ES2865275T3 - Células inmunocompatibles creadas por edición mediada por nucleasas, de genes que codifican HLA - Google Patents

Abstract

Un método para producir células inmunocompatibles, que comprende editar solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, y un par de alelos de HLA-DR mediante deleción génica en una célula aislada, en donde HLA-A y HLA-B son heterocigotos.

Description

DESCRIPCIÓN

Células inmunocompatibles creadas por edición mediada por nucleasas, de genes que codifican HLA

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir células o poblaciones celulares inmunocompatibles, que comprende la edición de solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, y un par de alelos de HLA-DR mediante deleción génica en una célula aislada, en donde el antígeno leucocitario humano (HLA)-A, HLA-B y HLA-DR son genes de antígenos inmunocompatibles, para células inmunocompatibles producidas por el método de producción anterior, y para una población celular que comprende las células inmunocompatibles producidas por el método de producción anterior.

Antecedentes de la técnica

Las células madre embrionarias humanas (hESC) son células pluripotentes capaces de autorrenovación ilimitada y pueden diferenciarse en los tipos celulares de las tres capas germinales. El primer uso de las hESC proclamó una nueva era en la medicina regenerativa porque, en condiciones apropiadas, las hESC responden a señales externas y su diferenciación puede inducirse en tipos de células especializadas, como cardiomiocitos funcionales y células p pancreáticas. Estas características las convierten en un valioso recurso celular en la medicina regenerativa. Los pacientes que padecen enfermedades neurodegenerativas, autoinmunitarias, cardiovasculares y hematopoyéticas son beneficiarios potenciales de la terapia de células madre. A pesar de su tremendo potencial, el rechazo inmunológico de las células alogénicas derivadas de hESC es un obstáculo importante para usar las células en la clínica. La expresión en la superficie celular de los antígenos leucocitarios humanos (HLA), que están codificados por genes del complejo mayor de histocompatibilidad, constituye la principal barrera inmunológica.

Las propiedades únicas de las hESC se pueden restablecer en las células somáticas mediante la transferencia nuclear somática (SNT) o la expresión forzada de 4 factores de transcripción Oct4 (O), Sox2 (S), Klf4 (K) y c-Myc (M), que pueden inducir células somáticas a células similares a ESC, que se denominan células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Estos dos enfoques permiten la obtención de células madre pluripotentes específicas del paciente. Es importante destacar que, dado que estas células se producen a partir de las propias células del paciente, se considera que su sistema inmunológico no las rechazará.

Sin embargo, dado que la reprogramación de células somáticas humanas mediada por SNT está en sus inicios, tiene baja eficiencia y requiere la donación de ovocitos, todavía no puede ofrecer una solución práctica. Si bien la obtención relativamente simple de iPSC parece prometedora, de acuerdo con informes recientes, la reprogramación basada en factores de transcripción se asocia con una reprogramación epigenética incompleta. Por lo tanto, el uso de estas células en la clínica requiere un examen detallado de los clones de iPSC, lo cual es engorroso. Además, es probable que la generación de células madre pluripotentes bajo buenas prácticas de fabricación (BPF) para pacientes individuales, sea financieramente prohibitiva.

Un enfoque para superar la barrera inmunológica del trasplante de células madre es establecer bancos de hESC/iPSC/SNT-hESC, de grado clínico, con haplotipos HLA, que serán compatibles con una proporción significativa de la población. Sin embargo, la obtención de las líneas hESC/iPSC/SNT-hESC de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP), requiere inversiones de cantidades sustanciales de dinero y tiempo.

Otra solución para evitar el rechazo inmunológico de los derivados de hESC, es la manipulación genética de moléculas de HLA. Mediante el uso de nucleasas con dedos de zinc, Torikai y sus colaboradores eliminaron selectivamente el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I en las ESC y demostraron que las células HLA-A podían escapar de la lisis de los linfocitos T citotóxicos restringidos por HLA. Sin embargo, las células con desactivación del gen completo para HLA de clase I, son blanco de la citotoxicidad mediada por células NK (Oberg L, etc., Eur J Immunol., 2004, 34(6): 1646-1653.).

En otro estudio, Riolobos y colaboradores, interrumpieron la microglobulina beta-2 (B2M) que codifica la cadena auxiliar de las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y que es necesaria para su expresión superficial (Laura Riolobos, y otros, 2013, 21(6): 1232-1241). Por lo tanto, la deleción homocigota del gen B2M, previene la translocación superficial de las moléculas de HLA de clase I y reduce la inmunogenicidad. Sin embargo, este enfoque ofrece una solución limitada porque se ha informado que las células NK eliminan las células madre hematopoyéticas que carecen del gen B2M. Aunque la expresión forzada de proteínas quiméricas HLA-E o HLA-G-B2M menos polimórficas protege a las células clase I negativas de la lisis mediada por células NK in vitro, aún no se han informado ningún dato in vivo.

Más recientemente, se demostró que las ESC humanas (hESC) con inserción génica de la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4)-inmunoglobulina y del ligando 1 de muerte celular programada (PDL1), interrumpen simultáneamente las vías coestimuladoras de las células T y activan las vías inhibidoras de estas, en ratones humanizados. Es bien sabido que las células infectadas también están sujetas a una respuesta inmunitaria. No hay estudio in vivo que demuestre si las células inmunitarias pueden eliminar estas células de doble inserción génica de CTLA4 y PDL1, cuando se infectan.

Parece que la mutación monoalélica de las moléculas de HLA y la consiguiente obtención de las hESC homocigotas de HLA, podrían ofrecer una solución para superar el rechazo inmunitario de las hESC. La creación de una pequeña biblioteca de hESC homocigotas, a partir de líneas de hESC existentes, podría cubrir un porcentaje significativo de la población humana.

Problema técnico

Los autores de la presente invención, han llevado a cabo una investigación intensiva para desarrollar células para trasplante que porten un gen HLA de tipo hemicigoto, sin causar de esta manera inmunorrechazo en un receptor, y un proceso para construir poblaciones celulares que comprendan el mismo. Como resultado, los inventores han descubierto que las células para trasplante que son inmunocompatibles para muchos receptores, y las poblaciones celulares que comprenden las mismas, pueden producirse mediante la edición de solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y ^h LA-B, y un par de alelos de HLA-DR por deleción génica en una célula aislada, en donde HLA-A y HLA-B son heterocigotos.

Solución técnica

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir células o poblaciones celulares inmunocompatibles, que comprende editar solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, y un par de alelos de ^h LA-DR, mediante deleción génica en una célula aislada, en donde HLA-A y HLA-B son heterocigotos. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar células inmunocompatibles producidas mediante el método de producción anterior.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir células inmunocompatibles o una población celular que comprenda: (a) editar solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, y un par de alelos de HLA-DR mediante deleción génica en una célula aislada, en donde HLA-A y HLA-B son heterocigotos, y (b) recolectar las células producidas en la etapa (a).

Efectos ventajosos

De acuerdo con la presente invención, se pueden producir células que son inmunocompatibles para muchos receptores, mediante la edición de genes de antígeno de histocompatibilidad (HLA) críticos, que pueden causar inmunorrechazo de células alogénicas en trasplante. En consecuencia, cuando se construyen varios tipos de células diferentes mediante el uso de este proceso y se conservan en un banco, es posible proporcionar una base muy importante para la terapia celular que puede usarse para el trasplante alogénico, en el momento que sea necesario. Descripción de los dibujos

La Figura 1 es una vista esquemática que ilustra un método para producir células inmunocompatibles y construir una población celular mediante la eliminación de uno o ambos alelos paternos y maternos de los genes HLA-A y HLA-B y la desactivación de los dos alelos de los genes HLA-DRB1. De acuerdo con la invención, solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, y un par de alelos de HLA-DR se editan mediante deleción génica en una célula aislada, en donde HLA-A y HLA-B son heterocigotos.

