KR20230037044A - 인간 hla-a201 제한 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스 모델 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자, 인간 인터류킨 3 (IL3)을 코딩하는 핵산, 인간 과립구/대식세포-자극 인자 (GM-CSF)를 코딩하는 핵산, 인간 줄기 세포 인자 (SCF)를 코딩하는 핵산, 및 (i) MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인 및 (ii) 뮤린 H2-Db의 알파3 세포질 및 막관통 도메인을 코딩하는 HLA-A2/H2-D/B2M 트랜스진을 포함하는 면역결핍 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm 1Wjl/SzJ (NSG™) 마우스 모델을 제공한다.
Description
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2020년 7월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 63/049,187의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
마우스 모델은 인간 환자를 다루는 복잡성을 피하기 위해 인간 질환을 생체내 연구하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 뮤린 모델은 보통 부분적으로 마우스와 인간 면역계 사이의 중요한 차이로 인해 인간 질환을 불충분하게 재연한다 (Hagai et al., 2018; Kanazawa, 2007; Mestas & Hughes, 2004; Williams, Flavell, & Eisenbarth, 2010). 따라서, 인간 면역계를 갖는 마우스로서 정의된 인간화 마우스는 매력적인 대안일 수 있다 (Shultz, Brehm, Garcia-Martinez, & Greiner, 2012; Theocharides, Rongvaux, Fritsch, Flavell, & Manz, 2016; Victor Garcia, 2016; Zhang & Su, 2012). 이를 위해 NOD-SCID-Il2γc -/- (NSG), 또는 BALB/c-Rag2 -/--γc-/- (BRG)와 같은 공통 감마 쇄 (γc)가 결여된 면역결핍 마우스 (Matsumura et al., 2003; Traggiai et al., 2004)는 인간 CD34+ 조혈 전구 세포 (HPC)의 이식에 의해 인간화될 수 있다. T 세포의 공급원에 기반하여, 모델은 추가로 2개의 유형으로 분류될 수 있다: (1) 성숙 T 세포가 HPC의 공여자로부터 단리되고 입양성 전달되는 모델 (Aspord et al., 2007; Pedroza-Gonzalez et al., 2011; Wu et al., 2014; Wu et al., 2018; Yu et al., 2008); 이 경우에 T 세포는 인간 흉선에서 선택되었다; 및 (2) 내인성 T 세포가 인간 CD34+ HPC로부터 새로 생성되는 모델 (Matsumura et al., 2003; Traggiai et al., 2004); 이 경우에 인간 T 세포는 마우스 흉선에서 선택된다.
본 개시내용은 HLA-A201 제한 유전자를 발현하는 인간화 마우스 모델을 제공한다. 인간화 마우스 연구의 하나의 중요한 측면은 인간 MHC의 맥락에서의 인간 적응 면역의 성숙이다 (Billerbeck et al., 2013; Danner et al., 2011; Najima et al., 2016). 이 마우스 모델은, 부분적으로, 인간 HLA 상 항원 제시를 지원하고 조혈 전구 세포 (HPC) 공여자를 마우스와 매치하기 위해 생성되었다. 이 마우스 모델은, 그 중에서도, 상기 논의된 모델의 한계를 다룬다. 성숙 T 세포가 HPC의 공여자로부터 단리되고 입양성 전달되는 제1 모델의 가장 큰 한계는 이식편-대-숙주 질환이고; 내인성 T 세포가 인간 CD34+ HPC로부터 새로 생성되는 제2 모델의 가장 큰 한계는 인간 주요 조직적합성 복합체 (MHC)를 인식할 수 있는 T 세포의 제한된 수이다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 불활성화된 마우스 Prkdc 대립유전자, 불활성화된 마우스 IL2rg 대립유전자, 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자, 인간 인터류킨 3 (IL3)을 코딩하는 핵산, 인간 과립구/대식세포-자극 인자 (GM-CSF)를 코딩하는 핵산, 인간 줄기 세포 인자 (SCF)를 코딩하는 핵산, 및 MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인, 및 뮤린 H2-Db의 알파3 세포질 및 막관통 도메인 (HLA-A2/H2-D/B2M)을 코딩하는 핵산을 포함하는 비-비만성 당뇨병 (NOD) 마우스를 제공한다. 본 개시내용의 추가 측면은 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자; 인간 IL3을 코딩하는 핵산; 인간 GM-CSF를 코딩하는 핵산; 인간 SCF를 코딩하는 핵산; 및 HLA-A2/H2-D/B2M을 코딩하는 핵산을 포함하는 NSG™ 마우스를 제공한다. 이들 마우스 모델은 인간 HLA 상 항원 제시를 지원하고 조혈 전구 세포 (HPC) 공여자와 마우스의 매치를 허용한다.
또한 불활성화된 마우스 Prkdc 대립유전자, 불활성화된 마우스 IL2rg 대립유전자, 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자, 인간 IL3을 코딩하는 핵산, 인간 GM-CSF를 코딩하는 핵산, 인간 SCF를 코딩하는 핵산, 및 인간 HLA-A2/H2-D/B2M을 코딩하는 핵산을 포함하는 NOD 마우스를 생산하는 방법, 모델 시스템으로서 마우스를 사용하는 방법, 및 마우스를 번식시키는 방법이 본원에 제공된다.
추가로 인간 ILS를 코딩하는 핵산, 인간 GM-CSF를 코딩하는 핵산, 인간 SCF를 코딩하는 핵산, 및 인간 HLA-A2/H2-D/B2M을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 NSG™ 세포가 본원에 제공된다.
도 1a-1c는 NSG-SGM3F-A2 마우스에서의 인간 CD34+ HPC의 상이한 공급원으로부터의 인간 생착을 도시한다. 도 1a는 NSG-SGM3F-A2 마우스의 교배 계획을 도시하는 도식이다. 도 1b는 4주령 마우스의 혈액에서의 mCD45+ 세포 상 HLA-A2 발현을 도시한다. 도 1c는 인간 태아 간, 제대혈, 및 골수 HPC로의 이식-후 12주에서의 hNSG-SGM3F-A2에서의 hCD45+ 세포의 절대 수 및 인간 CD33+, CD19+, 및 CD3+ 세포의 백분율을 측정하는 그래프를 도시한다.
도 2a-2d는 인간 제대혈 또는 태아 간 HPC로 생착된 인간화 SGM3F-A2 마우스에서의 인간 생착의 비교를 도시한다. 도 2a는 1x105개의 제대혈 (CB) 또는 태아 간 (FL) HPC로의 이식-후 12주에서의 hSGM3F-A2 마우스에서의 백분율로의 혈액에서 측정된 인간 생착 및 hCD45+ 세포의 절대 수를 도시한다. n=5마리의 CB 공여자로부터의 91마리의 마우스, n=4마리의 FL 공여자로부터의 95마리의 마우스. 네스티드 t 검정. 도 2b는 hSGM3F-A2 마우스에서의 hCD33+, hCD19+, hCD3+ 세포의 절대 수를 도시한다. 도 2c는 hSGM3F-A2 마우스의 혈액에서의 인간 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 절대 수를 도시한다. 도 2d는 ELISA에 의해 이식-후 12-주에 hSGM3F-A2 마우스의 혈장에서 측정된 총 인간 IgM, IgG 및 IgA를 도시한다.
도 2a-2d는 인간 제대혈 또는 태아 간 HPC로 생착된 인간화 SGM3F-A2 마우스에서의 인간 생착의 비교를 도시한다. 도 2a는 1x105개의 제대혈 (CB) 또는 태아 간 (FL) HPC로의 이식-후 12주에서의 hSGM3F-A2 마우스에서의 백분율로의 혈액에서 측정된 인간 생착 및 hCD45+ 세포의 절대 수를 도시한다. n=5마리의 CB 공여자로부터의 91마리의 마우스, n=4마리의 FL 공여자로부터의 95마리의 마우스. 네스티드 t 검정. 도 2b는 hSGM3F-A2 마우스에서의 hCD33+, hCD19+, hCD3+ 세포의 절대 수를 도시한다. 도 2c는 hSGM3F-A2 마우스의 혈액에서의 인간 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 절대 수를 도시한다. 도 2d는 ELISA에 의해 이식-후 12-주에 hSGM3F-A2 마우스의 혈장에서 측정된 총 인간 IgM, IgG 및 IgA를 도시한다.
