能够快速筛选给定基因组区域中所有潜在的sgRNA序列，以鉴定导致最有效切割的sgRNA。通常，当在细胞中测试给定基因组区域内的一系列sgRNA时，观察到0%和90%之间的切割效率范围。计算机芯片上算法以及实验室实验也可以用于确定任何给定sgRNA的脱靶潜能。尽管与sgRNA的20 bp识别序列的完美匹配将主要在大多数真核基因组中仅出现一次，但基因组中将存在许多其他位点与sgRNA具有1个或多个错配。这些位点可以以可变频率切割，这基于根据错配的数量或位置经常是无法预测的。在通过计算机芯片上分析未鉴定的额外脱靶位点处的切割也可发生。因此，在相关细胞类型中筛选许多sgRNA以鉴定具有最有利脱靶概况的sgRNA是选择最佳sgRNA用于治疗用途的关键组分。有利的脱靶概况将不仅考虑实际脱靶位点的数量和在这些位点处切割的频率，而且还考虑这些位点在基因组中的位置。例如，接近功能上重要的基因(尤其是癌基因或抗癌基因)或在功能上重要的基因(尤其是癌基因或抗癌基因)内的脱靶位点会被认为比不具有已知功能的基因间区域中的位点不利。因此，最佳sgRNA的鉴定不能简单地通过计算机芯片上分析生物体的基因组序列来预测，而是需要进行实验测试。尽管计算机芯片上分析可以有助于缩小测试的指导物的数量，但其无法预测具有高靶上切割的指导物或预测具有期望的低脱靶切割的指导物。给定的sgRNA促进Cas酶切割的能力可能与基因组DNA中的该特定位点的可及性相关，所述可及性可以通过该区域中的染色质结构来确定。静态分化细胞中的大多数基因组DNA存在于高度浓缩的异染色质中，而活跃转录的区域则以更开放的染色质状态存在，已知所述更开放的染色质状态对于大分子(诸如蛋白、如Cas蛋白)更容易接近。由于存在或不存在结合的转录因子或其他调节蛋白，甚至在活跃转录的基因内，DNA的一些特定区域也比其他区域更容易接近。预测基因组中或特定基因组基因座或基因组位点的区域内的位点是不可能的，且因此需要在相关细胞类型中实验确定。一旦选择一些位点作为潜在的插入位点，就可能在有或没有实验测试的情况下向该位点添加一些变异，例如，通过从选择的位点向上游或下游移动几个核苷酸。
在一些实施方案中，可以在本文公开的方法中使用的gRNA包括间隔区，所述间隔区包含SEQ ID NO:1-18中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1-18中任一者具有至少约85%核苷酸序列同一性的任何衍生物。
核酸修饰
在一些实施方案中，引入细胞中的多核苷酸具有一种或多种修饰，所述修饰可以独立地或组合地使用，例如，以增强活性、稳定性或特异性，改变递送，减少在宿主细胞中的先天性免疫应答，或用于其他增强，如在本文中进一步描述的和本领域已知的。
在一些实施方案中，将修饰的多核苷酸用在本文所述的CRISPR/Cas系统(诸如CRISPR/Cas9/Cpf1系统)中，在该情况下，可以修饰指导RNA (单分子指导或双分子指导)和/或引入细胞中的编码Cas或Cpf1核酸内切酶的DNA或RNA，如下面描述和举例说明的。这样的修饰的多核苷酸可以用在CRISPR/Cas系统中以编辑任何一个或多个基因组基因座。
为了这样的应用的非限制性举例说明的目的使用CRISPR/Cas系统，可以使用指导RNA的修饰来增强具有指导RNA(其可以是单分子指导或双分子)和Cas或Cpf1核酸内切酶的CRISPR/Cas基因组编辑复合物的形成或稳定性。指导RNA的修饰也可以或可替代地用于增强基因组编辑复合物与基因组中的靶标序列之间的相互作用的起始、稳定性或动力学，这可以用于例如增强靶上活性。指导RNA的修饰也可以或可替代地用于增强特异性，例如，靶上位点处的基因组编辑相对于在其他(脱靶)位点处的效应的相对比率。
修饰也可以或可替代地用于增加指导RNA的稳定性，例如，通过增加它对存在于细胞中的核糖核酸酶(RNA酶)的降解的抗性，由此引起它在所述细胞中的半衰期增加。在其中通过RNA(其需要翻译才能产生核酸内切酶)将Cas或Cpf1核酸内切酶引入要编辑的细胞中的实施方案中，增强指导RNA半衰期的修饰可以是特别有用的，因为在RNA编码核酸内切酶的同时增加引入的指导RNA的半衰期，可以用于增加所述指导RNA和所述编码的Cas或Cpf1核酸内切酶在细胞中共存的时间。
修饰也可以或可替代地用于减小引入细胞中的RNA引起先天性免疫应答的可能性或程度。这样的应答(其已经在RNA干扰(RNAi)的背景下确定地表征，包括小干扰RNA(siRNA)，如在下面和在本领域中描述的)倾向于与减小的RNA半衰期和/或细胞因子或其他因子(其与免疫应答有关)的引起相关。
还可以对引入细胞中的编码核酸内切酶的RNA做出一种或多种类型的修饰，包括、但不限于，增强RNA的稳定性的修饰(诸如通过增加存在于细胞中的RNA酶对它的降解)，增强得到的产物(即核酸内切酶)的翻译的修饰，和/或减小引入细胞中的RNA引起先天性免疫应答的可能性或程度的修饰。
同样可以使用修饰的组合，诸如前述和其他。在CRISPR/Cas的情况下，例如，可以对指导RNA做出一种或多种类型的修饰(包括上面举例说明的那些)，和/或可以对编码Cas核酸内切酶的RNA做出一种或多种类型的修饰(包括上面举例说明的那些)。
示例性的修饰的核酸描述于WO2018/002719中。
递送
在一些实施方案中，将本文提供的方法中使用的任何核酸分子，例如编码本公开的靶向基因组的核酸和/或定点多肽的核酸，包装到递送媒介物内部或递送媒介物的表面上用于递送给细胞。预见到的递送媒介物包括、但不限于纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。如在本领域中描述的，多种靶向部分可以用于增强这样的媒介物与期望的细胞类型或位置的优先相互作用。
本公开的复合物、多肽和核酸向细胞中的引入可以通过病毒或细菌噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、颗粒枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等而发生。
示例性的递送方法和试剂描述于WO2018/002719中。
上面已经参考特定替代方案描述了本公开。然而，在本公开的范围内，除了上述以外的其他替代方案同样是可能的。在本公开的范围内可以提供与上述方法步骤不同的方法步骤。本文描述的不同特征和步骤可以以除了描述的那些以外的其他组合来组合。
关于本文中的复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以对于情况和/或应用适当地从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，本文可以明确地阐述各种单数/复数置换。
本领域技术人员将理解，通常，本文中和尤其是在所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中使用的术语通常意欲作为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，等等)。
另外，在马库什组的方面描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，还由此在马库什组的任何个别成员或成员的亚组的方面来描述本公开。
第一至第十一方面的替代方案的任何特征均适用于本文中鉴定的所有方面和替代方案。此外，第一至第十一方面的替代方案的任何特征可以任何方式与本文所述的其他替代方案部分或全部独立地组合，例如，一个、两个或三个或更多个替代方案可以全部或部分组合。此外，可以使第一至第十一方面的替代方案的任何特征对其他方面或替代方案是任选的。尽管以上在各个示例性替代方案和实施方式的方面进行描述，但应当理解，在单独替代方案的一个或多个中描述的各种特征、方面和功能的适用性不限于描述它们的具体替代方案，而是反而可以单独地或以各种组合地应用于本申请的其他替代方案中的一个或多个，而不管是否描述此类替代方案以及此类特征是否呈现为所描述的替代方案的一部分。因此，本申请的宽度和范围不应受到任何上述示例性替代方案的限制。
本文引用的所有参考文献都通过引用以整体并入本文。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中含有的公开内容相抵触的程度上，本说明书意欲替代和/或优先于任何此类抵触的材料。在通过引用并入本文的出版物和专利或专利申请与说明书中含有的公开内容相抵触的程度上，本说明书意欲替代和/或优先于任何此类抵触的材料。
本公开的一个或多个实施方案中的细节在下面的随附描述中阐明。与本文所述的那些相似或等效的任何材料和方法都可以用于本公开的实践或测试中。本公开的其他特征、目的和优点将从说明书显而易见。在说明书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确规定。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，将以本说明书为准。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且鉴于其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
通过以下非限制性实施例进一步举例说明本文提供的公开的一些实施方案。
实施例
材料和方法
试剂
从293细胞的三重转染产生腺相关病毒(AAV)，并经由碘克沙醇梯度离心纯化。所有AAV都是血清型2/6的。单一指导RNA (sgRNA)从Synthego订购，并根据制造商的推荐使用。sgRNA序列的靶标结合部分如下：TRAC 1: 5’-ACAAAACTGTGCTAGACATG-3’ (SEQ ID NO:3)；TRAC 2: 5’-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3’ (SEQ ID NO:1)；TRAC 3: 5’-TCTCTCAGCTGGTACACGGC-3’ (SEQ ID NO:2)；IL2RG GC8: 5’-GGTTATCTCTGTTGGCTCCA-3’(SEQ ID NO:11)；IL2RG GC10: 5’-AAGGCTGATAATCAATCCCA-3’ (SEQ ID NO:13)；和IL2RGGC12: 5’-CCACGGCTTCCAATGCAAAC-3’ (SEQ ID NO:15)。Cas9酶 (TrueCut V2)购自ThermoFisher Scientific。使用前，将Cas9和sgRNA在室温下在磷酸盐缓冲盐水中复合至少10分钟。
