BR112020021894A2 - Células car-t anti-bcma para depleção de células plasmáticas - Google Patents
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Abstract
células car-t anti-bcma para depleção de células plasmáticas. a presente invenção refere-se a composições e métodos para a depleção controlada de células plasmáticas, tal como para o tratamento de várias doenças e condições associadas às células plasmáticas.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CÉLU- LAS CAR-T ANTI-BCMA PARA DEPLEÇÃO DE CÉLULAS PLASMÁ- TICAS”. Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pe- dido de Patente Provisória US. No. 62/663.974, depositado em 27 de abril de 2018, e o Pedido de Patente Provisória US. No. 62/773.058, depositado em 29 de novembro de 2018, as descrições de cada um de- les são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Listagem de Sequências
[0002] Este pedido contém uma Listagem de Sequências que foi en- viada eletronicamente em formato ASCII e é incorporada aqui por refe- rência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 26 de abril de 2019, chama-se 052984-515001WO_SL_ST25.txt e tem 295.038 bytes. Campo
[0003] A presente descrição refere-se a composições e métodos para a depleção controlada de células plasmáticas em um indivíduo. Em particular, as composições incluem uma arquitetura geral para gerar complexos de sinalização induzida por produtos químicos sintéticos fisi- ologicamente funcionais (CISCs) que permitem controlar a sobrevida e / ou a proliferação de células T. Além disso, são fornecidos métodos de uso de tais composições, tal como para o tratamento de várias doenças e condições. Antecedentes
[0004] Os receptores de antígenos quiméricos (CARs) são recepto- res manipulados usados para manipular geneticamente células T para uso em imunoterapia com células adotivas (ver Pule, M. e outros (2003). Cytother., 5 (3): 211 a 226; Restifo, NP e outros (2012). Nat. Rev. Immu- nol. 12 (4): 269 a 281). A ligação ao antígeno estimula os domínios de sinalização no segmento intracelular do CAR, ativando assim as vias de sinalização. A imunoterapia com células adotivas baseada em CAR tem sido usada para tratar pacientes com câncer com tumores refratários aos tratamentos convencionais padrão (ver Grupp, SA e outros (2013). N. Engl. J. Med. 368 (16): 1509 a 1518; Kalos, M. e outros (2011). Sci. Transl. Med. 3 (95): 95ra73).
[0005] A imunoterapia com células adotivas baseada em CAR tam- bém pode ser usada para direcionar as células hospedeiras envolvidas em uma doença ou condição. Por exemplo, as células CAR T específi- cas para células plasmáticas produtoras de anticorpos poderiam ser po- tencialmente usadas para tratar doenças ou condições caracterizadas por uma resposta imune adversa mediada por anticorpos, tal como au- toimunidade ou rejeição de enxerto de órgão. No entanto, a administra- ção de células CAR T convencionais direcionadas a células plasmáticas em um indivíduo levaria à depleção descontrolada de células plasmáti- cas no indivíduo, o que poderia resultar em efeitos adversos graves, tal como incapacidade de responder a infecções patogênicas. Permanece a necessidade de novas composições e métodos que permitam contro- lar a depleção de células plasmáticas para permitir tratamentos viáveis para doenças e condições caracterizadas pela produção adversa de an- ticorpos. Sumário
[0006] São descritas aqui células T manipuladas citotóxicas em di- reção às células plasmáticas, em que as células T manipuladas com- preendem um complexo de sinalização induzida por produtos químicos (CISC) permitindo a sobrevida e / ou a proliferação controlada das célu- las T manipuladas, métodos de produção e uso de células T manipula- das, e composições úteis para os métodos.
[0007] Em um aspecto, é fornecida neste documento uma célula T manipulada compreendendo a) um gene de receptor alfa de célula T
(TRA) endógeno modificado para codificar um domínio constante de re- ceptor alfa de célula T não funcional (TRAC); e b) um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR) que pode reco- nhecer o antígeno de maturação de células B (BCMA). Em algumas mo- dalidades, a sobrevida e / ou proliferação da célula T manipulada pode ser controlada pela modulação da quantidade de um ligando em contato com a célula T manipulada.
[0008] Em algumas modalidades, o CAR que pode reconhecer BCMA compreende um domínio de reconhecimento de BCMA extrace- lular, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmático.
[0009] Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento de BCMA extracelular é uma porção de anticorpo que pode se ligar espe- cificamente a BCMA.
[0010] Em algumas modalidades, a porção do anticorpo compre- ende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende a região determinante de comple- mentaridade de cadeia pesada (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC-CDR3, re- gião determinante de complementaridade de cadeia leve (LC-CDR)1, LC-CDR2 e LC-CDR3 da SEQ ID NO: 55.
[0011] Em algumas modalidades, a porção do anticorpo é um scFv.
[0012] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de CAR compreende um domínio transmembrana CD8, o domínio coesti- mulatório de CAR compreende um domínio coestimulatório 4-1BB e / ou CD28, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático de CAR compre- ende um domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ.
[0013] Em algumas modalidades, o b) ácido nucleico codificando um CAR que pode reconhecer BCMA é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC e / ou b) o ácido nucleico codi- ficando um CAR que pode reconhecer BCMA é inserido em um gene
IL2RG endógeno.
[0014] Em algumas modalidades, os componentes polipeptídicos do CISC compreendem i) um primeiro componente de CISC compreen- dendo um primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização ou porção do mesmo; e ii) um segundo compo- nente de CISC compreendendo um segundo domínio de ligação extra- celular ou porção do mesmo, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização ou porção do mesmo; em que o primeiro componente de CISC e o segundo componente de CISC são configurados de modo que, quando expressos, eles dimerizam na presença do ligando para criar um CISC competente em sinalização.
[0015] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização do pri- meiro componente de CISC compreende um domínio de sinalização ci- toplasmático do receptor de IL-2 subunidade gama (IL2Rγ).
[0016] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplas- mático de IL2Rγ compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0017] Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação ex- tracelular ou porção do mesmo compreende um domínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo.
[0018] Em algumas modalidades, o domínio FKBP compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 47.
[0019] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização do se- gundo componente de CISC compreende um domínio de sinalização citoplasmático do receptor de IL-2 subunidade beta (IL2Rβ).
[0020] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplas- mático de IL2Rβ compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.
[0021] Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação ex- tracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma porção do mesmo.
[0022] Em algumas modalidades, o FRB compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0023] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana do pri- meiro e do segundo componente de CISC compreende, independente- mente, um domínio transmembrana do receptor de IL-2.
[0024] Em algumas modalidades, 1) os um ou mais ácidos nucleicos codificando o primeiro componente de CISC são inseridos em um gene IL2RG endógeno e os um ou mais ácidos nucleicos codificando o se- gundo componente de CISC são inseridos na região do gene TRA en- dógeno codificando o domínio TRAC; ou 2) os um ou mais ácidos nu- cleicos codificando o primeiro componente de CISC são inseridos na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC e os um ou mais ácidos nucleicos codificando o segundo componente de CISC são inseridos no gene IL2RG endógeno.
[0025] Em algumas modalidades, o ligando é rapamicina ou um análogo de rapamicina (rapalog).
[0026] Em algumas modalidades, o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenó- lico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903, ou AP23573, ou meta- bólitos, derivados, e / ou combinações dos mesmos.
[0027] Em algumas modalidades, o ligando está presente ou é for- necido em uma quantidade de 0,05 nM a 100 nM.
[0028] Em algumas modalidades, a célula compreende ainda d) um ou mais ácidos nucleicos codificando um receptor quimérico compreen- dendo um domínio extracelular de β2-microglobulina, um domínio trans- membrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmático.
[0029] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de re- ceptor quimérico compreende um domínio transmembrana CD8, o do- mínio coestimulatório do receptor quimérico compreende um domínio coestimulatório 4-1BB, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático do receptor quimérico compreende um domínio de sinalização citoplas- mático CD3-ζ.
[0030] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 65.
[0031] Em algumas modalidades, d) um ou mais ácidos nucleicos codificando o receptor quimérico são inseridos na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC ou d) um ou mais ácidos nuclei- cos codificando o receptor quimérico são inseridos em um gene IL2RG endógeno.
[0032] Em algumas modalidades, a célula compreende ainda g) um ácido nucleico codificando um marcador selecionável.
[0033] Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um po- lipeptídeo truncado do receptor do fator de crescimento do nervo de baixa afinidade (tLNGFR).
[0034] Em algumas modalidades, o polipeptídeo tLNGFR compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[0035] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando o marcador selecionável é inserido na região do gene TRA endógeno co- dificando o domínio TRAC ou o ácido nucleico codificando o marcador selecionável é inserido em um gene IL2RG endógeno.
[0036] Em algumas modalidades, a célula compreende ainda e) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina.
[0037] Em algumas modalidades, o polipeptídeo que confere resis- tência a um ou mais inibidores de calcineurina confere resistência ao tacrolimus (FK506) e / ou ciclosporina A (CsA).
[0038] Em algumas modalidades, o polipeptídeo que confere resis- tência a um ou mais inibidores de calcineurina é um polipeptídeo de calcineurina (CN) mutante.
[0039] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CN mutante con- fere resistência a tacrolimus (FK506) e ciclosporina A (CsA).
[0040] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67).
[0041] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando o po- lipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineu- rina é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC ou o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resis- tência a um ou mais os inibidores de calcineurina são inseridos em um gene IL2RG endógeno.
[0042] Em algumas modalidades, a célula compreende ainda f) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo de domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR).
[0043] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio FRB é expresso intracelularmente.
[0044] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio FRB compreende o aminoácido da SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante tendo pelo menos 90% de homologia de sequência com o aminoácido da SEQ ID NO: 68 ou 69.
[0045] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando o po- lipeptídeo de domínio FRB é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC ou o ácido nucleico codificando o polipep- tídeo de domínio FRB é inserido em um gene IL2RG endógeno.
[0046] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um RNA guia (gRNA) que compreende uma sequência que é complementar a uma sequência em um gene TRA endógeno dentro ou próximo de uma região codificando o domínio TRAC.
[0047] Em algumas modalidades, o gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3, ou uma vari- ante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3.
[0048] Em outro aspecto, é fornecido aqui um RNA guia (gRNA) que compreende uma sequência que é complementar a uma sequência den- tro ou próximo de um gene IL2RG endógeno.
[0049] Em algumas modalidades, o gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, ou uma va- riante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18.
[0050] Em outro aspecto, é fornecido aqui um sistema que compre- ende a) um primeiro gRNA e / ou um segundo gRNA, em que o primeiro gRNA é um gRNA de acordo com qualquer uma das modalidades des- critas acima e o segundo gRNA é um gRNA de acordo com qualquer das modalidades descritas acima; e b) uma endonuclease guiada por RNA (RGEN) ou um ácido nucleico codificando o RGEN.
[0051] Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda c) um ou mais modelos de doadores compreendendo a codificação de ácido nucleico: i) um CAR que pode reconhecer um polipeptídeo de an- tígeno de maturação de células B (BCMA); ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um domínio de dobradiça, um domínio transmem- brana, e um domínio de sinalização ou porção do mesmo ou derivado funcional do mesmo; e iii) um segundo componente de CISC compre- endendo um segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização ou porção do mesmo, em que o primeiro com- ponente de CISC e o segundo componente de CISC são configurados de modo que quando expressos por uma célula T, eles dimerizam na presença de um ligando para criar um CISC competente em sinalização capaz de promover a sobrevida e / ou proliferação da célula T.
[0052] Em algumas modalidades, o CAR que pode reconhecer BCMA compreende um domínio de reconhecimento de BCMA extrace- lular, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmático.
[0053] Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento de BCMA extracelular é uma porção de anticorpo que pode se ligar espe- cificamente a BCMA.
[0054] Em algumas modalidades, a porção do anticorpo compre- ende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende a região determinante de comple- mentaridade de cadeia pesada (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC-CDR3, re- gião determinante de complementaridade de cadeia leve (LC-CDR)1, LC-CDR2 e LC-CDR3 da SEQ ID NO: 55.
[0055] Em algumas modalidades, a porção do anticorpo é um scFv.
[0056] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de CAR compreende um domínio transmembrana CD8, o domínio coesti- mulatório de CAR compreende um domínio coestimulatório 4-1BB e / ou CD28, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático de CAR compre- ende um domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ.
[0057] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização do pri- meiro componente de CISC compreende um domínio do receptor de IL- 2 subunidade gama (IL2Rγ).
[0058] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplas- mático de IL2Rγ compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50.
[0059] Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação ex- tracelular ou porção do mesmo compreende um domínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo.
[0060] Em algumas modalidades, o domínio FKBP compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 47.
[0061] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização do se- gundo componente de CISC compreende um domínio do receptor de IL- 2 subunidade beta (IL2Rβ).
[0062] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplas- mático de IL2Rβ compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.
[0063] Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação ex- tracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma porção do mesmo.
[0064] Em algumas modalidades, FRB compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0065] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana do pri-
meiro e do segundo componente de CISC compreende, independente- mente, um domínio transmembrana do receptor de IL-2.
[0066] Em algumas modalidades, o ligando é rapamicina ou um ra- palog.
[0067] Em algumas modalidades, o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenó- lico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903, ou AP23573, ou meta- bólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos.
[0068] Em algumas modalidades, c) um ou mais modelos de doado- res compreendem ainda ácido nucleico codificando um ou mais dentre: iv) um receptor quimérico que compreende um domínio extracelular β2- microglobulina, um domínio transmembrana, um domínio coestimulató- rio, e um domínio de sinalização citoplasmático; v) um marcador seleci- onável; vi) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibi- dores de calcineurina; ou vii) um polipeptídeo de domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR).
[0069] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana do re- ceptor quimérico compreende um polipeptídeo de domínio transmem- brana CD8, o domínio coestimulatório do receptor quimérico compre- ende um domínio coestimulatório 4-1BB, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático do receptor quimérico compreende um domínio de sina- lização citoplasmático CD3-ζ.
[0070] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 65.
[0071] Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um po- lipeptídeo truncado do receptor do fator de crescimento do nervo de baixa afinidade (tLNGFR).
[0072] Em algumas modalidades, o polipeptídeo tLNGFR compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[0073] Em algumas modalidades, o polipeptídeo que confere resis- tência a um ou mais inibidores de calcineurina é um polipeptídeo da calcineurina (CN) mutante.
[0074] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67).
[0075] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio FRB compreende o aminoácido da SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante tendo pelo menos 90% de homologia de sequência com o aminoácido da SEQ ID NO: 68 ou 69.
[0076] Em algumas modalidades, o RGEN é selecionado a partir do grupo que consiste em endonuclease Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecido como Csn1 e Csx12), Cas100, Csy1, Csy2 , Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, Csx10, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 e Cpf1, ou um derivado funcional das mesmas.
[0077] Em algumas modalidades, o RGEN é Cas9.
[0078] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando o RGEN é uma sequência de ácido ribonucleico (RNA).
[0079] Em algumas modalidades, a sequência de RNA codificando o RGEN está ligada ao primeiro gRNA ou ao segundo gRNA por meio de uma ligação covalente.
[0080] Em algumas modalidades, o sistema compreende um vetor de vírus adenoassociado (AAV) que compreende um de um ou mais modelos de doadores.
[0081] Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 46 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 46.
[0082] Em algumas modalidades, o sistema compreende o primeiro gRNA e um primeiro vetor AAV e o segundo gRNA e um segundo vetor AAV, em que (A) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleo- tídica de SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de qualquer um das SEQ ID NOs: 40 a 44; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38, o segundo gRNA compreende a sequên- cia polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e varian- tes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs : 40 a 44 ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica de qualquer um de SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44.
[0083] Em algumas modalidades, o sistema compreende: (A) o pri- meiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 19 ou 22 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 19 ou 22, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID
NO: 45; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o pri- meiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 20 ou 23 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 20 ou 23, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO : 21 ou 24 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo em pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compre- ende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de SEQ ID NO: 45.
[0084] Em algumas modalidades, o sistema compreende: (A) o pri- meiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 25, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 46; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV com- preende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26 ou uma vari- ante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26, o segundo gRNA compreende a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46; ou (C) o pri- meiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 27 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 27, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ
ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46
[0085] Em algumas modalidades, o sistema compreende um com- plexo de ribonucleoproteína (RNP) compreendendo o RGEN e o pri- meiro gRNA e / ou o segundo gRNA.
[0086] Em algumas modalidades, o RGEN é pré-complexado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA em uma relação molar de gRNA para RGEN entre 1:1 e 20:1, respectivamente, para formar o RNP.
[0087] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um vetor que compreende a sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 46, ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 46.
[0088] Em algumas modalidades, o vetor é um Vetor de Vírus Ade- noassociado (AAV).
[0089] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método de edição do genoma de uma célula, o método compreendendo fornecer à célula: a) um primeiro gRNA e / ou um segundo gRNA, em que o pri- meiro gRNA é um gRNA de acordo com qualquer das modalidades des- critas acima e o segundo gRNA é um gRNA de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima; b) um RGEN ou um ácido nu- cleico codificando o RGEN; e c) um ou mais modelos de doadores com- preendendo a codificação de ácido nucleico: i) um CAR que pode reco- nhecer um polipeptídeo BCMA; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização ou porção do mesmo, ou derivado funcional do mesmo; e iii) um segundo componente de CISC compreendendo um segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um do- mínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de si- nalização ou porção do mesmo, em que o primeiro componente de CISC e o segundo componente de CISC são configurados de modo que quando expressos por uma célula T, eles dimerizam na presença de um ligando para criar um CISC competente em sinalização capaz de pro- mover a sobrevida e / ou proliferação da célula T.
[0090] Em algumas modalidades, o CAR que pode reconhecer BCMA compreende um domínio de reconhecimento de BCMA extrace- lular, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmático.
[0091] Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento de BCMA extracelular é uma porção de anticorpo que pode se ligar espe- cificamente a BCMA.
[0092] Em algumas modalidades, a porção do anticorpo compre- ende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende a região determinante de comple- mentaridade de cadeia pesada (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC-CDR3, re- gião determinante de complementaridade de cadeia leve (LC-CDR)1, LC-CDR2 e LC-CDR3 da SEQ ID NO: 55.
[0093] Em algumas modalidades, a porção do anticorpo é um scFv.
[0094] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de CAR compreende um domínio transmembrana CD8, o domínio coesti- mulatório de CAR compreende um domínio coestimulatório 4-1BB e / ou CD28, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático de CAR compre- ende um domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ.
[0095] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização do pri- meiro componente de CISC compreende um domínio de sinalização ci- toplasmático do receptor de IL-2 subunidade gama (IL2Rγ).
[0096] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplas- mático de IL2Rγ compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0097] Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação ex- tracelular ou porção do mesmo compreende um domínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo.
[0098] Em algumas modalidades, o domínio FKBP compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 47.
[0099] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização do se- gundo componente de CISC compreende um domínio de sinalização citoplasmático do receptor de IL-2 subunidade beta (IL2Rβ).
[0100] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplas- mático de IL2Rβ compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51.
[0101] Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação ex- tracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma porção do mesmo.
[0102] Em algumas modalidades, o domínio FRB compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0103] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana do pri- meiro e do segundo componente de CISC compreende, independente- mente, um domínio transmembrana do receptor de IL-2.
[0104] Em algumas modalidades, o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenó- lico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903, ou AP23573, ou meta- bólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos.
[0105] Em algumas modalidades, c) um ou mais modelos de doado- res compreendem ainda ácido nucleico codificando um ou mais dentre: iv) um receptor quimérico que compreende um domínio extracelular β2- microglobulina, um domínio transmembrana, um domínio coestimulató- rio, e um domínio de sinalização citoplasmático; v) um marcador seleci- onável; vi) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibi- dores de calcineurina; ou vii) um polipeptídeo de domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR).
[0106] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana do re- ceptor quimérico compreende um polipeptídeo de domínio transmem- brana CD8, o domínio coestimulatório do receptor quimérico compre- ende um domínio coestimulatório 4-1BB, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático do receptor quimérico compreende um domínio de sina- lização citoplasmático CD3-ζ.
[0107] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 65.
[0108] Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um po- lipeptídeo truncado do receptor do fator de crescimento do nervo de baixa afinidade (tLNGFR).
[0109] Em algumas modalidades, o polipeptídeo tLNGFR compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[0110] Em algumas modalidades, o polipeptídeo que confere resis- tência a um ou mais inibidores de calcineurina é um polipeptídeo da calcineurina (CN) mutante.
[0111] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67).
[0112] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio FRB compreende o aminoácido da SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante tendo pelo menos 90% de homologia de sequência com o aminoácido da SEQ ID NO: 68 ou 69.
[0113] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de edição do genoma de uma célula, o método compreendendo fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um primeiro vetor, e um segundo vetor, em que (A) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro ve- tor compreende a sequência polinucleotídica da qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37, o segundo gRNA compreende a sequên- cia polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e varian- tes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer um de SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo me- nos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor compreende a sequência polinucleotídica de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer um das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante deste tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; ou (C) o primeiro gRNA com- preende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44.
[0114] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de edição do genoma de uma célula, o método compreendendo fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um primeiro vetor, e um segundo vetor, em que (A) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro ve- tor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 19 ou 22 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 19 ou 22, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ
ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 45; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o pri- meiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 20 ou 23 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 20 ou 23, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO : 21 ou 24 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo em pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compre- ende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de SEQ ID NO: 45.
[0115] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de edição do genoma de uma célula, o método compreendendo fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um primeiro vetor, e um segundo vetor, em que (A) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro ve- tor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25, o segundo gRNA com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo em pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 46; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o pri- meiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ
ID NO: 27 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 27, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia à sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46
[0116] Em algumas modalidades, o RGEN é selecionado a partir do grupo que consiste em uma endonuclease Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecido como Csn1 e Csx12), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 e Cpf1, ou um derivado funcional das mesmas.
[0117] Em algumas modalidades, o RGEN é Cas9.
[0118] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando o RGEN é uma sequência de ácido ribonucleico (RNA).
[0119] Em algumas modalidades, a sequência de RNA codificando o RGEN está ligada ao primeiro gRNA ou ao segundo gRNA por meio de uma ligação covalente.
[0120] Em algumas modalidades, o modelo de doador está contido em um vetor AAV.
[0121] Em algumas modalidades, o RGEN é pré-complexado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA, formando um complexo RNP, antes do fornecimento à célula.
[0122] Em algumas modalidades, o RGEN é pré-complexado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA em uma relação molar de gRNA para RGEN entre 1:1 e 20:1, respectivamente.
[0123] Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores são, independentemente, inseridos no genoma da célula.
[0124] Em algumas modalidades, um primeiro modelo de doador é inserido em, dentro ou próximo a um gene TRA ou elemento regulador de gene e / ou um segundo modelo de doador é inserido em, dentro ou próximo de um gene IL2RG ou elemento regulador de gene.
[0125] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando i) o primeiro componente de CISC é inserido em um gene IL2RG endógeno e / ou ácido nucleico codificando ii) o segundo componente de CISC é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC; ou ácido nucleico codificando i) o primeiro componente de CISC é inse- rido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC, e / ou ácido nucleico codificando ii) o segundo componente de CISC é in- serido no gene IL2RG endógeno.
[0126] Em algumas modalidades, a célula é uma célula T.
[0127] Em algumas modalidades, a célula T é um linfócito T citotó- xico CD8+ ou uma célula T pan CD3+.
[0128] Em algumas modalidades, a célula T é um elemento de um grupo de células T derivadas de múltiplos doadores.
[0129] Em algumas modalidades, os múltiplos doadores são doado- res humanos.
[0130] Em algumas modalidades, a célula é citotóxica para as célu- las plasmáticas.
[0131] Em outro aspecto, é fornecida neste documento uma célula manipulada produzida por um método de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima.
[0132] Em algumas modalidades, a célula manipulada é citotóxica para as células plasmáticas.
[0133] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade de tratamento, o método compreen- dendo: administrar uma célula manipulada de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima ao indivíduo.
[0134] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade de trata- mento, em que a doença ou condição é caracterizada pela produção adversa de anticorpos, o método compreendendo: a) editar o genoma de células T de acordo com a um método de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima, produzindo assim células T manipu- ladas; e b) administrar as células T manipuladas ao indivíduo.
[0135] Em algumas modalidades, as células T são autólogas ao in- divíduo.
[0136] Em algumas modalidades, as células T são alogênicas ao indivíduo.
[0137] Em algumas modalidades, as células T compreendem um grupo de células T derivadas de múltiplos doadores.
[0138] Em algumas modalidades, os múltiplos doadores são doado- res humanos.
[0139] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade de trata- mento, em que a doença ou condição é caracterizada pela produção adversa de anticorpos, o método compreendendo editar o genoma de uma célula T no indivíduo de acordo com um método de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima.
[0140] Em algumas modalidades, as células T compreendem célu- las T citotóxicas CD8+ ou células T pan CD3+.
[0141] Em algumas modalidades, o indivíduo é humano.
[0142] Em algumas modalidades, o método compreende ainda ad- ministrar rapamicina ou um rapalog ao indivíduo.
[0143] Em algumas modalidades, o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenó- lico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903, ou AP23573, ou meta- bólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos.
[0144] Em algumas modalidades, a rapamicina ou o rapalog são ad- ministrados em uma concentração de 0,05 nM a 100 nM.
[0145] Em algumas modalidades, a doença ou condição é doença de enxerto versus hospedeiro (GvHD), doença autoimune mediada por anticorpos, ou amiloidose de cadeia leve.
[0146] Em algumas modalidades, a doença ou condição é GvHD, e o indivíduo recebeu anteriormente um transplante alogênico.
[0147] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um kit que compreende instruções de uso e a) uma célula manipulada de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima e / ou um ou mais componentes de um sistema de acordo com qualquer uma das modali- dades descritas acima; e / ou b) rapamicina ou um rapalog.
[0148] Em algumas modalidades, o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenó- lico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903, ou AP23573, ou meta- bólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos.
[0149] Em outro aspecto, é fornecida neste documento uma seringa que compreende uma célula manipulada de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima ou uma composição que compreende um ou mais componentes de um sistema de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima.
[0150] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um cateter que compreende uma célula manipulada de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima ou uma composição que compreende um ou mais componentes de um sistema de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima.
[0151] Em outro aspecto, é fornecida aqui uma célula T manipulada de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima para uso no tratamento de doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma do- ença autoimune, ou uma doença ou condição caracterizada pela produ- ção adversa de anticorpos. Em algumas modalidades, a doença autoi- mune é uma doença autoimune mediada por anticorpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve.
[0152] Em outro aspecto, é fornecida aqui uma célula T manipulada de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de doença de en- xerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma doença autoimune, ou uma doença ou condição caracterizada pela produção adversa de anticorpos. Em al- gumas modalidades, a doença autoimune é uma doença autoimune me- diada por anticorpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve.
[0153] Em outro aspecto, é fornecido aqui um sistema de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima para uso no trata- mento de doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma doença au- toimune, ou uma doença ou condição caracterizada pela produção ad- versa de anticorpos. Em algumas modalidades, a doença autoimune é uma doença autoimune mediada por anticorpos. Em algumas modalida- des, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve.
[0154] Em outro aspecto, é fornecido aqui um sistema de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima para uso na fabri- cação de um medicamento para o tratamento da doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD) ou de uma doença autoimune, ou uma doença ou condição caracterizada pela produção adversa de anticorpos. Em algu-
mas modalidades, a doença autoimune é uma doença autoimune medi- ada por anticorpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve.
[0155] Em outro aspecto, são fornecidos neste documento um ou mais gRNAs, um ou mais modelos de doadores, um kit, uma seringa e / ou um cateter de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima para uso no tratamento de doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma doença autoimune, ou uma doença ou condição carac- terizada pela produção adversa de anticorpos. Em algumas modalida- des, a doença autoimune é uma doença autoimune mediada por anti- corpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve.
[0156] Em outro aspecto, é fornecido aqui um ou mais gRNAs, um ou mais modelos de doadores, um kit, uma seringa e / ou um cateter de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de doença do en- xerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma doença autoimune, ou uma doença ou condição caracterizada pela produção adversa de anticorpos. Em al- gumas modalidades, a doença autoimune é uma doença autoimune me- diada por anticorpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve. Breve Descrição dos Desenhos
[0157] A Figura 1 mostra esquemas para construtos de modelo de doador # 1 a # 11, representando elementos presentes nos construtos de modelos de doador (não mostrados em escala) e suas posições re- lativas. 5’ HA: braço de homologia 5’; 3’ HA: braço de homologia 3’; s pA: sinal poliA sintético; SV40 pA: sinal SV40 poliA; pMSCV: promotor do vírus de células tronco murinas (MSCV); CD8 sp: peptídeo sinal CD8; CD8 tm: domínio transmembrana de CD8; CD28: domínio coestimula-
tório de CD28; 4-1BB: Domínio coestimulatório de 4-1BB; CD3z: domí- nio de sinalização citoplasmático CD3-ζ; WPRE3: Elemento Regulador Pós-transcricional (WPRE) do Vírus da Hepatite da Marmota (WHP) 3; CISCβ: subunidade de CISC com domínio FRB e domínio IL2Rβ; tCISCγ: subunidade de CISC com domínio FKBP e fragmento do domí- nio IL2Rγ; β2M CR: receptor quimérico de β2-microglobulina; FRB: po- lipeptídeo de domínio de FRB nu; P2A, T2A: peptídeo autoclivável; ER: sequência sinal do retículo endoplasmático; CNb30: polipeptídeo de cal- cineurina mutante; tLNGFR: receptor truncado do fator de crescimento do nervo de baixa afinidade. Descrição Detalhada
[0158] São descritas aqui células T manipuladas citotóxicas em di- reção às células plasmáticas, em que as células T manipuladas com- preendem um complexo de sinalização induzida por produtos químicos (CISC) permitindo a sobrevida e / ou a proliferação controlada das célu- las T manipuladas, tal como células T manipuladas que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-BCMA que confere citotoxi- cidade para as células que expressam BCMA, métodos de produção e uso de células T manipuladas, e composições úteis para os métodos.
[0159] O Requerente desenvolveu uma série de novos sistemas CRISPR / Cas para integração direcionada de sequências de ácido nu- cleico heterólogas codificando um CAR anti-BCMA e / ou CISC em um gene TRA e / ou um gene IL2RG em um genoma celular, onde o CISC é capaz de sinalização semelhante a IL2R após ligação de rapamicina ou análogos de rapamicina, aproveitando a integração das sequências de ácido nucleico heterólogas que reprimem funcionalmente a expres- são de TCR endógeno e / ou IL2RG em células editadas. Os RNAs guia (gRNAs) com sequências espaçadoras direcionadas a TRA ou IL2RG foram analisados quanto à clivagem no alvo e fora do alvo e revelaram ter perfis favoráveis, tornando-os candidatos para usos à jusante, tal como em terapias baseadas em células. As células T CD3+ humanas primárias foram editadas com sucesso para expressar um CAR anti- BCMA e / ou um CISC, e as células editadas mostraram diminuição da expressão de TCR endógeno e / ou IL2RG. Esses achados indicam que os sistemas CRISPR / Cas aqui descritos são úteis para o tratamento de doenças, por exemplo, doenças associadas a células que expressam BCMA. Definições
[0160] A menos que definido de outra forma, todos os termos técni- cos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um versado na técnica à qual a descri- ção refere-se. Todas as patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações aqui citadas são expressamente incorporados por referên- cia em sua totalidade, a menos que indicado de outra forma. No caso de haver uma pluralidade de definições para um termo aqui citado, aquelas nesta seção prevalecem, a menos que indicado de outra forma.
[0161] Conforme usado neste documento, “um” ou “uma” pode sig- nificar um ou mais de um.
[0162] “Cerca de” tem seu significado simples e comum quando lido face à especificação e pode ser usado, por exemplo, quando refere-se a um valor mensurável e pode ser destinado a abranger variações de ± 20% ou ± 10%, ± 5%, ± 1% ou ± 0,1% do valor especificado.
[0163] Tal como aqui utilizado, “sequência de proteína” refere-se a uma sequência polipeptídica de aminoácidos que é a estrutura primária de uma proteína. Tal como aqui utilizado, “a montante” refere-se às po- sições 5’ de uma localização em um polinucleotídeo, e as posições em direção ao N-terminal de uma localização em um polipeptídeo. Tal como aqui utilizado, “à jusante” refere-se às posições 3’ de uma localização no nucleotídeo, e posições em direção ao C-terminal de uma localização em um polipeptídeo. Assim, o termo “N-terminal” refere-se à posição de um elemento ou localização em um polinucleotídeo em direção ao N- terminal de uma localização em um polipeptídeo.
[0164] “Ácido nucleico” ou “molécula de ácido nucleico” refere-se a polinucleotídeos, tal como ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ri- bonucleico (RNA), oligonucleotídeos, fragmentos gerados pela reação em cadeia da polimerase (PCR), e fragmentos gerados por qualquer um dentre ligação, cisão, ação da endonuclease, e ação da exonuclease. As moléculas de ácido nucleico podem ser compostas por monômeros que são nucleotídeos de ocorrência natural (tal como DNA e RNA), ou análogos de nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, formas enantioméricas de nucleotídeos de ocorrência natural) ou uma combi- nação de ambos. Os nucleotídeos modificados podem ter alterações nas porções de açúcar e / ou nas porções base de pirimidina ou purina. As modificações de açúcar incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais grupos hidroxila por halogênios, grupos alquila, aminas, e gru- pos azido, ou os açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, toda a porção de açúcar pode ser substituída por estruturas estericamente e eletronicamente semelhantes, tal como aza- açúcares e análogos carbocíclicos de açúcar. Exemplos de modifica- ções em uma porção base incluem purinas e pirimidinas alquiladas, pu- rinas ou pirimidinas aciladas, ou outros substitutos heterocíclicos bem conhecidos. Os monômeros de ácido nucleico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos de tais ligações. Os análogos de liga- ções fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforoseleno- ato, fosforodiselenoato, fosforanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato e similares. O termo “molécula de ácido nucleico” também compreende os chamados “ácidos nucleicos de peptídeo”, que compreendem bases de ácido nucleico de ocorrência natural ou modificadas ligadas a um esqueleto de poliamida. Os ácidos nucleicos podem ser de fita simples ou de fita dupla. Em algumas modalidades, é fornecida uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão. Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico é RNA ou DNA.
[0165] “Codificando para” ou “codificando” são usados aqui e refe- rem-se à propriedade de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA, ou um mRNA, para servir como modelos para a síntese de outras macromoléculas tais como uma sequência definida de aminoácidos. Assim, um gene codifica para uma proteína se a transcrição e tradução do mRNA correspon- dente a esse gene produzir a proteína em uma célula ou outro sistema biológico.
[0166] Uma “sequência de ácido nucleico codificando para um poli- peptídeo” compreende todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e codificando para a mesma se- quência de aminoácidos. Em algumas modalidades, um ácido nucleico é fornecido, em que o ácido nucleico codifica uma proteína de fusão.
[0167] “Vetor”, “vetor de expressão” ou “construto” é um ácido nu- cleico usado para introduzir ácidos nucleicos heterólogos em uma célula que tem elementos reguladores para fornecer a expressão dos ácidos nucleicos heterólogos na célula. Os vetores incluem, mas não estão li- mitados a plasmídeo, minicírculos, levedura, e genomas virais. Em al- gumas modalidades, os vetores são plasmídeos, minicírculos, levedu- ras, ou genomas virais. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um lentivírus. Em algu- mas modalidades, o vetor é um vetor viral adenoassociado (AAV). Em algumas modalidades, o vetor é para a expressão de proteínas em um sistema bacteriano, tal como E. coli. Tal como aqui utilizado, o termo “expressão” ou “expressão de proteína” refere-se à tradução de uma molécula de RNA transcrita em uma molécula de proteína. A expressão da proteína pode ser caracterizada por suas qualidades temporais, es- paciais, de desenvolvimento ou morfológicas, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas. Em algumas modalidades, a proteína ou proteínas são expressas de modo que as proteínas sejam posicionadas para dimerização na presença de um ligando.
[0168] Tal como aqui utilizado, “proteínas de fusão” ou “proteínas quiméricas” são proteínas criadas através da união de dois ou mais ge- nes que originalmente codificavam para proteínas ou porções separa- das de proteínas. As proteínas de fusão também podem ser constituídas por domínios específicos de proteínas de duas ou mais proteínas sepa- radas. A tradução deste gene de fusão pode resultar em um único poli- peptídeo ou múltiplos polipeptídeos com propriedades funcionais deri- vadas de cada uma das proteínas originais. Proteínas de fusão recom- binantes podem ser criadas artificialmente por tecnologia de DNA re- combinante para uso em pesquisa biológica ou terapêutica. Tais méto- dos para criar proteínas de fusão são conhecidos dos versados na téc- nica. Algumas proteínas de fusão combinam peptídeos integrais e, por- tanto, podem conter todos os domínios, especialmente domínios funci- onais, das proteínas originais. No entanto, outras proteínas de fusão, especialmente aquelas que não ocorrem naturalmente, combinam ape- nas porções de sequências de codificação e, portanto, não mantêm as funções originais dos genes parentais que as formaram.
[0169] Tal como aqui utilizado, o termo “elemento regulador” refere- se a uma molécula de DNA com atividade reguladora de gene, por exemplo, uma que tem a capacidade de afetar a transcrição e / ou tra- dução de uma molécula de DNA transcritível operacionalmente ligada. Elementos reguladores, tal como promotores, líderes, íntrons e regiões de terminação da transcrição, são moléculas de DNA que têm atividade reguladora de genes e desempenham um papel integral na expressão geral dos genes em células vivas. Elementos reguladores isolados, tal como promotores, que funcionam em plantas são, portanto, úteis para modificar fenótipos de plantas por meio de métodos de engenharia ge- nética.
[0170] Tal como aqui utilizado, o termo “operacionalmente ligado” refere-se a uma primeira molécula unida a uma segunda molécula, em que as moléculas são dispostas de modo que a primeira molécula afeta a função da segunda molécula. As duas moléculas podem ser parte de uma única molécula contígua e podem ser adjacentes. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma molécula de DNA trans- critível se o promotor modula a transcrição da molécula de DNA trans- critível de interesse em uma célula.
[0171] Um “promotor” é uma região do DNA que inicia a transcrição de um gene específico. Os promotores podem estar localizados próxi- mos do sítio de início da transcrição de um gene, na mesma fita e a montante do DNA (a região 5’ da fita senso). O promotor pode ser um promotor condicional, induzível ou constitutivo. O promotor pode ser es- pecífico para a expressão de proteínas de células de bactérias, de ma- míferos ou de insetos. Em algumas modalidades, em que um ácido nu- cleico codificando uma proteína de fusão é fornecido, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência promotora. Em algumas modalida- des, o promotor é específico para a expressão de proteínas de células de bactérias, mamíferos ou insetos. Em algumas modalidades, o pro- motor é um promotor condicional, induzível ou constitutivo. Em outras modalidades, o promotor é um promotor MND.
[0172] “Complexo de sinalização induzida por produto químico di- mérico”, “CISC dimérico”, ou “dímero”, tal como aqui utilizado, refere-se a dois componentes de um CISC, que podem ou não ser complexos de proteínas de fusão que se unem. “Dimerização” refere-se ao processo de união de duas entidades separadas em uma única entidade. Em al- gumas modalidades, um ligando ou agente estimula a dimerização. Em algumas modalidades, a dimerização refere-se à homodimerização, ou à união de duas entidades idênticas, tal como dois componentes de CISC idênticos. Em algumas modalidades, a dimerização refere-se à heterodimerização, da união de duas entidades diferentes, tal como dois componentes de CISC diferentes e distintos. Em algumas modalidades, a dimerização dos componentes de CISC resulta em uma via de sinali- zação celular. Em algumas modalidades, a dimerização dos componen- tes de CISC permite a expansão seletiva de uma célula ou população de células. Sistemas CISC adicionais podem incluir um sistema de di- merização de CISC giberelina CISC, ou um sistema de dimerização de CISC SLF-TMP. Outros sistemas de dimerização quimicamente induzí- veis (CID) e partes de componentes podem ser usados.
[0173] Conforme usado neste documento, “complexo de sinalização induzida por produtos químicos” ou “CISC” refere-se a um complexo manipulado que inicia um sinal no interior de uma célula como um re- sultado direto da dimerização induzida por ligando. Um CISC pode ser um homodímero (dimerização de dois componentes idênticos) ou um heterodímero (dimerização de dois componentes distintos). Assim, tal como aqui utilizado, o termo “homodímero” refere-se a um dímero de dois componentes de proteína aqui descritos com sequências de ami- noácidos idênticas. O termo “heterodímero” refere-se a um dímero de dois componentes de proteína aqui descritos com sequências de ami- noácidos não idênticas.
[0174] O CISC pode ser um complexo sintético, conforme descrito neste documento em mais detalhes. “Sintético”, conforme usado neste documento, refere-se a um complexo, proteína, dímero ou composição, conforme descrito neste documento, que não é natural ou que não é encontrado na natureza. Em algumas modalidades, um IL2R-CISC re- fere-se a um complexo de sinalização que envolve componentes do re- ceptor de interleucina-2. Em algumas modalidades, um IL2 / 15-CISC refere-se a um complexo de sinalização que envolve subunidades de sinalização de receptor que são compartilhadas pela interleucina-2 e in- terleucina-15. Em algumas modalidades, um IL7-CISC refere-se a um complexo de sinalização que envolve componentes do receptor de in- terleucina-7. Um CISC pode, portanto, ser denominado de acordo com as partes componentes que constituem os componentes de um deter- minado CISC. Um versado na técnica reconhecerá que as partes com- ponentes do complexo de sinalização induzida por produtos químicos podem ser compostas por um componente natural ou sintético útil para incorporação em um CISC. Assim, os exemplos fornecidos neste docu- mento não são destinados a ser limitantes.
