KR20220084296A

KR20220084296A - 형질전환 돼지, 이의 제조 방법 및 용도, 그리고 인간 면역계 마우스를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20220084296A
Application number: KR1020227012957A
Authority: KR
Inventors: 메간 사이크스; 로버트 제이. 홀리
Original assignee: 더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2022-06-21
Also published as: CN114585744A; AU2020370254A1; WO2021081156A1; US20220279767A1; CA3155234A1; EP4048802A1; EP4048802A4; IL292406A; JP2022553328A

Abstract

본 개시내용은 돼지 게놈의 하나 이상의 천연 SLA 유전자좌에 삽입된 하나 이상의 HLA I 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 HLA II 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 형질전환 돼지, 이의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 인간 면역계 마우스를 제조하는 개선된 방법을 제공한다.

Description

형질전환 돼지, 이의 제조 방법 및 용도, 그리고 인간 면역계 마우스를 제조하는 방법

다른 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2019년 10월 22일자로 출원된 미국 특허출원 일련번호 제62/924,228호 및 2019년 10월 25일자로 출원된 미국 특허출원 일련번호 제62/925,859호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 둘 다는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.

정부 이익의 진술

본 출원은 미국국립보건원(National Institutes of Health)이 수여한 AI045897에 띠라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.

분야

본 개시내용은 돼지 게놈의 하나 이상의 천연 SLA 유전자좌에 삽입된 하나 이상의 HLA I 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 HLA II 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 형질전환 돼지(transgenic swine), 및 이의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 인간 면역계 마우스를 제조하는 개선된 방법을 제공한다.

인간 면역계(HIS) 마우스는 인간 자가면역 질환, 이식 및 감염성 질환의 연구에 엄청난 잠재력을 가지고 있다. 면역결핍 마우스에서 강력한 인간 면역계를 생성하는 데 필요한 중요한 조직은 태아 인간 흉선 조직이며, 상기 조직은 인간 T 세포의 고도로 기능적이고, 다양한 레퍼토리를 생성한다. 출생 후 인간 흉선 조직은 피막(capsule)이 배치된 뮤린 신장보다 더 커지도록 생성될 수 있는 다수의 인간 T 세포를 생성할 수 있는 성장 잠재력이 부족하다. 일부 인간 T 세포는 면역 결핍 마우스의 천연 뮤린 흉선에서 발생하지만, 흉선 기능이 비정상적이고 무질서하며, 적절한 내성 유도에 필요한 정상적인 흉선 교육을 받지 않은 소수의 인간 T 세포만이 생성된다. 따라서 인간 태아 흉선 조직은 HIS 마우스 모델에 최적인 것으로 간주된다. 그러나, 연구를 위한 인간 태아 조직의 가용성은 제공되지 않는다. 따라서, 조직의 대안적인 공급원이 필요하다.

태아 돼지 흉선 조직이 해당 대안을 제공할 수 있다. 태아 돼지(SW) 흉선(THY) 조직은 면역결핍 마우스에 이식될 때 인간(HU) 태아 THY 조직과 유사한 성장 특징을 가지며, 인간 CD34+ 세포로부터 높은 수준의 강력한 인간 흉선세포발달(thymopoiesis) 및 말초 면역 재구성을 지원한다. 그러나, SW 흉선 상피 세포(TEC)에서 HLA 분자의 부재는 기존 T 세포의 음성 선택과 TEC에 의해 생성된 HLA-제한 항원(TRA)을 인식하는 조절 T 세포의 양성 선택을 제한한다. 또한 개인의 HLA의 맥락에서 외래 항원을 인식할 수 있는 인간 T 세포의 양성 선택을 제한한다. 따라서, 태아 돼지 흉선 조직을 사용하여 HIS 마우스를 생성할 때 개선이 필요하다. 추가적으로, 인간에 대한 이종장기이식과 같은 다른 적응증에 돼지 흉선 조직을 사용할 경우 개선이 필요한다.

태아 돼지 흉선 조직을 사용하여 인간 면역계 마우스를 생성하는 개선된 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 또한 형질전환 돼지가 본 명세서에 기재되어 있다.

형질전환 돼지, 이와 같은 돼지를 생성하는 방법, 및 이와 같은 돼지의 용도가 본 명세서에서 제공된다.

일 실시형태에서, 형질전환 돼지는 돼지 게놈의 하나 이상의 천연 SLA 유전자좌에 삽입된 하나 이상의 HLA I 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 HLA II 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 인간 HLA는 HLAI 폴리펩타이드 및 HLAII 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 인간 HLA1은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, HLAI 폴리펩타이드는 HLA-A2이다.

일부 실시형태에서, HLA II 폴리펩타이드는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DQ, 및 HLA-DR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, HLA II 폴리펩타이드는 HLA-DQ8 또는 SLA-DRa이다. 일부 실시형태에서, HLA-DQ8 폴리펩타이드는 HLA-DQ8(HLA-DQA1:03:01:01 및 HLA-DQB1:03:02:01)을 인코딩하는 바이시스트론(bicistronic) 벡터를 통해 천연 SLA-DQα 유전자좌에 대해 표적화된다.

일부 실시형태에서, 천연 SLA 유전자좌는 SLA-1, SLA-2 또는 SLA-3이다. 일부 실시형태에서, SLA 유전자좌는 SLA-DQα 또는 SLA-DR□ 유전자좌이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 천연 SLA 프로모터 뒤에 삽입되거나 통합된다. 일부 실시형태에서, HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 천연 SLA 유전자좌의 인트론 1/엑손 2 접합부에 삽입되거나 통합된다.

일부 실시형태에서, HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 표적화 벡터를 사용하여 천연 SLA 유전자좌에 삽입되거나 통합된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이시스트론성이다. 일부 실시형태에서, 벡터에는 프로모터가 없다.

일부 실시형태에서, 벡터는 고효율 IRES 요소를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 벡터는 폴리아데닐화 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리아데닐화 부위는 토끼 β-글로빈이다.

또한 형질전환 돼지를 생성하는 방법, 및 이의 용도(인간 대상체로의 이종장기이식을 포함하지만, 이로 제한되지 않음)가 본 명세서에서 제공된다.

인간 면역계 마우스를 생성하는 개선된 방법이 본 명세서에서 제공된다.

일부 실시형태에서, 방법은 마우스의 흉선을 절제하는 단계 및 돼지 태아 흉선 조직 및 인간 CD34+ 세포를 마우스에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 CD34+ 세포는 제대혈에서 유래된다.

일부 실시형태에서, 방법은 마우스의 흉선을 절제하는 단계 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 형질전환 돼지 유래의 돼지 태아 흉선 조직을 도입하는 단계를 포함한다.

본 발명을 예시할 목적으로, 본 발명의 특정 실시형태가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다.
도 1. 삭스 미니 돼지(Sachs Miniature Swine) GGTA1 유전자좌로의 다유전자(multigenic) 삽입. 도 1A는 동일한 게놈 표적화 암(arm) 분절(청색) 사이에서 CRIPSR-보조 상동 재조합을 통해 삽입된 10.5 kbp 이식유전자 카세트의 개략도이다. 카세트는 자가-스플라이싱 2A 요소(노랑색)에 의해 연결된 2개의 바이시스트론 단위를 포함하며, 둘 다 편재적으로 발현되는 CAG 프로모터에 의해 구동된다. 도 1B는 클로닝된 형질전환 돼지(우측 피크) 및 비-형질전환 대조군(좌측 피크)으로부터의 말초 혈액 림프구의 FCM 분석 결과이다.
도 2. 천연 돼지 ILRa 프로모터 뒤에 인간 IL3 수용체를 인코딩하는 바이시스트론 카세트의 표적화된 삽입. 도 2A는 IL3Ra 유전자의 하류 게놈 영역을 나타낸다(상단). IL3Ra 유전자의 pA 부위를 통한 엑손 2는 청색으로 나타나 있다. SLC25A6 유전자의 pA 부위를 통한 엑손 2는 적색으로 나타나 있다. 인간 IL3Ra 및 IL3Rb 사슬의 첨가를 위한 표적화 벡터는 하단에 나타나 있다. 동일한 게놈 서열(청색 및 적색 실선) 사이의 상동 재조합은 천연 IL3Ra 유전자의 대부분을 포함하는 15.7 kbp의 천연 게놈 서열을, 인간 IL3R 사슬을 인코딩하고 (T2A 요소를 통해) GFP CDS(녹색)로 SLC25A6 유전자의 말단을 태깅하는 7.1 kbp의 서열로 대체한다. 도 2B는 프로모터 트랩 벡터로 형질감염된 태아 섬유아세포의 제2차 라운드의 유세포 분류를 나타낸다. 낮은 GFP 형광 세포(백색)와 높은 형광 세포(황색)를 별도로 회수하였다. 도 2C는 유세포 분류 집단의 표적화 분석 결과이다. 밴드를 생성한 벡터 서열 외부에 하나의 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 게놈 DNA의 상류 및 하류 말단에서 PCR을 수행하였고 이는 저형광 분획 및 고형광 분획 둘 다에서 상류 말단의 적절한 표적화를 나타낸 반면, 하류 말단에서의 PCR은 고형광 집단에서만 예상된 크기의 밴드를 생성하였다. 도 2D는 고형광 분류 집단 유래의 세포를 이용하여 SCNT에 의해 생성된 8마리의 39일 태아의 게놈 DNA의 표적화 분석 결과를 나타낸다. 8마리의 태아는 모두 상류(US) 및 하류(DS) 말단 둘 다에서 적절한 표적화를 나타내는 밴드를 생성하였다. 도 2E는 8마리의 형질전환 태아 유래의 간 세포에서 유전자 발현의 RT-PCR 분석 결과이다. 예상한 바와 같이, 8마리의 태아는 모두 재조합 SLC25A6-GFP 유전자로부터 전사체를 생성하였다. 또한 8마리는 모두 인간 IL3Ra-IRES-IL3Rb 카세트로부터 적절하게 스플라이싱된 전사체를 생성하였다.
도 3은 SLA I 유전자의 HLA-A2 표적화를 나타내는 도면. 상단 개략도는 천연 유전자이다. 하단 개략도는 프로모터가 없는 표적화 벡터이다. 프로모터가 없는 표적화 벡터를 이용하여, 천연 유전자좌의 SLA 인트론 1/엑손 2 접합부 근처에서 쌍을 형성한 CRISPR/Cas9 닉(nick)에 의해 향상된 재조합은 HLA-A2(A*02:01)의 성숙한 코딩 서열에 융합된 인간 B2 마이크로글로불린의 성숙한 형태로 구성된 카세트의 첨가를 초래한다. 융합 단백질에 대한 리더 펩타이드는 SLA1 엑손 1에 의해 제공되며 생성된 전사체는 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 부위에서 종결된다. 벡터의 프로모터가 없는 설계로 인해, 인간 인간 B2m/HLA-A2 융합체를 발현하는 세포의 매우 높은 비율이 DQA 유전자를 적절하게 표적화할 것이다.
도 4는 IFN-g와 함께(우측 곡선) 또는 IFN-g 없이(좌측 곡선) 배양 6일 후 범-일배체형 항-돼지 DR 또는 항-돼지 DQ 항체로 염색된 세포의 유세포분석 결과를 나타내는 도면.
도 5는 SLA-DQA 유전자의 HLA-DQ8 표적화를 나타내는 도면. 상단 개략도는 천연 유전자이다. 하단 개략도는 프로모터가 없는 표적화 벡터이다. 프로모터가 없는 표적화 벡터를 이용하여, 천연 유전자좌의 DRA 인트론 1/엑손 2 접합부 근처에서 쌍을 형성한 CRISPR/Cas9 닉에 의해 향상된 재조합은 DQ8α(DQA* 03:01)의 성숙한 형태, IRES 요소 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 부위로 종결되는 DQ8β(DQB1*03:02)의 전구체 형태로 구성된 카세트의 첨가를 초래한다. 벡터의 프로모터가 없는 설계로 인해, 인간 DQ8α 및 DQ8β를 발현하는 매우 높은 비율의 세포가 DQA 유전자를 적절하게 표적화할 것이다.
도 6은 HIS 마우스에서 인간 T 세포 항상성에 대한 흉선과 말초 APC 사이의 HLA 공유의 중요성을 나타내는 연구를 보이는 도면. 도 6A는 실험 설계의 개략도이다. 도 6B는 입양 전이 10일 후 마우스의 각각의 유형에서 증식하는 (Ki67+) T 세포의 비율의 그래프이다.
도 7은 다양한 HIS 마우스에서 인간 면역 재구성의 비교를 나타내는 도면. 도 7A는 전이 후 표시된 시간에 표시된 마우스의 말초 혈액에서 인간 CD3+ 세포의 수의 그래프이다. 도 7B는 이식 후 15주째에 대표적인 마우스로부터의 T 세포의 표현형을 나타내는 유세포 분석 결과이다.
도 8은 HLA-A2+ 인간 흉선에서 MART1 TCR에 대한 양성 선택을 보이지만 돼지 흉선에서는 그렇지 않음을 나타내는 도면. CD34 세포를 GFP-MART1 TCR을 이용하여 렌티바이러스로 형질도입하였고 표시된 THY 이식편을 받은 흉선이 절제된 NSG 마우스로 주입하였다. 그래프는 HLA-A2+ HU THY 이식편과 비교하여 SW 및 HLA-A2-음성 HU THY 이식편에서 GFP+MART1+ TCR+(MART1 사량체로 검출됨) 흉선세포 수의 감소를 나타낸다.
도 9는 인간 조혈 줄기 세포에 도입될 때 HLA-제한된 TCR인 클론 5(HLA-DQ8에 의해 제시된 인슐린 B 9-23에 특이적임)가 HIS 마우스의 HLA-DQ8 인간 흉선에서 양성으로 선택되지만 조혈 줄기 세포가 HLA-DQ8을 발현하는 경우에만 음성으로 선택되는 증거를 나타내는 도면. HLA-DQ8 Tg NSG 마우스는 클론 5 TCR을 이용하여 형질도입된 HLA-DQ8+ 인간 태아 흉선 및 HLA-DQ8 또는 DQ8- 태아 간 CD34+ HSC를 받았다. 도 9A는 DQ8-음성 HSC와 비교하여 DQ8+를 받은 마우스의 흉선에서 GFP+ 클론 5 CD4/8DP 및 SP 흉선세포의 절대 수가 감소되었음을 나타낸다. 도 9B는 DQ8- HSC와 비교하여 DQ8+를 받은 마우스의 흉선에서 이중 음성 흉선세포 중 T 세포 계통 위임(CD1a+) 클론 5(GFP+) 세포의 풍부화를 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA에서 유래되는 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "단리된"은 실질적으로 다른 물질이 없는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기능적"은 특정한 명시된 효과를 달성하는 것을 의도하기 위해 임의의 분자, 생물학적 물질 또는 세포 물질을 수식하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 어느 하나의 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭하는 데 호환 가능하게 사용된다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩타이드모방체의 2개 이상의 서브유닛의 화합물을 지칭하는 데 호환 가능하게 그리고 가장 넓은 의미로 사용된다. 서브유닛은 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 양태에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어 에스터, 에터 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 포함하여야 하며, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 한계가 없다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체 둘 다, 아미노산 유사체 및 펩타이드모방체를 포함하여 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "표적화하다", "표적화한다" 또는 "표적화"는 폴리뉴클레오타이드의 공유 골격이 부분적으로 파손되거나 파손되지 않는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 비활성화된 Cas 단백질(또는 dCas)은 가이드 RNA와 DNA-결합 복합체를 형성한 후 뉴클레오타이드 서열을 표적화한다. dCas의 뉴클레아제 활성은 완전히 또는 부분적으로 비활성화되기 때문에, dCas는 서열을 절단하거나 완전히 절단하지 않고 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, dCas로 유전자 서열 또는 이의 프로모터를 표적화하는 것은 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자의 전사 및/또는 발현을 저해하거나 방지할 수 있다.

