CN116970609A - 用于清除hbv病毒的基因片段、其工具系统及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于清除HBV病毒的基因片段、其工具系统及应用。该基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10之一。根据上述基因片段合成出相应的crRNA，应用于I‑B型CRISPR‑Cascade‑Cas3基因编辑系统后即形成工具系统，能够对HBV感染的病毒库cccDNA进行清除，实现HBV病毒特异的长片段清除，在乙肝病毒感染的临床治愈上具有巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及用于清除HBV病毒的基因片段、其工具系统及应用，属于生物技术、生物医药技术领域。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种能够引起多种肝脏疾病(包括肝炎，肝纤维化，肝细胞癌)的病毒。在全世界范围内，慢性乙肝感染者有近3.5亿人，而其中近三分之一感染者在我国。乙型肝炎病毒给全世界尤其是我国的医疗卫生体系带来了巨大的挑战。目前针对HBV的治疗方法主要包括两种：1.采用α干扰素(IFN-α)、聚乙二醇化α干扰素(PEG-IFN-α)进行治疗，以干扰素治疗HBV感染的机制目前尚未完全明确，普遍认为可能是通过直接抑制病毒复制或者通过免疫调节作用来实现治疗。2.采用核苷类似物进行治疗，当前临床使用的核苷类似物主要包括拉米夫定，阿德福韦酯，恩替卡韦，替诺夫韦，替比夫定等；这些药物主要作用于乙肝病毒的逆转录酶，通过抑制病毒的逆转录从而抑制病毒的复制。但是，当前的这些药物都只能抑制病毒的复制，并不能直接清除已经存在的病毒基因组DNA，复发率高，且需要长期用药。因此，当前迫切需要研制出能够清除HBV基因组DNA从而实现功能性治愈效果的技术手段。
目前已经有技术方案利用CRISPR-Cas9基因编辑系统通过切割双链DNA造成碱基的插入或缺失(InDel)来沉默基因表达(例如授权公告号CN106754912B的发明专利)，然而此类技术方案并不能实现DNA长片段的清除，对于HBV病毒库cccDNA的清除效率仍然较低。根据文献1记载的内容可知，如图1所示，CRISPR-Cas9系统对乙肝病毒抗原和病毒DNA拷贝数的降低幅度不足50％，清除病毒的效果非常有限；根据文献2记载的内容可知，如图2所示，在动物实验中CRISPR-Cas9系统也有类似效果，只能部分降低病毒载量，无法实现彻底的清除。
文献1：Jie Wang,et al.Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 systeminhibitshepatitis B virus replication.World Journal of Gastroenterol,2015,21(32):9554-9565.
文献2：Daniel Stone,et al.CRISPR-Cas9 gene editing of hepatitis Bvirus in chronically infected humanized mice.Molecular Therapy:Methods&Clinical Development,2021,20:258-275.
本发明的发明人课题组于2022年9月19日申请的发明专利《一种I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统及应用》中，公开了I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统，能够使单个CRISPR靶向位点形成不同程度的长片段缺失，从而弥补CRISPR-Cas9产生长片段缺失的能力相对有限的空白。目前经进一步研究得出了该I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统用于清除HBV病毒的应用成果，并以此来申报本发明专利。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种用于清除HBV病毒的基因片段，将其对应的crRNA与I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统相配合后，能够有效清除HBV病毒DNA；同时还提供含有该基因片段的工具系统，以及相关应用。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
用于清除HBV病毒的基因片段，其特征是，所述基因片段与crRNA相对应；所述基因片段的基本结构为5'-tgagcac-子片段-gtgtccaaaccattgatgccgtaag gcgt-3'；所述基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10之一。
优选地，所述基因片段的序列为SEQ ID No.5。
根据上述基因片段可合成出相应的crRNA，用于清除HBV病毒。
本发明还提供：
与前文所述基因片段对应的crRNA。
优选地，所述crRNA的3'端和5'端各有3个碱基进行了硫代修饰和甲氧基修饰。
上述crRNA与I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统相配合后，能够对HBV感染的病毒库cccDNA进行清除，实现HBV病毒特异的长片段清除，在乙肝病毒感染的临床治愈上具有巨大潜力。
本发明还提供：
一种工具系统，其特征是，所述工具系统含有前文所述的crRNA；所述工具系统为Cas3基因编辑系统。
优选地，所述Cas3基因编辑系统为I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统。