[0175] Conforme usado neste documento, “receptor de citocina” re- fere-se a moléculas receptoras que reconhecem e se ligam a citocinas. Em algumas modalidades, o receptor de citocina abrange moléculas de receptor de citocina modificadas (por exemplo, “receptores de citocinas variantes”), compreendendo aquelas com substituições, deleções e / ou adições na sequência de aminoácido e / ou de ácido nucleico do recep- tor de citocina. Assim, pretende-se que o termo englobe receptores de citocinas de ocorrência natural, bem como, receptores recombinantes, produzidos sinteticamente, e variantes. Em algumas modalidades, o re- ceptor de citocina é uma proteína de fusão compreendendo um domínio de ligação extracelular, um domínio de dobradiça, um domínio trans- membrana, e um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, os componentes do receptor (ou seja, os domínios do receptor) são natu- rais ou sintéticos. Em algumas modalidades, os domínios são domínios derivados de humanos.
[0176] “FKBP”, conforme usado neste documento, é um domínio de proteína de ligação a FK506. FKBP refere-se a uma família de proteínas que têm atividade de prolil isomerase e estão relacionadas às ciclofilinas em função, embora não na sequência de aminoácidos. Os FKBPs foram identificados em muitos eucariotos a partir de leveduras a humanos e funcionam como chaperonas de dobramento de proteínas para proteí- nas contendo resíduos de prolina. Junto com a ciclofilina, os FKBPs per- tencem à família das imunofilinas. O termo FKBP compreende, por exemplo, FKBP12, bem como proteínas codificadas pelos genes AIP, AIPL1, FKBP1A, FKBP1B, FKBP2, FKBP3, FKBP5, FKBP6, FKBP7, FKBP8, FKBP9, FKBP9L, FKBP10, FKBP11, FKBP14, FKBP15, FKBP52, e / ou LOC541473, compreendendo homólogos dos mesmos e fragmentos de proteínas funcionais dos mesmos.
[0177] “FRB”, tal como aqui utilizado, como um domínio de ligação FKBP - rapamicina. Os domínios FRB são regiões polipeptídicas (“do- mínios” de proteínas) que são configuradas para formar um complexo tripartido com uma proteína FKBP e rapamicina ou rapalog da mesma. Os domínios FRB estão presentes em várias proteínas de ocorrência natural, compreendendo proteínas mTOR (também chamadas na litera- tura como FRAP, RAPT 1 ou RAFT) a partir de humanos e outras espé- cies; proteínas de levedura compreendendo Tor1 e / ou Tor2; e um ho- mólogo FRAP de Candida. Tanto o FKBP quanto o FRB são os princi- pais constituintes da sinalização do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR).
[0178] Um “polipeptídeo de domínio de ligação FKBP - rapamicina nu” ou um “polipeptídeo de domínio FRB nu” (que também pode ser chamado de um “polipeptídeo de domínio de ligação FKBP - rapamicina” ou um “polipeptídeo de domínio FRB”) refere-se a um polipeptídeo com- preendendo apenas os aminoácidos de um domínio FRB ou de uma proteína em que cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos aminoácidos das proteínas são aminoácidos de um domínio FRB. O domínio FRB pode ser expresso como uma proteína solúvel de 12 kDa (Chen, J. e outros (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92 (11): 4947 a 4951). O domínio FRB forma um feixe de quatro hélices, um motivo estrutural comum em proteínas globulares. Suas di- mensões gerais são 30 Å por 45 Å por 30 Å, e todas as quatro hélices têm conexões diretas curtas semelhantes ao citocromo b562 (Choi, J. e outros (1996). Science, 273 (5272): 239 a 242). Em algumas modalida- des, o domínio FRB nu compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69.
[0179] Em algumas modalidades, o fármaco imida imunomodulador usado nas abordagens aqui descritas pode compreender: talidomida (in- cluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitá- veis do mesmo. A talidomida pode incluir Imunoprina, Talomida, Talidex, Talizer, Neurosedyn, α-(N-Ftalimido) glutarimida, 2- (2,6-dioxopiperidin- 3-il) -2,3-di-hidro-1H-isoindol-1,3-diona); pomalidomida (incluindo aná- logos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo. A Pomalidomida pode incluir Pomalyst, Imnovid, (RS)-4-Amino- 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) isoindol-1,3-diona); lenalidomida (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo. A Lenalidomida pode incluir Revlimid, (RS)-3-(4-Amino-1-oxo- 1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il) piperidina- 2,6-diona); ou apremilast (inclu- indo análogos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo. O Apremilast pode incluir Otezla, CC-10004, N-{2-[(1S)-1- (3-Etóxi-4-metoxifenil) -2- (metilsulfonil) etil] -1,3-dioxo-2,3-di-hidro-1H- isoindol-4-il} acetamida); ou quaisquer combinações dos mesmos.
[0180] Tal como aqui utilizado, o termo “domínio de ligação extrace- lular” refere-se a um domínio de um complexo que está fora da célula, e que está configurado para se ligar a um átomo ou molécula específica. Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular de um CISC é um domínio FKBP ou uma porção do mesmo. Em algumas mo- dalidades, o domínio de ligação extracelular é um domínio FRB ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ex- tracelular é configurado para ligar um ligando ou agente, estimulando assim a dimerização de dois componentes de CISC. Em algumas mo- dalidades, o domínio de ligação extracelular é configurado para se ligar a um modulador de receptor de citocina.
[0181] Tal como aqui utilizado, o termo “modulador de receptor de citocina” refere-se a um agente que modula a fosforilação de um alvo à jusante de um receptor de citocina, a ativação de uma via de transdução de sinal associada a um receptor de citocina, e / ou a expressão de uma proteína particular, tal como uma citocina. Tal agente pode modular di- reta ou indiretamente a fosforilação de um alvo à jusante de um receptor de citocina, a ativação de uma via de transdução de sinal associada a um receptor de citocina, e / ou a expressão de uma proteína particular, tal como uma citocina. Assim, exemplos de moduladores de receptor de citocina incluem, mas não estão limitados a citocinas, fragmentos de ci- tocinas, proteínas de fusão e / ou anticorpos ou suas porções de ligação que se ligam imunoespecificamente a um receptor de citocina ou um fragmento do mesmo. Além disso, exemplos de moduladores de recep- tor de citocina incluem, mas não estão limitados a peptídeos, polipeptí- deos (por exemplo, receptores de citocinas solúveis), proteínas de fusão e / ou anticorpos ou porções de ligação dos mesmos que se ligam imu- noespecificamente a uma citocina ou um fragmento da mesma.
[0182] Conforme usado neste documento, o termo “ativar” refere-se a um aumento em pelo menos uma atividade biológica de uma proteína de interesse. Da mesma forma, o termo “ativação” refere-se a um estado de uma proteína de interesse em um estado de atividade aumentada. O termo “ativável” refere-se à capacidade de uma proteína de interesse de se tornar ativada na presença de um sinal, um agente, um ligando, um composto, ou um estímulo. Em algumas modalidades, um dímero, como aqui descrito, é ativado na presença de um sinal, um agente, um li- gando, um composto ou um estímulo, e se torna um dímero competente em sinalização. Conforme usado neste documento, o termo “compe- tente em sinalização” refere-se à capacidade ou configuração do dímero de modo a ser capaz de iniciar ou sustentar uma via de sinalização à jusante.
[0183] Conforme usado neste documento, o termo “domínio de do- bradiça” refere-se a um domínio que liga o domínio de ligação extrace- lular ao domínio transmembrana, e pode conferir flexibilidade ao domí- nio de ligação extracelular. Em algumas modalidades, o domínio de do- bradiça posiciona o domínio extracelular próximo à membrana plasmá- tica para minimizar o potencial de reconhecimento por anticorpos ou fra- gmentos de ligação dos mesmos. Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular está localizado N-terminal ao domínio de dobra- diça. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça pode ser natu- ral ou sintético.
[0184] Conforme usado neste documento, o termo “domínio trans- membrana” ou “domínio TM” refere-se a um domínio que é estável em uma membrana, tal como em uma membrana celular. Os termos “exten- são transmembrana”, “proteína integral” e “domínio integral” também são usados neste documento. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça e o domínio extracelular estão localizados no N-terminal do domínio transmembrana. Em algumas modalidades, o domínio trans- membrana é um domínio natural ou sintético. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é um domínio transmembrana do receptor de IL-2.
[0185] Conforme usado neste documento, o termo “domínio de si- nalização” refere-se a um domínio da proteína de fusão ou componente de CISC que está envolvido em uma cascata de sinalização dentro da célula, tal como uma célula de mamífero. Um domínio de sinalização refere-se a uma porção de sinalização que fornece às células, tal como células T, um sinal que, além do sinal primário fornecido, por exemplo,
pela cadeia zeta CD3 do complexo TCR / CD3, medeia uma resposta celular, tal como como uma resposta de células T, compreendendo, mas não limitado à ativação, proliferação, diferenciação e / ou secreção de citocinas. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização é N-ter- minal ao domínio transmembrana, o domínio de dobradiça e o domínio extracelular. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização é um domínio sintético ou natural. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização é um domínio de sinalização citoplasmático concatenado. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização é um domínio de sinalização de citocina. Em algumas modalidades, o domínio de sinali- zação é um domínio de sinalização de antígeno. Em algumas modalida- des, o domínio de sinalização é um domínio do receptor de interleucina- 2 subunidade gama (IL2Rγ ou IL2RG). Em algumas modalidades, o do- mínio de sinalização é um domínio do receptor de interleucina-2 subu- nidade beta (IL2Rβ ou IL2RB). Em algumas modalidades, a ligação de um agente ou ligando ao domínio de ligação extracelular causa uma transdução de sinal através do domínio de sinalização pela ativação de uma via de sinalização, como um resultado da dimerização dos compo- nentes de CISC. Conforme usado neste documento, o termo “transdu- ção de sinal” refere-se à ativação de uma via de sinalização por um li- gando ou um agente de ligação ao domínio extracelular. A ativação de um sinal é um resultado da ligação do domínio extracelular ao ligando ou agente, resultando na dimerização de CISC.
[0186] Conforme usado neste documento, o termo “IL2RB” ou “IL2Rβ” refere-se a um receptor de interleucina-2 subunidade beta. Da mesma forma, o termo “IL2RG” ou IL2Rγ “refere-se a um receptor de interleucina-2 subunidade gama, e o termo” IL2RA “ou” IL2Rα “refere- se a um receptor de interleucina-2 subunidade alfa. O receptor de IL-2 tem três formas, ou cadeias, alfa, beta e gama, que também são subu-
nidades para receptores para outras citocinas. IL2Rβ e IL2Rγ são mem- bros da família de receptores de citocinas do tipo I. “IL2R”, tal como aqui utilizado, refere-se ao receptor de interleucina-2, que está envolvido em respostas imunes mediadas por células T. IL2R está envolvido na en- docitose mediada por receptor e transdução de sinais mitogênicos a par- tir da interleucina 2. Da mesma forma, o termo “IL-2 / 15R” refere-se a uma subunidade de sinalização de receptor que é compartilhada por IL- 2 e IL-15, e pode incluir uma subunidade alfa (IL2 / 15Ra ou IL2 / 15Rα), beta (IL2 / 15Rb ou IL2 / 15Rβ, ou gama (IL2 / 15Rg ou IL2 / 15Rγ).
[0187] Em algumas modalidades, um complexo de sinalização indu- zida por produtos químicos é um complexo de sinalização ativado por heterodimerização que compreende dois componentes. Em algumas modalidades, o primeiro componente compreende um domínio de liga- ção extracelular que é uma parte de um par de heterodimerização, um domínio de dobradiça opcional, um domínio transmembrana, e um ou mais domínios de sinalização citoplasmáticos concatenados. Em algu- mas modalidades, o segundo componente compreende um domínio de ligação extracelular que é a outra parte de um par de heterodimização, um domínio de dobradiça opcional, um domínio transmembrana, e um ou mais domínios de sinalização citoplasmáticos concatenados. Assim, em algumas modalidades, existem dois eventos de modificação distin- tos. Em algumas modalidades, os dois componentes de CISC são ex- pressos em uma célula, tal como uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula, tal como uma célula de mamífero, ou uma popu- lação de células, tal como uma população de células de mamífero, é colocada em contato com um ligando ou agente que causa heterodime- rização, iniciando assim um sinal. Em algumas modalidades, um par de homodimerização dimeriza, em que um único componente de CISC é expresso em uma célula, tal como uma célula de mamífero, e os com- ponentes de CISC homodimerizam para iniciar um sinal.
[0188] Conforme usado neste documento, o termo “ligando” ou “agente” refere-se a uma molécula que tem um efeito biológico dese- jado.
Em algumas modalidades, um ligando é reconhecido e ligado por um domínio de ligação extracelular, formando um complexo tripartido compreendendo o ligando e dois componentes de CISC de ligação.
Os ligandos incluem, mas não estão limitados a, moléculas proteicas, com- preendendo, mas não limitadas a, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, proteínas modificadas pós-tradução, anticorpos, porções de ligação dos mesmos; moléculas pequenas (menos de 1000 Daltons), compostos inorgânicos ou orgânicos; e moléculas de ácido nucleico compreen- dendo, mas não limitadas a DNA de fita dupla ou de fita simples, ou RNA de fita dupla ou de fita simples (por exemplo, antissenso, RNAi, etc.), aptâmeros, bem como moléculas de ácido nucleico de hélice tripla.
Os ligandos podem ser derivados ou obtidos a partir de qualquer orga- nismo conhecido (compreendendo, mas não limitado a animais (por exemplo, mamíferos (mamíferos humanos e não humanos)), plantas, bactérias, fungos e protistas, ou vírus) ou a partir de uma biblioteca de moléculas sintéticas.
Em algumas modalidades, o ligando é uma prote- ína, um anticorpo ou porção do mesmo, uma pequena molécula, ou um fármaco.
Em algumas modalidades, o ligando é rapamicina ou um aná- logo de rapamicina (rapalogs). Em algumas modalidades, o rapalog compreende variantes de rapamicina tendo uma ou mais das seguintes modificações em relação à rapamicina: desmetilação, eliminação ou substituição do metóxi em C7, C42 e / ou C29; eliminação, derivatização ou substituição do hidróxi em C13, C43 e / ou C28; redução, eliminação ou derivatização da cetona em C14, C24 e / ou C30; substituição do anel pipecolato de 6 membros por um anel prolila de 5 membros; e subs- tituição alternativa no anel ciclohexila ou substituição do anel ciclohexila por um anel ciclopentila substituído.
Assim, em algumas modalidades,
o rapalog é everolimus, merilimus, novolimus, pimecrolimus, ridaforoli- mus, tacrolimus, temsirolimus, umirolimus, zotarolimus, CCI-779, C20- metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de benidipina, AP23573, ou AP1903 ou metabólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o ligando é um fármaco da classe IMID (por exemplo, talidomida, pomalidomida, lenalidomida ou análogos relacionados).
[0189] Por conseguinte, em algumas modalidades, o ligando ou agente utilizado nas abordagens aqui descritas para a indução química do complexo de sinalização pode compreender: rapamicina (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. A rapamicina pode incluir Sirolimus, Rapamune, (3S, 6R, 7E, 9R, 10R, 12R, 14S, 15E, 17E, 19E, 21S, 23S, 26R, 27R, 34aS) - 9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-hexadecahidro-9,27- dihidróxi-3 -[(1R) -2 - [(1S, 3R, 4R) -4-hidróxi-3-metoxiciclohexil] -1 -me- tiletil]-10,21-dimetóxi-6,8,12,14,20,26-hexametil-23,27-epóxi-3H-pirido [2,1-c] [1,4] oxaazaciclohentriacontina-1,5,11,28,29 (4H, 6H, 31H) -pen- tona); everolimus (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farma- ceuticamente aceitáveis dos mesmos. O Everolimus pode incluir RAD001, Zortress, Certican, Afinitor, Votubia, 42-O- (2-hidroxietil) rapa- micina, (1R, 9S, 12S, 15R, 16E, 18R, 19R, 21R, 23S, 24E, 26E, 28E, 30S, 32S, 35R) -1,18-dihidróxi-12 - [(2R) -1 - [(1S, 3R, 4R) -4- (2-hidro- xietóxi)-3-metoxiciclohexil]propan-2-il]-19,30-dimetóxi-15,17,21,23,29, 35-hexametil-11,36-dioxa-4-azatriciclo [30.3.1.0⁴,⁹] hexatriaconta- 16,24,26,28-tetraeno-2,3,10,14,20-pentona); merilimus (incluindo aná- logos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. O Merilimus pode incluir SAR943, 42-O- (tetra-hidrofuran-3-il) rapamicina (Merilimus-1); 42-O- (oxetan-3-il) rapamicina (Merilimus-2),
42-O- (tetrahidropiran-3-il) rapamicina (Merilimus-3), 42-O- (4-metil, te- trahidrofuran-3-il) rapamicina, 42-O- (2,5,5-trimetil, tetra-hidrofuran-3-il) rapamicina, 42-O- (2,5-dietil-2-metil, tetra-hidrofuran-3-il) rapamicina, 42-O - (2H-Piran-3-il, tetra-hidro-6-metóxi-2-metil) rapamicina, ou 42-O- (2H-Piran-3-il, tetra-hidro-2,2-dimetil-6-fenil) rapamicina) ; novolimus (in- cluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitá- veis dos mesmos.
O Novolimus pode incluir 16-O-Demetil Rapamicina); pimecrolimus (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceu- ticamente aceitáveis dos mesmos.
O Pimecrolimus pode incluir Elidel, (3S, 4R, 5S, 8R, 9E, 12S, 14S, 15R, 16S, 18R, 19R, 26aS) -3 - ((E) -2 - ((1R, 3R, 4S) -4-cloro-3-metoxiciclohexil)-1-metilvinil)-8-etil 5,6,8,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,24,26,26ahexadecahidro-5,19-epóxi- 3H-pirido (2,1-c) (1,4) oxaazaciclotricosina-1,17,20,21 (4H, 23H) -te- trona 33-epi- Cloro-33-desoxiascomicina); ridaforolimus (incluindo aná- logos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
O Ridaforolimus pode incluir AP23573, MK-8669, deforolimus, (1R, 9S, 12S, 15R, 16E, 18R, 19R, 21R, 23S, 24E, 26E, 28E, 30S, 32S, 35R) -12 - ((1R) -2 - ((1S, 3R, 4R) -4 - ((Dimetilfosfinoil) óxi) -3-metoxi- ciclohexil) -1-metiletil) -1,18-dihidróxi- 19,30-dimetoxi15,17,21,23,29,35- hexametil-11,36-dioxa-4-azatriciclo (30.3.1.04,9) hexatriaconta- 16,24,26,28-tetraeno-2,3, 10,14,20-pentona); tacrolimus (incluindo aná- logos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
O Tacrolimus pode incluir FK-506, fujimycin, Prograf, Adva- graf, protopic, 3S- [3R * [E (1S*, 3S*, 4S *)], 4S*, 5R*, 8S*, 9E, 12R*, 14R*, 15S*, 16R*, 18S*, 19S*, 26aR* 5,6,8,11,12,13,14,15,16, 17,18,19,24,25,26,26a-hexadecahidro-5,19-dihidróxi-3- [2- (4-hidróxi-3- metoxiciclohexil) -1-metiletenil] -14,16-dimetóxi-4, 10,12,18-tetrametil-8- (2-propenil)-15,19-epóxi-3H-pirido [2,1-c] [1,4] oxaazaciclotricosina- 1,7,20,21 (4H, 23H) -tetrona, monohidrato); temsirolimus (incluindo aná- logos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
O Temsirolimus pode incluir CCI-779, CCL-779, Torisel, (1R, 2R, 4S) -4 - {(2R) -2 - [(3S, 6R, 7E, 9R, 10R, 12R, 14S, 15E, 17E, 19E, 21S, 23S, 26R, 27R, 34aS) -9,27-dihidróxi-10,21-dimetóxi- 6,8,12,14,20,26-hexametil-1,5,11,28,29-pentaoxo-1,4,5,6,9,10,11,12, 13,14,21,22,23,24,25,26,27,28,29,31,32,33,34,34a-tetracosaidro-3H- 23,27-epoxipirido [2,1-c] [1,4] oxazaciclohentriacontin-3-il] propil} -2-me- toxiciclohexil 3-hidróxi- 2- (hidroximetil) -2-metilpropanoato); umirolimus (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente acei- táveis dos mesmos.
O Umirolimus pode incluir Biolimus, Biolimus A9, BA9, TRM-986, 42-O- (2-etoxietil) Rapamicina); zotarolimus (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
O Zotarolimus pode incluir ABT-578, (42S) -42-Deóxi-42- (1H- tetrazol-1-il) -rapamicina); C20-metalilrapamicina (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
C20-metalilrapamicina pode incluir C20-Marap); C16-(S)-3-metilindolra- pamicina (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceutica- mente aceitáveis dos mesmos.
C16-(S)-3-metilindolrapamicina pode in- cluir C16-iRap); AP21967 (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
AP21967 pode incluir C-16-(S)-7-metilindolrapamicina); ácido micofenólico de sódio (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
O ácido micofenólico de sódio pode incluir CellCept, Myfortic, ácido (4E)-6- (4-Hidróxi-6-metóxi-7-metil-3-oxo-1,3-di-hidro-2-benzofu- ran-5-il) -4-metilhex-4-enoico); cloridrato de benidipina (incluindo análo- gos, derivados e incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mes- mos.
O cloridrato de benidipina pode incluir Benidipinum, Coniel); ou AP1903 (incluindo análogos, derivados e incluindo sais farmaceutica- mente aceitáveis dos mesmos.
AP1903 pode incluir Rimiducid, [(1R) -3- (3,4-dimetoxifenil) -1- [3- [2- [2 - [[2- [3 - [(1R) -3- (3,4-dimetoxifenil) -1 - [(2S) -1 - [(2S) -2- (3,4,5-trimetoxifenil) butanoil] piperidina-2-carbonil]
oxipropil] fenoxi] acetil] amino] etilamino] -2-oxoetoxi] fenil] propil] (2S) - 1 - [(2S) -2- (3,4,5-trimetoxifenil) butanoil] piperidina-2-carboxilato); ou quaisquer combinações dos mesmos.
[0190] Conforme usado neste documento, o termo “giberelina” re- fere-se a uma forma sintética ou de ocorrência natural dos ácidos diter- penoides que são sintetizados pela via terpenoide em plastídeos e então modificados no retículo endoplasmático e citosol até atingirem sua forma biologicamente ativa. A giberelina pode ser uma giberelina natural ou um análogo da mesma, incluindo, por exemplo, giberelinas derivadas do esqueleto ent-giberelano ou sintetizadas via ent-kauren, incluindo gi- berelina 1 (GA1), GA2, GA3. . . GA136, e seus análogos e derivados. Em algumas modalidades, a giberelina ou um análogo ou derivado da mesma é utilizado para dimerização de CISC.
[0191] Conforme usado neste documento, “SLF-TMP” ou “ligando sintético de FKBP ligado a trimetoprim” refere-se a um dimerizador para dimerização de CISC. Em algumas modalidades, a porção de SLF se liga a um primeiro componente de CISC e a porção de TMP se liga a um segundo componente de CISC, causando dimerização de CISC. Em algumas modalidades, SLF pode se ligar, por exemplo, a FKBP e TMP pode se ligar a dihidrofolato redutase de E. coli (eDHFR).
[0192] Tal como aqui utilizado, o termo “ligação simultânea” refere- se à ligação do ligando por dois ou mais componentes de CISC ao mesmo tempo ou, em alguns casos, substancialmente ao mesmo tempo, para formar um complexo multicomponente, compreendendo os componentes de CISC e o componente ligando, resultando na ativação do sinal subsequente. A ligação simultânea requer que os componentes de CISC sejam configurados espacialmente para se ligarem a um único ligando, e também que ambos os componentes de CISC são configura- dos para se ligarem ao mesmo ligando, incluindo a diferentes porções no mesmo ligando.
[0193] Tal como aqui utilizado, o termo “expansão seletiva” refere- se a uma capacidade de uma célula desejada, tal como uma célula de mamífero, ou uma população de células desejada, tal como uma popu- lação de células de mamíferos de se expandir. Em algumas modalida- des, a expansão seletiva refere-se à geração ou expansão de uma po- pulação pura de células, tal como células de mamíferos, que sofreram dois eventos de modificação genética. Um componente de uma dimeri- zação de CISC é parte de uma modificação e o outro componente é a outra modificação. Assim, um componente do CISC de heterodimeriza- ção está associado a cada modificação genética. A exposição das célu- las a um ligando permite a expansão seletiva apenas das células, tal como células de mamíferos, tendo ambas as modificações desejadas. Assim, em algumas modalidades, as únicas células, tal como células de mamíferos, que serão capazes de responder ao contato com um ligando são aquelas que expressam ambos os componentes de CISC de hete- rodimerização.
[0194] Tal como aqui utilizado, “célula hospedeira” compreende qualquer tipo de célula, tal como uma célula de mamífero, que é sus- ceptível à transformação, transfecção ou transdução, com um construto de ácido nucleico ou vetor. Em algumas modalidades, a célula hospe- deira, tal como uma célula de mamífero, é uma célula T ou uma célula T reguladora (Treg). Em algumas modalidades, a célula hospedeira, tal como uma célula de mamífero, é uma célula tronco hematopoiética. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula CD3+, CD8+ ou CD4+. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula linfócito T citotóxico CD8+ selecionada a partir do grupo que consiste em células T CD8+ virgens, células T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetoras, e células T CD8+ em massa. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula linfócito T auxiliar CD4+ selecionada a partir do grupo que consiste em células T CD4+ virgens,
células T CD4+ de memória central, células T CD4+ de memória efetora, e células T CD4+ em massa. Conforme usado neste documento, o termo “população de células” refere-se a um grupo de células, tal como células de mamíferos, compreendendo mais de uma célula. Em algu- mas modalidades, uma célula, tal como uma célula de mamífero, é fa- bricada, em que a célula compreende a sequência de proteína como aqui descrita ou um vetor de expressão codificando a sequência de pro- teína como aqui descrito.
[0195] Tal como aqui utilizado, o termo “transformado” ou “transfec- tado” refere-se a uma célula, tal como uma célula, tecido, órgão ou or- ganismo de mamífero no qual uma molécula de polinucleotídeo estra- nho, tal como um construto, foi introduzida. A molécula de polinucleotí- deo introduzida pode ser integrada no DNA genômico da célula recep- tora, tal como uma célula, tecido, órgão ou organismo de mamífero de modo que a molécula de polinucleotídeo introduzida seja herdada pela progênie subsequente. Uma célula “transgênica” ou “transfectada”, tal como uma célula de mamífero ou organismo também compreende a progênie da célula ou organismo e a progênie produzida a partir de um programa de melhoramento empregando tal organismo transgênico como um pai em um cruzamento e exibindo um fenótipo alterado resul- tante a partir da presença de uma molécula de polinucleotídeo estran- geira. O termo “transgênico” refere-se a uma bactéria, fungo ou planta contendo uma ou mais moléculas de ácido polinucleico heterólogas. “Transdução” refere-se à transferência de genes mediada por vírus para as células, tal como células de mamíferos.
[0196] O termo “célula manipulada” refere-se a uma célula que com- preende o(s) construto(s) da invenção, independentemente de a célula ter sido manipulada “diretamente” (por exemplo, a célula foi fisicamente alterada a partir de uma condição original ou de ocorrência natural), ou descendente de uma célula que foi modificada. Assim, “célula manipu- lada” inclui as células modificadas diretamente e sua progênie.
[0197] Conforme usado neste documento, um “indivíduo” refere-se a um animal que é o objeto de tratamento, observação ou experimento. “Animal” compreende vertebrados e invertebrados de sangue frio e quente, tal como peixes, crustáceos, répteis e, em particular, mamíferos. “Mamífero” compreende, sem limitação, camundongos, ratos, coelhos, porquinhos-da-Índia, cães, gatos, ovelhas, cabras, vacas, cavalos, pri- matas, tal como macacos, chimpanzés e grandes macacos e, em parti- cular, humanos. Em alguma alternativa, o indivíduo é humano.
[0198] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um li- gando usado para induzir a dimerização é uma quantidade de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 nM ou uma concentração dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores mencionados acima.
[0199] Uma “sequência de marcador”, conforme descrito neste do- cumento, codifica uma proteína que é usada para selecionar ou rastrear uma proteína ou célula, tal como uma célula de mamífero, que tem uma proteína de interesse. Nas modalidades aqui descritas, a proteína de fusão fornecida pode compreender uma sequência de marcador que pode ser selecionada em experimentos, tal como citometria de fluxo.
[0200] “Receptor quimérico” ou “receptor de antígeno quimérico”, tal como aqui utilizado, refere-se a um receptor projetado sinteticamente que compreende um domínio de ligação ao ligando de um anticorpo ou outra sequência de proteína que se liga a uma molécula associada à doença ou distúrbio e está ligada via um domínio espaçador a um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma célula T ou outros re- ceptores, tal como um domínio coestimulatório. Em algumas modalida- des, uma célula, tal como uma célula de mamífero, é fabricada em que a célula compreende um ácido nucleico codificando uma proteína de fusão e em que a célula compreende um receptor de antígeno quimé- rico.
[0201] “Linfócito T citotóxico” (CTL), tal como aqui utilizado, refere- se a um linfócito T que expressa CD8 na sua superfície (por exemplo, uma célula T CD8+). Em algumas modalidades, tais células são células T de “memória” (células TM) que são experimentadas em antígeno. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula para a secreção de pro- teína de fusão. Em algumas modalidades, a célula é um linfócito T cito- tóxico. Célula T de “memória central” (ou “TCM”), tal como aqui utilizado, refere-se a um CTL experimentado em antígeno que expressa CD62L, CCR-7 e / ou CD45RO na sua superfície, e não expressa ou tem ex- pressão diminuída de CD45RA, em comparação com células virgens. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula para a secreção da proteína de fusão. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T de memória central (TCM). Em algumas modalidades, as células de memó- ria central são positivas para a expressão de CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO e / ou CD95, e podem ter expressão diminuída de CD54RA, em comparação com células virgens. Célula T de “memória efetora” (ou “TEM”), tal como aqui utilizado, refere-se a uma célula T ex- perimentada em antígeno que não expressa ou tem expressão diminu- ída de CD62L na sua superfície, em comparação com células de me- mória central, e não expressa ou tem uma expressão diminuída de CD45RA, em comparação com as células virgens. Em algumas modali- dades, é fornecida uma célula para a secreção da proteína de fusão. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T de memória efetora. Em algumas modalidades, as células de memória efetora são negativas para a expressão de CD62L e / ou CCR7, em comparação com células virgens ou células de memória central, e podem ter expressão variável de CD28 e / ou CD45RA.
[0202] “Células T virgens”, conforme usado neste documento, re- fere-se a um linfócito T não experimentado em antígeno que expressa CD62L e / ou CD45RA, e não expressa CD45RO-, em comparação com células de memória central ou efetora. Em algumas modalidades, é for- necida uma célula, tal como uma célula de mamífero, para a secreção da proteína de fusão. Em algumas modalidades, a célula, tal como uma célula de mamífero, é uma célula T virgem. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD8+ virgens são caracterizados pela expressão de mar- cadores fenotípicos de células T virgens compreendendo CD62L, CCR7, CD28, CD127 e / ou CD45RA.
[0203] Células T “efetoras”, conforme usadas neste documento, re- ferem-se a células linfócitos T citotóxicos experimentados em antígeno que não expressam ou têm expressão diminuída de CD62L, CCR7 e / ou CD28 e são positivos para granzima B e / ou perforina, em compara- ção com as células T de memória central ou virgens. Em algumas mo- dalidades, é fornecida uma célula, tal como uma célula de mamífero, para a secreção da proteína de fusão. Em algumas modalidades, a cé- lula, tal como uma célula de mamífero, é uma célula T efetora. Em algu- mas modalidades, a célula, tal como uma célula de mamífero, não ex- pressa ou tem expressão diminuída de CD62L, CCR7 e / ou CD28 e é positiva para granzima B e / ou perforina, em comparação com as célu- las T de memória central ou virgens.
[0204] “Epítopo”, tal como aqui utilizado, refere-se a uma parte de um antígeno ou molécula que é reconhecida pelo sistema imunológico que compreende anticorpos, células T e / ou células B. Os epítopos ge- ralmente têm pelo menos 7 aminoácidos e podem ser um epítopo linear ou conformacional. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula,
tal como uma célula de mamífero, que expressa uma proteína de fusão, em que a célula compreende ainda um receptor de antígeno quimérico. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico compre- ende um scFv que pode reconhecer um epítopo em uma célula cance- rosa. “Isolar” ou “purificar”, quando usado para descrever os vários po- lipeptídeos ou ácidos nucleicos aqui descritos, refere-se a um polipeptí- deo ou ácido nucleico que foi identificado e separado e / ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo ou ácido nucleico isolado está livre de associ- ação com todos os componentes com os quais ele está naturalmente associado. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que normalmente interferem no uso diagnóstico ou tera- pêutico do polipeptídeo ou ácido nucleico, e podem incluir enzimas, hor- mônios e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em algumas moda- lidades, é fornecido um método que compreende entregar o ácido nu- cleico de qualquer uma das modalidades aqui descritas ou o vetor de expressão de qualquer uma das modalidades aqui descritas a uma cé- lula de bactéria, célula de mamífero ou célula de inseto, cultivar a célula em uma cultura, induzir a expressão da proteína de fusão e purificar a proteína de fusão para tratamento.
[0205] “Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoáci- dos” em relação às sequências CISC aqui identificadas é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candi- data que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência de referência para cada um dentre o domínio de ligação extracelular, do- mínio de dobradiça, domínio transmembrana e / ou domínio de sinaliza- ção, após alinhar as sequências e introduzir espaços, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identi-
dade de sequência. O alinhamento para fins de determinação de por- centagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcan- çado de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, tal como softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, compreendendo quaisquer algo- ritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo do com- primento total das sequências sendo comparadas. Por exemplo, os va- lores de % de identidade de sequência de aminoácidos gerados usando o programa de computador WU-BLAST-2 (Altschul, SF e outros (1996). Methods in Enzymol., 266: 460 a 480) usam vários parâmetros de pes- quisa, a maioria dos quais são definidos para os valores padrão. Aque- les que não são definidos para os valores padrão (por exemplo, os pa- râmetros ajustáveis) são definidos com os seguintes valores: extensão de sobreposição = 1, fração de sobreposição = 0,125, limite de palavra (T) = 11 e matriz de escore = BLOSUM62. Em algumas modalidades do CISC, o CISC compreende um domínio de ligação extracelular, um do- mínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de si- nalização, em que cada domínio compreende uma forma natural, sinté- tica, ou mutada ou truncada (tal como uma forma truncada de um domí- nio de sinalização de ILRβ) do domínio nativo. Em algumas modalida- des, uma forma mutada ou truncada de qualquer determinado domínio compreende uma sequência de aminoácidos com 100%, 95%, 90%, 85% de identidade de sequência, ou uma porcentagem de identidade de sequência que está dentro de uma faixa definida por quaisquer duas das porcentagens mencionadas acima para uma sequência estabele- cida em uma sequência fornecida neste documento.
[0206] “Sequência polipeptídica variante de CISC” ou “sequência de aminoácidos variante de CISC”, tal como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de proteína conforme definido abaixo com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoáci- dos (ou uma porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos dentro de uma faixa definida por quaisquer duas das porcentagens men- cionadas acima) com as sequências de proteínas fornecidas neste do- cumento, ou um fragmento derivado especificamente das mesmas, tal como a sequência de proteína para um domínio de ligação extracelular, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana e / ou um domí- nio de sinalização.
Normalmente, um polipeptídeo variante de CISC ou fragmento do mesmo terá pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 81% de identidade de sequência de ami- noácidos, pelo menos 82% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 83% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo me- nos 84% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 86% de iden- tidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 87% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 88% de identidade de sequên- cia de aminoácidos, pelo menos 89% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoá- cidos, pelo menos 91% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 92% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo me- nos 93% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 94% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 95% identi- dade de sequência de aminoácidos, pelo menos 96% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 97% de identidade de sequên- cia de aminoácidos, pelo menos 98% de identidade de sequência de aminoácidos ou pelo menos 99% de identidade de sequência de amino- ácidos com a sequência de aminoácidos ou um fragmento derivado da mesma.
As variantes não abrangem a sequência da proteína nativa.
[0207] “Células T” ou “linfócitos T”, conforme usado neste docu- mento, podem ser de qualquer mamífero, espécie, incluindo, sem limi- tação, macacos, cães, primatas e humanos. Em algumas modalidades, as células T são alogênicas (da mesma espécie, mas de doadores dife- rentes) como o indivíduo receptor; em algumas modalidades, as células T são autólogas (o doador e o receptor são o mesmo); em algumas mo- dalidades, as células T são singênicas (o doador e os receptores são diferentes, mas são gêmeos idênticos).
[0208] “Endonuclease guiada por RNA”, “RGEN”, “endonuclease Cas” ou “nuclease Cas”, conforme usado neste documento, inclui, mas não está limitado a, por exemplo, uma enzima DNA endonuclease gui- ada por RNA associada ao sistema de imunidade adaptativa CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespa- çadas). Aqui, “RGEN” ou “endonuclease Cas” refere-se a endonuclea- ses Cas de ocorrência natural e recombinante.
[0209] Conforme usado neste relatório descritivo, seja em uma frase de transição ou no corpo da reivindicação, os termos “compreende(m)” e “compreendendo” devem ser interpretados como tendo um significado aberto. Ou seja, os termos devem ser interpretados como sinônimos das frases “tendo pelo menos” ou “compreendendo pelo menos”. Quando usado no contexto de um processo, o termo “compreendendo” significa que o processo compreende pelo menos as etapas citadas, mas pode incluir etapas adicionais. Quando usado no contexto de um composto, composição ou dispositivo, o termo “compreendendo” significa que o composto, composição ou dispositivo compreende pelo menos os recur- sos ou componentes citados, mas também pode incluir recursos ou componentes adicionais. Sistemas para Depleção Controlada de Células Plasmáticas
[0210] Em um aspecto, é fornecido aqui um sistema para gerar cé-
lulas manipuladas (por exemplo, células T manipuladas) para a deple- ção controlada de células plasmáticas em um indivíduo. O sistema com- preende a) ácido nucleico para integração no genoma de uma célula (por exemplo, uma célula T) codificando i) um construto anti-células plasmáticas capaz de conferir à célula citotoxicidade em direção a uma célula plasmática, e ii) componentes polipeptídicos de um complexo de sinalização induzida por produtos químicos ativável por dimerização (CISC), em que o CISC competente em sinalização é capaz de produzir um sinal estimulador em uma via de sinalização que promove a sobre- vida e / ou a proliferação da célula, e b) elementos de edição do genoma para integrar o ácido nucleico no genoma da célula para produzir uma célula modificada que expressa o construto anti-células plasmáticas e o CISC. O CISC permite controlar a sobrevida e / ou proliferação da célula manipulada, modulando a quantidade de um ligando necessária para a dimerização de CISC em contato com a célula manipulada. Em algumas modalidades, o CISC compreende um primeiro componente de CISC e um segundo componente de CISC, em que o primeiro componente de CISC e o segundo componente de CISC são configurados de modo que quando expressos pela célula manipulada, eles dimerizam na presença do ligando para criar um CISC competente em sinalização. Em algumas modalidades, a célula manipulada é incapaz de sobreviver e / ou proli- ferar na ausência do ligando. Em algumas modalidades, a célula mani- pulada é defeituosa em uma via de sinalização endógena envolvida na sobrevida e / ou proliferação da célula, e o CISC competente em sinali- zação é capaz de complementar a via de sinalização endógena defeitu- osa de modo que a célula manipulada possa sobreviver e / ou proliferar. Construto Anti-Células Plasmáticas
[0211] Em algumas modalidades, os sistemas descritos neste docu- mento compreendem ácido nucleico codificando um construto anti-célu- las plasmáticas. Em algumas modalidades, o construto de células anti-
plasmáticas é um receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-células plasmáticas. O CAR anti-células plasmáticas reconhece um antígeno presente na superfície de uma célula plasmática. Em algumas modali- dades, o CAR anti-células plasmáticas reconhece um antígeno ex- presso seletivamente na superfície de uma célula plasmática. Em algu- mas modalidades, a célula plasmática é uma célula plasmática não ma- ligna. Em algumas modalidades, o CAR anti-células plasmáticas reco- nhece CD27 (superfamília do receptor de fator de necrose tumoral, Membro 7, TNFRSF7), CD126 (receptor de interleucina-6, IL6R), CD138 (syndecan 1), CD269 (antígeno de maturação de células B, BCMA ), ou CD319 (membro da família SLAM 7, SLAMF7). Em algumas modalida- des, o CAR anti-células plasmáticas é um CAR anti-BCMA. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA reconhece BCMA de ocorrência natu- ral. As porções de anticorpo específicas para BCMA são conhecidas na técnica, e o CAR anti-BCMA pode compreender qualquer uma dessas porções de anticorpo anti-BCMA. Por exemplo, em algumas modalida- des, o CAR anti-BCMA compreende uma porção de anticorpo derivada do anticorpo anti-BCMA C11D5.3. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende um scFv anti-BCMA compreendendo CDR3s de cadeia pesada e de cadeia leve derivadas do anticorpo anti-BCMA C11D5.3. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende um scFv anti-BCMA, em que cada uma das CDRs de scFv anti-BCMA é derivada do anticorpo anti-BCMA C11D5.3. Em algumas modalidades, o scFv anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55.
[0212] Em algumas modalidades, os sistemas aqui descritos com- preendem ácido nucleico codificando um CAR anti-BCMA. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende um domínio de reconhe-
cimento de BCMA extracelular, um domínio transmembrana, um domí- nio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmático.
Em al- gumas modalidades, o domínio de reconhecimento de BCMA extrace- lular é uma porção de anticorpo que pode se ligar especificamente a BCMA.
Em algumas modalidades, a porção do anticorpo é um scFv anti- BCMA.
Em algumas modalidades, o scFv anti-BCMA compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) que compreende a região de- terminante de complementaridade de cadeia pesada (HC-CDR)1, HC- CDR2 e HC-CDR3, e um domínio variável de cadeia leve (VL) compre- endendo a região determinante de complementaridade de cadeia leve (LC-CDR)1, LC-CDR2 e LC-CDR3, em que algumas das CDRs são de- rivadas de um anticorpo anti-BCMA.
