CN109385405B - 利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系、其构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系、其构建方法及其应用。其中，该SuperH细胞母系是由H9细胞系转入HESPer基因元件形成，HESPer基因元件包括有效连接的第一启动子、HLA‑E基因、Sr39tk基因、第一终止子、loxP序列、第二启动子、筛选基因和第二终止子。应用本发明的技术方案，使用本发明所构建的SuperH细胞系，结合基因编辑系统(例如CRISPR/Cas9基因编辑系统)，可以一次实验对多基因进行调控表达。

Description

利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系、其 构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及细胞系工程改造和分子检测领域，具体而言，涉及一种利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系、其构建方法及其应用。

背景技术

干细胞治疗是通过体外分离或体细胞诱导获得干细胞系，再经定向诱导分化等实验步骤，培养获得的全新的、正常的、更年轻的细胞、组织、器官等，后再移植至体内，代替非正常或死亡的细胞，从而恢复机体功能，达到治疗目的的疗法。干细胞的移植具有广泛的应用，一般能治疗神经系统疾病、免疫系统疾病和其他内外科疾病。干细胞还可以在肝脏部位分泌细胞因子，促进机体的自我修复。但是，干细胞在转移至体内的时候存在着人体免疫系统排斥反应，为了消除这一负面影响，需要构建出低免疫和广适用的细胞系来促进干细胞治疗疗法的发展。现在的研究进展更多的是集中在单一基因影响细胞的免疫性和可用性开发上，难以解决复杂多样的疾病问题。

发明内容

本发明旨在提供一种利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系、其构建方法及其应用，以实现一次实验对多基因进行调控表达。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系。该SuperH细胞母系是由H9细胞系转入HESPer基因元件形成， HESPer基因元件包括有效连接的第一启动子、HLA-E基因、Sr39tk基因、第一终止子、loxP 序列、第二启动子、筛选基因和第二终止子。

进一步地，HESPer基因元件还包括有效连接的增强子，第一启动子不同于第二启动子，第一终止子不同于第二终止子。

进一步地，增强子为CMV增强子。

进一步地，第一启动子为EF1启动子，第一终止子为rb球蛋白聚腺苷酸终止子，第二启动子为PGK启动子，第二终止子为SV40终止子，筛选基因为Bla基因。

进一步地，HESPer基因元件具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸系列。

进一步地，HESPer基因元件插入质粒pHS-AAVS1后转入H9细胞系。

根据本发明的另一方面，提供了一种利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系的构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，构建HESPer基因元件，HESPer基因元件包括依次有效连接的第一启动子、HLA-E基因、Sr39tk基因、第一终止子、loxP序列、第二启动子、筛选基因和第二终止子，其中第一启动子不同于第二启动子，第一终止子不同于第二终止子；S2，将HESPer基因元件连接至质粒；S3，利用基因编辑系统将HESPer基因元件敲入H9细胞系的AAVS1位点上，并利用筛选基因筛选获得SuperH细胞母系。

进一步地，HESPer基因元件还包括有效连接的增强子，优选的，增强子为CMV增强子。

进一步地，第一启动子为EF1启动子，第一终止子为rb球蛋白聚腺苷酸终止子，第二启动子为PGK启动子，第二终止子为SV40终止子，筛选基因为Bla基因。

进一步地，HESPer基因元件具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸系列。

进一步地，HESPer基因元件插入质粒pHS-AAVS1后转入H9细胞系，基因编辑系统为CRISPR/Cas9基因编辑系统。

根据本发明的再一个方面，提供一种SuperH细胞母系在筛选低免疫细胞系中的应用。

进一步地，包括以下步骤：将目标基因的gRNA转入SuperH细胞母系，经gRNA所携带的抗药基因对应的药物筛选获得稳定细胞系后，进行ELISA检测细胞系的免疫反应。

进一步地，gRNA为一个或多个。

应用本发明的技术方案，使用本发明所构建的SuperH细胞系，结合基因编辑系统(例如 CRISPR/Cas9基因编辑系统)，可以一次实验对多基因进行调控表达。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了HESPer基因元件组成示意图；