용어 "Cas9"는 이 명칭으로 지칭되는 CRISPR 연관 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 비제한적인 예시적 Cas9로는, 예를 들어 UniProtKB G3ECR1(CAS9_STRTR)에서 제공되는 Cas9 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9뿐만 아니라, 뉴클레아제 사멸 Cas9, 이들 각각의 이종상동체(ortholog) 및 생물학적 등가물이 본 명세서에서 제공된다. 이종상동체는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9("spCas9"), 스트렙토코커스 써모필레스(Streptococcus thermophiles), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9; 및 아시다미노코커스 종(Acidaminococcus spp.) 및 프란시셀라 노비시다 U112(Francisella novicida U112)를 포함하는 다양한 박테리아 종 유래의 Cpf1(Cas9와 유사한 절단 기능을 수행함)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CRISPR"는 일정한 간격으로 놓인 짧은 회문 반복 서열 집합 경로에 의존하는 서열 특이적 유전자 조작 기법을 지칭한다. CRISPR는 유전자 편집 및/또는 유전자 조절을 수행하는 데뿐만 아니라, 특정 게놈 위치에 단백질을 단순히 표적화하는 데 사용될 수 있다. 유전자 편집은 표적 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 폴리뉴클레오타이드 서열에의 결실, 삽입, 또는 염기 치환의 도입을 통해 변화되는 유전 공학의 일종을 지칭한다. 유전자 조절은 단백질 또는 RNA와 같은 특정 유전자 산물의 생성을 증가시키거나 감소시키는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "gRNA" 또는 "가이드 RNA"는 CRISPR 기법을 이용하여 교정을 위해 특정 유전자를 표적화하는 데 사용되는 가이드 RNA 서열을 지칭한다. 표적 특이성을 위해 gRNA 및 공여체 치료용 폴리뉴클레오타이드를 설계하는 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Doench, et al. 2014. Nature biotechnology 32(12):1262-7, Mohr, et al. 2016. FEBS Journal 3232-38, 및 Graham, et al. 2015. Genome Biol. 16:260]. gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRIPSPR RNA(tracrRNA)를 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드; 또는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRIPSPR RNA(tracrRNA)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 대안적으로는 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 추가로 이로 이루어진다. 일부 양태에서, gRNA는 합성이다(Kelley, et al. 2016. J of Biotechnology 233:74-83). 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, gRNA의 생물학적 등가물은 Cas9 또는 이의 등가물을 세포 게놈의 특정 영역과 같은 특정 뉴클레오타이드 서열로 안내할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 표적화 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

용어 "배아"는 다세포 유기체의 발달 초기 단계를 지칭한다. 일반적으로, 유성 생식을 하는 유기체에서, 배 발달은 수정 직후에 시작되어 조직 및 기관과 같은 신체 구조의 형성을 통해 계속되는 생애 주기의 일부를 지칭한다. 각각의 배아는 배우자의 융합(즉, 수컷 정세포에 의한 암컷 난세포의 수정)으로 생성되는 단일 세포인 접합체로 발달을 시작한다. 배 발달의 첫 번째 단계에서, 단세포 접합체는 난할이라고 하는 다수의 빠른 세포 분열을 거쳐, 포배를 형성한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "형질전환(transgenic)" 및 이의 문법적 동등어는 (존재하는 경우) 유전자의 상동성, 내인성 형태가 전체 또는 부분적으로 유지되도록 비-이종상동성, 비-내인성 위치에서 공여체 동물의 게놈 내로 상이한 종 유래의 비-천연 유전자를 도입하도록 변형된 공여체 동물 게놈을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "이식유전자(transgene)", "형질전환" 및 문법적 동등어는 본 명세서에 기재된 바와 같은 재프로그래밍된 게놈, 녹아웃 또는 다른 변형을 포함하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "내성"은, 예를 들어 그렇지 않으면 비 자가 MHC 항원을 수용체에 도입하는 것에 대한 반응으로 발생할 수 있는, 예를 들어 공여체 항원에 대한 면역 반응을 시작할 수 있는 이식 수용체의 능력의 저해 또는 감소를 지칭한다. 내성은 체액성, 세포성, 또는 체액성 및 세포성 반응 둘 다를 포함할 수 있다. 내성의 개념은 완전 내성 및 부분 내성을 둘 다 포함한다. 다시 말해서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 내성은, 예를 들어 공여체 항원에 대한 면역 반응을 시작하는 이식 수용체의 능력의 임의의 저해 정도를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "조혈 줄기 세포"는 성숙한 골수성 및/또는 림프성 세포로 발달할 수 있는 세포를 지칭한다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포는 골수성 및/또는 림프성 계통을 장기간 재증식할 수 있다. 수용체 또는 공여체의 제대혈에서 유래된 줄기 세포는 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "미니 돼지"는 완전히 또는 부분적으로 근친교배한 미니 돼지를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "이식편"은 신체 부분, 기관, 조직, 세포, 또는 이들이 일부를 지칭한다.

약어

SW- 돼지

HU- 인간

TEC- 흉선 상피 세포

TMC- 흉선 중간엽 세포

WBC- 백혈구

DP- 이중 양성 세포(CD4+, CD8+ 둘 다)

SP- 단일 양성 세포(CD4+ 또는 CD8+ 중 어느 하나)

Treg- 조절 T 세포

LN- 림프절

TRA- 조직 제한 항원

HSC- 인간 조혈 세포

NSG- NOD scid 공통 γ 사슬 녹아웃

SCNT- 체세포 핵 이식

본 개시내용은 돼지 게놈의 SLA 유전자좌에 삽입된 HLA I 또는 HLA II 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 형질전환 돼지, 이와 같은 형질전환 돼지를 생성하는 방법, 및 이와 같은 형질전환 돼지를 사용하는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 형질전환 태아 돼지 유래의 흉선을 사용하여 생성된 인간 면역계(HIS) 마우스뿐만 아니라 태아 돼지 유래의 흉선 및 제대혈 유래의 CD34+ 세포를 사용하여 생성된 인간 면역화 마우스, 및 이와 같은 HIS 마우스를 생성하는 방법을 제공한다.

형질전환 돼지

본 발명자들은 이전에 돼지 흉선 이식편에서 강력한 인간 흉선세포발달이 일어난다는 것을 보인 바 있다(Nikolic, et al. 1999; Shimizu, et al. 2008; Kalscheuer, et al. 2014). 그러나, 인간 태아 흉선과 비교하여 돼지에서 생성된 말초 인간 T 세포는 HLA-제한 면역 기능과 조직 제한 항원에 대한 항상성 및 내성에서 미묘한 손상을 나타낸다. 돼지 흉선 조직에 형질전환 HLA 분자를 추가하면 이러한 한계의 대부분을 극복할 수 있다. 따라서, 일부 돼지 백혈구 항원(SLA, HLA의 돼지 대응물) 분자 대신 공통 HLA 대립유전자를 발현하는 형질전환 돼지의 몇몇 계통이 본 명세서에 개시되어 있다. 이러한 형질전환 돼지는 HIS 마우스를 생성하는 것을 포함하여 많은 목적을 위해 흉선 조직의 공급원으로서 그리고 공여체 조직으로서 사용될 수 있다. 공통 HLA 분자의 형질전환 발현은 HLA-제한 인간 T 세포의 양성 선택 및 말초에서 인간 항원-제시 세포(APC)와 효과적으로 상호작용하는 기능적 조절 T(Treg) 세포의 생성을 개선할 것이고 인간 TRA-반응성 T 세포의 음성 선택을 개선할 것이며, 이에 의해 자가면역의 위험을 감소시킬 것이다.

돼지 흉선신장 이식편을 받은 개코원숭이는 돼지 흉선 이식편에서 새로운 수용체 (개코원숭이) 흉선세포발달, 말초에서 최근 흉선 이주물의 출현, 및 Elispot 및 MLR 분석에서 공여체-특이적 무반응뿐만 아니라, 비-Gal 천연 항체 감소의 증거를 나타내었다. 후자는 돼지 신장에 의한 흡수를 반영할 수 있지만, 보체 고정 또는 상당한 병적 측면 없이 이러한 이종이식편에서 최소한의 IgM 결합이 검출되었다. 따라서, 이 모델로 얻은 결과는 영장류에서 내성을 유도하는 복합 흉선-신장 이종지식편의 가능성을 입증한다.

이종 돼지 흉선에서 인간 T 세포 레퍼토리를 생성하는 것의 한계는 돼지 MHC 상의 미생물 항원의 우선적 인식을 포함하며, 이는 이식편을 보호하는 데 유용하지만, 숙주를 감염시키는 미생물 병원체에 대한 보호를 최적화하지 않을 뿐만 아니라 기존 T 세포를 음성으로 선택하고 인간 조직-제한 항원(TRA)을 인식하는 Treg를 양성으로 선택하지 못한다. 실제로, 인간화 마우스에서의 연구는 인간 T 세포가 인간 흉선 이식편보다는 돼지에서 발달할 때 면역화 후 인간 APC에 의해 제시되는 펩타이드에 대한 감소된 반응을 나타내었다.

이러한 한계를 극복하기 위한 한 가지 접근법은 "하이브리드 흉선"의 생성을 포함하며, 여기서 흉선 절제 표본에서 얻거나 줄기 세포에서 생성된 수용체 흉선 상피 세포는 돼지 흉선 조직에 주입된다. 출생 후 흉선 공여체로부터 하이브리드 흉선이 생성되었으며, 여기서 하이브리드 흉선은 인간 T 세포 중에서 인간 TRA에 대한 내성을 촉진시킨다.

돼지 흉선 이식편은 정상적이고 다양한 뮤린 또는 인간 T 세포 레퍼토리의 발달을 지원하는 것으로 나타났으며, 이러한 T 세포는 이종 돼지 공여체에 대해 특이적으로 내성이다. 그러나, 말초에서 수용체 HLA 분자에 의해 제시되는 외래 항원의 인식은 최적이 아니다. 따라서, 면역 기능이 최적보다 낮을 수 있다. 이전에 공동 출원인 제PCT/US2019/0051865호에서 나타낸 바와 같이, 이는 돼지-인간 하이브리드 흉선 이식편에서 수용체 TEC를 제공함으로써 극복할 수 있는데, 이는 이러한 TEC가 양성 선택에 참여하여 말초에서 수용체 HLA 분자에 의해 제시되는 외래 항원을 보다 용이하게 인식할 수 있는 T 세포를 생성하기 때문이다. 돼지 흉선 이식편의 경우, 말초에서 "양성 선택" 리간드를 찾지 못하는 T 세포의 생존, 항상성 및 기능이 최적이 아니다. 양성 선택 리간드는 흉선세포가 해당 복합체를 인식하는 낮은 친화도 T 세포 수용체를 가질 때 세포 예정사로부터 흉선세포를 구출하는 TEC 상의 MHC/펩타이드 복합체이다. 돼지-인간 하이브리드 흉선에서 수용체 TEC를 제공하면 말초의 수용체 세포 상에서 동일한 리간드를 찾을 T 세포의 양성 선택을 가능하게 하며, 이는 정상적인 생존, 항상성 및 기능을 부여한다. 단순한 돼지 흉선 대신에 하이브리드 흉선을 사용하면, 돼지에 대한 내성이 발달할 수 있게 하면서 돼지 흉선에서 생성된 인간 T 세포 레퍼토리의 기능 및 자가-내성을 개선시킬 수 있다. 형질전환 돼지 흉선의 사용은 또한 돼지 흉선에서 생성된 인간 T 세포 레퍼토리의 기능 및 자가-내성을 개선시킬 수 있다는 결론에 이르게 된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 형질전환 돼지는 또한 공여체 흉선 조직에 대한 공급원으로 사용될 수 있다.

삭스 미니 돼지 군체는 1970년대 David Sachs 박사에 의해 2마리의 창시 동물로부터 확립되었다. 이들 동물의 MHC(돼지 백혈구 항원, SLA)는 Sachs 박사에 의해 혈청학적으로 정의되었고 3개의 SLA-동형접합 부분 근친교배 계통이 다수의 SLA 내 재조합과 함께 유지되었다. 이들 돼지는 본 명세서에 개시된 형질전환 돼지의 공급원 동물일 수 있다(미국 특허 제6,469,229호(Sachs), 미국 특허 제7,141,716호(Sachs), 이들 개시내용의 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 기재된 방법을 통한 이와 같은 돼지의 생성, 및/또는 생성 후 이와 같은 돼지 및 자손의 활용은 본 개시내용의 실시에 이용될 수 있으며, 이는 이와 같은 돼지에서 유래된 기관, 조직 및/또는 세포를 활용하는 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.

일부 실시형태에서, 돼지 유래의 세포가 출발 물질이다. 일부 실시형태에서, 세포는 섬유아세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 GTA1 널(null), SLA 일배체형 h 동형접합 삭스 미니 돼지(SLA-1*02:01, SLA-1*07:01, SLA-2*02:01, SLA-3 널, SLA-DRA*01:01:02, SLA-DRB*02:01, SLA-DQA*02:02:01, SLADQB*04:01:01) 유래이다. 이들 동물의 부분적으로 근친교배된 특성을 인해, 자손은 높은 정도의 유전적 유사성을 가질 것이다.

일부 실시형태에서, HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 천연 SLA 유전자좌에 삽입하거나 통합함으로써 이전에 변형된 세포가 출발 물질이다.

인간에서, 주요 조직접합성 복합체(MHC) 분자는 인간 백혈구 항원의 약어인 HLA로 지칭되며, 염색체 6p21.3에 위치한 HLA 영역에 의해 인코딩된다. HLA 분절은 (중심체에서 텔로미어까지) 3개의 영역, 즉 클래스 II, 클래스 III 및 클래스 I로 나뉜다. 이들 세포-표면 단백질은 인간에서 면역계의 조절을 담당한다. HLA 유전자는 고도로 다형성이며, 이는 이들 유전자가 다수의 상이한 대립유전자를 가져서 이들 유전자가 적응 면역계를 미세 조정할 수 있게 한다는 것을 의미한다. 특정 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 또한, 역사적 발견의 결과로서 장기 이식의 인자인 항원으로 알려져 있다. 상이한 부류는 상이한 기능을 가진다.

모두 HLA 클래스1 그룹인 MHC 클래스 I(A, B, 및 C)에 해당하는 HLA는 세포 내부로부터 펩타이드를 제시한다. 일반적으로, 이러한 특정 펩타이드는 길이가 약 9개 아미노산인 작은 중합체이다. MHC 클래스 I에 의해 제시되는 외래 항원은 세포를 파괴하는 킬러 T-세포(또한 CD8 양성-세포 또는 세포독성 T-세포라고도 함)를 유인한다. MHC 클래스 I 단백질은 β2-마이크로글로불린과 회합하며, 이는 HLA 단백질과 달리 염색체 15 상의 유전자에 의해 인코딩된다.

MHC 클래스 II(DP, DM, DO, DQ, 및 DR)에 해당하는 HLA는 세포 외부로부터 T-림프구에 대해 항원을 제시한다. 이러한 특정 항원은 T-헬퍼 세포(또한 CD4 양성 T 세포라고도 함)의 증식을 자극하고, 이는 결국 항체-생성 B-세포를 자극하여 특정 항원에 대한 항체를 생성한다. 자가-항원은 조절 T 세포에 의해 억제된다. 영향을 받는 유전자는 MHC 클래스 II 유전자의 전사를 제어하는 4개의 별개의 조절 인자를 인코딩하는 것으로 알려져 있다.

MHC 클래스 III에 해당하는 HLA는 보체 시스템의 구성요소를 인코딩한다.

6가지의 주요 항원-제시 단백질을 인코딩하는 유전자 외에도, HLA 복합체에 위치한, 다수가 면역 기능과 관련된, 많은 수의 다른 유전자가 있다.

인간 집단에서 HLA의 다양성은 질환 방어의 일 양태이며, 결과적으로 관련이 없는 2명의 개체가 모든 유전자좌에서 동일한 HLA 분자를 가지는 가능성은 극히 낮다. HLA 유전자는 역사적으로 HLA-유사 개체 간에 장기를 성공적으로 이식하는 능력의 결과로 식별되었다.

각각의 인간 세포는 6개의 MHC 클래스 I 대립유전자(각각의 부모로부터의 1개의 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C 대립유전자) 및 6 내지 8개의 MHC 클래스 II 대립유전자(각각의 부모로부터의 1개의 HLA-DP와 HLA-DQ, 및 1 또는 2개의 HLA-DR, 및 이들의 조합)를 발현한다. HLA-A 유전자의 경우 적어도 350개 대립유전자, HLA-B의 경우 620개 대립유전자, DR의 경우 400개 대립유전자, 및 DQ의 경우 90개 대립유전자로 인간 집단에서 MHC 변이는 높다. 인간에서, MHC 클래스 II 분자는 3개의 상이한 유전자좌, 즉 HLA-DR, HLA-DQ, 및 HLA-DP에 의해 인코딩되며, 이들 유전자좌는 서로 약 70%의 유사성을 나타낸다. 다형성은 MHC 클래스 II 유전자의 주목할 만한 특성이다. 이러한 유전적 다양성은 수용체의 면역 반응이 이식 후 생착 및 생존의 결과를 좌우하는 가장 중요한 인자인 이종장기이식 동안 문제를 나타낸다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 돼지의 하나 이상의 천연 SLA 유전자좌에 하나 이상의 인간 HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 삽입 또는 통합시킴으로써 돼지를 변형시키는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 인간 HLA는 HLA1 폴리펩타이드 및 HLAII 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 인간 HLA1은 HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, HLAI 폴리펩타이드는 HLA-A2이다. 일부 실시형태에서, HLA II 폴리펩타이드는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DQ, 및 HLA-DR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, HLA II 폴리펩타이드는 HLA-DQ8이다.

일부 실시형태에서, 인간 HLA는 공지된 HLA 폴리펩타이드이다. 이와 같은 HLA 서열은, 예를 들어 IPD-IMGT/HLA 데이터베이스(ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/에서 이용 가능함) 및 international ImMunoGeneTics information System.RTM(imgt.org에서 이용 가능함)에서 이용 가능하다. 예를 들어, HLA-A1, B8, DR17은 백인들 사이에서 5%의 빈도로 가장 흔한 HLA 일배체형이다. 따라서, 개시된 방법은 본 명세서에 기재된 방법과 함께 공지된 HLA 서열 정보를 사용하여 수행될 수 있다.

일부 실시형태에서, 인간 HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 특정 인간 개체에서 유래된다. 일부 실시형태에서, 형질전환 돼지는 특정 인간 개체에서 유래된 인간 HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 사용하여 생성되고, 형질전환 돼지 유래의 흉선 조직 또는 다른 세포, 조직 또는 기관은 동일한 특정 인간 개체로 도입될 것이다. 이들 실시형태에서, 형질전환 돼지로부터 이종이식을 받을 특정 인간 개체 유래의 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자가 식별되고 서열결정된다. 특정 HLA 대립유전자를 식별하고 서열결정하는 것은 당업계에 알려진 방법에 의해 수행될 수 있음이 이해될 것이다.