Em algumas modalidades, o HC- CDR3 e o LC-CD3 são derivados do anticorpo anti-BCMA.
Em algumas modalidades, o HC-CDR1, o HC-CDR2, o HC-CDR3, o LC-CDR1, o LC- CDR2 e o LC-CDR3 são derivados do anticorpo anti-BCMA.
Em algu- mas modalidades, o anticorpo anti-BCMA é C11D5.3. Em algumas mo- dalidades, o scFv anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de CAR anti-BCMA compreende um domínio transmembrana CD8. Em algumas modalida- des, o domínio transmembrana CD8 compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 56 ou uma variante da mesma tendo pelo me- nos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório de CAR anti-BCMA compreende um domínio coestimulatório 4-1BB e / ou CD28. Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório CD28 compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana coestimulatório 4-1BB compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplas- mático de CAR anti-BCMA compreende um domínio de sinalização ci- toplasmático CD3-ζ. Em algumas modalidades, o domínio de sinaliza- ção citoplasmático CD3-ζ compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 ou 61 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 ou 61.
[0213] Em algumas modalidades, os sistemas aqui descritos com- preendem ácido nucleico codificando um CISC dimérico compreen- dendo um primeiro componente de CISC e um segundo componente de CISC. Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC com- preende um primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um primeiro domínio transmembrana, e um primeiro domínio de sinalização ou porção do mesmo. Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC compreende ainda um primeiro domínio de dobra- diça. Em algumas modalidades, o segundo componente de CISC com- preende um segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um segundo domínio transmembrana, e um segundo domínio de sinalização ou porção do mesmo. Em algumas modalidades, o se- gundo componente de CISC compreende ainda um segundo domínio de dobradiça. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo com- ponente de CISC podem ser configurados de modo que, quando ex-
pressos, eles dimerizem na presença de um ligando. Em algumas mo- dalidades, o primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo, e o segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapa- micina (FRB) ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compre- ende um domínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo, e o primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o ligando é rapa- micina ou um rapalog. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de sinalização é um domínio de sinalização derivado de IL2Rγ e / ou o pri- meiro domínio transmembrana é um domínio transmembrana derivado de IL2Rγ e o segundo domínio de sinalização é um domínio de sinaliza- ção derivado de IL2Rβ e / ou o segundo domínio transmembrana é um domínio transmembrana derivado de IL2Rβ. Em algumas modalidades, o segundo domínio de sinalização é um domínio de sinalização derivado de IL2Rγ e / ou o segundo domínio transmembrana é um domínio trans- membrana derivado de IL2Rγ e o primeiro domínio de sinalização é um domínio de sinalização derivado de IL2Rβ e / ou o primeiro domínio transmembrana é um domínio transmembrana derivado de IL2Rβ.
[0214] Em algumas modalidades, os sistemas aqui descritos com- preendem ácido nucleico codificando um CISC dimérico compreen- dendo um primeiro componente de CISC e um segundo componente de CISC, em que o CISC compreende domínios de sinalização IL2Rγ e IL2Rβ. Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC com- preende uma porção de IL2Rγ incluindo um domínio de sinalização e o segundo componente de CISC compreende uma porção de IL2Rβ in- cluindo um domínio de sinalização, ou o segundo componente de CISC compreende uma porção de IL2Rγ incluindo um domínio de sinalização e o primeiro componente de CISC compreende uma porção de IL2Rβ incluindo um domínio de sinalização.
Em algumas modalidades, o pri- meiro componente de CISC compreende uma porção de IL2Rγ compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 ou uma vari- ante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 e o segundo componente de CISC compreende uma porção de IL2Rβ compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, ou o segundo componente de CISC compreende uma porção de IL2Rγ compreendendo sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e o primeiro com- ponente de CISC compreende uma porção de IL2Rβ compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, o primeiro do- mínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um do- mínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo, e o segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo com- preende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma por- ção do mesmo.
Em algumas modalidades, o segundo domínio de liga- ção extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio da pro- teína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo, e o primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma porção do mesmo.
Em algumas modalidades, o domínio FKBP compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 47. Em algumas modalidades, FRB compreende o amino- ácido sequência da SEQ ID NO: 48 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo com- ponente de CISC dimerizam na presença de rapamicina ou de um rapa- log para formar um CISC competente em sinalização. Em algumas mo- dalidades, o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapa- micina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903 ou AP23573, ou metabólitos, derivados e / ou com- binações dos mesmos.
[0215] Em outras modalidades, o componente de CISC compreen- dendo um domínio de sinalização IL2Rβ compreende um domínio IL2Rβ intracelular truncado. O domínio IL2Rβ truncado retém a capacidade de ativar a sinalização de IL2 à jusante após heterodimerização com o com- ponente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rγ. Em algumas modalidades, o IL2Rβ truncado compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO: 76. Em algumas modalidades, o domínio IL2Rβ truncado da SEQ ID NO: 76 não tem qualquer um de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos N-terminais. Em algumas modalidades, o componente de CISC compreendendo um domínio IL2Rβ intracelular truncado compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 77. Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos componentes de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ aqui descrito, o componente de CISC pode ser substituído por um componente de CISC compreendendo um domínio IL2Rβ intracelular truncado. Por exemplo, em algumas modalidades, um componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ aqui descrito é substituído por um componente de CISC compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77.
Construto Anti-Células T Citotóxicas
[0216] Em algumas modalidades, os sistemas aqui descritos com- preendem ainda ácido nucleico codificando um construto anti-células T citotóxicas. Em algumas modalidades, o construto anti-células T citotó- xicas é capaz de conferir a uma célula editada que expressa o construto, citotoxicidade em direção a uma célula T citotóxica que reconhece a célula editada como estrangeira, enquanto a célula T editada não é ci- totóxica em direção às células T citotóxicas que não reconhecem a cé- lula editada como estrangeira. Em algumas modalidades, o construto anti-células T citotóxicas é um receptor quimérico que compreende um domínio extracelular de β2-microglobulina, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmá- tico. Em algumas modalidades, o domínio extracelular de β2-microglo- bulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62. Em algumas modalida- des, o domínio transmembrana de receptor quimérico compreende um polipeptídeo de domínio transmembrana CD8. Em algumas modalida- des, o domínio transmembrana CD8 do receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 63 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o domínio co- estimulatório do receptor quimérico compreende um domínio coestimu- latório 4-1BB. Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório do receptor quimérico 4-1BB compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático do re- ceptor quimérico compreende um domínio de sinalização citoplasmático
CD3-ζ. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmá- tico do receptor quimérico CD3-ζ compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 59 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 65 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65. Marcador Selecionável
[0217] Em algumas modalidades, os sistemas descritos neste docu- mento compreendem ainda ácido nucleico codificando um marcador se- lecionável. Em algumas modalidades, o marcador selecionável é capaz de conferir a uma célula editada que expressa o marcador selecionável a capacidade de sobreviver em uma condição seletiva, tal como na pre- sença de uma toxina ou na ausência de um nutriente. Em algumas mo- dalidades, o marcador selecionável é um marcador de superfície que permite a seleção de células que expressam o marcador selecionável. Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um polipeptídeo truncado do receptor do fator de crescimento do nervo de baixa afini- dade (tLNGFR). Em algumas modalidades, o polipeptídeo tLNGFR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 66. Resistência ao Inibidor de Calcineurina
[0218] Em algumas modalidades, os sistemas aqui descritos com- preendem ainda ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina. Em algumas moda- lidades, o polipeptídeo é capaz de conferir a uma célula editada que expressa a resistência do polipeptídeo a um ou mais inibidores de cal-
cineurina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que confere resis- tência a um ou mais inibidores de calcineurina confere resistência ao tacrolimus (FK506) e / ou ciclosporina A (CsA). Em algumas modalida- des, o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67). Resistência à Rapamicina
[0219] Embora útil, observou-se que as células que expressam CISC expostas à rapamicina sofrem menos proliferação em compara- ção com a quantidade de proliferação alcançada usando o rapalog AP21967. O alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é uma quinase que em humanos é codificada pelo gene MTOR. mTOR é um membro da família de proteína quinases relacionada a fosfatidilinositol 3-qui- nase. Essa proteína é um regulador de crescimento que estimula o cres- cimento celular por meio da fosforilação de substratos que governam os processos anabólicos, tal como a síntese de lipídios e a tradução do mRNA, além de retardar os processos catabólicos, tal como a autofagia. Sem estar vinculado à teoria, acredita-se que a ligação de um complexo de rapamicina / FKBP ao domínio FRB de mTOR bloqueia ou diminui a sinalização intracelular mediada por mTOR levando à diminuição da tra- dução de mRNA e crescimento celular.
[0220] Em algumas modalidades, os sistemas aqui descritos com- preendem ainda ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é capaz de conferir a uma célula editada que expressa a resistência do polipeptídeo à rapamicina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo de domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR). Em algumas modalidades, o po- lipeptídeo que confere resistência à rapamicina compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69.
Elementos de Edição de Genoma
[0221] Em algumas modalidades, os sistemas descritos neste docu- mento compreendem elementos de edição de genoma para a integra- ção de ácido nucleico no genoma de uma célula para produzir uma cé- lula manipulada que expressa um construto anti-células plasmáticas e CISC aqui descrito. Em algumas modalidades, os elementos de edição do genoma são capazes de inserir ácido nucleico codificando os vários polipeptídeos aqui descritos em um gene TRA endógeno e / ou um gene IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, os elementos de edição do genoma compreendem um sistema CRISPR compreendendo a) um primeiro gRNA direcionado a um gene TRA endógeno e / ou um se- gundo gRNA direcionado a um gene IL2RG endógeno; e b) uma endo- nuclease guiada por RNA (RGEN) ou um ácido nucleico codificando o RGEN. Em algumas modalidades, o primeiro gRNA tem como alvo um gene TRA endógeno dentro ou próximo de uma região codificando o domínio TRAC. Um sítio alvo de gRNA está “próximo” a uma região co- dificando o domínio TRAC se a integração nesse sítio alvo for capaz de interromper a expressão e / ou função do domínio TRAC, normalmente em um flanco ou uma sequência adjacente. Em algumas modalidades, o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3, ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3. Em algumas modalidades, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, ou uma va- riante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18. Em algumas modalidades, o RGEN é selecionado a partir do grupo que consiste em endonuclease Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também co- nhecido como Csn1 e Csx12), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1,
Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 e Cpf1, ou um deri- vado funcional das mesmas.
[0222] Em algumas modalidades, os sistemas aqui descritos com- preendem elementos de edição de genoma compreendendo a) um pri- meiro gRNA direcionado a um gene TRA endógeno e / ou um segundo gRNA direcionado a um gene IL2RG endógeno; e b) uma endonuclease guiada por RNA (RGEN) ou um ácido nucleico codificando o RGEN. Em algumas modalidades, o primeiro gRNA tem como alvo um gene TRA endógeno dentro ou próximo de uma região codificando o domínio TRAC. Em algumas modalidades, o primeiro gRNA compreende a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3, ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3. Em algumas modalidades, o se- gundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18. Em algumas modalidades, o RGEN é Cas9. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando o RGEN é uma sequência de ácido ribonu- cleico (RNA). Em algumas modalidades, a sequência de RNA codifi- cando o RGEN está ligada ao primeiro gRNA ou ao segundo gRNA por meio de uma ligação covalente. Em algumas modalidades, o sistema compreende um ou mais modelos de doadores compreendendo ácido nucleico codificando um construto anti-células plasmáticas e CISC aqui descrito. Em algumas modalidades, o construto anti-células plasmáticas é um CAR anti-BCMA de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas. Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doa- dores compreendem ainda ácido nucleico codificando um ou mais de um construto anti-células T citotóxicas, um marcador selecionável, um polipeptídeo que confere resistência ao inibidor de calcineurina, e um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina de acordo com qual- quer das modalidades aqui descritas. Em algumas modalidades, o cons- truto anti-células T citotóxicas é um receptor quimérico que compreende um domínio extracelular de β2-microglobulina, um domínio transmem- brana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização cito- plasmático. Em algumas modalidades, o sistema compreende um pri- meiro modelo de doador para inserção no gene TRA endógeno e / ou um segundo modelo de doador para inserção no gene IL2RG endógeno.
[0223] Em algumas modalidades, os sistemas descritos neste docu- mento compreendem um ou mais modelos de doadores compreen- dendo ácido nucleico codificando os seguintes componentes do sis- tema: i) um construto anti-células plasmáticas; ii) um primeiro compo- nente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina; iv) um marcador selecionável; v) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vi) um segundo componente de CISC com- preendendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compre- endem um primeiro modelo de doador e um segundo modelo de doador. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endógeno e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endó- geno. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compre- ende um primeiro cassete de codificação e o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codificação. Em algumas modali- dades, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáticas e o ácido nucleico co- dificando o primeiro componente de CISC. Em algumas modalidades, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codifi-
cando o polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, o ácido nu- cleico codificando o marcador selecionável, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calci- neurina e o ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, o primeiro mo- delo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo um primeiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de co- dificação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende ácido nucleico codificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nu- cleico codificando um peptídeo autoclivável 2A a montante do primeiro cassete de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configu- rado de modo que quando inserido no primeiro gene endógeno, a por- ção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada a uma se- quência do primeiro gene endógeno e a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do primeiro gene endógeno em conjunto compreendem o primeiro cassete de expressão policistrô- nico.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção do primeiro modelo de do- ador resulta em um domínio TRAC não funcional.
O domínio TRAC em uma célula não é funcional se a célula for incapaz de expressar um re- ceptor funcional de célula T nativo (não modificado). Em algumas mo- dalidades, o segundo modelo de doador compreende um segundo cas- sete de expressão policistrônico ou porção do mesmo compreendendo um segundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de codificação, de modo que a expressão do segundo cassete de expres- são policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algu- mas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algu- mas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endó- geno.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo modelo de doador compreende uma por- ção do segundo cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nucleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codifi- cando o segundo componente de CISC, e o segundo modelo de doador é configurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC é ligado a uma sequência do gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em conjunto codificam o segundo componente de CISC, e a porção do segundo cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do gene IL2RG endógeno, juntos, com- preendem o segundo cassete de expressão policistrônico.
Configura- ções exemplificativas para o primeiro modelo de doador são mostradas na Figura 1, construtos de modelo de doador # 4 - # 7. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador com- preende a sequência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene TRA.
Braços de homologia exemplificativos para o primeiro mo- delo de doador incluem braços de homologia com as sequências poli- nucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exemplificativas para o segundo modelo de doador são mostradas na Figura 1, construto de modelo de doador #
8. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 43. Por exemplo, em algumas modalidades, o segundo mo- delo de doador compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO:
105. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador é flanque- ado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene IL2RG. Braços de homologia exemplificativos para o segundo modelo de doador incluem braços de homologia com as sequências polinucleo- tídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104 e va- riantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 43 ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 43. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 105 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 105.
[0224] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos modelos de doador aqui descritos, o modelo do doador compreende ácido nucleico codificando um construto anti-células plasmáticas.
Em algumas modalidades, o construto anti-células plasmáticas é um CAR anti-BCMA.
Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende um domínio de reconhecimento de BCMA extracelular, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinaliza- ção citoplasmático.
Em algumas modalidades, o domínio de reconheci- mento de BCMA extracelular é uma porção de anticorpo que pode se ligar especificamente a BCMA.
Em algumas modalidades, a porção do anticorpo é um scFv anti-BCMA.
Em algumas modalidades, o scFv anti- BCMA compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) que compreende a região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HC-CDR)1, HC-CDR2 e HC-CDR3, e um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo a região determinante de complemen- taridade de cadeia leve (LC-CDR)1, LC-CDR2 e LC-CDR3, em que al- guns dos CDRs são derivados de um anticorpo anti-BCMA.
Em algumas modalidades, o HC-CDR3 e o LC-CD3 são derivados do anticorpo anti- BCMA.
Em algumas modalidades, o HC-CDR1, o HC-CDR2, o HC- CDR3, o LC-CDR1, o LC-CDR2 e o LC-CDR3 são derivados do anti- corpo anti-BCMA.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BCMA é C11D5.3. Em algumas modalidades, o scFv anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o domínio trans- membrana de CAR anti-BCMA compreende um domínio transmem- brana CD8. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana CD8 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório de CAR anti-BCMA compreende um domínio coestimulatório 4-1BB e / ou CD28. Em algumas modalidades, o domí- nio coestimulatório CD28 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório 4-1BB compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático de CAR anti-BCMA compreende um domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ. Em algumas modalidades, o do- mínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 ou 61 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 60 ou 61.
[0225] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos modelos de doador aqui descritos, o modelo do doador compreende ácido nucleico codificando um primeiro componente de CISC compre- endendo um domínio de sinalização IL2Rβ. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação extracelular do primeiro componente de CISC compreende um domínio FRB. Em algumas modalidades, o pri- meiro componente de CISC compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54.
[0226] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos modelos de doador aqui descritos, o modelo do doador compreende ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resistência à ra-
pamicina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que confere resis- tência à rapamicina é um polipeptídeo de domínio FRB. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio FRB compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69.
[0227] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos modelos de doador aqui descritos, o modelo do doador compreende ácido nucleico codificando um marcador selecionável. Em algumas mo- dalidades, o marcador selecionável é um polipeptídeo tLNGFR. Em al- gumas modalidades, o polipeptídeo tLNGFR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66.
[0228] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos modelos de doador aqui descritos, o modelo do doador compreende ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina é um polipeptídeo CN mutante. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67).
[0229] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos modelos de doador aqui descritos, o modelo do doador compreende ácido nucleico codificando um segundo componente de CISC compre- endendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação extracelular do se- gundo componente de CISC compreende um domínio FKBP. Em algu- mas modalidades, o segundo componente de CISC compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Em algumas modalidades, o modelo de doador com- preende nucleico ácido codificando um fragmento do segundo compo- nente de CISC compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52.
[0230] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos modelos de doador aqui descritos, o modelo de doador compreende um promotor MSCV. Em algumas modalidades, o promotor MSCV compre- ende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 75 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de SEQ ID NO: 75.
[0231] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos modelos de doador aqui descritos, o modelo do doador compreende um promotor MND. Em algumas modalidades, o promotor MND compre- ende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 74 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de SEQ ID NO: 74.
[0232] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos modelos de doador descritos neste documento, o modelo de doador compreende ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A en- tre ácidos nucleicos adjacentes codificando componentes do sistema. Em algumas modalidades, o modelo de doador compreende ácido nu- cleico codificando um peptídeo autoclivável 2A entre cada um dos áci- dos nucleicos adjacentes codificando componentes do sistema. Por exemplo, em algumas modalidades, o modelo de doador compreende, na ordem de 5’ a 3’, ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, ácido nucleico codificando um peptí- deo autoclivável 2A, ácido nucleico codificando um marcador selecioná- vel, nucleico ácido codificando um peptídeo autoclivável 2A, ácido nu- cleico codificando um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina, ácido nucleico codificando um peptídeo au- toclivável 2A, e ácido nucleico codificando um segundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, cada um dos peptídeos autocliváveis 2A é, independentemente, um peptídeo au- toclivável T2A ou um peptídeo autoclivável P2A. Em algumas modalida- des, o peptídeo autoclivável T2A compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 72 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72. Em algumas modalidades, o peptídeo autoclivável P2A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 73.
[0233] Em algumas modalidades, os sistemas aqui descritos com- preendem um ou mais modelos de doadores compreendendo ácido nu- cleico codificando os seguintes componentes do sistema: i) um cons- truto anti-células plasmáticas; ii) um primeiro componente de CISC com- preendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um construto anti-cé- lulas T citotóxicas; iv) um polipeptídeo que confere resistência à rapa- micina; v) um marcador selecionável; vi) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vii) um segundo componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais mode- los de doadores compreendem um primeiro modelo de doador e um se- gundo modelo de doador. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endó- geno e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endógeno. Em algumas modalidades, o primeiro mo- delo de doador compreende um primeiro cassete de codificação e o se- gundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codifica-
ção.
Em algumas modalidades, o primeiro cassete de codificação com- preende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáti- cas e o ácido nucleico codificando o primeiro componente de CISC.
Em algumas modalidades, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células T citotóxicas, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência à ra- pamicina, o ácido nucleico codificando o marcador selecionável, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina, e o ácido nucleico codificando o se- gundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro cassete de expressão policis- trônico compreendendo um primeiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do pri- meiro cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do pri- meiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas mo- dalidades, o primeiro modelo de doador compreende ácido nucleico co- dificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrô- nico compreendendo ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivá- vel 2A a montante do primeiro cassete de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inserido no pri- meiro gene endógeno, a porção do primeiro cassete de expressão poli- cistrônico ligada a uma sequência do primeiro gene endógeno e a por- ção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do primeiro gene endógeno em conjunto compreendem o primeiro cas- sete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é inserido na região do gene TRA endó-
geno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inser- ção do primeiro modelo de doador resulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador com- preende um segundo cassete de expressão policistrônico ou porção do mesmo compreendendo um segundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de codificação, de modo que a expressão do se- gundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do se- gundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo modelo de doador compreende uma porção do segundo cassete de expressão policistrô- nico compreendendo ácido nucleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o se- gundo modelo de doador é configurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC é ligado a uma sequência do gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em conjunto codifica o segundo componente de CISC e a porção do se- gundo cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do gene IL2RG endógeno, juntos, compreendem o segundo cassete de expres- são policistrônico.
Configurações exemplificativas para o primeiro mo- delo de doador são mostradas na Figura 1, construtos de modelo de doador # 4 a # 7. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doa- dor compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende a sequência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades,
o primeiro modelo de doador é flanqueado por braços de homologia cor- respondentes a sequências no gene TRA.
Braços de homologia exem- plificativos para o primeiro modelo de doador incluem braços de homo- logia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exem- plificativas para o segundo modelo de doador são mostradas na Figura 1, construto de modelo de doador # 9. Em algumas modalidades, o se- gundo modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica con- tígua de SEQ ID NO: 44. Por exemplo, em algumas modalidades, o se- gundo modelo de doador compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 106. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene IL2RG.
Braços de homologia exemplificativos para o segundo mo- delo de doador incluem braços de homologia com as sequências poli- nucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doa- dor é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV.
Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compre- ende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compre- ende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 44 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 106 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 106.
[0234] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos modelos de doador aqui descritos, o modelo de doador compreende ácido nucleico codificando um construto anti-células T citotóxicas. Em algumas modalidades, o construto anti-células T citotóxicas é capaz de conferir a uma célula T editada que expressa o construto citotoxicidade em direção a uma célula T citotóxica que reconhece a célula T editada como estrangeira, enquanto a célula T editada não é citotóxica em dire- ção a células T citotóxicas que não reconhecem a célula T editada como estrangeira. Em algumas modalidades, o construto anti-células T citotó- xicas é um receptor quimérico que compreende um domínio extracelular de β2-microglobulina, um domínio transmembrana, um domínio coesti- mulatório, e um domínio de sinalização citoplasmático. Em algumas mo- dalidades, o domínio extracelular de β2-microglobulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, o domínio trans- membrana do receptor quimérico compreende um polipeptídeo de do- mínio transmembrana CD8. Em algumas modalidades, o domínio trans- membrana CD8 do receptor quimérico compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 63 ou uma variante da mesma tendo pelo me- nos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório do recep- tor quimérico compreende um domínio coestimulatório 4-1BB. Em algu- mas modalidades, o domínio coestimulatório 4-1BB do receptor quimé- rico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64. Em algumas modalida-
des, o domínio de sinalização citoplasmático do receptor quimérico com- preende um domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ do recep- tor quimérico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59. Em algumas mo- dalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 65 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65.
[0235] Em algumas modalidades, os sistemas aqui descritos com- preendem um ou mais modelos de doadores compreendendo ácido nu- cleico codificando os seguintes componentes do sistema: i) um cons- truto anti-células plasmáticas; ii) um primeiro componente de CISC com- preendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina; iv) um polipeptídeo que confere resis- tência a um ou mais inibidores de calcineurina; e v) um segundo com- ponente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compreendem um primeiro modelo de doador e um se- gundo modelo de doador. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endó- geno e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endógeno. Em algumas modalidades, o primeiro mo- delo de doador compreende um primeiro cassete de codificação e o se- gundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codifica- ção. Em algumas modalidades, o primeiro cassete de codificação com- preende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáti- cas. Em algumas modalidades, o segundo cassete de codificação com- preende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resis- tência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina, o ácido nu- cleico codificando o primeiro componente de CISC, e o ácido nucleico codificar o segundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro promotor ope- racionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do ácido nucleico codificando o construto anti-células plas- máticas esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas moda- lidades, o primeiro promotor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doa- dor compreende ácido nucleico codificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nucleico co- dificando um peptídeo autoclivável 2A a montante da primeira sequên- cia de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inserido no primeiro gene endógeno, a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada a uma sequência do primeiro gene endógeno e a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do primeiro gene endógeno em con- junto compreendem o primeiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA en- dógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é in- serido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção do primeiro modelo de doador re- sulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de ex- pressão policistrônico ou porção do mesmo compreendendo um se- gundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de codi- ficação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo modelo de doador compreende uma porção do segundo cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nu- cleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o segundo modelo de doador é confi- gurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fra- gmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC é ligado a uma sequência do gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à se- quência do gene IL2RG endógeno em conjunto codifica o segundo com- ponente de CISC, e a porção do segundo cassete de expressão policis- trônico ligada à sequência do gene IL2RG endógeno, juntos, compreen- dem o segundo cassete de expressão policistrônico. Configurações exemplificativas para o primeiro modelo de doador são mostradas na Figura 1, construções de modelo de doador # 1 e # 2. Em algumas mo- dalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 24. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador com- preende a sequência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 99. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é flan- queado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene TRA. Braços de homologia exemplificativos para o primeiro mo- delo de doador incluem braços de homologia com as sequências poli- nucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exemplificativas para o segundo modelo de doador são mostrados na Figura 1, construto de modelo de doador #
10. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compre- ende uma sequência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 45. Por exemplo, em algumas modalidades, o segundo modelo de doador com- preende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 107. Em algumas mo- dalidades, o segundo modelo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene IL2RG. Braços de homologia exemplificativos para o segundo modelo de doador incluem braços de homologia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 24 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 24. Em algu- mas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 99 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 99. Em algumas mo- dalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotí- dica de SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 107 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 107.
[0236] Em algumas modalidades, os sistemas descritos neste docu- mento compreendem um ou mais modelos de doadores compreen- dendo ácido nucleico codificando os seguintes componentes do sis- tema: i) um construto anti-células plasmáticas; ii) um primeiro compo- nente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um construto anti-células T citotóxicas; iv) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina; v) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vi) um segundo componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou frag- mento do mesmo.
Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compreendem um primeiro modelo de doador e um segundo modelo de doador.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de do- ador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endógeno e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende um primeiro cassete de codificação e o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codificação.
Em algumas modalidades, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáticas e o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina.
Em algumas modalidades, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o poli- peptídeo que confere resistência à rapamicina, o ácido nucleico codifi- cando o primeiro componente de CISC e o ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algu- mas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma se- quência poliA sintética a montante de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo um primeiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas mo- dalidades, o primeiro modelo de doador compreende ácido nucleico co- dificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrô- nico compreendendo ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivá- vel 2A a montante do primeiro cassete de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inserido no pri- meiro gene endógeno, a porção do primeiro cassete de expressão poli- cistrônico ligada a uma sequência do primeiro gene endógeno e a por- ção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do primeiro gene endógeno em conjunto compreendem o primeiro cas- sete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é inserido na região do gene TRA endó- geno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inser- ção do primeiro modelo de doador resulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador com- preende um segundo cassete de expressão policistrônico ou porção do mesmo compreendendo um segundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de codificação, de modo que a expressão do se- gundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do se- gundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo modelo de doador compreende uma porção do segundo cassete de expressão policistrô- nico compreendendo ácido nucleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o se- gundo modelo de doador é configurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC é ligado a uma sequência do gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em conjunto codifica o segundo componente de CISC e a porção do se- gundo cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do gene
IL2RG endógeno, juntos, compreendem o segundo cassete de expres- são policistrônico. Configurações exemplificativas para o primeiro mo- delo de doador são mostradas na Figura 1, construto de modelo de do- ador # 3. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador com- preende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27. Por exemplo, em algumas modalidades, o pri- meiro modelo de doador compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 100. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene TRA. Braços de homologia exemplificativos para o primeiro mo- delo de doador incluem braços de homologia com as sequências poli- nucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exemplificativas para o segundo modelo de doador são mostrados na Figura 1, construto de modelo de doador #
11. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compre- ende uma sequência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 46. Por exemplo, em algumas modalidades, o segundo modelo de doador com- preende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 108. Em algumas mo- dalidades, o segundo modelo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene IL2RG. Braços de homologia exemplificativos para o segundo modelo de doador incluem braços de homologia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27. Em algu-
mas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 100 e variantes da mesma tendo pelo me- nos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO:
100. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o segundo ve- tor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 108 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 108.
[0237] Em algumas modalidades, os sistemas descritos neste docu- mento compreendem um ou mais modelos de doadores e um ou mais gRNAs. Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compreendem um primeiro modelo de doador e um segundo modelo de doador, e um ou mais gRNAs compreendem um primeiro gRNA e um segundo gRNA. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um se- gundo vetor AAV. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37, e o primeiro gRNA compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44, e o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer um das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38, e o primeiro gRNA compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, e o segundo vetor AAV compreende o sequência de polinucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma va- riante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia à sequência po- linucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44, e o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39, e o primeiro gRNA compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44, e o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer um das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ
ID NOs: 4 a 18. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV com- preende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 19 ou 22 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia polinucleotídica de SEQ ID NO: 19 ou 22, e o primeiro gRNA com- preende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 1, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 45, e o segundo gRNA compreende a sequên- cia polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e varian- tes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer um de SEQ ID NOs: 4 a 18. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucle- otídica da SEQ ID NO: 20 ou 23 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 20 ou 23, e o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleo- tídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45, e o se- gundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer um de SEQ ID NOs: 4 a 18. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24, e o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3 ou uma va- riante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 45, e o segundo gRNA compreende a sequên- cia polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e varian- tes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer um de SEQ ID NOs: 4 a 18. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucle- otídica da SEQ ID NO: 25 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25, e o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46, e o segundo gRNA com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compre- ende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 26 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de SEQ ID NO: 26, e o primeiro gRNA compreende a se- quência polinucleotídica de SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da
SEQ ID NO: 46, e o segundo gRNA compreende a sequência polinucle- otídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mes- mas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleo- tídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18. Em algumas modali- dades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 27 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 27, e o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46, e o segundo gRNA com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18.
[0238] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos sistemas descritos neste documento compreendendo um modelo de do- ador, o modelo de doador compreende um cassete de codificação, e o modelo de doador é configurado de modo que o cassete de codificação seja capaz de ser integrado em um lócus genômico direcionado por um gRNA no sistema por reparo dirigido por homologia (HDR). Em algumas modalidades, o cassete de codificação é flanqueado em ambos os lados por braços de homologia correspondentes a sequências no lócus genô- mico direcionado. Em algumas modalidades, os braços de homologia correspondem a sequências no lócus genômico direcionado que in- cluem um sítio alvo para um gRNA é o sistema. Em algumas modalida- des, um ou ambos os braços de homologia compreendem uma sequên-
cia correspondente a um sítio alvo para um gRNA no sistema. Em algu- mas modalidades, os braços de homologia são configurados de modo que a integração do cassete de codificação no lócus genômico remova o sítio alvo genômico para o gRNA ou, de outro modo, modifique o sítio alvo genômico de modo que ele não seja mais um alvo para o gRNA. Em algumas modalidades, a sequência nos braços de homologia cor- respondentes ao sítio alvo compreende uma alteração na sequência PAM do sítio alvo de modo que não seja um alvo para o gRNA. Em algumas modalidades, um dos braços de homologia compreende uma sequência correspondente a uma porção do sítio alvo, e o outro braço de homologia compreende uma sequência correspondente ao restante do sítio alvo, de modo que a integração da sequência de codificação no lócus genômico interrompa o sítio alvo no lócus genômico. Em algumas modalidades, os braços de homologia são pelo menos ou pelo menos cerca de 0,2 kb (tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 0,3 kb, 0,4 kb, 0,5 kb, 0,6 kb, 0,7 kb, 0,8 kb, 0,9 kb, 1 kb, ou mais) de compri- mento. Braços de homologia exemplificativos incluem braços de homo- logia de modelos de doadores com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 46. Em algumas modalidades, o modelo de doador é codificado em um vetor de Vírus Adenoassociado (AAV). Em algumas modalidades, o vetor AAV é um vetor AAV6.
[0239] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos sistemas descritos neste documento compreendendo um modelo de do- ador, o modelo de doador compreende um cassete de codificação, e o modelo de doador é configurado de modo que o cassete de codificação seja capaz de ser integrado em um lócus genômico direcionado por um gRNA no sistema por união de extremidades não homólogas (NHEJ). Em algumas modalidades, o cassete de codificação é flanqueado em um ou ambos os lados por um sítio alvo de gRNA. Em algumas modali- dades, o cassete de codificação é flanqueado em ambos os lados por um sítio alvo de gRNA. Em algumas modalidades, o sítio alvo do gRNA é um sítio alvo para um gRNA no sistema. Em algumas modalidades, o sítio alvo de gRNA do modelo de doador é o complemento reverso de um sítio alvo de gRNA do genoma celular para um gRNA no sistema. Em algumas modalidades, o modelo de doador é codificado em um ve- tor de Vírus Adenoassociado (AAV). Em algumas modalidades, o vetor AAV é um vetor AAV6.
[0240] Em algumas modalidades, os sistemas aqui descritos com- preendem um complexo de ribonucleoproteína (RNP) compreendendo o RGEN e o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA. Em algumas mo- dalidades, o RGEN é pré-complexado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA em uma relação molar de gRNA para RGEN entre 1:1 e 20:1, respectivamente, para formar o RNP. Células Manipuladas
[0241] Em alguns aspectos, são fornecidas aqui células manipula- das, tal como células de mamíferos manipuladas (por exemplo, células T), compreendendo ácido nucleico codificando i) um construto anti-cé- lulas plasmáticas capaz de conferir às células manipuladas citotoxici- dade em direção a uma célula plasmática como apresentado e descrito aqui, e ii) componentes polipeptídicos de um complexo de sinalização induzida por produtos químicos ativável por dimerização (CISC), con- forme apresentado e descrito neste documento, em que o CISC compe- tente em sinalização é capaz de produzir um sinal estimulador em uma via de sinalização que promove a sobrevida e / ou proliferação das cé- lulas modificadas. O CISC permite controlar a sobrevida e / ou prolifera- ção das células manipuladas modulando a quantidade de um ligando necessária para a dimerização de CISC em contato com as células ma- nipuladas. Em algumas modalidades, o CISC compreende um primeiro componente de CISC e um segundo componente de CISC, em que o primeiro componente de CISC e o segundo componente de CISC são configurados de modo que quando expressos pela célula manipulada, eles dimerizam na presença do ligando para criar o CISC competente em sinalização. Em algumas modalidades, a célula manipulada é inca- paz de sobreviver e / ou proliferar na ausência do ligando. Em algumas modalidades, a célula manipulada é defeituosa em uma via de sinaliza- ção endógena envolvida na sobrevida e / ou proliferação da célula, e o CISC competente em sinalização é capaz de complementar a via de sinalização endógena defeituosa de modo que a célula manipulada possa sobreviver e / ou proliferar. Em algumas modalidades, as células manipuladas são células T manipuladas. Em algumas modalidades, as células T manipuladas compreendendo um CAR anti-células plasmáti- cas como aqui descrito, tal como, por exemplo, um CAR anti-BCMA, desgranulam na presença de, ou após o contato com, seu antígeno alvo. Em algumas modalidades, as células T manipuladas localizam-se em sítios de tumores de neoplasias de células plasmáticas, tal como, por exemplo, mieloma múltiplo, em um indivíduo. Em algumas modalidades, as células T modificadas se localizam nos sítios de residência das célu- las plasmáticas no corpo, por exemplo, na medula óssea e nos intesti- nos. Em algumas modalidades, as células T manipuladas são humanas.
[0242] Em algumas modalidades, as células manipuladas aqui des- critas compreendem ácido nucleico codificando um construto anti-célu- las plasmáticas. Em algumas modalidades, o construto anti-células plasmáticas é um receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-células plasmáticas. O CAR anti-células plasmáticas reconhece um antígeno presente na superfície de uma célula plasmática. Em algumas modali- dades, o CAR anti-células plasmáticas reconhece um antígeno ex- presso seletivamente na superfície de uma célula plasmática. Em algu- mas modalidades, a célula plasmática é uma célula plasmática não ma- ligna. Em algumas modalidades, o CAR anti-células plasmáticas reco- nhece CD27 (superfamília do receptor de fator de necrose tumoral,
Membro 7, TNFRSF7), CD126 (receptor de interleucina-6, IL6R), CD138 (syndecan 1), CD269 (antígeno de maturação de células B, BCMA), ou CD319 (membro da família SLAM 7, SLAMF7). Em algumas modalida- des, o CAR anti-células plasmáticas é um CAR anti-BCMA. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA reconhece BCMA de ocorrência natu- ral. As porções de anticorpo específicas para BCMA são conhecidas na técnica, e o CAR anti-BCMA pode compreender qualquer uma dessas porções de anticorpo anti-BCMA. Por exemplo, em algumas modalida- des, o CAR anti-BCMA compreende uma porção de anticorpo derivada do anticorpo anti-BCMA C11D5.3. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende um scFv anti-BCMA compreendendo CDR3s de cadeia pesada e de cadeia leve derivadas do anticorpo anti-BCMA C11D5.3. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende um scFv anti-BCMA, em que cada uma das CDRs de scFv anti-BCMA é derivada do anticorpo anti-BCMA C11D5.3. Em algumas modalidades, o scFv anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55.
[0243] Em algumas modalidades, as células manipuladas aqui des- critas compreendem ácido nucleico codificando um CAR anti-BCMA. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende um domínio de reconhecimento de BCMA extracelular, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmá- tico. Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento de BCMA extracelular é uma porção de anticorpo que pode se ligar especifica- mente a BCMA. Em algumas modalidades, a porção do anticorpo é um scFv anti-BCMA. Em algumas modalidades, o scFv anti-BCMA compre- ende um domínio variável de cadeia pesada (VH) que compreende a região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HC- CDR)1, HC-CDR2 e HC-CDR3, e um domínio variável de cadeia leve
(VL) compreendendo a região determinante de complementaridade de cadeia leve (LC-CDR)1, LC-CDR2 e LC-CDR3, em que algumas das CDRs são derivadas de um anticorpo anti-BCMA.
Em algumas modali- dades, o HC-CDR3 e o LC-CD3 são derivados do anticorpo anti-BCMA.
Em algumas modalidades, o HC-CDR1, o HC-CDR2, o HC-CDR3, o LC- CDR1, o LC-CDR2 e o LC-CDR3 são derivados do anticorpo anti- BCMA.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BCMA é C11D5.3. Em algumas modalidades, o scFv anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de CAR anti-BCMA compreende um domínio transmembrana CD8. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana CD8 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, o domínio co- estimulatório de CAR anti-BCMA compreende um domínio coestimula- tório 4-1BB e / ou CD28. Em algumas modalidades, o domínio coesti- mulatório CD28 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57. Em algumas mo- dalidades, o domínio transmembrana coestimulatório 4-1BB compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático de CAR anti-BCMA compreende um do- mínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ.
Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 ou 61 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 ou 61.
[0244] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas, um ácido nucleico exógeno codifi- cando o construto anti-células plasmáticas é inserido no genoma das células manipuladas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exó- geno é inserido em um gene TRA endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC. Em algumas modalidades, a inserção do ácido nucleico exógeno resulta em um domínio TRAC não funcional. O domínio TRAC não é funcional se a célula resultante for incapaz de ex- pressar um receptor funcional de célula T nativa (não modificado). Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene IL2RG endógeno de modo que a expressão do construto anti-células plasmáticas esteja sob o controle de um ou mais elementos reguladores de IL2RG endógenos. Em algumas modalida- des, o ácido nucleico exógeno compreende ainda um promotor operaci- onalmente ligado à porção do ácido nucleico exógeno codificando o construto anti-células plasmáticas, de modo que a expressão do cons- truto anti-células plasmáticas nas células manipuladas esteja sob o con- trole do promotor. Em algumas modalidades, o promotor é um potenci- alizador do vírus do sarcoma mieloproliferativo, região de controle ne- gativa deletada, promotor do sítio de ligação ao iniciador dl587rev subs- tituído (MND). Em algumas modalidades, o promotor MND compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 74 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica de SEQ ID NO: 74.
[0245] Em algumas modalidades, as células manipuladas aqui des- critas compreendem ácido nucleico codificando um CISC dimérico com- preendendo um primeiro componente de CISC e um segundo compo- nente de CISC.
Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC compreende um primeiro domínio de ligação extracelular ou por- ção do mesmo, um primeiro domínio transmembrana, e um primeiro do- mínio de sinalização ou porção do mesmo.
Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC compreende ainda um primeiro domínio de dobradiça.
Em algumas modalidades, o segundo componente de CISC compreende um segundo domínio de ligação extracelular ou por- ção do mesmo, um segundo domínio transmembrana, e um segundo domínio de sinalização ou porção do mesmo.
Em algumas modalidades, o segundo componente de CISC compreende ainda um segundo domí- nio de dobradiça.
Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo componente de CISC podem ser configurados de modo que, quando expressos, eles dimerizam na presença de um ligando.
Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo, e o segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapa- micina (FRB) ou uma porção do mesmo.
Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compre- ende um domínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo, e o primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma porção do mesmo.
Em algumas modalidades, o ligando é rapa- micina ou um rapalog.