본 개시내용은 인간 HLA 상 항원 제시를 지원하고 조혈 전구 세포 (HPC) 공여자를 마우스와 매치하는 마우스 모델을 제공한다. 본원에 제공된 마우스 모델은, 일부 측면에서, NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG™) 배경을 갖고 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자, 인간 인터류킨 3 (IL3)을 코딩하는 핵산, 인간 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 코딩하는 핵산, 인간 줄기 세포 인자 (SCF)를 코딩하는 핵산, 및 MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인, 및 뮤린 H2-Db의 알파3, 세포질 및 막관통 도메인을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다 (본원에서 NSG-SGM3F-A2 마우스로 지칭됨). 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스 모델의 유전자형은 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Dvs/SzJ Flt3em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ이다 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Dvs/SzJ Flt3em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ 마우스를 생성하는 예시적인 방법에 대한 실시예 1 참조). 일부 실시양태에서, NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl-Flt3 em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ (SGM3F) 마우스는 HLA-A0201 트랜스제닉 마우스 (NSG-A2 (HHD))와 교배되고 모든 후손이 동형접합일 때까지 이종교배되어 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Dvs/SzJ Flt3em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ 마우스를 생성한다.
NSG™ 마우스는 성숙 T 세포, B 세포, 및 자연 살해 (NK) 세포가 결여된 면역결핍 마우스이고, 다수의 시토카인 신호전달 경로가 결핍되고, 선천적 면역에서 많은 결함을 갖는다 (예를 들어, 이들 각각이 본원에 참조로서 포함된 문헌 (Shultz, Ishikawa, & Greiner, 2007; Shultz et al., 2005; Shultz et al., 1995) 참조). 비-비만성 당뇨병 (NOD) 마우스 균주 NOD/ShiLtJ로부터 유래된 NSG™ 마우스 (예를 들어, 본원에 참조로서 포함된 문헌 (Makino et al., 1980) 참조)는 Prkdc scid 돌연변이 (또한 "중증 복합 면역결핍증" 돌연변이 또는 "scid" 돌연변이로 지칭됨) 및 Il2rg tm1Wjl 표적화된 돌연변이를 포함한다. Prkdc scid 돌연변이는 인간 PRKDC 유전자의 마우스 상동체에서의 기능-상실 돌연변이이다 - 이 돌연변이는 적응 면역을 본질적으로 제거한다 (예를 들어, 이들 각각이 본원에 참조로서 포함된 문헌 (Blunt et al., 1995; Greiner, Hesselton, & Shultz, 1998) 참조). Il2rg tm1Wjl 돌연변이는 인터류킨 2 수용체 감마 쇄 (IL2Rγ, 인간의 IL2RG와 상동성임)를 코딩하는 유전자에서의 널 돌연변이이며, 이는 NK 세포 분화를 차단하며, 이로써 1차 인간 세포의 효율적인 생착을 방지하는 장애를 제거한다 ((Cao et al., 1995; Greiner et al., 1998; Shultz et al., 2005), 이들 각각은 본원에 참조로서 포함됨). 기능-상실 돌연변이는, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 기능이 거의 또는 전혀 없는 유전자 산물을 초래한다. 그에 비해, 널 돌연변이는 기능이 없는 유전자 산물을 초래한다. 불활성화된 대립유전자는 기능-상실 대립유전자 또는 널 대립유전자일 수 있다.
불활성화된 대립유전자는 검출가능한 수준의 기능적 유전자 산물 (예를 들어, 기능적 단백질)을 생산하지 않는 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, 불활성화된 대립유전자는 전사되지 않는다. 일부 실시양태에서, 불활성화된 대립유전자는 기능적 단백질을 코딩하지 않는다. 따라서, 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자를 포함하는 마우스는 검출가능한 수준의 기능적 FLT3을 생산하지 않는다. 일부 실시양태에서, 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자를 포함하는 마우스는 어떠한 기능적 FLT3도 생산하지 않는다.
Flt3은 수지상 세포 및 단핵구성 계통의 발생에 중요한 수용체이다. Flt3L-Flt3 신호전달은 다양한 DC 및 단핵구성 계통의 발생에 중요하고 (Ding et al., 2014; Ginhoux et al., 2009; McKenna et al., 2000; Waskow et al., 2008) 그의 역할은 추가로 마우스 및 인간에서의 생체내 Flt3L의 투여 후 순환 전통적인 (c)DC 및 형질세포성 (p)DC의 증가에 의해 지원된다 (Karsunky, Merad, Cozzio, Weissman, & Manz, 2003; Maraskovsky et al., 1996; Pulendran et al., 2000). 마우스 Flt3을 녹-아웃시키는 것은 (1) 뮤린 DC 및 다른 골수성 세포에서의 감소; 및 (2) 인간 세포에 대한 마우스 Flt3L (인간 수용체를 통해 작용할 수 있음)의 이용가능성에서의 증가를 야기할 수 있으며, 이로써 인간 CD34+ HPC로의 이식 시 인간 골수성 세포의 장기간 발생을 개선시킨다.
본원에 제공된 NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 마우스 Flt3 대립유전자를 불활성화시키는 게놈 변형을 포함한다. 핵산과 관련하여 변형은 상응하는 야생형 핵산 (예를 들어, 천연-발생 핵산)에 대한 핵산의 임의의 조작이다. 게놈 변형은 따라서 게놈에서의 상응하는 야생형 핵산 (예를 들어, 천연-발생 핵산)에 대한 게놈에서의 핵산의 임의의 조작이다. 핵산 (예를 들어, 게놈) 변형의 비-제한적인 예는 결실, 삽입, "indel" (결실 및 삽입), 및 치환 (예를 들어, 점 돌연변이)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자에서의 결실, 삽입, indel, 또는 다른 변형은 유전자가 더 이상 기능적 산물 (예를 들어 단백질)을 코딩하지 않도록 프레임이동 돌연변이를 초래한다. 변형은 또한 화학적 변형, 예를 들어, 적어도 1개의 핵염기의 화학적 변형을 포함한다. 핵산 변형의 방법, 예를 들어, 유전자 불활성화를 초래하는 것은 공지되어 있고, 제한 없이, RNA 간섭, 화학적 변형, 및 유전자 편집 (예를 들어, 재조합효소 또는 다른 프로그래밍가능한 뉴클레아제 시스템, 예를 들어, CRISPR/Cas, TALEN, 및/또는 ZFN을 사용함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 유전자 편집이 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 마우스 Flt3 대립유전자를 불활성화시키는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 게놈 변형 (예를 들어, 결실 또는 indel)은 코딩 영역, 비-코딩 영역, 및 조절 영역으로부터 선택된 마우스 Flt3 대립유전자의 (적어도 1개의) 영역 내에 있다. 일부 실시양태에서, 게놈 변형 (예를 들어, 결실 또는 indel)은 마우스 Flt3 대립유전자의 코딩 영역이다. 예를 들어, 게놈 변형 (예를 들어, 결실 또는 indel)은 엑손 3 내에 있을 수 있거나, 또는 그는 마우스 Flt3 대립유전자의 엑손 3에 걸칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈 변형은 게놈 결실이다. 예를 들어, 마우스 Flt3 대립유전자는 엑손 3에서의 뉴클레오티드 서열의 게놈 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 뉴클레오티드 서열은 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자로부터 결실되었다. 일부 실시양태에서, 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 검출가능한 수준의 마우스 FLT3을 발현하지 않는다. 검출가능한 수준의 마우스 FLT3은 표준 단백질 검출 검정, 예컨대 유동 세포계측 및/또는 ELISA를 사용하여 검출되는 임의의 수준의 FLT3 단백질이다. 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 검출가능하지 않은 수준 또는 낮은 수준의 마우스 FLT3을 발현한다. 예를 들어, 마우스 모델은 1,000 pg/ml 미만의 마우스 FLT3을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델은 500 pg/ml 미만의 마우스 FLT3 또는 100 pg/ml 미만의 마우스 FLT3을 발현한다. 마우스 FLT3 수용체는 또한 분화 클러스터 항원 CD135로 지칭된다. 따라서, 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 CD135+ 다분화능 전구 세포를 포함하지 않는다 (그의 부재가 있음).
Flt3 녹아웃 마우스는, 일부 실시양태에서, Cas9 mRNA 및 가이드 RNA (gRNA)를 사용하는 CRISPR에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, gRNA (예를 들어, 5'-AAGTGCAGCTCGCCACCCCA-3', 서열식별번호: 2)는 마우스 Flt3 NSG™ 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl-Flt3 em1Akp; RRID:IMSR JAX:005557)의 엑손 3을 표적화한다. 주사된 배아로부터 유래된 배반포가, 일부 실시양태에서, 양모로 이식되고 신생아 새끼가 수득된다. 일부 실시양태에서, 널 결실을 보유하는 마우스는 NSG™와 역교배된다. F0 및 F1 한배새끼는 예를 들어 PCR 및 생어(Sanger) 시퀀싱에 의해 성공적인 유전자-녹아웃에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 프라이머 (5'- GGTACCAGCAGAGTTGGATAGC -3', 서열식별번호: 3) 및 (5'- ATCCCTTACACAGAAGCTGGAG -3', 서열식별번호: 4)가 PCR 반응에서 돌연변이체 대립유전자로부터 마우스 Flt3 야생형 대립유전자를 검출하는 데 사용될 수 있다 (표 1). WT 대립유전자는 DNA 단편 799 bp 길이를 생성하는 반면에, 돌연변이된 대립유전자는 363 bp 길이의 DNA 단편을 생성한다.