알려진 인간 HLA 서열 또는 특정 인간 개체로부터 식별되고 서열결정된 HLA 서열(들)은, 예를 들어 HLA 서열과 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 가지도록 SLA 프로모터의 제어 하에 벡터에 도입될 수 있다.

일부 실시형태에서, HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 HLA 폴리펩타이드의 서열을 가지거나 수용체 포유동물의 HLA 대립유전자를 모방하도록 최적화될 수 있다.

일부 실시형태에서, HLA 폴리펩타이드는 또 다른 단백질에 융합된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 인간 β-2 마이크로글로불린(B2M)이다. 일부 실시형태에서, HLA-A2는 B2M에 융합된다. 융합 단백질로서 HLA-A2 및 인간 B2m의 도입은 HLA-A2와 돼지 B2m 사이의 이형(heterotypic) 상호작용이 HLA-A2 표면 발현을 방해하지 않을 것임을 보장할 것이다.

일부 실시형태에서, 천연 SLA 유전자좌는 SLAI이다. 일부 실시형태에서, 천연 SLA 유전자좌는 SLA-1 또는 SLA-2이다. 일부 실시형태에서, SLA 유전자좌는 SLA-DQα 유전자좌이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 천연 SLA 프로모터 뒤에 삽입되거나 통합된다. 일부 실시형태에서, HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 천연 SLA 유전자좌의 인트론 1/엑손 2에 삽입되거나 통합된다.

일부 실시형태에서, HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 표적화 벡터를 사용하여 천연 SLA 유전자좌에 삽입되거나 통합된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이시스트론성이다. 일부 실시형태에서, 벡터에는 프로모터가 없다. 벡터의 프로모터가 없는 설계의 사용은, 인간 B2m/HLA-A2 융합체를 발현하는 세포의 매우 높은 비율이 DQA 유전자를 적절하게 표적화할 것임을 보장한다.

HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 통합 또는 삽입에 의해 SLA 유전자좌를 변형시키는 방법은 하기 기재된 바와 같이 부위 특이적 뉴클레아제의 사용을 포함한다.

따라서 형질전환 돼지를 생성하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일 양태에서, 특정 인간 개별 수용체의 HLA 유전자가 서열결정되고 돼지 세포로의 도입을 위한 표적화 벡터 구축에서 사용된다. 또 다른 양태에서, WHO 데이터베이스로부터 공지된 인간 HLA 유전자형이 돼지 세포로의 도입을 위한 표적화 벡터 구축에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적화 벡터는 HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 사용하여 구축된다. CRISPR-Cas9 플라스미드가 제조될 수 있다. 돼지 세포의 SLA/MHC 유전자좌에서 CRISPR 절단 부위가 식별되고 절단 부위를 표적화하는 gRNA 서열이 설계되며 하나 이상의 CRISPR-Cas9 플라스미드로 클로닝된다. 그 다음 CRISPR-Cas9 플라스미드가 표적화 벡터와 함께 돼지 세포에 투여된다.

변형이 완료되면, 당업계에 알려진 방법을 사용하여 원하는 변형에 대해 세포를 스크리닝한다. 원하는 변형이 있는 세포는 또한 당업계에 알려진 방법에 의해, 형질전환 돼지 태아 및 새끼 돼지의 핵 이식/배 이식 및 생성을 위한 체세포 핵 이식(SCNT) 공여체 세포로서 사용될 수 있다.

형질전환 돼지 태아는 대략 40주에 수확된다. 이들 태아는 원하는 HLA 유전자의 발현 및 적절한 통합에 대해 분석될 것이다. 적절한 통합이 있는 것으로 확인된 태아는 추가적인 태아 및 새끼 돼지를 생성하기 위한 SCNT 클로닝을 위한 세포주의 공급원으로서 사용된다. 태아는 흉선 분리를 위해 대략 56 내지 70주에 수확된다.

태아는 또한 형질전환 창시 수퇘지(boar)를 생성하는 데 사용될 것이다.

형질전환 태아 돼지 유래의 흉선 조직은 하기 기재된 바와 같이 개선된 인간 면역계(HIS) 마우스의 생성을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 많은 용도를 가진다.

흉선 조직을 포함하여 형질전환 태아 돼지 유래의 세포, 조직 및/또는 기관은 또한 이종장기이식뿐만 아니라, 대상체에서 흉선의 기능 손상을 회복시키거나 복원시키고 T 세포를 재구성하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.

형질전환 돼지에서 유래된 이종장기이식의 목적을 위한 세포, 조직, 및 기관은 야생형 돼지에서 유래된 세포, 조직, 및 기관과 비교하여 감소된 거부반응을 가질 것이다.

또한 제1 종의 수용체 포유동물에서의 이종장기이식 방법이 본 개시내용에 포함되며, 방법은 흉선 조직을 수용체 포유동물에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 흉선 조직은 본 명세서에 기재된 형질전환 돼지 유래이다.

본 개시내용은 또한 제1 종의 수용체 포유동물에서 면역적격을 복원시키거나 유도하는 방법을 제공하며, 방법은 흉선 조직을 수용체 포유동물에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 흉선 조직은 본 명세서에 기재된 형질전환 돼지 유래이다.

본 개시내용은 또한 제1 종의 수용체 포유동물에서 T 세포 전구체가 성숙한 기능적 T 세포로 발달하는 흉선-의존적 능력을 복원시키거나 촉진시키는 방법을 제공하며, 방법은 흉선 조직을 제1 종의 수용체 포유동물에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 흉선 조직은 본 명세서에 기재된 형질전환 돼지 유래이다.

일 실시형태에서, 흉선 기능은 흉선 조직이 도입되기 전에 수용체 포유동물에 본질적으로 존재하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 수용체 포유동물은 흉선 조직이 도입되기 전에 흉선이 절제된다. 또 다른 실시형태에서, 수용체 포유동물은 면역 장애를 가진다.

제2 종은 돼지, 예컨대, 형질전환 돼지일 수 있다.

제1 종은 영장류, 예컨대, 비-인간 영장류 또는 인간일 수 있다.

일 실시형태에서, 수용체 포유동물은 인간이고 공여체 포유동물은 본 명세서에 기재된 형질전환 돼지이다. 일부 실시형태에서, 수용체 인간은 돼지에 도입되어 형질전환 돼지를 생성하는 HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 공급원이다. 일부 실시형태에서, HLA 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 당업계에 알려진 것이다.

일 실시형태에서, 흉선 조직은 수용체 포유동물에 이식된다. 예를 들어, 흉선 조직은 주로 혈관화된 흉선엽 또는 복합 흉선-신장 이식편으로서 이식될 수 있다. 흉선 조직은 수용체에서 근육내로 이식될 수 있다. 흉선 조직은 수용체에서 단독으로 또는 추가적인 이식 부위(예를 들어, 신장 피막 및 장막)와 함께 대퇴사두근에 이식될 수 있다.

CRISPR/Cas 및 다른 엔도뉴클레아제

형질전환 돼지를 생성하기 위해 임의의 적합한 뉴클레아제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 뉴클레아제는 핵산을 가수분해하는 효소이다. 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로 분류될 수 있다. 엔도뉴클레아제는 DNA 또는 RNA 분자의 내부에 있는 핵산 사이 결합의 가수분해를 촉매하는 효소 그룹 중 임의의 것이다. 엑소뉴클레아제는 DNA 또는 RNA 사슬의 말단으로부터 단일 뉴클레오타이드의 가수분해를 촉매하는 효소 그룹 중 임의의 것이다. 뉴클레아제는 또한 DNA 또는 RNA를 특이적으로 분해하는지 여부를 기반으로 하여 분류될 수 있다. DNA의 가수분해를 특이적으로 촉매하는 뉴클레아제는 데옥시리보뉴클레아제 또는 DN아제(DNase)로 지칭될 수 있는 반면, RNA의 가수분해를 특이적으로 촉매하는 뉴클레아제는 리보뉴클레아제 또는 RN아제(RNase)로 지칭될 수 있다. 일부 뉴클레아제는 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 서열에 특이적이다. 일부 효소는 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 특성을 둘 다 가진다. 추가적으로, 일부 효소는 DNA 및 RNA 서열을 둘 다 분해할 수 있다.

엔도뉴클레아제의 비제한적인 예는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, ZF닉카제(ZFNickase), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제(예를 들어, CRISPR/Cas)를 포함한다. 메가뉴클레아제는 대형 DNA 서열(12개 염기쌍 이상)을 인식하고 절단하는 능력을 특징으로 하는 엔도뉴클레아제이다. LAGLIDADG 및 PI-Sce 패밀리의 엔도뉴클레아제를 포함하여 숙주 게놈에서 이중-가닥 파손을 생성하기 위해 임의의 적합한 메가뉴클레아제가 본 방법에서 사용될 수 있다.

본 개시내용의 일 양태는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 제공한다. RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 또한 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인 및 가이드 RNA와 상호작용하는 적어도 하나의 도메인을 포함한다. RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA에 의해 특정 핵산 서열(또는 표적 부위)로 지시된다. 가이드 RNA는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제뿐만 아니라 표적 부위와 상호작용하여, 일단 표적 부위로 향하면 RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 파손을 표적 부위 핵산 서열에 도입할 수 있다. 가이드 RNA는 표적화 절단에 대해 특이성을 제공하므로, RNA-가이드 엔도뉴클레아제의 엔도뉴클레아제는 보편적이며 상이한 표적 핵산 서열을 절단하기 위해 상이한 가이드 RNA와 함께 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 RNA가이드 서열-특이적 뉴클레아제 시스템의 일 예는 CRISPR 시스템을 포함한다(Wiedenheft, et al. 2012 Nature 482:331-338; Jinek, et al. 2012 Science 337:816-821; Mali, et al. 2013 Science 339:823-826; Cong, et al. 2013. Science 339:819-823). CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; 일정한 간격으로 놓인 짧은 회문 반복 서열 집합) 시스템은 RNA-가이드 DNA-결합 및 표적 DNA의 서열-특이적 절단을 활용한다. 가이드 RNA/Cas 조합은 뉴클레아제에 대해 부위 특이성을 부여한다. 단일 가이드 RNA(sgRNA)는 게놈 PAM(protospacer adjacent motif; 프로토스페이서 인접 모티프) 부위(예를 들어, NGG) 및 불변 RNA 스캐폴드 영역의 상류에 있는 표적 게놈 DNA 서열에 상보적인 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. Cas(CRISPR-연관) 단백질은 sgRNA 및 sgRNA가 결합하는 표적 DNA에 결합하고 PAM 부위의 상류에 정의된 위치에서 이중-가닥 파손을 도입한다. Cas9는 HNH 및 RuvC 엔도뉴클레아제에 상동성인 2개의 독립적인 뉴클레아제 도메인을 보유하며, 2개 도메인 중 어느 하나를 돌연변이시킴으로써, Cas9 단백질은 단일-가닥 파손을 도입하는 닉카제로 전환될 수 있다(Cong, et al. 2013 Science 339:819-823). 본 개시내용의 방법 및 조성물은 Cas9의 단일- 또는 이중-가닥-유도 형태뿐만 아니라, 다른 박테리아의 Cas9-유사 시스템과 같은 다른 RNA-가이드 DNA 뉴클레아제와 함께 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 본 명세서에 기재된 본 방법 및 조성물의 서열-특이적 뉴클레아제는 조작되거나, 키메라이거나, 유기체로부터 단리될 수 있다. 뉴클레아제는 DNA, mRNA 및 단백질의 형태로 세포에 도입될 수 있다.

특정 유전자, 선택적으로 질환, 장애, 또는 병태와 연관된 유전자를 표적화하기 위한 표적 특이성을 위해 gRNA를 생성할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 따라서, Cas9와 함께, 가이드 RNA는 CRISPR/Cas9 시스템의 표적 특이성을 촉진시킨다. 프로모터 선택과 같은 추가 양태는 표적 특이성을 달성하는 추가적인 메커니즘, 예를 들어 특정 기관 또는 조직에서 발현을 촉진시키는 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 가이드 RNA에 대한 프로모터를 선택하는 것을 제공할 수 있다. 따라서, 특정 질환, 장애, 또는 병태에 적합한 gRNA의 선택이 본 명세서에서 고려된다. 일 실시형태에서, gRNA는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 포함하는 유전자 또는 대립유전자에 혼성화한다.

적합한 CRISPR/Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(또는 CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(또는 CasA), Cse2(또는 CasB), Cse3(또는 CasE), Cse4(또는 CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966을 포함한다.

일 실시형태에서, RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 II형 CRISPR/Cas 시스템에서 유래된다. 특정 실시형태에서, RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질에서 유래된다. Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란기움 로세움, 알리사이클로바실러스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 마이크로스킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데설포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 종(Arthrospira sp.), 링비아 종(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina) 유래일 수 있다.

일부 실시형태에서, Cas(예를 들어, Cas9) 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 단백질의 활성을 변경하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, Cas(예를 들어, Cas9) 뉴클레아제는 촉매적으로 불활성인 Cas(예를 들어, Cas9)(또는 촉매적으로 비활성화/결함이 있는 Cas9 또는 dCas9)이다. 일 실시형태에서, dCas(예를 들어, dCas9)는 야생형 Cas(예를 들어, Cas9)의 엔도뉴클레아제 촉매 부위(RuvC 및 HNH) 중 하나 또는 둘 다에서 점 돌연변이로 인해 엔도뉴클레아제 활성이 결여된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)이다. 예를 들어, dCas9는 촉매적으로 활성인 잔기(D10 및 H840)의 돌연변이를 포함하고 뉴클레아제 활성을 가지지 않는다. 일부 경우에, dCas는 표적 DNA의 상보적 가닥과 비-상보적 가닥을 둘 다 절단하는 능력이 감소된다. 일부 경우에, dCas9는 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9의 아미노산 서열의 D10A 및 H840A 돌연변이 둘 다를 보유한다. 일부 실시형태에서 dCas9가 감소되거나 결함이 있는 촉매 활성을 가질 때(예를 들어, Cas9 단백질이 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, 및/또는 A987 돌연변이, 예를 들어 D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A, 및/또는 D986A를 가질 때), Cas 단백질은 대상체 폴리뉴클레오타이드(예를 드어, gRNA)의 Cas-결합 서열과 상호작용하는 능력을 유지하는 한, 대상체 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gRNA)의 DNA-표적화 서열에 의한 표적 뉴클레오타이드 서열로 여전히 유도되기 때문에, 부위-특이적 방식으로 표적 DNA에 여전히 결합할 수 있다.

Cas 엔도뉴클레아제 활성의 불활성화는 촉매적으로 비활성화된 Cas(dCas, 예를 들어 dCas9)를 생성할 수 있다. dCas는 DNA에 결합할 수 있지만 이를 절단할 수 없으므로, 전사 인자의 작용에 대한 물리적 장벽을 생성함으로써 표적 유전자의 전사를 방지할 수 있다. CRISPR의 이러한 연출은 가역적인 방식으로 전사 수준에서 작용한다. 이러한 전략은 CRISPR 간섭, 또는 CRISPRi로 불린다. CRISPR 간섭(CRISPRi)에서, dCas 융합 단백질(예를 들어, 또 다른 단백질 또는 이의 일부에 융합되는 dCas)은 현재 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, dCas는 (전사) 억제자 도메인 또는 전사 사일렌서에 융합된다. 전사 억제 도메인의 비-제한적인 예는

-연관 박스(KRAB) 도메인, ERF 억제자 도메인(ERD), mSin3A 상호작용 도메인(SID) 도메인, SID의 쇄상체(예를 들어, SID4X), 또는 이들의 동족체를 포함한다. 전사 사일렌서의 비-제한적인 예는 이질염색질 단백질 1(HP1)을 포함한다. CRISPRi는 Cas(예를 들어, dCas)를 Cas의 억제 효과를 증대시키는 Kruppel-연관 박스 억제 도메인(KRAB)에 융합시킴으로써 변형될 수 있다. Gilbert et al. 2013. Cell 154(2):442-51.

2세대 CRISPRi는 PUF-KRAB 억제자를 통해 강력하게 억제한다. PUF 단백질(드로소필라 푸밀리오(Drosophila Pumilio) 및 씨. 엘라간스(C. elegans) fern-3 결합 인자의 이름을 따서 명명함)은 mRNA 안정성 및 번역을 매개하는 것에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들 단백질은 PUF 도메인으로 알려진 독특한 RNA-결합 도메인을 포함한다. 인간 Pumilio 1 단백질(또한 PUM으로 지칭됨)의 것과 같은 RNA-결합 PUF 도메인은 역평행 방식으로 연속적인 염기에 결합하는 8개의 반복부(각각의 반복부는 PUF 모티프 또는 PUF 반복부라고 함)를 포함하고, 각각의 반복부는 단일 염기를 인식하며, 즉 PUF 반복부 R1 내지 R8은 각각 뉴클레오타이드 N8 내지 N1을 인식한다. 예를 들어, PUM은 8개의 직렬 반복부로 구성되며, 각각의 반복부는 알파 나선으로 구성된 빽빽하게 채워진 도메인으로 접힌 34개의 아미노산으로 이루어진다. PUF 및 이의 유도체 또는 기능적 변이체는, 임의의 이펙터 도메인을 대상체 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gRNA) 상의 특정 PUF-결합 서열로 가져오는 PUF-도메인-융합체의 일부로서, 본 방법 및 시스템에서 사용될 수 있는 프로그래밍 가능한 RNA-결합 도메인이다.