Em algumas modalidades, o primeiro domínio de sinalização é um domínio de sinalização derivado de IL2Rγ e / ou o pri- meiro domínio transmembrana é um domínio transmembrana derivado de IL2Rγ, e o segundo domínio de sinalização é um domínio de sinali- zação derivado de IL2Rβ e / ou o segundo domínio transmembrana é um domínio transmembrana derivado de IL2Rβ. Em algumas modalida- des, o segundo domínio de sinalização é um domínio de sinalização de- rivado de IL2Rγ e / ou o segundo domínio transmembrana é um domínio transmembrana derivado de IL2Rγ, e o primeiro domínio de sinalização é um domínio de sinalização derivado de IL2Rβ e / ou o primeiro domínio transmembrana é um domínio transmembrana derivado de IL2Rβ.
[0246] Em algumas modalidades, as células manipuladas aqui des- critas compreendem ácido nucleico codificando um CISC dimérico com- preendendo um primeiro componente de CISC e um segundo compo- nente de CISC, em que o CISC compreende os domínios de sinalização IL2Rγ e IL2Rβ. Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC compreende uma porção de IL2Rγ incluindo um domínio de sina- lização e o segundo componente de CISC compreende uma porção de IL2Rβ incluindo um domínio de sinalização, ou o segundo componente de CISC compreende uma porção de IL2Rγ incluindo um domínio de sinalização e o primeiro CISC componente compreende uma porção de IL2Rβ incluindo um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC compreende uma porção de IL2Rγ compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, e o segundo componente de CISC compreende uma porção de IL2Rβ compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, ou o segundo componente de CISC compreende uma porção de IL2Rγ compreendendo sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50, e o primeiro com- ponente de CISC compreende uma porção de IL2Rβ compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, o primeiro do- mínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um do- mínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo, e o segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo com- preende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma por- ção do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo domínio de liga- ção extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio da pro- teína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo, e o primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio FKBP compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47. Em algumas modalidades, FRB compreende o amino- ácido sequência da SEQ ID NO: 48 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo com- ponente de CISC dimerizam na presença de rapamicina ou um rapalog para formar um CISC competente em sinalização. Em algumas modali- dades, o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em eve- rolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapami- cina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de be- nidipina, AP1903 ou AP23573, ou metabólitos, derivados e / ou combi- nações dos mesmos.
[0247] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas, um primeiro ácido nucleico exógeno codificando o primeiro componente de CISC ou uma porção do mesmo é inserido no genoma das células manipuladas e / ou um segundo ácido nucleico exógeno codificando o segundo componente de CISC ou uma porção do mesmo é inserido no genoma das células manipuladas.
Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico exógeno é inserido em um gene TRA endógeno e / ou o segundo ácido nucleico exógeno é inserido em um gene TRA endógeno.
Em algumas modalidades, o pri- meiro ácido nucleico exógeno é inserido na região do gene TRA endó- geno codificando o domínio TRAC e / ou o segundo ácido nucleico exó- geno é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção de ácido nucleico exógeno resulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico exógeno é inserido em um gene IL2RG endó- geno e / ou o segundo ácido nucleico exógeno é inserido em um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno codificando um componente de CISC compreendendo uma porção de IL2Rγ é inserido no gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno codificando um componente de CISC compre- endendo uma porção de IL2Rγ é inserido no gene IL2RG endógeno de modo que a expressão do componente de CISC esteja sob o controle de um ou mais elementos reguladores de IL2RG endógeno.
Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico exógeno codificando um fragmento N-terminal de um componente de CISC compreendendo uma porção de IL2Rγ é inserido no gene IL2RG endógeno de modo que i) a expressão do componente de CISC esteja sob o controle de um ou mais elementos reguladores de IL2RG endógeno, e ii) o ácido nucleico exógeno codifi- cando o fragmento N-terminal do componente de CISC é inserido na estrutura com o gene IL2RG endógeno, e a porção C-terminal restante do componente de CISC é codificada por uma porção C-terminal da se-
quência de codificação do gene IL2RG endógeno. Em algumas modali- dades, o primeiro ácido nucleico exógeno compreende ainda um pri- meiro promotor operacionalmente ligado à porção do ácido nucleico exógeno codificando o primeiro componente de CISC ou porção do mesmo, de modo que a expressão do primeiro componente de CISC nas células modificadas esteja sob o controle do primeiro promotor. Em algumas modalidades, o segundo ácido nucleico exógeno compreende ainda um segundo promotor operacionalmente ligado à porção do ácido nucleico exógeno codificando o segundo componente de CISC ou por- ção do mesmo, de modo que a expressão do segundo componente de CISC nas células modificadas esteja sob o controle do segundo promo- tor. Em algumas modalidades, um único ácido nucleico exógeno codifi- cando o primeiro componente de CISC ou porção do mesmo e o se- gundo componente de CISC ou porção do mesmo é inserido no genoma das células modificadas. Em algumas modalidades, o único ácido nu- cleico exógeno compreende ainda um único promotor operacionalmente ligado às porções do ácido nucleico exógeno codificando o primeiro e o segundo componente de CISC ou porções dos mesmos, de modo que a expressão do primeiro e do segundo componente de CISC nas células manipuladas esteja sob o controle de um único promotor. Em algumas modalidades, o primeiro, o segundo e / ou o único promotor é um poten- cializador do vírus do sarcoma mieloproliferativo, região de controle ne- gativa deletada, promotor do sítio de ligação ao iniciador dl587rev subs- tituído (MND). Em algumas modalidades, o promotor MND compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 74 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica de SEQ ID NO: 74.
[0248] Em algumas modalidades, as células manipuladas são célu- las T ou células precursoras capazes de se diferenciar em células T. Em algumas modalidades, as células manipuladas são linfócitos T CD3+,
CD8+ e / ou CD4+. Em algumas modalidades, as células manipuladas são células de linfócitos T citotóxicos CD8+, que podem incluir células T CD8+ virgens, células T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetora, ou células T CD8+ em massa.
[0249] Os linfócitos (linfócitos T) podem ser coletados de acordo com técnicas conhecidas e enriquecidos ou depletados por técnicas co- nhecidas, tal como ligação por afinidade a anticorpos, tal como citome- tria de fluxo e / ou seleção imunomagnética. Após as etapas de enrique- cimento e / ou depleção, a expansão in vitro dos linfócitos T desejados pode ser realizada de acordo com técnicas conhecidas ou variações das mesmas que serão evidentes para os versados na técnica. Em algumas modalidades, as células T são células T autólogas obtidas a partir de um paciente.
[0250] Por exemplo, a população ou subpopulação de células T de- sejada pode ser expandida adicionando-se uma população de linfócitos T inicial a um meio de cultura in vitro e, em seguida, adicionando-se ao meio de cultura células alimentadoras, tal como células mononucleares do sangue periférico sem divisão (PBMC), (por exemplo, de modo que a população de células resultante contenha pelo menos 5, 10, 20 ou 40 ou mais células alimentadoras PBMC para cada linfócito T na população inicial a ser expandida); e incubar a cultura (por exemplo, por um tempo suficiente para expandir o número de células T). As células alimentado- ras sem divisão podem compreender células alimentadoras PBMC com radiação gama. Em algumas modalidades, as PBMC são irradiadas com raios gama na faixa de 3000 a 3600 rads para evitar a divisão celular. Em algumas modalidades, as PBMC são irradiadas com raios gama de 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500 ou 3600 rads ou qualquer valor de rads entre quaisquer dois pontos extremos de qualquer um dos valores listados para evitar a divisão celular. A ordem de adição das células T e células alimentadoras ao meio de cultura pode ser invertida, se dese- jado. A cultura pode geralmente ser incubada sob condições de tempe- ratura e similares que sejam adequadas para o crescimento de linfócitos T. Para o crescimento de linfócitos T humanos, por exemplo, a tempe- ratura será geralmente de pelo menos 25° C, pelo menos 30° C ou pelo menos 37° C. Em algumas modalidades, a temperatura para o cresci- mento de linfócitos T humanos é de 22° C, 24° C, 26° C, 28° C, 30°C, 32°C, 34°C, 36°C, 37°C, ou qualquer outra temperatura entre quaisquer dois pontos extremos de qualquer um dos valores listados.
[0251] Após o isolamento de linfócitos T, tanto os linfócitos T citotó- xicos quanto os auxiliares podem ser classificados em subpopulações de células T virgens, de memória, e efetoras antes ou depois da expan- são.
[0252] As células CD8+ podem ser obtidas usando métodos conhe- cidos na técnica. Em algumas modalidades, as células CD8+ são ainda classificadas em células virgens, de memória central e de memória efe- tora, identificando antígenos de superfície celular que estão associados a cada um desses tipos de células CD8+. Em algumas modalidades, as células T de memória estão presentes em ambos os subconjuntos CD62L+ e CD62L- de linfócitos do sangue periférico CD8+. PBMCs são classificadas em frações CD62L-CD8+ e CD62L+ CD8+ após a colora- ção com anticorpos anti-CD8 e anti-CD62L. Em algumas modalidades, a expressão de marcadores fenotípicos de TCM de memória central in- cluem CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 e / ou CD127 e são nega- tivos ou baixos para granzima B. Em algumas modalidades, as células T de memória central são CD45RO+, CD62L+, e / ou células T CD8+. Em algumas modalidades, os TE efetores são negativos para CD62L, CCR7, CD28 e / ou CD127 e positivos para granzima B e / ou perforina. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD8+ virgens são caracteriza- dos pela expressão de marcadores fenotípicos de células T virgens compreendendo CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 e / ou CD45RA.
[0253] Se uma célula, tal como uma célula de mamífero, ou popula- ção de células, tal como uma população de células de mamíferos, é se- lecionada para expansão depende se a célula ou população de células sofreu dois eventos de modificação genética distintos. Se uma célula, tal como uma célula de mamífero, ou uma população de células, tal como uma população de células de mamíferos, sofreu um ou menos eventos de modificação genética, então a adição de um ligando não re- sultará em dimerização. No entanto, se a célula, tal como uma célula de mamífero, ou a população de células, tal como uma população de célu- las de mamíferos, sofreu dois eventos de modificação genética, então a adição do ligando resultará na dimerização do componente de CISC e subsequente cascata de sinalização. Assim, uma célula, tal como uma célula de mamífero, ou uma população de células, tal como uma popu- lação de células de mamíferos, pode ser selecionada com base em sua resposta ao contato com o ligando. Em algumas modalidades, o ligando pode ser adicionado em uma quantidade de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 nM ou uma concentração dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores mencionados acima.
[0254] Em algumas modalidades, uma célula, tal como uma célula de mamífero, ou uma população de células, tal como uma população de células de mamíferos, pode ser positiva para o CISC dimérico com base na expressão de um marcador como resultado de um caminho de sina- lização. Assim, uma população de células positiva para o CISC dimérico pode ser determinada por citometria de fluxo usando coloração com um anticorpo específico para o marcador de superfície e um anticorpo de controle de isotipo compatível.
[0255] Em algumas modalidades, as células manipuladas aqui des- critas compreendem ainda ácido nucleico codificando um construto anti- células T citotóxicas.
Em algumas modalidades, o construto anti-células T citotóxicas é capaz de conferir às células modificadas a citotoxicidade em direção a uma célula T citotóxica que reconhece as células modifi- cadas como estrangeiras, em que a célula T editada não é citotóxica em direção às células T citotóxicas que não reconhecem as células mani- puladas como estrangeiras.
Em algumas modalidades, o construto anti- células T citotóxicas é um receptor quimérico que compreende um do- mínio de β2-microglobulina extracelular, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmá- tico.
Em algumas modalidades, o domínio de β2-microglobulina extra- celular compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62. Em algumas modalida- des, o domínio transmembrana do receptor quimérico compreende um polipeptídeo de domínio transmembrana CD8. Em algumas modalida- des, o domínio transmembrana CD8 do receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 63 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o domínio co- estimulatório do receptor quimérico compreende um domínio coestimu- latório 4-1BB.
Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório 4- 1BB do receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático do re- ceptor quimérico compreende um domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ.
Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmá-
tico CD3-ζ do receptor quimérico compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 59 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 65 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65.
[0256] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas compreendendo ácido nucleico co- dificando um construto anti-células T citotóxicas, um ácido nucleico exó- geno codificando o construto anti-células T citotóxicas é inserido no ge- noma das células T manipuladas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene TRA endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC. Em algumas modalidades, a inserção do ácido nucleico exógeno resulta em um domínio TRAC não funcional. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inse- rido em um gene IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene IL2RG endógeno de modo que a expressão do construto anti-células T citotóxicas esteja sob o controle de um ou mais elementos reguladores de IL2RG endógeno. Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico exógeno compreende ainda um pro- motor operacionalmente ligado à porção do ácido nucleico exógeno co- dificando o construto anti-células T citotóxicas, de modo que a expres- são do construto anti-células T citotóxicas nas células manipuladas es- teja sob o controle do promotor. Em algumas modalidades, o promotor é um potencializador do vírus do sarcoma mieloproliferativo, região de controle negativa deletada, promotor do sítio de ligação ao iniciador dl587rev substituído (MND). Em algumas modalidades, o promotor MND compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 74 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 74.
[0257] Em algumas modalidades, as células manipuladas aqui des- critas compreendem ainda ácido nucleico codificando um marcador se- lecionável. Em algumas modalidades, o marcador selecionável é capaz de conferir às células modificadas a capacidade de sobreviver em uma condição seletiva, tal como na presença de uma toxina ou na ausência de um nutriente. Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um marcador de superfície que permite a seleção de células que ex- pressam o marcador selecionável. Em algumas modalidades, o marca- dor selecionável é um polipeptídeo truncado do receptor do fator de crescimento do nervo de baixa afinidade (tLNGFR). Em algumas moda- lidades, o polipeptídeo tLNGFR compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 66 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66.
[0258] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas compreendendo ácido nucleico co- dificando um marcador selecionável, um ácido nucleico exógeno codifi- cando o marcador selecionável é inserido no genoma das células mani- puladas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene TRA endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico exógeno é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC. Em algumas modalidades, a inserção do ácido nu- cleico exógeno resulta em um domínio TRAC não funcional. Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene IL2RG endógeno de modo que a expressão do marcador selecionável esteja sob o controle de um ou mais elementos reguladores de IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nu-
cleico exógeno compreende ainda um promotor operacionalmente li- gado à porção do ácido nucleico exógeno codificando o marcador sele- cionável, de modo que a expressão do marcador selecionável nas célu- las modificadas esteja sob o controle do promotor. Em algumas modali- dades, o promotor é um potencializador do vírus do sarcoma mielopro- liferativo, região de controle negativa deletada, promotor do sítio de li- gação ao iniciador dl587rev substituído (MND). Em algumas modalida- des, o promotor MND compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 74 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 74.
[0259] Em algumas modalidades, as células manipuladas aqui des- critas compreendem ainda ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina. Em al- gumas modalidades, o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina confere resistência ao tacrolimus (FK506) e / ou ciclosporina A (CsA). Em algumas modalidades, o poli- peptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineu- rina é um polipeptídeo de calcineurina (CN) mutante. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo CN mutante confere resistência ao tacrolimus (FK506) e à ciclosporina A (CsA). Em algumas modalidades, o polipep- tídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67).
[0260] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas, compreendendo ácido nucleico co- dificando um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibido- res de calcineurina, um ácido nucleico exógeno codificando o polipeptí- deo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina é inserido no genoma das células modificadas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene TRA endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC. Em algumas moda- lidades, a inserção do ácido nucleico exógeno resulta em um domínio TRAC não funcional. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exó- geno é inserido em um gene IL2RG endógeno. Em algumas modalida- des, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene IL2RG endógeno de modo que a expressão do marcador selecionável esteja sob o con- trole de um ou mais elementos reguladores de IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno compreende ainda um promotor operacionalmente ligado à porção do ácido nucleico exógeno codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibi- dores de calcineurina, de modo que a expressão do polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina nas células modificadas está sob o controle do promotor. Em algumas modalidades, o promotor é um potencializador do vírus do sarcoma mieloproliferativo, região de controle negativa deletada, promotor do sítio de ligação ao iniciador dl587rev substituído (MND). Em algumas modalidades, o pro- motor MND compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 74 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 74.
[0261] Em algumas modalidades, as células manipuladas aqui des- critas compreendem ainda ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo é um polipeptídeo de domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR). Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo que confere resistência à rapamicina compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69.
[0262] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas compreendendo ácido nucleico co- dificando um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, um ácido nucleico exógeno codificando o polipeptídeo que confere resistên- cia à rapamicina é inserido no genoma das células manipuladas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene TRA endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC. Em algumas modalidades, a inserção do ácido nucleico exógeno resulta em um domínio TRAC não funcional. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno é inserido em um gene IL2RG endógeno de modo que a expressão do marcador selecionável esteja sob o controle de um ou mais elementos reguladores de IL2RG endó- geno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno compreende ainda um promotor operacionalmente ligado à porção do ácido nucleico exógeno codificando o polipeptídeo que confere resistência à rapami- cina, de modo que a expressão do polipeptídeo que confere resistência à rapamicina nas células manipuladas está sob o controle do promotor. Em algumas modalidades, o promotor é um potencializador do vírus do sarcoma mieloproliferativo, região de controle negativa deletada, pro- motor do sítio de ligação ao iniciador dl587rev substituído (MND). Em algumas modalidades, o promotor MND compreende a sequência poli- nucleotídica de SEQ ID NO: 74 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 74.
[0263] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas, as células manipuladas compreen- dem ácido nucleico codificando os seguintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plasmáticas; ii) um primeiro componente de
CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um polipep- tídeo que confere resistência à rapamicina; iv) um marcador selecioná- vel; v) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vi) um segundo componente de CISC compreen- dendo um domínio de sinalização IL2Rγ.
Em algumas modalidades, as células manipuladas compreendem ácido nucleico que compreende um primeiro cassete de codificação e ácido nucleico que compreende um segundo cassete de codificação.
Em algumas modalidades, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáticas e o ácido nucleico codificando o pri- meiro componente de CISC.
Em algumas modalidades, o segundo cas- sete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o polipep- tídeo que confere resistência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o marcador selecionável, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina, e o ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ou um fra- gmento do mesmo.
Em algumas modalidades, as células manipuladas compreendem ácido nucleico compreendendo um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo um primeiro promotor opera- cionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro pro- motor é um promotor exógeno e as células modificadas compreendem um primeiro ácido nucleico exógeno inserido em um gene endógeno, em que o primeiro ácido nucleico exógeno compreende uma sequência poliA sintética a montante do primeiro cassete de expressão policistrô- nico.
Em algumas modalidades, o promotor exógeno é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor endógeno de um primeiro gene endó- geno e as células modificadas compreendem um primeiro ácido nucleico exógeno inserido no primeiro gene endógeno, em que o primeiro ácido nucleico exógeno compreende ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A a montante do primeiro cassete de codificação.
Em al- gumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endó- geno.
Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico exógeno é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção do primeiro ácido nucleico exó- geno resulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modali- dades, as células manipuladas compreendem ácido nucleico compre- endendo um segundo cassete de expressão policistrônico compreen- dendo um segundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cas- sete de codificação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor exógeno e as células modificadas compreendem um segundo ácido nucleico exó- geno inserido em um segundo gene endógeno, em que o segundo ácido nucleico exógeno compreende o segundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de codificação.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas mo- dalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo ácido nucleico exógeno compreende um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o segundo ácido nucleico exógeno é inserido no gene IL2RG endógeno de modo que o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC está ligado a uma sequência do gene IL2RG endógeno e o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em conjunto codifi- cam o segundo componente de CISC.
Em algumas modalidades, o pri- meiro cassete de expressão policistrônico compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Em algumas modalidades, o segundo cassete de expressão policistrônico compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 43.
[0264] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas compreendendo um cassete de ex- pressão policistrônico, o cassete de expressão policistrônico compre- ende ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A entre áci- dos nucleicos adjacentes codificando componentes do sistema. Em al- gumas modalidades, o cassete de expressão policistrônico compreende ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A entre cada um dos ácidos nucleicos adjacentes codificando componentes do sistema. Por exemplo, em algumas modalidades, o cassete de expressão poli- cistrônico compreende, na ordem de 5’ a 3’, ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A, ácido nucleico codificando um marcador selecionável, ácido nucleico codificando um peptídeo autocli- vável 2A, ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resis- tência a um ou mais inibidores de calcineurina, ácido nucleico codifi- cando um peptídeo autoclivável 2A, e ácido nucleico codificando um se- gundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, cada um dos peptídeos autocliváveis 2A é, independen- temente, um peptídeo autoclivável T2A ou um peptídeo autoclivável P2A. Em algumas modalidades, o peptídeo autoclivável T2A compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72. Em algumas modalidades, o peptídeo autoclivável P2A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73.
[0265] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas, as células manipuladas compreen- dem ácido nucleico codificando os seguintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plasmáticas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um cons- truto anti-células T citotóxicas; iv) um polipeptídeo que confere resistên- cia à rapamicina; v) um marcador selecionável; vi) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vii) um segundo componente de CISC compreendendo um domínio de sinali- zação IL2Rγ.
Em algumas modalidades, as células manipuladas com- preendem ácido nucleico que compreende um primeiro cassete de co- dificação e ácido nucleico que compreende um segundo cassete de co- dificação.
Em algumas modalidades, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plas- máticas e o ácido nucleico codificando o primeiro componente de CISC.
Em algumas modalidades, o segundo cassete de codificação compre- ende o ácido nucleico codificando o construto anti-células T citotóxicas, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o marcador selecionável, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina, e o ácido nucleico codificando o se- gundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, as células manipuladas compreendem ácido nucleico compreendendo um primeiro cassete de expressão policistrônico com- preendendo um primeiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor exógeno e as células modificadas compreendem um primeiro ácido nucleico exó- geno inserido em um gene endógeno, em que o primeiro ácido nucleico exógeno compreende uma sequência poliA sintética a montante do pri- meiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o promotor exógeno é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor endógeno de um primeiro gene endógeno, e as células modificadas compreendem um primeiro ácido nucleico exógeno inserido no primeiro gene endógeno, em que o primeiro ácido nucleico exógeno compreende ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A a montante do primeiro cassete de codificação.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico exógeno é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção do primeiro ácido nucleico exógeno resulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, as células manipuladas compreendem ácido nucleico compreendendo um segundo cassete de expressão policistrônico compreendendo um segundo promotor opera- cionalmente ligado ao segundo cassete de codificação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor exógeno e as células modificadas compreen- dem um segundo ácido nucleico exógeno inserido em um segundo gene endógeno, em que o segundo ácido nucleico exógeno compreende o segundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de co- dificação.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promo- tor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o segundo gene en- dógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo ácido nucleico exógeno compreende um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o segundo ácido nucleico exógeno é inserido no gene IL2RG endógeno de modo que o fragmento de o ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC está ligado a uma sequên- cia do gene IL2RG endógeno e o fragmento do ácido nucleico codifi- cando o segundo componente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em conjunto codificam o segundo componente de CISC. Em algumas modalidades, o primeiro cassete de expressão poli- cistrônico compreende uma sequência nucleotídica contígua de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Em algumas modalidades, o se- gundo cassete de expressão policistrônico compreende uma sequência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 44.
[0266] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas, as células manipuladas compreen- dem ácido nucleico codificando os seguintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plasmáticas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um polipep- tídeo que confere resistência à rapamicina; iv) um polipeptídeo que con- fere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e v) um se- gundo componente de CISC compreendendo um domínio de sinaliza- ção IL2Rγ. Em algumas modalidades, as células manipuladas compre- endem ácido nucleico que compreende um primeiro cassete de codifi- cação e ácido nucleico que compreende um segundo cassete de codifi- cação. Em algumas modalidades, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plas- máticas. Em algumas modalidades, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere re- sistência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina, o ácido nu- cleico codificando o primeiro componente de CISC, e o ácido nucleico codificar o segundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, as células manipuladas compreendem ácido nucleico compreendendo um primeiro cassete de expressão policistrô- nico compreendendo um primeiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor exógeno, e as células modificadas compreendem um primeiro ácido nu- cleico exógeno inserido em um gene endógeno, em que o primeiro ácido nucleico exógeno compreende uma sequência poliA sintética a mon- tante do primeiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas mo- dalidades, o promotor exógeno é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor endógeno de um primeiro gene endógeno, e as células modi- ficadas compreendem um primeiro ácido nucleico exógeno inserido no primeiro gene endógeno, em que o primeiro ácido nucleico exógeno compreende ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A a montante do primeiro cassete de codificação.
Em algumas modalida- des, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico exógeno é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas moda- lidades, a inserção do primeiro ácido nucleico exógeno resulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, as células ma- nipuladas compreendem ácido nucleico compreendendo um segundo cassete de expressão policistrônico compreendendo um segundo pro- motor operacionalmente ligado ao segundo cassete de codificação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor exógeno, e as células modificadas compreendem um segundo ácido nucleico exógeno inserido em um se- gundo gene endógeno, em que o segundo ácido nucleico exógeno com-
preende o segundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cas- sete de codificação. Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND. Em algumas modalidades, o segundo gene endó- geno é um gene IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, o se- gundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo ácido nucleico exógeno compreende um fragmento do ácido nucleico codifi- cando o segundo componente de CISC, e o segundo ácido nucleico exógeno é inserido no gene IL2RG endógeno de modo que o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC está li- gado a uma sequência do gene IL2RG endógeno e o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à sequên- cia do gene IL2RG endógeno em conjunto codificam o segundo compo- nente de CISC. Em algumas modalidades, o primeiro cassete de ex- pressão policistrônico compreende uma sequência nucleotídica contí- gua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 24. Em algumas modalida- des, o segundo cassete de expressão policistrônico compreende uma sequência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 45.
[0267] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das células manipuladas aqui descritas, as células manipuladas compreen- dem ácido nucleico codificando os seguintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plasmáticas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um cons- truto anti-células T citotóxicas; iv) um polipeptídeo que confere resistên- cia à rapamicina; v) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vi) um segundo componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rγ. Em algumas moda- lidades, as células manipuladas compreendem ácido nucleico que com- preende um primeiro cassete de codificação e ácido nucleico que com- preende um segundo cassete de codificação. Em algumas modalida-
des, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico co- dificando o construto anti-células plasmáticas e o ácido nucleico codifi- cando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina.
Em algumas modalidades, o segundo cassete de codi- ficação compreende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o primeiro componente de CISC, e o ácido nucleico codificando o segundo com- ponente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalida- des, as células manipuladas compreendem ácido nucleico compreen- dendo um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo um primeiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expres- são policistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algu- mas modalidades, o primeiro promotor é um promotor exógeno, e as células modificadas compreendem um primeiro ácido nucleico exógeno inserido em um gene endógeno, em que o primeiro ácido nucleico exó- geno compreende uma sequência poliA sintética a montante do primeiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o pro- motor exógeno é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor endógeno de um primeiro gene endógeno, e as células modificadas compreendem um primeiro ácido nucleico exógeno inserido no primeiro gene endógeno, em que o primeiro ácido nucleico exógeno compreende ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A a montante do primeiro cassete de codificação.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico exógeno é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção do primeiro ácido nucleico exógeno resulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, as células manipuladas compreendem ácido nucleico compreendendo um segundo cassete de expressão policistrônico compreendendo um segundo promotor opera- cionalmente ligado ao segundo cassete de codificação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor. Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor exógeno e as células modificadas compreen- dem um segundo ácido nucleico exógeno inserido em um segundo gene endógeno, em que o segundo ácido nucleico exógeno compreende o segundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de co- dificação. Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promo- tor MND. Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, o segundo gene en- dógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo ácido nucleico exógeno compreende um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o segundo ácido nucleico exógeno é inserido no gene IL2RG endógeno de modo que o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC está ligado a uma sequên- cia do gene IL2RG endógeno e o fragmento do ácido nucleico codifi- cando o segundo componente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em conjunto codificam o segundo componente de CISC. Em algumas modalidades, o primeiro cassete de expressão poli- cistrônico compreende uma sequência nucleotídica contígua de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27. Em algumas modalidades, o se- gundo cassete de expressão policistrônico compreende uma sequência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 46. Método de Edição do Genoma
[0268] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um método para editar o genoma de uma célula, em particular, editar o genoma celular para permitir a expressão de i) um construto anti-células plasmáticas capaz de conferir à célula citotoxicidade em direção a uma célula plas- mática, e ii) componentes polipeptídicos de um complexo de sinalização induzida por produtos químicos ativável por dimerização (CISC), em que o CISC competente em sinalização é capaz de produzir um sinal esti- mulador em uma via de sinalização que promove a sobrevida e / ou proliferação da célula.
[0269] Em um aspecto, é fornecido neste documento um método de edição do genoma de uma célula para produzir uma célula manipulada, o método compreendendo fornecer à célula a) um primeiro gRNA e / ou um segundo gRNA de acordo com qualquer uma das modalidades des- critas aqui, b) um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, e c) um ou mais modelos de doadores de acordo com qualquer uma das modalida- des aqui descritas, compreendendo ácido nucleico codificando i) um construto anti-células plasmáticas capaz de conferir citotoxicidade à cé- lula modificada em direção a uma célula plasmática; e ii) componentes polipeptídicos de um complexo de sinalização induzida por produtos quí- micos ativável por dimerização (CISC), em que o CISC competente em sinalização é capaz de produzir um sinal estimulador em uma via de sinalização que promove a sobrevida e / ou proliferação da célula modi- ficada. Em algumas modalidades, o CISC compreende um primeiro componente de CISC e um segundo componente de CISC, em que o primeiro componente de CISC e o segundo componente de CISC são configurados de modo que, quando expressos pela célula manipulada, eles dimerizam na presença de um ligando para criar o CISC compe- tente em sinalização. Em algumas modalidades, a célula manipulada é incapaz de sobreviver e / ou proliferar na ausência do ligando. Em algu- mas modalidades, a célula manipulada é defeituosa em uma via de si- nalização endógena envolvida na sobrevida e / ou proliferação da célula e o CISC competente em sinalização é capaz de complementar a via de sinalização endógena defeituosa de modo que a célula manipulada possa sobreviver e / ou proliferar.
Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC compreende um domínio de sinalização IL2Rβ.
Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação extracelular do primeiro componente de CISC compreende um domínio FRB.
Em algu- mas modalidades, o primeiro componente de CISC compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o segundo componente de CISC compreende um domínio de sinalização IL2Rγ.
Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação extracelular do segundo componente de CISC compreende um domínio FKBP.
Em algumas mo- dalidades, o segundo componente de CISC compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em algumas modalidades, os um ou mais modelos de doadores compreendem ainda ácido nucleico codificando um ou mais de iii) um construto anti-células T citotóxicas; iv) um marcador selecio- nável; v) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibido- res de calcineurina; ou vii) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina.
Em algumas modalidades, o construto anti-células plasmá- ticas é um CAR anti-BCMA.
Em algumas modalidades, o CAR anti- BCMA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 ou 61 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 ou 61. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação extracelular do primeiro componente de CISC compreende um domínio FRB.
Em algumas mo- dalidades, o primeiro componente de CISC compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 54. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que confere resistên- cia à rapamicina é um polipeptídeo de domínio FRB. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo de domínio FRB compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69. Em algumas modalidades, o marcador selecio- nável é um polipeptídeo tLNGFR. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo tLNGFR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibido- res de calcineurina é um polipeptídeo CN mutante. Em algumas moda- lidades, o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67). Em al- gumas modalidades, o segundo domínio de ligação extracelular do se- gundo componente de CISC compreende um domínio FKBP. Em algu- mas modalidades, o segundo componente de CISC compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em algumas modalidades, a célula é uma T célula, como uma célula T citotóxica. Em algumas modalidades, a célula é um precursor de células T, tal como uma célula capaz de se diferenciar em uma célula T citotóxica.
[0270] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de edição do genoma de uma célula aqui descritos, um ou mais modelos de doadores compreendem ácido nucleico codificando os se- guintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plasmáti- cas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um polipeptídeo que confere resistência à ra- pamicina; iv) um marcador selecionável; v) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vi) um segundo componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, um ou mais mode- los de doadores compreendem um primeiro modelo de doador e um se- gundo modelo de doador.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endó- geno e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro mo- delo de doador compreende um primeiro cassete de codificação e o se- gundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codifica- ção.
Em algumas modalidades, o primeiro cassete de codificação com- preende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáti- cas e o ácido nucleico codificando o primeiro componente de CISC.
Em algumas modalidades, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o marcador selecionável, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina, e o ácido nucleico codificando o se- gundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro cassete de expressão policis- trônico compreendendo um primeiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do pri- meiro cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do pri- meiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas mo- dalidades, o primeiro modelo de doador compreende ácido nucleico co- dificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrô- nico compreendendo ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivá- vel 2A a montante do primeiro cassete de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inserido no pri- meiro gene endógeno, a porção do primeiro cassete de expressão poli- cistrônico ligada a uma sequência do primeiro gene endógeno e a por- ção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do primeiro gene endógeno em conjunto compreendem o primeiro cas- sete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é inserido na região do gene TRA endó- geno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inser- ção do primeiro modelo de doador resulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador com- preende um segundo cassete de expressão policistrônico ou porção do mesmo compreendendo um segundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de codificação, de modo que a expressão do se- gundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do se- gundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo modelo de doador compreende uma porção do segundo cassete de expressão policistrô- nico compreendendo ácido nucleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o se- gundo modelo de doador é configurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado a uma sequência do gene IL2RG endógeno e o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo com- ponente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em con- junto codificam o segundo componente de CISC, e a porção do segundo cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do gene IL2RG endógeno, juntos, compreendem o segundo cassete de expressão poli- cistrônico.
Configurações exemplificativas para o primeiro modelo de doador são mostradas na Figura 1, construtos de modelo de doador # 4 a # 7. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compre- ende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende a sequência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é flanqueado por braços de homologia corresponden- tes a sequências no gene TRA.
Braços de homologia exemplificativos para o primeiro modelo de doador incluem braços de homologia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83 ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exemplificativas para o segundo modelo de doador são mostradas na Figura 1, construto de modelo de doador # 8. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 43. Por exemplo, em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 105. Em algumas modalidades, o segundo modelo de do- ador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequên- cias no gene IL2RG.
Braços de homologia exemplificativos para o se- gundo modelo de doador incluem braços de homologia com as sequên- cias polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV.
Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 43 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 43. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV com- preende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 105 ou uma vari- ante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 105.
[0271] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de edição do genoma de uma célula aqui descritos, um ou mais modelos de doadores compreendem ácido nucleico codificando os se- guintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plasmáti- cas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um construto anti-células T citotóxicas; iv) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina; v) um marcador se- lecionável; vi) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vii) um segundo componente de CISC com- preendendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compre- endem um primeiro modelo de doador e um segundo modelo de doador. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endógeno, e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endó- geno. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compre- ende um primeiro cassete de codificação e o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codificação. Em algumas modali- dades, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáticas e o ácido nucleico co- dificando o primeiro componente de CISC.
Em algumas modalidades, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codifi- cando o construto anti-células T citotóxicas, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o marcador selecionável, o ácido nucleico codificando o po- lipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineu- rina, e o ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo um pri- meiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codifi- cação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expressão po- licistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas mo- dalidades, o primeiro promotor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doa- dor compreende ácido nucleico codificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nucleico co- dificando um peptídeo autoclivável 2A a montante do primeiro cassete de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inserido no primeiro gene endógeno, a porção do pri- meiro cassete de expressão policistrônico ligada a uma sequência do primeiro gene endógeno e a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do primeiro gene endógeno em con- junto compreendem o primeiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA en- dógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é in- serido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção do primeiro modelo de doador re- sulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de ex- pressão policistrônico ou porção do mesmo compreendendo um se- gundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de codi- ficação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo modelo de doador compreende uma porção do segundo cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nu- cleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC e o segundo modelo de doador é confi- gurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fra- gmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado a uma sequência do gene IL2RG endógeno e o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à se- quência do gene IL2RG endógeno em conjunto codificam o segundo componente de CISC e a porção do segundo cassete de expressão po- licistrônico ligada à sequência do gene IL2RG endógeno, juntos, com- preendem o segundo cassete de expressão policistrônico.
Configura- ções exemplificativas para o primeiro modelo de doador são mostradas na Figura 1, construções de modelo de doador # 4 a # 7. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador com- preende a sequência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene TRA.
Braços de homologia exemplificativos para o primeiro mo-
delo de doador incluem braços de homologia com as sequências poli- nucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exemplificativas para o segundo modelo de doador são mostrados na Figura 1, construto de modelo de doador #
9. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 44. Por exemplo, em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 106. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene IL2RG. Braços de homologia exemplificativos para o segundo modelo de doador incluem braços de homologia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas moda- lidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV. Em algumas mo- dalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotí- dica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 44 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucle- otídica da SEQ ID NO: 106 ou uma variante da mesma tendo pelo me- nos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO:
106.
[0272] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de edição do genoma de uma célula aqui descritos, um ou mais modelos de doadores compreendem ácido nucleico codificando os se- guintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plasmáti- cas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um polipeptídeo que confere resistência à ra- pamicina; iv) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais ini- bidores de calcineurina; e v) um segundo componente de CISC compre- endendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compreendem um primeiro modelo de doador e um segundo modelo de doador.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endógeno e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende um primeiro cassete de codificação e o segundo modelo de doador com- preende um segundo cassete de codificação.
Em algumas modalida- des, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico co- dificando o construto anti-células plasmáticas.
Em algumas modalida- des, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina, o ácido nucleico codificando o primeiro componente de CISC, e o ácido nucleico codificar o segundo compo- nente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro promotor operacionalmente ligado ao pri- meiro cassete de codificação, de modo que a expressão do ácido nu- cleico codificando o construto anti-células plasmáticas esteja sob o con-
trole do primeiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro promo- tor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algu- mas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende ácido nu- cleico codificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A a montante da primeira sequência de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inserido no primeiro gene endógeno, a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada a uma sequência do primeiro gene en- dógeno e a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico li- gada à sequência do primeiro gene endógeno em conjunto compreen- dem o primeiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas moda- lidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endógeno.
Em algu- mas modalidades, o primeiro modelo de doador é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas moda- lidades, a inserção do primeiro modelo de doador resulta em um domí- nio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de expressão policistrô- nico ou porção do mesmo compreendendo um segundo promotor ope- racionalmente ligado ao segundo cassete de codificação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo mo- delo de doador compreende uma porção do segundo cassete de ex- pressão policistrônico compreendendo ácido nucleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC e o segundo modelo de doador é configurado de modo que,
quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nu- cleico codificando o segundo componente de CISC ligado a uma se- quência do gene IL2RG endógeno e o fragmento do ácido nucleico co- dificando o segundo componente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em conjunto codificam o segundo componente de CISC e a porção do segundo cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do gene IL2RG endógeno, juntos, compreendem o se- gundo cassete de expressão policistrônico.
Configurações exemplifica- tivas para o primeiro modelo de doador são mostradas na Figura 1, construções de modelo de doador # 1 e # 2. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 24. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende a se- quência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 99. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene TRA.
Bra- ços de homologia exemplificativos para o primeiro modelo de doador incluem braços de homologia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exemplificativas para o segundo modelo de doador são mostrados na Figura 1, construto de modelo de doador # 10. Em algu- mas modalidades, o segundo modelo de doador compreende uma se- quência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 45. Por exemplo, em al- gumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende a se- quência nucleotídica de SEQ ID NO: 107. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador é flanqueado por braços de homologia cor- respondentes a sequências no gene IL2RG.
Braços de homologia exemplificativos para o segundo modelo de doador incluem braços de homologia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e
87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas moda- lidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV. Em algumas mo- dalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotí- dica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 24 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 24. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 98 a 99 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 99. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia à se- quência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 107 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de ho- mologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 107.
[0273] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de edição do genoma de uma célula aqui descritos, um ou mais modelos de doadores compreendem ácido nucleico codificando os se- guintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plasmáti- cas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um construto anti-células T citotóxicas; iv) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina; v) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vi) um segundo componente de CISC compreendendo um domínio de si- nalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compreendem um primeiro modelo de doador e um segundo modelo de doador. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endógeno e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endógeno.
Em algumas moda- lidades, o primeiro modelo de doador compreende um primeiro cassete de codificação e o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codificação.
Em algumas modalidades, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáticas e o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina.
Em al- gumas modalidades, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência à ra- pamicina, o ácido nucleico codificando o primeiro componente de CISC, e o ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo um pri- meiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codifi- cação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expressão po- licistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas mo- dalidades, o primeiro promotor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doa- dor compreende ácido nucleico codificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nucleico co- dificando um peptídeo autoclivável 2A a montante do primeiro cassete de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inserido no primeiro gene endógeno, a porção do pri- meiro cassete de expressão policistrônico ligada a uma sequência do primeiro gene endógeno e a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do primeiro gene endógeno em con- junto compreendem o primeiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA en- dógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é in- serido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção do primeiro modelo de doador re- sulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de ex- pressão policistrônico ou porção do mesmo compreendendo um se- gundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de codi- ficação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo modelo de doador compreende uma porção do segundo cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nu- cleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o segundo modelo de doador é confi- gurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fra- gmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado a uma sequência do gene IL2RG endógeno e o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à se- quência do gene IL2RG endógeno em conjunto codificam o segundo componente de CISC e a porção do segundo cassete de expressão po- licistrônico ligada à sequência do gene IL2RG endógeno, juntos, com- preendem o segundo cassete de expressão policistrônico.
Configura- ções exemplificativas para o primeiro modelo de doador são mostradas na Figura 1, construto de modelo de doador # 3. Em algumas modalida- des, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência nucleo- tídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 100. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é flanqueado por braços de homologia cor- respondentes a sequências no gene TRA.
Braços de homologia exem- plificativos para o primeiro modelo de doador incluem braços de homo- logia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exem- plificativas para o segundo modelo de doador são mostrados na Figura 1, construto de modelo de doador # 11. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 46. Por exemplo, em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 108. Em algumas modalidades, o segundo modelo de do- ador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequên- cias no gene IL2RG.
Braços de homologia exemplificativos para o se- gundo modelo de doador incluem braços de homologia com as sequên- cias polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV.
Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 100 e varian- tes da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 100. Em algumas modalidades, o se- gundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46. Em algumas mo-
dalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 108 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO:
108.
[0274] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de edição do genoma de uma célula aqui descritos, o método compreende fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um primeiro vetor, e um segundo vetor, em que (A) o primeiro gRNA compreende a se- quência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor compreende a sequência polinucleo- tídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; (B) o pri- meiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor compre- ende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de ho- mologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38, o segundo gRNA compreende a sequência poli- nucleotídica de qualquer um das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante deste tendo pelo menos 85% de homolo- gia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica de SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39, o segundo gRNA com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotí- dica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44.
[0275] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de edição do genoma de uma célula aqui descritos, o método compreende fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um primeiro vetor, e um segundo vetor, em que (A) o primeiro gRNA compreende a se- quência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica de SEQ ID NO: 19 ou 22 ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 19 ou 22, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 45; (B) o primeiro gRNA com- preende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV compreende a se- quência polinucleotídica da SEQ ID NO: 20 ou 23 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica de SEQ ID NO: 20 ou 23, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45; ou (C) o pri- meiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO : 21 ou 24 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo em pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID
NO: 45.
[0276] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de edição do genoma de uma célula aqui descritos, o método compreende fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um primeiro vetor, e um segundo vetor, em que (A) o primeiro gRNA compreende a se- quência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 25 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compre- ende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de SEQ ID NO: 46; (B) o primeiro gRNA compreende a se- quência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 26 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compre- ende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 46 ; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO : 27 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 27, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia à sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 46.
[0277] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de edição do genoma de uma célula aqui descritos, o RGEN é selecionado a partir do grupo que consiste em uma endonuclease Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também co- nhecido como Csn1 e Csx12), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 e Cpf1, ou um derivado funcional das mesmas. Em algumas modalidades, o RGEN é Cas9. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificando o RGEN é uma sequência de ácido ribonucleico (RNA). Em algumas modalida- des, a sequência de RNA codificando o RGEN está ligada ao primeiro gRNA ou ao segundo gRNA por meio de uma ligação covalente. Em algumas modalidades, o RGEN é pré-complexado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA, formando um complexo RNP, antes do forneci- mento à célula. Em algumas modalidades, o RGEN é pré-complexado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA a uma relação molar de gRNA para RGEN entre 1:1 e 20:1, respectivamente.
[0278] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de edição do genoma de uma célula aqui descrita, a célula é uma célula T. Em algumas modalidades, a célula T é um linfócito T ci- totóxico CD8+ ou uma célula T pan CD3+. Em algumas modalidades, a célula T é um membro de um grupo de células T derivadas de múltiplos doadores. Em algumas modalidades, os múltiplos doadores são doado- res humanos. Em algumas modalidades, a célula é citotóxica para as células plasmáticas. Método de Tratamento
[0279] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um método de tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo em necessi- dade de tratamento, em que a doença ou condição é caracterizada pela produção adversa de anticorpos, o método compreendendo: 1) editar o genoma de células T de acordo com a qualquer um dos métodos aqui descritos, produzindo assim células T manipuladas, e administrar as cé- lulas T manipuladas ao indivíduo; ou 2) editar o genoma de células T no indivíduo de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos, pro- duzindo assim células T manipuladas no indivíduo. Em algumas moda- lidades, as células T de a) são autólogas ao indivíduo. Em algumas mo- dalidades, as células T de a) são alogênicas ao indivíduo. Em algumas modalidades, as células T de a) compreendem um grupo de células T derivadas de múltiplos doadores. Em algumas modalidades, os múlti- plos doadores são doadores humanos. Em algumas modalidades, as células T compreendem células T citotóxicas CD8+ ou células T pan CD3+. Em algumas modalidades, o indivíduo é humano. Em algumas modalidades, a doença ou condição é doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD), doença autoimune mediada por anticorpos, neoplasia de célu- las plasmáticas ou amiloidose de cadeia leve. Em algumas modalida- des, a neoplasia de células plasmáticas é mieloma de células plasmáti-
cas (por exemplo, mieloma múltiplo). Em algumas modalidades, a do- ença ou condição é GvHD e o indivíduo recebeu previamente um trans- plante de órgão.
[0280] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descritos, edi- tar o genoma de células T para produzir células T manipuladas compre- ende fornecer às células T a) um primeiro gRNA e / ou um segundo gRNA de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, b) um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, e c) um ou mais modelos de doadores de acordo com qualquer uma das modalidades aqui des- critas, compreendendo ácido nucleico codificando i ) um construto anti- células plasmáticas capaz de conferir às células modificadas citotoxici- dade em direção a uma célula plasmática; e ii) componentes polipeptí- dicos de um complexo de sinalização induzida por produtos químicos ativável por dimerização (CISC), em que o CISC competente em sinali- zação é capaz de produzir um sinal estimulador em uma via de sinaliza- ção que promove a sobrevida e / ou proliferação das células modifica- das. Em algumas modalidades, o CISC compreende um primeiro com- ponente de CISC e um segundo componente de CISC, em que o pri- meiro componente de CISC e o segundo componente de CISC são con- figurados de modo que, quando expressos pelas células manipuladas, eles dimerizam na presença de um ligando para criar o CISC compe- tente em sinalização. Em algumas modalidades, as células modificadas são incapazes de sobreviver e / ou proliferar na ausência do ligando. Em algumas modalidades, as células manipuladas são defeituosas em uma via de sinalização endógena envolvida na sobrevida e / ou prolife- ração das células, e o CISC competente em sinalização é capaz de complementar a via de sinalização endógena defeituosa de modo que as células manipuladas possam sobreviver e / ou proliferar. Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC compreende um domínio de sinalização IL2Rβ.
Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação extracelular do primeiro componente de CISC compreende um domínio FRB.
Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54. Em algumas modalida- des, o segundo componente de CISC compreende um domínio de sina- lização IL2Rγ.
Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação extracelular do segundo componente de CISC compreende um domínio FKBP.
Em algumas modalidades, o segundo componente de CISC com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 ou uma vari- ante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em algumas modalidades, o cons- truto anti-células plasmáticas é um CAR anti-BCMA.
Em algumas mo- dalidades, o CAR anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 ou 61 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 ou 61. Em algumas modalidades, os um ou mais modelos de doadores compreendem ainda ácido nucleico codificando um ou mais de iii) um construto anti-células T citotóxicas; iv) um marcador selecionável; v) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calci- neurina; ou vi) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo que confere resistência à ra- pamicina é um polipeptídeo de domínio FRB.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio FRB compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69. Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um polipeptídeo tLNGFR.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo tLNGFR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66. Em algumas modalida- des, o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina é um polipeptídeo CN mutante. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67).
[0281] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descritos, um ou mais modelos de doadores compreendem ácido nucleico codificando os seguintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plas- máticas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um do- mínio de sinalização IL2Rβ; iii) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina; iv) um marcador selecionável; v) um polipeptídeo que con- fere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vi) um se- gundo componente de CISC compreendendo um domínio de sinaliza- ção IL2Rγ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compreendem um primeiro modelo de doa- dor e um segundo modelo de doador. Em algumas modalidades, o pri- meiro modelo de doador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endógeno, e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endógeno. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende um primeiro cassete de codifi- cação e o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codificação. Em algumas modalidades, o primeiro cassete de codifi- cação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáticas e o ácido nucleico codificando o primeiro componente de CISC. Em algumas modalidades, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere re- sistência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o marcador seleci-
onável, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resis- tência a um ou mais inibidores de calcineurina, e o ácido nucleico codi- ficando o segundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo um primeiro promotor opera- cionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro pro- motor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende ácido nucleico codificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A a montante do primeiro cassete de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inse- rido no primeiro gene endógeno, a porção do primeiro cassete de ex- pressão policistrônico ligada a uma sequência do primeiro gene endó- geno e a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do primeiro gene endógeno em conjunto compreendem o primeiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endógeno.
Em algumas mo- dalidades, o primeiro modelo de doador é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção do primeiro modelo de doador resulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de expressão policistrônico ou porção do mesmo compreendendo um segundo promotor operacionalmente li- gado ao segundo cassete de codificação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND. Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno. Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo modelo de doador compreende uma porção do segundo cassete de expressão policistrô- nico compreendendo ácido nucleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC e o segundo modelo de doador é configurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado a uma sequência do gene IL2RG endó- geno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em conjunto co- dificam o segundo componente de CISC e a porção do segundo cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do gene IL2RG endó- geno, juntos, compreendem o segundo cassete de expressão policistrô- nico. Configurações exemplificativas para o primeiro modelo de doador são mostradas na Figura 1, construções de modelo de doador # 4 a #
7. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro mo- delo de doador compreende a sequência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o primeiro mo- delo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene TRA. Braços de homologia exemplificativos para o primeiro modelo de doador incluem braços de homologia com as se- quências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exemplificativas para o se- gundo modelo de doador são mostrados na Figura 1, construto de mo- delo de doador # 8. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 43. Por exemplo, em algumas modalidades,
o segundo modelo de doador compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 105. Em algumas modalidades, o segundo modelo de do- ador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequên- cias no gene IL2RG. Braços de homologia exemplificativos para o se- gundo modelo de doador incluem braços de homologia com as sequên- cias polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 43 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 43. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV com- preende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 105 ou uma vari- ante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 105.
[0282] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descrita, um ou mais modelos de doadores compreendem ácido nucleico codificando os seguintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plas- máticas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um do- mínio de sinalização IL2Rβ; iii) um construto anti-células T citotóxicas;
iv) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina; v) um marca- dor selecionável; vi) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vii) um segundo componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compreendem um primeiro modelo de doador e um segundo modelo de doador.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é con- figurado para ser inserido em um primeiro gene endógeno, e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende um primeiro cassete de codificação e o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codificação.
Em algu- mas modalidades, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáticas e o ácido nucleico codificando o primeiro componente de CISC.
Em algumas mo- dalidades, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nu- cleico codificando o construto anti-células T citotóxicas, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o marcador selecionável, o ácido nucleico codifi- cando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina, e o ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, o pri- meiro modelo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro cassete de expressão policistrônico compre- endendo um primeiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro promotor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o pri- meiro modelo de doador compreende ácido nucleico codificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreen- dendo ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A a mon- tante do primeiro cassete de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inserido no primeiro gene endógeno, a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico li- gada a uma sequência do primeiro gene endógeno e a porção do pri- meiro cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do pri- meiro gene endógeno em conjunto compreendem o primeiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o primeiro gene en- dógeno é um gene TRA endógeno.
Em algumas modalidades, o pri- meiro modelo de doador é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção do primeiro modelo de doador resulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de expressão policistrônico ou porção do mesmo compreendendo um segundo promotor operacionalmente ligado ao se- gundo cassete de codificação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promo- tor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o segundo gene en- dógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo modelo de doador com- preende uma porção do segundo cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nucleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o segundo mo- delo de doador é configurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado a uma sequência do gene IL2RG endó- geno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em conjunto co- dificam o segundo componente de CISC e a porção do segundo cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do gene IL2RG endó- geno, juntos, compreendem o segundo cassete de expressão policistrô- nico. Configurações exemplificativas para o primeiro modelo de doador são mostradas na Figura 1, construções de modelo de doador # 4 a #
7. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro mo- delo de doador compreende a sequência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o primeiro mo- delo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene TRA. Braços de homologia exemplificativos para o primeiro modelo de doador incluem braços de homologia com as se- quências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exemplificativas para o se- gundo modelo de doador são mostrados na Figura 1, construto de mo- delo de doador # 9. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 44. Por exemplo, em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 106. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene IL2RG. Braços de homologia exemplificativos para o segundo modelo de doa- dor incluem braços de homologia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e
91. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é um pri- meiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28 a 39. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104 e va- riantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 104. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica de SEQ ID NO: 44 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV com- preende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 106 ou uma vari- ante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 106.
[0283] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descritos, um ou mais modelos de doadores compreendem ácido nucleico codificando os seguintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plas- máticas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um do- mínio de sinalização IL2Rβ; iii) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina; iv) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e v) um segundo componente de CISC com- preendendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compre- endem um primeiro modelo de doador e um segundo modelo de doador. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endógeno, e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endó- geno. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compre- ende um primeiro cassete de codificação e o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codificação.
Em algumas modali- dades, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáticas.
Em algumas modalida- des, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência à rapamicina, o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina, o ácido nucleico codificando o primeiro componente de CISC, e o ácido nucleico codificando o segundo com- ponente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalida- des, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codificação, de modo que a expressão do ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáticas esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas modalidades, o primeiro pro- motor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende ácido nucleico codificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nucleico codificando um peptídeo autoclivável 2A a montante da primeira sequência de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inserido no primeiro gene endógeno, a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada a uma sequência do primeiro gene en- dógeno e a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico li- gada à sequência do primeiro gene endógeno em conjunto compreen- dem o primeiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas moda- lidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA endógeno.
Em algu- mas modalidades, o primeiro modelo de doador é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas moda- lidades, a inserção do primeiro modelo de doador resulta em um domí- nio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de expressão policistrô- nico ou porção do mesmo compreendendo um segundo promotor ope- racionalmente ligado ao segundo cassete de codificação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo mo- delo de doador compreende uma porção do segundo cassete de ex- pressão policistrônico compreendendo ácido nucleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o segundo modelo de doador é configurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nu- cleico codificando o segundo componente de CISC é ligado a uma se- quência do gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codi- ficando o segundo componente de CISC ligado à sequência do gene IL2RG endógeno em conjunto codificam o segundo componente de CISC e a porção do segundo cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do gene IL2RG endógeno, juntos, compreendem o se- gundo cassete de expressão policistrônico.
Configurações exemplifica- tivas para o primeiro modelo de doador são mostradas na Figura 1, construções de modelo de doador # 1 e # 2. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 24. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende a se- quência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 99. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequências no gene TRA.
Bra- ços de homologia exemplificativos para o primeiro modelo de doador incluem braços de homologia com as sequências polinucleotídicas de
SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exemplificativas para o segundo modelo de doador são mostrados na Figura 1, construto de modelo de doador # 10. Em algu- mas modalidades, o segundo modelo de doador compreende uma se- quência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 45. Por exemplo, em al- gumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende a se- quência nucleotídica de SEQ ID NO: 107. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador é flanqueado por braços de homologia cor- respondentes a sequências no gene IL2RG. Braços de homologia exemplificativos para o segundo modelo de doador incluem braços de homologia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas moda- lidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV. Em algumas mo- dalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotí- dica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 24 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 24. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 98 a 99 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 99. Em algumas modalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 45. Em algumas modalida- des, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 107 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 107.
[0284] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descritos, um ou mais modelos de doadores compreendem ácido nucleico codificando os seguintes componentes do sistema: i) um construto anti-células plas- máticas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um do- mínio de sinalização IL2Rβ; iii) um construto anti-células T citotóxicas; iv) um polipeptídeo que confere resistência à rapamicina; v) um polipep- tídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vi) um segundo componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rγ ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, um ou mais modelos de doadores compreendem um primeiro modelo de doador e um segundo modelo de doador.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é configurado para ser inserido em um primeiro gene endógeno, e o segundo modelo de doador é configurado para ser inserido em um segundo gene endógeno.
Em algumas moda- lidades, o primeiro modelo de doador compreende um primeiro cassete de codificação e o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de codificação.
Em algumas modalidades, o primeiro cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o construto anti-células plasmáticas e o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina.
Em al- gumas modalidades, o segundo cassete de codificação compreende o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência à ra- pamicina, o ácido nucleico codificando o primeiro componente de CISC, e o ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ou um fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência poliA sintética a montante de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo um pri- meiro promotor operacionalmente ligado ao primeiro cassete de codifi- cação, de modo que a expressão do primeiro cassete de expressão po- licistrônico esteja sob o controle do primeiro promotor.
Em algumas mo- dalidades, o primeiro promotor é um promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV). Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doa- dor compreende ácido nucleico codificando uma porção de um primeiro cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nucleico co- dificando um peptídeo autoclivável 2A a montante do primeiro cassete de codificação, em que o primeiro modelo de doador é configurado de modo que quando inserido no primeiro gene endógeno, a porção do pri- meiro cassete de expressão policistrônico ligada a uma sequência do primeiro gene endógeno e a porção do primeiro cassete de expressão policistrônico ligada à sequência do primeiro gene endógeno em con- junto compreendem o primeiro cassete de expressão policistrônico.
Em algumas modalidades, o primeiro gene endógeno é um gene TRA en- dógeno.
Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é in- serido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC.
Em algumas modalidades, a inserção do primeiro modelo de doador re- sulta em um domínio TRAC não funcional.
Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende um segundo cassete de ex- pressão policistrônico ou porção do mesmo compreendendo um se- gundo promotor operacionalmente ligado ao segundo cassete de codi- ficação, de modo que a expressão do segundo cassete de expressão policistrônico esteja sob o controle do segundo promotor.
Em algumas modalidades, o segundo promotor é um promotor MND.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno.
Em algumas modalidades, o segundo gene endógeno é um gene IL2RG endógeno, o segundo modelo de doador compreende uma porção do segundo cassete de expressão policistrônico compreendendo ácido nu- cleico compreendendo um fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC, e o segundo modelo de doador é confi- gurado de modo que, quando inserido no gene IL2RG endógeno, o fra- gmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado a uma sequência do gene IL2RG endógeno, o fragmento do ácido nucleico codificando o segundo componente de CISC ligado à sequên- cia do gene IL2RG endógeno em conjunto codificam o segundo compo- nente de CISC e a porção do segundo cassete de expressão policistrô- nico ligada à sequência do gene IL2RG endógeno, juntos, compreen- dem o segundo cassete de expressão policistrônico.
Configurações exemplificativas para o primeiro modelo de doador são mostradas na Figura 1, construto de modelo de doador # 3. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador compreende a se- quência nucleotídica da SEQ ID NO: 100. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é flanqueado por braços de homologia cor- respondentes a sequências no gene TRA.
Braços de homologia exem- plificativos para o primeiro modelo de doador incluem braços de homo- logia com as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 80 e 81, SEQ ID NOs: 82 e 83, ou SEQ ID NOs: 84 e 85. Configurações exem- plificativas para o segundo modelo de doador são mostrados na Figura 1, construto de modelo de doador # 11. Em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende uma sequência nucleotídica contígua de SEQ ID NO: 46. Por exemplo, em algumas modalidades, o segundo modelo de doador compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 108. Em algumas modalidades, o segundo modelo de do- ador é flanqueado por braços de homologia correspondentes a sequên- cias no gene IL2RG.
Braços de homologia exemplificativos para o se- gundo modelo de doador incluem braços de homologia com as sequên- cias polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 86 e 87, SEQ ID NOs: 88 e 89, ou SEQ ID NOs: 90 e 91. Em algumas modalidades, o primeiro modelo de doador é um primeiro vetor AAV e / ou o segundo modelo de doador é um segundo vetor AAV.
Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das
SEQ ID NOs: 25 a 27 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 100 e varian- tes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 100. Em algumas modalidades, o se- gundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46. Em algumas mo- dalidades, o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 108 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO:
108.
[0285] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descritos, o método compreende fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um pri- meiro vetor, e um segundo vetor, em que (A) o primeiro gRNA compre- ende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor compreende o polinucleo- tídeo sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o pri- meiro vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs : 29, 32, 35 e 38, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor compreende a sequência polinucleo- tídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44.
[0286] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descritos, o método compreende fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um pri- meiro vetor, e um segundo vetor, em que (A) o primeiro gRNA compre- ende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a se- quência polinucleotídica de SEQ ID NO: 19 ou 22 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica de SEQ ID NO: 19 ou 22, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a se- quência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 45; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV com- preende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 20 ou 23 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia polinucleotídica de SEQ ID NO: 20 ou 23, o segundo gRNA compre- ende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor
AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo em pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 45.
[0287] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descritos, o método compreende fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um pri- meiro vetor, e um segundo vetor, em que (A) o primeiro gRNA compre- ende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a se- quência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25, o segundo gRNA compreende a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 46; (B) o primeiro gRNA com- preende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli-
nucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV compreende a se- quência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26, o segundo gRNA compreende a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3 ou uma va- riante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 27 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinu- cleotídica da SEQ ID NO: 27, o segundo gRNA compreende a sequên- cia polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e varian- tes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia à sequência po- linucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46
[0288] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descritos, o RGEN é selecionado a partir do grupo que consiste em uma endonu- clease Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecido como Csn1 e Csx12), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 e Cpf1, ou um derivado funcional das mesmas. Em algumas modalida- des, o RGEN é Cas9. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codi- ficando o RGEN é uma sequência de ácido ribonucleico (RNA). Em al- gumas modalidades, a sequência de RNA codificando o RGEN está li- gada ao primeiro gRNA ou ao segundo gRNA por meio de uma ligação covalente. Em algumas modalidades, o RGEN é pré-complexado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA, formando um complexo RNP, antes do fornecimento para a célula. Em algumas modalidades, o RGEN é pré-complexado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA a uma relação molar de gRNA para RGEN entre 1:1 e 20:1, respectivamente.
[0289] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer um dos métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descritos, a célula é uma célula T. Em algumas modalidades, a célula T é um linfó- cito T citotóxico CD8+ ou uma célula T pan CD3+. Em algumas modali- dades, a célula T é um membro de um grupo de células T derivadas de múltiplos doadores. Em algumas modalidades, os múltiplos doadores são doadores humanos. Em algumas modalidades, a célula é citotóxica para as células plasmáticas.
[0290] Em algumas modalidades, os métodos de tratamento de uma doença ou condição aqui descritos compreendem ainda administrar a rapamicina ou um rapalog ao indivíduo. Em algumas modalidades, o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapamicina, C16- iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903 ou AP23573, ou metabólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a rapamicina ou o rapalog é admi- nistrado em uma concentração de 0,05 nM a 100 nM.
[0291] Em outro aspecto, é fornecida aqui uma célula T manipulada de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas para uso no tratamento de doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma do- ença autoimune, ou uma doença ou condição caracterizada pela produ- ção de anticorpos adversos. Em algumas modalidades, a doença autoi- mune é uma doença autoimune mediada por anticorpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve.
[0292] Em outro aspecto, é fornecida aqui uma célula T manipulada de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de doença de en- xerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma doença autoimune, ou uma doença ou condição caracterizada pela produção adversa de anticorpos. Em al- gumas modalidades, a doença autoimune é uma doença autoimune me- diada por anticorpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve.
[0293] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um sistema de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas para uso no tratamento de doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma do- ença autoimune, ou uma doença ou condição caracterizada pela produ- ção de anticorpos adversos. Em algumas modalidades, a doença autoi- mune é uma doença autoimune mediada por anticorpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve.
[0294] Em outro aspecto, é fornecido aqui um sistema de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas para uso na fabrica- ção de um medicamento para o tratamento de doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma doença autoimune, ou uma doença ou con- dição caracterizada pela produção adversa de anticorpos. Em algumas modalidades, a doença autoimune é uma doença autoimune mediada por anticorpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é ami- loidose de cadeia leve.
[0295] Em outro aspecto, são fornecidos neste documento um ou mais gRNAs, um ou mais modelos de doadores, um kit, uma seringa e
/ ou um cateter de acordo com qualquer uma das modalidades aqui des- critas para uso no tratamento de doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma doença autoimune, ou uma doença ou condição carac- terizada pela produção adversa de anticorpos. Em algumas modalida- des, a doença autoimune é uma doença autoimune mediada por anti- corpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve.
[0296] Em outro aspecto, são fornecidos aqui um ou mais gRNAs, um ou mais modelos de doadores, um kit, uma seringa e / ou um cateter de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de doença do en- xerto vs hospedeiro (GvHD) ou uma doença autoimune, ou uma doença ou condição caracterizada pela produção adversa de anticorpos. Em al- gumas modalidades, a doença autoimune é uma doença autoimune me- diada por anticorpos. Em algumas modalidades, a doença ou condição é amiloidose de cadeia leve. Composições
[0297] São fornecidas aqui composições que compreendem uma célula geneticamente modificada, tal como uma célula de mamífero, pre- parada conforme estabelecido nesta descrição. Em algumas modalida- des, as células, tal como células de mamíferos, incluem as sequências de proteínas conforme descrito nas modalidades aqui. Em algumas mo- dalidades, as composições incluem células T que têm um CISC com- preendendo um domínio de ligação extracelular, um domínio de dobra- diça, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização. Em al- gumas modalidades, o CISC é um IL2R-CISC. Em outras modalidades, a composição compreende ainda uma preparação de célula, tal como uma célula de mamífero, compreendendo células T CD8+ que têm um CISC compreendendo um domínio de ligação extracelular, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de sinaliza- ção. Em algumas modalidades, os componentes de CISC dimerizam na presença de um ligando (por exemplo, rapamicina ou um rapalog), o que pode ocorrer simultaneamente ou sequencialmente. Em algumas mo- dalidades, cada uma dessas populações pode ser combinada umas com as outras ou com outros tipos de células para fornecer uma com- posição.
[0298] Em algumas modalidades, as células da composição são cé- lulas CD8+. A célula CD8+ pode ser uma célula de linfócito T citotóxico, uma célula T CD8+ virgem, célula T CD8+ de memória central, célula T CD8+ de memória efetora e / ou célula T CD8+ em massa. Em algumas modalidades, a célula T citotóxica CD8+ é uma célula T de memória central, em que a célula T de memória central compreende uma célula T CD45RO+, CD62L + e / ou CD8+. Em ainda outras modalidades, a célula de linfócito T citotóxica CD8+ é uma célula T de memória central.
[0299] Em algumas modalidades, as composições compreendem precursores de células T. Em algumas modalidades, as composições compreendem células tronco hematopoiéticas. Em algumas modalida- des, a composição compreende uma célula hospedeira, em que a célula hospedeira é uma célula de linfócito T citotóxico CD8+ selecionada a partir do grupo que consiste em células T CD8+ virgens, células T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetora e células T CD8+ em massa, e uma segunda célula hospedeira, em que a segunda célula hospedeira é uma célula T precursora. Em algumas modalidades, a célula T precursora é uma célula tronco hematopoiética.
[0300] Em algumas composições, as células são células NK.
[0301] Em algumas modalidades, a célula é CD8+. Em algumas mo- dalidades, a célula é uma célula de linfócito T citotóxico CD8+ selecio- nada a partir do grupo que consiste em células T CD8+ virgens, células
T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetoras e cé- lulas T CD8+ em massa. Em algumas modalidades, a célula é uma cé- lula T precursora. Em algumas modalidades, a célula é uma célula tronco. Em algumas modalidades, a célula é uma célula tronco hemato- poiética ou célula NK. Em algumas modalidades, a célula compreende ainda um receptor de antígeno quimérico.
[0302] Também são fornecidos aqui kits e sistemas incluindo as cé- lulas, vetores de expressão e sequências de proteínas fornecidos e des- critos aqui. Assim, por exemplo, é fornecido neste documento um kit que compreende um ou mais dentre: uma sequência de proteína conforme descrito neste documento; um vetor de expressão como aqui descrito; e / ou uma célula como aqui descrita. Também é fornecido um sistema para ativação seletiva de um sinal no interior de uma célula, o sistema compreendendo uma célula como aqui descrita, em que a célula com- preende um vetor de expressão como aqui descrito, compreendendo um ácido nucleico codificando uma sequência de proteína como aqui descrito. Método para preparar uma célula que expressa um componente de CISC dimérico
[0303] Em algumas modalidades aqui descritas, pode ser desejado introduzir uma sequência de proteína ou um vetor de expressão em uma célula hospedeira, tal como uma célula de mamífero, por exemplo, um linfócito, a ser usado para sinalização de citocinas reguladas por fárma- cos e / ou para a expansão seletiva de células que expressam os com- ponentes de CISC dimérico. Por exemplo, o CISC dimérico pode permi- tir a sinalização de citocinas em células que têm os componentes de CISC introduzidos para transmitir sinais para o interior de uma célula, tal como uma célula de mamífero, após contato com um ligando. Além disso, a expansão seletiva de células, tal como células de mamíferos,
pode ser controlada para selecionar apenas aquelas células que sofre- ram dois eventos de modificação genética específicos, conforme des- crito neste documento. A preparação dessas células pode ser realizada de acordo com técnicas conhecidas que serão evidentes para aqueles versados na técnica com base na presente descrição.
[0304] Em algumas modalidades, é fornecido um método de produ- ção de uma célula portadora de CISC, tal como uma célula de mamífero, em que a célula expressa um CISC dimérico. O método pode incluir en- tregar a uma célula, tal como uma célula de mamífero, a sequência de proteína de qualquer uma das modalidades aqui descritas ou o vetor de expressão de acordo com as modalidades aqui descritas e entregar à célula, tal como uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a sequência da proteína compreende uma primeira e uma segunda se- quência. Em algumas modalidades, a primeira sequência codifica para um primeiro componente de CISC compreendendo um primeiro domínio de ligação extracelular, um domínio de dobradiça, um ligando de um comprimento especificado, em que o comprimento é opcionalmente oti- mizado, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, a segunda sequência codifica para um segundo componente de CISC compreendendo um segundo domínio de ligação extracelular, um domínio de dobradiça, um ligando de um comprimento especificado, em que o comprimento é opcionalmente otimizado, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização. Em algumas mo- dalidades, o espaçador tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos de comprimento ou um comprimento dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos comprimentos mencionados acima. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização compreende um domínio de sinalização de interleucina-2, tal como um domínio IL2RB ou IL2RG. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ex- tracelular é um domínio de ligação que se liga à rapamicina ou a um rapalog, compreendendo FKBP ou FRB ou uma porção dos mesmos. Em algumas modalidades, a célula é uma célula CD8+. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de linfócito T citotóxico CD8+ sele- cionada a partir do grupo que consiste em células T CD8+ virgens, cé- lulas T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetoras e células T CD8+ em massa. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T precursora. Em algumas modalidades, a célula é uma célula tronco. Em algumas modalidades, a célula é uma célula tronco hemato- poiética. Em algumas modalidades, a célula é uma célula NK. Método para Ativar um Sinal no Interior de uma Célula
[0305] Em algumas modalidades, um método aqui descrito emprega uma etapa de ativar um sinal no interior de uma célula, tal como uma célula de mamífero. O método pode incluir fornecer uma célula, tal como uma célula de mamífero, conforme descrito neste documento, em que a célula compreende uma sequência de proteína conforme estabelecido neste documento ou um vetor de expressão conforme estabelecido neste documento. Em algumas modalidades, o método compreende ainda expressar a sequência de proteína codificando um CISC dimérico, conforme descrito neste documento, ou um vetor de expressão con- forme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o método compreende colocar em contato a célula, tal como uma célula de mamí- fero, com um ligando, o que faz com que o primeiro e o segundo com- ponente de CISC dimerizem, o que transduz um sinal para o interior da célula. Em algumas modalidades, o ligando é rapamicina ou rapalog. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um ligando para induzir a dimerização é fornecida em uma quantidade de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 nM ou uma concentração dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores mencionados acima.
[0306] Em algumas modalidades, o ligando utilizado nessas abor- dagens é rapamicina ou um rapalog, compreendendo, por exemplo, everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapa- micina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de benidipina, AP23573 ou AP1903 ou metabólitos, derivados e / ou com- binações dos mesmos. Rapalogs adicionais úteis podem incluir, por exemplo, variantes de rapamicina tendo uma ou mais das seguintes mo- dificações em relação à rapamicina: desmetilação, eliminação ou subs- tituição do metóxi em C7, C42 e / ou C29; eliminação, derivatização ou substituição do hidróxi em C13, C43 e / ou C28; redução, eliminação ou derivatização da cetona em C14, C24 e / ou C30; substituição do anel pipecolato de 6 membros por um anel prolila de 5 membros; e / ou subs- tituição alternativa no anel ciclohexila ou substituição do anel ciclohexila por um anel ciclopentila substituído. Rapalogs úteis adicionais podem incluir novolimus, pimecrolimus, ridaforolimus, tacrolimus, temsirolimus, umirolimus ou zotarolimus, ou metabólitos, derivados e / ou combina- ções dos mesmos.
[0307] Em algumas modalidades, a detecção de um sinal no interior da célula, tal como uma célula de mamífero, pode ser alcançada por um método de detecção de um marcador que é o resultado de uma via de sinalização. Assim, por exemplo, um sinal pode ser detectado pela de- terminação dos níveis de Akt ou de outro marcador de sinalização em uma célula, tal como uma célula de mamífero, por meio de um processo de Western blot, citometria de fluxo ou outro método de detecção e quantificação de proteína. Os marcadores para detecção podem incluir, por exemplo, JAK, Akt, STAT, NF-κ, MAPK, PI3K, JNK, ERK ou Ras, ou outros marcadores de sinalização celular que são indicativos de um evento de sinalização celular.
[0308] Em algumas modalidades, a transdução de um sinal afeta a sinalização de citocinas. Em algumas modalidades, a transdução do si- nal afeta a sinalização de IL2R. Em algumas modalidades, a transdução do sinal afeta a fosforilação de um alvo à jusante de um receptor de citocina. Em algumas modalidades, o método de ativação de um sinal induz a proliferação em células que expressam CISC, tal como células de mamíferos, e uma antiproliferação concomitante em células que não expressam CISC.
[0309] Para que a sinalização celular ocorra, não apenas os recep- tores de citocina devem dimerizar ou heterodimerizar, mas devem estar na configuração adequada para que ocorra uma alteração conformaci- onal (Kim, MJ e outros (2007). J. Biol. Chem., 282 (19): 14253 a 14261). Assim, a dimerização em conjunto com o posicionamento conformacio- nal correto dos domínios de sinalização são processos desejados para a sinalização apropriada, porque a dimerização ou heterodimerização do receptor por si só é insuficiente para conduzir a ativação do receptor. Os complexos de sinalização induzida por produtos químicos descritos neste documento estão geralmente na orientação correta para que ocor- ram eventos de sinalização à jusante. Método de Expansão Seletiva de Populações de Células
[0310] Em algumas modalidades, um método descrito neste docu- mento emprega uma etapa de expandir seletivamente uma população de células, tal como células de mamíferos. Em algumas modalidades, o método compreende fornecer uma célula, tal como uma célula de ma- mífero, como aqui descrito, em que a célula compreende uma sequência de proteína como aqui estabelecida ou um vetor de expressão como aqui estabelecido. Em algumas modalidades, o método compreende ainda expressar a sequência de proteína codificando um CISC dimérico conforme descrito neste documento, ou um vetor de expressão con- forme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o método compreende colocar em contato a célula, tal como uma célula de mamí- fero, com um ligando, o que faz com que o primeiro e o segundo com- ponente de CISC dimerizem, o que transduz um sinal para o interior da célula. Em algumas modalidades, o ligando é rapamicina ou rapalog. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um ligando forne- cido para induzir a dimerização é uma quantidade de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 nM ou uma concentração dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores mencionados acima. Em algu- mas modalidades, onde o ligando é um rapalog, uma quantidade eficaz do ligando fornecido para induzir a dimerização é uma quantidade de 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1000 nM ou superior, ou uma concentração dentro de um inter- valo definido por quaisquer dois dos valores mencionados acima.
[0311] Em algumas modalidades, o ligando utilizado é rapamicina ou um rapalog, compreendendo, por exemplo, everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindolrapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de benidipina, ou AP23573, AP1903 ou metabólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos. Rapalogs adicionais úteis podem incluir, por exemplo, varian- tes de rapamicina tendo uma ou mais das seguintes modificações em relação à rapamicina: desmetilação, eliminação ou substituição do me- tóxi em C7, C42 e / ou C29; eliminação, derivatização ou substituição do hidróxi em C13, C43 e / ou C28; redução, eliminação ou derivatiza- ção da cetona em C14, C24 e / ou C30; substituição do anel pipecolato de 6 membros por um anel prolila de 5 membros; e / ou substituição alternativa no anel ciclohexila ou substituição do anel ciclohexila por um anel ciclopentila substituído. Rapalogs úteis adicionais podem incluir no- volimus, pimecrolimus, ridaforolimus, tacrolimus, temsirolimus, umiroli- mus ou zotarolimus, ou metabólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos.
[0312] Em algumas modalidades, a expansão seletiva de uma po- pulação de células, tal como células de mamíferos, ocorre apenas quando dois eventos de modificação genética distintos ocorreram. Um evento de modificação genética é um componente do complexo de si- nalização induzida por produtos químicos dimérico, e o outro evento de modificação genética é o outro componente do complexo de sinalização induzida por produtos químicos dimérico. Quando ambos os eventos ocorrem dentro da população de células, tal como uma população de células de mamíferos, os componentes do complexo de sinalização in- duzida por produtos químicos dimerizam na presença de um ligando, resultando em um complexo de sinalização induzida por produtos quí- miosa ativo e na geração de um sinal para o interior das células. Ácidos Nucleicos Ácido nucleico Direcionado para o Genoma ou RNA Guia
[0313] A presente descrição fornece um ácido nucleico direcionado para o genoma que pode dirigir as atividades de um polipeptídeo asso- ciado (por exemplo, um polipeptídeo sítio-direcionado ou DNA endonu- clease) para uma sequência alvo específica dentro de um ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico direcionado para o ge- noma é um RNA. Um RNA direcionado para o genoma é chamado de um “RNA guia” ou “gRNA” neste documento. Um RNA guia tem pelo menos uma sequência espaçadora que hibridiza com uma sequência de ácido nucleico alvo de interesse e uma sequência de repetição CRISPR. Em sistemas Tipo II, o gRNA também tem um segundo RNA chamado de sequência tracrRNA. No RNA guia (gRNA) do Tipo II, a sequência de repetição CRISPR e a sequência tracrRNA hibridizam-se para formar um duplex. No RNA guia (gRNA) do Tipo V, o crRNA forma um duplex. Em ambos os sistemas, o duplex se liga a um polipeptídeo sítio-direcionado de modo que o RNA guia e o polipeptídeo sítio-direci- onado formem um complexo. O ácido nucleico direcionado para o ge- noma fornece especificidade de alvo para o complexo em virtude de sua associação com o polipeptídeo sítio-direcionado. O ácido nucleico dire- cionado para o genoma dirige assim a atividade do polipeptídeo sítio- direcionado.
[0314] Em algumas modalidades, o ácido nucleico direcionado para o genoma é um RNA guia de molécula dupla. Em algumas modalidades, o ácido nucleico direcionado para o genoma é um RNA guia de molécula única. Um RNA guia de molécula dupla tem duas fitas de RNA. A pri- meira fita tem, na direção 5’ para 3’, uma sequência de extensão espa- çadora opcional, uma sequência espaçadora e uma sequência de repe- tição CRISPR mínima. A segunda fita tem uma sequência de tracrRNA mínima (complementar à sequência de repetição CRISPR mínima), uma sequência de tracrRNA 3’ e uma sequência de extensão de tracrRNA opcional. Um RNA guia de molécula única (sgRNA) em um sistema Tipo II tem, na direção 5’ para 3’, uma sequência de extensão espaçadora opcional, uma sequência espaçadora, uma sequência de repetição CRISPR mínima, um ligando guia de molécula única, uma sequência tracrRNA mínima, uma sequência 3’ tracrRNA e uma sequência de ex- tensão tracrRNA opcional. A extensão tracrRNA opcional pode ter ele- mentos que contribuem com funcionalidade adicional (por exemplo, es- tabilidade) para o RNA guia. O ligando guia de molécula única liga a repetição CRISPR mínima e a sequência de tracrRNA mínima para for- mar uma estrutura em alça. A extensão de tracrRNA opcional tem um ou mais alças. Um RNA guia de molécula única (sgRNA) em um sistema Tipo V tem, na direção 5’ para 3’, uma sequência de repetição CRISPR mínima e uma sequência espaçadora.
[0315] Os ácidos nucleicos direcionados para o genoma exemplifi- cativos são descritos em WO 2018/002719. DNA de Doador ou Modelo de Doador
[0316] Os polipeptídeos sítio-direcionados, tal como uma DNA en- donuclease, podem introduzir quebras de fita dupla ou quebras de fita simples em ácidos nucleicos, por exemplo, DNA genômico. A quebra de fita dupla pode estimular as vias de reparo de DNA endógeno de uma célula (por exemplo, reparo dependente de homologia (HDR) ou união de extremidades não homólogas ou união de extremidades não homó- logas alternativa (A-NHEJ) ou união de extremidades mediada por mi- cro-homologia (MMEJ)). NHEJ pode reparar o ácido nucleico alvo cli- vado sem a necessidade de um modelo homólogo. Isso pode às vezes resultar em pequenas deleções ou inserções (indels) no ácido nucleico alvo no sítio de clivagem, e pode levar ao rompimento ou alteração da expressão gênica. HDR, também conhecida como recombinação homó- loga (HR), pode ocorrer quando um modelo de reparo homólogo, ou do- ador, está disponível.
[0317] O modelo de doador homólogo tem sequências que são ho- mólogas às sequências que flanqueiam o sítio de clivagem do ácido nu- cleico alvo. A cromátide irmã é geralmente usada pela célula como mo- delo de reparo. No entanto, para fins de edição do genoma, o modelo de reparo é frequentemente fornecido como um ácido nucleico exógeno, tal como um plasmídeo, oligonucleotídeo duplex, oligonucleotídeo de fita simples, oligonucleotídeo de fita dupla, ou ácido nucleico viral. Com modelos de doadores exógenos, é comum introduzir uma sequência de ácido nucleico adicional (tal como um transgene) ou modificação (tal como uma única ou múltiplas alterações de base ou uma deleção) entre as regiões flanqueadoras de homologia de modo que a sequência de ácido nucleico adicional ou alterada também se torne incorporada no lócus alvo. MMEJ resulta em um resultado genético que é semelhante ao NHEJ em que pequenas deleções e inserções podem ocorrer no sítio de clivagem. MMEJ faz uso de sequências homólogas de alguns pares de bases que flanqueiam o sítio de clivagem para conduzir um resultado de reparo de DNA de união de extremidades favorecido. Em alguns ca- sos, pode ser possível prever os resultados de reparo prováveis com base na análise de potenciais micro-homologias nas regiões alvo de nu- clease.