La Figura 2 es una vista ilustrativa que indica que, al eliminar uno de los alelos paternos y maternos de los genes HLA-A, HLA-B y HLA-DRB1, un total de ocho tipos de células homocigotas con relación a los genes HLA-A, HLA-B y HLA-DRB1, pueden producirse a partir de las células de un donante (ejemplo de referencia).

La Figura 3 se refiere a la presente invención y es una vista ilustrativa que indica que, al desactivar uno de los alelos paternos y maternos de los genes HLA-A y HLA-B y desactivar ambos alelos del gen HLA-DRB1, un total de cuatro tipos de células homocigotas con relación a los genes HLA-A, HLA-B y HLA-DRB1 pueden producirse a partir de las células de un donante.

La Figura 4 muestra los resultados de analizar si, después de introducir plásmidos que expresan proteínas Cas9 y ARN guía de DRB1 en una célula madre pluripotente inducida humana #12, mediante electroporación, la mutación de inserción-deleción se induce en el sitio de las secuencias diana en el gen DRB1.

La Figura 5 muestra los resultados de analizar si, después de introducir las proteínas Cas9 y el ARN guía de DRB1 en una célula madre pluripotente inducida humana #8 mediante electroporación, se induce la mutación de inserción-deleción en el sitio de las secuencias diana, en el gen DRB1.

La Figura 6 muestra los resultados de identificar si la mutación de inserción-deleción está presente en el alelo 2 del clon #8 entre los clones identificados en la Figura 5 a través de un análisis de secuencias.

La Figura 7 muestra los resultados de analizar si, después de introducir las proteínas Cas9 y el ARN guía de DRB1 en una célula madre pluripotente inducida humana #12 mediante electroporación, se induce la mutación de inserción-deleción en el sitio de las secuencias diana, en el gen DRB1.

La Figura 8 muestra los resultados de identificar si la mutación de inserción-deleción está presente en el alelo 1 del clon #4 entre los clones identificados en la Figura 7 a través de un análisis de secuencias.

La Figura 9 muestra los resultados de identificar si luego de introducir las proteínas Cas9 y el guía de ARN de DRB1 en células madre embrionarias humanas H9 #85 y CHA15 #34 y células madre pluripotentes inducidas humanas hiPSC12 #13, mediante electroporación, se induce la mutación de inserción-deleción en el sitio de las secuencias diana en el gen DRB1 a través de un análisis de secuencia.

La Figura 10 muestra los resultados de identificar la pluripotencia de los clones identificados en la Figura 9. La Figura 11 es un diagrama esquemático que muestra un proceso de desactivación de un alelo del gen HLA-A en células que tienen ambos alelos del gen DRB1 desactivados, mediante el uso de proteína Cas9 y sgARN de HLA-A (ejemplo de referencia).

La Figura 12 muestra los resultados del análisis de genotipos HLA-A y secuencias de clones A #69 y A #305.6. La Figura 13 es un diagrama esquemático que muestra un proceso de la invención de desactivación de un alelo del gen HLA-B mediante el uso de proteínas Cas9 y sgARN de HLA-B, en los clones identificados en la FIG. 12. La Figura 14 muestra los resultados del análisis de genotipos HLA-B de los clones #53, #34, #98 y #134.

La Figura 15 muestra los resultados del análisis de las secuencias HLA-B de los clones #53, #34, #98 y #134. La Figura 16 muestra los resultados de identificar la pluripotencia del clon H9 que tiene el genotipo de HLA-A*02+/*03' y HLA-B*35+/*44' y en donde ambos alelos de los genes DRB1 están desactivados.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir células inmunocompatibles, que comprende editar solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, y un par de alelos de HLA-DR mediante deleción génica en una célula aislada, en donde HLA-A y HLA-B son heterocigotos.

La barrera más importante que toda terapia celular debe superar para poder usarse con fines terapéuticos, es el inmunorrechazo. Las entidades que causan el inmunorrechazo son 6 tipos de proteínas de la superficie celular HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR) llamadas antígeno mayor de histocompatibilidad (MHC). Se sabe que un ser humano expresa seis especies derivadas de genes paternos y seis especies derivadas de genes maternos, es decir, un total de seis pares. Más específicamente, las células somáticas generales expresan un total de solo tres pares, es decir, HLA-A, HLA-B y HLA-C pertenecientes a MHC clase I, y las células inmunitarias expresan un total de 6 pares, una suma de MHC clase I y MHC clase II.

La función de los antígenos de superficie HLA es mostrar fragmentos de las proteínas presentes en las células, en la superficie celular y permitir que las células inmunitarias detecten infecciones o mutaciones que puedan ocurrir en el cuerpo. Por esta razón, también se denominan proteínas presentadoras de antígenos.

Cuando se realiza una terapia celular o un trasplante de tejidos, que incluye el trasplante de médula ósea, si estas proteínas presentadoras de antígenos no son autólogas, se convierten en los principales objetivos de las células inmunitarias presentes en el cuerpo de un receptor de trasplante. Esto se debe a que cada persona tiene una serie de polimorfismos genéticos en sus respectivos genes HLA. Por ejemplo, debido a que los genes HLA-A del donante y los genes HLA-A del receptor no son los mismos, las células inmunitarias del cuerpo del receptor, reconocen la diferencia y atacan a las células del donante. En última instancia, esto conduce al fracaso del trasplante debido al inmunorrechazo. Este fenómeno es aplicable a todos los genes HLA-A, así como también a los genes HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR. Debido a la experiencia clínica acumulada hasta ahora, se ha sabido que es posible asegurar una tasa de éxito considerable del trasplante incluso por compatibilidad de tres pares de HLA-A, HLA-B y HLA-DRB1 con muchos polimorfismos (o cuatro pares que incluyen hasta HLA-C), sin compatibilidad de los seis pares de genes HLA (MHC clase I y clase II).

Con respecto a esto, la presente invención se caracteriza porque proporciona un método capaz de producir células inmunocompatibles, en donde los antígenos inmunocompatibles tienen genotipos similares a homocigotos o hemicigotos mediante deleción génica.

En la presente invención, el término "homocigosis de antígenos inmunocompatibles" significa que uno, dos o tres genotipos seleccionados de los genes HLA-A, HLA-B y HLA-DR heredados por vía paterna y materna del donante, tienen exactamente los mismos genotipos HLA. Específicamente, la homocigosis de antígenos inmunocompatibles puede incluir que los genotipos de los respectivos genes HLA-A y HLA-B sean completamente iguales, pero no se limita a esto. Además, cuando contiene el gen HLA-DR, la homocigosis de antígenos inmunocompatibles puede incluir que los genotipos de los respectivos genes HLA-A, HLA-B y HLA-DR sean completamente iguales, pero no se pretende que se limiten a estos.

Para un ejemplo más específico y no limitante, las células derivadas del donante (los genotipos HLA paterno y materno son los mismos) que tienen [HLA-A*11 (en adelante, HLA omitido), B*51, DRB1*16 (paterno)/A*11, B*51, DRB1*16 (materno)] pueden ser homocigotos con los antígenos inmunocompatibles. En este caso, el trasplante está disponible para los receptores de todas las combinaciones de genotipos HLA en los que solo tres de los seis pares son idénticos, como el receptor de [A*11, B*51, DRB1*16 (paterno)/A*24, B*34, DRB1*08 (materno)], el receptor de [A*11, B*15, DRB1*04 (paterno)/A*24, B*51, DRB1*16 (materno)], el receptor de [A*03, B*08, DRB1*16 (paterno)/A*11, B*51, DRB1*09 (materno)] o el receptor de [A*02, B*51 DRB1**07 (paterno)/A*11, B*44, DRB1*16 (materno)]. Existe un informe de que, para la terapia celular inmunocompatible, para más del 90 % de las personas, son necesarias alrededor de 200 especies de líneas celulares que portan los antígenos homocigotos inmunocompatibles [Taylor C, Banking on human embryonic stem cells: estimating the number of donor cell lines needed for HLA matching, 2005, Lancet, 366: 2019-2025]. Por lo tanto, al encontrar 200 donantes con homocigosis de antígenos inmunocompatibles diferentes entre sí a través del análisis del genotipo de HLA, es posible asegurar de antemano las líneas celulares inmunocompatibles capaces de trasplantarse a más del 90 %, pero existe una gran dificultad para realizar la selección del gen ^h L^a para tantas personas.