以三种不同方式产生表达/不表达BCMA的细胞系的同基因对。首先，用Cas9和靶向BCMA的编码区中的5’-tattaagctcagtcccaaac-3’ (SEQ ID NO:78)序列的sgRNA转染RPMI-8266细胞。用PE-缀合的抗人BCMA抗体(Biolegend 357503)对细胞合并物进行染色，并分离未染色的细胞。第二，在正常BCMA-阴性的K562细胞中，通过使用靶向5’-ggggccactagggacaggat-3’ (SEQ ID NO:79)的sgRNA将SA-2A-BCMA-BGH聚A构建体整合至AAVS1基因座中，将BCMA表达置于低水平PPP1R12C (AAVS1)启动子的控制下。通过有限稀释克隆细胞，并通过流式细胞术证实BCMA表达。第三，在K562细胞中，通过使用靶向5’-ggggccactagggacaggat-3’ (SEQ ID NO:79)的sgRNA将MND-BCMA-BGH聚A构建体整合至AAVS1基因座中，将BCMA表达置于强MND启动子的控制下。通过有限稀释克隆细胞，并通过流式细胞术证实BCMA表达。分离两个克隆：一个具有高BCMA表达，且另一个具有非常高的BCMA表达。
T细胞培养
从个别全血白细胞(leukopaks)分离原代人CD3+ T细胞。在AIM-V培养基+5%人AB血清+50 ng/mL IL-2中培养T细胞。使用抗CD3/CD28磁珠(Miltenyi Biotec, 130-091-441)刺激细胞增殖。将细胞与珠粒以1:1比率以在0.5e6个细胞/mL的起始浓度孵育三天。然后除去珠粒，并使细胞在转染前分裂一天。
T细胞转染和感染
使用Lonza 4D核转染器和程序E0-115，用由60 pmol sgRNA和12 pmol Cas9组成的预复合的RNP转染细胞。转染后一小时，细胞用AAV2/6以范围为1,000-100,000的MOI (通常各自50,000)的感染，所述AAV2/6含有TRAC基因的BCMA-CAR/CISCβ或TNP-CAR/CISCβ靶向构建体和/或IL2RG基因的FRB/tLNGFR/CNb30/CISCγ靶向构建体。
流式细胞术
基因编辑后五天，通过流式细胞术分析T细胞的TRAC、IL2RG、CAR和CISC的表达。通过用APC-缀合的小鼠抗人α/β TCR(克隆IP26; Biolegend-目录号306702)对细胞染色来探测TRAC表达。用与小鼠抗人CD132 (BV421; BD Biosciences目录号566222)缀合的PE监测IL2RG表达。使用生物素化的-BCMA (Acro Biosystems BC7-H82F0)和PE-缀合的链霉抗生物素蛋白(BD Biosciences目录号554061)检测BCMA CAR表达；使用PE-缀合的山羊抗小鼠Fv F(ab)2 (Jackson Immunoresearch 115-066-072)检测BCMA和TNP CAR表达。用APC-缀合的小鼠抗人CD271 (克隆REA844; Miltenyi Biotec 130-112-791)监测tLNGFR表达。用定制的生物素：雷帕霉素缀合物和PE-缀合的链霉抗生物素蛋白显现CISC表达。所有流式细胞术都在Attune NxT (ThermoFisher)上进行。
细胞毒性测定
五十万个靶标细胞(RPMI-8226或RPMI-8226 BCMA-KO；K562或K562-BCMA-低或K562-BCMA高或K562-BCMA非常高)用eFluor 670 (Invitrogen #50-246-095)标记并与CART细胞以0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1的效应子:靶标比率孵育16小时。细胞合并物用DAPI(Invitrogen #D3571)染色以检测死细胞，与Countbrite计数珠粒(Invitrogen #C36950)混合以进行体积归一化，并定量eFluor 670-阳性、DAPI-阴性和eFluor-阳性、DAPI-阳性细胞。百分比活力被确定为活细胞的分数乘以100%；百分比细胞毒性被计算为100%减去百分比活力。
干扰素-γ ELISA
IFN-γ ELISA试剂盒购自R&D Systems，并根据制造商的说明使用。孵育16小时后，测量培养上清液。
小鼠异种移植测定
将500万个RPMI-8226或RPMI-8226 BCMA-KO细胞皮下注射至NSG小鼠中。肿瘤生长2.5周后，静脉内注射BCMA CAR-或TNP CAR-修饰的T细胞，并用卡尺监测肿瘤大小。
CISC-介导的细胞扩增
将具有整合至TRAC基因和IL2RG基因中的CISC的T细胞合并物在AIM-V培养基+5%AB血清+10 nM雷帕霉素(没有IL-2)中生长。
实施例1：gRNA的表征
靶向TRAC基因的gRNA
为了评估对于TRAC基因特异性的gRNA实现靶向切割的能力，从Synthego订购包括间隔区TRAC 1(SEQ ID NO:3)、TRAC 2(SEQ ID NO:1)和TRAC 3(SEQ ID NO:2)的gRNA，并在用抗CD3/CD8/CD28珠粒活化三天后，通过电穿孔在用Cas9/gRNA RNP(包括相应的gRNA)转染的原代人CD8+或CD3+ T细胞中进行评估。转染后48小时，使用TIDES方案(Brinkman, E.K.等人 (2014). Nucleic Acids Res., 42(22):e168)针对每种gRNA在靶上位点处的切割效率分析细胞，其中侧接预期切割位点的PCR引物用于从处理的细胞扩增基因组DNA，随后对PCR产物进行Sanger测序。当在细胞的基因组中产生双链断裂时，所述细胞试图修复双链断裂。该修复过程是易错的，其可能导致在双链断裂的位点处的核苷酸的缺失或插入。因为通过Cas9核酸酶重新切割被完全修复的断裂，而核苷酸的插入或缺失将阻止Cas9切割，所以存在代表切割效率的插入和缺失的聚集。然后使用计算机算法分析测序色谱图数据，所述计算机算法计算在预测切割位点处插入或缺失碱基的频率。插入或缺失的碱基(INDEL)的频率用于计算总体切割频率。在编辑后的第二天分析细胞的INDEL效率、细胞活力和总细胞数，这对于测试的所有3种gRNA都是相似的(表1，来自2次独立实验的结果)。gRNA对CD8+和CD3+ T细胞两者导致范围为54%至64%的INDEL效率，其中细胞活力范围为77%至89%，表明这些gRNA在T细胞中有效地切割其靶标位点而不诱导细胞毒性。
表1
Figure 322323DEST_PATH_IMAGE001
。
在编辑后第7天，通过流式细胞术针对TCR和CD3表达进一步分析细胞(表2)。与未处理的对照相比，每种gRNA都能够将CD8+和CD3+ T细胞两者中的TCR表达降低约90%或更多。在用每种gRNA处理的细胞中，取决于TCR表达的表面CD3表达也降低。这些结果支持INDEL效率的发现，并且表明用gRNA编辑能够抑制T细胞中的TCR表达，使通过编辑的细胞中的内源TCR的信号传导沉默。
表2
Figure 447319DEST_PATH_IMAGE002
。
为了评估由gRNA TRAC 1、TRAC 2和TRAC 3介导的供体模板在TRAC基因处的靶向整合，原代人CD3+ T细胞通过电穿孔用包括相应的gRNA的Cas9/gRNA RNP转染，随后立即用对应的AAV载体转导，用于以50,000的感染复数(MOI)整合，所述AAV载体具有对于每种gRNA特异性的同源臂，且携带编码CISC和mCherry标志物(SEQ ID NO:94-96)的供体模板。转导后48小时，对于mCherry和TCR表达，使用流式细胞术针对整合效率分析细胞。如表3中所示(来自用不同T细胞批次的两次独立实验的结果)，对于测试的三种gRNA各自实现供体模板的靶向整合，并且TCR-/CISC+细胞的量范围为约12%至约18%。
表3
Figure 961477DEST_PATH_IMAGE003
。
靶向IL2RG基因座的gRNA
为了评估对IL2RG基因座特异性的gRNA实现靶向切割的能力，从Synthego订购15种gRNA，包括靶向IL2RG基因的外显子6的间隔区GC1 (SEQ ID NO:4)、GC2 (SEQ ID NO:5)、GC3 (SEQ ID NO:6)、GC4 (SEQ ID NO:7)、GC5 (SEQ ID NO:8)、GC6 (SEQ ID NO:9)、GC7(SEQ ID NO:10)、GC8 (SEQ ID NO:11)、GC9 (SEQ ID NO:12)、GC10 (SEQ ID NO:13)、GC11(SEQ ID NO:14)、GC12 (SEQ ID NO:15)、GC13 (SEQ ID NO:16)、GC14 (SEQ ID NO:17)和GC15 (SEQ ID NO:18)，并在用抗CD3/CD8/CD28珠粒活化三天后，在通过电穿孔用包括相应的gRNA的Cas9/gRNA RNP转染的原代人CD3+ T细胞中评估。转染后48小时，如上所述，使用TIDES方案针对每种gRNA在靶上位点处的切割效率分析细胞。编辑后一天针对INDEL效率分析细胞，所述INDEL效率范围为约15%至约80%，表明许多gRNA在T细胞中在其靶标位点处有效地切割(表4，来自3次独立实验的结果)。
表4
Figure 91107DEST_PATH_IMAGE004
。
为了评估由gRNA GC8、GC10和GC12介导的供体模板在ILR2G基因座处的靶向整合，通过单独的电穿孔或随后立即用相应的AAV载体转导，用包括相应的gRNA的Cas9/gRNA RNP转染原代人CD3+ T细胞，用于以50,000的感染复数(MOI)整合，所述AAV载体具有对于每种gRNA特异性的同源臂(对于，SEQ ID NO:86和87的同源臂；对于GC10，SEQ ID NO:88和89的同源臂；和对于GC12，SEQ ID NO:90和91的同源臂)，且携带编码CISC和tLNGFR标志物(SEQID NO:97)的供体模板。转导后48小时，对于tLNGFR和INDEL效率，使用流式细胞术针对整合效率分析细胞。如表5中所示(来自用不同T细胞批次的两次独立实验的结果)，对于测试的三种gRNA各自实现供体模板的靶向整合，并且CISC+细胞的量(如通过tLNGFR表达所示)范围为约11%至约29%。