[0318] Assim, em alguns casos, a recombinação homóloga é usada para inserir uma sequência polinucleotídica exógena no sítio de cliva- gem do ácido nucleico alvo. Uma sequência polinucleotídica exógena é aqui denominada um polinucleotídeo doador (ou doador ou sequência doadora ou modelo de polinucleotídeo doador). Em algumas modalida- des, o polinucleotídeo doador, uma porção do polinucleotídeo doador, uma cópia do polinucleotídeo doador, ou uma porção de uma cópia do polinucleotídeo doador é inserido no sítio de clivagem do ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo doador é uma se- quência polinucleotídica exógena, ou seja, uma sequência que não ocorre naturalmente no sítio de clivagem do ácido nucleico alvo.
[0319] Quando uma molécula de DNA exógena é fornecida em con- centração suficiente dentro do núcleo de uma célula na qual a quebra de fita dupla ocorre, o DNA exógeno pode ser inserido na quebra de fita dupla durante o processo de reparo de NHEJ e, assim, tornar-se uma adição permanente ao genoma. Essas moléculas de DNA exógenas são chamadas de modelos de doadores em algumas modalidades. Se o mo- delo de doador contém uma sequência de codificação para um ou mais componentes do sistema descritos neste documento, opcionalmente, juntamente com sequências regulatórias relevantes, tal como promoto- res, intensificadores, sequências poliA e / ou sequências aceitadoras de splice, os um ou mais componentes do sistema podem ser expressos a partir do ácido nucleico integrado no genoma, resultando em expressão permanente para a vida da célula. Além disso, o ácido nucleico inte- grado do modelo de DNA do doador pode ser transmitido para as células filhas quando a célula se divide.
[0320] Na presença de concentrações suficientes de um modelo de DNA de doador que contém sequências de DNA flanqueadoras com ho- mologia à sequência de DNA em ambos os lados da quebra de fita dupla (chamadas de braços de homologia), o modelo de DNA de doador pode ser integrado através da via HDR. Os braços de homologia atuam como substratos para recombinação homóloga entre o modelo de doador e as sequências de cada lado da quebra de fita dupla. Isso pode resultar em uma inserção livre de erros do modelo de doador em que as sequências de cada lado da quebra de fita dupla não são alteradas a partir do ge- noma não modificado.
[0321] Os doadores fornecidos para edição por HDR variam acen- tuadamente, mas geralmente contêm a sequência pretendida com bra- ços de homologia de flanco pequeno ou grande para permitir o anela- mento com o DNA genômico. As regiões de homologia que flanqueiam as alterações genéticas introduzidas podem ser de 30 pb ou menores, ou tão grandes quanto um cassete multi-quilobase que pode conter pro- motores, cDNAs, etc. Tanto doadores de oligonucleotídeo de fita sim- ples quanto de fita dupla podem ser usados. Esses oligonucleotídeos variam em tamanho de menos de 100 nt a mais de muitos kb, embora um ssDNA mais longo também possa ser gerado e usado. Doadores de fita dupla são frequentemente usados, incluindo amplicons de PCR, plasmídeos, e minicírculos. Em geral, descobriu-se que um vetor AAV é um meio muito eficaz de entrega de um modelo de doador, embora os limites de empacotamento para doadores individuais sejam < 5 kb. A transcrição ativa do doador aumentou o HDR três vezes, indicando que a inclusão do promotor pode aumentar a conversão. Por outro lado, a metilação CpG do doador pode diminuir a expressão gênica e HDR.
[0322] Em algumas modalidades, o DNA do doador pode ser forne- cido com a nuclease ou independentemente por uma variedade de mé- todos diferentes, por exemplo, por transfecção, nanopartícula, microin- jeção, ou transdução viral. Uma gama de opções de fixação pode ser usada para aumentar a disponibilidade dos doadores para HDR em al- gumas modalidades. Os exemplos incluem anexar o doador à nuclease, anexar a proteínas de ligação de DNA que se ligam nas proximidades, ou anexar a proteínas que estão envolvidas na ligação ou reparo da extremidade do DNA.
[0323] Além da edição do genoma por NHEJ ou HDR, as inserções de genes sítio-específicas podem ser conduzidas usando a via de NHEJ e HR. Uma abordagem de combinação pode ser aplicável em certos cenários, possivelmente incluindo bordas de íntron / éxon. NHEJ pode provar-se eficaz para a ligação no íntron, enquanto o HDR livre de erros pode ser mais adequado na região de codificação.
[0324] Em algumas modalidades, uma sequência exógena que se destina a ser inserida em um genoma compreende um ou mais compo- nentes de sistema aqui descritos. Em algumas modalidades, a sequên- cia exógena compreende ácido nucleico codificando um ou mais de i) um construto anti-células plasmáticas; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um domínio de sinalização IL2Rβ; iii) um cons- truto anti-células T citotóxicas; iv) um polipeptídeo que confere resistên- cia à rapamicina; v) um marcador selecionável; vi) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina; e vii) um segundo componente de CISC compreendendo um domínio de sinali- zação IL2Rγ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o construto anti-células plasmáticas é um CAR anti-BCMA. Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 60 ou 61 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 60 ou 61. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação extracelular do primeiro componente de CISC compreende um domínio FRB.
Em algumas modalidades, o primeiro componente de CISC com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 ou uma vari- ante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o cons- truto anti-células T citotóxicas é um receptor quimérico que compreende um domínio de β2-microglobulina extracelular, um domínio transmem- brana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização cito- plasmático.
Em algumas modalidades, o receptor quimérico compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo que confere resistência à rapamicina é um polipeptídeo de domínio FRB.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio FRB com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69. Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um polipeptídeo tLNGFR.
Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo tLNGFR compreende a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 66 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina é um polipeptídeo CN mutante.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67). Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação ex- tracelular do segundo componente de CISC compreende um domínio FKBP.
Em algumas modalidades, o segundo componente de CISC com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 ou uma vari- ante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Ácido nucleico Codificando um Polipeptídeo Sítio-Direcionado ou DNA Endonuclease
[0325] Em algumas modalidades, os métodos de edição de genoma e composições, portanto, podem usar uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo sítio-direcionado ou DNA endonuclease. A sequência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo sítio-direcionado pode ser DNA ou RNA. Se a sequência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo sítio-direcionado for RNA, ela pode ser ligada covalente- mente a uma sequência de gRNA ou pode existir como uma sequência separada. Em algumas modalidades, uma sequência peptídica do poli- peptídeo sítio-direcionado ou DNA endonuclease pode ser usada em vez da sua sequência de ácido nucleico. Vetores
[0326] Em outro aspecto, a presente descrição fornece um ácido nu- cleico tendo uma sequência nucleotídica codificando um ácido nucleico direcionado para o genoma da descrição, um polipeptídeo sítio-direcio- nado da descrição e / ou qualquer ácido nucleico ou molécula proteica necessária para executar as modalidades dos métodos da descrição. Em algumas modalidades, esse ácido nucleico é um vetor (por exemplo, um vetor de expressão recombinante).
[0327] Os vetores de expressão considerados incluem, mas não es- tão limitados a, vetores virais baseados em vírus vaccinia, poliovírus, adenovírus, vírus adenoassociado, SV40, vírus herpes simplex, vírus da imunodeficiência humana, retrovírus (por exemplo, vírus da leucemia murina, vírus da necrose do baço, e vetores derivados de retrovírus, tal como vírus do sarcoma de Rous, vírus do sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, um lentivírus, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo, e vírus do tumor mamário) e outros veto-
res recombinantes. Outros vetores considerados para células eucarióti- cas alvo incluem, mas não estão limitados aos vetores pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG e pSVLSV40 (Pharmacia). Os vetores adicionais considerados para células alvo eucarióticas incluem, mas não estão li- mitados aos vetores pCTx-1, pCTx-2 e pCTx-3. Outros vetores podem ser usados, desde que sejam compatíveis com a célula hospedeira.
[0328] Em algumas modalidades, um vetor tem um ou mais elemen- tos de controle de transcrição e / ou tradução. Dependendo do sistema hospedeiro / vetor utilizado, qualquer um de uma série de elementos de controle de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos intensificadores de transcrição, ter- minadores de transcrição, etc. podem ser usados no vetor de expres- são. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de autoinativação que inativa as sequências virais ou os componentes da máquina CRISPR ou outros elementos.
[0329] Exemplos não limitantes de promotores eucarióticos adequa- dos (ou seja, promotores funcionais em uma célula eucariótica) incluem aqueles a partir de citomegalovírus (CMV) imediato precoce, vírus her- pes simplex (HSV) timidina quinase, SV40 precoce e tardio, repetições terminais longas (LTRs) a partir de retrovírus, promotor do fator de alon- gamento humano-1 (EF1), um construto híbrido tendo o intensificador de citomegalovírus (CMV) fusionado ao promotor de beta-actina de ga- linha (CAG), promotor de vírus de células tronco murinas (MSCV), pro- motor de lócus de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), e metalotioneína-I de camundongo.
[0330] Para expressar pequenos RNAs, incluindo RNAs guia usa- dos em conjunto com a endonuclease Cas, vários promotores, tal como promotores de RNA polimerase III, incluindo, por exemplo, U6 e H1, po- dem ser vantajosos. As descrições e os parâmetros para intensificar o uso de tais promotores são conhecidos na técnica, e informações e abordagens adicionais estão sendo regularmente descritas; ver, por exemplo, Ma, H. e outros (2014). Mol. Ther. – Nucleic Acids 3: e161, doi: 10.1038/mtna.2014.12.
[0331] O vetor de expressão também pode conter um sítio de liga- ção ao ribossomo para o início da tradução e um terminador da trans- crição. O vetor de expressão também pode incluir sequências apropria- das para amplificar a expressão. O vetor de expressão também pode incluir sequências de nucleotídeos codificando marcadores não nativos (por exemplo, marcador de histidina, marcador de hemaglutinina, prote- ína fluorescente verde, etc.) que são fusionados ao polipeptídeo sítio- direcionado, resultando assim em uma proteína de fusão.
[0332] Em algumas modalidades, um promotor é um promotor indu- zível (por exemplo, um promotor de choque térmico, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metal, promotor regulado por receptor de estrogênio, etc.). Em algu- mas modalidades, um promotor é um promotor constitutivo (por exem- plo, promotor CMV, promotor UBC). Em algumas modalidades, o pro- motor é um promotor espacialmente restrito e / ou temporalmente res- trito (por exemplo, um promotor tecido-específico, um promotor especí- fico de tipo de célula, etc.). Em algumas modalidades, um vetor não tem um promotor para pelo menos um gene a ser expresso em uma célula hospedeira se o gene for expresso, após ser inserido em um genoma, sob um promotor endógeno presente no genoma. Polipeptídeo Sítio-Direcionado ou DNA Endonuclease
[0333] As modificações do DNA alvo devido a NHEJ e / ou HDR podem levar, por exemplo, a mutações, deleções, alterações, integra- ções, correção de genes, substituição de genes, marcação de genes, inserção de transgene, deleção de nucleotídeos, rompimento de genes, translocações e / ou mutação genética. O processo de integração de ácido nucleico não nativo em DNA genômico é um exemplo de edição de genoma.
[0334] Um polipeptídeo sítio-direcionado é uma nuclease usada na edição do genoma para clivar o DNA. O polipeptídeo sítio-direcionado pode ser administrado a uma célula ou a um paciente como: um ou mais polipeptídeos, ou um ou mais ácidos nucleicos codificando o polipeptí- deo.
[0335] No contexto de um sistema CRISPR / Cas ou CRISPR / Cpf1, o polipeptídeo sítio-direcionado pode se ligar a um RNA guia que, por sua vez, especifica o sítio no DNA alvo para o qual o polipeptídeo é direcionado. Em modalidades de sistemas CRISPR / Cas ou CRISPR / Cpf1 aqui citados, o polipeptídeo sítio-direcionado é uma endonuclease, tal como uma DNA endonuclease. Tal polipeptídeo sítio-direcionado gui- ado por RNA também é chamado aqui de uma endonuclease guiada por RNA, ou RGEN.
[0336] Polipeptídeos sítio-direcionados exemplificativos são descri- tos em WO 2018/002719. Seleção de Sequência Alvo
[0337] Em algumas modalidades, os deslocamentos na localização do limite 5’ e / ou do limite 3’ em relação aos loci de referência particu- lares são usados para facilitar ou melhorar aplicações particulares de edição de genes, que dependem em parte do sistema de endonuclease selecionado para a edição, conforme descrito e ilustrado aqui.
[0338] Em um primeiro aspecto não limitante de tal seleção de se- quência alvo, muitos sistemas de endonuclease têm regras ou critérios que orientam a seleção inicial de potenciais sítios de clivagem alvo, como o requisito de um motivo de sequência PAM em uma posição par- ticular adjacente aos sítios de clivagem de DNA no caso de endonuclea- ses CRISPR Tipo II ou Tipo V.
[0339] Em outro aspecto não limitante da seleção ou otimização de sequência alvo, a frequência da atividade “fora do alvo” para uma com- binação particular de sequência alvo e endonuclease de edição de gene (ou seja, a frequência de DSBs ocorrendo em sítios que não a sequên- cia alvo selecionada) é avaliada em relação à frequência da atividade no alvo. Em alguns casos, as células que foram editadas corretamente no lócus desejado podem ter uma vantagem seletiva em relação a ou- tras células. Exemplos ilustrativos, mas não limitantes, de uma vanta- gem seletiva incluem a aquisição de atributos, tal como taxas aumenta- das de replicação, persistência, resistência a certas condições, taxas aumentadas de enxerto bem-sucedido ou persistência in vivo após a introdução em um paciente, e outros atributos associados com a manu- tenção ou aumento do número ou viabilidade de tais células. Em outros casos, as células que foram editadas corretamente no lócus desejado podem ser selecionadas positivamente por um ou mais métodos de tri- agem usados para identificar, classificar ou de outra forma selecionar células que foram editadas corretamente. Tanto a vantagem seletiva quanto os métodos de seleção direcionada podem tirar vantagem do fenótipo associado à correção. Em algumas modalidades, as células po- dem ser editadas duas ou mais vezes de modo a criar uma segunda modificação que cria um novo fenótipo que é usado para selecionar ou purificar a população de células pretendida. Essa segunda modificação poderia ser criada adicionando um segundo gRNA para um marcador selecionável ou rastreável. Em alguns casos, as células podem ser edi- tadas corretamente no lócus desejado usando um fragmento de DNA que contém o cDNA e também um marcador selecionável.
[0340] Em modalidades, se qualquer vantagem seletiva é aplicável ou qualquer seleção dirigida deve ser aplicada em um caso particular, a seleção de sequência alvo também é guiada pela consideração de fre- quências fora do alvo, a fim de aumentar a eficácia da aplicação e / ou reduzir o potencial de alterações indesejadas em sítios que não o alvo desejado. Conforme descrito adicionalmente e ilustrado aqui e na téc- nica, a ocorrência de atividade fora do alvo é influenciada por uma série de fatores, incluindo similaridades e dissimilaridades entre o sítio alvo e vários sítios fora do alvo, bem como a endonuclease particular utilizada. Estão disponíveis ferramentas de bioinformática que auxiliam na previ- são de atividade fora do alvo, e frequentemente essas ferramentas tam- bém podem ser usadas para identificar os sítios mais prováveis de ati- vidade fora do alvo, que podem então ser avaliados em cenários expe- rimentais para avaliar as frequências relativas de atividade fora do alvo para atividade no alvo, permitindo assim a seleção de sequências que têm atividades no alvo relativas mais altas. Exemplos ilustrativos de tais técnicas são fornecidos aqui, e outros são conhecidos na técnica.
[0341] Outro aspecto da seleção de sequência alvo refere-se a eventos de recombinação homóloga. Sequências que compartilham re- giões de homologia podem servir como pontos focais para eventos de recombinação homóloga que resultam na deleção de sequências inter- venientes. Tais eventos de recombinação ocorrem durante o curso nor- mal de replicação de cromossomos e outras sequências de DNA, e tam- bém em outros momentos quando as sequências de DNA estão sendo sintetizadas, como no caso de reparos de quebras de fita dupla (DSBs), que ocorrem em uma base regular durante o ciclo normal de replicação celular, mas também pode ser intensificada pela ocorrência de vários eventos (tal como luz ultravioleta e outros indutores de quebra de DNA) ou pela presença de certos agentes (tal como vários indutores quími- cos). Muitos desses indutores fazem com que as DSBs ocorram indis- criminadamente no genoma, e as DSBs estão sendo regularmente in- duzidas e reparadas em células normais. Durante o reparo, a sequência original pode ser reconstruída com total fidelidade, no entanto, em al- guns casos, pequenas inserções ou deleções (chamadas de “indels”) são introduzidas no sítio de DSB.
[0342] As DSBs também podem ser especificamente induzidas em localizações específicas, como no caso dos sistemas de endonucleases aqui descritos, que podem ser usados para causar eventos de modifica- ção genética direcionada ou preferencial em localizações cromossômi- cas selecionadas. A tendência de sequências homólogas serem subme- tidas à recombinação no contexto de reparo de DNA (bem como repli- cação) pode ser aproveitada em uma série de circunstâncias, e é a base para uma aplicação de sistemas de edição de genes, tal como CRISPR, em que o reparo dirigido por homologia é usado para inserir uma se- quência de interesse, fornecida através do uso de um polinucleotídeo “doador”, em uma localização cromossômica desejada.
[0343] As regiões de homologia entre sequências particulares, que podem ser pequenas regiões de “micro-homologia” que podem ter ape- nas dez pares de bases ou menos, também podem ser usadas para provocar deleções desejadas. Por exemplo, uma única DSB é introdu- zida em um sítio que exibe micro-homologia com uma sequência pró- xima. Durante o curso normal de reparo de tal DSB, um resultado que ocorre com alta frequência é a deleção da sequência interveniente como resultado da recombinação sendo facilitada pela DSB e processo de re- paro celular concomitante.
[0344] Em algumas circunstâncias, no entanto, a seleção de se- quências alvo dentro de regiões de homologia também pode dar origem a deleções muito maiores, incluindo fusões gênicas (quando as dele- ções estão em regiões de codificação), que podem ou não ser deseja- das dadas as circunstâncias particulares.
[0345] Os exemplos fornecidos neste documento ilustram ainda a seleção de várias regiões alvo para a criação de DSBs projetadas para inserir um ou mais componentes do sistema aqui descritos, bem como a seleção de sequências alvo específicas dentro de tais regiões que são projetadas para minimizar eventos fora do alvo relativos a eventos no alvo. Integração Direcionada
[0346] Em algumas modalidades, um método fornecido neste docu- mento é integrar o ácido nucleico codificando um ou mais componentes do sistema descritos neste documento em uma localização específica no genoma de células alvo (por exemplo, células T), que é chamado de “integração direcionada”. Em algumas modalidades, a integração dire- cionada é ativada usando uma nuclease sequência-específica para ge- rar uma quebra de fita dupla no DNA genômico.
[0347] O sistema CRISPR-Cas usado em algumas modalidades tem a vantagem de que um grande número de alvos genômicos pode ser rastreado rapidamente para identificar um modelo CRISPR-Cas ideal. O sistema CRISPR-Cas usa uma molécula de RNA chamada de RNA guia único (sgRNA) que tem como alvo uma nuclease Cas associada (por exemplo, a nuclease Cas9) para uma sequência específica no DNA. Este direcionamento ocorre por pareamento baseado em Watson- Crick entre o sgRNA e a sequência do genoma dentro da sequência de direcionamento de aproximadamente 20 bp do sgRNA. Uma vez ligada a um sítio alvo, a nuclease Cas cliva ambas as fitas do DNA genômico criando uma quebra de fita dupla. O único requisito para projetar um sgRNA para atingir uma sequência de DNA específica é que a sequên- cia alvo deve conter uma sequência de motivo adjacente do protoespa- çador (PAM) na extremidade 3’ da sequência de sgRNA que é comple- mentar à sequência genômica. No caso da nuclease Cas9 de Strepto- coccus pyogenes, a sequência PAM é NRG (em que R é A ou G e N é qualquer base), ou a sequência PAM mais restrita NGG. Portanto, as moléculas de sgRNA que têm como alvo qualquer região do genoma podem ser manipuladas in silico, localizando a sequência de 20 bp ad- jacente a todos os motivos PAM. Os motivos PAM ocorrem em média 15 bp no genoma dos eucariotos. No entanto, o sgRNA projetado por métodos in silico gerará quebras de fita dupla em células com diferentes eficiências e não é possível prever as eficiências de corte de uma série de moléculas de sgRNA usando métodos in silico.
Como o sgRNA pode ser rapidamente sintetizado in vitro, isso permite a rápida triagem de todas as potenciais sequências de sgRNA em uma determinada região genômica para identificar o sgRNA que resulta no corte mais eficiente.
Geralmente, quando uma série de sgRNA dentro de uma determinada região genômica é testada em células, uma faixa de eficiências de cli- vagem entre 0 e 90% é observada.
Algoritmos in silico, bem como ex- perimentos de laboratório, também podem ser usados para determinar o potencial fora do alvo de qualquer determinado sgRNA.
Embora uma combinação perfeita com a sequência de reconhecimento de 20 pb de um sgRNA ocorra principalmente uma vez na maioria dos genomas eu- carióticos, haverá uma série de sítios adicionais no genoma com 1 ou mais incompatibilidades de pares de bases com o sgRNA.
Esses sítios podem ser clivados em frequências variáveis que muitas vezes não são previsíveis com base no número ou localização das incompatibilidades.
A clivagem em sítios fora do alvo adicionais que não foram identificados pela análise in silico também pode ocorrer.
Assim, a triagem de uma série de sgRNA em um tipo de célula relevante para identificar sgRNA que tem o perfil fora do alvo mais favorável é um componente crucial da seleção de um sgRNA ideal para uso terapêutico.
Um perfil fora do alvo favorável levará em consideração não apenas o número de sítios fora do alvo reais e a frequência de corte nesses sítios, mas também a loca- lização no genoma desses sítios.
Por exemplo, sítios fora do alvo próxi- mos ou dentro de genes funcionalmente importantes, particularmente oncogenes ou anti-oncogenes, seriam considerados menos favoráveis do que sítios em regiões intergênicas sem função conhecida.
Assim, a identificação de um sgRNA ideal não pode ser prevista simplesmente por análise in silico da sequência genômica de um organismo, mas re- quer testes experimentais. Embora a análise in silico possa ser útil na redução do número de guias para teste, ela não pode prever guias que têm alto corte no alvo ou prever guias com baixo corte fora do alvo de- sejável. A capacidade de um determinado sgRNA de promover a cliva- gem por uma enzima Cas pode estar relacionada à acessibilidade desse sítio específico no DNA genômico, que pode ser determinado pela es- trutura da cromatina nessa região. Enquanto a maioria do DNA genô- mico em uma célula diferenciada quiescente existe em heterocromatina altamente condensada, as regiões que são ativamente transcritas exis- tem em estados de cromatina mais abertos que são conhecidos por se- rem mais acessíveis a moléculas grandes, tal como proteínas como a proteína Cas. Mesmo dentro de genes transcritos ativamente, algumas regiões específicas do DNA são mais acessíveis do que outras devido à presença ou ausência de fatores de transcrição ligados ou outras pro- teínas regulatórias. A previsão de sítios no genoma ou dentro de um lócus genômico específico ou região de um lócus genômico não é pos- sível e, portanto, precisaria ser determinada experimentalmente em um tipo de célula relevante. Uma vez que alguns sítios são selecionados como potenciais sítios para inserção, pode ser possível adicionar algu- mas variações a esse sítio, por exemplo, movendo alguns nucleotídeos a montante ou à jusante a partir dos sítios selecionados, com ou sem testes experimentais.
[0348] Em algumas modalidades, os gRNAs que podem ser usados nos métodos aqui descritos compreendem um espaçador compreen- dendo a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 18 ou quaisquer derivados das mesmas tendo pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência nucleotídica com qualquer um das SEQ ID NOs: 1 a 18. Modificações de Ácido Nucleico
[0349] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos introduzidos nas células têm uma ou mais modificações que podem ser usadas in- dependentemente ou em combinação, por exemplo, para aumentar a atividade, estabilidade ou especificidade, alterar a entrega, reduzir as respostas imunes inatas nas células hospedeiras, ou para outros apri- moramentos, conforme descrito adicionalmente neste documento e co- nhecido na técnica.
[0350] Em certas modalidades, os polinucleotídeos modificados são usados em um sistema CRISPR / Cas aqui descrito (tal como um sis- tema CRISPR / Cas9 / Cpf1), caso em que os RNAs guia (guias de mo- lécula única ou guias de molécula dupla) e / ou um DNA ou um RNA codificando uma endonuclease Cas ou Cpf1 introduzida em uma célula pode ser modificado, conforme descrito e ilustrado abaixo. Esses poli- nucleotídeos modificados podem ser usados no sistema CRISPR / Cas para editar qualquer um ou mais loci genômicos.
[0351] Usando um sistema CRISPR / Cas para fins de ilustrações não limitantes de tais usos, modificações de RNAs guia podem ser usa- das para aumentar a formação ou estabilidade do complexo de edição do genoma CRISPR / Cas tendo RNAs guia, que podem ser guias de moléculas únicas ou guias de moléculas duplas, e uma endonuclease Cas ou Cpf1. Modificações de RNAs guia também podem alternativa- mente ser usadas para aumentar a iniciação, estabilidade ou cinética de interações entre o complexo de edição do genoma com a sequência alvo no genoma, que pode ser usada, por exemplo, para aumentar a atividade no alvo. As modificações de RNAs guia também podem alter- nativamente ser usadas para aumentar a especificidade, por exemplo, as taxas relativas de edição do genoma no sítio no alvo em comparação com os efeitos em outros sítios (fora do alvo).
[0352] As modificações também podem alternativamente ser usa-
das para aumentar a estabilidade de um RNA guia, por exemplo, au- mentando sua resistência à degradação por ribonucleases (RNases) presentes em uma célula, fazendo assim com que sua meia-vida na cé- lula aumente. Modificações que aumentam a meia-vida do RNA guia podem ser particularmente úteis em modalidades nas quais uma endo- nuclease Cas ou Cpf1 é introduzida na célula para ser editada por meio de um RNA que precisa ser traduzido para gerar endonuclease, porque aumentar a meia-vida dos RNAs guia introduzidos ao mesmo tempo que o RNA codificando a endonuclease pode ser usado para aumentar o tempo em que os RNAs guia e a endonuclease Cas ou Cpf1 codificada coexistem na célula.
[0353] As modificações também podem alternativamente ser usa- das para diminuir a probabilidade ou grau em que os RNAs introduzidos nas células induzem respostas imunes inatas. Tais respostas, que foram bem caracterizadas no contexto de interferência de RNA (RNAi), inclu- indo pequenos RNAs interferentes (siRNAs), conforme descrito abaixo e na técnica, tendem a estar associadas à meia-vida reduzida do RNA e / ou à produção de citocinas ou outros fatores associados às respostas imunes.
[0354] Um ou mais tipos de modificações também podem ser feitos em RNAs codificando uma endonuclease que são introduzidos em uma célula, incluindo, sem limitação, modificações que aumentam a estabili- dade do RNA (tal como aumentando sua degradação por RNAses pre- sentes na célula), modificações que aumentam a tradução do produto resultante (ou seja, a endonuclease), e / ou modificações que diminuem a probabilidade ou o grau em que os RNAs introduzidos nas células produzem respostas imunes inatas.
[0355] Combinações de modificações, tal como as anteriores e ou- tras, também podem ser utilizadas. No caso de sistemas CRISPR / Cas, por exemplo, um ou mais tipos de modificações podem ser feitos para guiar os RNAs (incluindo aqueles exemplificados acima), e / ou um ou mais tipos de modificações podem ser feitos nos RNAs codificando a endonuclease Cas (incluindo aqueles exemplificados acima).
[0356] Ácidos nucleicos modificados exemplificativos são descritos em WO 2018/002719. Entrega
[0357] Em algumas modalidades, quaisquer moléculas de ácido nu- cleico usadas nos métodos aqui fornecidos, por exemplo, um ácido nu- cleico codificando um ácido nucleico direcionado para o genoma da des- crição e / ou um polipeptídeo sítio-direcionado são empacotados na su- perfície de veículos de entrega para entrega às células. Os veículos de entrega considerados incluem, mas não estão limitados a nanoesferas, lipossomas, pontos quânticos, nanopartículas, partículas de polietileno glicol, hidrogéis, e micelas. Conforme descrito na técnica, uma varie- dade de porções de direcionamento pode ser usada para aumentar a interação preferencial de tais veículos com os tipos de células ou locali- zações desejados.
[0358] A introdução dos complexos, polipeptídeos e ácidos nuclei- cos da descrição nas células pode ocorrer por infecção viral ou por bac- teriófago, transfecção, conjugação, fusão de protoplasto, lipofecção, eletroporação, nucleofecção, precipitação de fosfato de cálcio, transfec- ção mediada por polietilenoimina (PEI), transfecção mediada por DEAE- dextrano, transfecção mediada por lipossomas, tecnologia de pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta, distri- buição de ácido nucleico mediada por nanopartículas, e similares.
[0359] Métodos de entrega e reagentes exemplificativos são descri- tos em WO 2018/002719.
[0360] A presente descrição foi descrita acima com referência a al- ternativas específicas. No entanto, outras alternativas além das descri-
tas acima são igualmente possíveis dentro do escopo da descrição. Eta- pas de método diferentes daquelas descritas acima podem ser forneci- das dentro do escopo da descrição. As diferentes características e eta- pas descritas neste documento podem ser combinadas em outras com- binações além das descritas.
[0361] No que diz respeito ao uso de termos no plural e / ou no sin- gular, os versados na técnica podem traduzir do plural para o singular e / ou do singular para o plural conforme apropriado ao contexto e / ou aplicação. As várias trocas de singular / plural podem ser expressa- mente estabelecidas neste documento por uma questão de clareza.
[0362] Será entendido por aqueles versados na técnica que, em ge- ral, os termos usados neste documento, e especialmente nas reivindi- cações em anexo (por exemplo, corpos das reivindicações em anexo) são geralmente concebidos como termos “abertos” (por exemplo, o termo “incluindo” deve ser interpretado como “incluindo, mas não limi- tado a”, o termo “tendo” deve ser interpretado como “tendo pelo menos”, o termo “inclui” deve ser interpretado como “inclui, mas não está limitado a”, etc.).
[0363] Além disso, quando as características ou aspectos da des- crição são descritos em termos de grupos Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a descrição também é descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.
[0364] Qualquer uma das características de uma alternativa do pri- meiro ao décimo primeiro aspecto é aplicável a todos os aspectos e al- ternativas aqui identificadas. Além disso, qualquer uma das caracterís- ticas de uma alternativa do primeiro ao décimo primeiro aspecto é inde- pendentemente combinável, parcial ou totalmente com outras alternati- vas aqui descritas de qualquer forma, por exemplo, uma, duas, ou três ou mais alternativas podem ser combináveis no todo ou em parte. Além disso, qualquer uma das características de uma alternativa do primeiro ao décimo primeiro aspecto pode ser tornada opcional para outros as- pectos ou alternativas. Embora descrito acima em termos de várias al- ternativas exemplificativas e implementações, dever-se-ia entender que as várias características, aspectos e funcionalidades descritos em uma ou mais das alternativas individuais não são limitados em sua aplicabi- lidade à alternativa particular com a qual são descritos, mas em vez disso, pode ser aplicado, sozinho ou em várias combinações, a uma ou mais das outras alternativas do presente pedido, sejam essas alternati- vas descritas ou não e sejam ou não tais características apresentadas como sendo parte de uma alternativa descrita. Assim, a amplitude e o escopo do presente pedido não devem ser limitados por qualquer uma das alternativas exemplificativas descritas acima.
[0365] Todas as referências citadas neste documento são incorpo- radas aqui por referência em sua totalidade. Na medida em que as pu- blicações e patentes ou pedidos de patentes incorporados por referên- cia contradizem a descrição contida na especificação, a especificação se destina a substituir e / ou ter precedência sobre qualquer material contraditório. Na medida em que as publicações e patentes ou pedidos de patentes aqui incorporados por referência contradizem a descrição contida na especificação, a especificação se destina a substituir e / ou ter precedência sobre qualquer material contraditório.
[0366] Os detalhes de uma ou mais modalidades da descrição são apresentados na descrição em anexo abaixo. Quaisquer materiais e mé- todos similares ou equivalentes aos descritos neste documento podem ser usados na prática ou no teste da presente descrição. Outras carac- terísticas, objetivos e vantagens da descrição serão evidentes a partir da descrição. Na descrição, as formas singulares também incluem o plu- ral, a menos que o contexto indique claramente o contrário. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usa- dos neste documento têm o mesmo significado como comumente en- tendido por alguém versado na técnica à qual esta descrição pertence. Em caso de conflito, a presente descrição prevalecerá.
[0367] Entende-se que os exemplos e as modalidades aqui descri- tos são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alte- rações aos mesmos serão sugeridas a pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e âmbito deste pedido e escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados neste documento são incorporados por meio deste por referência em sua totalidade para todos os fins.
[0368] Algumas modalidades das descrições aqui fornecidas são ainda ilustradas pelos seguintes exemplos não limitantes. Exemplos Materiais e Métodos Reagentes
[0369] O vírus adenoassociado (AAV) foi produzido a partir de trans- fecção tripla de células 293 e purificado por meio de centrifugação em gradiente de iodixanol. Todos os AAVs são do sorotipo 2/6. RNAs guia únicos (sgRNA) foram solicitados à Synthego e usados de acordo com as recomendações do fabricante. A porção de ligação ao alvo das se- quências de sgRNA são as seguintes: TRAC 1: 5’-ACAAAACTGTGC- TAGACATG-3’ (SEQ ID NO: 3); TRAC 2: 5’-AGAGCAACAGTGCTG- TGGCC-3 ’(SEQ ID NO: 1); TRAC 3: 5’-TCTCTCAGCTGGTACACGGC- 3’ (SEQ ID NO: 2); IL2RG GC8: 5’-GGTTATCTCTGTTGGCTCCA-3’ (SEQ ID NO: 11); IL2RG GC10: 5’-AAGGCTGATAATCAATCCCA-3’ (SEQ ID NO: 13); e IL2RG GC12: 5’-CCACGGCTTCCAATGCAAAC-3’ (SEQ ID NO: 15). A enzima Cas9 (TrueCut V2) foi adquirida a partir de Thermo Fisher Scientific. Cas9 e sgRNAs foram complexados em solu-
ção salina tamponada com fosfato por pelo menos 10 minutos em tem- peratura ambiente antes do uso.
[0370] Os pares isogênicos de linhagens celulares que expressam / não expressam BCMA foram criados de três maneiras diferentes. Em primeiro lugar, as células RPMI-8266 foram transfectadas com Cas9 e um sgRNA direcionado à sequência 5’-tattaagctcagtcccaaac-3’ (SEQ ID NO: 78) na região de codificação de BCMA. O grupo de células foi co- rado com um anticorpo anti-BCMA humano conjugado com PE (Biole- gend 357503) e as células sem coloração isoladas. Em segundo lugar, em células K562 normalmente negativas para BCMA, a expressão de BCMA foi colocada sob o controle do promotor PPP1R12C (AAVS1) de baixo nível por integração de um construto SA-2A-BCMA-BGH poliA no lócus AAVS1 usando um sgRNA direcionado a 5’-ggggccactagggacag- gat-3’ (SEQ ID NO: 79). As células foram clonadas por diluição limitante e a expressão de BCMA confirmada por citometria de fluxo. Em terceiro lugar, em células K562, a expressão de BCMA foi colocada sob controle do promotor MND forte por integração de um construto MND-BCMA- BGH polyA no lócus AAVS1 usando um sgRNA direcionado a 5’-gggg- ccactagggacaggat-3’ (SEQ ID NO: 79). As células foram clonadas por diluição limitante e a expressão de BCMA confirmada por citometria de fluxo. Dois clones foram isolados: um com alta expressão de BCMA e outro com expressão de BCMA muito alta. Cultura de Células T
[0371] Células T CD3+ humanas primárias foram isoladas a partir de leucopaks de sangue integral individuais. As células T foram cultiva- das em meio AIM-V mais 5% de soro AB humano mais 50 ng / mL de IL-2. As células foram estimuladas a proliferar usando microesferas magnéticas anti-CD3 / CD28 (Miltenyi Biotec, 130-091-441). As células foram incubadas com microesferas em uma relação de 1:1 em uma con- centração de partida de 0,5e6 células / mL por três dias. As microesferas foram então removidas e as células permitidas a se dividir por um dia antes da transfecção. Transfecção de Células T e Infecção
[0372] As células foram transfectadas com RNP pré-complexado consistindo de 60 pmol de sgRNA e 12 pmol de Cas9 usando um nucle- ofetor Lonza 4D e o programa E0-115. Uma hora após a transfecção, as células foram infectadas com um AAV2 / 6 contendo construtos de direcionamento BCMA-CAR / CISCβ ou TNP-CAR / CISCβ para um gene TRAC e / ou construtos de direcionamento FRB / tLNGFR / CNb30 / CISCγ para um gene IL2RG em MOIs variando de 1.000 a 100.000 (geralmente 50.000 cada). Citometria de Fluxo
[0373] Cinco dias após a edição do gene, as células T foram anali- sadas por citometria de fluxo quanto à expressão de TRAC, IL2RG, CAR e CISC. A expressão de TRAC foi sondada por coloração das células com TCR α / β anti-humano de camundongo conjugado com APC (clone IP26; catálogo Biolegend # 306702). A expressão de IL2RG foi monito- rada com um PE-conjugado com CD132 de camundongo anti-humano (BV421; catálogo BD Biosciences # 566222). A expressão de BCMA CAR foi detectada usando BCMA biotinilado (Acro Biosystems BC7- H82F0) e estreptavidina conjugada com PE (catálogo BD Biosciences # 554061); a expressão de BCMA e TNP CAR foi detectada usando um Fv F(ab)2 de cabra anti-camundongo conjugado com PE (Jackson Immunoresearch 115-066-072). A expressão de tLNGFR foi monitorada com um CD271 de camundongo anti-humano conjugado com APC (clone REA844; Miltenyi Biotec 130-112-791). A expressão de CISC foi visualizada com um conjugado de biotina:rapamicina feito sob medida e a estreptavidina conjugada com PE. Toda a citometria de fluxo foi reali- zada em um Attune NxT (ThermoFisher). Ensaio de Citotoxicidade
[0374] Cinquenta mil células alvo (RPMI-8226 ou RPMI-8226 BCMA-KO; K562 ou K562 BCMA-baixo ou K562-BCMA alto ou K562- BCMA muito alto) foram marcadas com eFluor 670 (Invitrogen # 50-246- 095) e incubadas com células CAR T em relações de efetor:alvo de 0,5:1, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1 por 16 horas. O grupo de células foi corado com DAPI (Invitrogen # D3571) para detectar células mortas, misturado com microesferas de contagem Countbrite (Invitrogen # C36950) para nor- malização de volume, e as células eFluor 670-positivas, DAPI-negativas e eFluor-positivas, DAPI-positivas quantificadas. A viabilidade percen- tual foi determinada como a fração de células vivas vezes 100%; por- centagem de citotoxicidade calculada como 100% menos a porcenta- gem de viabilidade. IFN- ELISA
[0375] Um kit ELISA IFN-gama foi adquirido a partir de R&D Sys- tems e usado de acordo com as instruções do fabricante. O sobrena- dante da cultura foi medido após 16 horas de incubação. Ensaio de Xenoenxerto de Camundongo
[0376] Cinco milhões de células RPMI-8226 ou RPMI-8226 BCMA- KO foram injetadas por via subcutânea em camundongos NSG. Após 2,5 semanas de crescimento do tumor, células T modificadas com BCMA CAR ou TNP CAR foram injetadas por via intravenosa e o tama- nho do tumor monitorado com paquímetros. Expansão Celular Mediada por CISC
[0377] Conjuntos de células T com o CISC integrado em um gene TRAC e um gene IL2RG foram cultivados em meio AIM-V mais 5% de soro AB mais 10 nM de rapamicina sem IL-2. Exemplo 1: Caracterização de gRNAs gRNAs direcionados ao gene TRAC
[0378] Para avaliar a capacidade de gRNAs específicos para o gene
TRAC de efetuar a clivagem direcionada, gRNAs incluindo os espaça- dores TRAC 1 (SEQ ID NO: 3), TRAC 2 (SEQ ID NO: 1) e TRAC 3 (SEQ ID NO: 2) foram adquiridos a partir de Synthego e avaliados em células T CD8+ ou CD3+ humanas primárias transfectadas com RNPs Cas9 / gRNA incluindo o respectivo gRNA por eletroporação após três dias de ativação com microesferas anti-CD3 / CD8 / CD28. Quarenta e oito ho- ras após a transfecção, as células foram analisadas quanto à eficiência de clivagem no sítio no alvo para cada gRNA usando o protocolo TIDES (Brinkman, E.
K. e outros (2014). Nucleic Acids Res., 42 (22): e168), em que os iniciadores de PCR que flanqueiam o sítio de clivagem previsto são usados para amplificar o DNA genômico de células tratadas, se- guido por sequenciamento Sanger do produto de PCR.
Quando uma quebra de fita dupla é criada no genoma de uma célula, a célula tenta reparar a quebra de fita dupla.
Este processo de reparo está indivíduo a erros, o que pode resultar na deleção ou inserção de nucleotídeos no sítio da quebra da fita dupla.
Como as quebras que são perfeitamente reparadas são reclivadas pela nuclease Cas9, ao passo que a inserção ou deleção de nucleotídeos evitará a clivagem de Cas9, haverá um acú- mulo de inserções e deleções que são representativas da eficiência de corte.
Os dados do cromatograma de sequenciamento foram então ana- lisados usando um algoritmo de computador que calcula a frequência de bases inseridas ou deletadas no sítio de clivagem previsto.
A fre- quência de bases inseridas ou deletadas (INDELs) foi usada para cal- cular a frequência de clivagem geral.