본 방법은 CRISPR 결실(CRISPRd)을 사용할 수 있다. CRISPRd는 NHEJ에 대해 디폴팅하는 DNA 복구 전략의 경향을 활용하며 절단된 가닥을 복구하기 위해 공여체 주형을 필요로 하지 않는다. 대신, Cas는 먼저 돌연변이를 보유하는 유전자에서 DSB를 생성한 다음, NHEJ가 발생하고, 서열을 손상시키는 삽입 및/또는 결실(INDEL)을 도입하여, 유전자가 발현되거나 적절한 단백질 접힙이 일어나는 것을 방지한다. 이러한 전략은, 돌연변이된 우성 대립유전자를 녹아웃시키고 야생형 대립유전자를 원래 상태로 두는 경우가 표현형을 야생형으로 복원시키기에 충분할 수 있는 우성 조건에 특히 적용 가능할 수 있다.

특정 실시형태에서, Cas 효소는 촉매적으로 결함이 있는 Cas(예를 들어, Cas9) 또는 dCas, 또는 Cas 닉카제 또는 닉카제일 수 있다.

Cas 효소(예를 들어, Cas9)는 DSB 대신 단일-가닥 파손을 유도함으로써 DNA에 "틈"을 형성하기 때문에, 그 자체로 명명된, 닉카제로서 기능하도록 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "Cas 닉카제" 또는 "닉카제"는 이중나선 핵산 분자(예를 들어, 이중나선 DNA 분자)의 하나의 가닥만 절단할 수 있는 Cas 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, Cas 닉카제는 미국 특허 제10,167,457호에 개시된 닉카제 중 임의의 것일 수 있으며, 상기 특허의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 일 실시형태에서, Cas(예를 들어, Cas9) 닉카제는 활성 HNH 뉴클레아제 도메인을 가지고 DNA의 비-표적화 가닥, 즉 gRNA에 의해 결합된 가닥을 절단할 수 있다. 일 실시형태에서, Cas(예를 들어, Cas9) 닉카제는 불활성 RuvC 뉴클레아제 도메인을 가지고 DNA의 표적화 가닥, 즉 염기 편집을 원하는 가닥을 절단할 수 없다. 일부 구현예에서 Cas 닉카제는 이중가닥 핵산 분자의 표적 가닥을 절단하는데, 이는 Cas 닉카제가 Cas에 결합된 gRNA(예를 들어, sgRNA)와 염기쌍을 형성하는(상보적인) 가닥을 절단함을 의미한다. 일부 실시형태에서, Cas 닉카제는 이중나선 핵산 분자의 비-표적, 비-염기-편집된 가닥을 절단하는데, 이는 Cas 닉카제가 Cas에 결합된 gRNA(예를 들어, sgRNA)와 염기쌍을 형성하지 않은 가닥을 절단함을 의미한다. 추가적인 적합한 Cas9 닉카제는 본 개시내용 및 당 분야의 지식을 기반으로 하여 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시내용의 범주 내에 있다.

CRISPR 활성화(CRISPRa)에서, dCas는 VP64 또는 VPR과 같은 활성화제 도메인에 융합될 수 있다. 이와 같은 dCas 융합 단백질은 유전자 활성화를 위해 본 명세서에 기재된 작제물과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, dCas는 후성적 조절 도메인, 예컨대, 히스톤 데메틸라제 도메인 또는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 도메인에 융합된다. 일부 실시형태에서, dCas는 LSD1 또는 p300, 또는 이들의 일부에 융합된다. 일부 실시형태에서, dCas 융합은 CRISPR-기반 후성적 조절에 사용된다. 일부 실시형태에서, dCas 또는 Cas는 Fok1 뉴클레아제 도메인에 융합된다. 일부 실시형태에서, Fok1 뉴클레아제 도메인에 융합된 Cas 또는 dCas는 게놈 편집에 사용된다. 일부 실시형태에서, Cas 또는 dCas는 형광 단백질(예를 들어, GFP, RFP, mCherry 등)에 융합된다. 일부 실시형태에서, 형광 단백질에 융합된 Cas/dCas 단백질은 Cas 엔도뉴클레아제를 발현하는 게놈 유전자좌의 표적화 및/또는 시각화 또는 이를 발현하는 세포를 식별하는 데 사용된다. 일반적으로, CRISPR/Cas 단백질은 적어도 하나의 RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인을 포함한다. RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인은 가이드 RNA와 상호작용한다. CRISPR/Cas 단백질은 또한 뉴클레아제 도메인(즉, DN아제 또는 RN아제 도메인), DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, RN아제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인뿐만 아니라, 다른 도메인을 포함할 수 있다.

잘 특성화된 CRISPR-Cas 시스템에 추가적으로, Cpf1(PreFran 하위유형의 Cas 단백질 1)이라고 하는 새로운 CRISPR 효소가 본 방법 및 시스템에서 사용될 수 있다(Zetsche et al. 2015. Cell). Cpf1은 tracrRNA가 결여되고, T-풍부 프로토스페이서-인접 모티프를 이용하는 단일 RNA-가이드 엔도뉴클레아제이다. 저자는 Cpf1이 Cas9와는 구별되는 특징으로 강한 DNA 간섭을 매개한다는 것을 입증하였다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, CRISPR-Cpf1 시스템은 표적화 유전자 내의 원하는 영역을 절단하는 데 사용될 수 있다.

추가 실시형태에서, 뉴클레아제는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. TALEN은 특정 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 TAL 이펙터 도메인 및 표적 부위에서 이중 가닥 파손을 촉매하는 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다(PCT 특허 공개 제WO2011072246호; Miller et al., 2011 Nat. Biotechnol. 29:143-148; Cermak et al., 2011 Nucleic Acid Res. 39:e82). 서열-특이적 엔도뉴클레아제는 사실상 모듈식일 수 있고, DNA 결합 특이성은 하나 이상의 모듈을 배열함으로써 얻어진다(Bibikova et al., 2001 Mol. Cell. Biol. 21:289-297; Boch et al., 2009 Science 326:1509-1512).

ZFN은 이펙터 엔도뉴클레아제 도메인(예를 들어, FokI 엔도뉴클레아제)에 융합된 2개 이상(예를 들어, 2 내지 8, 3 내지 6, 6 내지 8개, 또는 그 이상)의 서열-특이적 DNA 결합 도메인(예를 들어, 징크 핑거 도메인)을 포함할 수 있다. Porteus et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:967-973; Kim et al., 2007 Proceedings of the National Academy of Sciences of USA,　93:1156-1160; 미국 특허 제6,824,978호; PCT 공개 제WO1995/09233호 및 제WO1994018313호.

일 실시형태에서, 뉴클레아제는 오메가, 징크 핑거, TALEN, 및 CRISPR/Cas로 이루어진 군의 또는 이러한 군으로부터 선택되는 부위-특이적 뉴클레아제이다.

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 서열-특이적 엔도뉴클레아제는 조작되거나, 키메라이거나, 유기체로부터 단리될 수 있다. 엔도뉴클레아제는, 예를 들어 돌연변이유발에 의해 특정 DNA 서열을 인식하도록 조작될 수 있다(Seligman et al. 2002 Nucleic Acids Research 30:3870-3879). 조합 조립은 상이한 효소 유래의 단백질 서브유닛이 회합하거나 융합될 수 있는 방법이다(Arnould et al. 2006 Journal of Molecular Biology 355:443-458). 특정 실시형태에서, 이들 2가지 접근법, 즉 돌연변이유발 및 조합 조립은 조합되어 원하는 DNA 인식 서열을 가지는 조작된 엔도뉴클레아제를 생성할 수 있다.

서열-특이적 뉴클레아제는 단백질의 형태로 또는 서열-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산, 예컨대, mRNA 또는 cDNA의 형태로 세포에 도입될 수 있다. 핵산은 더 큰 작제물, 예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 부분으로서, 또는 예를 들어 전기천공, 지질 소포, 바이러스 수송체, 미세주입, 및 유전자총에 의해 직접 전달될 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 이식유전자를 포함하는 작제물은 핵산을 세포에 도입하는 데 적절한 임의의 방법에 의해 전달될 수 있다.

본 개시내용의 방법에서 사용되는 가이드 RNA(들)는 이것이 게놈에서 미리 결정된 절단 부위에 대한 Cas-gRNA 복합체의 결합을 지시하도록 설계될 수 있다. 일 실시형태에서, 절단 부위는 프레임 이동 돌연변이의 영역을 포함하는 단편 또는 서열을 방출하도록 선택될 수 있다. 추가 실시형태에서, 절단 부위는 여분의 염색체를 포함하는 단편 또는 서열을 방출하도록 선택될 수 있다.

Cas 패밀리 효소(예컨대, Cas9)가 DNA에 성공적으로 결합하기 위해, 게놈 DNA의 표적 서열은 gRNA 서열에 상보적일 수 있으며 올바른 프로토스페이서 인접 모티프 또는 "PAM" 서열이 바로 뒤에 올 수 있다. "상보성"은 전통적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 다른 비-전통적인 유형에 의해 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 백분율은 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기 쌍형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자 잔기의 백분율을 나타낸다. 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. Cas9 단백질은 PAM에서 먼 쪽의 불일치를 견딜 수 있다. PAM 서열은 Cas9가 유래된 박테리아의 종에 따라 다르다. 가장 널리 사용되는 CRISPR 시스템은 에스. 피오게네스에서 유래되며 PAM 서열은 sgRNA 인식 서열의 바로 3' 말단에 위치하는 NGG이다. 예시적인 박테리아 종 유래의 CRISPR 시스템의 PAM 서열은 스트렙토코커스 피오게네스(NGG), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)(NNNNGATT), 스트렙토코커스 써모필러스(NNAGAA) 및 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)(NAAAAC)를 포함한다.

본 개시내용에서 사용되는 gRNA(들)는 약 5 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 그 이상(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 60, 61, 62, 63, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 그 이상)일 수 있다. 일 실시형태에서, gRNA(들)는 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 약 15 내지 29, 15 내지 26, 15 내지 25개; 16 내지 30, 16 내지 29, 16 내지 26, 16 내지 25개; 또는 약 18 내지 30, 18 내지 29, 18 내지 26, 또는 18 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이)일 수 있다.

gRNA 설계를 용이하게 하기 위해, 다수의 컴퓨터를 이용한 도구가 개발되었다(문헌[Prykhozhij et al. 2015 PLoS ONE 10(3):; Zhu et al. 2014 PLoS ONE 9(9); Xiao et al. 2014 Bioinformatics. Jan 21 (2014)); Heigwer et al. 2014 Nat Methods 11(2):122-123] 참조). 가이드 RNA 설계를 위한 방법 및 도구는 문헌[Zhu 2015 Frontiers in Biology 10(4):289-296]에 논의되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 추가적으로, gRNA(들)의 설계를 용이하게 하는 데 사용될 수 있는 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 도구가 있다(http://www.genscript.com/gRNA-design-tool.html).

인간 면역계(HIS) 마우스

뮤린 T, B 및 NK 세포가 결여되어 있는 고도로 면역결핍된 NOD-scid-공통 감마 사슬 결핍(NSG) 마우스의 가용성은 인간 면역계(HIS) 마우스를 생성하는 능력을 크게 향상시켰다. 최적의 면역 기능을 가지는 HIS 마우스를 생성하기 위한 주요 필요조건 중 하나는 인간 흉선 조직의 가용성이다. 태아 인간 흉선 조직은 주입된 태아 또는 성인 CD34+ 세포로부터 강력한 인간 흉선세포발달을 지원하며, 상기 세포는 흉선에 대한 T 세포 전구체의 지속적인 공급을 유지하고 골수에서 말초에 존재하고 인간 태아 흉선 이식편에서 발달하는 T 세포를 위한 항원-제시 세포(APC)의 역할을 하는 B 세포, DC 및 단핵구를 생성한다(Lan et al. 2004; Lan et al. 2006; Melkus et al. 2006). 인간 흉선 이식편에서 새로 발달하는 T 세포는, 아마도 이들 이식편에서 검출 가능한 뮤린 APC에 의한 결실로 인해, 뮤린 숙주에 대해 내성이 있다(Kalscheuer et al. 1999). 천연 뮤린 흉선은 낮은 수준에서 인간 T 세포를 생성할 수 있지만, 뮤린 흉선의 비정상적인 구조는 정상적인 음성 선택의 실패를 초래한다(Khosravi Maharlooei, et al. 2019). 이는 느린 말초 T 세포 재구성 및 결과적으로 높은 수준의 림프구감소증 유도 증식(LIP)과 조합되어, 천연 마우스의 흉선 절제술에 의해 예방될 수 있는 심각한 자가면역 증후군을 초래한다(Khosravi Maharlooei, et al. 2019). 대조적으로, CD34+ 조혈 줄기/전구체 세포(HSPC)를 받은 HIS 마우스에서 인간 태아 흉선 조직의 이식은, 용이하게 식별할 수 있는 피질, 수질 및 하살 소체를 포함하는 정상적인 구조를 가지는 인간 흉선을 생성한다. 이러한 인간 흉선은, 천연 NSG 마우스 흉선에서 발달하는 T 세포에 대해 관찰된 것과 비교하여 현저하게 감소된 LIP 및 더 적은 자가면역으로, 말초에서 미경험 인간 T 세포의 비교적 신속한 재구성을 달성한다.

인간 태아 조직의 가용성 및 사용에 관한 문제의 관점에서, 인간 태아의 것과 유사하게 기능할 수 있는 흉선 조직의 또 다른 공급원을 식별하는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 이전에 인간 HSPC를 수용하는 면역결핍 마우스에 이식된 돼지 흉선 이식편에서 강력한 인간 흉선세포발달이 일어나는 것을 보였다(Nikolic et al. 1999; Shimizu et al. 2008; Kalscheuer et al. 2014). 태아 돼지 흉선 조직의 사용은 다양한 TCR 레퍼토리를 가지는 Treg를 포함하여 정상적이고 기능적인 인간 T 세포를 생성하는 인간 태아 흉선 조직에 대한 대안을 제공한다. 그러나, 돼지 흉선 상피 세포(TEC) 상에서 HLA 분자의 부재는 면역화에 대한 반응 및 HLA 제한 형질전환 TCR20을 발현하는 흉선세포를 양성으로 선택하지 못하는 돼지 흉선의 입증된 실패에 의해 나타낸 바와 같이, 말초에서 최적의 HLA-제한 면역 기능을 매개하는 인간 T 세포의 선택을 제한할 수 있다(도 6 및 8). 또한, 돼지 흉선은 TEC에 의해 생성된 인간 조직-제한 항원(TRA)을 인식하는 HLA-제한 Treg를 양성으로 선택하는 능력, 및 이러한 TRA/HLA 복합체를 인식하는 이펙터 T 세포의 음성 선택에서 제한될 수 있다. 인간 태아 흉선과 비교하여 돼지에서 생성된 말초 인간 T 세포는 HLA-제한 면역 기능과 조직-제한 항원에 대한 항상성 및 내성에서 미묘한 손상을 보인다(Kalscheuer et al. 2012). 돼지 흉선 조직에 대한 형질전환 HLA 분자의 추가로 이러한 한계를 대부분 극복할 수 있다.

본 명세서에는 인간 태아 조직의 사용에 의존하지 않는 HIS 마우스를 얻기 위한 개선된 방법이 나타나 있다.

일 실시형태에서, HIS 마우스는 돼지 및 인간 CD34+ 세포에서 유래된 태아 흉선 조직을 마우스에 도입함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD34+ 세포는 제대혈에서 유래된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD34+ 세포는 성체 조직에서 유래된다. 일부 실시형태에서, 성체 조직은 골수이다. 일부 실시형태에서, CD34+ 세포는 동원된 말초 혈액 조혈 줄기 세포에서 유래된다.

추가 실시형태에서, HIS 마우스는 본 명세서에 기재된 형질전환 돼지에서 유래된 태아 흉선 조직을 도입함으로써 생성된다.

일부 실시형태에서, 마우스는 최근에 기재된 바와 같이 흉선 조직의 도입 전에 흉선이 절제된다(Khosravi Maharlooei et al. 2019). 일부 실시형태에서, 마우스는 또한 방사선 조사를 받는다. 일부 실시형태에서, 마우스는 NOD scid 공통 γ 사슬 녹아웃(NSG) 마우스이다.

돼지 태아 흉선은 마우스의 신장 피막 하에 이식될 수 있다. 마우스에 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포를 주입하는 경우, 상기 세포는 흉선의 이식 전, 후 또는 이와 동시에 주입될 수 있다.

HIS 마우스 모델은 T 세포가 중요한 역할을 하는 연구 분야에 광범위하게 적용될 수 있다. 이러한 영역은 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지 않을 것이다:

HIV 감염 및 기타 감염. 이 모델은 돼지 흉선이 인간 태아 흉선 조직과 비교하여 HIV 감염에 대한 저항성을 부여한다는 것을 입증하는 데 사용되었다(Hongo et al. 2007).