图2a和2b分别示出了HESPer基因元件装载的pHESPer和pHS-AAVS1-HESPer的质粒图谱；以及

图3示出了装载HLA-A基因的gRNA的载体质粒图谱。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

目前发现的主要的调控细胞免疫性的方式为基因调控(基因表达量的调控)。规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats，CRISPR)和Cas9酶一起可以对基因组进行切割，所以CRISPR/Cas9基因编辑系统适用于目的基因的表达调控，并且CRISPR/Cas9基因编辑系统在细胞中行使功能是被RNA所介导，引导RNA决定了基因组切断的位置。利用这一原理，可以实现目的基因表达被调控，就能够实现对干细胞免疫的调控，以达到降低人体免疫系统的排斥反应。

本发明提供了一种用于低免疫细胞筛选的SuperH细胞母系，更快、更易获得，适合于不同疾病的干细胞治疗的细胞系，即适用于不同免疫型。

根据本发明一个方面，提供了一种利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系，其核心技术是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统在H9细胞系中构建一种可用于筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系。在以SuperH细胞系为母系细胞系，转入不同目的基因的gRNA 用来调控相应的基因表达，用来筛选目的基因是否对SuperH细胞系的免疫调控起作用。本发明还公开了SuperH细胞系筛选低免疫细胞系的使用方法，通过分别转入不同的gRNA或同时转入多种不同的gRNA来获得低免疫反应的细胞系，进一步的结果是根据不同的gRNA组合获得最适的低免疫细胞系。本发明所述的SuperH细胞系能够用于筛选与免疫相关的基因及其相关的gRNA调控的基因的表达情况分析，使用本发明所述的策略所获得的细胞系可用于功能细胞系的初始宿主，在干细胞治疗疗法方面有着重要的意义。

本发明所构建的用于筛选低免疫性的母细胞系--SuperH细胞系具有的优势是简单、快速、多目标基因筛选和获得低免疫细胞系，并使细胞系具有自我识别和控制自杀性的特点，所衍生出来的细胞系具有干细胞治疗的潜力。

构建本发明的SuperH细胞系有助于筛选与免疫相关的基因和获得低免疫的细胞系，并且 SuperH细胞系可以当做初始细胞系，再进一步调控基因后，应用于干细胞移植治疗疗法。本发明中所构建的HESPer基因元件是SuperH细胞系的核心系统。当HESPer基因元件转至宿主基因组上，就是本发明所述的SuperH细胞系，之后转入不同的gRNA通过引导CRISPR/Cas9 系统对候选基因进行筛选。利用细胞系的免疫检测来鉴定候选基因与免疫相关的关联。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的 SuperH细胞母系。该SuperH细胞母系是由H9细胞系转入HESPer基因元件形成，HESPer基因元件包括依次有效连接的第一启动子、HLA-E基因、Sr39tk基因、第一终止子、loxP序列、第二启动子、筛选基因和第二终止子。

优选的，其中第一启动子不同于第二启动子，第一终止子不同于第二终止子，HESPer基因元件还包括有效连接的增强子，更优选的，增强子为CMV增强子，第一启动子为EF1启动子，第一终止子为rb球蛋白聚腺苷酸终止子，第二启动子为PGK启动子，第二终止子为 SV40终止子，筛选基因为Bla基因。