表5
Figure 639900DEST_PATH_IMAGE005
。
脱靶分析
使用GUIDE-seq方法在原代人CD3+细胞中评估靶向人IL2RG的gRNA GC8、GC10和GC12的脱靶位点(Tsai, S. Q.等人 (2015). Nat. Biotechnol., 33(2):187-197)。GUIDE-seq是用于鉴定切割位点的经验方法。GUIDE-seq依赖于寡核苷酸在染色体DNA中的双链断裂的位点处的自发捕获。简而言之，在用指导RNA/Cas9 RNP复合物和双链寡核苷酸转染细胞后，从细胞纯化基因组DNA，进行声处理，并进行一系列衔接子连接以创建文库。对含有寡核苷酸的文库进行高通量DNA测序，并使用默认GUIDE-seq软件处理输出，以鉴定寡核苷酸捕获的位点。
平行处理未转染含有SpCas9和sgRNA的RNP的样品。从进一步分析排除在含有RNP的样品和未含有RNP的样品两者中发现的位点(+/-1 kb)。
通过使通用衔接子与含有8-聚体分子索引的样品条形码衔接子(A01-A16)各自退火来制备Y-衔接子。使用Qubit荧光计(ThermoFisher Scientific)定量从用RNP和GUIDE-seq ODN核转染的CD3+ T细胞提取的基因组DNA，并将所有样品针对120 µl体积的TE缓冲液中的400 ng进行归一化。根据Covaris S220超声仪的标准操作程序，将基因组DNA剪切至200 bp的平均长度。为了证实平均片段长度，根据制造商的方案，在TapeStation(Agilent)上分析1 µl样品。根据制造商的方案，使用AMPure XP SPRI珠粒清洁剪切的DNA的样品，并洗脱于17 µl TE缓冲液中。通过混合1.2 µl dNTP混合物(5 mM每种dNTP)、3 µl10 x T4 DNA连接酶缓冲液、2.4 µl End-Repair Mix、2.4 µl 10x Platinum Taq缓冲液(没有Mg2+)、0.6 µl Taq聚合酶(非热启动)和14 µl剪切的DNA样品(来自上一步)（每管总体积为22.5 µl）执行末端修复反应，并在热循环仪中孵育(12℃，15分钟；37℃，15分钟；72℃，15分钟；4℃保持)。向其中添加1 µl退火的Y衔接子(10 µM)和2 µl T4 DNA连接酶，并将混合物在热循环仪中孵育(16℃，30分钟；22℃，30分钟；4℃保持)。根据制造商的方案，使用AMPure XP SPRI珠粒清洁样品，并洗脱于23 µl TE缓冲液中。根据制造商的方案，在TapeStation上运行1 µl样品，以证实衔接子与片段的连接。为了制备GUIDE-seq文库，准备反应，其含有14 µl无核酸酶的H2O、3.6 µl 10 x Platinum Taq缓冲液、0.7 µl dNTP混合物(各自10 mM)、1.4 µl MgCl2、50 mM，0.36 µl Platinum Taq聚合酶、1.2 µl有义或反义基因特异性引物(10 µM)、1.8 µl TMAC(0.5 M)、0.6 µl P5_1 (10 µM)和10 µl来自前一步骤的样品。将该混合物在热循环仪中孵育(95℃，5分钟，然后15个循环的95℃，30秒；70℃(每个周期减1℃)持续2分钟；72℃，30秒；随后10个循环的95℃，30秒；55℃，1分钟；72℃，30秒；随后72℃，5分钟)。根据制造商的方案，使用AMPure XP SPRI珠粒清洁PCR反应，并稀释于15 µl TE缓冲液中。根据制造商的方案，在TapeStation上检查1 µl样品，以追踪样品进展。通过混合6.5 µl无核酸酶的H2O、3.6 µl 10x Platinum Taq缓冲液(没有Mg2+)、0.7 µldNTP混合物(各自10 mM)、1.4 µl MgCl2 (50 mM)、0.4 µl Platinum Taq聚合酶、1.2 µl基因特异性引物(GSP)2(有义：+，或反义：-)、1.8 µl TMAC (0.5 M)、0.6 µl P5_2(10 µM)和15 µl来自前一步骤的PCR产物，进行第二次PCR。。
对于每种gRNA，对多个独立细胞样品重复(来自独立转染)完成GUIDE-seq，并且结果显示于表6和7中。这些结果表明gRNA间隔区GC8、GC10和GC12的总体有利的靶上/脱靶概况。
表6：CD3+ T细胞中具有间隔区GC8、GC10和GC12的gRNA的GUIDE-seq结果的概述
Figure 196783DEST_PATH_IMAGE006
。
表7：至少2个细胞样品重复中通过GUIDE-seq检测到的靶外位点的细节
Figure 198237DEST_PATH_IMAGE007
1.位置是指Genome Reference Consortium Human Build 38 (hg38)中的基因组位置。NCBI Genome Data Viewer用于注释每个位置(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv)。
尽管脱靶:靶上读取值的百分比提供了gRNA是否对于其预期靶标特异性的总体代表，但可能涉及其他因素。例如，生物体的存活所需的必需基因的外显子中的候选gRNA的脱靶位点可能使gRNA不适合在临床中使用。另一方面，非编码或内含子区域中的脱靶位点可能造成较少的担忧。对于评估意欲用于治疗用途的gRNA有用的考量包括1)脱靶位点的数量，2)脱靶位点的位置，3)脱靶编辑与靶上编辑相比的频率，和4)脱靶位点与gRNA间隔区序列的同源性程度。
通过在细胞样品重复中复制实验来验证潜在的脱靶位点。因此，申请人进行实验，以鉴定使用靶向IL2RG外显子6的gRNA编辑的细胞中潜在的脱靶位点。在多个细胞样品重复中检测到的脱靶位点报告于表7中。GUIDE-seq中的每个脱靶位点与靶上位点的读取计数的比较提供了每种sgRNA的脱靶位点的脱靶效率的估算值。这些数据连同关于基因组位点以及脱靶位点是否位于基因的编码区内的信息概述于表7中。Zheng, T.等人已经显示由对应于与原间隔区相邻基序(PAM)相邻的靶标序列的间隔区的七个核苷酸组成的间隔区种子序列对于错配是敏感的(Zheng, T. 等人(2017). Sci. Rep., 7, 40638.)。不会预测具有对应于sgRNA间隔区种子序列的错配的预测的脱靶位点被有效地编辑。在该种子区域中具有错配的此类脱靶位点可能是假阳性。真正的脱靶频率可以通过深度测序方法、诸如扩增子测序进行证实(参见Medinger, R. 等人 (2010). Mol. Ecol., 19(Suppl. 1):32-40)。
使用扩增子测序在原代人CD3+细胞中评估了靶向人TRAC的gRNA间隔区TRAC 1(SEQ ID NO:3)的靶上位点和潜在的脱靶位点。设计了一对PCR引物，以扩增~200 bp的目标区域，其中潜在的切割位点位于近似中间。从RNP-处理和模拟-转染的细胞生成条形码化扩增子，进行多重化，并进行高通量DNA测序。使用Pandaseq 2.11 (Masella, A. P., 等人(2012). BMC bioinformatics, 13(1), 31)，对序列读取值进行去多重化，配对末端读取值比对和合并，并用使用Biopython 1.69 pairwise2比对器的定制软件确定每个靶标位点的INDEL频率。对于每个靶标位点，进行最少10,000次序列读取和在读取集合间平均40,000次。如表8中所示，脱靶位点的INDEL频率为约85%。鉴定三个潜在的脱靶位点，其中INDEL频率大于0.2%，但这些似乎由测序运行中的噪音导致。这些结果表明，gRNA间隔区TRAC 1的高度有利的靶上/脱靶概况。
表8
Figure 865979DEST_PATH_IMAGE008
Figure 518546DEST_PATH_IMAGE009
。
总体而言，CD3+ T细胞中来自GUIDE-seq和扩增子测序分析的结果表明，具有间隔区GC8、GC10、GC12和TRAC 1的gRNA是用于进一步使用、诸如在过继细胞疗法或其他基于细胞的疗法中的良好候选物。
使用本文所述的GUIDE-seq和/或扩增子测序方法针对其在人细胞中的靶上/脱靶概况筛选在人TRAC和IL2RG基因中具有靶标位点的额外gRNA，被考虑作为为了产生抗BCMACAR T细胞的目的鉴定可用于靶向这些基因的额外gRNA分子的方法。
实施例2：通过在TRAC基因处的靶向整合来生成和表征表达抗BCMA CAR的T细胞
使用靶向TRAC的Cas9/sgRNA RNP与设计用于通过HDR整合的AAV供体模板的组合，生成将编码抗BCMA CAR的表达盒靶向整合入TRAC基因的T细胞。通常，应当配置经设计用于HDR-介导的整合的供体模板，使得整合位点靠近gRNA靶标位点，例如距离小于10 bp(blog.addgene.org/crispr-101-homology-directed-repair)。AAV供体模板含有具有其自身启动子且被同源臂侧接的表达盒，所述同源臂包括RNP中sgRNA的靶标位点(图1，供体模板构建体#1和#6)。
从个别全血白细胞(leukopaks)分离原代人CD3+ T细胞。 在AIM-V培养基+5%人AB血清+50 NG/ML IL-2中培养分离的T细胞。 将细胞使用抗CD3/CD28磁珠(MiltenyiBiotec, 130-091-441)以1:1比率以0.5e6个细胞/mL的起始浓度刺激以增殖三天。 然后除去珠粒，并使细胞在转染前分裂一天。
通过将60 pmol TRAC 3 sgRNA (间隔区序列：TCTCTCAGCTGGTACACGGC (SEQ IDNO:2))和12 pmol Cas9 (TrueCut V2, Thermo Fisher Scientific)在磷酸盐缓冲盐水中在室温下组合至少10分钟，制备靶向TRAC基因的Cas9/sgRNA RNP。使用Lonza 4D核转染器和程序E0-115用RNP转染细胞。转染后一小时，将细胞用供体AAV2/6载体以20,000的MOI感染，用于表达具有CD28共刺激结构域的抗BCMA CAR (#1 TRAC 3，SEQ ID NO:20)，具有4-1BB共刺激结构域的抗BCMA CAR (#6 TRAC 3，SEQ ID NO:35)，具有CD28共刺激结构域的抗TNP CAR(SEQ ID NO:92)或具有4-1BB共刺激结构域的抗TNP CAR (SEQ ID NO:93)。