优选地，所述I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统由Cascade复合物以及Cas3蛋白组成；所述crRNA位于Cascade复合物中；所述Cascade复合物由Cmx8蛋白、Cas8蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas11蛋白以及crRNA复合而成；所述Cmx8蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.11；所述Cas8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.12；所述Cas5蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.13；所述Cas6蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.14；所述Cas11蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；所述Cas3蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.16。
上述工具系统能够有效清除乙肝病毒。
本发明还提供：
前文所述基因片段、或前文所述crRNA、或前文所述工具系统用于制备清除HBV病毒的产品的应用。
优选地，所述产品为治疗乙肝的药物。
含有前文所述工具系统的细胞系或细胞株。
与现有技术相比，本发明的系列基因片段所对应的crRNA分别与I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统相配合后，能够对HBV感染的病毒库cccDNA进行清除，实现HBV病毒特异的长片段清除，在乙肝病毒感染的临床治愈上具有巨大潜力。
附图说明
图1为本发明背景技术中文献1记载的CRISPR-Cas9系统在细胞系中清除乙肝病毒效果图。
图2为本发明背景技术中文献2记载的肝人源化小鼠模型AAV递送Cas9体内给药效果图。
图3为本发明实施例3的细胞实验路线图。
图4为本发明实施例3中降低HBsAg水平的效果示意图。
图5为本发明实施例3中降低病毒DNA水平的效果示意图。
图6为本发明实施例3中效果最好的crRNA降低HBsAg、HBeAg、以及病毒DNA水平的效果示意图。
图7为本发明实施例4中降低HBsAg水平的效果示意图。
图8为本发明实施例4中降低病毒DNA水平的效果示意图。
具体实施方式
本发明利用I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统，通过反复深入地系统性试验研究，得到了靶向HBV基因的系列基因片段，这些基因片段所对应的crRNA分别与I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统相配合后，能够有效清除HBV病毒DNA。
具体而言，系列基因片段的基本结构为5'-tgagcac-子片段-gtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt-3'。各基因片段的具体序列如下所示(各子片段以大写字母表示)：
SEQ ID No.1：
tgagcacCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.2：
tgagcacTTAGTATACCTTGGACTCATAAGGTGGGAAACTTTgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.3：
tgagcacATAAAACGCCGCAGACACATCCAACGATAACCAGGgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.4：
tgagcacTTGTACAGACTTGGCCCCCAATACCACATCATCCAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.5：
tgagcacCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.6：
tgagcacAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.7：
tgagcacCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.8：
tgagcacAAAAACCCCGCCTGTAACACGAGCAGGGGTCCTAGgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.9：
tgagcacAACCAACAAGAAGATGAGGCATAGCAGCAGGATGAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.10：
tgagcacATGTTGTACAGACTTGGCCCCCAATACCACATCATgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
其中，优选SEQ ID No.5。
各基因片段对应的crRNA中，在3'端、5'端各有3个碱基进行了硫代修饰和甲氧基修饰以提高其稳定性。
本发明用于清除HBV病毒的工具系统由Cascade复合物以及Cas3蛋白组成；Cascade复合物由Cmx8蛋白、Cas8蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas11蛋白以及crRNA复合而成；Cmx8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.11；Cas8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.12；Cas5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.13；Cas6蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.14；Cas11蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；Cas3蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.16；与crRNA对应的基因片段为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10之一，且优选SEQ ID No.5。
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1
本实施例为靶向HBV DNA的crRNA的设计。