优选的，HESPer基因元件具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸系列： GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATA GCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGA CCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAA CGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCA ATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTT CCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGAATAGCAACA GACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCG ATACTAGTAAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACAT CGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCC TAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGC CTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAAC GTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCT CGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGT TGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGT CTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTG GAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAA CTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACC GGCGCCTACTCTAGAGCTAGCGAAATGGTAGATGGAACCCTCCTTTTACTCCTCT CGGAGGCCCTGGCCCTTACCCAGACCTGGGCGGGCTCCCACTCCTTGAAGTATTT CCACACTTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCTGTGGG CTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGCGCTTCGACAACGACGCCGCGAGTCCGAG GATGGTGCCGCGGGCGCCGTGGATGGAGCAGGAGGGGTCAGAGTATTGGGACC GGGAGACACGGAGCGCCAGGGACACCGCACAGATTTTCCGAGTGAATCTGCGG ACGCTGCGCGGCTACTACAATCAGAGCGAGGCCGGGTCTCACACCCTGCAGTGG ATGCATGGCTGCGAGCTGGGGCCCGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTATGAACAG TTCGCCTACGACGGCAAGGATTATCTCACCCTGAATGAGGACCTGCGCTCCTGGA CCGCGGTGGACACGGCGGCTCAGATCTCCGAGCAAAAGTCAAATGATGCCTCTG AGGCGGAGCACCAGAGAGCCTACCTGGAAGACACATGCGTGGAGTGGCTCCAC AAATACCTGGAGAAGGGGAAGGAGACGCTGCTTCACCTGGAGCCCCCAAAGAC ACACGTGACTCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGC CCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCAGGATGGGGAGGG CCATACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTT CCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACGT GCCATGTGCAGCATGAGGGGCTACCCGAGCCCGTCACCCTGAGATGGAAGCCGG CTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGA TCTGTGGTCTCTGGAGCTGTGGTTGCTGCTGTGATATGGAGGAAGAAGAGCTCA GGTGGAAAAGGAGGGAGCTACTCTAAGGCTGAGTGGAGCGACAGTGCCCAGGG GTCTGAGTCTCACAGCTTGGGATCTGGCGCCACCAACTTCTCTCTGCTGAAGCA GGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGCCCAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCCCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACCACGCAACTGCTGGT GGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGG CGGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGC CTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCC CAGATAACAATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGG GGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCATCTTCCTCGACC GCCATCCCATCGCCTTCATGCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACCTTATGGGCAG CATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCC GGCACCAACATCGTGCTTGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTG GCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTGGACCTGGCTATGCTGGCTGCGATT CGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGTGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGACTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGT GCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTT ACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGATGGCCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTGT TTGCCTGGGCCTTGGACGTCTTGGCCAAACGCCTCCGTTCCATGCACGTCTTTAT CCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACC TCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATATGCG ACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAACTGATAGGCGGCCG CTCTAGAGAATTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTT GTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGGGCG CGTGAATTCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTG GCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTA TGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTT ATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATA TGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCA ACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATC AGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACT TGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAA AATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAG TCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCATAACTTCGTATAGCATACATTATAC GAAGTTATGCGGATCGACAGTACTAAGCTTGGTGCGTTTTTATGCTTGTAGTATTG TATAATGTTTTTAAGATCCTTAATCAGGTCGTCGAAATTCTACCGGGTAGGGGAGG CGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTG GCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCG CCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTA GTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATG GAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGG AAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCT GGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTC AGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCT TCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCG ACCTGCAGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACG ACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCACCC TCATTGAAAGAGCAACGGCTACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAGACTACA GCGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCTAGCGACGGCCGCATCTTCACTGGTGTCAATGT ATATCATTTTACTGGGGGACCTTGTGCAGAACTCGTGGTGCTGGGCACTGCTGCT GCTGCGGCAGCTGGCAACCTGACTTGTATCGTCGCGATCGGAAATGAGAACAGG GGCATCTTGAGCCCCTGCGGACGGTGCCGACAGGTGCTTCTCGATCTGCATCCTG GGATCAAAGCCATAGTGAAGGACAGTGATGGACAGCCGACGGCAGTTGGGATTCGTGAATTGCTGCCCTCTGGTTATGTGTGGGAGGGCTAAGGGGATCAATTCTCTAG AGCTCGCTGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAG CTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTT TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。

优选的，HESPer基因元件插入质粒pHS-AAVS1后转入H9细胞系。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的 SuperH细胞母系的构建方法。该方法包括以下步骤：S1，构建HESPer基因元件，HESPer基因元件包括依次有效连接的第一启动子、HLA-E基因、Sr39tk基因、第一终止子、loxP序列、第二启动子、筛选基因和第二终止子，其中第一启动子不同于第二启动子，第一终止子不同于第二终止子；S2，将HESPer基因元件连接至质粒；S3，利用基因编辑系统将HESPer基因元件敲入H9细胞系的AAVS1位点上，并利用筛选基因筛选获得SuperH细胞母系。

优选的，HESPer基因元件还包括有效连接的增强子，更优选的，增强子为CMV增强子，第一启动子为EF1启动子，第一终止子为rb球蛋白聚腺苷酸终止子，第二启动子为PGK启动子，第二终止子为SV40终止子，筛选基因为Bla基因。

优选的，HESPer基因元件具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸系列。

根据本发明一种典型的实施方式，HESPer基因元件插入质粒pHS-AAVS1后转入H9细胞系，基因编辑系统为CRISPR/Cas9基因编辑系统。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种SuperH细胞母系在筛选低免疫细胞系中的应用。优选的，包括以下步骤：将目标基因的gRNA转入SuperH细胞母系，经gRNA所携带的抗药基因对应的药物筛选获得稳定细胞系后，进行ELISA检测细胞系的免疫反应，优选的， gRNA为一个或多个。