En un aspecto para resolver los problemas mencionados anteriormente, los presentes inventores han desarrollado un método para producir células de tipo homocigoto mediante el uso de un método llamado edición de genes, edición del genoma o ingeniería del genoma.

En la presente invención, el término "de tipo homocigoto" se refiere a que tiene un solo alelo al desactivar o insertar un alelo en un par de alelos heterocigotos particulares. Para los propósitos de la presente invención, de tipo homocigoto se refiere a un estado en donde uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B y HLA-DR tienen solo un alelo. Más específicamente, en la presente invención, el tipo homocigoto puede ser un estado en donde los genes HLA-A, HLA-B y, opcionalmente, HLA-DR tienen solo un alelo, pero no se limita a esto.

En la presente invención, la "célula inmunocompatible" puede ser una célula en donde los antígenos inmunocompatibles, específicamente uno, dos o tres alelos seleccionados del grupo que consiste en genes HLA-A, HLA-B y HLA-DR, están presentes como homocigotos, pero no se limita particularmente a esto. Más específicamente, puede ser una célula en donde los genes HLA-A, HLA-B y, opcionalmente, HLA-DR pueden estar presentes como homocigotos.

Además, el gen HLA-DR en la célula inmunocompatible puede ser aquel en donde ambos alelos se eliminan completamente (se desactivan), pero no se limita a esto. En este caso, la célula inmunocompatible se puede producir mediante la eliminación de o modificando un alelo de cada uno de los genes HLA-A o HLA-B mediante la edición de genes en una célula en la que un par de alelos del gen HLA-DR está desactivado o en una célula aislada, en donde uno o ambos genes HLA-A o HLA-B son heterocigotos. Alternativamente, en la célula aislada, en donde uno o ambos genes HLA-A o HLA-B son heterocigotos, un alelo de cada gen HLA-A o HLA-B se elimina o modifica mediante la edición del gen, seguido de la eliminación de un par de genes HLA-DR. Además, en la presente invención, uno o más genes seleccionados de HLA-A, HLA-B y HLA-DR en la célula inmunocompatible, pueden ser aquéllos en los que ambos alelos se eliminan por completo (se desactivan). Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada por los ejemplos descritos anteriormente.

A través de esto, es posible obtener una célula que se puede trasplantar a receptores con una combinación de solo dos o solo un genotipo de HLA idéntico entre los seis pares.

Además, de acuerdo con el proceso de la presente invención, cuando un alelo (paterno o materno) de los principales genes del antígeno de histocompatibilidad se elimina mediante la edición génica, es posible obtener células genéticamente homocigotas, como se describió anteriormente. Por lo tanto, cuando se recolectan las células así obtenidas, en las que los alelos respectivos se desactivan o se insertan uno por uno, finalmente se pueden obtener varios tipos de células que exhiben efectos homocigotos a partir de las células de un donante (ver las Figuras de la 1 a la 3, la Figura 3 que se refieren a la invención). Por tanto, puede proporcionar una gran ventaja de la obtención de más de 200 células inmunocompatibles, capaces de trasplantarse a más del 90 % de las personas.

De acuerdo con la presente invención, las células inmunocompatibles pueden ser aquellas en las que solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, y un par de alelos de HLA-Dr por deleción génica en una célula aislada, HLA-A y HLA-B son genes heterocigotos editados por deleción génica. En particular, la eliminación se puede realizar mediante desactivación.

Las técnicas de edición del genoma/edición de genes, son aquellas capaces de introducir una mutación dirigida a una diana en la secuencia genómica de células animales y vegetales, incluidas las células humanas, y pueden desactivar o insertar un determinado gen o introducir una mutación incluso en secuencias de ADN no codificantes que no producen una proteína. El método de la presente invención puede producir células inmunocompatibles mediante las tecnologías de edición del genoma o edición de genes.

En una modalidad específica de la presente invención, la tecnología de edición de genes se caracteriza por usar una nucleasa específica de la diana.

En la presente invención, el término "nucleasa específica de la diana" puede referirse a una nucleasa capaz de reconocer y escindir una posición específica de ADN en el genoma de interés. La nucleasa puede incluir una nucleasa en donde se han fusionado un dominio que reconoce una secuencia diana específica en el genoma y un dominio que escinde la misma. Los ejemplos de estos pueden incluir, pero no se limitan a, una meganucleasa, o una nucleasa modificada genéticamente, especialmente una nucleasa efectora de tipo activador de transcripción (TALEN) en donde un efector de tipo activador de transcripción (TAL) derivado de un gen patógeno de plantas que es un dominio que reconoce una secuencia diana específica en el genoma y un dominio de escisión, una nucleasa con dedos de zinc o una RGEN (nucleasa modificada genéticamente genética guiada por ARN) derivada del sistema inmunológico microbiano CRISPR. El método que usa el RGEN para los propósitos de la presente invención es simple y puede lograr resultados más convenientes, pero no se pretende que esté particularmente limitado a estos. Además, para los propósitos de esta invención, la edición de genes antes mencionada puede realizarse mediante el uso de nucleasas específicas de HLA-A, nucleasas específicas de HLA-B o nucleasas específicas de HLA-DR, y la nucleasa es preferiblemente una nucleasa modificada genéticamente, pero no se limita a esto.

Al realizar el proceso de desactivación o inserción mediante el uso de la nucleasa, específicamente la nucleasa modificada genéticamente, a diferencia del proceso de desactivación, que no necesariamente usa un ADN de donante excepto la nucleasa, el proceso de inserción usa un ADN de donante junto con la nucleasa. El ADN del donante se refiere al ADN que incluye un gen que se introducirá en una posición del cromosoma escindido por la nucleasa. El ADN del donante puede incluir un brazo flanqueante izquierdo y un brazo flanqueante derecho para la recombinación. Además, el ADN del donante puede incluir opcionalmente un marcador de selección, pero no se limita a este.

La nucleasa específica de la diana reconoce una secuencia de nucleótidos específica en el genoma de las células animales y vegetales, que incluyen las células humanas, para provocar de esta manera una ruptura de la doble hebra (DSB). La DSB se repara eficazmente mediante recombinación homóloga o un mecanismo de unión de extremos no homólogos (NHEJ) dentro de las células. Durante este proceso, puede introducirse una mutación deseada en una ubicación diana. La nucleasa específica de la diana puede ser artificial o modificada genéticamente y no se produce de forma natural.

La nucleasa puede ser una nucleasa con dedos de zinc (ZFN).