以HBV-B基因型序列为基础，通过比对各基因型的序列在保守区域内查找具备PAM的位点，经设计筛选后得到10条crRNA序列，由金斯瑞公司的SafeEdit合成服务提供HPLC纯化级别的crRNA，其中3'端和5'端各有3个硫代和氧甲基修饰，通过修饰提高RNA的稳定性。
各crRNA对应的基因片段序列如下表所示：
实施例2
本实施例为制备Cascade-Cas3的mRNA。
以携带cas3、cmx8、cas8、cas5、cas6、cas11基因的无内毒素线性质粒作为模板，按照mMessage mMachine T7 Ultra试剂盒的操作说明来进行体外转录，其中用N1-甲基假尿苷三磷酸(m1Ψ-5'-triphosphate)替代尿苷三磷酸(Uridine triphosphate)，并且补加120nt的poly(A)tail。反应产物经过纤维素法柱层析分离纯化后保存于-20℃，备用。
实施例3
本实施例为在HepG2细胞系中测试本发明系统病毒清除效果，具体路线图如图3所示。
将乙肝病毒表达载体pHBV1.3转染的HepG2细胞(HepG-AD38)培养48小时，分别用乙型肝炎病毒表面s抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)诊断试剂通过酶联免疫法(ELISA法)检测培养基中HBV分泌抗原HBsAg和HBeAg的浓度，确定转染成功后收集细胞并电转Cascade-Cas3 mRNA(见实施例2)和各crRNA(见实施例1)，使用Invitrogen Neon TransfectionSystem进行电转操作，之后将细胞进行继续培养72小时，分别用上述抗原检测试剂盒检测HBsAg和HBeAg浓度，并收集细胞裂解检测HBV DNA含量，通过比较抗原和DNA浓度的降低水平筛选效果最好的crRNA进入下一步小鼠模型测试。
如图4、图5所示，各crRNA与Cascade-Cas3配合后均具有清除效果。其中，SEQ IDNo.5对应的crRNA清除效果最好，该crRNA与对照组Ctrl的对比效果如图6所示。
实施例4
本实施例为在水动力注射小鼠模型中研究本发明系统对HBV的清除作用。
通过水动力学注射(hydrodynamic injection，HDI)将乙型肝炎病毒的复制子pHBV1.3通过高压尾静脉注射的方法注射到小鼠体内，从而构建乙型肝炎病毒的小鼠模型。一周后取少量小鼠血清稀释后用ELISA法测其中的乙型肝炎病毒表面s抗原(HBsAg)，从小鼠血清中提取HBV DNA，并用qPCR检测其中的HBV DNA含量，确定乙肝小鼠模型构建成功。以LNP包裹的方式进行体内递送，具体为注射Cascade-Cas3 mRNA(见实施例2)和实施例3筛选出的SEQ ID No.5对应的crRNA(均以LNP包裹)，在后面1-5周在不同的时间点分别采集血液，检测乙肝抗原和病毒DNA水平，并分析病毒清除效果。
为与Cascade-Cas9系统进行效果对比，采用背景技术提到的文献2所记载的Cascade-Cas9系统及其sgRNA通过上述实验过程进行测试。
如图7、图8所示，结果表明，与Cascade-Cas9系统相比，本实施例采用的Cascade-Cas3系统具有更好的清除效果。由此可见，相比于现有以Cascade-Cas9通过导致双链DNA断裂的方法来清除HBV病毒cccDNA，本发明采用I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统后，通过利用其长片段清除的特点清除病毒具有明显优势，有希望成为治愈乙肝的技术手段。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.用于清除HBV病毒的基因片段，其特征是，所述基因片段与crRNA相对应；所述基因片段的基本结构为5'-tgagcac-子片段-gtgtccaaaccattgatgccgta aggcgt-3'；所述基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10之一。
2.根据权利要求1所述的基因片段，其特征是，所述基因片段的序列为SEQ ID No.5。
3.与权利要求1或2所述的基因片段对应的crRNA。
4.根据权利要求3所述的crRNA，其特征是，所述crRNA的3'端和5'端各有3个碱基进行了硫代修饰和甲氧基修饰。
5.一种工具系统，其特征是，所述工具系统含有权利要求3或4所述的crRNA；所述工具系统为Cas3基因编辑系统。
6.根据权利要求5所述的工具系统，其特征是，所述Cas3基因编辑系统为I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统。
7.根据权利要求6所述的工具系统，其特征是，所述I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统由Cascade复合物以及Cas3蛋白组成；所述crRNA位于Cascade复合物中；所述Cascade复合物由Cmx8蛋白、Cas8蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas11蛋白以及crRNA复合而成；所述Cmx8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.11；所述Cas8蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.12；所述Cas5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.13；所述Cas6蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.14；所述Cas11蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；所述Cas3蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.16。
8.权利要求1或2所述基因片段、或者权利要求3或4所述crRNA、或者权利要求5至7任一项所述工具系统用于制备清除HBV病毒的产品的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述产品为治疗乙肝的药物。
10.含有权利要求5至7任一项所述工具系统的细胞系或细胞株。
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