트랜스제닉 마우스 모델
트랜스제닉 마우스 모델 (Tg 마우스)은, 예를 들어, 유전자 서열을 트랜스진으로 치환하거나, 또는 로커스 내에서 발견되지 않는 유전자 서열을 부가함으로써 유전자 서열을 변형시키기 위해 생성될 수 있다. 본원에 제공된 NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 트랜스제닉 대립유전자를 포함한다. 이들은 마우스 게놈으로 도입된 외인성 핵산을 포함한다.
본원에 제공된 바와 같이 사용된 핵산은 DNA, RNA, 또는 DNA 및 RNA의 키메라일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, DNA)은 특정 관심 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 유전자는 뉴클레오티드의 별개의 서열이며, 그의 순서는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에서의 단량체의 순서를 결정한다. 유전자는 전형적으로 단백질을 코딩한다. 유전자는 내인성 (숙주 유기체에서 천연 발생함) 또는 외인성 (천연적으로 또는 유전자 조작을 통해, 숙주 유기체로 전달됨)일 수 있다. 대립유전자는 돌연변이에 의해 발생하고 염색체 상 동일한 로커스에서 발견되는 유전자의 2개 이상의 대안적인 형태 중 하나이다. 유전자는, 일부 실시양태에서, 프로모터 서열, 코딩 영역 (예를 들어, 엑손), 비-코딩 영역 (예를 들어, 인트론), 및 조절 영역 (또한 조절 서열로 지칭됨)을 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 프로모터 서열은 유전자의 전사가 시작하는 DNA 서열이다. 프로모터 서열은 전형적으로 전사 개시 부위 (의 5' 단부에서)의 바로 상류에 위치된다. 엑손은 아미노산을 코딩하는 유전자의 영역이다. 인트론 (및 다른 비-코딩 DNA)은 아미노산을 코딩하지 않는 유전자의 영역이다.
인간 유전자를 포함하는 마우스는 인간 트랜스진을 포함하는 것으로 간주된다. 트랜스진은 숙주 유기체에 대해 외인성인 유전자이다. 즉, 트랜스진은, 천연적으로 또는 유전자 조작를 통해, 숙주 유기체로 전달된 유전자이다. 트랜스진은 숙주 유기체 (트랜스진을 포함하는 유기체, 예를 들어, 마우스)에서 천연 발생하지 않는다.
트랜스제닉 마우스 모델을 생산하는 방법은 본원에서 다른 곳에 기재된다.
본원에 기재된 NSG-SGM3F-A2 마우스는 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자, IL3을 코딩하는 핵산, GM-CSF를 코딩하는 핵산, SCF를 코딩하는 핵산, 및 MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인, 및 뮤린 H2-Db의 알파3, 세포질 및 막관통 도메인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NSG-SGM3F-A2 마우스는 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자, 인간 IL3을 코딩하는 핵산, 인간 GM-CSF를 코딩하는 핵산, 인간 SCF를 코딩하는 핵산, 및 MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인, 및 뮤린 H2-Db의 알파3, 세포질 및 막관통 도메인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스는 인간 IL3 트랜스진, 인간 GM-CSF 트랜스진, 인간 SCF 트랜스진, 및 인간 HLA-A2/H2-D/B2M 트랜스진 (MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인, 및 뮤린 H2-Db의 알파3, 세포질 및 막관통 도메인을 코딩하는 트랜스진)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진, 예컨대 인간 IL3 트랜스진, 인간 GM-CSF 트랜스진, 인간 SCF 트랜스진, 및/또는 인간 HLA-A2/H2-D/B2M 트랜스진은 마우스 게놈 내로 통합된다. 인간 IL3, CSF2, 및 KITLG 트랜스진은 본원에 참조로서 포함된 문헌 (Nicolini, Cashman, Hogge, Humphries, & Eaves, 2004)에 기재되어 있다. 인간 HLA-A2/H2-D/B2M 트랜스진은 본원에 참조로서 포함된 문헌 (Pascolo et al., 1997; Takaki et al., 2006)에 기재되어 있다.
NSG-SGM3F-A2 마우스는, 일부 실시양태에서, NSG-HLA-A2/HHD 마우스 (RRID:IMSR JAX: 014570)를 SGM3F 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl-Flt3 em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ)와 교배시킴으로써 생성된다. NSG-SGM3 마우스는 각각 인간 인터류킨-3 (IL3) 유전자, 인간 과립구/대식세포-자극 인자 (GM-CSF) 유전자, 또는 인간 줄기 세포 인자 (SCF) 유전자 중 하나를 보유하도록 설계된 3개의 별개의 트랜스진을 보유한다. 각각의 유전자의 발현은 인간 시토메갈로바이러스 프로모터/인핸서 서열에 의해 구동되고 인간 성장 호르몬 카세트 및 폴리아데닐화 (폴리A) 서열이 이어진다. 트랜스진은 수정된 C57BL/6xC3H/HeN 난모세포 내로 미세주사되었다. 3개의 트랜스진 (3GS) 모두를 보유하는 생성된 창시자는, 일부 실시양태에서, BALB/c-scid/scid 마우스와 여러 세대 동안 역교배되고 후속적으로 NOD.CB17-Prkdcscid 마우스와 다수 (예를 들어, 적어도 11) 세대 동안 역교배된다 (Nicolini et al., 2004; Wunderlich et al., 2010). 이들 마우스는 이어서 NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl; RRID:IMSR JAX: 005557)와 교배되고, 예를 들어, 이어서 모든 후손이 3GS 및 IL2rg 표적화된 돌연변이에 대해 동형접합일 때까지 이종교배될 수 있다. 트랜스제닉 마우스는 NSG 마우스와 적어도 1세대 동안 교배되어 NSG-SGM3 마우스를 확립할 수 있다. NSGF 마우스는, 예를 들어, CRISPR/cas 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. Cas9 mRNA 및 마우스 Flt3을 표적화하는 sgRNA는, 일부 실시양태에서, 수정된 NSG 난모세포 내로 공동주사된다. Flt3 결실을 보유하는 생성된 창시자는 NSG 마우스와 교배되고, 이어서 모든 후손이 Flt3 표적화된 돌연변이에 대해 동형접합일 때까지 이종교배될 수 있다. NSG-SGM3 마우스는 NSGF 마우스와 다수 (예를 들어, 2) 세대 동안 교배되어 NSG-SGM3F 마우스를 확립할 수 있다. H-2Db-/- B2m-/- 마우스에서의 HLA-A2/HHD 트랜스제닉 발현은 CD8+ T 세포를 회복시키고 HLA-A2.1-제한된 세포독성 T 세포 반응을 가능하게 한다 (Pascolo et al., 1997). NSG-HLA-A2/HHD 마우스는 이어서 NSG-SGM3F 마우스와 다수 (예를 들어, 적어도 4) 세대 동안 교배되어 NSG-SGM3F-A2 마우스를 확립할 수 있다.
인간 면역계 모델
본 개시내용의 NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은, 일부 실시양태에서, 인간 CD34+ 조혈 전구 세포 (HPC) 및 인간 선천적 면역계의 발생을 지원하는 데 사용된다. 인간 면역계는 선천적 면역계 및 적응 면역계를 포함한다. 선천적 면역계는 감염 부위로의 면역 세포의 모집, 보체 캐스케이드의 활성화, 백혈구에 의한 신체로부터의 외래 물질의 확인 및 제거, 적응 면역계의 활성화, 및 감염체에 대한 물리적 및 화학적 장벽으로서의 작용을 담당한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 상주 마우스 HPC를 살해하기 위해 준치사적으로 조사되고 (예를 들어, 100 - 300 cGy), 이어서 조사된 마우스는 인간 선천적 면역계의 발생을 개시하기 위해 인간 CD34+ HPC (예를 들어, 50,000 내지 200,000개의 HPC)로 생착된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 마우스는 인간 CD34+ HPC를 추가로 포함한다. 인간 CD34+ HPC는 인간 태아 간, 제대혈, 동원된 말초 혈액, 및 골수를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 공급원으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 CD34+ HPC는 인간 제대혈로부터의 것이다.