La ZFN incluye un gen seleccionado y una proteína con dedos de zinc modificada genéticamente para unirse a un sitio diana en un dominio de escisión o un semidominio de escisión. La ZFN puede ser una enzima de restricción artificial que incluye un dominio de unión al ADN con dedos de zinc y un dominio de escisión del ADN. En este caso, el dominio de unión al ADN con dedos de zinc puede ser uno que esté modificado genéticamente para unirse a una secuencia seleccionada, como se describe, por ejemplo, en Beerli y otros (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo y otros (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan y otros, (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal y otros (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632-637; y Choo y otros (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416. En comparación con una proteína de dedos de zinc de origen natural, un dominio de unión de dedos de zinc modificado genéticamente, puede tener una nueva especificidad de unión. El método de ingeniería genética incluye el diseño racional y la selección de varios tipos, pero no se limita a este. El diseño racional incluye el uso de una base de datos que comprende, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos triple (o cuádruple) y secuencias de aminoácidos individuales con dedos de zinc. En este momento, las respectivas secuencias de nucleótidos triples o cuádruples se combinan con una o más secuencias de dedos de zinc que se unen a una determinada secuencia triple o cuádruple.

Los expertos en la técnica conocen la selección de una secuencia diana, el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que las codifican) y se describen en detalle en las publicaciones de patente de Estados Unidos núms. 2005/0064474 y 2006/0188987. Además, como se describe en estas referencias y las otras referencias en la técnica relevante, los dominios con dedos de zinc y/o proteínas con múltiples dedos de zinc se pueden unir entre sí mediante cualquier secuencia de enlazadora adecuada, por ejemplo, un enlazador que incluye cinco o más aminoácidos de longitud. Ejemplos de la secuencia enlazadora de seis o más aminoácidos de longitud se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 6,479,626; 6,903,185; y 7,153,949. Las proteínas descritas en la presente descripción pueden comprender cualquier combinación de enlazadores adecuados entre cada uno de los dedos de zinc de las proteínas.

Además, la nucleasa tal como ZFN incluye porciones activas de nucleasa (es decir, dominio de escisión y semidominio de escisión). Como se conoce, por ejemplo, en el dominio de escisión de la nucleasa diferente del dominio de unión al ADN de dedo de zinc, el dominio de escisión puede ser heterólogo al dominio de unión al ADN. El dominio de escisión heterólogo puede derivarse de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Una endonucleasa ilustrativa de la que se puede derivar el dominio de escisión, puede incluir una endonucleasa de restricción y una meganucleasa, pero no se limita a estas.

De manera similar, el semidominio de escisión puede derivarse de cualquier nucleasa o porción de esta que requiera dimerización para la actividad de escisión, como se ha establecido anteriormente. Cuando una proteína de fusión incluye un semidominio de escisión, típicamente se requieren dos proteínas de fusión para la escisión. Alternativamente, puede usarse una única proteína que incluye dos semidominios de escisión. Los dos semidominios de escisión también pueden derivarse de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de esta), o cada semidominio de escisión puede derivarse de diferentes endonucleasas (o fragmentos funcionales de estas). Además, es preferible disponer los sitios diana de las dos proteínas de fusión de manera que los dominios de mitad de escisión estén orientados espacialmente entre sí mediante la unión de las dos proteínas de fusión a los sitios diana de estas y, de esta manera, el semidominio de escisión forma dominios de escisión funcionales, por ejemplo, mediante dimerización. Por lo tanto, en una modalidad, el borde vecino del sitio diana está separado por 5 a 8 nucleótidos o de 15 a 18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede interponerse entre los dos sitios diana (por ejemplo, de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de escisión se coloca entre los sitios diana.

Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y se pueden unir de forma específica a la secuencia al ADN (en un sitio diana), para escindir así el ADN en el sitio de unión o cerca del mismo. Algunas enzimas de restricción (por ejemplo, Tipo IIS) escinden el ADN en un sitio eliminado del sitio de reconocimiento e incluyen dominios de unión y escindibles separables. Por ejemplo, la enzima FokI de tipo IIS cataliza una escisión bicatenaria del ADN en nueve nucleótidos a partir del sitio de reconocimiento en una hebra y en 13 nucleótidos a partir del sitio de reconocimiento en la hebra restante. Por tanto, en una modalidad, la proteína de fusión incluye al menos un dominio de escisión (o semidominio de escisión) de la enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios con dedos de zinc (que pueden o no ser modificados genéticamente).

En la presente invención, el término "TALEN" se refiere a una nucleasa que puede reconocer y escindir la región diana del ADN. TALEN se refiere a una proteína de fusión que comprende un dominio TALE y un dominio de escisión de nucleótidos. En la presente invención, los términos "nucleasa efectora de TAL" y "TALEN" se pueden usar indistintamente. El efector TAL se conoce como una proteína secretada a través de su sistema de secreción de Tipo III cuando varias especies de plantas están infectadas con bacterias Xanthomonas. La proteína puede asociarse con una secuencia promotora en la planta huésped para activar de esta manera la expresión de un gen en la planta que ayuda a las infecciones bacterianas. La proteína reconoce una secuencia de ADN vegetal a través de un dominio repetido central, compuesto por 34 o menos aminoácidos repetidos. Por lo tanto, se cree que TALE puede ser una plataforma novedosa usada como herramienta en la ingeniería del genoma. Sin embargo, para producir una TALEN funcional que tenga una actividad de edición del genoma, algunos parámetros clave previamente desconocidos hasta ahora, deben definirse de la siguiente manera: i) un dominio mínimo de unión al ADN de TALE, ii) una longitud del separador entre dos sitios medios que forman una región diana y iii) un enlazador o una unión de fusión que une el dominio de nucleasa FokI con dTALE.

En la presente invención, el dominio TALE se refiere a un dominio proteico que se une a un nucleótido a través de uno o más módulos de repetición de TALE que se repiten de una manera específica de secuencia. El dominio TALE incluye al menos un módulo de repetición de TALE, más particularmente de 1 a 30 módulos de repetición de TALE, pero no se limita a estos. En la presente invención, el término "dominio efector TAL" y "dominio TALE" se usan indistintamente. El dominio TALE puede comprender la mitad del módulo de repetición de TALE. En relación con la TALEN, se hace referencia a la publicación de patente internacional WO/2012/093833 o a la publicación de patente de Estados Unidos núm. 2013-0217131.

En la presente invención, el término "RGEN" se refiere a una nucleasa que contiene un ARN guía específico de ADN diana y una proteína Cas como un componente. Es decir, por ejemplo, el RGEN en la presente invención puede comprender un ARN guía que se une específicamente a una secuencia particular del gen HLA-A, HLA-B o HLA-DR, y una proteína Cas, pero no se limita a esto.

En la presente invención, el RGEN puede aplicarse a células en forma de un ADN guía específico de ADN diana o un ADN que codifique el ARN guía; y una proteína Cas separada o un ácido nucleico que codifica la proteína Cas, pero no se limita a esto.

En una modalidad más específica de la presente invención, el RGEN puede aplicarse a las células en forma de 1) un ARN guía específico de ADN diana y una proteína Cas separada, y 2) un ADN que codifica el ARN guía y un ácido nucleico que codifica a la proteína Cas.

La transferencia de RGEN a las células en la forma del 1) anterior se denomina "suministro de RNP", pero no se limita a esto.

Cuando se aplica en forma de ARN guía aislado, el ARN guía puede transcribirse in vitro, pero no se limita a esto. Además, el ADN que codifica el ARN guía y el ácido nucleico que codifica la proteína Cas pueden usarse como un ácido nucleico aislado en sí mismo, y pueden estar presentes en forma de un vector que contiene un casete de expresión para expresar el ARN guía y/o la proteína Cas, pero no se limita a esto.

El vector puede ser un vector viral, un vector plasmídico o un vector de Agrobacterium, y el tipo de vector viral puede incluir AAV (virus adenoasociado), pero no se limita a esto.

El ADN que codifica el ARN guía y el ácido nucleico que codifica la proteína Cas están presentes en vectores individuales, respectivamente, o pueden estar presentes en el mismo vector, pero no se limitan a esto.

Cada una de las modalidades descritas anteriormente puede aplicarse de manera completa incluso con respecto a las modalidades más específicas descritas en la presente descripción.