编辑后五天，将细胞用抗小鼠Fv-生物素染色，随后用链霉抗生物素蛋白-PE染色，并通过流式细胞术进行分析。如表9中所示，9%至12%的用抗BCMA CAR供体处理的T细胞显示CAR表达。这些结果表明，表达盒至T细胞中的TRAC基因中的靶向整合允许从整合的盒表达CAR。
表9
Figure 246330DEST_PATH_IMAGE010
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实施例3：同时分析TRAC和CAR表达
为了评估将异源序列靶向整合至TRAC基因中对TCR表达的影响，如实施例2中所述处理的T细胞在用抗α/β TCR抗体和生物素化的BCMA/链霉抗生物素蛋白-PE同时处理后五天进行染色，并通过流式细胞术进行分析。 当用靶向TRAC的Cas9/sgRNA RNP处理时，近似90%的T细胞缺乏TCR表达，且18%至22%的用靶向TRAC的Cas9/sgRNA RNP和抗BCMA CAR AAV供体处理的T细胞是TCR-阴性的并表达抗BCMA CAR(表10)。 这些结果表明，使用靶向TRAC的Cas9/gRNA RNP编辑T细胞对于敲除编辑细胞中的TCR表达是有效的。
表10
Figure 469501DEST_PATH_IMAGE011
。
实施例4： CAR持续至转染后第12天
为了评估抗BCMA CAR T细胞中的抗BCMA CAR表达的持久性，如实施例2中所述处理的T细胞在用抗α/β TCR抗体和生物素化的BCMA/链霉抗生物素蛋白-PE同时处理后第12天进行染色，并通过流式细胞术进行分析。 当用靶向TRAC的RNP处理时，近似90%的细胞缺乏TCR表达，且22%至30%的用抗BCMA CAR AAV供体处理的T细胞是TCR-阴性的并表达抗BCMACAR(表11)。 这些结果表明，抗BCMA CAR表达在编辑的T细胞中至少持续至转染后第12天。
表11
Figure 940934DEST_PATH_IMAGE012
。
在另一项实验中，通过用识别每个CAR的细胞外抗体部分的抗小鼠抗体染色，随后进行流式细胞术分析，在转染后第12天评估如实施例2中处理的T细胞的CAR表达。在本实验中未评估α/β TCR表达，因为抗小鼠可变链CAR检测试剂干扰小鼠TCR抗体。18%至30%的T细胞表达CAR(表12)。
表12
Figure 933161DEST_PATH_IMAGE013
。
实施例5：更多的AAV得到更多的CAR阳性细胞
为了评估用于转导的AAV供体的量对抗BCMA CAR表达的影响，如实施例2中编辑T细胞，但MOI为25,000、50,000或100,000。用抗α/β TCR抗体和生物素化的BCMA/链霉抗生物素蛋白-PE同时对细胞染色，并在编辑后五天通过流式细胞仪进行分析。当用靶向TRAC的RNP处理时，大于95%的细胞缺乏TCR表达，且20%至60%的T细胞表达抗BCMA CAR，其中抗BCMACAR+细胞的量与AAV供体MOI正相关(表13)。这些结果表明AAV供体MOI对供体整合效率的剂量应答。
表13
Figure 97426DEST_PATH_IMAGE014
。
实施例6：抗BCMA CAR T细胞对表达BCMA的细胞是细胞毒性的
本实施例表明抗BCMA CAR T细胞对表达BCMA的细胞的细胞毒性。T细胞用含有TRAC 3或TRAC 1 sgRNA的RNP转染，且然后用相应的AAV供体(α-BCMA/CD28/CD3z TRAC 1，SEQ ID NO:21；α-BCMA/CD28/CD3z TRAC 3，SEQ ID NO:20；或α-BCMA/41BB/CD3z-CISCβTRAC 1，SEQ ID NO:36)以50,000的MOI感染。转染后14天(TRAC 1 sgRNA)或22天(TRAC 3sgRNA)，在细胞毒性测定中使用T细胞，以野生型K562细胞(不表达BCMA)或K562 VeryHigh-BCMA (K562 VH-BCMA)细胞(表达BCMA)作为靶标细胞，效应子：靶标比率为8:1。在与抗BCMA CAR T细胞共培养后，K562 VH-BCMA靶标细胞活力(如通过DAPI染色确定)从93%下降至26%，而在与抗BCMA CAR T细胞共培养后，K562靶标细胞活力保持在约82% (表14)，表明抗BCMA CAR T细胞对表达BCMA的细胞是细胞毒性的，并且细胞毒性取决于BCMA表达。
表14
Figure 558625DEST_PATH_IMAGE015
。
实施例7：细胞毒性需要结合BCMA的CAR
本实施例表明CAR T细胞对表达BCMA的细胞的细胞毒性取决于CAR对BCMA的特异性。T细胞用含有TRAC 1 sgRNA的RNP转染，且然后用对应的编码抗TNP CAR (α-TNP/CD28/CD3ζ CAR TRAC 1，SEQ ID NO:92；或α-TNP/41BB/CD3ζ CAR TRAC 1，SEQ ID NO:93)的AAV供体或对应的编码抗BCMA CAR (α-BCMA/CD28/CD3z TRAC 1，SEQ ID NO:21；或α-BCMA/41BB/CD3z-CISCβ TRAC 1，SEQ ID NO:36)的AAV供体以50,000的MOI感染。转染后14天，在细胞毒性测定中使用T细胞，以K562 Very High-BCMA (K562 VH-BCMA)作为靶标细胞，效应子：靶标比率为8:1。暴露于抗BCMA CAR T细胞后，靶标细胞活力从93%下降至~40%，而暴露于抗TNP CAR T细胞仅使活力降低~10%(表15)。这些结果表明抗BCMA CAR T细胞细胞毒性对抗BCMA CAR特异性的依赖性。
表15
Figure 568170DEST_PATH_IMAGE016
。
使用具有41BB共刺激结构域的抗BCMA CAR构建体，进行额外的实验以进一步证明CAR特异性的细胞毒性。如上所述，将TNP-特异性或BCMA-特异性CAR T细胞与K562 VH-BCMA细胞以各种CAR T:靶标细胞比率(2:1至16:1)共培养。在共培养后，将细胞用DAPI染色，并测量DAPI-阳性和DAPI-阴性细胞的频率。暴露于BCMA-特异性而非TNP特异性的CAR T细胞引起培养物的活力与E:T比率大致成比例下降，在16:1 E:T比率下达到~13%的最低点(表16)。在没有CAR T暴露的情况下，靶标细胞活力>95%(未显示)。这些结果进一步表明，杀死表达BCMA的靶标细胞需要CAR T效应细胞的BCMA特异性。
表16
Figure 680482DEST_PATH_IMAGE017
1：效应子:靶标(E:T)比率。
实施例8：靶向整合至IL2RG基因座中
本实施例证明使用靶向IL2RG基因的gRNA和相容的供体模板靶向整合至该基因中。T细胞用含有靶向IL2RG基因的外显子6的GC8、GC10或GC12 sgRNA的RNP转染，且然后用FRB/tLNGFR/CNb30/CISC-γ供体AAV (SEQ ID NO:40)以50,000的MOI感染。包括仅用RNP和仅用AAV的条件作为对照。在转染后1.5天，将细胞用抗IL2RG和抗LNGFR抗体同时染色，并通过流式细胞术进行分析。当分别使用GC8、GC10和GC12 sgRNA时，4%、4%和6%的细胞表达tLNGFR转基因(表17)。对于所有RNP-处理的样品，大于85%的细胞丢失IL2RG表达。
表17
Figure 218911DEST_PATH_IMAGE018
。
在另一项实验中，T细胞用含有GC8、GC10或GC12 sgRNA的RNP转染，且然后用对应的sgRNA-特异性FRB/tLNGFR/CNb30/CISC-γ供体AAV例如以50,000的MOI感染，所述sgRNA-特异性FRB/tLNGFR/CNb30/CISC-γ供体AAV被突变以防止整合的转基因的再切割并促进正确的同源性依赖的DNA修复(例如，对于GC8、GC10或GC12 sgRNA分别为SEQ ID NO:41、42或43)。细胞用抗IL2RG和抗LNGFR抗体同时染色，并在转染后(例如，转染后1.5天)通过流式细胞术分析tLNGFR转基因表达和IL2RG表达。
实施例9：同时TI入TRAC基因和IL2RG基因
T细胞用靶向TRAC的RNP(例如，TRAC 3、TRAC 2或TRAC 1 RNP)连同靶向IL2RG的RNP(例如，GC8、GC10或GC12 RNP)转染。 转染后(例如，转染后三十分钟)，细胞用编码靶向至TRAC基因的抗BCMA CAR/CISC-b(例如SEQ ID NO:28-39)的供体AAV和编码靶向至IL2RG基因的FRB/tLNGFR/CNb30/CISC-γ (例如SEQ ID NO:40-44)的供体AAV感染(例如，两者MOI均为50,000)。 将细胞回收至含有雷帕霉素或rapalog (例如1 nM雷帕霉素)的培养基中，并维持在含有雷帕霉素/rapalog的培养基中。 在转染后(例如，转染后五天)通过流式细胞术测定细胞的TRAC表达、CAR表达、IL2RG表达和/或TLNGFR表达。
进行流式细胞术以说明双重靶向整合的效率。CD8+ T细胞用CD3/CD28珠粒刺激三天，除去珠粒，且然后一天后用TRAC 1 RNP + BCMA CAR-CISCβ AAV和IL2RG GC12 RNP +FRB-tLNGFR-CNb30-CISCγ AAV处理细胞。以25,000的感染复数使用供体AAV；TRAC 1 RNP含有30 pmol指导RNA和6 pmol Cas9；且IL2RG GC12 RNP含有60 pmol指导RNA和12 pmolCas9。将细胞回收至含有1nM雷帕霉素的培养基中，并维持在含有雷帕霉素的培养基中。处理后1、3和7天，通过流式细胞术分析细胞的tLNGFR的存在和抗BCMA CAR的存在。在这些实验中，单基因座靶向的效率范围为约20%，而双重靶向频率(例如，在两个基因座处同时靶向整合)约近似8%(表18)。
表18
Figure 931521DEST_PATH_IMAGE019
。
实施例10：同时TI入TRAC和IL2RG得到CISC-可调节的T细胞
将来自实施例9的修饰细胞或对应的未修饰细胞在雷帕霉素存在的情况下扩增，例如，扩增两周或扩增至至少100倍扩增。在该扩增后，将细胞转移至任选地补充有IL-2(例如，100ng/mL IL-2)的无雷帕霉素的培养基中，并监测细胞的活力(例如每天监测，持续七天)。
实施例11：同时TI入TRAC和IL2RG得到环孢菌素抗性细胞