다른 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 수지상 세포)로의 인간 CD34+ HPC의 분화는 연속적인 발생 단계가 다수의 시토카인에 의해 조절되는 복잡한 과정이다. 이 과정은 세포 표면 항원, 예컨대 분화 클러스터 (CD) 항원을 통해 모니터링될 수 있다. 예를 들어, CD45는 HPC, 대식세포, 단핵구, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 및 수지상 세포의 표면 상에 발현되며, 따라서 생착을 나타내는 마커로서 사용될 수 있다. T 세포 상에서, CD45는 T 세포 수용체 신호전달, 세포 성장, 및 세포 분화를 조절한다. 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 인간 CD45+ 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 또한 폐, 흉선, 비장, 림프절, 및/또는 소장의 조직으로의 인간 CD45+ 세포의 생착을 나타내나, 이에 제한되지는 않는다.
CD45+ 세포 성숙으로서, 이들은 다양한 발생 단계 및 분화하는 세포 유형을 나타내는 추가적인 바이오마커를 발현하기 시작한다. 발생하는 T 세포는, 예를 들어, 또한 CD3, CD4, 및 CD8을 발현한다. 또 다른 예로서, 발생하는 골수성 세포는 CD33+를 발현한다. 본원에서 마우스 모델은, 일부 실시양태에서, 인간 CD45+ 세포 뿐만 아니라 이중 양성 인간 CD45+/CD3+ T 세포 뿐만 아니라 이중 양성 인간 CD45+/CD33+ 골수성 세포도 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스 모델에서의 인간 CD45+ 세포의 집단은 인간 CD45+/CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 CD45+ 세포의 집단은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 증가된 백분율의 인간 CD45+/CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD3+ T 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 25%만큼 증가된다. 예를 들어, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD3+ T 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD3+ T 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 50%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD3+ T 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 100%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD3+ T 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 25%-100%, 25%-75%, 25%-50%, 50%-100%, 50%-75%, 또는 75%-100%만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스 모델에서의 인간 CD45+ 세포의 집단은 인간 CD45+/CD33+ 골수성 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 CD45+ 세포의 집단은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 증가된 백분율의 인간 CD45+/CD33+ 골수성 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD33+ T 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 25%만큼 증가된다. 예를 들어, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD33+ 골수성 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD33+ 골수성 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 50%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD33+ 골수성 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 100%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD33+ 골수성 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 25%-100%, 25%-75%, 25%-50%, 50%-100%, 50%-75%, 또는 75%-100%만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스 모델에서의 인간 CD45+ 세포의 집단은 인간 CD45+/CD19+ B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 CD45+ 세포의 집단은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 증가된 백분율의 인간 CD45+/CD19+ B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD19+ B 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 25%만큼 증가된다. 예를 들어, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD19+ B 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD19+ B 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 50%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD19+ B 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 적어도 100%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델에서의 인간 CD45+/CD19+ B 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스에 비해, 25%-100%, 25%-75%, 25%-50%, 50%-100%, 50%-75%, 또는 75%-100%만큼 증가된다.
본원에 제공된 NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은, 놀랍게도, 또한 수지상 세포 (예를 들어, 형질세포성 수지상 세포 및 골수성 수지상 세포), 자연 살해 세포, 및 단핵구-유래된 대식세포 (단핵구 대식세포)의 생착을 지원할 수 있다. 형질세포성 수지상 세포 (pDC)는 높은 수준의 인터페론 알파를 분비하고; 골수성 수지상 세포 (mDC)는 인터류킨 12, 인터류킨 6, 종양 괴사 인자, 및 케모카인을 분비하고; 자연 살해 세포는 손상된 숙주 세포, 예컨대 종양 세포 및 바이러스-감염된 세포를 파괴하고; 대식세포는 상당한 수의 박테리아 또는 다른 세포 또는 미생물을 소모한다.
일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 NSG™ 대조군 마우스 및/또는 NSGF 대조군 마우스에 비해, 증가된 백분율의 인간 CD11c+ 골수성 수지상 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스에서의 인간 CD11c+ HLA-DR+ 골수성 수지상 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스 및/또는 NSGF 대조군 마우스에 비해, 적어도 25%만큼 증가된다. 예를 들어, NSG-SGM3F-A2 마우스에서의 인간 CD11C+ HLA-DR+ 골수성 수지상 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스 및/또는 NSGF 대조군 마우스에 비해, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스에서의 인간 CD11c+ HLA-DR+ 골수성 수지상 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스 및/또는 NSGF 대조군 마우스에 비해, 적어도 50%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스에서의 인간 CD11c+ HLA-DR+ 골수성 수지상 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스 및/또는 NSGF 대조군 마우스에 비해, 적어도 100%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, NSG-SGM3F-A2 마우스에서의 인간 CD11c+ HLA-DR+ 골수성 수지상 세포의 백분율은 NSG™ 대조군 마우스 및/또는 NSGF 대조군 마우스에 비해, 25%-100%, 25%-75%, 25%-50%, 50%-100%, 50%-75%, 또는 75%-100%만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 HLA-A2 매치된 조혈 계통의 생착을 지원하는 데 사용된다.
트랜스제닉 동물을 생산하는 방법
일부 측면에서, 인간 트랜스진을 발현하는 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 트랜스제닉 동물은, 본원에서, 그의 게놈 내로 삽입된 (내로 통합된) 외래 (외인성) 핵산 (예를 들어, 트랜스진)을 갖는 동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 동물은 트랜스제닉 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트이다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 동물은 마우스이다. 트랜스제닉 동물의 생산에 사용된 3개의 전통적인 방법은 DNA 미세주사 ((Gordon & Ruddle, 1981), 본원에 참조로서 포함됨), 배아 줄기 세포-매개된 유전자 전달 ((Gossler, Doetschman, Korn, Serfling, & Kemler, 1986), 본원에 참조로서 포함됨) 및 레트로바이러스-매개된 유전자 전달 ((Jaenisch, 1976), 본원에 참조로서 포함됨)을 포함하며, 이들 중 임의의 것이 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있다. 전기천공이 또한 트랜스제닉 마우스를 생산하는 데 사용될 수 있다 (예를 들어, 이들 각각이 본원에 참조로서 포함된 WO 2016/054032 및 WO 2017/124086 참조).
핵산은, 일부 실시양태에서, 트랜스진, 예를 들어, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 (예를 들어, 구성적으로 활성인 프로모터)를 포함하는 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 데 사용된 핵산은 벡터, 예컨대 플라스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 효모 인공 염색체 (YAC) 상에 존재하며, 이는, 예를 들어, 핵산이 동물 게놈 내로 무작위로 통합하는 수정된 배아의 전핵/핵으로 전달된다. 일부 실시양태에서, 수정된 배아는 단일-세포 배아 (예를 들어, 접합자)이다. 일부 실시양태에서, 수정된 배아는 다중-세포 배아 (예를 들어, 접합자 후 발생 단계, 예컨대 배반포)이다. 일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, BAC 상에 보유됨)은 본 개시내용의 마우스 모델을 생산하기 위해 마우스의 수정된 배아로 전달된다. 수정된 배아의 주사 후, 수정된 배아는 가임신 암컷으로 전달될 수 있으며, 이는 후속적으로 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 후손을 출산한다. 핵산의 존재 또는 부재는, 예를 들어, 임의의 수의 유전자형 결정 방법 (예를 들어, 시퀀싱 및/또는 게놈 PCR)을 사용하여 확인될 수 있다.
또한 내인성 Flt3 대립유전자를 불활성화시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 내인성 Flt3 대립유전자는 트랜스제닉 동물에서 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 유전자/게놈 편집 방법은 유전자 (대립유전자) 불활성화에 사용된다. 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 조작된 뉴클레아제-기반 유전자 편집 시스템은, 예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 시스템, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 및 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 포함한다. 예를 들어, 이들 각각이 본원에 참조로서 포함된 문헌 (Carroll, 2011; Gaj, Gersbach, & Barbas, 2013; Joung & Sander, 2013)을 참조한다.
일부 실시양태에서, CRISPR 시스템이 본원에 제공된 NSG-SGM3F-A2 마우스 모델의 내인성 Flt3 대립유전자를 불활성화시키는 데 사용된다. 예를 들어, 문헌 (Harms et al., 2014; Inui et al., 2014) (이들 각각은 본원에 참조로서 포함됨)을 참조한다. 예를 들어, Cas9 mRNA 또는 단백질 및 1개 또는 다수의 가이드 RNA (gRNA)는 Flt3 유전자로의 정확한 게놈 편집을 생성하기 위해 마우스 배아 내로 직접적으로 주사될 수 있다. 이들 배아로부터 발생하는 마우스는 이들이 목적하는 돌연변이(들)를 보유하는지 여부를 결정하기 위해 유전자형 결정되거나 또는 시퀀싱될 수 있고, 생식세포계열 전달을 확인하기 위해 교배될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 유전자 편집을 위한 RNA-가이드된-DNA-표적화 플랫폼으로서 용도 변경된 원핵생물의 천연 발생 방어 메커니즘이다. 조작된 CRISPR 시스템은 2개의 주요 성분을 함유한다: 가이드 RNA (gRNA) 및 CRISPR-연관된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas 단백질). gRNA는 뉴클레아제-결합을 위한 스캐폴드 서열 및 변형될 게놈 표적을 정의하는 사용자-정의된 뉴클레오티드 스페이서 (예를 들어, ~15-25개의 뉴클레오티드, 또는 ~20개의 뉴클레오티드)로 구성된 짧은 합성 RNA이다. 따라서, 그는 단순히 gRNA에 존재하는 표적 서열을 변화시킴으로써 Cas 단백질의 게놈 표적을 변화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR-연관된 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cpf1, C2c1, 및 C2c3으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9이다.
