JP2023533980A - ヒトｈｌａ－ａ２０１制限遺伝子を発現するトランスジェニックマウスモデル - Google Patents

ヒトｈｌａ－ａ２０１制限遺伝子を発現するトランスジェニックマウスモデル Download PDF

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Abstract

本開示は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と、ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸と、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸と、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をコードする核酸と、ならびに（ｉ）ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子のＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）と（ｉｉ）マウスＨ２－Ｄｂのα３細胞質および膜貫通ドメインとをコードするＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ導入遺伝子とを含む免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ（商標））マウスモデルを提供する。

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０２０年７月８日に出願された米国仮出願第６３／０４９，１８７号の恩典を主張する。
背景
マウスモデルは、ヒト患者を扱う複雑さを回避するために、インビボでヒト疾患を研究するために広く使用されている。それにもかかわらず、１つには、マウス免疫系とヒト免疫系間の重要な差異のために、マウスモデルは、ヒト疾患を不十分に再現することが多い（Ｈａｇａｉら、２０１８；Ｋａｎａｚａｗａ，２００７；Ｍｅｓｔａｓ＆Ｈｕｇｈｅｓ，２００４；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆｌａｖｅｌｌ，＆Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ，２０１０）。したがって、ヒト免疫系を有するマウスとして定義されるヒト化マウスは、魅力的な代替物であり得る（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｂｒｅｈｍ，Ｇａｒｃｉａ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ，＆Ｇｒｅｉｎｅｒ，２０１２；Ｔｈｅｏｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｒｏｎｇｖａｕｘ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｆｌａｖｅｌｌ，＆Ｍａｎｚ，２０１６；Ｖｉｃｔｏｒ Ｇａｒｃｉａ，２０１６；Ｚｈａｎｇ＆Ｓｕ，２０１２）。この目的のために、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－Ｉｌ２γｃ－／－（ＮＳＧ）またはＢＡＬＢ／ｃ－Ｒａｇ２－／－－γｃ－／－のような共通ガンマ鎖（γｃ）を欠く免疫不全マウス（ＢＲＧ）（Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、２００３；Ｔｒａｇｇｉａｉら、２００４）を、ヒトＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）の移植によってヒト化することができる。Ｔ細胞の供給源に基づいて、モデルは、以下の２つのタイプにさらに分類することができる。（１）ＨＰＣのドナーから成熟Ｔ細胞が単離され、養子移植されるモデル（Ａｓｐｏｒｄら、２００７；Ｐｅｄｒｏｚａ－Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２０１１；Ｗｕら、２０１４；Ｗｕら、２０１８；Ｙｕら、２００８）；この場合、Ｔ細胞はヒト胸腺において選択されている；（２）ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣから内因性Ｔ細胞がデノボ生成されるモデル（Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、２００３；Ｔｒａｇｇｉａｉら、２００４）；この場合、ヒトＴ細胞はマウス胸腺において選択される。
概要
本開示は、ＨＬＡ－Ａ２０１制限遺伝子を発現するヒト化マウスモデルを提供する。ヒト化マウス研究の１つの重要な側面は、ヒトＭＨＣに関連したヒト適応免疫の成熟である（Ｂｉｌｌｅｒｂｅｃｋら、２０１３；Ｄａｎｎｅｒら、２０１１；Ｎａｊｉｍａら、２０１６）。このマウスモデルは、１つには、ヒトＨＬＡ上での抗原提示を支えるために、および造血前駆細胞（ＨＰＣ）ドナーをマウスと適合させるために作製された。このマウスモデルは、とりわけ、上記モデルの制限に対処する。成熟Ｔ細胞がＨＰＣのドナーから単離され、養子移植される第１のモデルの最大の制限は、移植片対宿主病であり、内因性Ｔ細胞がヒトＣＤ３４＋ＨＰＣからデノボ生成される第２のモデルの最大の制限は、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）を認識することができる限られた数のＴ細胞である。
したがって、本開示のいくつかの局面は、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスであって、不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子と；不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子と；不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と；ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸と；ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸と；ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をコードする核酸と；ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子のＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）とマウスＨ２－Ｄｂのα３細胞質および膜貫通ドメイン（ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）とをコードする核酸とを含む、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスを提供する。本開示のさらなる局面は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と；ヒトＩＬ３をコードする核酸と；ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸と；ヒトＳＣＦをコードする核酸と；ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍをコードする核酸とを含むＮＳＧ（商標）マウスを提供する。これらのマウスモデルは、ヒトＨＬＡ上での抗原提示を支え、造血前駆細胞（ＨＰＣ）ドナーのマウスとの適合を可能にする。