根据本发明一种典型的实施方式，HESPer基因元件构建和装载HESPer基因元件的载体构建，包括下述步骤：

A.HESPer基因元件如图1所示，是通过DNA序列合成的方式获得。

B.合成的HESPer序列需要通过Sanger测序验证。

C.将HESPer基因元件装载至pUC19质粒。

功能性质粒的使用方法，包括以下步骤：

A.使用PCR扩增将HESPer基因元件线性化。

B.将目的片段HESPer连接至线性化的pHS-AAVS1质粒中而获得目的质粒 pHS-AAVS1-HESPer。

C.将步骤B获得的质粒转化至大肠杆菌中，筛选正确的克隆子，并通过Sanger测序验证。

D.将质粒pHS-AAVS1-HESPer和CRISPR/Cas9系统一起转移至H9细胞系中，利用HESPer基因元件的筛选标记Bla筛选获得SuperH细胞系。

在一个实施方式中，SuperH细胞系分别转入不同目的gRNA序列来调控基因的表达，进而来调控细胞系的免疫性。

通过上述方法，本发明得以得到一种筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系。可以应用于筛选与免疫相关的基因，并且通过调控基因的表达来调控细胞系的免疫性。使用本发明所述的母系SuperH细胞能够快速筛选不同免疫度的细胞系，并可以应用于不同的干细胞治疗。

当Sr39tk基因表达时，添加GCV或ACV后，细胞就会死亡。所以当完成治疗后，就杀死外源转入的干细胞；而HLA-E表达于细胞膜，起到细胞系对于机体免疫系统的识别。所以，本发明SuperH细胞系还具有自我识别和自杀的特性，使SuperH细胞系发展出来的细胞系具有干细胞治疗的调控基础。

在本发明中，细胞培养在培养基中直接加入就可；动物实验中，可通过静脉注射。如，可将干细胞移植至肝中，使肝功能恢复，为防止转入的干细胞数量，采用药物进行细胞自杀，达到控制的目的；又如，据The Scientist (https://www.the-scientist.com/news-opinion/first-ips-cell-trial-for-heart-disease-raises-excitement- -concern-64743)报道，Yoshiki Sawa等人在3名患有晚期心力衰竭的心脏中植入干细胞分化的心肌细胞，已达到心脏的新生。如果转入的不是自身重编程的iPS细胞，那么就会出现免疫排斥反应，一般情况下，都需要服用至少3个月以上的免疫抑制剂。所以本发明为了解决排斥反应而产生的低免疫细胞系，以期能够极大提高移植细胞在宿主中的存活率。

在本发明的一个实施方式中，SuperH细胞系转入一个gRNA载体质粒(调控HLA-A基因)，经过初步的药物筛选后的单克隆的RT-PCR实验显示，HLA-A基因是被调控的。另外，利用ELISA实验发现，被调控的单克隆细胞系的免疫性是低于调控前的母细胞系。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

在下述实施例中，所用的酶购自NEB，H9细胞系来自赛贝生物。HESPer基因元件的CMV 增强子、EF1启动子、HLA-E基因、Sr39tk基因、rb球蛋白聚腺苷酸终止子、loxP序列、PGK启动子、Bla基因和SV40终止子的序列信息来自NCBI数据库，合成由金唯智公司完成，并转载到pUC19质粒上(见图2a)。参考图1为基因元件HESPer示意图谱。

本发明通过遗传操作过程获得pHS-AAVS1-HESPer质粒(图2b)，示例性过程如下：

将300ng的质粒pHS-AAVS1的DNA与0.5μl限制性内切酶Bst BI混合，进行酶切，37℃水浴1h，回收后获得线性化载体片段pHS-AAVS1。以HESPer-pUC19质粒为模板，以HESPer-P1 (SEQ ID NO：2)和HESPer-P2(SEQ ID NO：3)为引物扩增HESPer序列。使用SLIC克隆方法连接上述2片段。将100ng的pHS-AAVS1和插入片段HESPer按照摩尔比1：2，利用 0.5U的T4DNA聚合酶于室温下处理2.5分钟，随后冰浴并转化至大肠杆菌中，涂布在含有 Amp平板上筛选正确的克隆子，获得质粒pHS-AAVS1-HESPer，并且进行测序验证。