En la presente invención, el RGEN puede incluir un ARN guía que se une específicamente a una secuencia específica del gen HLA-A, HLA-B o HLA-DR o un ADN que lo codifica, y una proteína Cas o una secuencia de ácido nucleico que lo codifica, pero no se limita a esto. En la presente invención, el término "proteína Cas" es un componente proteico principal del sistema CRISPR/Cas y es una proteína capaz de formar una endonucleasa o nickasa activada.

La proteína Cas puede formar un complejo con crARN (CRISPR ARN) y ARNtracr (crARN transactivador) para de esta manera exhibir su actividad.

La proteína Cas o la información genética sobre la misma puede obtenerse de bases de datos conocidas como GenBank de NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica). Más específicamente, la proteína Cas puede ser una proteína Cas9. Además, la proteína Cas puede ser una proteína derivada del género Streptococcus, particularmente una proteína Cas derivada de Streptococcus pyogens, y más particularmente una proteína Cas9. Además, la proteína Cas puede ser una proteína derivada del género Campylobacter, particularmente una proteína Cas derivada de Campylobacter jejuni y más particularmente una proteína Cas9. Sin embargo, la presente invención no pretende limitarse a los ejemplos mencionados anteriormente.

Además, la proteína Cas usada en la presente invención incluye, además de las proteínas de origen natural, una endonucleasa activada en cooperación con el ARN guía, o una variante de esta capaz de actuar como una nickasa. La variante de la proteína Cas9 puede ser una muteína de Cas9 en donde un residuo de aspartato catalítico se ha cambiado por cualquier otro aminoácido. Específicamente, el otro aminoácido puede ser alanina, pero no se limita a este.

En la presente invención, la proteína Cas puede ser una proteína recombinante.

Cuando se usa en el contexto de células, los ácidos nucleicos, proteínas o vectores, el término "recombinante" se refiere, por ejemplo, a células modificadas, ácidos nucleicos, proteínas o vectores en los que se introduce un ácido nucleico heterólogo o una proteína, se modifica un ácido nucleico nativo o proteína, o las células se derivan de las células modificadas. Así, por ejemplo, la proteína Cas recombinante puede producirse al reconstruir la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína Cas mediante el uso de la tabla de codones humanos.

La proteína Cas o el ácido nucleico que la codifica puede estar en una forma en donde la proteína Cas permite la acción en el núcleo.

La proteína Cas separada también puede ser una forma fácil de introducir en la célula. Como ejemplo, la proteína Cas puede unirse a un péptido que penetra en las células o un dominio de transducción de proteínas. El dominio de transducción de proteínas puede ser una poliarginina o una proteína TAT derivada del VIH, pero no se limita a esto. Es bien conocido en la técnica que existen varios tipos de dominios de transducción de proteínas o péptidos de penetración celular, además de los ejemplos indicados anteriormente, por lo que una persona experta en la técnica puede aplicar varios ejemplos a la presente invención sin estar limitado a lo anterior.

Además, el ácido nucleico que codifica las proteínas Cas puede comprender además una secuencia de señal de localización nuclear (NLS). Por tanto, un casete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína Cas, puede comprender la secuencia NLS así como también una secuencia reguladora tal como una secuencia promotora para expresar la proteína Cas. Sin embargo, la invención no se limita a esto.

La proteína Cas puede unirse a una etiqueta que facilita la separación y/o purificación. Como ejemplo, una etiqueta de péptido pequeño como una etiqueta His, una etiqueta Flag o una etiqueta S, o una etiqueta GST (glutatión S-transferasa), una etiqueta MBP (proteína de unión a maltosa) y similares pueden unirse de acuerdo con el propósito, pero no se limita a esto.

En la presente invención, el término "ARN guía" se refiere a un ARN específico de ADN diana que se une específicamente a una secuencia diana particular, y se une a la proteína Cas para que la proteína Cas pueda dirigirse al ADN diana.

En la presente invención, el ARN guía puede ser un ARN dual que incluye dos ARN, es decir, ARNcr (ARN CRISPR) y ARNtracr (ARNcr transactivador) como componente; o una forma que comprende una primera región que incluye una secuencia que puede formar un par de bases con una secuencia complementaria a la secuencia de ADN diana y una segunda región que incluye una secuencia que interactúa con la proteína Cas, más particularmente sgARN (ARN monocatenario) en donde las partes principales de crARN y ARNtracr se han fusionado.

El sgARN puede incluir una porción que tiene una secuencia que puede formar un par de bases con una secuencia complementaria a la secuencia de ADN diana (esto también puede denominarse región separadora, secuencia de reconocimiento del ADN diana, región de apareamiento de bases, etc.) y una estructura de horquilla para la unión a proteínas Cas. Más particularmente, el sgARN puede incluir una porción que tiene una secuencia que puede formar un par de bases con una secuencia complementaria a la secuencia de ^a Dⁿ diana, una estructura de horquilla para la unión a la proteína Cas y una secuencia de terminación. La estructura descrita anteriormente puede estar presente secuencialmente en el orden de 5' a 3'. Sin embargo, no se limita a esto.

Si el ARN guía comprende la porción esencial de ARNcr y ARNtracr y una porción que puede formar pares de bases complementarias a una diana, en la presente invención puede usarse cualquier ARN guía.

El crARN puede hibridar con un ADN diana.

El RGEN está compuesto por una proteína Cas y un ARN doble, o puede estar compuesto por una proteína Cas y sgARN. Además, el RGEN puede incluir, como un componente, un ácido nucleico que codifica la proteína Cas y un ácido nucleico que codifica el ARN doble; o incluir un ácido nucleico que codifica la proteína Cas y un ácido nucleico que codifica el sgARN, pero no se limita a esto.

El ARN guía, particularmente crARN o sgARN, puede incluir una secuencia que puede formar un par de bases con una secuencia complementaria a la secuencia de ADN diana, y además incluir uno o más nucleótidos adicionales en una porción aguas arriba de crARN o sgARN, particularmente en el extremo 5' de crARN de sgARN o ARN doble. El nucleótido adicional puede ser guanina (G), pero no se limita a esto.

Más específicamente, la edición de genes de la presente invención puede realizarse al introducir en las células, un ARN guía que se une específicamente a una secuencia específica del gen HLA-A, HLA-B o HLA-DR o un ADN que codifica el ARN guía; y un ácido nucleico que codifica una proteína Cas o la propia proteína Cas. Es decir, se elimina un alelo (paterno o materno) de los principales genes del antígeno de histocompatibilidad mediante el uso del método RGEN al emplear un sistema CRISPR/Cas, una de las nucleasas, como se describió anteriormente, que da como resultado que solo quede un alelo. Finalmente, pueden construirse las células que tienen efectos genéticos similares a los homocigotos.

Las secuencias diana que pueden usarse para la desactivación de alelos del gen HLA-DRB1 mediante el método RGEN pueden incluir secuencias conservadas, comúnmente presentes en todos los seres humanos, por ejemplo, 5'-ATCCAGGCAGCATTGAAGTCAGG-3' (SEQ ID NO 1), 5'-CCAGGCAGCATTGAAGTCAGGTG-3' (SEQ ID NO: 2), 5-CCTTCCAGACCCTGGTGATGCTG-3' (SEQ ID NO 3) o 5-CCAGACCCTGGTGATGCTGGAAA-3 '(SEQ ID NO 4) que están presentes en 4HLA-DRB1, pero no se limita a esto.

Las secuencias diana que pueden usarse para la eliminación de alelos del gen HLA-A mediante el método RGEN pueden incluir, por ejemplo, 5'-CCCTGCGGAGATCACACTGACCT-3' (SEQ ID NO 5) 5-CCTGCGGAGATCACACTGACCTG-3' (SEQ ID NO 6), 5'-GAGACCAGGCCTGCAGGGGATGG-3' (SEQ ID NO 7), o 5'-CACCTGCCATGTGCAGCATGAGG-3' (SEQ ID NO 8) que están presentes en el exón 4 de H^lA-A, pero no se limitan a esto.