가이드 RNA는 적어도 표적 핵산 서열에 혼성화하는 (그에 결합하는) 스페이서 서열 및 엔도뉴클레아제에 결합하고 엔도뉴클레아제를 표적 핵산 서열로 가이드하는 CRISPR 반복 서열을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 각각의 gRNA는 그의 게놈 표적 서열 (예를 들어, Flt3 대립유전자의 영역)과 상보성인 스페이서 서열을 포함하도록 설계된다. 예를 들어, 이들 각각이 본원에 참조로서 포함된 문헌 (Deltcheva et al., 2011; Jinek et al., 2012)을 참조한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용된 gRNA는 마우스 Flt3 대립유전자의 영역 (예를 들어, 엑손 3)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Flt3 대립유전자의 영역에 결합하는 gRNA는 5'-AAGTGCAGCTCGCCACCCCA-3'(서열식별번호: 2)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
사용 방법
본원에 제공된 NSG-SGM3F-A2 마우스 모델은 임의의 수의 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 마우스 모델은 특정 작용제 (예를 들어, 치료제) 또는 의료 절차 (예를 들어, 조직 이식)가 인간 선천적 면역계 (예를 들어, 인간 선천적 면역 세포 반응) 및 인간 적응 면역계 (예를 들어, 항체 반응)에 영향을 미치는 방법을 시험하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 마우스 모델은 인간 선천적 면역계 발생에 대한 작용제의 효과를 평가하는 데 사용된다. 따라서, 마우스 모델에게 작용제를 투여하는 것, 및 마우스에서 인간 선천적 면역계 발생에 대한 작용제의 효과를 평가하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 작용제의 효과는, 예를 들어, 인간 선천적 면역 세포 (예를 들어, T 세포 및/또는 수지상 세포) 반응 (예를 들어, 세포 사멸, 세포 신호전달, 세포 증식 등) 및 인간 적응 면역 반응 (예를 들어, 항체 생산)을 측정함으로써 평가될 수 있다. 작용제의 비-제한적인 예는 치료제, 예컨대 항암제 및 항염증제, 및 예방제, 예컨대 면역원성 조성물 (예를 들어, 백신)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 마우스 모델은 인간 종양에 대한 면역요법 반응을 평가하는 데 사용된다. 따라서, 인간 종양을 갖는 마우스 모델에게 작용제를 투여하는 것, 및 마우스에서 인간 선천적 면역계 및/또는 종양에 대한 작용제의 효과를 평가하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 작용제의 효과는 인간 선천적 면역 세포 (예를 들어, T 세포 및/또는 수지상 세포) 반응, 인간 적응 면역 반응 (예를 들어, 항체 생산) 및/또는 종양 세포 반응 (예를 들어, 세포 사멸, 세포 신호전달, 세포 증식 등)을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 항암제이다.
또 다른 실시양태에서, 마우스 모델은 감염성 미생물에 대한 인간 선천적 면역 반응을 평가하는 데 사용된다. 따라서, 마우스 모델을 감염성 미생물 (예를 들어, 박테리아 및/또는 바이러스)에 노출시키는 것, 및 인간 선천적 면역 반응에 대한 감염성 미생물의 효과를 평가하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 감염성 미생물의 효과는 인간 선천적 면역 세포 (예를 들어, T 세포 및/또는 수지상 세포) 반응 (예를 들어, 세포 사멸, 세포 신호전달, 세포 증식 등)을 측정함으로써 평가될 수 있다. 이들 방법은 마우스에게 약물 또는 항미생물제 (예를 들어, 항박테리아제 또는 항바이러스제)를 투여하는 것, 및 감염성 미생물에 대한 약물 또는 항미생물제의 효과를 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 마우스 모델은 조직 이식에 대한 인간 면역 반응을 평가하는 데 사용된다. 따라서, 조직 (예를 들어, 동종이계 조직)을 마우스 모델로 이식하는 것 및 인간 선천적 면역 반응에 대한 이식된 조직의 효과를 평가하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 이식된 조직의 효과는 이식된 조직에 대한 인간 선천적 면역 세포 (예를 들어, T 세포 및/또는 수지상 세포) 반응 (예를 들어, 세포 사멸, 세포 신호전달, 세포 증식 등) 및 인간 적응 면역 반응 (예를 들어, 항체 생산)을 측정함으로써 평가될 수 있다.
실시예
실시예 1. NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Dvs/SzJ Flt3em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ (NSG-SGM3F-A2) 마우스 모델
인간화 마우스 연구의 하나의 중요한 측면은 인간 MHC의 맥락에서의 인간 적응 면역의 성숙이다 (Billerbeck et al., 2013; Danner et al., 2011; Najima et al., 2016). 인간 HLA 상 항원 제시를 지원하고 HPC 공여자를 마우스와 매치하기 위해, 본 발명자들은 SGM3F (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl-Flt3 em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ) 마우스를 HLA-A0201 트랜스제닉 마우스 (NSG-A2 (HHD))와 교배시키고 모든 후손이 동형접합일 때까지 이종교배시켜 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Dvs/SzJ Flt3em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ (NSG-SGM3F-A2)를 생성하였다 (도 1a). SGM3F 마우스는 인간 줄기 세포 인자 (SCF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 인터류킨 (IL)-3의 트랜스제닉 발현을 갖는 NSG 마우스 (NSG-SGM3, SGM3) (Nicolini et al., 2004; Wunderlich et al., 2010) 및 Flt3 돌연변이체 마우스를 갖는 NSG 마우스 (NSGF)의 특색을 결합하였다. 인간 HLA-A0201의 발현을 확인하기 위해, 본 발명자들은 마우스 골수 세포에서의 HLA-A2의 표면 발현을 측정하고 확인하였다 (도 1b). 인간 면역계의 생착을 지원하는 이들의 능력을 시험하기 위해, NSG-SGM3F-A2 마우스는 준치사적으로 조사되고 인간 태아 간, 제대혈 또는 성체 골수로부터의 1x105개의 HLA-A2+ CD34+ HPC로 이식되었다. 태아 간 및 제대혈 HPC 둘 다를 받은 마우스는 혈액에서 비교할 만한 면역 세포 조성을 나타냈지만 보다 적은 CD3+ T 세포가 골수 HPC를 갖는 마우스에서 발견되었다 (도 1c). 더욱이, FL, CB, 또는 BM HPC로의 이식-후 6개월에, 본 발명자들은 CD11c+ DC 및 CD3+ T 세포를 포함하는, 선천적 및 적응 면역 반응 둘 다에 중요한 상이한 인간 면역 세포를 갖는 폐에서 높은 양의 hCD45+ 면역 세포를 관측하였다 (데이터는 제시되지 않음). 중요하게는, HLA-A2+ CB HPC로의 이식-후 6개월에, 흉선에서의 HLA-A2 발현은 HLA-A2에 특이적인 BB7.2 항체를 사용하여 HLA-A2+ HPC로 재구성된 hNSG-SGM3F-A2 마우스의 마우스 흉선 상피 세포 상에서 검출되었으며 (데이터는 제시되지 않음), 이는 인간 HLA-A2의 맥락에서 T 세포의 성숙을 허용한다.