SEQ ID NO：2

CCTCCACCCCACAGTGGGGCGACATTGATTATTGACTAGT

SEQ ID NO：3

TCACCAATCCTGTCCCTAGTATAACTTCGTATAATGTATG

实施例2

本发明中SuperH细胞系的获得，是通过如下步骤：

当H9细胞系生长到汇合度为60％左右时，收集细胞。将质粒pHS-AAVS1-HESPer和pAVVS1-gRNA一起转至H9中，在药物Bla的作用下，筛选单克隆细胞系。使用引物AAVS1-p1(SEQ ID NO：4)、AAVS1-p2(SEQ ID NO：5)和AAVS1-p3(SEQ ID NO：6)来鉴定SuperH 细胞系中是被插入HESPer基因元件的DNA序列，SuperH细胞系的基因组使用以上引物会获得两条条带，并且进行测序验证。

SEQ ID NO：4

CTCCTGTGGATTCGGGTCACC

SEQ ID NO：5

GAGCCAGTACACGACATCAC

SEQ ID NO：6

GGCTCCATCGTAAGCAAAC

实施例3

为了鉴定目的基因与细胞的免疫相关性的大小，需要将目标基因的目标gRNA装载至载体上，操作如下：

针对目标HLA-A基因进行gRNA设计后，使用引物gRNA-p-01(SEQ ID NO：7)和gRNA-p-02(SEQ ID NO：8)混合后在PCR仪中执行退火程序，获得gRNA01片段。

将300ng的质粒pHS-Cas 9的DNA与限制性内切酶BspQ I酶切(为0.5μl)混合，进行酶切，37℃水浴1h，回收后获得线性化载体pHS-Cas 9。

将上述产物使用T4连接酶连接，并转化至大肠杆菌中，涂布在含有Amp平板上筛选正确的克隆子，获得质粒gRNA01-pHS-Cas 9，并且进行测序验证。

SEQ ID NO：7

GTGGAAAGGACGAAACACCGGGCCCTGACCCAGACCTGGG

SEQ ID NO：8

CCCAGGTCTGGGTCAGGGCCCAGGTCCACTCGGTCAGTCT

实施例4

将质粒gRNA01-pHS-Cas 9转至SuperH细胞系中，通过药物puro筛选获得单克隆细胞系ΔHLA-A-SuperH。使用引物hla-a-p1(SEQ ID NO：9)和hla-a-p2(SEQ ID NO：10)鉴定细胞系ΔHLA-A-SuperH是否是被编辑的细胞系。

取100ul细胞悬液后，加入生理盐水漩涡震荡5min。1000×g离心10min，去上清液，使用Elisa试剂盒测定细胞系ΔHLA-A-SuperH的OD值，来断定细胞系的免疫性是否被调节，在实施例中，HLA-A基因是被降低的，具体结果见表1。本发明所描述的SuperH细胞系，可以被用于筛选被调控的基因是否与免疫性相关。

(SEQ ID NO：9)

GAGAAGCCAATCAGTGTCG

(SEQ ID NO：10)

GTAGCCCACGGCGATGAAG

表1 ELISA测定细胞系的HLA-A含量

为了提高干细胞系的配型效率，减少免疫排斥反应。在免疫系统中，HLA-A具有重要的功能是免疫识别作用。而本发明以减少机体对植入细胞的免疫排斥反应为目的，所以本发明以失活HLA-A为例，来减少机体对非自身细胞的免疫排斥反应。表1的结果显示，当转入 gRNA01后，能够快速获得适合于配型的细胞系。所以说，本发明获得的SuperH细胞系在细胞治疗方面具有广泛的前景。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京赛贝生物技术有限公司

<120> 利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系、其构建方法及其应用

<130> PN94293SBSW

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5118

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5118)