As células foram analisadas no segundo dia pós-edição quanto à eficiência INDEL, viabilidade celular, e contagens de células totais, que foram similares para todos os 3 gRNAs testados (Tabela 1, resultados de 2 experimentos independen- tes). Os gRNAs resultaram em uma eficiência INDEL variando de 54% a 64% para células T CD8+ e CD3+, com viabilidades celulares variando de 77% a 89%, indicando que esses gRNAs clivam de forma eficiente em seus sítios alvo em células T sem induzir citotoxicidade. tabela 1 Frequência de Viabilidade Contagem INDEL (%) Celular (%) de Células TRAC 1 62,05 84 5,66E+05 Células T CD8+ TRAC 2 59,5 88,5 7,84E+05 TRAC 3 64,05 85,5 7,39E+05 TRAC 1 56,3 76,5 6,16E+05 Células T CD3+ TRAC 2 53,85 80 7,77E+05 TRAC 3 56,85 82,5 9,45E+05
[0379] As células foram ainda analisadas por citometria de fluxo no dia sete pós-edição para expressão de TCR e CD3 (Tabela 2). Cada um dos gRNAs foi capaz de reduzir a expressão de TCR em células T CD8+ e CD3+ em cerca de 90% ou mais em comparação com controles não tratados. A expressão na superfície de CD3, que depende da expressão de TCR, também foi reduzida em células tratadas com cada um dos gRNAs. Esses resultados suportam os achados da eficiência de INDEL, e indicam que a edição com os gRNAs foi capaz de reprimir a expressão de TCR em células T, silenciando a sinalização através do TCR endó- geno nas células editadas. Tabela 2 Células TCR+ (%) Células CD3+ (%) Controle 99,55 93,6 TRAC 1 9,63 23,65 Células T CD8+ TRAC 2 8,1 24,34 TRAC 3 2,33 17,39 Controle 98,53 96,06 TRAC 1 4,53 53,98 Células T CD3+ TRAC 2 8,63 43,17 TRAC 3 14,72 43,96
[0380] Para avaliar a integração direcionada de um modelo de doa- dor no gene TRAC mediado por gRNAs TRAC 1, TRAC 2 e TRAC 3, células T CD3+ humanas primárias foram transfectadas com Cas9 /
gRNA RNPs incluindo o respectivo gRNA por eletroporação imediata- mente seguido por transdução com um vetor AAV correspondente com braços de homologia específicos para cada gRNA e carregando um mo- delo de doador codificando um CISC e um marcador mCherry (SEQ ID NOs: 94 a 96) para integração em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 50.000. Quarenta e oito horas após a transdução, as células foram analisadas quanto à eficiência de integração usando citometria de fluxo para expressão de mCherry e TCR. Conforme mostrado na Tabela 3 (resultados de dois experimentos independentes com diferentes lotes de células T), a integração direcionada dos modelos de doadores foi alcançada para cada um dos três gRNAs testados, e a quantidade de células TCR- / CISC+ variou de cerca de 12% a cerca de 18%. Tabela 3 Células TCR+ (%) Células CISC+ (%) Células TCR-/CISC+ (%) Não tratadas 90,55 0 0 TRAC 1 RNP 44,5 0 0 TRAC 2 RNP 44,8 0 0 TRAC 3 RNP 55,45 0 0 TRAC 1 RNP + AAV 28,85 18,65 17,5 TRAC 2 RNP + AAV 41,35 16,4 15,2 TRAC 3 RNP + AAV 47,9 12,75 11,85 gRNAs direcionados ao lócus IL2RG
[0381] Para avaliar a capacidade de gRNAs específicos para o lócus IL2RG de afetar a clivagem direcionada, 15 gRNAs incluindo os espa- çadores GC1 (SEQ ID NO: 4), GC2 (SEQ ID NO: 5), GC3 (SEQ ID NO: 6), GC4 (SEQ ID NO: 7), GC5 (SEQ ID NO: 8), GC6 (SEQ ID NO: 9), GC7 (SEQ ID NO: 10), GC8 (SEQ ID NO: 11), GC9 (SEQ ID NO: 12), GC10 (SEQ ID NO: 13), GC11 (SEQ ID NO: 14), GC12 (SEQ ID NO: 15), GC13 (SEQ ID NO: 16), GC14 (SEQ ID NO: 17), e GC15 (SEQ ID NO: 18) direcionados ao éxon 6 do gene IL2RG foram adquiridos a partir de Synthego e avaliados em células T CD3+ humanas primárias trans- fectadas com Cas9 / gRNA RNPs incluindo o respectivo gRNA por ele- troporação após três dias de ativação com microesferas anti-CD3 / CD8
/ CD28. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram ana- lisadas quanto à eficiência de clivagem no sítio alvo para cada gRNA usando o protocolo TIDES como descrito acima. As células foram ana- lisadas um dia após a edição quanto à eficiência de INDEL, que variou de cerca de 15% a cerca de 80%, indicando que uma série de gRNAs clivam eficientemente em seus sítios alvo em células T (Tabela 4, resul- tados de 3 experimentos independentes). Tabela 4 Espaçador de gRNA Frequência média de INDEL (%) Desvio Padrão GC3 77,53 3,95 GC2 74,67 6,57 GC10 71,77 17,24 GC8 66,40 3,44 GC12 58,43 12,03 GC15 46,77 13,17 GC1 46,43 19,90 GC4 41,07 23,40 GC13 35,60 4,20 GC9 31,37 14,28 GC7 31,07 15,37 GC14 28,23 20,65 GC11 15,60 10,00 GC6 14,80 8,51 GC5 13,03 6,56 No RNP 1,63 1,27
[0382] Para avaliar a integração direcionada de um modelo de doa- dor no lócus ILR2G mediado por gRNAs GC8, GC10 e GC12, células T CD3+ humanas primárias foram transfectadas com Cas9 / gRNA RNPs incluindo o respectivo gRNA por eletroporação isoladamente, ou imedi- atamente seguido por transdução com um vetor AAV correspondente com braços de homologia específicos para cada gRNA (braços de ho- mologia de SEQ ID NOs: 86 e 87 para GC8; braços de homologia de SEQ ID NOs: 88 e 89 para GC10; e braços de homologia de SEQ ID NOs: 90 e 91 para GC12) e transportando um modelo de doador codifi- cando um CISC e um marcador tLNGFR (SEQ ID NO: 97) para integra- ção em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 50.000. Quarenta e oito horas após a transdução, as células foram analisadas quanto à eficiên- cia de integração usando citometria de fluxo para tLNGFR e para efici- ência de INDEL. Conforme mostrado na Tabela 5 (resultados de dois experimentos independentes com diferentes lotes de células T), a inte- gração direcionada dos modelos de doadores foi alcançada para cada um dos três gRNAs testados e a quantidade de células CISC+ (como indicado pela expressão de tLNGFR) variou de cerca de 11% a cerca de 29%. Tabela 5 Frequência de INDEL (%) Células CISC+ (%) Não tratadas 4,7 0,1 GC8 RNP 24,3 0,1 GC10 RNP 53,25 0,05 GC12 RNP 27,75 0,05 GC8 RNP + AAV 3,4 10,85 GC10 RNP + AAV 30,85 28,55 GC12 RNP + AAV 24,85 11,9 Análise Fora do Alvo
[0383] Os sítios fora do alvo para gRNAs direcionados a IL2RG hu- mano GC8, GC10 e GC12 foram avaliados em células CD3+ humanas primárias usando o método GUIDE-seq (Tsai, SQ e outros (2015). Nat. Biotechnol., 33 (2): 187 a 197). GUIDE-seq é um método empírico usado para identificar os sítios de clivagem. O GUIDE-seq depende da captura espontânea de um oligonucleotídeo no sítio de uma quebra de fita dupla no DNA cromossômico. Em resumo, após a transfecção de células com um complexo de RNA guia / Cas9 RNP e oligonucleotídeo de fita dupla, o DNA genômico é purificado das células, sonicado, e uma série de li- gações adaptadoras são realizadas para criar uma biblioteca. As biblio- tecas contendo oligonucleotídeos são submetidas a sequenciamento de DNA de alto rendimento, e a saída é processada usando o software
GUIDE-seq padrão para identificar sítios de captura de oligonucleotí- deos.
[0384] As amostras sem transfecção de RNP contendo SpCas9 e o sgRNA foram processadas em paralelo. Os sítios (+/- 1 kb) encontrados em amostras contendo RNP e amostras virgens de RNP foram excluí- dos de análises posteriores.
[0385] O adaptador Y foi preparado por anelamento do adaptador comum para cada um dos adaptadores de código de barras de amostra (A01 - A16) que contêm o índice molecular de 8-mer. O DNA genômico extraído das células T CD3+ que foram nucleofetadas com RNP e o GUIDE-seq ODN foi quantificado usando um fluorômetro Qubit (Ther- moFisher Scientific) e todas as amostras foram normalizadas para 400 ng em um volume de 120 µl de tampão TE. O DNA genômico foi cisa- lhado em um comprimento médio de 200 bp de acordo com o procedi- mento operacional padrão para o sonicador Covaris S220. Para confir- mar o comprimento médio do fragmento, 1 µl da amostra foi analisado em um TapeStation (Agilent) de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras de DNA cisalhado foram limpas usando microesferas AM- Pure XP SPRI de acordo com o protocolo do fabricante e eluídas em 17 µl de tampão TE. A reação de reparo final foi realizada no DNA genô- mico misturando 1,2 µl de dNTP mix (5 mM cada dNTP), 3 µl de tampão 10 x T4 DNA ligase, 2,4 µl de End-Repair Mix, 2,4 µl de tampão Platinum Taq 10x (Mg2+ livre) e 0,6 µl de Taq Polimerase (não hotstart) e 14 µl de amostra de DNA cisalhado (a partir da etapa anterior) para um volume total de 22,5 µl por tubo e incubado em um termociclador (12°C, 15 mi- nutos; 37°C, 15 minutos; 72°C, 15 minutos; 4°C mantido). A isto foi adi- cionado 1 µl de adaptador Y anelado (10 µM) e 2 µl de T4 DNA ligase, e a mistura foi incubada em um termociclador (16°C, 30 minutos; 22°C, 30 minutos; 4°C mantido). A amostra foi limpa usando microesferas AM- Pure XP SPRI de acordo com o protocolo do fabricante e eluída em 23 µl de tampão TE. Um µl de amostra foi corrido em um TapeStation de acordo com o protocolo do fabricante para confirmar a ligação dos adap- tadores aos fragmentos. Para preparar a biblioteca GUIDE-seq, uma re- ação foi preparada contendo 14 µl de H2O livre de nuclease, 3,6 µl de tampão Platinum Taq 10 x, 0,7 µl de dNTP (10 mM cada), 1,4 µl de MgCl2, 50 mM, 0,36 µl de Platinum Taq polimerase, 1,2 µl de iniciador específico para gene senso ou antissenso (10 µM), 1,8 µl de TMAC (0,5 M), 0,6 µl de P5_1 (10 µM) e 10 µl da amostra da etapa anterior. Esta mistura foi incubada em um termociclador (95° C, 5 minutos, em se- guida, 15 ciclos de 95° C, 30 segundos; 70°C (menos 1° C por ciclo) por 2 minutos; 72°C, 30 segundos; seguido por 10 ciclos de 95°C, 30 se- gundos; 55°C, 1 minuto; 72°C, 30 segundos; seguido por 72°C, 5 minu- tos). A reação de PCR foi limpa usando microesferas AMPure XP SPRI de acordo com o protocolo do fabricante e eluída em 15 µl de tampão TE. 1 µl de amostra foi verificado no TapeStation de acordo com o pro- tocolo do fabricante para rastrear o progresso da amostra. Uma se- gunda PCR foi realizada misturando-se 6,5 µl de H2O livre de nuclease, 3,6 µl de tampão Platinum Taq 10x (livre de Mg2+), 0,7 µl de dNTP mix (10 mM cada), 1,4 µl de MgCl2 (50 mM), 0,4 µl de Platinum Taq polime- rase, 1,2 µl de Iniciador Específico de Gene (GSP) 2 (senso: + ou antis- senso: -), 1,8 µl de TMAC (0,5 M), 0,6 µl de P5_2 (10 µM) e 15 µl do produto de PCR da etapa anterior.
[0386] GUIA-seq foi concluído em múltiplos replicados de amostras de células independentes (de transfecções independentes) para cada gRNA e os resultados são mostrados nas Tabelas 6 e 7. Estes resulta- dos demonstram perfis no alvo / fora do alvo geralmente favoráveis para espaçadores de gRNA GC8, GC10 e GC12. Tabela 6: Resumo dos resultados do GUIA-seq para gRNAs com espa- çadores GC8, GC10 e GC12 em células T CD3+
Nome do GUIDE-seq Fora Presente em Múltiplos Contagem de Lei- guia do Alvo Replicados tura no Alvo GC8 930 3 4348 GC10 1227 14 5384 GC12 1368 4 2352 Tabela 7: Detalhes dos sítios fora do alvo detectados por GUIDE-seq em pelo menos 2 dos replicados da amostra de células GC8 Cromossomo Posição1 Tipo de Locali- Gene Nome Completo do Gene Fora do Alvo / zação No Alvo chr1 125180094 Intergênica 1,54% chr16 46399022 Intergênica 0,46% chr16 46390807 Intergênica 0,14% GC10 Cromossomo Posição Tipo de Locali- Gene Nome Completo do Gene Fora do Alvo / zação No Alvo chr3 108840645 Intrônica TRAT1 Adaptador transmembrana asso- 3,05% ciado a receptor de células T chrUn_KI270438v1 104161 1,60% chr13 18212170 Intrônica FAM230C Família com similaridade de se- 1,02% quência 230 membro C chrUn_KI270438v1 109477 0,97% chr21 17142630 Intergênica 0,71% chr12 62289934 Intrônica USP15 peptidase 15 específica de ubi- 0,48% quitina chrUn_KI270467v1 2622 0,48% chrUn_KI270438v1 109447 0,39% chrUn_KI270438v1 104938 0,28% chrUn_KI270467v1 3365 0,26% chr5 159185831 Intrônica RNF145 Proteína dedo de anel 145 0,20% chrUn_KI270467v1 2297 0,17% chrUn_KI270467v1 2459 0,17% chrUn_KI270467v1 2830 0,13% GC12 Cromossomo Posição Tipo de Locali- Gene Nome Completo do Gene Fora do Alvo / zação No Alvo chr13 18212170 Intrônica FAM230C Família com similaridade de se- 1,02% quência 230 membro C chrUn_KI270467v1 2459 0,77% chrUn_KI270590v1 2621 0,38% chrUn_KI270467v1 2660 0,34%
1. A posição refere-se à localização genômica no Genome Reference Consortium Human Build 38 (hg38). O NCBI Genome Data Viewer foi usado para anotar cada posição (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv).
[0387] Embora a porcentagem de leituras fora do alvo / no alvo for- neça uma representação geral de se um gRNA é específico para seu alvo pretendido, outros fatores podem estar envolvidos. Por exemplo, um sítio fora do alvo para um gRNA candidato em um éxon de um gene essencial necessário para a sobrevida de um organismo poderia tornar o gRNA inadequado para uso na clínica. Por outro lado, um sítio fora do alvo em uma região não codificante ou intrônica pode representar me- nos preocupação. Considerações úteis para avaliar um gRNA preten- dido para uso terapêutico incluem 1) o número de sítios fora do alvo, 2) a localização dos sítios fora do alvo, 3) a frequência de edição fora do alvo em comparação com a edição no alvo e 4) o grau de homologia do sítio fora do alvo com a sequência espaçadora de gRNA.
[0388] Potenciais sítios fora do alvo foram validados reproduzindo- se o experimento em replicados de amostras de células. Por conse- guinte, o requerente conduziu experimentos para identificar potenciais sítios fora do alvo em células editadas usando gRNAs direcionados ao éxon 6 de IL2RG. Os sítios fora do alvo que foram detectados em múl- tiplos replicados de amostras de células são relatados na Tabela 7. A comparação das contagens de leitura para cada sítio fora do alvo para o sítio no alvo em GUIDE-seq fornece uma estimativa das frequências fora do alvo dos sítios fora do alvo para cada sgRNA. Esses dados estão resumidos na Tabela 7, juntamente com informações sobre o sítio ge- nômico e se o sítio fora do alvo está dentro da região de codificação de um gene. Uma sequência semente espaçadora consistindo dos sete nu- cleotídeos do espaçador correspondendo à sequência alvo adjacente ao motivo adjacente do protoespaçador (PAM) foi mostrada por Zheng, T. e outros como sendo sensível a incompatibilidades (Zheng, T. e ou- tros (2017). Sci. Rep., 7, 40638). Não seria de esperar que sítios fora do alvo previstos com incompatibilidades correspondentes à sequência se- mente do espaçador sgRNA fossem editados de forma eficiente. Esses sítios fora do alvo com incompatibilidades nesta região semente são provavelmente falso positivos. As verdadeiras frequências fora do alvo podem ser confirmadas por métodos de sequenciamento profundo, como sequenciamento de amplicons (ver Medinger, R. e outros (2010). Mol. Ecol., 19 (Supl. 1): 32 a 40).
[0389] O sítio no alvo e os potenciais sítios fora do alvo para o es- paçador de gRNA direcionado ao TRAC TRAC 1 (SEQ ID NO: 3) foram avaliados em células CD3+ humanas primárias usando sequenciamento de amplicon. Um par de iniciadores de PCR foi projetado para amplificar ~ 200 bp da região de interesse com o potencial sítio de clivagem loca- lizado aproximadamente no meio. Os amplicons com código de barras foram gerados a partir de células tratadas com RNP e transfectadas com mock, multiplexadas, e submetidas a sequenciamento de DNA de alto rendimento. As leituras de sequência foram leituras de extremidades pareadas desmultiplexadas, alinhadas e mescladas usando Pandaseq
2.11 (Masella, AP, e outros (2012). BMC bioinformatics, 13(1), 31), e a frequência de INDELs foi determinada para cada sítio alvo com software personalizado que usa o alinhador Biopython 1,69 pairwise2. Para cada sítio alvo, um mínimo de 10.000 leituras de sequência e uma média de
40.000 em toda a coleção de leituras foram realizadas. Conforme mos- trado na Tabela 8, a frequência de INDEL para o sítio no alvo foi de cerca de 85%. Três potenciais sítios fora do alvo com frequências de INDEL maiores que 0,2% foram identificados, mas estes parecem ter resultado de ruído nas corridas de sequenciamento. Estes resultados indicam um perfil no alvo / fora do alvo altamente favorável para o es- paçador de gRNA TRAC 1. Tabela 8 Lócus de Sítio Alvo Frequência de INDEL (%) on-target site 84,89 chr1_151031887 0,5 chr10_42385299 0,27 chr4_175681976 0,22 chr4_64499999 0,17 chr19_55086187 0,16 chr1_192338993 0,14 chr11_83606941 0,14 chr19_54783512 0,13 chr19_27731991 0,12 chr11_31817474 0,11 chr18_21359558 0,11 chr5_16698674 0,1 chr19_55143375 0,07 chr1_91846342 0,06 chr13_100290751 0,05 chr10_37704866 0,04 chr4_152822294 0,02 chr8_32397899 0,02 chr16_48670703 0,02 chr13_100546989 0,02 chr20_41690279 0,01 chr5_131598919 0,01 chr7_61970309 0,01 chr9_120595625 0,01 chr1_109932513 0,01 chr8_59715325 0,01 chr14_77738868 0,01 chr1_100337774 0 chr11_12874646 0 chr20_20928859 0 chr6_16112813 0 chr7_157040012 0 chr2_242214607 -0,01 chr1_104671743 -0,01 chr17_61008724 -0,01 chr11_115032260 -0,01 chr15_92478803 -0,03 chr2_173826344 -0,03 chrX_150198527 -0,03 chr15_64155080 -0,06 chr11_71948806 -0,09 chr12_2987230 -0,16 chr6_100380971 -0,26 chr4_157542466 -1,1 chr2_236746479 -1,22 chr2_179621956 -8,34
[0390] No geral, os resultados do GUIDE-seq e análise de sequen- ciamento de amplicon em células T CD3+ demonstraram que gRNAs com espaçadores GC8, GC10, GC12 e TRAC 1 são bons candidatos para uso posterior, tal como em terapia com células adotivas ou outra célula terapia baseada em células.
[0391] A triagem de gRNAs adicionais com sítios alvo em genes TRAC e IL2RG humanos para seu perfil no alvo / fora do alvo em células humanas usando as metodologias de sequenciamento GUIDE-seq e / ou amplicon aqui descritas é considerada como uma abordagem para identificar moléculas de gRNA que podem ser usadas para direcionar esses genes com o propósito de criar células T CAR anti-BCMA. Exemplo 2: Geração e caracterização de células T expressando CAR anti-BCMA por integração direcionada a um gene TRAC
[0392] As células T com integração direcionada de um cassete de expressão codificando um CAR anti-BCMA em um gene TRAC foram geradas usando RNPs de Cas9 / sgRNA direcionados a TRAC em com- binação com modelos de doadores de AAV projetados para integração por HDR. Em geral, os modelos de doadores projetados para integra- ções mediadas por HDR devem ser configurados de modo que o sítio de integração esteja próximo do sítio alvo do gRNA, por exemplo, a me- nos de 10 bp de distância (blog.addgene.org/crispr-101-homology-direc- ted-repair). Os modelos de doadores de AAV continham um cassete de expressão com seu próprio promotor e flanqueado por braços de homo- logia incluindo um sítio alvo para o sgRNA no RNP (Figura 1, construtos de modelo de doador # 1 e # 6).
[0393] As células T CD3+ humanas primárias foram isoladas de leu- copaks de sangue integral individuais. As células T isoladas foram cul- tivadas em meio AIM-V mais 5% de soro AB humano mais 50 ng / mL de IL-2. As células foram estimuladas para proliferar usando microesfe- ras magnéticas anti-CD3 / CD28 (Miltenyi Biotec, 130-091-441) em uma relação de 1:1 em uma concentração inicial de 0,5e6 células / mL por três dias. As microesferas foram então removidas e as células foram deixadas dividir por um dia antes da transfecção.
[0394] Cas9 / sgRNA RNPs direcionados ao gene TRAC foram pre- parados combinando-se 60 pmol de TRAC 3 sgRNA (sequência espa- çadora: TCTCTCAGCTGGTACACGGC (SEQ ID NO: 2)) e 12 pmol de Cas9 (TrueCut V2, Thermo Fisher Scientific) em solução salina tampo- nada com fosfato por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente. As células foram transfectadas com os RNPs usando um nucleofector Lonza 4D e o programa E0-115. Uma hora após a transfecção, as célu- las foram infectadas com vetores doadores AAV2 / 6 para a expressão de um CAR anti-BCMA com um domínio coestimulatório CD28 (# 1 TRAC 3, SEQ ID NO: 20), um CAR anti-BCMA com um domínio coesti- mulatório 4-1BB (# 6 TRAC 3, SEQ ID NO: 35), um CAR anti-TNP com um domínio coestimulatório CD28 (SEQ ID NO: 92) ou um CAR anti- TNP com domínio coestimulatório 4-1BB (SEQ ID NO: 93) em um MOI de 20.000.
[0395] Cinco dias após a edição, as células foram coradas com Fv- biotina anti-camundongo seguido por estreptavidina-PE e analisadas por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Tabela 9, entre 9% e 12% das células T tratadas com os doadores CAR anti-BCMA mostra- ram expressão de CAR. Estes resultados demonstram que a integração direcionada de um cassete de expressão em um gene TRAC em células T permite a expressão de um CAR a partir do cassete integrado. Tabela 9 Tratamento Células CAR+ (%) #1 TRAC 3 11,59 #6 TRAC 3 9,40 α-TNP/CD28/CD3ζ CAR 23,09 α-TNP/41BB/CD3ζ CAR 11,98 Exemplo 3: Análise simultânea da expressão de TRAC e CAR
[0396] Para avaliar o efeito da integração direcionada de uma se- quência heteróloga em um gene TRAC na expressão de TCR, as células T tratadas como no Exemplo 2 foram coradas cinco dias após o trata- mento simultaneamente com um anticorpo TCR anti-α / β e BCMA bio- tinilado / estreptavidina-PE e analisadas por citometria de fluxo. Aproxi- madamente 90% das células T não apresentaram expressão de TCR quando tratadas com Cas9 / sgRNA RNP direcionado a TRAC, e entre 18% e 22% das células T tratadas com Cas9 / sgRNA RNP direcionado a TRAC e um doador AAV CAR anti-BCMA foram TCR-negativas e ex- pressaram um CAR anti-BCMA (Tabela 10). Estes resultados indicam que a edição de células T usando um Cas9 / gRNA RNP direcionado a TRAC foi eficaz para eliminar a expressão de TCR nas células editadas. Tabela 10 Tratamento Células α-BCMA Células α-BCMA Células α-BCMA Células α-BCMA CAR+/ CAR+/ CAR-/ CAR-/ TCR- (%) TCR+ (%) TCR- (%) TCR+ (%) AAV somente 0,00 0,15 0,85 98,99 RNP somente 0,05 0,01 90,72 9,22 #1 TRAC 3 18,05 1,01 70,71 10,23 #6 TRAC 3 22,36 1,15 67,16 9,33 α-TNP/CD28/CD3ζ CAR 0,12 0,00 88,63 11,25 α-TNP/41BB/CD3ζ CAR 0,05 0,02 88,38 11,54 Exemplo 4: Persistência de CAR até o dia doze pós-transfecção
[0397] Para avaliar a persistência da expressão de CAR anti-BCMA em células CAR T anti-BCMA, as células T tratadas como no Exemplo 2 foram coradas no dia doze pós-transfecção simultaneamente com um anticorpo anti-α / β TCR e BCMA biotinilado / estreptavidina-PE e anali- sadas por citometria de fluxo. Aproximadamente 90% das células T não apresentaram expressão de TCR quando tratadas com um RNP direci- onado a TRAC, e entre 22% e 30% das células T tratadas com um do- ador AAV CAR anti-BCMA foram TCR-negativas e expressaram um CAR anti-BCMA (Tabela 11). Estes resultados demonstram que a ex- pressão de CAR anti-BCMA persiste pelo menos até o dia doze pós- transfecção em células T editadas. Tabela 11 Tratamento Células α-BCMA Células α-BCMA Células α-BCMA Células α-BCMA CAR+/ CAR+/ CAR-/ CAR-/ TCR- (%) TCR+ (%) TCR- (%) TCR+ (%) #1 TRAC 3 29,84 0,95 62,45 6,76 #6 TRAC 3 21,81 0,95 66,51 10,73 α-TNP/CD28/CD3ζ CAR 0,18 0,00 88,94 10,88 α-TNP/41BB/CD3ζ CAR 0,00 0,01 92,48 7,51
[0398] Em outro experimento, as células T tratadas como no Exem- plo 2 foram avaliadas quanto à expressão de CAR no dia doze após a transfecção por coloração com um anticorpo anti-camundongo que re- conhece a porção de anticorpo extracelular de cada um dos CARs se- guido por análise de citometria de fluxo. A expressão de TCR α / β não foi avaliada neste experimento porque o reagente de detecção de CAR de cadeia variável anti-camundongo interfere com o anticorpo TCR de camundongo. Entre 18% e 30% das células T expressaram um CAR (Tabela 12). Tabela 12 Tratamento Células CAR+ (%) Células CAR- (%) #1 TRAC 3 21,71 78,29 #6 TRAC 3 18,90 81,10 α-TNP/CD28/CD3ζ CAR 30,21 69,79 α-TNP/41BB/CD3ζ CAR 23,09 76,90 Exemplo 5: Mais AAV fornece mais células CAR-positivas
[0399] Para avaliar o efeito da quantidade de AAV doador usado para transdução na expressão de CAR anti-BCMA, as células T foram editadas como no Exemplo 2, mas com MOIs de 25.000, 50.000 ou
100.000. As células foram coradas simultaneamente com anticorpo
TCR anti-α / β e BCMA biotinilado / estreptavidina-PE e analisadas por citometria de fluxo cinco dias após a edição. Mais de 95% das células não apresentaram expressão de TCR quando tratadas com um RNP direcionado a TRAC, e entre 20% e 60% das células T expressaram um CAR anti-BCMA, com a quantidade de células CAR+ anti-BCMA corre- lacionando-se positivamente com MOI do AAV doador (Tabela 13). Es- tes resultados demonstram uma dose-resposta para MOI do AAV doa- dor na eficiência de integração do doador. Tabela 13 Tratamento Células α-BCMA Células α-BCMA Células α-BCMA Células α-BCMA CAR+/ CAR+/ CAR-/ CAR-/ TCR- (%) TCR+ (%) TCR- (%) TCR+ (%) #1 TRAC 3, 25k MOI 20,55 0,52 74,31 4,62 #1 TRAC 3, 50k MOI 42,76 0,50 53,28 3,47 #1 TRAC 3, 100k MOI 60,92 0,29 38,21 0,57 #6 TRAC 3, 25k MOI 26,74 0,42 69,44 3,40 #6 TRAC 3, 50k MOI 37,16 0,35 58,04 4,45 #6 TRAC 3, 100k MOI 40,26 0,25 57,62 1,86 Exemplo 6: Células CAR T anti-BCMA são citotóxicas para células que expressam BCMA
[0400] Este exemplo demonstra a citotoxicidade de células CAR T anti-BCMA para células que expressam BCMA. As células T foram transfectadas com RNPs contendo os sgRNAs TRAC 3 ou TRAC 1 e depois infectadas com um AAV doador correspondente (α-BCMA / CD28 / CD3z TRAC 1, SEQ ID NO: 21; α-BCMA / CD28 / CD3z TRAC 3, SEQ ID NO: 20; ou α-BCMA / 41BB / CD3z-CISCβ TRAC 1, SEQ ID NO: 36) em um MOI de 50.000. Ou 14 (TRAC 1 sgRNA) ou 22 (TRAC 3 sgRNA) dias após a transfecção, as células T foram usadas em um en- saio de citotoxicidade com células K562 de ocorrência natural (não ex- pressando BCMA) ou células K562 de BCMA muito alto (K562 VH- BCMA) (expressando BCMA) como as células alvo em uma relação efe- tor:alvo de 8:1. A viabilidade da célula alvo K562 VH-BCMA (conforme determinado pela coloração DAPI) caiu de 93% para 26% após a co- cultura com células CAR T anti-BCMA, enquanto a viabilidade da célula alvo K562 permaneceu em cerca de 82% após a co-cultura com células CAR T anti-BCMA (Tabela 14), demonstrando que as células CAR T anti-BCMA são citotóxicas para células que expressam BCMA, e a cito- toxicidade depende da expressão de BCMA. Tabela 14 Célula T Efetora (tratamento com AAV doador) Célula Alvo Viabilidade de Célula Alvo (%) Sem AAV doador K562 VH-BCMA 93,45 α-BCMA/CD28/CD3z TRAC 3 K562 VH-BCMA 25,99 α-BCMA/CD28/CD3z TRAC 1 K562 82,94 α-BCMA/41BB/CD3z-CISCβ TRAC 1 K562 81,94 Exemplo 7: A citotoxicidade requer um CAR que se liga ao BCMA
[0401] Este exemplo demonstra que a citotoxicidade de células CAR T em relação às células que expressam BCMA depende da especifici- dade de CAR para BCMA. As células T foram transfectadas com RNPs contendo os sgRNAs TRAC 1 e, em seguida, infectadas com os doado- res de AAV correspondentes codificando um CAR anti-TNP (α-TNP / CD28 / CD3ζ CAR TRAC 1, SEQ ID NO: 92; ou α-TNP / 41BB / CD3ζ CAR TRAC 1, SEQ ID NO: 93) ou doadores de AAV correspondentes codificando um CAR anti-BCMA (α-BCMA / CD28 / CD3z TRAC 1, SEQ ID NO: 21; ou α-BCMA / 41BB / CD3z-CISCβ TRAC 1, SEQ ID NO: 36) em um MOI de 50.000. Quatorze dias após a transfecção, as células T foram usadas em um ensaio de citotoxicidade com K562 BCMA muito alto (K562 VH-BCMA) como as células alvo em uma relação de efe- tor:alvo (E:T) de 8:1. A viabilidade celular alvo caiu de 93% para ~ 40% após a exposição a células CAR T anti-BCMA, enquanto a exposição a células CAR T anti-TNP reduziu a viabilidade em apenas ~ 10% (Tabela 15). Estes resultados demonstram a dependência da citotoxicidade de células CAR T anti-BCMA na especificidade de CAR anti-BCMA. Tabela 15 Célula T Efetora (tratamento com AAV doador) Célula Alvo Viabilidade Celular Alvo (%) α-BCMA/CD28/CD3z TRAC 1 K562 VH-BCMA 38,90 α-BCMA/41BB/CD3z-CISCβ TRAC 1 K562 VH-BCMA 43,40 α-TNP/CD28/CD3ζ CAR K562 VH-BCMA 82,29 α-TNP/41BB/CD3ζ CAR K562 VH-BCMA 79,95
[0402] Experimentos adicionais foram realizados para demonstrar ainda a citotoxicidade específica de CAR usando o construto de CAR anti-BCMA com o domínio coestimulatório 41BB. As células CAR T es- pecíficas de TNP ou específicas de BCMA foram co-cultivadas como descrito acima com células K562 VH-BCMA em diferentes relações de CAR T:células alvo (2:1 a 16:1). Após a co-cultura, as células foram co- radas com DAPI e a frequência de células DAPI-positivas e DAPI-nega- tivas foi medida. A exposição a células CAR T específicas de BCMA, mas não específicas de TNP, fez com que a viabilidade da cultura dimi- nuísse em proporção aproximada à relação E:T, atingindo um nadir de ~ 13% a uma relação E:T de 16:1 (Tabela 16). Na ausência de exposi- ção a CAR T, as células alvo eram > 95% viáveis (não mostrado). Estes resultados demonstram ainda a necessidade de especificidade de BCMA das células efetoras CAR T para matar células alvo que expres- sam BCMA. Tabela 16 Célula T Efetora Viabilidade Celular Alvo (%) 1 2:1 4:11 8:11 16:11 Célula CAR T anti-BCMA 79,97 68,58 27,05 13,10 Célula CAR T Anti-TNP 90,41 80,87 83,52 77,20 1: Relação Efetora-para-Alvo (E:T) Exemplo 8: Integração direcionada no lócus de IL2RG
[0403] Este exemplo demonstra a integração direcionada em um gene IL2RG usando um gRNA direcionado ao gene e um modelo de doador compatível. As células T foram transfectadas com RNPs con- tendo os sgRNAs GC8, GC10 ou GC12 direcionados ao éxon 6 do gene IL2RG e, em seguida, infectadas com um AAV doador FRB / tLNGFR / CNb30 / CISC-gama (SEQ ID NO: 40) em um MOI de 50.000. As con- dições com RNP somente e AAV somente foram incluídas como contro- les. As células foram coradas simultaneamente com anticorpos anti- IL2RG e anti-LNGFR e analisadas por citometria de fluxo um dia e meio após a transfecção. Quatro, quatro, e seis por cento das células expres- saram o transgene tLNGFR ao usar os sgRNAs GC8, GC10 e GC12, respectivamente (Tabela 17). Para todas as amostras tratadas com RNP, mais de 85% das células perderam a expressão de IL2RG. Tabela 17 Tratamento Células Células Células tLNGFR-/ Células tLNGFR-/ tLNGFR+/ tLNGFR+/ IL2RG- (%) IL2RG+ (%) IL2RG- (%) IL2RG+ (%) AAV doador somente 0,31 0,56 39,77 59,36 GC8 RNP somente 0,63 0,21 91,90 7,25 GC10 RNP somente 0,89 0,23 97,64 1,25 GC12 RNP somente 0,67 0,27 89,54 9,51 GC8 RNP + AAV doador 3,93 0,36 89,83 5,88 GC10 RNP + AAV doador 4,25 0,42 93,80 1,54 GC12 RNP + AAV doador 6,24 0,35 86,49 6,92
[0404] Em outro experimento, as células T são transfectadas com RNPs contendo os sgRNAs GC8, GC10 ou GC12 e, em seguida, infec- tadas com um AAV doador FRB / tLNGFR / CNb30 / CISC-gama espe- cífico de sgRNA para prevenir a reclivagem do transgene integrado e para promover o reparo correto de DNA dependente de homologia (por exemplo, SEQ ID NO: 41, 42 ou 43 para sgRNAs GC8, GC10 ou GC12, respectivamente), por exemplo, em um MOI de 50.000. As células são coradas simultaneamente com anticorpos anti-IL2RG e anti-LNGFR e analisadas por citometria de fluxo pós-transfecção (por exemplo, um dia e meio pós-transfecção) para a expressão do transgene tLNGFR e ex- pressão de IL2RG. Exemplo 9: TI simultânea em um gene TRAC e um gene IL2RG
[0405] As células T são transfectadas com um RNP direcionado a TRAC (por exemplo, TRAC 3, TRAC 2 ou TRAC 1 RNP) juntamente com um RNP direcionado a IL2RG (por exemplo, GC8, GC10 ou GC12 RNP). Após a transfecção (por exemplo, trinta minutos após a transfec- ção), as células são infectadas com um AAV doador codificando CAR anti-BCMA / CISC-b direcionado a um gene TRAC (por exemplo, SEQ ID NOs: 28 a 39) e um AAV doador codificando FRB / tLNGFR / CNb30 / CISC-gama direcionado a um gene IL2RG (por exemplo, SEQ ID NOs:
40 a 44) (por exemplo, ambos em MOIs de 50.000). As células são re- cuperadas em meio contendo rapamicina ou um rapalog (por exemplo, rapamicina 1 nM) e mantidas em meio contendo rapamicina / rapalog. As células são ensaiadas por citometria de fluxo pós-transfecção (por exemplo, cinco dias após a transfecção) para expressão de TRAC, ex- pressão de CAR, expressão de IL2RG e / ou expressão de tLNGFR.
[0406] A citometria de fluxo foi realizada para ilustrar a eficiência da integração direcionada dupla. As células T CD8+ foram estimuladas com microesferas de CD3 / CD28 por três dias, as microesferas remo- vidas e, em seguida, um dia depois, as células foram tratadas com TRAC 1 RNP + BCMA CAR-CISCβ AAV e IL2RG GC12 RNP + FRB- tLNGFR-CNb30-CISCγ AAV. O AAV doador foi usado em uma multipli- cidade de infecções de 25.000; TRAC 1 RNP continha 30 pmol de RNA guia e 6 pmol de Cas9; e IL2RG GC12 RNP continha 60 pmol de RNA guia e 12 pmol de Cas9. As células foram recuperadas em meio con- tendo rapamicina a 1 nM e mantidas em meio contendo rapamicina. Um, três e sete dias após o tratamento, as células foram analisadas por ci- tometria de fluxo quanto à presença de tLNGFR e quanto à presença de um CAR anti-BCMA. Nesses experimentos, as eficiências de direciona- mento de lócus único variaram de cerca de 20%, enquanto a frequência de direcionamento duplo (por exemplo, integração direcionada simultâ- nea em ambos os loci) foi de aproximadamente 8% (Tabela 18). Tabela 18 Dia Pós-Tratamento 1 3 7 Células tLNGFR+/ 4,61 8,24 6,35 CAR+ (%) Células tLNGFR+/ 6,99 10,62 13,54 CAR- (%) Células tLNGFR-/ 11,63 14,14 10,34 CAR+ (%) Células tLNGFR-/ 76,77 67,01 69,77 CAR- (%) Viabilidade (%) 96 97 95
Exemplo 10: TI simultânea em TRAC e IL2RG fornece células T re- guláveis por CISC
[0407] As células modificadas do Exemplo 9 ou células não modifi- cadas correspondentes são expandidas na presença de rapamicina, por exemplo, por duas semanas ou em expansão de pelo menos 100 vezes. Após esta expansão, as células são transferidas para meio sem rapa- micina opcionalmente suplementado com IL-2 (por exemplo, 100 ng / mL de IL-2), e a viabilidade das células é monitorada (por exemplo, mo- nitorada todos os dias durante sete dias). Exemplo 11: TI simultânea em TRAC e IL2RG fornece células resis- tentes à ciclosporina
[0408] As células modificadas do Exemplo 9 ou células não modifi- cadas correspondentes são cultivadas na presença de ciclosporina A e rapamicina (ou um rapalog), e a proliferação e / ou viabilidade das célu- las é monitorada. Exemplo 12: TI simultânea em TRAC e IL2RG fornece células ex- pressando BCMA e B2M-CAR
[0409] As células T são transfectadas com um RNP direcionado a TRAC (por exemplo, TRAC 3, TRAC 2, ou TRAC 1 RNP) juntamente com um RNP direcionado a IL2RG (por exemplo, GC8, GC10 ou GC12 RNP). Após a transfecção (por exemplo, trinta minutos pós-transfec- ção), as células são infectadas com um AAV doador codificando CAR anti-BCMA / CISC-b direcionado para TRAC (por exemplo, SEQ ID NOs: 28 a 39) e um AAV doador codificando B2M-CAR / FRB / CNb30 / CISC- gama direcionado a IL2RG (por exemplo, SEQ ID NO: 44) (por exemplo, ambos em MOIs de 50.000). As células são recuperadas em meio con- tendo rapamicina (por exemplo, rapamicina a 1 nM) e mantidas em meio contendo rapamicina. As células são ensaiadas por citometria de fluxo pós-transfecção (por exemplo, cinco dias após a transfecção) para ex- pressão de TRAC, expressão de CAR anti-BCMA, expressão de IL2RG e / ou expressão de B2M CAR. Exemplo 13: Células CAR T BCMA / B2M matam dois tipos diferen- tes de células alvo
[0410] As células modificadas do Exemplo 12 e células não modifi- cadas correspondentes são usadas em um ensaio de citotoxicidade, conforme descrito nos Exemplos 6 e 7, com células alvo expressando BCMA ou células alvo de linfócitos T derivadas de um doador de células T não relacionado do qual as células modificadas são derivadas. Exemplo 14: Células CAR T BCMA matam células de mieloma múl- tiplo in vivo
[0411] As células modificadas do Exemplo 5 e Exemplo 9 são inje- tadas por via intravenosa em camundongos NSG portadores de tumores de mieloma múltiplo de xenoenxerto estabelecidos (por exemplo, deri- vados da linhagem celular RPMI-8226 ou um grupo BCMA-negativo de células RPMI-8226). O tamanho do tumor é monitorado (por exemplo, monitorado todos os dias durante duas semanas após a injeção).