실시예 2. 인간 제대혈 또는 태아 간 HPC로 생착된 인간화 SGM3F-A2 마우스에서의 인간 생착의 비교
인간 태아 조직의 제한된 이용가능성으로 인해, 인간화 마우스를 구축하기 위한 제대혈 유래된 HPC의 사용이 검증되었다. 4-5개의 상이한 제대혈 또는 태아 간 공여자로 생착된 마우스의 코호트로부터의 상이한 세포 유형에 대해 나란히 비교를 수행하였다. 데이터는 태아 간 HPC로 생착된 인간화 마우스가 hCD19+ B 세포 및 hCD3+ T 세포의 확장으로 인해 이식-후 12-주에 단지 약간 더 높은 hCD45+ 생착을 나타냈다는 것을 제시한다 (도 2a-2b). 태아 간 HPC로 생착된 마우스에서, hCD4+ T 세포에서의 약간의 증가가 관측되었으나, hCD8+ T 세포의 총 수에서 차이가 발견되지 않았다 (도 2c). 적응 체액성 반응을 시작하는 데 있어서 태아 간 또는 제대혈-유래된 인간 HPC의 기능적 능력을 비교하기 위해, 인간 항체를 생산하는 인간화 NSG-SGM3F-A2 마우스의 능력이 평가되었다. 이를 위해, 이식-후 12-주에서의 혈장에서의 총 인간 Ig가 ELISA에 의해 측정되었다. 도 2d에 제시된 바와 같이, 마우스의 두 그룹은 혈장에서 비교할 만한 양의 인간 IgM을 분비하였고 총 인간 IgG 및 IgA 하위부류의 수준은 또한 유사하였다. 따라서, 항체 분비 및 Ig 부류 전환의 능력은 인간화 NSG-SGM3F-A2 마우스의 HPC의 상이한 공급원 사이에서 비교할 만하였다. 종합적으로, HPC의 공급원 사이의 가변성보다 HPC의 동일한 공급원으로부터의 상이한 공여자 중에서 생성된 마우스에서 더 높은 수준의 가변성이 관측되었다. 이 분석은 제대혈 HPC가 NSG-SGM3F-A2 마우스에서의 태아 간 HPC에 대해 비교할 만한 인간 생착을 제공하였다는 것을 제시하였다.
마우스 모델 SGM3F의 생성: NSG-SGM3-Flt3ko 또는 SGM3F 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl-Flt3 em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ)는 NSG-SGM3 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ; RRID:IMSR JAX:013062)를 NSGF (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl-Flt3 em1Akp) 마우스와 교배시킴으로써 생성되고 모든 후손이 동형접합일 때까지 이종교배시켰다. NSG-SGM3 마우스는 각각 인간 인터류킨-3 (IL3) 유전자, 인간 과립구/대식세포-자극 인자 (GM-CSF) 유전자, 또는 인간 줄기 세포 인자 (SCF) 유전자를 보유하도록 설계된 3개의 별개의 트랜스진을 보유하였다. 각각의 유전자의 발현은 인간 시토메갈로바이러스 프로모터/인핸서 서열에 의해 구동되고 인간 성장 호르몬 카세트 및 폴리아데닐화 (폴리A) 서열이 이어진다. 트랜스진은 수정된 C57BL/6xC3H/HeN 난모세포 내로 미세주사되었다. 3개의 트랜스진 (3GS) 모두를 보유하는 생성된 창시자는 BALB/c-scid/scid 마우스와 여러 세대 동안 역교배되고 후속적으로 NOD.CB17-Prkdcscid 마우스와 적어도 11세대 동안 역교배되었다 (Nicolini et al., 2004). 이들 마우스는 NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl; RRID:IMSR JAX: 005557)와 교배되었고, 이어서 모든 후손이 3GS 및 IL2rg 표적화된 돌연변이에 대해 동형접합일 때까지 이종교배되었다. 더 잭슨 래보라토리(The Jackson Laboratory)에 도착 시, 트랜스제닉 마우스는 NSG 마우스와 1세대 동안 교배되어 NSG-SGM3 마우스를 확립하였다. NSGF 마우스는 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 생성되었다. Cas9 mRNA 및 NSG 마우스의 수정란에서 마우스 Flt3의 엑손 3을 표적화하는 sgRNA (5'-AAGTGCAGCTCGCCACCCCA-3', 서열식별번호: 2)를 사용하는 CRISPR에 의해 생성되었다. 주사된 배아로부터 유래된 배반포는 양모로 이식되었고 신생아 새끼가 수득되었다. 널 결실을 보유하는 마우스는 NSG와 역교배되었다. F0 및 F1 한배새끼는 꼬리 티핑되고 PCR 및 생어 시퀀싱에 의해 성공적인 유전자-녹아웃에 대해 시험되었다. 프라이머 (5'- GGTACCAGCAGAGTTGGATAGC -3', 서열식별번호: 3) 및 (5'- ATCCCTTACACAGAAGCTGGAG -3', 서열식별번호: 4)가 PCR 반응에서 돌연변이체 대립유전자로부터 마우스 Flt3 야생형 대립유전자를 검출하는 데 사용되었다 (표 1). WT 대립유전자는 DNA 단편 799 bp 길이를 생성하는 반면에, 돌연변이된 대립유전자는 363 bp 길이의 DNA 단편을 생성한다.
마우스 모델 NSG-SGM3F-A2의 생성: NSG-SGM3-Flt3ko-A2 또는 NSG-SGM3F-A2 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Dvs/SzJ Flt3em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ)는 NSG-HLA-A2/HHD 마우스 (RRID:IMSR JAX: 014570)를 NSG-SGM3-Flt3ko 또는 SGM3F 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl-Flt3 em1Akp Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ)와 교배시킴으로써 생성되었다. NSG-SGM3-Flt3ko 마우스는 각각 인간 인터류킨-3 (IL3) 유전자, 인간 과립구/대식세포-자극 인자 (GM-CSF) 유전자, 또는 인간 줄기 세포 인자 (SCF) 유전자를 보유하도록 설계된 3개의 별개의 트랜스진을 보유하였다. 각각의 유전자의 발현은 인간 시토메갈로바이러스 프로모터/인핸서 서열에 의해 구동되고 인간 성장 호르몬 카세트 및 폴리아데닐화 (폴리A) 서열이 이어진다. 트랜스진은 수정된 C57BL/6xC3H/HeN 난모세포 내로 미세주사되었다. 3개의 트랜스진 (3GS) 모두를 보유하는 생성된 창시자는 BALB/c-scid/scid 마우스와 여러 세대 동안 역교배되고 후속적으로 NOD.CB17-Prkdcscid 마우스와 적어도 11세대 동안 역교배되었다 (Nicolini et al., 2004). 이들 마우스는 NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl; RRID:IMSR JAX: 005557)와 교배되었고 이어서 모든 후손이 3GS 및 IL2rg 표적화된 돌연변이에 대해 동형접합일 때까지 이종교배되었다. 더 잭슨 래보라토리에 도착 시, 트랜스제닉 마우스는 NSG 마우스와 1세대 동안 교배되어 NSG-SGM3 마우스를 확립하였다. NSGF 마우스는 CRISPR/cas 시스템을 사용하여 생성되었다. Cas9 mRNA 및 마우스 Flt3을 표적화하는 sgRNA는 수정된 NSG 난모세포 내로 공동주사되었다. Flt3 결실을 보유하는 생성된 창시자는 NSG 마우스와 교배되었고, 이어서 모든 후손이 Flt3 표적화된 돌연변이에 대해 동형접합일 때까지 이종교배되었다. NSG-SGM3 마우스는 NSGF 마우스와 2세대 동안 교배되어 NSG-SGM3-Flt3ko 마우스를 확립하였다. NSG-HLA-A2/HHD 마우스는 MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인, 및 뮤린 H2-Db의 알파3, 세포질 및 막관통 도메인을 코딩한 HLA-A2/H2-D/B2M 트랜스진을 보유하였다 (Pascolo et al., 1997; Shultz et al., 2010). NSG-HLA-A2/HHD 마우스는 NSG-SGM3F 마우스와 4세대 동안 교배되어 NSG-SGM3F-A2 마우스를 확립하였다.
추가적인 물질 및 방법
인간화 마우스
인간화 마우스는 더 잭슨 래보라토리 (메인주 바 하버)로부터 수득된 NSG 배경의 마우스의 상이한 균주 상에서 생성되었다. 모든 프로토콜은 더 잭슨 래보라토리 (14005) 및 유니버시티 오브 코네티컷 헬스 센터(University of Connecticut Health Center) (101163-0220 & 101831-0321; 코네티컷주 파밍턴)의 실험 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었다. 마우스는 4주령에서의 감마선 조사를 사용하여 준치사적으로 조사되었다 (체중의 그램당 10 cGy). 태아 간 또는 만삭의 제대혈로부터의 100,000개의 CD34+ HPC (어드밴스드 바이오사이언스 리소시스(Advanced Bioscience Resources) 또는 론자(Lonza))는 200 μL의 PBS 중 꼬리-정맥 정맥내 (IV) 주사에 의해 제공되었다. 대안적으로, 마우스는 표시된 바와 같이 골수로부터의 성체 CD34+ HPC (론자)를 받았다. 마우스는 생착을 평가하기 위해 HPC 이식 후 4-12주에 채혈하고 개별 실험 설계에 따라 안락사되었다.