흉선에서의 발달, 말초 조직에서의 수송 및 항상성을 포함한 Treg 생물학. 이 모델은 돼지 흉선에서 생성될 때 우수한 Treg 발달 및 기능을 입증하는 데 사용되었지만, 흉선 조직에 HLA 분자를 추가함으로써 수정될 것으로 예상되는 변경된 말초 항상성으로 인해 미묘한 표현형 차이가 있다. 추가적으로, 이 모델은 주입 후 생체외에서 확장된 Treg의 분포, 생존 및 활성(예를 들어, 이식편 거부반응 억제)의 결정을 가능하게 하므로, Treg 요법을 연구하는 데 유용할 것이다.

이식 면역학. 인간 또는 돼지 태아 흉선 조직 및 인간 태아 또는 성체 CD34+ 세포로 구성된 HIS 마우스는 인간 및 돼지 피부, 및 섬(islet) 동종이식편과 이종이식편을 거부할 수 있는 것으로 나타났지만(Lan, et al. 2004; Shimizu, et al. 2008; Zhao, et al. 1997; Zhao, et al. 1998), 돼지 태아 흉선 조직으로 생성된 것은 흉선 공여체의 SLA를 공유하는 피부 이식편을 특이적으로 수용한다(Kalscheuer et al, 2014). 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 마우스는 동종이계 인간 피부 이식편을 거부하는 데 사용될 수 있다. 이러한 데이터는 이 모델이 동종이식편 및 이종이식편에 대한 내성을 유도하는 접근법을 조사하기 위한 이식 면역학 및 전임상 연구에 유익할 것임을 나타낸다. 이 모델은 또한 현재 탐색 중인 이종이식편 내성에 대한 혼합 키메라 및 돼지 흉선 이식 접근법을 최적화할 것이다.

자가면역. 섬 자가항원을 인식하는 TCR로 CD34+ 세포를 형질도입하여, 이 모델은 흉선에서 자가반응성 T 세포의 발달 및 자가항원에 대한 내성이 흉선과 주변부 둘 다에서 조절되는 방법에 대한 연구를 용이하게 할 것이다. 추가적인 자가항원에 특이적인 TCR은 재현성이 높은 흉선 HLA 유전자형이 있는 잘 정의된 모델에서 용이하게 연구될 수 있다.

코비드-19(COVID-19)와 같은 감염. 코비드-19 병리에 미치는 영향을 조사하기 위해 인간 면역계를 포함하는 모델에 대한 절실한 필요성이 존재한다. 인간 태아 조직을 이용할 수 없다는 것은 이와 같은 연구에 대한 큰 난제를 제시한다. 이러한 난제는 인간 태아 흉선 대신에 HLA-형질전환 태아 돼지 흉선 조직을 사용함으로써 충족될 수 있다.

배경 MHC(SLA) 및 HLA 이식유전자가 각각의 공여체에 대해 동일하고 돼지는 전반적으로 상당히 근친교배되기 때문에, HIS 마우스를 생성하는 형질전환 돼지의 사용은 태아 인간 흉선을 사용하여 생성된 HIS 마우스보다 더 우수한 모델을 생성할 수 있다. 인간 태아 조직을 사용할 때의 큰 난제 중 하나는 HLA 및 전체 유전적 배경이 공여체마다 상이하고 이로 인해 HIS 마우스 연구의 재현성을 방해하는 변수가 도입된다는 것이다.

실시예

본 발명은 하기 실험적 세부내용으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 당업자는 논의된 특정 방법 및 결과가 이후에 뒤따르는 청구범위에서 보다 완전히 기재된 바와 같은 본 발명을 단지 예시하는 것임을 용이하게 이해할 것이다.

실시예 1 - CRISPR-보조 상동 재조합을 사용하는 돼지의 유전자 변형

CRISPR-보조 상동 재조합이 적절하게 표적화된 세포에 대한 적절한 선택 전략과 조합될 때 돼지의 유전자 변형을 가능하게 한다는 것을 설명하기 위해 2개의 돼지 유전자 변형을 수행하였다.

첫 번째 변형에서, 4개의 인간 유전자에 대한 코딩 서열을 CRISP-보조 상동 재조합을 사용하여 삭스 미니 돼지의 GGTA1 유전자좌에 도입하였다(도 1). 이 경우, GGTA1 유전자좌로의 표적화는, 이 게놈 영역이 엄격한 시간적 또는 계통 의존적 전사 억제의 대상이 아니므로, 이식유전자의 발현을 위한 "안전한 은신처"를 제공하였다. 2A 자가-스플라이싱 요소를 사용하여 2개의 그룹에서 편재하는 CAG 프로모터로부터 4개의 이식유전자가 발현되었다. 적절하게 표적화된 세포의 비-클론 선택은 이 경우에 간단했는데, 이는 이식유전자의 발현이 양성 마커로 사용될 수 있고, 벡터가 널 GGTA1 대립유전자에 대해 이형접합성인 세포로 형질감염되어 GGTA1 발현이 손실되었기 때문이다. 세포의 신속한 집단 기반 선택은 클로닝된 태아 및 새끼 돼지의 생성에 효율적인 체세포 핵 이식(SCNT) 공여체 집단을 생성하였다.

두 번째 변형은 첫 번째 변형을 보유하는 클로닝된 태아 유래의 섬유아세포에 연속적으로 도입되었으며, 상당히 더 복잡하였다. 이 경우, 인간 IL3R 발현의 적절한 계통 및 시간적 특이성을 달성하기 위해 천연 IL-3 수용체 알파 사슬 프로모터의 제어 하에 인간 IL-3 수용체의 두 사슬 모두에 대한 코딩 서열이 도입되어야 했다. 이 경우 표적화된 세포 선택에 대한 주요 장애물은 SCNT 클로닝에 필요한 섬유아세포에서 IL3R 발현의 결여이다. 추가적으로, 삽입결실 생성의 표적화된 통합을 통한 내인성 ILR3 발현의 파괴적인 손실은 치명적인 사건은 아니더라도 매우 해로울 것으로 예상되므로, 천연 ILRa 유전자좌의 1개 대립유전자에 대한 유전자 변형은 제한되어야 했다. 클로닝 관점으로부터, 가능한한 적은 수의 집단 배가로 적절하게 표적화된 세포에 대해 충분한 풍부화를 가지는 비-클론 공여체 세포 집단을 얻는 것이 희망사항이다.

이 연구로부터의 전략 및 결과는 도 2에 나타나 있다.

최소 배가로 고도로 풍부화된 SCNT 공여체 세포 집단에 대한 요구는 선택 마커 프로모터가 없는 벡터가 이용됨을 나타내었다. IL3Ra가 섬유아세포에서 발현되지 않으므로, 주변 유전자(SLC25A6, 미토콘드리아 뉴클레오타이드 수송체)의 편재적인 발현이 적절한 표적화의 마커로서 이용될 수 있는지를 알아보기로 결정하였다. 2A 자가 절단 펩타이드를 통해 연결된 GFP 코딩 서열을 사용하여 SLC25A6 전사 단위를 태깅하는 것은 확실한 선택 전략을 제공하였지만, 이와 같은 복잡한 변형(15 kbp 초과의 게놈 서열을 7 kbp 초과의 벡터 서열로 치환함)이 공여체 세포 선택에 대해 충분한 효율성으로 수행될 수 있는지 여부는 불분명하였다.

이전에 변형된 태아 세포에서 IL3Ra 유전자의 1개 대립유전자를 절단할 것으로 예상되는 CRISPR 가이드 RNA를 선택하고 예시된 벡터와 함께 테스트하였다. 예비 형질감염에서, Cas9의 "닉카제" 형태와 함께 쌍을 형성하는 가이드 RNA의 사용이 상당히 별개의 GFP 높음 및 낮음 하위집단을 포함하는 집단을 생성한다는 것이 발견되었다. 1개의 이와 같은 조합으로 생성된 집단의 흐름 분석은 도 2B에 나타나 있다. PCR 분석은 분류된 GFP 높음 하위집단의 세포가 벡터의 양쪽 말단이 적절하게 통합된 세포를 포함함을 나타내었다(도 2C). 이러한 집단의 세포를 대략 24배(32배에서의 평균 클론 노화 훨씬 이전)로 SCNT에서 사용하여, 3마리의 배아 수용체 어린 암퇘지로부터 8마리의 생존 가능한 태아의 생성을 초래하였다. 게놈 및 RT-PCR 분석은 8마리의 태아 모두가 의도한 유전자 변형을 보유함을 나타내었다(도 2D 및 2E). 이러한 공여체 세포 집단을 사용한 추가적인 임신은 만삭까지 계속되었고 관련 이식유전자를 발현하는 살아있는 출생이 얻어졌다.

종합하면, 본 명세서에 기재된 변형은 다중 유전자 변형을 보유하는 돼지를 빠르게 생성하기 위해 비-클론 공여체 세포 선택 전략을 사용하여 다중시스트론 표적화 변형이 돼지에 연속적으로 도입될 수 있음을 입증하였다.

실시예 2 - HLA-A2 유전자도입: d40 형질전환 돼지 태아의 생성 및 유전자형/표현형 평가 -

출발 물질

GGTA1 널, SLA 일배체형 h 동형접합 삭스 미니 돼지(SLA-1*02:01, SLA-2*02:01, SLA-3 널, SLA-DRA*01:01:02, SLA-DRB*02:01, SLA-DQA*02:02:01, SLADQB* 04:01:01) 유래의 섬유아세포를 유전자 변형을 위한 출발 물질로 사용한다. 이 계통 유래의 세포는 이전 형질전환 프로젝트에서 잘 클로닝되었고 이종장기이식 연구를 위한 CCTI에 의해 대규모 번식 집단이 유지되어 연구 커뮤니티에 흉선 조직을 공급하기 위한 HLA 형질전환의 확장을 용이하게 한다. 이들 동물의 부분적으로 근친교배된 특성으로 인해, 자손은 높은 정도의 유전적 유사성을 가질 것이다.

전반적인 전략

모든 형질전환 변형은 천연 SLA 프로모터 뒤의 표적화된 삽입에 의해 이루어진다. 이는 적절한 계통 및 시간적 발현 패턴을 보장할 것이다. 이는 또한 발달 동안 부적절한 태반 HLA 발현과 연관된 잠재적인 문제를 피한다. 형질전환 분자의 두 사슬 모두 동시에 도입된다. 첫 번째 HLA-A2 형질전환 흉선 물질에 이어 HLA-A2/HLA-DQ8 형질전환 흉선 물질을 신속하게 생성하기 위해 태아 단계에서 일련의 변형이 이용된다.

프로모터가 없는 유전자 표적화 벡터가 HLA 변형을 모두 도입하는 데 사용되어, 체세포 핵 이식(SCNT)에서 사용하기 전에 최소한의 수의 세포 분열로 적절하게 표적화된 세포에 대해 고도로 풍부화된 비클론 세포 집단의 선택을 가능하게 한다. 이는 IL3 수용체 사슬을 이용한 프로모터 표적화 변형을 위해 실시예 1에서 사용된 것과 유사한 접근법이지만, 클래스 I 및 클래스 II 분자 둘 다 SCNT 클로닝에 필요한 섬유아세포에서 정상적으로 또는 유도적으로 발현되므로 벡터 설계 과정은 상당히 단순화된다.

d40 클로닝된 형질전환 태아의 생성

HLA-A2에 대한 코딩 서열을 SLA-1 또는 SLA-2 클래스 I 프로모터 중 어느 하나의 뒤에 도입한다. 이러한 유전자좌는 의도된 변형과 관련하여 호환 가능하며 하나의 선택은 둘 다의 인트론 1 서열결정 및 최적의 CRISPR 가이드 RNA 부위에 대한 평가에 의해 결정될 것이다.

HLA-A2는 인간 베타-2 마이크로글로불린(B2M)과 HLA-A2 알파 사슬의 융합체로서 발현된다. 이와 같은 융합체의 형질전환 발현은 이전에 마우스에서 설명된 바 있으며(Kotsiou et al. 2011; Pascolo et al. 1997) 본 명세서에서 이의 사용은 HLA-A2와 돼지 B2m 사이의 이형 상호작용이 HLA-A2 표면 발현을 방해하지 않을 것임을 보장한다.

CRISPR/Cas9-보조 상동 재조합은 융합 카세트를 표적화하는 데 사용된다. HLA-A2 표적화는 SLA I 유전자의 하나의 대립유전자로 제한되며 다른 대립유전자는 널로 만들어질 수 있고: 제2 대립유전자의 돌연변이는 돼지에서 면역 결과가 없게 될 것이며 내인성 클래스 I 알파 사슬의 발현 감소를 통해 HLA-A2 발현을 증가시킬 수 있다.

HLA-A2의 통합을 위한 벡터 구축

HLA-A2의 통합을 위한 표적화 벡터는 도 3에 도식화되어 있다. 천연 유전자(백색 및 청색 분절)와 서열이 동일한 벡터 상동성 암 사이의 상동 재조합은 인트론 1/엑손 2 접합부에서 인간 B2M-HLA-A2 카세트의 도입을 초래한다. 인간 B2M의 성숙한 형태가 엑손 1에 의해 제공되는 신호 펩타이드와 함께 여기에서 도입되며; 신호 펩타이드는 스플라이스 부위로부터 1 bp에서 끝나므로, 융합 단백질은 B2M 단백질 서열의 변경 없이 제조된다. 쌍을 형성한 CRISPR 가이드 RNA는 인트론 1의 말단 및 엑손 2의 시작부 근처의 적절한 서열 부위에서 선택되고 Cas9 닉카제 활성을 발현하는 플라스미드에 통합된다.

SCNT를 위한 변형된 섬유아세포의 선택

표적화 및 CRISPR/Cas9 가이드 플라스미드를 섬유아세포에 뉴클레오펙션시키고(nucleofected) 3 내지 5일 후에 제1 라운드 선택을 수행한다. 선택은 HLA-A2-특이적 항체(클론 BB7.2, Biolegend)로 염색한 세포의 유세포 분류에 의한다. HLA-A2 발현을 기반으로 하여 가장 높은 표적화 비율을 산출하는 쌍을 결정하기 위해 선택된 가이드 쌍으로 예비 단일 분류 분석을 수행한다. SCNT 공여체 세포 선택을 위해, 발현 세포의 최대 풍부화를 위해 2개 라운드의 유사한 선택을 이용한다. 그 다음 이 집단에 대해 게놈 및 RT-PCR 분석을 수행하여 형질전환 유전자좌의 예상된 구조 및 RNA 수준 발현을 확인하고 제2 SLA 유전자좌가 과정에서 변경되었는지 여부를 결정한다.

d40 형질전환 태아의 생성 및 특성화

선택된 SCNT 공여체 세포가 핵 이식/배 이식에 사용되며, 생성된 태아를 대략 임신 40일째에 수확하였다. 모든 돼지 조작 프로젝트에서 2단계 클로닝 과정을 이용한다. 임신 40일째에 수확하면 추가 클론 생성을 위한 계통에 적용하기 전에 클론 수준에서 유전자 구조의 확인, 및 종종 이식유전자의 발현의 확인이 가능하다. 추가적으로, 최소로 배양된 초기 배아 유래의 세포는 확장된 시험관내 과정을 따른 것보다 클로닝 속도가 훨씬 더 높은 경향이 있다. 마지막으로, 추가적인 유전자 변형(예를 들어, HLADQ8의 연속 도입)에 필수적인 시험관내 수명과 관련하여 계통의 "재생"을 허용한다.

HLA-A2 형질전환 태아의 특성화를 위해, 게놈 PCR을 사용하여 예상되는 통합 부위 구조를 확인하고, RT-PCR을 사용하여 적절한 RNA 발현을 확인하며 유세포 분석을 사용하여 세포 표면 발현을 확인한다.

실시예 3 - HLA-A2/HLA-DQ8 형질전환: d40 형질전환 돼지 태아의 생성 및 유전자형/표현형 평가

실시예 2에 기재된 HLA-DQ8 발현을 기반으로 하는 세포 선택을 이용하여 천연 프로모터에 대해 프로모터가 없는 벡터를 이용하는 표적화 발현 및 유사한 전체 전략을 사용하여 형질전환 돼지(HLA-A2,/HLA-DQ8)를 생성한다. SLA 클래스 I과 대조적으로, SLA 클래스 II는 일반적으로 섬유아세포에서 발현되지 않는다. 인간 및 마우스 섬유아세포에서 관찰되는 바와 같이, 인터페론 감마가 있는 태아 섬유아세포에서 클래스 II 발현이 유도될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 1차 태아 섬유아세포를 돼지 IFN-g(80 ng/㎖)에 노출시킨 다음 돼지 DR 및 DQ 범-대립유전자 표면 발현을 유세포 분석에 의해 관찰하였다. DR 및 DQ 둘 다의 표면 발현은 IFN-g 처리 6일 후 거의 모든 세포에서 강하게 유도되는 것으로 확인되었으며(도 4), 대부분의 세포는 유도 3일 후에 둘 다 강하게 발현하였다. 중요한 점은, 이와 같은 처리가 이들 세포의 형태 또는 성장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다는 점이다. 따라서 클래스 II의 유도된 발현은 SCNT 클로닝에 필요한 세포에서 형질전환 HLA-DQ8의 천연 클래스 II 프로모터 발현을 선택하는 실행 가능한 수단이다.