Las secuencias diana que pueden usarse para la eliminación de alelos del gen HLA-B mediante el método RGEN pueden incluir, por ejemplo, 5'-ACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGG-3' (SEQ ID NO 9), 5'-GATCACACTGACCTGGCAGCGGG-3' (SEQ ID NO 10), 5'-ACACTGACCTGGCAGCGGGATGG-3' (SEQ ID NO 11), 5'-GACCTGGCAGCGGGATGGCGAGG-3' (SEQ ID NO 12), o 5'-CCTTCTGGAGAGAAGAGCAGAGATA-3' (SEQ ID NO 13) que están presentes en el exón 4 de HLA-B, pero no se limitan a esto.

En una modalidad de la presente invención, se usó un método para transferir a las células una proteína Cas 9 y un sgARN que reconoce una secuencia diana del gen HLA particular que se va a editar, con el fin de realizar la desactivación del alelo de los genes HLA.

Específicamente, el método puede ser (1) un método en donde una proteína Cas 9 se sobreexpresa en bacterias y se purifica, y se produce in vitro un sgARN (ARN guiado único) que reconoce una secuencia diana de HLA específica, seguido de su transfección a las células; o (2) un método en donde los ADN plasmídicos que expresan la proteína Cas9 y el ARNg se transfectan en células y se expresan en estas, pero no se limitan a esto.

Además, en el método para transferir proteínas, ARN o ADN plasmídico a las células de acuerdo con la presente invención, varios métodos conocidos en la técnica, tales como una electroporación, un liposoma, vectores virales, nanopartículas y un dominio de translocación de proteínas (PTD), puede usarse el método de la proteína de fusión, pero no se limita este.

Además, el método de la presente invención puede aplicarse a células madre no diferenciadas (células madre pluripotentes inducidas), células madre embrionarias, así como también a todas las células. Es decir, esto es ventajoso como técnica que puede aplicarse a varias células.

El método puede aplicarse a todas las células, es decir, células madre (células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, células madre embrionarias derivadas de transferencia nuclear de células somáticas no humanas y células madre adultas) y células somáticas.

Las células madre adultas mencionadas aquí incluyen todas las células madre adultas que pueden obtenerse del embrión humano, cuerpos neonatales y adultos, así como también de células madre de sangre del cordón umbilical, células madre de placenta, células madre de gelatina de Wharton, células madre de líquido amniótico, células epiteliales amnióticas, células madre extraembrionarias y células modificadas genéticamente que se derivan de ellas.

Además, las células somáticas mencionadas aquí incluyen todas las células que pueden obtenerse del embrión, así como también de los cuerpos de recién nacidos y adultos, y también todas las células modificadas genéticamente que se derivan de ellas.

Cuando los genes HLA-A y HLA-B tienen genotipos heterocigotos, el método de producción de células inmunocompatibles de acuerdo con la presente invención, puede eliminar secuencial o simultáneamente alelos de genes heterocigotos de las células correspondientes, mediante edición de genes y particularmente, puede realizarse de forma secuencial, pero no se limita a esto.

Además, cuando los genes HLA-A, HLA-B y HLA-DR tienen todos genotipos heterocigotos o cuando los genes HLA-A y HLA-B tienen genotipos heterocigotos, el método de producción puede eliminar o modificar uno o dos alelos de los genes respectivos de las células separadas mediante edición de genes y los alelos de los genes respectivos pueden eliminarse o modificarse secuencial o simultáneamente, mediante la edición de genes. Además, el método de producción puede comprender las etapas de eliminar un par de alelos de genes HLA-DR en una célula separada en donde los genes HLA-A, HLA-B y h LA-DR tienen todos genotipos heterocigotos mediante edición de genes y eliminar o modificar uno o dos alelos de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, mediante edición de genes, pero no se limita a esto. Dado que DRB1 se expresa solo en algunas células, como las células B, como una de las proteínas del MHC de clase II, existen ventajas en que es posible la desactivación bialélica y los tipos de combinaciones de HLA se pueden simplificar, pero no se limitan a esto. De acuerdo con este método, es posible producir cuatro células de tipo homocigota diferentes en un tipo de célula.

En una modalidad específica de la presente invención, la célula madre embrionaria y la célula madre pluripotente inducida, se sometieron a desactivación bialélica para alterar un gen Drbl (Figura 9) y luego, un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, se eliminaron mediante edición de genes para producir de esta manera cuatro células de tipo homocigoto diferentes (Figuras 14 y 15).

Además, el método de producción de la presente invención puede comprender, además, la etapa de eliminar o modificar los alelos de uno o más genes seleccionados de HLA-C, HLA-DP y HLA-DQ además de genes HLA-A, HLA-B y HLA-DR, por edición de genes. Es obvio que, para esta edición de genes, se aplican aquellos descritos anteriormente.

Además, el método de producción de la presente invención, que comprende además el análisis del tipo de HLA de las células producidas. Esta etapa se puede realizar mediante el uso varios métodos conocidos en la técnica para analizar el genotipo. Por ejemplo, esta etapa se puede realizar mediante el método de amplificar una región de secuencia diana del gen ^h L^a de interés, mediante PCR y luego analizar la secuencia del mismo, pero no se limita a esto.

Además, el método anterior puede comprender además la selección de células que tienen el tipo de HLA para trasplantar del grupo de células inmunocompatibles producido. En dicha etapa de selección, esto puede preceder a una etapa de análisis de un genotipo de HLA. Cuando se analiza el genotipo de HLA, las células deseadas se pueden seleccionar mediante el resultado del análisis. Este proceso puede proporcionar un tipo apropiado de células HLA a los receptores.

En otra modalidad de la presente invención, se proporcionan las células inmunocompatibles producidas mediante el método de producción.

Los detalles de este método de producción son como se describieron anteriormente.

En otra modalidad, la presente invención proporciona poblaciones celulares que comprenden las células inmunocompatibles producidas mediante el método de producción.

Los detalles de este método de producción son como se describieron anteriormente. Las poblaciones celulares anteriores también pueden denominarse banco de células.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una población celular inmunocompatible que comprende (a) editar solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, y un par de alelos de ^h LA-DR mediante deleción génica en una célula aislada, o en una célula aislada, en donde HLA-A y HLA-B son heterocigotos; y (b) recolectar las células producidas en la etapa (a).

Los detalles de la etapa (a) son los descritos anteriormente. Además, la población celular puede denominarse banco de células.

En la etapa (b), se puede construir una población celular que tienen varios genotipos HLA mediante la recolección de las células producidas en la etapa (a).

Además, después de realizar la etapa (a) y antes de realizar la etapa (b), el método de producción de la presente invención puede comprender además: (a') identificar los genotipos HLA de las células aisladas obtenidas en la etapa (a), para producir así la población celular identificada por el genotipo de HLA, es decir, una población celular.

Modo para la invención

Se sabe que las moléculas de HLA más importantes para la compatibilidad son HLA-A de clase I, HLA-B y HLA-DR de clase II. Para crear una biblioteca de células madre pluripotentes humanas homocigotas HLA-A, se diseñaron ARNg para dirigir Cas9 a los genes Drbl, HLA-A y HLA-B y se probó la capacidad de dirigir mutaciones específicas de sitio, tanto en células ES como en células iPS. La Figura 1 es un diagrama esquemático que resume nuestra estrategia.

Materiales y métodos

Cultivo de células

Las hESC y las iPSC se mantuvieron en placas recubiertas con Geltrex (Invitrogen) en medio E8 (Invitrogen) suplementado con inhibidor de ROCK 10 pM Y27632 (Santa Cruz) durante 24 h. Las células se subcultivaron con EDTA cada 4 días a 5 días.