유동 세포계측 분석
마우스를 안락사시켰고 혈액을 헤파린으로 수집하였다. 골 (대퇴골 및 경골), 비장 및 폐를 수집하여 단일 세포 현탁액을 만들었다. 비장은 50 μg/ml의 리버라제(Liberase) (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 인디애나주 인디애나폴리스) 및 24U/mL의 DNase I (시그마(Sigma))로 10분 동안 37℃에서 소화되었다. 폐는 50 μg/ml의 리버라제 및 24U/mL의 DNase I (시그마)로 30분 동안 37℃에서 소화되었고, 젠틀맥스(GentleMACS) (밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotec))를 사용한 기계적 해리가 이어진다. 세포는 먼저 뮤린 Fc 차단제 (BD)로 처리되고 이어서 얼음 상에서 항체 칵테일로 30분 동안 염색되었다. PBS로 2회 세척한 후, 샘플이 LSRII 또는 FACSARIA II (BD) 상에서 획득되고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리 스타(Tree Star), 오리건주 애슐랜드)로 분석되었다. 인간 HLA-0201의 발현의 경우, 세포는 마우스 CD45-BV421 (30-F11, BD) 및 인간 HLA-A2-PE (BB7.2, BD)에 대한 항체로 염색되었다. 혈액에서의 인간 생착의 경우, 세포는 마우스 CD45-BV650 (30-F11, BD) 및 인간 CD45-BV510 (HI30, BD), CD33-PE (P67.6, 바이오레전드), CD14-PE-Cy7 (MqP9, BD), CD19-APC (HIB19, 바이오레전드) 및 CD3-APC-H7 (SK7, BD)에 대한 항체로 염색되었다.
면역형광 염색
조직은 OCT (사쿠라 파인텍 유.에스.에이.(Sakura Finetek U.S.A.))에 매립되고 액체 질소에서 급속 동결되었다. 동결된 절편은 6 μm로 절단되고, 슈퍼프로스트(Superfrost) 플러스 슬라이드 상에서 공기 건조되고 차가운 아세톤으로 5분 동안 고정되었다. 조직 절편은 먼저 0.03% 히알루로니다제 (시그마)로 15분 동안 처리되고, 이어서 배경 파괴 및 Fc 수용체 차단 (이노벡스 바이오사이언스(Innovex Bioscience))으로 처리되었다. 절편은 이어서 인간 CD3 (UCHT1, 바이오레전드), CD11c (S-HCL-3, BD), HLA-A2 (BB7.2, BD), HLA-DR (L243, 바이오레전드) 또는 범-시토케라틴 (AE1/AE3, 밀테니 바이오테크)에 대한 모노클로날 항체로 1시간 동안 실온에서, 이어서 이소형-특이적 2차 항체로 30분 동안 실온에서 염색되었다. 각각의 이소형 항체가 대조군으로서 사용되었다. 최종적으로, 절편은 1 μg/ml의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 대비염색되고, 플루오로마운트(Fluoromount) (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))로 마운트되고, 라이카(Leica) LAS AF 2.0 소프트웨어를 사용한 라이카 SP 8 공초점 현미경 또는 ZEN 소프트웨어를 사용한 자이스 악시오(Zeiss Axio) 형광 현미경을 사용하여 가시화되었다.
통계적 분석
통계적 분석은 프리즘(Prism) (그래프패드(GraphPad))에서 수행될 것이다. 임의의 2개의 그룹 사이의 비교가 만-휘트니 검정 또는 양측 t-검정을 사용하여 분석된다. 임의의 3개 이상의 그룹 사이의 비교가 분산 분석 (ANOVA)에 의해 분석된다.
표 1. 마우스 유전자형 결정을 위한 프라이머의 목록.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용되는 주제와 관련하여 참조로서 포함되며, 이는 일부 경우에 문헌의 전문을 포함할 수 있다.
본원에서 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같은 단수 용어는, 명백하게 반대로 지시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 명백하게 반대로 지시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 작용을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 작용의 순서가 방법의 단계 또는 작용이 언급되는 순서로 반드시 제한되는 것이 아님이 이해되어야 한다.
청구범위 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 전환 어구, 예컨대 "포함하는", "포함하는", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "보유하는", "구성된" 등은 개방형인 것으로, 즉, 포함하나 이에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 오직 전환 어구 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진"만이 문헌 (United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03)에 제시된 바와 같이 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 전환 어구일 수 있다.
수치 값에 선행하는 용어 "약" 및 "실질적으로"는 언급된 수치 값의 ±10%를 의미한다.
값의 범위가 제공된 경우에, 범위의 상한 및 하한 사이 및 그를 포함하는 각각의 값이 본원에서 구체적으로 고려되고 기재된다.
SEQUENCE LISTING
<110> The Jackson Laboratory
<120> TRANSGENIC MOUSE MODEL EXPRESSING HUMAN HLA-A201 RESTRICTION GENE
<130> J0227.70086WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 63/049,187
<151> 2020-07-08
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3348
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
gggcacgtgg gatcggctgc agcactgcgc cagttcagcc cgcctagcag cgagcggccg 60
cggcctctgg agagaggttc ctccccctct gctctgcacc agtccgaggg aatctgtggt 120
cagtgacgcg catccttcag cgagccacct gcagcccggg gcgcgccgct gggaccgcat 180
cacaggctgg gccggcggcc tggctaccgc gcgctccgga ggccatgcgg gcgttggcgc 240
agcgcagcga ccggcggctg ctgctgcttg ttgttttgtc agtaatgatt cttgagaccg 300
ttacaaacca agacctgcct gtgatcaagt gtgttttaat cagtcatgag aacaatggct 360
catcagcggg aaagccatca tcgtaccgaa tgaggaatcg tttccatggc catcttgaac 420
gtgacagaga cccaggcagg agaataccta ctccatattc agagcgaagc cgccaactac 480
acagtactgt tcacagtgaa tgtaagagat acacagctgt acgtgctaag aagaccttac 540
tttaggaaga tggaaaacca ggacgcactg ctctgcatct ccgagggtgt tccagagccc 600
actgtggagt gggtgctctg cagctcccac agggaaagct gtaaagaaga aggccctgct 660
gttgtcagaa aggaggaaaa ggtacttcat gagttgttcg gaacagacat cagatgctgt 720
gctagaaatg cactgggccg cgaatgcacc aagctgttca ccatagatct aaaccaggct 780
cctcagagca cactgcccca gttattcctg aaagtggggg aacccttgtg gatcaggtgt 840
aaggccatcc atgtgaacca tggattcggg ctcacctggg agctggaaga caaagccctg 900
gaggagggca gctactttga gatgagtacc tactccacaa acaggaccat gattcggatt 960
ctcttggcct ttgtgtcttc cgtgggaagg aacgacaccg gatattacac ctgctcttcc 1020
tcaaagcacc ccagccagtc agcgttggtg accatcctag aaaaagggtt tataaacgct 1080
accagctcgc aagaagagta tgaaattgac ccgtacgaaa agttctgctt ctcagtcagg 1140
tttaaagcgt acccacgaat ccgatgcacg tggatcttct ctcaagcctc atttccttgt 1200
gaacagagag gcctggagga tgggtacagc atatctaaat tttgcgatca taagaacaag 1260
ccaggagagt acatattcta tgcagaaaat gatgacgccc agttcaccaa aatgttcacg 1320
ctgaatataa gaaagaaacc tcaagtgcta gcaaatgcct cagccagcca ggcgtcctgt 1380
tcctctgatg gctacccgct accctcttgg acctggaaga agtgttcgga caaatctccc 1440
aattgcacgg aggaaatccc agaaggagtt tggaataaaa aggctaacag aaaagtgttt 1500
ggccagtggg tgtcgagcag tactctaaat atgagtgagg ccgggaaagg gcttctggtc 1560
aaatgctgtg cgtacaattc tatgggcacg tcttgcgaaa ccatcttttt aaactcacca 1620
ggccccttcc ctttcatcca agacaacatc tccttctatg cgaccattgg gctctgtctc 1680
cccttcattg ttgttctcat tgtgttgatc tgccacaaat acaaaaagca atttaggtac 1740
gagagtcagc tgcagatgat ccaggtgact ggccccctgg ataacgagta cttctacgtt 1800
gacttcaggg actatgaata tgaccttaag tgggagttcc cgagagagaa cttagagttt 1860
gggaaggtcc tggggtctgg cgctttcggg agggtgatga acgccacggc ctatggcatt 1920
agtaaaacgg gagtctcaat tcaggtggcg gtgaagatgc taaaagagaa agctgacagc 1980
tgtgaaaaag aagctctcat gtcggagctc aaaatgatga cccacctggg acaccatgac 2040
aacatcgtga atctgctggg ggcatgcaca ctgtcagggc cagtgtactt gatttttgaa 2100
tattgttgct atggtgacct cctcaactac ctaagaagta aaagagagaa gtttcacagg 2160
acatggacag agatttttaa ggaacataat ttcagttttt accctacttt ccaggcacat 2220