적절한 클래스 II 발현은 CD74, 및 인간에서는 HLA-DM을 포함한 보조 분자의 기능에 따라 달라진다. 형질전환 마우스에서 HLA-DQ8의 발현은 돼지도 또한 HLA-DQ8 발현에 대한 모든 적절한 활성을 가질 가능성이 있게 만든다(Cheng et al. 1996). 뮤린 연구는 내인성 MHC-II 분자의 발현이 아마도 경쟁을 통해 외인성 MHC-II 발현을 제한할 수 있음을 나타내었다. HLA-DQ8 발현은 천연 SLA-DQA 유전자좌에 대해 표적화된다. 표적화 사건은 그 자체로 하나의 SLA-DQA 대립유전자의 기능 손실을 초래할 것이다. CRISPR-매개 변형의 특성으로 인해, 삽입결실 연관 기능 손실은 또한 많은 비율의 세포의 비-표적화 대립유전자에서도 발생할 것이다.

벡터 구축

HLA-DQ8의 통합을 위한 표적화 벡터는 도 5에 도식화되어 있다.

HLA-A2 형질전환의 경우, 알파 사슬과 베타 사슬을 둘 다 단일의 형질전환 단계에서 도입한다. DQ8의 경우, 2개의 사슬에 대한 코딩 서열이 다른 바이시스트론 발현 벡터에서 성공적으로 이용된 고효율 IRES 요소와 연결된다. HLA-DQ 알파 사슬에 아미노산을 추가하는 것에 대한 기능적 결과가 알려져 있지 않으므로, 여기에서 IRES 연결이 자가-스플라이싱 요소보다 선호된다. 또한 HLA-A2 추가와 마찬가지로, 천연 유전자좌의 엑손 1은 HLA-DQ8에 대한 리더 서열을 공급하는 데 사용되며, 이는 N-말단에 단일 아미노산의 추가를 초래한다.

SCNT를 위한 변형된 섬유아세포의 선택

실시예 2에서 생성된 HLA-A2 형질전환 d40 태아 세포는 HLA-DQ8 변형의 도입을 위한 출발 물질이다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 예비 및 SCNT 공여체 세포 형질감염을 수행한다. 다수의 항-범 일배체형 인간 DQ 항체가 상업적으로 입수 가능하다. 선택 후보를 먼저 IFN-g-유도 돼지 섬유아세포에서 스크리닝하여 돼지 DQ 이량체에 결합하지 않는 후보를 식별한다. 그 다음 종간 이량체를 인식하는 임의의 항체를 제거하기 위해 HLA-DQA*03:01 및 HLADQB1* 03:02에 대한 발현 작제물로 별도로 형질감염된 IFNg-유도 돼지 섬유아세포를 사용하여 이들 후보에 대해 2차 스크리닝을 수행한다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 이러한 기준을 충족하는 후보(들)를 이용한 세포 선택을 수행한다. 또한 실시예 2에서와 같이 유세포 분류된 집단에 대해 게놈 및 RT-PCR 분석을 수행하여 형질전환 유전자좌의 예상된 구조 및 RNA 발현을 확인한다.

d40 형질전환 태아의 생성 및 특성화:

실시예 2에서 HLA-A2 변형에 대해 기재된 바와 같이 게놈 및 RNA 분석을 수행할 것이다.

실시예 4 - HLA-A2 및 HLA-A2/HLA-DQ8을 발현하는 d56 내지 70 흉선 조직의 생성

실시예 2 및 3으로부터 생성된 유전형 및 표현형이 확인된 초기 태아 세포주를 세포 배양, 난모세포 성숙 및 배아 재건을 위한 실험실뿐만 아니라, 배 이식 및 태아 및 새끼 돼지의 분만을 위한 외과 시설이 있는 시설로 보낸다. 56 내지 70일 태아를 생성하기 위한 SCNT 클로닝을 수행한다. 태아의 유전자형 및 표현형을 확인한 후 당업계에 알려진 방법에 의해 흉선 분리를 수행한다.

실시예 5 - HLA-A2/HLA-DQ8 형질전환 창시 수퇘지의 번식

창시 수퇘지를 위한 SCNT는 실시예 2 및 3에서 생성된 확인된 유전자형/표현형의 d40 태아 세포를 이용한다. 형질전환 새끼 돼지를 선적 연령(8 내지 16주)까지 사육하고 추가 사육을 위해 대형 동물 사육, 수용 및 절차를 위한 최첨단 사육 시설로 보낸다.

실시예 6 - HIS 마우스에서 인간 T 세포 항상성을 위한 흉선과 말초 APC 간의 HLA 공유의 중요성

방법

Jackson Laboratories에서 구입한 6 내지 8주령 암컷 NOD scid 공통 γ 사슬 녹아웃(NSG) 마우스에서 이전에 기재된 바와 같이 흉선을 절제하였다(Khosravi Maharlooei et al. 2019). 2주 후, 이들 마우스는 치사량 이하의 전신 방사선 조사(1 ㏉)를 받은 다음 신장 피막 아래에 1 ㎣의 태아 돼지 또는 인간 흉선 조직 단편을 외과적으로 이식받았다.

그 다음 HLA 공유가 없는 두 세트의 동종이계 CD34+ 세포(#1 및 #2) 및 공여체 #1의 자가 태아 흉선을 흉선 절제한 NSG 마우스에 이식함으로써 혼합 키메라 공여체 HIS 마우스를 생성하였다. CD34+ 세포 #1 또는 #2를 흉선 절제한 NSG 마우스(흉선이 없음)에 주입함으로써 두 그룹의 입양 수용체(AR)를 생성하였다. 이식 후 20주째에 혼합 키메라 유래의 T 세포를 AR1 및 AR2 마우스에 i.v. 주입하였다. 도 6A를 참조한다.

결과

입양 전이 후 10일째에, 증식하는 (Ki67+) T 세포의 비율은, 동종이계 HLA만 보유하는 AR2 마우스에서보다, APC가 T 세포를 선택한 공여체 흉선에 대해 HLA-자가 유래인 AR1 마우스에서 현저하게 더 컸다. 도 6B를 참조한다.

이러한 연구는 말초 APC 상의 흉선 HLA가 말초 인간 T 세포의 최대 림프구감소증-유발 확장을 지원하는 데 필요하다는 것을 입증하며, 정상적인 면역 항상성을 달성하기 위해 돼지 흉선에서 인간 흉선 상피 세포 또는 HLA 분자를 제공하는 연구의 중요성을 강조한다.

실시예 7 - HIS 마우스에서 인간 면역 재구성의 비교

방법

실시예 6에 기재된 바와 같이 흉선이 절제되고 방사선 조사된 NOD scid 공통 γ 사슬 녹아웃(NSG) 마우스의 신장 피막 아래에 돼지 태아 흉선을 이식함으로써 인간화 마우스를 생성하였다.

그 다음 이들 마우스에 인간 제대혈-유래 CD34+ 세포를 주입하였다. 동일한 태아 돼지 흉선 및 상이한 제대혈 CD34+ 세포를 사용하여 2개 배취(batch)의 인간화 마우스를 생성하였다. 인간 CD34 마이크로비드 키트(Miltenyi Biotech)를 사용함으로써 CD34+ 세포를 단리할 것이다. CD34+ 세포 접종원 중 잔류 T 세포 및 인간 태아 흉선 조직으로부터 방출된 잔류 흉선세포의 고갈을 위해 항-CD2mAb LoCD2b(400 ㎍/마우스)를 2주 동안(제0일, 제7일 및 제14일) 일주일에 한 번 복강내 주입하여 이식편 유래의 기존 인간 흉선세포에 의한 주입된 동종이계 인간 제대혈 CD34+ 세포 및/또는 돼지 흉선 조직의 거부반응을 방지하였다.

다른 실험에서 인간 태아 흉선 조직 및 자가 태아 간-유래 CD34+ 세포로 생성된 인간화 마우스의 재구성을 비교를 위해 포함하였다.

4주째에 시작하여, 마우스의 말초 혈액을 수득하고 인간 CD3 세포의 혈중 농도를 측정하였다.

15주째에, 말초 혈액의 유세포 분석을 수행하여 CD4 및 CD8 T 세포, 미경험 및 메모리 CD4 및 CD8 T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 T 여포 헬퍼(Tfh) 세포를 포함한 T, B 및 골수성 세포 집단; 고전적 DC(cDC1 및 cDC2) 및 형질세포양 DC(pDC)를 포함한, B 세포 하위세트, 단핵구 및 수지상 세포(DC)의 수를 결정하였다.

결과

도 7A에 나타낸 바와 같이, 마우스의 말초 혈액 중 인간 세포를 기반으로 하여, 인간 T 세포 재구성은 돼지 태아 흉선 및 인간 CD34+ 세포로 생성된 마우스의 2개 배취에서 인간 태아 흉선으로 생성된 것과 비슷하였다.

도 7B에 나타낸 바와 같이, CD4 및 CD8 하위세트에서 미경험 T 세포의 높은 백분율이 검출되었다. CD4+CD25^highCD127^low 조절 T의 생성이 또한 입증되었다.

실시예 8 - HIS 마우스의 지속적인 모니터링 및 분석

실시예 7에서 생성된 마우스를 다음과 같이 추가로 모니터링한다.

이식 후 4주마다 ELISA에 의해 혈장 면역글로불린 수준(IgM 및 IgG)을 모니터링하고 비교한다.

이식하고 14 내지 16주 후에, HIS 마우스가 인간 세포에 의해 완전히 재구성될 것으로 예상될 때, 각각의 그룹에서 동물의 절반을 안락사시키고, 말초 혈액, 림프절, 비장 및 흉선 내의 크기, 구조, 세포질(cellularity) 및 세포 집단을 모든 그룹과 비교한다. 면역 세포 집단을 연구하기 위한 유세포분석 패널은 표 1에 나타낸 것이다. 비장, 림프절 및 흉선을 포함한 각각의 림프 조직의 작은 조각은 이들 조직의 구조를 비교하기 위한 조직학적 연구에 사용된다. 혈청 면역글로불린 수준(IgM 및 IgG)을 모든 HIS 마우스에서 ELISA에 의해 측정한다. 추가적으로, 각각의 그룹의 마우스 말초에서 인간 T 세포의 기능을 범-TCR 자극(항-CD3/CD28 비드), 동종항원 자극, 이종항원 자극 및 파상풍 톡소이드 신생항원 자극에 대한 반응으로 증식, 사이토카인 생성 및 세포독성의 시험관내 분석을 사용하여 비교한다. 증식을 CFSE 세포 염료 희석에 의해 결정한다. IL-2 및 IFN-γ를 포함한 사이토카인의 생성을 세포내 염색에 의해 분석한다. 동종항원 및 이종항원 자극의 경우, 동종이계 인간 PBMC 및 제3자 돼지 PBMC를 자극제로서 사용한다. HIS 마우스로부터 단리된 비장 T 세포를 CFSE로 표지하고, 방사선 조사된 자극제와 함께 1:1의 비율로 6일 동안 공동 배양한다. 인간 CD4 및 CD8 T 세포의 CFSE 희석을 유세포 분석에 의해 결정한다. 파상풍 톡소이드 신생항원 자극의 경우, HIS 마우스의 생성에 사용되는 제대혈 또는 태아 간-유래 CD34+ 세포를 사용하여 DC를 생성한다. CD34+ 세포를 수지상 세포로의 분화를 위해 줄기 세포 인자, GM-CSF 및 IL-4를 포함한 인간 사이토카인과 함께 13일 동안 배양한다. CD34-유래 DC를 파상풍 톡소이드 신생항원으로 펄스한 다음 TNF-α 및 PGE2에 의해 성숙시킨 후 CFSE-표지된 단리된 비장 T 세포와 함께 7일 동안 공동 배양한다. 증식된 T 세포를 유세포 분석에 의해 결정한다. 단핵구를 LPS로 자극할 것이며 상청액에서 TNF-α, IL-6 및 IL-10의 생성을 ELISA에 의해 결정한다.

나머지 HIS 마우스를 최대 30주까지 모니터링하여 각각의 계통의 재구성 지속성을 관찰하고 이식편-대-숙주/자가면역 질환의 출현을 관찰한다. 마우스에서 4주마다 채혈하여 인간 세포 생착을 결정한다. 이식 후 20주째로부터 시작하여, 하기에 나타낸 채점 시스템을 사용하여 30주까지 주당 2회 이식편-대-숙주/자가면역에 대해 마우스를 채점한다. 모든 분석은 상기 기재한 것과 동일할 것이다.

채점 시스템:

체중 감소(%): 10% 미만, 0; 10 내지 15% 미만, 1; 15 내지 20% 미만, 2; 20% 초과, 3

자세: 정상, 0; 휴식시 등이 약간 구부정함, 1; 등이 중간 정도로 구부정하고, 정상적으로 걸을 수 있음, 2; 등이 심하게 구부정하고, 움직임 및 보행 장애가 있음, 3

모발 덮힘: 정상, 0; 약한 주름, 1; 중간 정도의 주름, 2: 심한 주름, 얼굴 또는 앞다리의 포르피린 염색, 3

활동: 정상, 0; 약간 내지 중간 정도의 감소, 1; 먹거나, 마시거나, 자극을 받을 때만 활동적, 2; 일어나기 어려움, 자극을 받을 때 움직일 수 없음, 3

GVHD(2점 초과의 점수)의 임의의 징후가 있는 동물을 매일 모니터링하고 격일로 한번 체중을 확인한다. 총 점수가 6점 이상인 동물을 매일 모니터링하고 체중을 측정한다. 총 점수가 9점 이상이거나 임의의 하나의 카테고리의 점수가 3점인 동물을 안락사시킨다.

이 연구는 태아 돼지 흉선 및 제대혈 유래 CD34+ 세포의 이식 후 인간 재구성을 태아 인간 흉선 및 태아 CD34+ 세포로 달성한 재구성과 비교한다. 결과는 태아 돼지 흉선 및 제대혈 유래 CD34+ 세포로 생성된 HIS 마우스가 태아 인간 흉선 및 태아 CD34+ 세포로 생성된 HIS 마우스와 유사한 인간 재구성을 가진다는 것을 나타낸다. 인간 세포 재구성이 말초 혈액에서 확인되면(이식하고 약 4개월 후), 하기 기재한 바와 같이, 인간 동종이계 피부 이식편의 제한 및 거부반응이 한정된 형질전환 인간 T 세포 수용체(TCR)의 흉선 선택을 결정함으로써 이들 마우스이 생체내 면역 기능을 조사하는 연구가 개시된다.

실시예 9 - HIS 마우스에서 HLA-A2 제한 TCR의 선택 비교

SLA-한정 태아 흉선 조직에서 HLA-A2 제한 TCR 대 제대혈 CD34+ 세포로부터 재구성된 흉선이 절제된 NSG 마우스에서 HLA-A2+ 태아 인간 흉선 조직의 선택을 비교한다. HU/HU 마우스에서 인간 CD34+ 세포의 렌티바이러스 형질도입을 사용하여, 인간 HLA-A2-제한 TCR MART1이 HLA-A2+ 인간 흉선에서 양성으로 선택되었지만 SLAkm 돼지 흉선에서는 그렇지 않다는 것이 확립되었다(도 8). 이 연구는 이러한 TCR이 실시예 2 및 3의 형질전환 돼지에서 HLA 이식유전자의 도입에 사용되는 돼지 SLA이므로, 상기 TCR이 또한 동형접합 SLAhh 태아 돼지 흉선에서 양성으로 선택되지 않는다는 것을 보여준다.

실시예 7에 일반적으로 기재된 바와 같이 태아 돼지 흉선(SLAhh) 또는 태아 인간 흉선 및 MART-1-TCR-형질도입 태아 간 또는 제대혈-유래 CD34+ 세포(표 2)를 사용하여 3개의 마우스 그룹을 생성한다. CD34+ 세포의 형질도입을 위해, 인간 태아 간 또는 제대혈 CD34+ 세포를 각각 10 ㎍/㎖ 프로타민 설페이트 및 60 ng/㎖, 150 ng/㎖ 및 300 ng/㎖ 재조합 인간 IL-3, Flt3 리간드, 및 줄기 세포 인자와 함께 3시간 동안 Stemline II 배지에서 인큐베이션함으로써 레트로넥틴(retronectin)-코팅 플레이트에서 사전 자극한다. 감염 다중도 30에서 세포를 밤새 형질도입한 다음, 수확하고 경골내 주입을 위해 준비한다. 소수의 형질도입된 CD34+ 세포를 프로타민 설페이트가 없는 줄기 세포 배지에서 4일 동안 배양한 다음, 유세포분석에 의해 형질도입 효율에 대해 평가한다. 말초에서 HLA-A2+ APC의 존재가 HLA-A2에 의해 선택된 인간 T 세포의 최적 항상성을 위해 필요할 가능성이 있으므로, HLAA2+ 태아 간 또는 제대혈 CD34+ 세포를 HIS 마우스를 생성하는 데 사용한다. HLA 유형 분류를 위해, 이들 조직으로부터 CD34+ 세포를 단리한 후 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)를 사용하여 CD34 음성 태아 간 또는 제대혈 세포로부터 DNA를 단리한다. 생어(Sanger) 대립유전자-수준 HLA 유형 분류를 수행하여 조직의 HLA 유형을 결정한다. 조직의 유형을 분류하는 동안, 인간 태아 및 제대혈 CD34+ 세포를 동결시킨다.