ARN guía

El ARN se transcribió in vitro mediante el uso el kit MEGAshortscript T7 (Ambion) de acuerdo con el manual del fabricante. Las plantillas para sgARN se generaron por hibridación y extensión de dos oligonucleótidos complementarios. Las secuencias de ARN guía tienen la misma secuencia de ADN diana y son una secuencia de 23 nt en donde el extremo 3' de la secuencia es "NGG".

T ransfección

Las hESC y las iPSC se transfectaron con el kit maxa P3 Primary Cell 4DNucleofector mediante el uso del programa CB-150, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, 2x105 de las células se transfectaron con proteína Cas9 de Toolgen (30 pg) premezclada con un transcrito in vitro de sgARN (40 pg). La proteína Cas9 se mezcló con sgARN disuelto en agua libre de nucleasas y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Se añadieron no más de 10 pl de la mezcla Cas0-sgARN a 100 pl de la solución de nucleofección. Las células se analizaron 3 días después de la transfección.

Ensayo de T7E1

El ADN genómico se extrajo mediante el uso del kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN). Los amplicones de PCR, que incluyen los sitios diana Cas9, se generaron mediante el uso del sistema de PCR de alta fidelidad PicoMaxx (Agilent). Los amplicones de PCR se desnaturalizaron por calentamiento y se (hibridaron) reasociaron para formar ADN heterodúplex mediante el uso de un termociclador y luego se digirieron con endonucleasa 1 T7 (New England Biolabs) durante 20 min a 37 °C, y luego se analizaron mediante el uso de electroforesis en gel de agarosa. Para el análisis de secuenciación, los productos del PCR se usaron para la subclonación mediante el uso del vector de clonación TA (vector pGEM-T Easy; Promega). Los plásmidos reconstruidos se purificaron y los clones individuales se secuenciaron (Macrogen Inc.).

Tinción con fosfatasa alcalina

La tinción con fosfatasa alcalina se realizó mediante el uso del kit II de tinción con fosfatasa alcalina (Stemgent) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4 %, se lavaron con solución salina tamponada con Tris/Tween 20 al 0,05 % (Sigma) y se tiñeron con solución de tinción de AP.

Inmunofluorescencia

Las hESC se fijaron con formaldehído al 4 % y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Invitrogen) durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron con Triton X-100 al 0,03 % en PBS (tampón de lavado). Las muestras fijadas se bloquearon durante 1 h con solución de albúmina de suero bovino al 5 %, disuelta en tampón de lavado seguido de incubación durante 24 ha 4 °C con anticuerpos primarios. Las muestras se lavaron con tampón de lavado y luego se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con FITC (Molecular Probes) durante 2 h. Los portaobjetos se tiñeron por contraste con DAPI (Vector Laboratories) para teñir los núcleos celulares.

Secuenciación profunda dirigida.

Los segmentos de ADN genómico que abarcan los sitios dentro y potencialmente fuera de la diana, se amplificaron mediante el uso la polimerasa Phusion (New England BioLabs). Los amplicones de PCR resultantes se sometieron a secuenciación de extremos emparejados mediante el uso de Illumina MiSeq.

Cariotipaje

El cariotipaje se analizó por GenDix Inc.

Ejemplo 1: Producción de células de tipo homocigoto a través de la desactivación monoalélica de los genes HLA-A, HLA-B y HLA-DRB1

Mediante la edición del genoma en una célula aislada en donde los genes del antígeno leucocitario humano (HLA)-A, HLA-B y HLA-DR tienen genotipos heterocigotos, se realizó la desactivación monoalélica de los genes HLA-A, HLA-B y HLA-DRB1 mediante el uso una nucleasa, para construir de esta manera ocho tipos de células en las que los genes HLA-A, HLA-B y HLA-DRB1 tienen propiedades homocigotas. El proceso anterior se mostró en el diagrama esquemático de la Figura 2.

Ejemplo 2: Producción de células de tipo homocigoto mediante desactivación monoalélica de los genes HLA-A y HLA-B y desactivación bialélica del gen HLA-DRB1 de acuerdo con la invención

Mediante la edición del genoma en una célula aislada en donde los genes HLA-A, HLA-B y HLA-DRB1 tienen genotipos heterocigotos, se eliminó un par de alelos del gen HLA-DRB1 y se realizó la desactivación monoalélica de los genes HLA-A y HLA-B mediante el uso de una nucleasa para construir de esta manera cuatro tipos de células en donde los genes HLA-A y HLA-B tienen propiedades homocigotas. El proceso anterior se mostró en el diagrama esquemático de la Figura 3.

Ejemplo 3: Introducción del plásmido que expresa la proteína Cas9 y el ARN guía específico de HLA-DRB1 (ARNg de DRB1) en células madre pluripotentes inducidas humanas

Los ADN plasmídicos que expresan una proteína Cas9 y un ARNg de DRB1 se suministraron a una célula madre pluripotente inducida humana #12 (iPSC #12), mediante electroporación. Luego, se extrajo el ADN genómico de las colonias resultantes derivadas de iPSC #12. A continuación, se analizó si se indujo la mutación de inserción-deleción (inserción o deleción) en la secuencia diana dentro del gen DRB1, mediante un ensayo de detección de mutación de la endonucleasa I T7 (T7E1) y los resultados se muestran en la Figura 4.

Como se muestra en la Figura 4, como resultado del análisis, entre 23 líneas celulares iPSC, las iPSC en las que se ha inducido mutación de inserción-deleción en ambos alelos (paterno y materno) del gen DRB1, se determinaron como 7 líneas celulares (flecha roja); la iPSC en donde se indujo inserción y deleción en el alelo #1 (que se muestra como alelo 1) se determinó como 1 línea celular (flecha violeta); y las iPSC en las que se indujo mutación de inserción-deleción en el alelo #2 (mostrado como alelo 2) se determinaron como 4 líneas celulares (flecha azul). Ejemplo 4: Introducción de la proteína Cas 9 y el ARN guía específico de HLA-DRB1 (ARNg de DRB1) en células madre pluripotentes inducidas humanas mediante el uso de electroporación

Se suministraron una proteína Cas9 y un ARNg de HLA-DRB1, no un ADN plasmídico, en la célula madre pluripotente inducida humana #8 (iPSC #8) mediante electroporación. Luego, se extrajo el ADN genómico de las colonias resultantes derivadas de iPSC #8. Posteriormente, se analizó si la mutación de inserción-deleción (inserción o deleción) en la secuencia diana dentro del gen HLA-DRB1 mediante un ensayo de detección de mutación de la endonucleasa I T7 (T7E1), y los resultados se muestran en la Figura. 5.

Como se muestra en la Figura 5, como resultado del análisis, entre un total de 75 líneas celulares iPSC, las iPSC en las que se había inducido mutación de inserción-deleción en el alelo #1 del gen DRB1 (mostrado como alelo 1) se determinaron como siete líneas celulares (flecha roja); y las iPSC en las que se indujo la mutación de insercióndeleción en el alelo #2 (que se muestra como alelo 2), se determinaron como dos líneas celulares (flecha azul). La Figura 5 muestra los resultados del análisis en gel de agarosa de 42 líneas celulares de un total de 75 líneas celulares iPSC analizadas.

Además, se ha encontrado en la Figura 5 que como resultado de inducir la mutación de inserción-deleción, mediante el uso de la célula madre pluripotente inducida humana #8 (iPSC #8), se ha identificado que el clon #8 incluye la mutación de inserción-deleción en el alelo 2 (ver Figura 5). Para verificar esto, la región de la secuencia diana se amplificó mediante PCR, seguido de análisis de secuencia. Los resultados se muestran en la Figura 6.