<223> HESPer基因元件

<400> 1

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gaatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca 420

aattacaaaa attcaaaatt ttatcgatac tagtaaggat ctgcgatcgc tccggtgccc 480

gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca 540

attgaacggg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact 600

ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga 660

acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga ggggctcgca 720

tctctccttc acgcgcccgc cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg ttgagtcgcg 780

ttctgccgcc tcccgcctgt ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag gtaagtttaa 840

agctcaggtc gagaccgggc ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct agactcagcc 900

ggctctccac gctttgcctg accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt tcgttttctg 960

ttctgcgccg ttacagatcc aagctgtgac cggcgcctac tctagagcta gcgaaatggt 1020

agatggaacc ctccttttac tcctctcgga ggccctggcc cttacccaga cctgggcggg 1080

ctcccactcc ttgaagtatt tccacacttc cgtgtcccgg cccggccgcg gggagccccg 1140

cttcatctct gtgggctacg tggacgacac ccagttcgtg cgcttcgaca acgacgccgc 1200

gagtccgagg atggtgccgc gggcgccgtg gatggagcag gaggggtcag agtattggga 1260

ccgggagaca cggagcgcca gggacaccgc acagattttc cgagtgaatc tgcggacgct 1320

gcgcggctac tacaatcaga gcgaggccgg gtctcacacc ctgcagtgga tgcatggctg 1380

cgagctgggg cccgacgggc gcttcctccg cgggtatgaa cagttcgcct acgacggcaa 1440

ggattatctc accctgaatg aggacctgcg ctcctggacc gcggtggaca cggcggctca 1500

gatctccgag caaaagtcaa atgatgcctc tgaggcggag caccagagag cctacctgga 1560

agacacatgc gtggagtggc tccacaaata cctggagaag gggaaggaga cgctgcttca 1620

cctggagccc ccaaagacac acgtgactca ccaccccatc tctgaccatg aggccaccct 1680

gaggtgctgg gccctgggct tctaccctgc ggagatcaca ctgacctggc agcaggatgg 1740

ggagggccat acccaggaca cggagctcgt ggagaccagg cctgcagggg atggaacctt 1800

ccagaagtgg gcagctgtgg tggtgccttc tggagaggag cagagataca cgtgccatgt 1860

gcagcatgag gggctacccg agcccgtcac cctgagatgg aagccggctt cccagcccac 1920

catccccatc gtgggcatca ttgctggcct ggttctcctt ggatctgtgg tctctggagc 1980

tgtggttgct gctgtgatat ggaggaagaa gagctcaggt ggaaaaggag ggagctactc 2040

taaggctgag tggagcgaca gtgcccaggg gtctgagtct cacagcttgg gatctggcgc 2100

caccaacttc tctctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaacccag gcccaatgcc 2160

cacgctactg cgggtttata tagacggtcc ccacgggatg gggaaaacca ccaccaccac 2220

gcaactgctg gtggccctgg gttcgcgcga cgatatcgtc tacgtacccg agccgatgac 2280

ttactggcgg gtgctggggg cttccgagac aatcgcgaac atctacacca cacaacaccg 2340

cctcgaccag ggtgagatat cggccgggga cgcggcggtg gtaatgacaa gcgcccagat 2400

aacaatgcct tatgccgtga ccgacgccgt tctggctcct catatcgggg gggaggctgg 2460

gagctcacat gccccgcccc cggccctcac catcttcctc gaccgccatc ccatcgcctt 2520

catgctgtgc tacccggccg cgcggtacct tatgggcagc atgacccccc aggccgtgct 2580

ggcgttcgtg gccctcatcc cgccgacctt gcccggcacc aacatcgtgc ttggggccct 2640

tccggaggac agacacatcg accgcctggc caaacgccag cgccccggcg agcggctgga 2700

cctggctatg ctggctgcga ttcgccgcgt ttacgggcta cttgccaata cggtgcggta 2760

tctgcagtgc ggcgggtcgt ggcgggagga ctggggacag ctttcgggga cggccgtgcc 2820

gccccagggt gccgagcccc agagcaacgc gggcccacga ccccatatcg gggacacgtt 2880

atttaccctg tttcgggccc ccgagttgat ggcccccaac ggcgacctgt ataacgtgtt 2940

tgcctgggcc ttggacgtct tggccaaacg cctccgttcc atgcacgtct ttatcctgga 3000

ttacgaccaa tcgcccgccg gctgccggga cgccctgctg caacttacct ccgggatggt 3060

ccagacccac gtcaccaccc ccggctccat accgacgata tgcgacctgg cgcgcacgtt 3120

tgcccgggag atgggggagg ctaactgata ggcggccgct ctagagaatt cgatatcaag 3180

cttatcgata atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac 3240

tatgttgctc cttttacgct atgtggggcg cgtgaattca ctcctcaggt gcaggctgcc 3300

tatcagaagg tggtggctgg tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt 3360

tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc 3420

taataaagga aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc 3480

ggaaggacat atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt 3540

ttggcaacat atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat 3600

cagtatatga aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga 3660

ggttagattt tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt 3720

tccttacatg ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct 3780

gtccctcttc tcttatggag atcataactt cgtatagcat acattatacg aagttatgcg 3840

gatcgacagt actaagcttg gtgcgttttt atgcttgtag tattgtataa tgtttttaag 3900

atccttaatc aggtcgtcga aattctaccg ggtaggggag gcgcttttcc caaggcagtc 3960

tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc 4020

tcgcacacat tccacatcca ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt 4080

cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc 4140

gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga tggacagcac 4200

cgctgagcaa tggaagcggg taggcctttg gggcagcggc caatagcagc tttgctcctt 4260

cgctttctgg gctcagaggc tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct 4320

caggggcggg gcgggcgccc gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca cgcttcaaaa 4380

gcgcacgtct gccgcgctgt tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga cctgcagcct 4440

gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac 4500

taaaccatgg ccaagccttt gtctcaagaa gaatccaccc tcattgaaag agcaacggct 4560

acaatcaaca gcatccccat ctctgaagac tacagcgtcg ccagcgcagc tctctctagc 4620

gacggccgca tcttcactgg tgtcaatgta tatcatttta ctgggggacc ttgtgcagaa 4680

ctcgtggtgc tgggcactgc tgctgctgcg gcagctggca acctgacttg tatcgtcgcg 4740

atcggaaatg agaacagggg catcttgagc ccctgcggac ggtgccgaca ggtgcttctc 4800

gatctgcatc ctgggatcaa agccatagtg aaggacagtg atggacagcc gacggcagtt 4860

gggattcgtg aattgctgcc ctctggttat gtgtgggagg gctaagggga tcaattctct 4920

agagctcgct ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt 4980

ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 5040

tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatataact tcgtatagca 5100

tacattatac gaagttat 5118

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> 引物HESPer-P1

<400> 2

cctccacccc acagtggggc gacattgatt attgactagt 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> 引物HESPer-P2

<400> 3

tcaccaatcc tgtccctagt ataacttcgt ataatgtatg 40

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<223> 引物AAVS1-p1

<400> 4

ctcctgtgga ttcgggtcac c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> 引物AAVS1-p2

<400> 5

gagccagtac acgacatcac 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<223> 引物AAVS1-p3

<400> 6

ggctccatcg taagcaaac 19

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> 引物gRNA-p-01

<400> 7

gtggaaagga cgaaacaccg ggccctgacc cagacctggg 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> 引物gRNA-p-02

<400> 8

cccaggtctg ggtcagggcc caggtccact cggtcagtct 40

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<223> 引物hla-a-p1

<400> 9

gagaagccaa tcagtgtcg 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<223> 引物hla-a-p2

<400> 10

gtagcccacg gcgatgaag 19

Claims (5)

1.一种利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系，其特征在于，所述SuperH细胞母系是由H9细胞系转入HESPer基因元件形成，所述HESPer基因元件包括有效连接的第一启动子、HLA-E基因、Sr39tk基因、第一终止子、loxP序列、第二启动子、筛选基因和第二终止子；所述HESPer基因元件还包括有效连接的增强子，所述第一启动子不同于所述第二启动子，所述第一终止子不同于所述第二终止子；所述HESPer基因元件的序列如SEQID NO：1所示。

2.一种如权利要求1所述的利用基因编辑系统筛选低免疫细胞系的SuperH细胞母系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，构建HESPer基因元件，所述HESPer基因元件的序列如SEQ ID NO：1所示；

S2，将所述HESPer基因元件连接至质粒；

S3，利用基因编辑系统将所述HESPer基因元件敲入所述H9细胞系的AAVS1位点上，并利用所述筛选基因筛选获得所述SuperH细胞母系。

3.一种如权利要求1所述的SuperH细胞母系在筛选低免疫细胞系中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将目标基因的gRNA转入所述SuperH细胞母系，经所述gRNA所携带的抗药基因对应的药物筛选获得稳定细胞系后，进行ELISA检测细胞系的免疫反应。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述gRNA为一个或多个。

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