使来自实施例9的修饰细胞或对应的未修饰细胞在环孢菌素A和雷帕霉素(或rapalog)存在的情况下生长，并监测细胞的增殖和/或活力。
实施例12：同时TI入TRAC和IL2RG得到表达BCMA和B2M-CAR的细胞
T细胞用靶向TRAC的RNP(例如，TRAC 3、TRAC 2或TRAC 1 RNP)连同靶向IL2RG的RNP(例如，GC8、GC10或GC12 RNP)转染。 转染后(例如，转染后三十分钟)，细胞用编码靶向至TRAC的抗BCMA CAR/CISC-b(例如SEQ ID NO:28-39)的供体AAV和编码靶向至IL2RG的B2M-CAR/FRB/CNb30/CISC-γ (例如SEQ ID NO:44)的供体AAV感染(例如，两者MOI均为50,000)。 将细胞回收至含有雷帕霉素(例如1 nM雷帕霉素)的培养基中，并维持在含有雷帕霉素的培养基中。 在转染后(例如，转染后五天)通过流式细胞术测定细胞的TRAC表达、抗BCMA CAR表达、IL2RG表达和/或B2M CAR表达。
实施例13：BCMA/B2M CAR T细胞杀死两种不同的靶标细胞类型
在实施例6和7中所述的细胞毒性测定中使用来自实施例12的修饰细胞和对应的未修饰细胞与表达BCMA的靶标细胞或T淋巴细胞靶标细胞，所述T淋巴细胞靶标细胞衍生自由其衍生修饰细胞的不相关的T细胞供体。
实施例14：BCMA CAR T细胞在体内杀死多发性骨髓瘤细胞
将来自实施例5和实施例9的修饰细胞静脉内注射入携带建立的异种移植多发性骨髓瘤肿瘤(例如，源自RPMI-8226细胞系或RPMI-8226细胞的BCMA-阴性合并物)的NSG小鼠中。监测肿瘤大小(例如，在注射后每天监测，持续两周)。
将五百万个RPMI-8226细胞植入NSG小鼠中，并使其形成肿瘤。肿瘤生长十九天后，给小鼠注射PBS、8百万个TNP CAR T细胞或8百万个BCMA CAR T细胞。处死未处理的小鼠、用抗TNP CAR T细胞处理的小鼠和响应于用抗BCMA CAR T细胞处理而具有肿瘤消退的小鼠，分离肿瘤，并通过流式细胞术分析所得的细胞悬浮液的人CD45，作为浸润响应的肿瘤的CART细胞的标志物(CD45是白细胞标志物，并且在RPMI-8226细胞中不表达)。仅用抗BCMA CART细胞处理的小鼠显示施用的人T细胞的肿瘤浸润，其中12.00%的来自肿瘤的细胞为hCD45+，相比之下，对照小鼠和用抗TNP CAR T细胞的小鼠分别为0.05%和0.19%。通过流式细胞术进一步分析该hCD45+细胞群体的人CD8和CAR表达。如表19中所示，约96%的hCD45+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是CD8+，且14.66%是CD8+和CAR+。这些结果表明，施用的淋巴细胞的肿瘤浸润是抗BCMA CAR T细胞处理特异性的。耗竭标志物、诸如LAG3、TIM3和PD1无法检测到(未显示)。
表19
Figure 744756DEST_PATH_IMAGE020
。
实施例15：CAR-特异性和抗原-特异性T细胞脱粒
为了评估经编辑以表达CAR的T细胞中的脱粒，将抗TNP CAR T细胞或抗BCMA CART细胞与BCMA蛋白、K562细胞或K562 VH-BCMA细胞在抗CD107a抗体(CD107a是细胞毒性T细胞中的脱粒的标志物)和莫能菌素(以避免CD107a的内化)存在的情况下孵育18小时。在孵育后，通过流式细胞术分析细胞的CD107a表达，并且结果显示于表20中。在抗BCMA CAR+ T细胞+ BCMA蛋白条件下的抗BCMA CAR+ T细胞的百分比为25%(数据未显示)，并且在该条件下的脱粒细胞的百分比为22%，表明几乎所有用BCMA蛋白处理的抗BCMA CAR+ T细胞都被活化以脱粒。相比之下，在抗TNP CAR T细胞+ BCMA蛋白条件下仅0.24%的细胞被脱粒。这些结果表明抗BCMA CAR T细胞的CAR-特异性、抗原特异性T细胞脱粒。用K562 VH-BCMA细胞观察到较弱的刺激，并且脱粒仍然是靶标特异性和CAR特异性的。
表20
Figure 180417DEST_PATH_IMAGE021
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Claims (145)

1.工程改造的T细胞，其包含：a)内源T细胞受体α (TRA)基因，其被修饰以编码非功能性T细胞受体α恒定(TRAC)结构域；和b)编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体(CAR)可以识别B细胞成熟抗原(BCMA)。
2.权利要求1的细胞，其中可以识别BCMA的CAR包含细胞外BCMA识别结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
3.权利要求2的细胞，其中所述细胞外BCMA识别结构域是可以特异性结合BCMA的抗体部分。
4.权利要求3的细胞，其中所述抗体部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其包含来自SEQ ID NO:55的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2、HC-CDR3、轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3。
5.权利要求3或4的细胞，其中所述抗体部分是scFv。
6.权利要求2-5中任一项的细胞，其中所述CAR跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述CAR共刺激结构域包含4-1BB和/或CD28共刺激结构域，和/或所述CAR细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
7.权利要求1-6中任一项的细胞，其中b)编码可以识别BCMA的CAR的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域，或b)编码可以识别BCMA的CAR的核酸被插入内源IL2RG基因。
8.权利要求1-7中任一项的细胞，其进一步包含c)一种或多种编码二聚化可活化化学诱导的信号传导复合物(CISC)的多肽组分的核酸，其中所述CISC的多肽组分包含：
i) 第一CISC组分，其包含第一细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分；和
ii) 第二CISC组分，其包含第二细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分；
其中所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置为使得当表达时，它们在配体存在的情况下二聚化以产生有信号传导能力的CISC。
9.权利要求8的细胞，其中所述第一CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基γ(IL2Rγ)细胞质信号传导结构域。
10.权利要求9的细胞，其中所述IL2Rγ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
11.权利要求8-10中任一项的细胞，其中所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分。
12.权利要求11的细胞，其中所述FKBP结构域包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
13.权利要求8-12中任一项的细胞，其中所述第二CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基β (IL2Rβ)细胞质信号传导结构域。
14.权利要求13的细胞，其中所述IL2Rβ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
15.权利要求8-14中任一项的细胞，其中所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。
16.权利要求15的细胞，其中所述FRB包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:48的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
17.权利要求8-16中任一项的细胞，其中所述第一和第二CISC组分的跨膜结构域独立地包含IL-2受体跨膜结构域。
18.权利要求8-17中任一项的细胞，其中1)一个或多个编码所述第一CISC组分的核酸被插入内源IL2RG基因，且一个或多个编码所述第二CISC组分的核酸被插入内源TRA基因的编码所述TRAC结构域的区域；或2)一个或多个编码所述第一CISC组分的核酸被插入内源TRA基因的编码所述TRAC结构域的区域，且一个或多个编码所述第二CISC组分的核酸被插入内源IL2RG基因。
19.权利要求1-18中任一项的细胞，其中所述配体是雷帕霉素或雷帕霉素类似物(rapalog)。
20.权利要求19的细胞，其中所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
21.权利要求1-20中任一项的细胞，其中所述配体以0.05 nM至100 nM的量存在或提供。
22.权利要求1-21中任一项的细胞，其进一步包含d)一种或多种编码嵌合受体的核酸，所述嵌合受体包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
23.权利要求22的细胞，其中所述嵌合受体跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述嵌合受体共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，和/或所述嵌合受体细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