[0412] Cinco milhões de células RPMI-8226 foram implantadas em camundongos NSG e permitiram que formassem tumores. Após deze- nove dias de crescimento do tumor, os camundongos foram injetados com PBS, oito milhões de células CAR T TNP ou oito milhões de células CAR T BCMA. Um camundongo não tratado, um camundongo tratado com células CAR T anti-TNP, e um camundongo com regressão do tu- mor em resposta ao tratamento com células CAR T anti-BCMA foram sacrificados, os tumores foram dissociados, e as suspensões celulares resultantes foram analisadas por fluxo citometria para CD45 humano como um marcador para células CAR T que se infiltraram nos respecti- vos tumores (CD45 é um marcador de leucócitos, e não é expresso em células RPMI-8226). Apenas o camundongo tratado com as células CAR T anti-BCMA apresentou infiltração tumoral das células T humanas administradas, com 12,00% das células do tumor sendo hCD45+, em comparação com 0,05% e 0,19% para o camundongo de controle e o camundongo tratado com células CAR T anti-TNP, respectivamente. Esta população de células hCD45+ foi analisada adicionalmente por ci- tometria de fluxo quanto à expressão de CD8 e CAR humano. Como mostrado na Tabela 19, cerca de 96% dos linfócitos infiltrantes de tumor hCD45+ (TILs) eram CD8+, e 14,66% eram CD8+ e CAR+. Estes resul- tados demonstram que a infiltração tumoral de linfócitos administrados era específica para o tratamento com células CAR T anti-BCMA. Mar- cadores de exaustão, tal como LAG3, TIM3 e PD1, não foram detectá- veis (não mostrados). Tabela 19 Células hCD8+/ Células hCD8+/ Células hCD8-/ Células hCD8-/ CAR+ (%) CAR- (%) CAR+ (%) CAR- (%) 14,66 81,08 0,33 3,94 Exemplo 15: Desgranulação de células T CAR-específicas do antí- geno-específicas
[0413] Para avaliar a desgranulação em células T editadas para ex- pressar um CAR, células CAR T anti-TNP ou células CAR T anti-BCMA foram incubadas por 18 horas com proteína BCMA, células K562 ou cé- lulas K562 VH-BCMA na presença de um anticorpo anti-CD107a (CD107a é um marcador para degranulação em células T citotóxicas) e monensina (para evitar a internalização de CD107a). Após a incubação, as células foram analisadas quanto à expressão de CD107a por citome- tria de fluxo e os resultados são mostrados na Tabela 20. A porcenta- gem de células CAR+ T anti-BCMA na condição de células T CAR+ anti- BCMA + proteína BCMA foi de 25% (dados não mostrados), e a porcen- tagem de células desgranuladas nessa condição foi de 22%, sugerindo que quase todas as células CAR+ T anti-BCMA tratadas com a proteína BCMA foram ativadas para desgranulação. Em contraste, apenas 0,24% das células na condição de célula T CAR anti-TNP + proteína BCMA foram desgranuladas. Estes resultados demonstram a desgranu-
lação de células T CAR-específicas, antígeno-específicas para as célu- las CAR T anti-BCMA. Uma estimulação mais fraca foi observada com células K562 VH-BCMA, e a desgranulação ainda era alvo-específica e CAR-específica. Tabela 20 Tratamento Células CD107a+ (%) Células CAR T anti-BCMA Células CAR T Anti-TNP Sem estímulo 0,06 0,02 Proteína BCMA 22,20 0,24 Células K562 1,53 0,85 Células K562 VH-BCMA 3,82 0,53
[0414] Listagem de Sequências SEQ ID NO Sequência Descrição 1 AGAGCAACAGTGCTGTGGCC TRAC gRNA espaçador TRAC 2 2 TCTCTCAGCTGGTACACGGC TRAC gRNA espaçador TRAC 3 3 ACAAAACTGTGCTAGACATG TRAC gRNA espaçador TRAC 1 4 ACCAGTGCCTGGCATGTAGT IL2RG gRNA espaça- dor GC1 5 CCAGTGCCTGGCATGTAGTA IL2RG gRNA espaça- dor GC2 6 CAGTGCCTGGCATGTAGTAG IL2RG gRNA espaça- dor GC3 7 GTAGGGGCACAACAAATATA IL2RG gRNA espaça- dor GC4 8 GAATCCTTTCCTGTTTGCAT IL2RG gRNA espaça- dor GC5 9 CCTGTTTGCATTGGAAGCCG IL2RG gRNA espaça- dor GC6 10 GAAGCCGTGGTTATCTCTGT IL2RG gRNA espaça- dor GC7 11 GGTTATCTCTGTTGGCTCCA IL2RG gRNA espaça- dor GC8 12 GTTATCTCTGTTGGCTCCAT IL2RG gRNA espaça- dor GC9 13 AAGGCTGATAATCAATCCCA IL2RG gRNA espaça- dor GC10 14 GGAGCCAACAGAGATAACCA IL2RG gRNA espaça- dor GC11 15 CCACGGCTTCCAATGCAAAC IL2RG gRNA espaça- dor GC12 16 GCTTCCAATGCAAACAGGAA IL2RG gRNA espaça- dor GC13 17 TAGAAAAAAGAAAAGCAAAG IL2RG gRNA espaça- dor GC14 18 TTGTGCCCCTACTACATGCC IL2RG gRNA espaça- dor GC15 19 cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcg- TRAC AAV #1 TRAC 2: tcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccgcccaagattgatagcttgtgcctgtcc HA TRAC 2-C11D5.3- ctgagtcccagtccatcacgagcagctggtttctaagatgctatttcccgtataaagcatga- CD8-CD28-CD3z-HA gaccgtgacttgccagccccacagagccccgcccttgtccatcactggcatctggactccagcctgggttggggcaaagagggaaatgagatcatgtcctaaccctgatcctcttgtcc TRAC 2 cacagatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtga- caagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaa cagtgctgtgtgaatgaatgattaattaataaaagatctttattttcattagatctgtgtg- ttggttttttgtgtgatcctcgagggaatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaatacataactgagaatagagaagttcag atcaaggttaggaacagagagacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcag- ttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaaatgaccctg tgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctg- ctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggcgcgcgccagtccggtaccagtcgccaccatggccctgcctgtgacagctctgctcctccctctggccctgctgctcc atgccgccagacccgacatcgtgctgacccagagcccccccagcctggccatgtctctggg- caagagagccaccatcagctgccgggccagcgagagcgtgaccatcctgggcagccacctgatccactggtatcagcagaagcccggccagccccccaccctgctgatccagct cgccagcaatgtgcagaccggcgtgcccgccagattcagcggcagcggcagcagaaccgac- ttcaccctgaccatcgaccccgtggaagaggacgacgtggccgtgtactactgcctgcagagccggaccatcccccggacctttggcggaggcaccaaactggaaatcaagggca gcaccagcggctccggcaagcctggctctggcgagggcagcacaaagggacagattcag- ctggtgcagagcggccctgagctgaagaaacccggcgagacagtgaagatcagctgcaaggcctccggctacaccttcaccgactacagcatcaactgggtgaaaagagcccct ggcaagggcctgaagtggatgggctggatcaacaccgagacaagagagcccgcctacgcc- tacgacttccggggcagattcgccttcagcctggaaaccagcgccagcaccgcctacctgcagatcaacaacctgaagtacgaggacaccgccacctacttttgcgccctggactac agctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgtccagcttcgtgcccg- 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FRB CISC 49 gsntskenpflfaleavvisvgsmgliisllcvyfwler Fragmento ILR2g CISC 50 gsntskenpflfaleavvisvgsmgliisllcvyfwlertmpriptlknledlvteyhgn- Domínio ILR2g CISC fsawsgvskglaeslqpdyserlclvseippkggalgegpgaspcnqhspywappcytlkpet 51 gkdtipwlghllvglsgafgfiilvyllincrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqls- Domínio ILR2b CISC sehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqlllqqdkvpepaslssnhsltscftnqgyfffhlpdaleieacqvyftydpyseedpdegvagaptgsspqplqplsge ddayctfpsrddlllfspsllggpsppstapggsgageermppslqervprdwdpqplg- pptpgvpdlvdfqpppelvlreageevpdagpregvsfpwsrppgqgefralnarlplntdaylslqelqgqdpthlv 52 gvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkfdssrdrnkpfkfmlgkqe- Fragmento CISCγ virgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellklgegsntskenpflfaleavvisvgsmgliisllcvyfwler 53 gvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkfdssrdrnkpfkfmlgkqe- componente CISCγ virgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellklgegsntskenpflfaleavvisvgsmgliisllcvyfwlertmpriptlknledlvteyhgnfsawsgvskgl aeslqpdyserlclvseippkggalgegpgaspcnqhspywappcytlkpet 54 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59 rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr Domínio de ativação CD3zeta 60 divltqsppslamslgkratiscrasesvtilgshlihwyqqkpgqpptlliqlasnvqtgv- CAR anti-BCMA, CD28 parfsgsgsrtdftltidpveeddvavyyclqsrtiprtfgggtkleikgstsgsgkpgsgegstkgqiqlvqsgpelkkpgetvkisckasgytftdysinwvkrapgkglkwmgwintetre payaydfrgrfafsletsastaylqinnlkyedtatyfcaldysyamdywgqgtsvtvssfv- pvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkf srsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr 61 divltqsppslamslgkratiscrasesvtilgshlihwyqqkpgqpptlliqlasnvqtgv- CAR anti-BCMA, 4-1BB parfsgsgsrtdftltidpveeddvavyyclqsrtiprtfgggtkleikgstsgsgkpgsgegstkgqiqlvqsgpelkkpgetvkisckasgytftdysinwvkrapgkglkwmgwintetre payaydfrgrfafsletsastaylqinnlkyedtatyfcaldysyamdywgqgtsvtvs- saaafvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpee eeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrkn- pqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr 62 msrsvalavlallslsgleaiqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdm Domínio de beta-2-mi- croglobulina 63 sdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc Domínio transmem- brana CD8 64 krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel Domínio coestimulató- rio 4-1BB 65 msrsvalavlallslsgleaiqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkn- Receptor quimérico de geriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdmsdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelr beta-2-microglobulina vkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr 66 mgagatgramdgprlllllllgvslggakeacptglythsgecckacnlgegvaqpcgan- Polipeptídeo tLNGFR qtvcepcldsvtfsdvvsatepckpctecvglqsmsapcveaddavcrcaygyyqdettgrceacrvceagsglvfscqdkqntvceecpdgtysdeanhvdpclpctvcedterqlr ectrwadaeceeipgrwitrstppegsdstapstqepeappeqdliastvagvvttvmgssqpvvtrgttdnlipvycsilaavvvglvayiafkr 67 mgneasyplemcshfdadeikrlgkrfkkldldnsgslsveefmslpelqqnplvqrvi- Polipeptídeo CNb30 difdtdgngevdfkefiegvsqfsvkgdkeqklrfafriydmdkdgyisngelfqvlkmmvgnntkladtqlqqivdktiinadkdgdgrisfeefcavvggldihkkmvvdv 68 memwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnvkdltqawdlyyhvfrrisk Polipeptídeo de ocor- rência natural FRB nu 69 memwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnvkdllqawdlyyhvfrrisk Polipeptídeo mutante FRB nu 70 malpvtalllplalllhaarp CD8 sinal 71 mplgllwlglallgalhaqa ER sinal 72 gsgegrgslltcgdveenpgp T2A 73 gsgatnfsllkqagdveenpgp P2A 74 acgtAAGCTTgtgtgaacagagaaacaggagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaag- Promotor MND cagttcctgccccggctcagggccaagaacagttggaacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtcccc agatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaag- gacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcaAAGCT Tacgt 75 aatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaagg- Promotor MSCV catggaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggttaggaacagagagacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcag ggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatca- gatgtttccagggtgccccaaggacctgaaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccac aacccctcactcggc 76 paalgkdtipwlghllvglsgafgfiilvyllincrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqls- Domínio IL2Rβ trun- sehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqlllqqdkvpepaslslntdaylslqelq cado 77 malpvtalllplalllhaarpilwhemwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammerg- Componente CISCβ, pqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnvkdllqawdlyyhvfrriskpaalgkdtipwlghllvglsgafgfiilvyllincrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwl truncado sspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqlllqqdkvpepaslslntdaylslqelq 78 tattaagctcagtcccaaac Sequência alvo de
BCMA 79 ggggccactagggacaggat Sequência alvo de AAVS1 80 tggccgtgaacgttcactgaaatcatggcctcttggccaagattgatagcttgtgcctg- Braço de homologia TRAC tccctgagtcccagtccatcacgagcagctggtttctaagatgctatttcccgtataaagcatgagaccgtgacttgccagccccacagagccccgcccttgtccatcactggcatctggactccagcctgggtt 1 5' ggggcaaagagggaaatgagatcatgtcctaaccctgatcctcttgtcccacagatatcca- gaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaa ctgtgctagac 81 atgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttg- Braço de homologia TRAC catgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccaggtaagggcagctttggtgccttcgcaggctgtttccttgcttcaggaatggccaggttctgcccagagctctggt 1 3' caatgatgtctaaaactcctctgattggtggtctcggccttatccattgccaccaaaac- cctctttttactaagaaacagtgagccttgttctggcagtccagagaatgacacgggaaaaaagcagatgaagagaaggtggcaggagagggcacgtggcccagcctcagtctctccaactgagttcctgcc tgcctgcctttgc
82 ccaagattgatagcttgtgcctgtccctgagtcccagtccatcacgagcagctggtttctaa- Braço de homologia TRAC gatgctatttcccgtataaagcatgagaccgtgacttgccagccccacagagccccgcccttgtccatcactggcatctggactccagcctgggttggggcaaagagggaaatgagatcatgtcctaaccctg 2 5' atcctcttgtcccacagatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactc- taaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagca acagtgctgtg 83 gcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattcca- Braço de homologia TRAC gaagacaccttcttccccagcccaggtaagggcagctttggtgccttcgcaggctgtttccttgcttcaggaatggccaggttctgcccagagctctggtcaatgatgtctaaaactcctctgattggtggtctcg 2 3' gccttatccattgccaccaaaaccctctttttactaagaaacagtgagccttgttctggcag- tccagagaatgacacgggaaaaaagcagatgaagagaaggtggcaggagagggcacgtggcccagcctcagtctctccaactgagttcctgcctgcctgcctttgctcagactgtttgccccttactgctctt ctaggcctc 84 cccatgcctgcctttactctgccagagttatattgctggggttttgaagaagatcctattaa- Braço de homologia TRAC ataaaagaataagcagtattattaagtagccctgcatttcaggtttccttgagtggcaggccaggcctggccgtgaacgttcactgaaatcatggcctcttggccaagattgatagcttgtgcctgtccctgagt 3 5' cccagtccatcacgagcagctggtttctaagatgctatttcccgtataaagcatgagaccg- tgacttgccagccccacagagccccgcccttgtccatcactggcatctggactccagcctgggttggggcaaagagggaaatgagatcatgtcctaaccctgatcctcttgtcccacagatatccagaaccctg accctgcc 85 gtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcac- Braço de homologia TRAC cgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgac 3 3' tttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccag- cccaggtaagggcagctttggtgccttcgcaggctgtttccttgcttcaggaatggccaggttctgcccagagctctggtcaatgatgtctaaaactcctctgattggtggtctcggccttatccattgccaccaa aaccctctttttactaaga 86 caacctctagaaatcaaggtttttctgtgtagggttgggttagcgtgttgttagagtaggg- Braço de homologia GC8 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tccctgagtcccagtccatcacgagcagctggtttctaagatgctatttcccgtataaagcatgagaccgtgacttgccagccccacagagccccgcccttgtccatcactggcatctggactccagcctgggtt CD8-CD28-CD3z-P2A- ggggcaaagagggaaatgagatcatgtcctaaccctgatcctcttgtcccacagatatcca- CISCb-HA TRAC 1 gaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaa ctgtgctagactgaatgaatgattaattaataaaagatctttattttcattagatctgtgtg- ttggttttttgtgtgatcctcgagggaatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggttagg aacagagagacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccgg- ctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagtt cgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaac- ccctcactcggcgcgcgccagtccggtaccagtcgccaccatggccctgcctgtgacagctctgctcctccctctggccctgctgctccatgccgccagacccgacattgtgatgacccagtctcaaaaattcat 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97 atgaaataaaagatctttattttcattagatctgtgtgttggttttttgtgtgaaca- IL2RG AAV cassete: CISC- gagaaacaggagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagttggaacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccc tLNGFR cggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttc- tagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctctatataagcagagctc gtttagtgaaccgtcagatcgccgccaccATGGGTGCTGGCGCAACTGGACGCGCTATGGA-
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Claims (145)
1. Célula T manipulada caracterizada pelo fato de que a) um gene de receptor alfa de célula T (TRA) endógeno modificado para co- dificar um domínio constante de receptor alfa de célula T (TRAC) não funcional; e b) um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR) que pode reconhecer o antígeno de maturação de cé- lulas B (BCMA).
2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o CAR que pode reconhecer BCMA compreende um domínio de reconhecimento de BCMA extracelular, um domínio trans- membrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmático.
3. Célula, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o domínio de reconhecimento de BCMA extracelular é uma porção de anticorpo que pode se ligar especificamente a BCMA.
4. Célula, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a porção do anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende a região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC- CDR3, a região determinante de complementaridade de cadeia leve (LC-CDR)1, LC-CDR2 e LC-CDR3 da SEQ ID NO: 55.
5. Célula, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracteri- zada pelo fato de que a porção de anticorpo é um scFv.
6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que o domínio transmembrana de CAR compreende um domínio transmembrana CD8, o domínio coestimulató- rio de CAR compreende um domínio coestimulatório 4-1BB e / ou CD28, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático de CAR compreende um domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ.
7. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a) o ácido nucleico codificando um CAR que pode reconhecer BCMA é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC ou e b) o ácido nucleico codifi- cando um CAR que pode reconhecer BCMA é inserido em um gene IL2RG endógeno.
8. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente c) um ou mais ácidos nucleicos codificando componentes polipeptídicos de um complexo de sinalização induzida por produtos químicos ativável por dimerização (CISC), em que os componentes polipeptídicos do CISC compreendem: i) um primeiro componente de CISC compreendendo um pri- meiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização ou porção do mesmo; e ii) um segundo componente de CISC compreendendo um se- gundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um domí- nio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de sinali- zação ou porção do mesmo; em que o primeiro componente de CISC e o segundo com- ponente de CISC são configurados de modo que, quando expressos, eles dimerizam na presença do ligando para criar um CISC competente em sinalização.
9. Célula, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização do primeiro componente de CISC compreende um domínio de sinalização citoplasmático de recep- tor de IL-2 subunidade gama (IL2Rγ).
10. Célula, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático IL2Rγ compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
11. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo.
12. Célula, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o domínio FKBP compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 47 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47.
13. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização do se- gundo componente de CISC compreende um domínio de sinalização citoplasmático do receptor de IL-2 subunidade beta (IL2Rβ).
14. Célula, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático IL2Rβ compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.
15. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma porção do mesmo.
16. Célula, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a FRB compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
17. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações
8 a 16, caracterizada pelo fato de que o domínio transmembrana do pri- meiro e do segundo componente de CISC compreende, independente- mente, um domínio transmembrana do receptor de IL-2.
18. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 17, caracterizada pelo fato de que 1) os um ou mais ácidos nucleicos codificando o primeiro componente de CISC são inseridos em um gene IL2RG endógeno e um ou mais ácidos nucleicos codificando o segundo componente de CISC são inseridos no região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC; ou 2) os um ou mais ácidos nucleicos co- dificando o primeiro componente de CISC são inseridos na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC e os um ou mais áci- dos nucleicos codificando o segundo componente de CISC são inseri- dos no gene IL2RG endógeno.
19. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o ligando é rapamicina ou um análogo da rapamicina (rapalog).
20. Célula, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindol- rapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903 ou AP23573, ou metabólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos.
21. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o ligando está presente ou é for- necido em uma quantidade de 0,05 nM a 100 nM.
22. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente d) um ou mais ácidos nucleicos codificando um receptor quimérico com- preendendo um domínio de β2-microglobulina extracelular, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinaliza- ção citoplasmático.
23. Célula, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o domínio transmembrana do receptor quimérico com- preende um domínio transmembrana CD8, o domínio coestimulatório do receptor quimérico compreende um domínio coestimulatório 4-1BB, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático do receptor quimérico com- preende um domínio de sinalização citoplasmático CD3- ζ.
24. Célula, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o receptor quimérico compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 65 ou uma variante da mesma tendo pelo me- nos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65.
25. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizada pelo fato de que d) um ou mais ácidos nucleicos codificando o receptor quimérico são inseridos na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC ou d) um ou mais ácidos nuclei- cos codificando o receptor quimérico são inseridos em um gene IL2RG endógeno.
26. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente g) um ácido nucleico codificando um marcador selecionável.
27. Célula, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o marcador selecionável é um polipeptídeo truncado do receptor do fator de crescimento do nervo de baixa afinidade (tLNGFR).
28. Célula, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tLNGFR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
29. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico codificando o marcador selecionável é inserido na região do gene TRA endógeno co- dificando o domínio TRAC ou o ácido nucleico codificando o marcador selecionável é inserido em um gene IL2RG endógeno.
30. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente e) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina.
31. Célula, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina confere resistência ao tacrolimus (FK506) e / ou ciclosporina A (CsA).
32. Célula, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracte- rizada pelo fato de que o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina é um polipeptídeo de calcineurina (CN) mutante.
33. Célula, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo CN mutante confere resistência a tacro- limus (FK506) e ciclosporina A (CsA).
34. Célula, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracte- rizada pelo fato de que o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67).
35. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calci- neurina é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o do- mínio TRAC ou o ácido nucleico codificando o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina é inserido em um gene IL2RG endógeno.
36. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente f) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo de domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR).
37. Célula, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de domínio FRB é expresso intracelular- mente.
38. Célula, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracte- rizada pelo fato de que o polipeptídeo de domínio FRB compreende o aminoácido da SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante tendo pelo menos 90% de homologia de sequência com o aminoácido da SEQ ID NO: 68 ou 69.
39. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico codificando o polipeptídeo de domínio FRB é inserido na região do gene TRA endó- geno codificando o domínio TRAC ou o ácido nucleico codificando o po- lipeptídeo de domínio FRB é inserido em um gene IL2RG endógeno.
40. RNA guia (gRNA) caracterizado pelo fato de que com- preende uma sequência que é complementar a uma sequência em um gene TRA endógeno dentro ou próximo de uma região codificando o domínio TRAC.
41. gRNA, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3, ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3.
42. RNA guia (gRNA) caracterizado pelo fato de que com- preende uma sequência que é complementar a uma sequência dentro ou próxima de um gene IL2RG endógeno.
43. gRNA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18.
44. Sistema, caracterizado pelo fato de que compreende a) um primeiro gRNA e / ou um segundo gRNA, em que o primeiro gRNA é o gRNA como definido na reivindicação 40 ou 41 e o segundo gRNA é o gRNA como definido na reivindicação 42 ou 43; e b) uma endonu- clease guiada por RNA (RGEN) ou um ácido nucleico codificando o RGEN.
45. Sistema, de acordo com a reivindicação 44, caracteri- zado pelo fato de que compreende adicionalmente c) um ou mais mo- delos de doadores compreendendo ácido nucleico codificando: i) um CAR que pode reconhecer um polipeptídeo de antígeno de maturação de células B (BCMA); ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um pri- meiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização ou porção do mesmo ou derivado funcional do mesmo; e iii) um segundo componente de CISC compreendendo um segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um do- mínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de si- nalização ou porção do mesmo, em que o primeiro componente de CISC e o segundo com- ponente de CISC são configurados de modo que, quando expressos por uma célula T, eles dimerizam na presença de um ligando para criar um CISC competente em sinalização capaz de promover a sobrevida e / ou proliferação da célula T.
46. Sistema, de acordo com a reivindicação 45, caracteri- zado pelo fato de que o CAR que pode reconhecer BCMA compreende um domínio de reconhecimento de BCMA extracelular, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinaliza- ção citoplasmático.
47. Sistema, de acordo com a reivindicação 46, caracteri- zado pelo fato de que o domínio de reconhecimento de BCMA extrace- lular é uma porção de anticorpo que pode se ligar especificamente a BCMA.
48. Sistema, de acordo com a reivindicação 47, caracteri- zado pelo fato de que a porção do anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo a região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC- CDR3, região determinante de complementaridade de cadeia leve (LC-CDR)1, LC-CDR2 e LC- CDR3 da SEQ ID NO: 55.
49. Sistema, de acordo com a reivindicação 47 ou 48, carac- terizado pelo fato de que a porção de anticorpo é um scFv.
50. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 49, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana de CAR compreende um domínio transmembrana CD8, o domínio co- estimulatório de CAR compreende um domínio coestimulatório 4-1BB e / ou CD28, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático de CAR com- preende um domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ.
51. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 50, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização do primeiro componente de CISC compreende um domínio do receptor de IL-2 subunidade gama (IL2Rγ).
52. Sistema, de acordo com a reivindicação 51, caracteri- zado pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático IL2Rγ compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 50.
53. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 52, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de liga- ção extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio da pro- teína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo.
54. Sistema, de acordo com a reivindicação 53, caracteri- zado pelo fato de que o domínio FKBP compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47.
55. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 54, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização do segundo componente de CISC compreende um domínio do receptor de IL-2 subunidade beta (IL2Rβ).
56. Sistema, de acordo com a reivindicação 55, caracteri- zado pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático IL2Rβ compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 51.
57. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 56, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de li- gação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma porção do mesmo.
58. Sistema, de acordo com a reivindicação 57, caracteri- zado pelo fato de que a FRB compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
59. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 58, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana do primeiro e do segundo componente de CISC compreende, indepen- dentemente, um domínio transmembrana do receptor de IL-2.
60. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 59, caracterizado pelo fato de que o ligando é rapamicina ou um rapalog.
61. Sistema, de acordo com a reivindicação 60, caracteri- zado pelo fato de que o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3- metilindolrapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903 ou AP23573, ou metabólitos, deriva- dos e / ou combinações dos mesmos.
62. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 61, caracterizado pelo fato de que c) um ou mais modelos de doadores compreendem adicionalmente ácido nucleico codificando um ou mais de: iv) um receptor quimérico compreendendo um domínio de β2-microglobulina extracelular, um domínio transmembrana, um domí- nio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmático; v) um marcador selecionável; vi) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais ini- bidores de calcineurina; ou vii) um polipeptídeo de domínio de ligação FKBP - rapami- cina (FRB) do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR).
63. Sistema, de acordo com a reivindicação 62, caracteri- zado pelo fato de que o domínio transmembrana do receptor quimérico compreende um polipeptídeo de domínio transmembrana CD8, o domí- nio coestimulatório do receptor quimérico compreende um domínio co- estimulatório 4-1BB, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático do receptor quimérico compreende um domínio de sinalização citoplasmá- tico CD3 -ζ.
64. Sistema, de acordo com a reivindicação 63, caracteri- zado pelo fato de que o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65.
65. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 62 a 64, caracterizado pelo fato de que o marcador selecionável é um polipeptídeo truncado do receptor do fator de crescimento do nervo de baixa afinidade (tLNGFR).
66. Sistema, de acordo com a reivindicação 65, caracteri- zado pelo fato de que o polipeptídeo tLNGFR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
67. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 62 a 66, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que confere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina é um polipeptídeo de calcineurina (CN) mutante.
68. Sistema, de acordo com a reivindicação 67, caracteri- zado pelo fato de que o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67).
69. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 62 a 68, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de domínio FRB compreende o aminoácido da SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma vari- ante tendo pelo menos 90% de homologia de sequência com o amino- ácido da SEQ ID NO: 68 ou 69.
70. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 44 a 69, caracterizado pelo fato de que o RGEN é selecionado a partir do grupo que consiste em uma endonuclease Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecido como Csn1 e Csx12), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb3, Csb1, Cs17 Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 e Cpf1, ou um derivado funcional das mesmas.
71. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 44 a 70, caracterizado pelo fato de que o RGEN é Cas9.
72. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 44 a 71, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico codifi- cando o RGEN é uma sequência de ácido ribonucleico (RNA).
73. Sistema, de acordo com a reivindicação 72, caracteri- zado pelo fato de que a sequência de RNA codificando o RGEN está ligada ao primeiro gRNA ou ao segundo gRNA por meio de uma ligação covalente.
74. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 73, caracterizado pelo fato de que compreende um vetor de vírus adenoassociado (AAV) que compreende um de um ou mais mo- delos de doadores.
75. Sistema, de acordo com a reivindicação 74, caracteri- zado pelo fato de que o vetor AAV compreende a sequência polinucle- otídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 46 e variantes das mes- mas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleo- tídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 46.
76. Sistema, de acordo com a reivindicação 74 ou 75, carac- terizado pelo fato de que compreende o primeiro gRNA e um primeiro vetor AAV e o segundo gRNA e um segundo vetor AAV, em que: (A) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID
NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs : 40 a 44 ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência poli- nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica de SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs : 40 a 44 ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica de SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID
NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência polinu- cleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs : 40 a 44 ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44.
77. Sistema, de acordo com a reivindicação 74 ou 75, carac- terizado pelo fato de que compreende: (A) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 19 ou 22 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 19 ou 22, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 20 ou 23 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 20 ou 23, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante deste tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 45.
78. Sistema, de acordo com a reivindicação 74 ou 75, carac- terizado pelo fato de que compreende: (A) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46;
(B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 27 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 27, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46.
79. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 44 a 78, caracterizado pelo fato de que compreende um complexo de ribonucleoproteína (RNP) compreendendo o RGEN e o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA.
80. Sistema, de acordo com a reivindicação 79, caracteri- zado pelo fato de que o RGEN é pré-complexado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA em uma relação molar de gRNA para RGEN entre 1:1 e 20:1, respectivamente, para formar o RNP.
81. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a se- quência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 46, ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 a 46.
82. Vetor, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o vetor é um Vetor de Vírus Adenoassociado (AAV).
83. Método de edição do genoma de uma célula, caracteri- zado pelo fato de que compreende fornecer à célula: a) um primeiro gRNA e / ou um segundo gRNA, em que o primeiro gRNA é o gRNA como definido na reivindicação 40 ou 41 e o segundo gRNA é o gRNA como definido na reivindicação 42 ou 43; b) um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN; e c) um ou mais modelos de doadores compreendendo o ácido nucleico codificando: i) um CAR que pode reconhecer um polipeptídeo BCMA; ii) um primeiro componente de CISC compreendendo um pri- meiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de sinalização ou porção do mesmo, ou derivado funcional do mesmo; e iii) um segundo componente de CISC compreendendo um segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo, um do- mínio de dobradiça, um domínio transmembrana, e um domínio de si- nalização ou porção do mesmo, em que o primeiro componente de CISC e o segundo com- ponente de CISC são configurados de modo que, quando expressos por uma célula T, eles dimerizam na presença de um ligando para criar um
CISC competente em sinalização capaz de promover a sobrevida e / ou proliferação da célula T.
84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o CAR que pode reconhecer BCMA compreende um domínio de reconhecimento de BCMA extracelular, um domínio trans- membrana, um domínio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmático.
85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o domínio de reconhecimento de BCMA extracelular é uma porção de anticorpo que pode se ligar especificamente a BCMA.
86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que a porção de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende a região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC- CDR3, região determinante de complementaridade de cadeia leve (LC-CDR)1, LC-CDR2 e LC-CDR3 da SEQ ID NO: 55.
87. Método, de acordo com a reivindicação 85 ou 86, carac- terizado pelo fato de que a porção de anticorpo é um scFv.
88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 87, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana de CAR compreende um domínio transmembrana CD8, o domínio coesti- mulatório de CAR compreende um domínio coestimulatório 4-1BB e / ou CD28, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático de CAR compre- ende um domínio de sinalização citoplasmático CD3-ζ.
89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 88, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização do primeiro componente de CISC compreende um domínio de sinalização citoplasmático do receptor de IL-2 subunidade gama (IL2Rγ).
90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático IL2Rγ compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50.
91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 90, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio da proteína de ligação FK506 (FKBP) ou uma porção do mesmo.
92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o domínio FKBP compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 47 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47.
93. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 92, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização do segundo componente de CISC compreende um domínio de sinalização citoplasmático do receptor de IL-2 subunidade beta (IL2Rβ).
94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático IL2Rβ compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51.
95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 94, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação extracelular ou porção do mesmo compreende um domínio de ligação FKBP - rapamicina (FRB) ou uma porção do mesmo.
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o domínio FRB compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 48 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
83 a 96, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana do primeiro e do segundo componente de CISC compreende, independen- temente, um domínio transmembrana do receptor de IL-2.
98. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 97, caracterizado pelo fato de que o ligando é rapamicina ou um rapalog.
99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindol- rapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903 ou AP23573, ou metabólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos.
100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 99, caracterizado pelo fato de que c) um ou mais modelos de doadores compreendem ainda ácido nucleico codificando um ou mais de: iv) um receptor quimérico compreendendo um domínio de β2-microglobulina extracelular, um domínio transmembrana, um domí- nio coestimulatório, e um domínio de sinalização citoplasmático; v) um marcador selecionável; vi) um polipeptídeo que confere resistência a um ou mais ini- bidores de calcineurina; ou vii) um polipeptídeo de domínio de ligação FKBP - rapami- cina (FRB) do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR).
101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracteri- zado pelo fato de que o domínio transmembrana do receptor quimérico compreende um polipeptídeo de domínio transmembrana CD8, o domí- nio coestimulatório do receptor quimérico compreende um domínio co- estimulatório 4-1BB, e / ou o domínio de sinalização citoplasmático do receptor quimérico compreende um domínio de sinalização citoplasmá- tico CD3 -ζ.
102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65
103. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 100 a 102, caracterizado pelo fato de que o marcador selecionável é um polipeptídeo truncado do receptor do fator de crescimento do nervo de baixa afinidade (tLNGFR).
104. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracteri- zado pelo fato de que o polipeptídeo tLNGFR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
105. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 100 a 104, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que con- fere resistência a um ou mais inibidores de calcineurina é um polipeptí- deo de calcineurina (CN) mutante.
106. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracteri- zado pelo fato de que o polipeptídeo CN mutante é CNb30 (SEQ ID NO: 67).
107. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 100 a 106, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo do domí- nio FRB compreende o aminoácido da SEQ ID NO: 68 ou 69 ou uma variante tendo pelo menos 90% de homologia de sequência com o ami- noácido da SEQ ID NO: 68 ou 69.
108. Método de edição do genoma de uma célula, caracteri- zado pelo fato de que compreende fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um primeiro vetor e um segundo vetor, em que
(A) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 28, 31, 34 e 37, o segundo gRNA com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer um das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29, 32, 35 e 38, o segundo gRNA com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer um das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante deste tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos
85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36 e 39, o segundo gRNA com- preende a sequência polinucleotídica de qualquer um das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44 ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 44.
109. Método de edição do genoma de uma célula, caracteri- zado pelo fato de que compreende fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um primeiro vetor e um segundo vetor, em que: (A) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 19 ou 22 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 19 ou 22, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45;
(B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 20 ou 23 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 20 ou 23, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 21 ou 24, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequên- cia polinucleotídica da SEQ ID NO: 45 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 45.
110. Método de edição do genoma de uma célula, caracteri- zado pelo fato de que compreende fornecer à célula um primeiro gRNA, um segundo gRNA, um RGEN ou um ácido nucleico codificando o RGEN, um primeiro vetor e um segundo vetor, em que:
(A) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 25, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ; (B) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 2, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 26, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46 ; ou (C) o primeiro gRNA compreende a sequência polinucleotí- dica da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 3, o primeiro vetor AAV compreende a sequência polinucleotídica da SEQ
ID NO: 27 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homo- logia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 27, o segundo gRNA compreende a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18 e variantes das mesmas tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 18, e o segundo vetor AAV compreende a sequência poli- nucleotídica da SEQ ID NO: 46 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 85% de homologia com a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 46.
111. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 110, caracterizado pelo fato de que o RGEN é selecionado a partir do grupo que consiste em uma endonuclease Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecido como Csn1 e Csx12 ), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 e Cpf1, ou um derivado fun- cional das mesmas.
112. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 111, caracterizado pelo fato de que o RGEN é Cas9.
113. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 112, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico codifi- cando o RGEN é uma sequência de ácido ribonucleico (RNA).
114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteri- zado pelo fato de que a sequência de RNA codificando o RGEN está ligada ao primeiro gRNA ou ao segundo gRNA por meio de uma ligação covalente.
115. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 114, caracterizado pelo fato de que o modelo de doador está contido em um vetor AAV.
116. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 115, caracterizado pelo fato de que o RGEN é pré-comple- xado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA, formando um com- plexo de RNP, antes do fornecimento à célula.
117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracteri- zado pelo fato de que o RGEN é pré-complexado com o primeiro gRNA e / ou o segundo gRNA em uma relação molar de gRNA para RGEN entre 1:1 e 20:1, respectivamente.
118. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 117, caracterizado pelo fato de que um ou mais modelos de doadores são, independentemente, inseridos no genoma da célula.
119. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracteri- zado pelo fato de que um primeiro modelo de doador é inserido em, dentro ou próximo a um gene TRA ou elemento regulador de gene e / ou um segundo modelo de doador é inserido em, dentro ou próximo a um gene IL2RG ou elemento regulador de gene.
120. Método, de acordo com a reivindicação 118 ou 119, ca- racterizado pelo fato de que o ácido nucleico codificando i) o primeiro componente de CISC é inserido em um gene IL2RG endógeno e / ou ácido nucleico codificando ii) o segundo componente de CISC é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC; ou ácido nucleico codificando i) o primeiro componente de CISC é inserido na região do gene TRA endógeno codificando o domínio TRAC, e / ou o ácido nucleico codificando ii) o segundo componente de CISC é inse- rido no gene IL2RG endógeno.
121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 120, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula T.
122. Método, de acordo com a reivindicação 121, caracteri- zado pelo fato de que a célula T é um linfócito T citotóxico CD8+ ou uma célula T pan CD3+.
123. Método, de acordo com a reivindicação 121 ou 122, ca- racterizado pelo fato de que a célula T é um membro de um grupo de células T derivadas de múltiplos doadores.
124. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracteri- zado pelo fato de que os múltiplos doadores são doadores humanos.
125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 124, caracterizado pelo fato de que a célula é citotóxica para as células plasmáticas.
126. Célula manipulada caracterizada pelo fato de que é pro- duzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 83 a 125.
127. Célula manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39 e 126, caracterizada pelo fato de que a célula ma- nipulada é citotóxica para as células plasmáticas.
128. Método de tratamento da doença de enxerto vs hospe- deiro (GvHD) ou doença autoimune em um indivíduo em necessidade de tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a célula manipulada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 ou 126 ao indivíduo.
129. Método de tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade de tratamento, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é constituída pela produção adversa de anti- corpos, compreendendo: a) editar o genoma de células T de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 83 a 120, produ- zindo assim células T manipuladas; e b) administrar as células T manipuladas ao indivíduo.
130. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracteri- zado pelo fato de que as células T são autólogas ao indivíduo.
131. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracteri- zado pelo fato de que as células T são alogênicas ao indivíduo.
132. Método, de acordo com a reivindicação 131, caracteri- zado pelo fato de que as células T compreendem um grupo de células T derivadas de múltiplos doadores.
133. Método, de acordo com a reivindicação 132, caracteri- zado pelo fato de que os múltiplos doadores são doadores humanos.
134. Método de tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade de tratamento, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é constituída pela produção adversa de anti- corpos, compreendendo editar o genoma de uma célula T no indivíduo de acordo com o método como definido em qualquer uma de reivindica- ções 83 a 120.
135. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 129 a 134, caracterizado pelo fato de que as células T compreen- dem células T citotóxicas CD8+ ou células T pan CD3+.
136. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 128 a 135, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.
137. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 128 a 136, caracterizado pelo fato de que compreende adicional- mente administrar rapamicina ou um rapalog ao indivíduo.
138. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracteri- zado pelo fato de que o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3- metilindolrapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903 ou AP23573, ou metabólitos, deriva- dos e / ou combinações dos mesmos.
139. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 137 a 138, caracterizado pelo fato de que a rapamicina ou o rapa- log é administrado em uma concentração de 0,05 nM a 100 nM.
140. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 129 a 139, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é doença de enxerto vs hospedeiro (GvHD), doença autoimune mediada por anticorpo, ou amiloidose de cadeia leve.
141. Método, de acordo com a reivindicação 140, caracteri- zado pelo fato de que a doença ou condição é GvHD e o indivíduo re- cebeu previamente um transplante alogênico.
142. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende instru- ções de uso e a) a célula manipulada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 ou 126 e / ou um ou mais componentes do sistema como definido em qualquer uma das reivindicações 44 a 80; e / ou b) rapamicina ou um rapalog.
143. Kit, de acordo com a reivindicação 142, caracterizado pelo fato de que o rapalog é selecionado a partir do grupo que consiste em everolimus, CCI-779, C20-metalilrapamicina, C16-(S)-3-metilindol- rapamicina, C16-iRap, AP21967, ácido micofenólico de sódio, cloridrato de benidipina, AP1903 ou AP23573, ou metabólitos, derivados e / ou combinações dos mesmos.
144. Seringa, caracterizada pelo fato de que compreende a célula manipulada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 ou 126, ou uma composição compreendendo um ou mais com- ponentes do sistema como definido em qualquer uma das reivindica- ções 44 a 80.
145. Cateter, caracterizado pelo fato de que compreende a célula manipulada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 ou 126, ou uma composição compreendendo um ou mais com- ponentes do sistema como definido em qualquer uma das reivindica- ções 44 a 80.
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