Como resultado, como se muestra en la Figura 6, se confirmó que no hubo cambios en el alelo 1, pero se insertó un nucleótido ("A") en el alelo 2.

Además, la proteína Cas9 y el ARNg de HLA-DRB1, no el ADN plasmídico, se suministraron a la célula madre pluripotente inducida humana #12 (iPSC #12) mediante electroporación. Luego, se extrajo el ADN genómico de las colonias resultantes derivadas de iPSC #12. Posteriormente, se analizó si la mutación de inserción-deleción (inserción o deleción) en la secuencia diana dentro del gen HLA-DRB1 mediante un ensayo de detección de mutación de la endonucleasa I T7 (T7E1), y los resultados se muestran en la Figura 7.

Como se muestra en la Figura 7, los resultados del análisis mostraron que en los clones #4, #6, #9 y #10, la mutación de inserción-deleción estaba presente en el alelo 1 y no hubo cambios en el alelo 2.

En la Figura 7, entre los clones #4, #6, #9 y #10, en los que se demostró que tenían mutación de inserción-deleción en el alelo 1, se seleccionó el clon #4 y se sometió a verificación para detectar la presencia de esta mutación. Para ello, las regiones de la secuencia diana de los alelos 1 y 2 se amplificaron mediante PCR y luego se sometieron a análisis de secuencia. Los resultados se muestran en la Figura 8.

Como resultado, como se muestra en la Figura 8, se confirmó que se insertó un nucleótido ("A") en el alelo 1 y no hubo cambios en el alelo 2.

Ejemplo 5: Establecimiento de líneas de células madre pluripotentes Drb1 completamente desactivadas

Las proteínas de clase II se expresan principalmente en linfocitos B, macrófagos y células dendríticas. A diferencia de la clase I, su pérdida no desencadena la lisis celular mediada por células NK. Por lo tanto, se crearon hESC con Drbl completamente desactivados.

Para hacer esto, la proteína Cas9 recombinante purificada se complementó con sgARN transcrito in vitro, dirigido al locus Drbl. El complejo de proteína-ARN resultante se transfectó en las líneas H9, CHA15 hES y hiPSC12 mediante electroporación. A las 72 h después de la transfección, las células se disociaron y reemplazaron como células individuales a una densidad muy baja en medio hESC, suplementado con inhibidor de Rho quinasa (ROCK).

Para validar la desactivación de Drbl, se realizó una secuenciación profunda y una secuenciación de Sanger. Entre los clones representativos seleccionados H9, #85 mostró patrones de deleción de 5 nt y 13 nt, CHA15 #34 mostró una inserción de 1 nt de ambos alelos, y se observaron patrones de inserción de 1 nt y de deleción de 32 nt en el clon #13 de hiPSC12 (Figura 9). Todos nuestros clones con Drbl desactivado exhibieron un crecimiento estable y mostraron una morfología redonda y compacta durante 10 pases.

Para validar aún más la pluripotencia de nuestros clones, se realizó inmunotinción. El análisis inmunocitoquímico confirmó que los clones Drb1 KO expresan apropiadamente el marcador de pluripotencia Oct4, Nanog, AP y no se observaron anomalías de cariotipaje (Figura 10).

Ejemplo 6: Establecimiento de las líneas de células madre pluripotentes homocigotas HLA-A y HLA-B y con desactivación de Drb1

Para tener 4 líneas celulares homocigotas HLA-A y B, a continuación, nos dirigimos a HLA-A y HLA-B en clones Dr1b KO.

Mediante el uso de la proteína Cas9 y un método de suministro in vitro del sgARN, de nuevo se establecieron primero células mutantes monoalélicas HLA-A. Se analizó la secuenciación de clones derivados de células individuales, para identificar los clones que tienen patrones de mutación de inserción-deleción monoalélicos en regiones diana. La Figura 11 resume los patrones de mutación y desnatado de clones mutantes monoalélicos HLA-A derivados de la línea celular Drb1 KO CHA 15 hES.

El análisis de T7E1 de los productos de PCR amplificados específicos del alelo mostró una escisión específica en un solo alelo. Los resultados de la secuenciación validaron además que el clon A #69 tiene una inserción de 1 nt en el alelo A*31 y el clon A #300 tiene una deleción de 1 nt en el alelo A*33 (Figura 12).

Después de la validación de la mutación HLA-A, se introdujo el sgARN dirigido al gen HLA-B (Figura 13). Los clones se examinaron mediante secuenciación y T7E1 específico del alelo. Las Figuras 14 y 15 muestran clones representativos, derivados de líneas celulares CHA15 hES. También se realizaron experimentos paralelos en H9 hES e iPS12.

Los presentes inventores no observaron ninguna anomalía morfológica o de crecimiento en los clones. Finalmente, se caracterizó aún más la pluripotencia de un clon H9 que tiene Drbl completamente KO, de los genotipos HLA-A*02+/*03' y HLA-B *35+/*44'. El análisis inmunocitoquímico confirmó que estas células expresaban el marcador de pluripotencia Oct4 y Nanog.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir células inmunocompatibles, que comprende

editar solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, y un par de alelos de HLA-DR mediante deleción génica en una célula aislada, en donde HLA-A y HLA-B son heterocigotos.

2. El método para producir células inmunocompatibles de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la deleción génica se realiza mediante desactivación del gen.

3. El método para producir células inmunocompatibles de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la edición de genes se realiza mediante el uso de una nucleasa modificada genéticamente específica de HLA-A, una nucleasa modificada genéticamente específica de HLA-B o una nucleasa modificada genéticamente específica de HLA-DR.

4. El método para producir células inmunocompatibles de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la nucleasa modificada genéticamente se selecciona del grupo que consiste en nucleasa con dedos de zinc (ZFN), nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (T^{a l} Eⁿ ) y nucleasa modificada genéticamente guiada por ARN (RGEN) opcionalmente, en donde la RGEN comprende un ARN guía que se une específicamente a una secuencia particular del gen HLA-A, HLA-B o HLA-DR y una proteína Cas.

5. El método para producir células inmunocompatibles de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la edición de genes se realiza mediante la introducción en las células de un ARN guía que se une específicamente a una secuencia particular del gen HLA-A, HLA-B o HLA-DR, o ADN que codifica el ARN guía; y un ácido nucleico que codifica una proteína Cas o la propia proteína Cas, en donde opcionalmente, el ARN guía tiene forma de ARN dual que comprende ARNcr y ARNtracr, o un ARN guía monocatenario.

6. El método para producir células inmunocompatibles de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la proteína Cas es una proteína Cas9.

7. El método para producir células inmunocompatibles de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células son células madre o células somáticas, opcionalmente en donde las células madre son células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, células madre embrionarias derivadas de transferencia nuclear de células somáticas no humanas o células madre adultas.

8. El método para producir células inmunocompatibles de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además eliminar alelos de uno o más genes seleccionados de HLA-C, HLA-DP y HLA-DQ mediante edición de genes.

9. El método para producir células inmunocompatibles de acuerdo con la reivindicación 1:

(a) en donde el método es para producir poblaciones celulares; o

(b) el método que comprende además analizar el tipo de HLA de las células producidas.

10. Una población celular que comprende las células inmunocompatibles producidas por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un método para producir una población celular inmunocompatible que comprende:

(a) editar solo un alelo de cada uno de los genes HLA-A y HLA-B, y un par de alelos de HLA-DR mediante deleción génica en una célula aislada, en donde HLA-A y HLA-B son heterocigotos; y

(b) recolectar las células producidas en la etapa (a).

12. El método para producir una población celular inmunocompatible de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además (a') identificar los genotipos HLA de las células aisladas obtenidas de la etapa (a) después de realizar la etapa (a) y antes de realizar la etapa (b).