24.权利要求23的细胞，其中所述嵌合受体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其与SEQID NO:65的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
25.权利要求22-24中任一项的细胞，其中d)一种或多种编码所述嵌合受体的核酸被插入内源TRA基因的编码所述TRAC结构域的区域，或d)一种或多种编码所述嵌合受体的核酸被插入内源IL2RG基因。
26.权利要求1-25中任一项的细胞，其进一步包含g)编码可选择标志物的核酸。
27.权利要求26的细胞，其中所述可选择标志物是截短的低亲和力神经生长因子受体(tLNGFR)多肽。
28.权利要求27的细胞，其中所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
29.权利要求26-28中任一项的细胞，其中编码所述可选择标志物的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域，或编码所述可选择标志物的核酸被插入内源IL2RG基因。
30.权利要求1-29中任一项的细胞，其进一步包含e)编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸。
31.权利要求30的细胞，其中所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽赋予对他克莫司(FK506)和/或环孢菌素A (CSA)的抗性。
32.权利要求30或31的细胞，其中所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型钙调神经磷酸酶(CN)多肽。
33.权利要求32的细胞，其中所述突变型CN多肽赋予对他克莫司(FK506)和环孢菌素A(CSA)的抗性。
34.权利要求32或33的细胞，其中所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQ ID NO:67)。
35.权利要求30-34中任一项的细胞，其中所述编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域，或所述编码赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽的核酸被插入内源IL2RG基因。
36.权利要求1-35中任一项的细胞，其进一步包含f)编码雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸。
37.权利要求36的细胞，其中所述FRB结构域多肽在细胞内表达。
38.权利要求36或37的细胞，其中所述FRB结构域多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸或与SEQ ID NO:68或69的氨基酸具有至少90%序列同源性的变体。
39.权利要求36-38中任一项的细胞，其中编码所述FRB结构域多肽的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域，或编码所述FRB结构域多肽的核酸被插入内源IL2RG基因。
40.指导RNA (gRNA)，其包含与内源TRA基因中的编码所述TRAC结构域的区域内或附近的序列互补的序列。
41.权利要求40的gRNA，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:1-3中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1-3中任一者具有至少85%同源性的变体。
42.指导RNA (gRNA)，其包含与内源IL2RG基因内或附近的序列互补的序列。
43.权利要求42的gRNA，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:4-18中任一者具有至少85%同源性的变体。
44.系统，其包含：a)第一gRNA和/或第二gRNA，其中所述第一gRNA是权利要求40或41的gRNA，且所述第二gRNA是权利要求42或43的gRNA；和b) RNA-指导的核酸内切酶(RGEN)或编码RGEN的核酸。
45.权利要求44的系统，其进一步包含c)一种或多种供体模板，其包含编码以下的核酸：
i) 可以识别B细胞成熟抗原(BCMA)多肽的CAR；
ii) 第一CISC组分，其包含第一细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分或其功能衍生物；和
iii) 第二CISC组分，其包含第二细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分，
其中所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置为使得当由T细胞表达时，它们在配体存在的情况下二聚化以产生能够促进T细胞的存活和/或增殖的有信号传导能力的CISC。
46.权利要求45的系统，其中可以识别BCMA的CAR包含细胞外BCMA识别结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
47.权利要求46的系统，其中所述细胞外BCMA识别结构域是可以特异性结合BCMA的抗体部分。
48.权利要求47的系统，其中所述抗体部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其包含来自SEQ ID NO:55的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2、HC-CDR3、轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3。
49.权利要求47或48的系统，其中所述抗体部分是scFv。
50.权利要求46-49中任一项的系统，其中所述CAR跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述CAR共刺激结构域包含4-1BB和/或CD28共刺激结构域，和/或所述CAR细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
51.权利要求45-50中任一项的系统，其中所述第一CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基γ (IL2Rγ)结构域。
52.权利要求51的系统，其中所述IL2Rγ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
53.权利要求45-52中任一项的系统，其中所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分。
54.权利要求53的系统，其中所述FKBP结构域包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
55.权利要求45-54中任一项的系统，其中所述第二CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基β (IL2Rβ)结构域。
56.权利要求55的系统，其中所述IL2Rβ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
57.权利要求45-56中任一项的系统，其中所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。
58.权利要求57的系统，其中所述FRB包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:48的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
59.权利要求45-58中任一项的系统，其中所述第一和第二CISC组分的跨膜结构域独立地包含IL-2受体跨膜结构域。
60.权利要求45-59中任一项的系统，其中所述配体是雷帕霉素或rapalog。
61.权利要求60的系统，其中所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
62.权利要求45-61中任一项的系统，其中c)一种或多种供体模板进一步包含编码以下中的一种或多种的核酸：
iv) 嵌合受体，其包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域；
v) 可选择标志物；
vi) 赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；或
vii) 雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽。
63.权利要求62的系统，其中所述嵌合受体跨膜结构域包含CD8跨膜结构域多肽，所述嵌合受体共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，和/或所述嵌合受体细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
64.权利要求63的系统，其中所述嵌合受体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其与SEQID NO:65的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
65.权利要求62-64中任一项的系统，其中所述可选择标志物是截短的低亲和力神经生长因子受体(tLNGFR)多肽。
66.权利要求65的系统，其中所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
67.权利要求62-66中任一项的系统，其中所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型钙调神经磷酸酶(CN)多肽。
68.权利要求67的系统，其中所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQ ID NO:67)。