tcaaattcca gcttcagaat gaattaaatt cccattgaac cctgagagct gatccaaggg 2280
cgggtgtaac tgaacttctc gtgaaccagg catgatgaga ttgaatatga aaaccagaag 2340
aggctggcag aagaagagga ggaagatttg aacgtgctga cgtttgaaga cctcctttgc 2400
tttgcgtacc aagtggccaa aggcatggaa ttcctggagt tcaagtcgtg tgtccacaga 2460
gacctggcag ccaggaatgt gttggtcacc cacgggaagg tggtgaagat ctgtgacttt 2520
ggactggccc gagacatcct gagcgactcc agctacgtcg tcaggggcaa cgcacggctg 2580
ccggtgaagt ggatggcacc tgagagctta tttgaaggga tctacacaat caagagtgac 2640
gtctggtcct acggcatcct tctctgggag atattttcac tgggtgtgaa cccttaccct 2700
ggcattcctg tcgacgctaa cttctataaa ctgattcaga gtggatttaa aatggagcag 2760
ccattctatg ccacagaagg gatatgtatc agaacatggg tggcaacgtc ccagaacatc 2820
catccatcta ccaaaacagg cggcccctca gcagagaggc aggctcagag ccgccatcgc 2880
cacaggccca ggtgaagatt cacggagaaa gaagttagcg aggaggcctt ggaccccgcc 2940
accctagcag gctgtagacc acagagccaa gattagcctc gcctctgagg aagcgcccta 3000
caggccgttg cttcgctgga cttttctcta gatgctgtct gccattactc caaagtgact 3060
tctataaaat caaacctctc ctcgcacagg tgggagagcc aataatgaga cttgttggtg 3120
agcccgccta ccctgggggg cctttccagg ccccccaggc ttgaggggaa agccatgtat 3180
ctgaaatata gtatattctt gtaaatacgt gaaacaaacc aaacccgttt tttgctaagg 3240
gaaagctaaa tatgattttt aaaaatctat gttttaaaat actatgtaac tttttcatct 3300
atttagtgat atattttatg gatggaaata aactttctac tgtagaaa 3348
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2
aagtgcagct cgccacccca 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 3
ggtaccagca gagttggata gc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 4
atcccttaca cagaagctgg ag 22
Claims (25)
- 하기를 포함하는 비-비만성 당뇨병 (NOD) 마우스:
불활성화된 마우스 Prkdc 대립유전자;
불활성화된 마우스 IL2rg 대립유전자;
불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자;
인간 인터류킨 3 (IL3)을 코딩하는 핵산;
인간 과립구/대식세포-자극 인자 (GM-CSF)를 코딩하는 핵산;
인간 줄기 세포 인자 (SCF)를 코딩하는 핵산; 및
MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인, 및 뮤린 H2-Db의 알파3 세포질 및 막관통 도메인 (HLA-A2/H2-D/B2M)을 코딩하는 핵산. - 제1항에 있어서, 마우스가 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자; 인간 IL3을 코딩하는 핵산; 인간 GM-CSF를 코딩하는 핵산; 인간 SCF를 코딩하는 핵산; 및 HLA-A2/H2-D/B2M을 코딩하는 핵산을 포함하는 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ (NOD scid 감마) 마우스인 마우스.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-A2/H2-D/B2M을 코딩하는 핵산이 HLA-A2/H2-D/B2M을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 것인 마우스.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스가 HLA-A2/H2-D/B2M을 코딩하는 트랜스진을 발현하는 것인 마우스.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 골수 마우스 CD45+ 세포가 4주령에 검출가능한 수준의 HLA-A2를 발현하는 것인 마우스.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스가 조사되고, 인간 조혈 전구 세포 (HPC)로 이식되었고, 인간 HPC가 인간 CD45+ 세포로 생착하는 것인 마우스.
- 제6항에 있어서, 인간 HPC가 태아 간, 제대혈, 또는 골수로부터의 것이고, 마우스에서의 생착된 인간 CD45+ 세포가 CD19+ B 세포, CD33+ 골수성 세포, 및 CD3+ T 세포의 혼합된 집단을 포함하는 것인 마우스.
- 제6항에 있어서, 인간 HPC가 태아 간, 제대혈, 또는 골수로부터의 것이고, 마우스의 폐 조직이 CD3+ T 세포 및 HLA-DR+CD11c+ 수지상 세포를 포함하는 것인 마우스.
- 제6항에 있어서, 인간 HPC가 HLA-A2+이고, 마우스가 HLA-A2+ 마우스 흉선 상피 세포를 포함하는 것인 마우스.
- HLA-A2/H2-D/B2M을 코딩하는 트랜스진을 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자, 인간 인터류킨 3 (IL3)을 코딩하는 핵산, 인간 과립구/대식세포-자극 인자 (GM-CSF)를 코딩하는 핵산, 및 인간 줄기 세포 인자 (SCF)를 코딩하는 핵산을 포함하는 NOD scid 감마 마우스로 도입하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 마우스를 생산하는 방법.
- 인간 인터류킨 3 (IL3)을 코딩하는 핵산, 인간 과립구/대식세포-자극 인자 (GM-CSF)를 코딩하는 핵산, 인간 줄기 세포 인자 (SCF)를 코딩하는 핵산, 및 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자를 포함하는 NSG-SGM3F 마우스를 MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인, 및 뮤린 H2-Db의 알파3, 세포질 및 막관통 도메인을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 NSG-HLA-A2/HHD 마우스와 교배시키는 것을 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 마우스를 생산하는 방법.
- 하기를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 마우스를 생산하는 방법:
(a) NOD scid 감마 유전자 배경, 불활성화된 마우스 Flt3 대립유전자, 인간 IL3을 코딩하는 핵산, 인간 GM-CSF를 코딩하는 핵산, 및 인간 SCF를 코딩하는 핵산을 갖는 창시자 마우스를 발생시키는 것;
(b) 창시자 마우스를 MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인, 및 뮤린 H2-Db의 알파3, 세포질 및 막관통 도메인을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 NOD scid 감마 마우스와 교배시켜 F1 자손 마우스를 생산하는 것; 및
(c) F1 자손 마우스를 이종교배시켜 불활성화된 Flt3 대립유전자, 인간 인터류킨 3 (IL3)을 코딩하는 핵산, 인간 과립구/대식세포-자극 인자 (GM-CSF)를 코딩하는 핵산, 인간 줄기 세포 인자 (SCF)를 코딩하는 핵산, 및 MHC 부류 1에 공유 연결된 인간 B2-마이크로글로불린 (B2M), 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파1 및 알파2 결합 도메인, 및 뮤린 H2-Db의 알파3, 세포질 및 막관통 도메인을 코딩하는 트랜스진에 대해 동형접합인 F2 자손 마우스를 생산하는 것. - Prkdc scid 에 대해 동형접합이고, Il2rg tm1Wjl 에 대해 동형접합이고, Flt3 em1Akp 에 대해 동형접합이고, Il-3에 대해 동형접합이고, GM-CSF에 대해 동형접합이고, SCF에 대해 동형접합이고, HLA-A2/H2-D/B2M을 코딩하는 트랜스진에 대해 동형접합인 암컷 마우스를 Prkdc scid 에 대해 동형접합이고, X-연관 Il2rg tm1Wjl 에 대해 반접합성이고, Flt3 em1Akp 에 대해 동형접합이고, Il-3에 대해 동형접합이고, GM-CSF에 대해 동형접합이고, SCF에 대해 동형접합이고, HLA-A2/H2-D/B2M을 코딩하는 트랜스진에 대해 동형접합인 수컷 마우스와 교배시켜 자손 마우스를 생산하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 마우스로부터 수득된 세포.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 마우스로부터 수득된 세포의 동일한 유전자형을 갖는 세포를 포함하는 마우스.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 마우스의 자손 마우스.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 마우스를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 마우스를 번식시키는 방법.
- 제18항에 있어서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 마우스를 제2 마우스와 교배시켜 자손 마우스를 생산하는 것을 포함하는 방법.
- 제19항에 있어서, 제2 마우스가 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 마우스인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 마우스를 준치사적으로 조사하여 조사된 마우스를 생산하는 것을 포함하는 방법.
- 제21항에 있어서, 마우스에게 인간 조혈 전구 세포 (HPC)를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 마우스에게 관심 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, 마우스에서의 인간 면역 세포에 대한 작용제의 효과를 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제24항에 있어서, 인간 면역 세포가 T 세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 및 대식세포로부터 선택되는 것인 방법.
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