이식하고 14 내지 16주 후에, HIS 마우스가 인간 세포에 의해 완전히 재구성될 때, 이들 마우스를 분석을 위해 안락사시킨다. CD7+ 초기 흉선세포, 이중 양성, CD4 단일 양성 및 CD8 단일 양성 하위세트를 포함하여 이중 음성(CD1a+) 중에서 MART-1+ 흉선세포의 백분율 및 절대 수를 선택 마커(CD69, PD1, CCR7)와 함께 결정한다. 태아 돼지 흉선에서 HLA 클래스 I-제한 TCR MART1의 양성 선택의 실패가 관찰된다.

형광색소-표지 MART1 사량체는 형질전환 T 세포를 식별하는 데 사용되며 GFP는 형질도입된 HSPC로부터 기원 마커의 역할을 한다. 흉선 발달의 각각의 단계에서 GFP+ 및 GFP- 흉선세포는 각각의 개별 마우스에서 형질전환 및 비-형질전환 T 세포의 선택 수준에 대한 내부-제어 비교를 제공한다. 형질전환 돼지를 생성할 때(실시예 3 및 4) 수행된 이러한 연구는 돼지 태아 흉선에서 HLA-A2 이식유전자가 돼지 흉선에서 HLA-A2-제한 인간 T 세포의 선택에 미치는 영향을 결정하는 것에 대한 기준선을 제공한다. 상세한 패널은 하기 표 3에 나타나 있다. Aurora Spectral 유세포분석으로 분석을 수행할 것이다.

실시예 10 - HIS 마우스에서 HLA-DQ8-제한 섬 자가항원-특이적 TCR의 선택 비교

다음으로, HLA-DQ8-제한 섬 자가항원-특이적 TCR인 클론 5의 선택을 HLA-DQ8+ 제대혈 CD34+ 세포로부터 재구성된 흉선이 절제된 NSG 마우스에서 SLA-한정 태아 흉선 조직 대 태아 인간(각각의 TCR에 대한 관련 HLA 대립유전자를 보유함)에서 비교한다. 인간 태아 흉선 조직을 사용하여, 클론 5 TCR+ T 세포가 HLADQ8 인간 태아 흉선에서 양성으로 선택되고 HSPC가 HLA-DQ8을 발현하는 경우 음성으로 선택되는 것으로 나타났다(도 9). 실시예 7에 일반적으로 기재된 바와 같이 태아 돼지 흉선(SLAhh) 또는 태아 인간 흉선 및 클론 5 TCR-형질도입 태아 간 또는 제대혈 유래 HLA-DQ8+ CD34+ 세포를 사용하여 3개의 HIS 마우스 그룹(표 4)을 생성한다.

HLA 유형 분류를 위해, 이들 조직으로부터 CD34+ 세포를 단리한 후 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)를 사용하여 CD34 음성 태아 간 또는 제대혈 세포로부터 DNA를 단리한다. 생어 대립유전자-수준 HLA 유형 분류를 수행하여 조직의 HLA 유형을 결정한다. 조직의 유형을 분류하는 동안, 인간 태아 및 제대혈 CD34+ 세포를 동결시킨다.

이식하고 14 내지 16주 후에, HIS 마우스가 인간 세포에 의해 완전히 재구성될 때, 이들 마우스를 분석을 위해 안락사시킨다. CD7+ 초기 흉선세포, CD69+ 및 CD69- 이중 양성, CD4 단일 양성 및 CD8 단일 양성 하위세트를 포함하여 이중 음성(CD1a+) 중에서 클론 5+ 흉선세포의 백분율 및 절대 수를 음성 선택 마커(PD1, CCR7)와 함께 결정한다. HLA-DQ8+ 흉선에서 이 TCR을 이용하여 흉선세포의 Treg 계통 분화를 검출하기 위해 Treg의 마커(CD25 및 CD127)를 또한 분석에 포함한다. 상세한 패널은 하기 표 5에 나타나 있다. Aurora Spectral 유세포분석으로 분석을 수행한다.

이 TCR에 의해 인식되는 인슐린 펩타이드는 수질 TEC(mTEC)에 의해 생성될 것으로 예상되므로, 이 TCR의 양성 선택은 둘 다 흉선 상피에 의한 HLA-DQ8의 발현에 따라 다르다. 따라서, 태아 돼지 흉선에서 HLA 클래스 II-제한 TCR 클론 5의 양성 선택의 실패가 관찰된다.

그러나, 일부 경우에는 이 TCR을 양성으로 선택할 수 있는 SLAhh 돼지 흉선에서 생성된 교차 반응성 결정인자가 있다. 이 경우, HLA-DQ8+ CD34+ 세포로 재구성된 돼지 흉선에서 이 TCR에 의해 흉선세포의 음성 선택이 일어나는지 여부를 결정한다.

HLA-DQ8+ 인간 흉선에서의 예비 데이터는 이 TCR을 음성으로 선택하기 위해 HLA-DQ8이 CD34 세포 유래 APC에 필요함을 시사한다(도 8 참조). 이는 인슐린 B(9-23) 펩타이드가 돼지 및 인간 인슐린 분자에서 동일하고 돼지 흉선 이식편에서 인간 APC에 의해 선택되고 제시될 수 있으므로, 인간 HLA-DQ8+ APC를 포함하는 돼지 흉선에서 여전히 일어날 수 있다. 형광색소-표지 클론5 Vβ-특이적 mAb(Vβ21.3)는 형질전환 T 세포를 식별하는 데 사용되며 GFP는 형질도입된 HSPC로부터 기원 마커의 역할을 할 것이다. 흉선 발달의 각각의 단계에서 GFP+ 및 GFP- 흉선세포는 각각의 개별 마우스에서 Tg 및 비-Tg T 세포의 선택 수준에 대한 내부-제어 비교를 제공한다. 형질전환 돼지를 생성할 때(실시예 3 및 4) 수행된 이러한 연구는 태아 돼지 흉선에서 HLA-DQ8 이식유전자가 돼지 흉선에서 HLA DQ8-제한 인간 T 세포의 선택에 미치는 영향을 결정하는 것에 대한 기준선을 제공한다.

실시예 11 - HIS 마우스의 동종이계 인간 피부 이식편의 거부반응의 비교

상이한 흉선 및 CD34+ 세포로 생성된 HIS 마우스에서 인간 면역계의 기능을 조사하기 위해, 동종이계 피부 이식편을 거부하는 이들의 능력을 비교한다. 이를 위해, 실시예 7에 일반적으로 기재된 바와 같이 태아 돼지 또는 인간 흉선 및 CB 또는 태아 간-유래 CD34+ 세포(표 6)를 이식함으로써 HIS 마우스를 생성한다.

이식하고 14 내지 16주 후에, 동종이계 인간 공여체 유래의 분할 두께(2.3㎜) 피부 샘플을 흉곽 측벽에 이식한다. 피부 이식편을 제7일부터 제4주까지 매일 평가한 다음, 그 이후에는 3일마다 적어도 1회의 검사를 수행한다. 이식편의 10% 미만이 생존 가능한 상태로 남아 있을 때 이식편은 거부된 것으로 정의된다. 흉선 및 CD34+ 세포의 2가지 유형으로 구축된 HIS 마우스는 동종이계 피부 이식편을 거부할 수 있다.

실시예12 - 비-형질전환 대 HLA-A2 형질전환 돼지 흉선을 이용하는 인간 세포 재구성의 비교

실시예 7에 나타낸 바와 같이, 태아 돼지 흉선 및 제대혈-유래 CD34+ 세포로 생성된 HIS 마우스는 태아 흉선 및 자가 태아 간 유래 CD34+ 세포로 생성된 HIS 마우스와 비교하여 T 세포에서 약간의 기능적 결함, 예컨대, 감소된 HLA 제한 항원 반응 및 TCR-형질도입 T 세포의 흉선 선택을 가진다. 주요 이유는 HLA보다 돼지 백혈구 항원(SLA) 분자가 돼지 흉선에서 흉선세포 양성 선택을 매개하고 이러한 선택된 T 세포의 작은 하위세트만이 인간 HLA와 충분히 교차 반응하여 CD34 세포 공여체-유래 DC의 HLA에 의해 제시된 펩타이드 항원을 인식할 것이기 때문이다. 이 모델은 HLA-A2 및 HLA-DQ8을 포함한 공통 HLA 분자를 발현하는 형질전환(Tg) 태아 돼지 흉선을 사용함으로써 최적화된다.

실시예 3의 HLA-A2 형질전환 태아 돼지 흉선을 사용하여, 비-형질전환 대 HLA-A2 형질전환 태아 돼지 흉선으로 생성된 HIS 마우스에서 면역 재구성 및 면역 기능을 비교한다.

흉선이 절제된 NSG 마우스를 사용하여, 표 7에 기재되고 실시예 7에 일반적으로 기재된 바와 같이 형질전환 및 비-형질전환 태아 돼지 흉선과 CB CD34+ 세포를 사용하는 2가지 유형의 HIS 마우스를 생성한다.

이들 HIS 마우스의 생성 후, 마우스를 다음과 같이 모니터링한다.

CD4 및 CD8 T 세포, 미경험 및 메모리 CD4 및 CD8 T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 T 여포 헬퍼(Tfh) 세포를 포함한 T, B 및 골수성 세포 집단; 고전적 DC(cDC1 및 cDC2) 및 형질세포양 DC(pDC)를 포함한, B 세포 하위세트, 단핵구 및 DC의 재증식의 속도 및 말초 혈액 농도를 결정함으로써 HIS 마우스의 2가지 유형에서 인간 면역 세포 재구성을 모니터링하고 비교한다. 이식 후 4주마다, HIS 마우스로부터 말초 혈액을 얻고 ACK 완충액으로 적혈구를 용해한다. 말초 혈액의 유세포 분석을 수행하여 각각의 집단의 백분율 및 절대 수를 결정한다. 각각의 집단의 절대 수를 카운팅 비드(counting bead)를 사용하여 계산한다. HIS 마우스의 각각의 그룹에서 재구성을 달성한 마우스의 백분율을 또한 결정한다. 면역 세포 집단을 연구하는 데 사용한 패널은 표 1에 나타나 있다.

3가지 유형의 HIS 마우스에 이식한 후 4주마다 ELISA에 의해 혈장 면역글로불린 수준(IgM 및 IgG)을 모니터링하고 비교한다.

이식하고 14 내지 16주 후에, HIS 마우스가 인간 세포에 의해 완전히 재구성될 것으로 예상될 때, 각각의 그룹에서 동물의 절반을 안락사시키고, 모든 그룹의 말초 혈액, 림프절, 비장 및 흉선 내의 크기, 구조, 세포질 및 세포 집단을 비교한다. 면역 세포 집단을 연구하기 위한 유세포분석 패널은 표 1에 나타낸 바와 동일하다. 비장, 림프절 및 흉선을 포함한 각각의 림프 조직의 작은 조각은 이들 조직의 구조를 비교하기 위한 조직학적 연구에 사용된다. 혈청 면역글로불린 수준(IgM 및 IgG)을 모든 HIS 마우스에서 ELISA에 의해 측정한다. 추가적으로, 각각의 그룹의 마우스 말초에서 인간 T 세포의 기능을 범-TCR 자극(항-CD3/CD28 비드), 동종항원 자극, 이종항원 자극 및 파상풍 톡소이드 신생항원 자극에 대한 반응으로 증식, 사이토카인 생성 및 세포독성의 시험관내 분석을 사용하여 비교한다. 증식을 CFSE 세포 염료 희석에 의해 결정한다. IL-2 및 IFN-γ를 포함한 사이토카인의 생성을 세포내 염색에 의해 분석한다. 동종항원 및 이종항원 자극의 경우, 동종이계 인간 PBMC 및 제3자 돼지 PBMC를 자극제로서 사용한다. HIS 마우스로부터 단리된 비장 T 세포를 CFSE로 표지하고, 방사선 조사된 자극제와 함께 1:1의 비율로 6일 동안 공동 배양한다. 인간 CD4 및 CD8 T 세포의 CFSE 희석을 유세포 분석에 의해 결정한다. 파상풍 톡소이드 신생항원 자극의 경우, HIS 마우스의 생성에 사용되는 CB CD34+ 세포를 사용하여 DC를 생성한다. CD34+ 세포를 수지상 세포로의 분화를 위해 줄기 세포 인자, GM-CSF 및 IL-4를 포함한 인간 사이토카인과 함께 13일 동안 배양한다. CD34-유래 DC를 파상풍 톡소이드 신생항원으로 펄스한 다음 TNF-α 및 PGE2에 의해 성숙시킨 후 CFSE-표지된 단리된 비장 T 세포와 함께 7일 동안 공동 배양한다. 증식된 T 세포를 유세포분석에 의해 결정한다. 단핵구를 LPS로 자극하고 상청액에서 TNF-α, IL-6 및 IL-10의 생성을 ELISA에 의해 결정한다.

나머지 HIS 마우스를 최대 30주까지 모니터링하여 각각의 계통의 재구성 지속성을 관찰하고 이식편-대-숙주/자가면역 질환의 출현에 대해 관찰한다. 마우스에서 4주마다 채혈하여 인간 세포 생착을 결정한다. 이식 후 20주째로부터 시작하여, 실시예 6에 나타낸 채점 시스템을 사용하여 30주까지 주당 2회 이식편-대-숙주 질환에 대해 마우스를 채점한다. 이 시점에서 수행한 모든 분석은 14 내지 16주에서의 분석과 동일하다.

유사한 골수 재구성이 그룹 간에 발견된다. 면역 재구성 및 기능은 HLA 형질전환 돼지 흉선의 수용체에서 향상될 수 있다.

실시예 13 - HLA-A2 분자에 대한 HLA-A2-형질전환 태아 돼지 흉선에서 발달하는 인간 T 세포의 내성 비교

HLA-A2-형질전환 태아 돼지 흉선으로 생성된 HIS에서 발달하는 인간 T 세포의 한 가지 주요 특징은, HLA-A2-반응성 T 세포가 HLA-A2를 발현하는 흉선 상피 세포에 의한 음성 선택을 통해 제거되고/되거나 HLA-A2를 발현하는 TEC에 의해 선택되는 Treg에 의해 억제될 것이므로, HLA-A2에 대해 내성일 것으로 예상된다. 이를 위해, 인간 Tg HLA 분자에 대한 HLA-A2-Tg 대 비-Tg 태아 돼지 흉선에서 발달하는 T 세포의 내성을 비교한다. CD34+ 세포-유래 APC에 의한 HLA-A2-반응성 T 세포의 음성 선택을 제거하기 위해 HLA-A2- CB CD34+ 세포를 사용하여 HIS 마우스를 생성한다. 생성된 HIS 마우스의 그룹은 표 8에 나타나 있다. 이식하고 14 내지 16주 후에, 비장 및 성숙한 흉선 T 세포를 단리하고 HLA-A2에 대한 내성에 대해 시험관 내에서 테스트하며, 이를 본 발명자들은 공여체 돼지 유래의 DC를 사용하여 HLA-A2-Tg 태아 돼지 흉선의 수용체에서만 관찰할 것으로 예상한다. DC는 태아 돼지 간 백혈구로부터 생성되며, 이는 태아 흉선 수확 시 수확되어 사용할 때까지 동결될 것이다. 태아 간 백혈구는 돼지 줄기 세포 인자, GM-CSF 및 IL-4에서 13일 동안 배양되어 DC로 분화된다. 이러한 연구는 HLA-A2에 대한 반응의 Treg 억제에 미치는 HLA-A2의 형질전환 발현의 영향을 결정하기 위해 Treg 고갈을 포함한다.

실시예 14 - 대조군 대 HLA-A2-Tg 태아 돼지 흉선으로 생성된 HIS 마우스에서 HLA-A2-제한 TCR의 선택 비교

비-Tg 대조군 대 HLA-A2-Tg 태아 돼지 흉선으로 생성된 HIS 마우스에서 HLA-A2-제한 TCR인 MART1의 선택을 비교한다. 치사량 이하의 방사선 조사를 받은 흉선이 절제된 NSG 마우스에 MART-1-형질도입 HLA-A2+ CB CD34+ 세포를 주입한 다음 비-Tg 대조군 또는 HLA-A2-Tg 태아 돼지 흉선을 이식한다(표 9).

이식하고 14 내지 16주 후에, HIS 마우스가 인간 세포에 의해 완전히 재구성될 때, 이들 마우스를 분석을 위해 안락사시킨다. CD7+ 초기 흉선세포, 이중 양성, CD4 단일 양성 및 CD8 단일 양성 하위세트를 포함하여 이중 음성(CD1a+) 중에서 MART-1+ 흉선세포의 백분율 및 절대 수를 다른 음성 선택 마커(CD69, PD1, CCR7)와 함께 결정한다. HLA-A2+ Tg 태아 돼지 흉선에서 HLA 클래스 I 제한 TCR MART1의 향상된 양성 선택이 보일 것으로 예상된다. 형광색소-표지 MART1 사량체는 Tg T 세포를 식별하는 데 사용되며 GFP는 형질도입된 HSPC로부터 기원 마커의 역할을 한다. 흉선 발달의 각각의 단계에서 GFP+ 및 GFP- 흉선세포는 각각의 개별 마우스에서 Tg 및 비-Tg T 세포의 선택 수준에 대한 내부-제어 비교를 제공한다. 상세한 패널은 상기 표 4에 나타나 있다. Aurora Spectral 유세포 분석으로 분석을 수행할 것이다.