69.权利要求62-68中任一项的系统，其中所述FRB结构域多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸或与SEQ ID NO:68或69的氨基酸具有至少90%序列同源性的变体。
70.权利要求44-69中任一项的系统，其中所述RGEN选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1核酸内切酶或其功能衍生物。
71.权利要求44-70中任一项的系统，其中所述RGEN是Cas9。
72.权利要求44-71中任一项的系统，其中编码RGEN的核酸是核糖核酸(RNA)序列。
73.权利要求72的系统，其中所述编码RGEN的RNA序列经由共价键连接至所述第一gRNA或所述第二gRNA。
74.权利要求45-73中任一项的系统，其包含腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒(AAV)载体包含一种或多种供体模板之一。
75.权利要求74的系统，其中所述AAV载体包含SEQ ID NO:19-46中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:19-46中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
76.权利要求74或75的系统，其包含所述第一gRNA和第一AAV载体以及所述第二gRNA和第二AAV载体，其中
(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；
(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或
(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
77.权利要求74或75的系统，其包含：
(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；
(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或
(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
78.权利要求74或75的系统，其包含：
(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:25的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；
(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:26的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:26的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或
(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:27的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:27的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
79.权利要求44-78中任一项的系统，其包含核糖核蛋白(RNP)复合物，所述核糖核蛋白(RNP)复合物包含RGEN和第一gRNA和/或第二gRNA。
80.权利要求79的系统，其中将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA分别以1:1至20:1之间的gRNA与RGEN的摩尔比预复合，以形成RNP。
81.载体，其包含SEQ ID NO:19-46中任一者的核酸序列或其与SEQ ID NO:19-46中任一者具有至少85%同源性的变体。
82.权利要求81的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。
83.编辑细胞的基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供：
a) 第一gRNA和/或第二gRNA，其中所述第一gRNA是权利要求40或41的gRNA，且所述第二gRNA是权利要求42或43的gRNA；
b) RGEN或编码RGEN的核酸；和
c) 一种或多种供体模板，其包含编码以下的核酸：
i) 可以识别BCMA多肽的CAR；
ii) 第一CISC组分，其包含第一细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分或其功能衍生物；和
iii) 第二CISC组分，其包含第二细胞外结合结构域或其部分、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分，
其中所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置为使得当由T细胞表达时，它们在配体存在的情况下二聚化以产生能够促进T细胞的存活和/或增殖的有信号传导能力的CISC。
84.权利要求83的方法，其中可以识别BCMA的CAR包含细胞外BCMA识别结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
85.权利要求84的方法，其中所述细胞外BCMA识别结构域是可以特异性结合BCMA的抗体部分。
86.权利要求85的方法，其中所述抗体部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其包含来自SEQ ID NO:55的重链互补决定区(HC-CDR)1、HC-CDR2、HC-CDR3、轻链互补决定区(LC-CDR)1、LC-CDR2和LC-CDR3。
87.权利要求85或86的方法，其中所述抗体部分是scFv。
88.权利要求84-87中任一项的方法，其中所述CAR跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述CAR共刺激结构域包含4-1BB和/或CD28共刺激结构域，和/或所述CAR细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
89.权利要求83-88中任一项的方法，其中所述第一CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基γ (IL2Rγ)细胞质信号传导结构域。
90.权利要求89的方法，其中所述IL2Rγ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
91.权利要求83-90中任一项的方法，其中所述第一细胞外结合结构域或其部分包含FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其部分。
92.权利要求91的方法，其中所述FKBP结构域包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
93.权利要求83-92中任一项的方法，其中所述第二CISC组分的信号传导结构域包含IL-2受体亚基β (IL2Rβ)细胞质信号传导结构域。
94.权利要求93的方法，其中所述IL2Rβ细胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
95.权利要求83-94中任一项的方法，其中所述第二细胞外结合结构域或其部分包含FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域或其部分。
96.权利要求95的方法，其中所述FRB结构域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
97.权利要求83-96中任一项的方法，其中所述第一和第二CISC组分的跨膜结构域独立地包含IL-2受体跨膜结构域。
98.权利要求83-97中任一项的方法，其中所述配体是雷帕霉素或rapalog。
99.权利要求98的方法，其中所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
100.权利要求83-99中任一项的方法，其中c)一种或多种供体模板进一步包含编码以下中的一种或多种的核酸：
iv) 嵌合受体，其包含细胞外β2-微球蛋白结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞质信号传导结构域；
v) 可选择标志物；
vi) 赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽；或
vii) 雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽。
101.权利要求100的方法，其中所述嵌合受体跨膜结构域包含CD8跨膜结构域多肽，所述嵌合受体共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，和/或所述嵌合受体细胞质信号传导结构域包含CD3-ζ细胞质信号传导结构域。
102.权利要求101的方法，其中所述嵌合受体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少85%同源性的变体。
103.权利要求100-102中任一项的方法，其中所述可选择标志物是截短的低亲和力神经生长因子受体(tLNGFR)多肽。
104.权利要求103的方法，其中所述tLNGFR多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
105.权利要求100-104中任一项的方法，其中所述赋予对一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂的抗性的多肽是突变型钙调神经磷酸酶(CN)多肽。
106.权利要求105的方法，其中所述突变型CN多肽是CNb30 (SEQ ID NO:67)。