각각의 마우스의 말초(혈액, 비장 림프절)에서 MART1+ 및 음성 CD8+ T 세포를 열거하고, 돼지 흉선에서 양성 선택의 증가를 초래할 HLA-A2가 더 많은 수의 MART1+ T 세포를 말초로 내보낼 것이라는 가설을 세운다. 세포 증식 염료 eFluor 450으로 이들 세포를 표지화하고, 자가 DC와 함께 이들 세포를 인큐베이션한 다음, MART1 펩타이드의 등급이 지정된 양을 첨가하고, 증식 및 GFP+ T 세포의 활성화의 다른 마커를 측정함으로써 말초 MART1+ 세포의 기능을 검사한다.

실시예 15 - HLA-A2-Tg 태아 돼지 흉선으로 생성된 HIS 마우스에 의한 동종이계 피부 이식편의 거부반응의 비교

HLA-A2-Tg 흉선 및 CD34+ 세포로 생성된 HIS 마우스에서 면역계의 기능을 조사하기 위해, 동종이계 피부 이식편을 거부하는 HIS 마우스의 능력을 비교한다. 이를 위해, 치사량 이하의 방사선 조사를 받은 흉선이 절제된 NSG 마우스에 HLA-A2-Tg 또는 비-Tg 대조군 태아 돼지 흉선 및 CB CD34+ 세포를 이식함으로써 HIS 마우스를 생성한다(표 10). 이식하고 14 내지 16주 후에, 동종이계 인간 공여체 유래의 분할 두께(2.3㎜) 피부 샘플을 흉곽벽에 이식한다. 피부 이식편을 제7일부터 제4주까지 매일 평가한 다음, 그 이후에는 3일마다 적어도 1회의 검사를 수행한다. 이식편의 10% 미만이 생존 가능한 상태로 남아 있을 때 이식편은 거부된 것으로 정의된다. 말초 T 세포 기능은 흉선 및 말초 인간 APC가 HLA 분자를 공유할 때 더 강력하여, 대조군 돼지 흉선 이식편보다 HLA-A2-Tg의 수용체에서 이식편 거부반응을 더 빠르게 초래한다.

실시예 16 - 비-Tg 대 HLA-A2/DQ8-Tg 돼지 흉선을 이용한 인간 세포 재구성의 비교

HLA-A2/DQ8-Tg 태아 돼지 흉선이 이용 가능한 경우, 비-Tg 대 HLA-A2/DQ8-Tg 태아 돼지 흉선으로 생성된 HIS 마우스에서 면역 재구성 및 면역 기능을 비교한다. 흉선이 절제된 NSG 마우스를 사용하여, 표 11에 기재된 바와 같이 HLA-A2-Tg 및 HLA-A2/DQ8-Tg 태아 돼지 흉선과 HLA-DQ8+ CB CD34+ 세포를 사용하여 2가지 유형의 HIS 마우스를 생성한다. HLA-DQ8에 의해 선택되는 인간 T 세포의 최적의 항상성을 위해 말초에 HLA-DQ8+ APC의 존재가 필요하므로, HLA-DQ8+ CB CD34+ 세포를 사용하여 HIS 마우스를 생성한다. 흉선과 말초 APC가 공유하는 클래스 I 및 클래스 II HLA 대립유전자 둘 다를 가짐으로써 면역 기능을 최적화하기 위해 HLA-A2+DQ8+ CD34+ 세포를 사용한다.

이들 HIS 마우스의 생성 후, 마우스를 다음과 같이 모니터링한다:

CD4 및 CD8 T 세포, 미경험 및 메모리 CD4 및 CD8 T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 T 여포 헬퍼(Tfh) 세포를 포함한 T, B 및 골수성 세포 집단; 고전적 DC(cDC1 및 cDC2) 및 형질세포양 DC(pDC)를 포함한, B 세포 하위세트, 단핵구 및 DC의 재증식 속도 및 말초 혈액 농도를 결정함으로써 HIS 마우스의 2가지 유형에서 인간 면역 세포 재구성을 모니터링하고 비교한다. 4개 세포마다 ACK 완충액으로 용해된다. 말초 혈액의 유세포 분석을 수행하여 각각의 집단의 백분율 및 절대 수를 결정한다. 각각의 집단의 절대 수를 카운팅 비드를 사용하여 계산한다. HIS 마우스의 각각의 그룹에서 재구성을 달성한 마우스의 백분율을 또한 결정할 것이다. 면역 세포 집단을 연구하는 데 사용한 패널은 표 2에 나타나 있다.

이식하고 14 내지 16주 후에, HIS 마우스가 인간 세포에 의해 완전히 재구성될 것으로 예상될 때, 각각의 그룹에서 동물의 절반을 안락사시키고, 모든 그룹의 말초 혈액, 림프절, 비장 및 흉선 내의 크기, 구조, 세포질 및 세포 집단을 비교한다. 면역 세포 집단을 연구하기 위한 유세포분석 패널은 표 2에 나타낸 바와 동일하다. 비장, 림프절 및 흉선을 포함한 각각의 림프 조직의 작은 조각은 이들 조직의 구조를 비교하기 위한 조직학적 연구에 사용된다. 혈청 면역글로불린 수준(IgM 및 IgG)을 모든 HIS 마우스에서 ELISA에 의해 측정한다. 추가적으로, 각각의 그룹의 마우스 말초에서 인간 T 세포의 기능을 범-TCR 자극(항-CD3/CD28 비드), 동종항원 자극, 이종항원 자극 및 파상풍 톡소이드 신생항원 자극에 대한 반응으로 증식, 사이토카인 생성 및 세포독성의 시험관내 분석을 사용하여 비교한다. 증식을 CFSE 세포 염료 희석에 의해 결정한다. IL-2 및 IFN-γ를 포함한 사이토카인의 생성을 세포내 염색에 의해 분석한다. 동종항원 및 이종항원 자극의 경우, 동종이계 인간 PBMC 및 제3자 돼지 PBMC를 자극제로서 사용한다. HIS 마우스로부터 단리된 비장 T 세포를 CFSE로 표지하고, 방사선 조사된 자극제와 함께 1:1의 비율로 6일 동안 공동 배양한다. 인간 CD4 및 CD8 T 세포의 CFSE 희석을 유세포 분석에 의해 결정한다. 파상풍 톡소이드 신생항원 자극의 경우, HIS 마우스의 생성에 사용되는 CB CD34+ 세포를 사용하여 DC를 생성한다. CD34+ 세포를 수지상 세포로의 분화를 위해 줄기 세포 인자, GM-CSF 및 IL-4를 포함한 인간 사이토카인과 함께 13일 동안 배양한다. CD34-유래 DC를 파상풍 톡소이드 신생항원으로 펄스한 다음 TNF-α 및 PGE2에 의해 성숙시킨 후 CFSE-표지된 단리된 비장 T 세포와 함께 7일 동안 공동 배양한다. 증식된 T 세포를 유세포분석에 의해 결정할 것이다. 단핵구를 LPS로 자극하고 상청액에서 TNF-α, IL-6 및 IL-10의 생성을 ELISA에 의해 결정한다.

나머지 HIS 마우스를 최대 30주까지 모니터링하여 각각의 계통의 재구성 지속성을 관찰하고 이식편-대-숙주/자가면역 질환의 출현에 대해 관찰한다. 마우스에서 4주마다 채혈하여 인간 세포 생착을 결정한다. 이식 후 20주째로부터 시작하여, 실시예 8에 나타낸 채점 시스템을 사용하여 30주까지 주당 2회 이식편-대-숙주 질환에 대해 마우스를 채점한다. 이 시점에서 수행한 모든 분석은 14 내지 16주째에서의 분석과 동일할 것이다.

실시예 17 - HLA-A2/DQ8-Tg 대 HLA-A2-Tg 태아 돼지 흉선에서 발달하는 인간 T 세포의 HLA-DQ8에 대한 내성 비교

인간 Tg HLA-DQ8 분자에 대한 HLA-A2/DQ8-Tg 대 비-Tg 태아 돼지 흉선에서 발달하는 T 세포의 내성을 비교한다. CD34+ 세포 유래 APC에 의한 HLA-DQ8-반응성 T 세포의 음성 선택을 제거하기 위해 HLA-DQ8- CB CD34+ 세포를 사용하여 HIS 마우스를 생성한다. 이 과제를 위해 생성된 HIS 마우스의 그룹은 표 12에 나타나 있다. 이식하고 14 내지 16주 후에, 비장 및 성숙한 흉선 T 세포를 단리하고 HLA-DQ8에 대한 내성에 대해 시험관 내에서 테스트하며, 이는 공여체 돼지에서 유래된 DC를 사용하여 HLA-A2/DQ8-Tg 태아 돼지 흉선의 수용체에서만 관찰할 것으로 예상된다. DC는 태아 돼지 간 백혈구로부터 생성되며, 이는 태아 흉선 수확 시 수확되어 사용할 때까지 동결될 것이다. 태아 간 백혈구는 돼지 줄기 세포 인자, GM-CSF 및 IL-4에서 13일 동안 배양되어 DC로 분화된다. TEC 상의 HLADQ8의 존재는 이러한 특이성을 가지는 Treg의 양성 선택을 허용할 수 있으므로, 이러한 연구는 Treg 고갈을 포함한다.

실시예 18 - 대조군 대 HLA-A2/DQ8-Tg 태아 돼지 흉선으로 생성된 HIS 마우스에서 HLA-DQ8-제한 TCR의 선택 비교

비-Tg 대조군 대 HLA-A2/DQ8-Tg 태아 돼지 흉선으로 생성된 HIS 마우스에서 HLA-DQ8-제한 TCR(클론 5)의 선택을 비교한다. 치사량 이하의 방사선 조사를 받은 흉선이 절제된 NSG 마우스에 클론 5-형질도입 CB CD34+ 세포를 주입한 다음 비-Tg 대조군 또는 HLA-A2/DQ8-Tg 태아 돼지 흉선을 이식한다(표 13).

이식하고 14 내지 16주 후에, HIS 마우스가 인간 세포에 의해 완전히 재구성될 때, HIS 마우스를 분석을 위해 안락사시킨다. CD7+ 초기 흉선세포, CD69+ 및 CD69- 이중 양성, CD4 단일 양성 및 CD8 단일 양성 하위세트를 포함하여 이중 음성(CD1a+) 중에서 클론 5+ 흉선세포의 백분율 및 절대 수를 음성 선택 마커(PD1, CCR7)와 함께 결정한다. HLA-DQ8+ 흉선에서 이 TCR을 이용하여 흉선세포의 Treg 계통 분화를 검출하기 위해 Treg의 마커(CD25 및 CD127)를 또한 평가한다. 상세한 패널은 상기 표 5에 나타나 있다. Aurora Spectral 유세포분석으로 분석을 수행할 것이다. 이 TCR에 의해 인식되는 인슐린 펩타이드는 수질 TEC(mTEC)에 의해 생성될 것으로 예상되므로, 이 TCR의 음성 선택은 흉선 상피에 의한 HLA-DQ8의 발현에 따라 다를 것으로 예상된다. 비-Tg 돼지 흉선과 비교하여 HLA-A2/DQ8-Tg 태아 돼지 흉선에서 HLA 클래스 II-제한 TCR 클론 5의 향상된 양성 선택을 보일 것으로 예상된다. HLA-DQ8+ 인간 흉선의 예비 데이터는 TEC에서의 발현에 추가적으로, 이 TCR을 음성으로 선택하기 위해 HLA-DQ8이 CD34 세포-유래 APC에 필요함을 시사한다(도 9 참조). 따라서, HIS 마우스를 생성하기 위해 HLA-DQ8+ CB CD34+ 세포를 사용하는 것은 또한 클론 5+ T 세포의 음성 선택 연구를 가능하게 할 것이다. 형광색소-표지 클론 5 Vβ-특이적 mAb(Vβ21.3)는 Tg T 세포를 식별하는 데 사용되며 GFP는 형질도입된 HSPC로부터 기원 마커의 역할을 할 것이다. 흉선 발달의 각각의 단계에서 GFP+ 및 GFP- 흉선세포는 각각의 개별 마우스에서 Tg 및 비-Tg T 세포의 선택 수준에 대한 내부-제어 비교를 제공한다.

실시예 19 - HLA-A2/DQ8 Tg 태아 돼지 흉선으로 생성된 HIS 마우스에 의한 동종이계 피부 이식편의 거부반응 비교

HLA-A2/DQ8-Tg 흉선 및 CD34+ 세포로 생성된 HIS 마우스에서 면역계의 기능을 조사하기 위해, 동종이계 피부 이식편을 거부하는 HIS 마우스의 능력을 비교한다. 이를 위해, HLA-A2/DQ8-Tg 또는 비-Tg 대조군 태아 돼지 흉선 및 CB CD34+ 세포를 이식함으로써 HIS 마우스를 생성한다(표 10). 이식하고 14 내지 16주 후에, 동종이계 인간 공여체 유래의 분할 두께(2.3㎜) 피부 샘플을 흉곽 측벽에 이식한다. 피부 이식편을 제7일부터 제4주까지 매일 평가한 다음, 그 이후에는 3일마다 적어도 1회의 검사를 수행한다. 이식편의 10% 미만이 생존 가능한 상태로 남아 있을 때 이식편은 거부된 것으로 정의된다.

참조문헌

SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of Columbia University in the City of New York <120> Transgenic Swine, Methods of Making and Uses Thereof, and Methods of Making Human Immune System Mice <130> WO2021/081156 <140> PCT/US 20/056771 <141> 2020-10-22 <150> 62/924,228 <151> 2019-10-22 <150> 62/925,859 <151> 2019-10-25 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly 1 5

Claims

형질전환 돼지(transgenic swine)로서,
돼지 게놈의 하나 이상의 천연 SLA 유전자좌에 삽입된 하나 이상의 HLA I 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 HLA II 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 형질전환 돼지.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 천연 SLA I 유전자좌에 삽입된 HLA I 폴리펩타이드를 인코딩하는, 형질전환 돼지.
제2항에 있어서, 상기 SLA I 유전자좌는 SLA-1 및 SLA-2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 형질전환 돼지.
제2항에 있어서, 상기 HLA I 폴리펩타이드는 인간 베타-2 마이크로글로불린(B2M)에 융합된 HLA-A2를 포함하는, 형질전환 돼지.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 천연 SLA I 프로모터 뒤에 삽입되는, 형질전환 돼지.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 SLA I 유전자좌의 인트론 1/엑손 2 접합부에서 삽입되는, 형질전환 돼지.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 천연 SLA-DQα 유전자좌에 삽입되는 HLA II 폴리펩타이드를 추가로 인코딩하는, 형질전환 돼지.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 천연 SLA-DQα 유전자좌에 삽입되는 HLA II 폴리펩타이드를 인코딩하는, 형질전환 돼지.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 HLA II 폴리펩타이드는 HLA-DQ8 폴리펩타이드를 포함하는, 형질전환 돼지.
제10항에 있어서, 상기 HLA-DQ8 폴리펩타이드는 HLA-DQ8(HLA-DQA1:03:01:01 및 HLA-DQB1:03:02:01)을 인코딩하는 바이시스트론(bicistronic) 벡터를 통해 천연 SLA-DQα 유전자좌에 대해 표적화되는, 형질전환 돼지.
제10항에 있어서, 상기 바이시스트론 벡터는 고효율 IRES 요소를 추가로 포함하는, 형질전환 돼지.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HLA II 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 천연 SLA DQα 프로모터 뒤에 삽입되는, 형질전환 돼지.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HLA II 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 SLA DQα 유전자좌의 인트론 1/엑손 2 접합부에서 삽입되는, 형질전환 돼지.
제1항에 있어서, 상기 HLA I 폴리펩타이드는 HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 HLA II 폴리펩타이드는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DQ, 및 HLA-DR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 형질전환 돼지.
흉선 조직의 이종장기이식을 필요로 하는 대상체에 흉선 조직을 이종장기이식하는 방법으로서,
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 형질전환 돼지 유래의 흉선 조직을 상기 대상체에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
흉선의 기능 손상의 회복 또는 복원을 필요로 하는 대상체에서 흉선의 기능 손상을 회복시키거나 복원시키는 방법으로서,
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 형질전환 돼지 유래의 흉선 조직을 상기 대상체에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
T 세포의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 T 세포를 재구성하는 방법으로서,
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 형질전환 돼지 유래의 흉선 조직을 상기 대상체에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 돼지는 대상체에서 유래된 HLA 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 형질전환 돼지를 생성하는 방법으로서,
적어도 하나의 표적화 벡터 및 적어도 하나의 CRISPR-Cas9 플라스미드를 돼지 세포에 투여하는 단계를 포함하되, 표적화 벡터는 하나 이상의 HLA I 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 HLA II 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 특정 개별 대상체에서 유래된 하나 이상의 HLA I 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 HLA II 폴리펩타이드를 인코딩하는, 방법.
인간 면역계(HIS) 마우스를 생성하는 방법으로서,
상기 마우스의 흉선을 절제하는 단계 및 돼지 태아 흉선 조직 및 인간 CD34+ 세포를 상기 마우스에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포는 태아 또는 성체인, 방법
제22항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포는 제대혈에서 유래된, 방법.
인간 면역계(HIS) 마우스를 생성하는 방법으로서,
상기 마우스의 흉선을 절제하는 단계 및 돼지 태아 흉선 조직을 도입하는 단계를 포함하되, 상기 태아 흉선 조직은 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 형질전환 돼지에서 유래되는, 방법.