107.权利要求100-106中任一项的方法，其中所述FRB结构域多肽包含SEQ ID NO:68或69的氨基酸或与SEQ ID NO:68或69的氨基酸具有至少90%序列同源性的变体。
108.编辑细胞的基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中
(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:28、31、34和37中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ IDNO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；
(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:29、32、35和38中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ IDNO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或
(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一载体包含SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:30、33、36和39中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二载体包含SEQ IDNO:40-44中任一者的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:40-44中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
109.编辑细胞的基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中
(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:19或22的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；
(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:20或23的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或
(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:21或24的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:45的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:45的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
110.编辑细胞的基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供第一gRNA、第二gRNA、RGEN或编码RGEN的核酸、第一载体和第二载体，其中
(A)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:25的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:25的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；
(B)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:26的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:26的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体；或
(C)所述第一gRNA包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第一AAV载体包含SEQ ID NO:27的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:27的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，所述第二gRNA包含SEQ IDNO:4-18中任一者的多核苷酸序列及其与SEQ ID NO:4-18中任一者的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体，且所述第二AAV载体包含SEQ ID NO:46的多核苷酸序列或其与SEQ IDNO:46的多核苷酸序列具有至少85%同源性的变体。
111.权利要求83-110中任一项的方法，其中所述RGEN选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1核酸内切酶或其功能衍生物。
112.权利要求83-111中任一项的方法，其中所述RGEN是Cas9。
113.权利要求83-112中任一项的方法，其中编码RGEN的核酸是核糖核酸(RNA)序列。
114.权利要求113的方法，其中所述编码RGEN的RNA序列经由共价键连接至所述第一gRNA或所述第二gRNA。
115.权利要求83-114中任一项的方法，其中所述供体模板包含在AAV载体中。
116.权利要求83-115中任一项的方法，其中在提供给所述细胞之前，将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA预复合，形成RNP复合物。
117.权利要求116的方法，其中将所述RGEN与所述第一gRNA和/或所述第二gRNA分别以1:1至20:1之间的gRNA与RGEN的摩尔比预复合。
118.权利要求83-117中任一项的方法，其中所述一种或多种供体模板被独立地插入所述细胞的基因组中。
119.权利要求118的方法，其中第一供体模板被插入TRA基因或基因调节元件处、内或附近，和/或第二供体模板被插入IL2RG基因或基因调节元件处、内或附近。
120.权利要求118或119的方法，其中编码i)所述第一CISC组分的核酸被插入内源IL2RG基因，和/或编码ii)所述第二CISC组分的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域；或编码i)所述第一CISC组分的核酸被插入内源TRA基因的编码TRAC结构域的区域；和/或编码ii)所述第二CISC组分的核酸被插入所述内源IL2RG基因。
121.权利要求83-120中任一项的方法，其中所述细胞是T细胞。
122.权利要求121的方法，其中所述T细胞是CD8+细胞毒性T淋巴细胞或CD3+泛T细胞。
123.权利要求121或122的方法，其中所述T细胞是源自多个供体的T细胞的合并物的成员。
124.权利要求123的方法，其中所述多个供体是人供体。
125.权利要求83-124中任一项的方法，其中所述细胞对浆细胞是细胞毒性的。
126.通过权利要求83-125中任一项的方法产生的工程改造的细胞。
127.权利要求1-39和126中任一项的工程改造的细胞，其中所述工程改造的细胞对浆细胞是细胞毒性的。
128.治疗有此需要的受试者中的移植物抗宿主病(GvHD)或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括： 将权利要求1-39或126中任一项的工程改造的细胞施用于所述受试者。
129.治疗有此需要的受试者中的疾病或病况的方法，其中所述疾病或病况的特征在于不利的抗体产生，所述方法包括：
a) 根据权利要求83-120中任一项的方法编辑T细胞的基因组，由此产生工程改造的T细胞；和
b) 将所述工程改造的T细胞施用于所述受试者。
130.权利要求129的方法，其中所述T细胞对所述受试者是自体的。
131.权利要求120的方法，其中所述T细胞对所述受试者是同种异体的。
132.权利要求131的方法，其中所述T细胞包含源自多个供体的T细胞的合并物。
133.权利要求132的方法，其中所述多个供体是人供体。
134.治疗有此需要的受试者中的疾病或病况的方法，其中所述疾病或病况的特征在于不利的抗体产生，所述方法包括根据权利要求83-120中任一项的方法编辑所述受试者中的T细胞的基因组。
135.权利要求129-134中任一项的方法，其中所述T细胞包含CD8+细胞毒性T细胞或CD3+泛T细胞。
136.权利要求128-135中任一项的方法，其中所述受试者是人。
137.权利要求128-136中任一项的方法，其进一步包括将雷帕霉素或rapalog施用于所述受试者。
138.权利要求137的方法，其中所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
139.权利要求137-138中任一项的方法，其中所述雷帕霉素或rapalog以0.05 nM至100nM的浓度施用。
140.权利要求129-139中任一项的方法，其中所述疾病或病况是移植物抗宿主病(GvHD)、抗体介导的自身免疫或轻链淀粉样变性。
141.权利要求140的方法，其中所述疾病或病况是GvHD，且所述受试者先前已经接受同种异体移植。
142.试剂盒，其包含：使用说明书和a)权利要求1-39或126中任一项的工程改造的细胞和/或权利要求44-80中任一项的系统的一种或多种组分；和/或b)雷帕霉素或rapalog。
143.权利要求142的试剂盒，其中所述rapalog选自依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573或其代谢物、衍生物和/或其组合。
144.注射器，其包含权利要求1-39或126中任一项的工程改造的细胞或包含权利要求44-80中任一项的系统的一种或多种组分的组合物。
145.导管，其包含权利要求1-39或126中任一项的工程改造的细胞或包含权利要求44-80中任一项的系统的一种或多种组分的组合物。
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