不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子と、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子と、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と、ヒトＩＬ３をコードする核酸と、ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸と、ヒトＳＣＦをコードする核酸と、ヒトＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍをコードする核酸とを含むＮＯＤマウスを作製する方法、モデル系としてマウスを使用する方法、ならびにマウスを繁殖させる方法も本明細書で提供される。
ヒトＩＬＳをコードする核酸と、ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸と、ヒトＳＣＦをコードする核酸と、ヒトＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍをコードする導入遺伝子とを含むＮＳＧ（商標）細胞が、本明細書中にさらに提供される。
図１Ａ～１Ｃは、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおけるヒトＣＤ３４＋ＨＰＣの異なる源からのヒト生着を示す。図１Ａは、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスの交配スキームを示す概略図である。図１Ｂは、４週齢マウスの血液中におけるｍＣＤ４５＋細胞上でのＨＬＡ－Ａ２発現を示す。図１Ｃは、ヒト胎児肝臓、臍帯血および骨髄ＨＰＣの移植後１２週でのｈＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２におけるｈＣＤ４５＋細胞の絶対数ならびにヒトＣＤ３３＋、ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋細胞の百分率を測定するグラフを示す。 同上。 同上。
図２Ａ～２Ｄは、ヒト臍帯血または胎児肝臓ＨＰＣを移植されたヒト化ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおけるヒト生着の比較を示す。図２Ａは、１×１０５個の臍帯血（ＣＢ）または胎児肝臓（ＦＬ）ＨＰＣの移植の１２週後でのｈＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおけるｈＣＤ４５＋細胞の百分率および絶対数によって血液中で測定されたヒト生着を示す。５人のＣＢドナーからｎ＝９１のマウス、４人のＦＬドナーからｎ＝９５のマウス。ネストｔ検定。図２Ｂは、ｈＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおけるｈＣＤ３３＋、ｈＣＤ１９＋、ｈＣＤ３＋細胞の絶対数を示す。図２Ｃは、ｈＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスの血液中のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を示す図である。図２Ｄは、ＥＬＩＳＡによって、移植後１２週にｈＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスの血漿中で測定された総ヒトＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡを示す。 同上。 同上。 同上。
詳細な説明
本開示は、ヒトＨＬＡ上での抗原提示を支え、造血前駆細胞（ＨＰＣ）ドナーをマウスと適合させるマウスモデルを提供する。本明細書に提供されるマウスモデルは、いくつかの局面において、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ（商標））背景を有し、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と、ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸と、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸と、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をコードする核酸と、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子のＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）とマウスＨ２－Ｄｂのα３、細胞質および膜貫通ドメインとをコードする核酸とをさらに含む（本明細書において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスと称される。）。いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルの遺伝子型は、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｄｖｓ／ＳｚＪＦｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪである（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｄｖｓ／ＳｚＪＦｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪマウスを作製する例示的な方法については実施例１を参照）。いくつかの態様において、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌーＦｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ（ＳＧＭ３Ｆ）マウスは、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｄｖｓ／ＳｚＪＦｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪマウスを得るために、ＨＬＡ－Ａ０２０１トランスジェニックマウス（ＮＳＧ－Ａ２（ＨＨＤ））と交配され、すべての子孫がホモ接合になるまで同系交配される。
ＮＳＧ（商標）マウスは、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠き、複数のサイトカインシグナル伝達経路が欠損しており、自然免疫に多くの欠陥を有する免疫不全マウスである（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｉｓｈｉｋａｗａ，＆Ｇｒｅｉｎｅｒ，２００７；Ｓｈｕｌｔｚら、２００５；Ｓｈｕｌｔｚら、１９９５）を参照されたい。）。非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス系統ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪに由来するＮＳＧ（商標）マウス（例えば、参照により本明細書に組み入れられる（Ｍａｋｉｎｏら、１９８０）を参照されたい。）は、Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ変異（「重症複合免疫不全」変異または「ｓｃｉｄ」変異とも呼ばれる）およびＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ標的化変異を含む。Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ変異は、ヒトＰＲＫＤＣ遺伝子のマウスホモログにおける機能喪失変異であり、この変異は適応免疫を本質的に排除する（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる（Ｂｌｕｎｔら、１９９５；Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｈｅｓｓｅｌｔｏｎ，＆Ｓｈｕｌｔｚ，１９９８）を参照されたい。）。Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ変異は、インターロイキン２受容体γ鎖（ＩＬ２Ｒγ、ヒトにおけるＩＬ２ＲＧと相同）をコードする遺伝子におけるヌル変異であり、これはＮＫ細胞分化を遮断し、それによって初代ヒト細胞の効率的な生着を妨げる障害を除去する（Ｃａｏら、１９９５；Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８；Ｓｈｕｌｔｚら、２００５）、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる。）。当技術分野で公知であるように、機能喪失変異は、機能をほとんどまたは全く有しない遺伝子産物をもたらす。比較すると、ヌル変異は、機能を有しない遺伝子産物をもたらす。不活性化された対立遺伝子は、機能喪失対立遺伝子またはヌル対立遺伝子であり得る。
不活性化された対立遺伝子は、検出可能なレベルの機能的遺伝子産物（例えば、機能的タンパク質）を産生しない対立遺伝子である。いくつかの態様において、不活性化された対立遺伝子は転写されない。いくつかの態様において、不活性化された対立遺伝子は、機能的タンパク質をコードしない。したがって、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むマウスは、検出可能なレベルの機能的ＦＬＴ３を産生しない。いくつかの態様において、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むマウスは、機能的ＦＬＴ３を産生しない。
Ｆｌｔ３は、樹状細胞および単球系統の発達に重要な受容体である。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｌｔ３シグナル伝達は、様々なＤＣおよび単球系統の発達にとって重要であり（Ｄｉｎｇら、２０１４；Ｇｉｎｈｏｕｘら、２００９；ＭｃＫｅｎｎａら、２０００；Ｗａｓｋｏｗら、２００８）、その役割は、マウスおよびヒトにおけるインビボでのＦｌｔ３Ｌの投与後の循環通常型（ｃ）ＤＣおよび形質細胞様（ｐ）ＤＣの増加によってさらに裏付けられる（Ｋａｒｓｕｎｋｙ，Ｍｅｒａｄ，Ｃｏｚｚｉｏ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，＆Ｍａｎｚ，２００３；Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら、１９９６；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら、２０００）。マウスＦｌｔ３をノックアウトすることによって、（１）マウスＤＣおよび他の骨髄系細胞の減少；および（２）ヒト細胞への（ヒト受容体を介して作用することができる）マウスＦｌｔ３Ｌの利用可能性の増大をもたらすことができ、それにより、ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣの移植に際するヒト骨髄系細胞の長期発達を改善する。
本明細書において提供されるＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、マウスＦｌｔ３対立遺伝子を不活性化するゲノム修飾を含む。核酸に関する修飾は、対応する野生型核酸（例えば、天然に存在する核酸）と比較した、核酸の任意の操作である。したがって、ゲノム修飾は、ゲノム中の対応する野生型核酸（例えば、天然に存在する核酸）と比較した、ゲノム中の核酸の任意の操作である。核酸（例えば、ゲノム）修飾の非限定的な例には、欠失、挿入、「インデル」（欠失および挿入）、および置換（例えば、点変異）が含まれる。いくつかの態様において、遺伝子における欠失、挿入、インデルまたは他の修飾は、その遺伝子がもはや機能的産物（例えば、タンパク質）をコードしないようなフレームシフト変異をもたらす。修飾には、化学的修飾、例えば、少なくとも１つの核酸塩基の化学的修飾も含まれる。核酸修飾の方法、例えば、遺伝子不活性化をもたらす方法は公知であり、限定されないが、ＲＮＡ干渉、化学的修飾および（例えば、リコンビナーゼまたは他のプログラム可能なヌクレアーゼ系、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＺＦＮを使用する）遺伝子編集が挙げられる。いくつかの態様において、本明細書の他の箇所に記載されるように、マウスＦｌｔ３対立遺伝子を不活性化するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集が使用される。
いくつかの態様において、ゲノム修飾（例えば、欠失またはインデル）は、コード領域、非コード領域および調節領域から選択されるマウスＦｌｔ３対立遺伝子の（少なくとも１つの）領域中にある。いくつかの態様において、ゲノム修飾（例えば、欠失またはインデル）は、マウスＦｌｔ３対立遺伝子のコード領域である。例えば、ゲノム修飾（例えば、欠失またはインデル）は、エクソン３中にあり得、またはマウスＦｌｔ３対立遺伝子のエクソン３にまたがり得る。いくつかの態様において、ゲノム修飾は、ゲノム欠失である。例えば、マウスＦｌｔ３対立遺伝子は、エクソン３中のヌクレオチド配列のゲノム欠失を含み得る。いくつかの態様において、配列番号１のヌクレオチド配列は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子から欠失されている。いくつかの態様において、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、検出可能なレベルのマウスＦＬＴ３を発現しない。検出可能なレベルのマウスＦＬＴ３は、フローサイトメトリーおよび／またはＥＬＩＳＡなどの標準的なタンパク質検出アッセイを使用して検出される任意のレベルのＦＬＴ３タンパク質である。いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、検出不能なレベルまたは低レベルのマウスＦＬＴ３を発現する。例えば、マウスモデルは、１，０００ｐｇ／ｍｌ未満のマウスＦＬＴ３を発現し得る。いくつかの態様において、マウスモデルは、５００ｐｇ／ｍｌ未満のマウスＦＬＴ３または１００ｐｇ／ｍｌ未満のマウスＦＬＴ３を発現する。マウスＦＬＴ３受容体は、表面抗原分類抗原ＣＤ１３５とも呼ばれる。したがって、いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、ＣＤ１３５＋多能性前駆細胞を含まない（存在しない）。
Ｆｌｔ３ノックアウトマウスは、いくつかの態様において、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用してＣＲＩＳＰＲによって作製される。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ（例えば、５’－ＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡ－３’、配列番号２）は、マウスＦｌｔ３ＮＳＧ（商標）マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ－Ｆｌｔ３ｅｍ１Ａｋｐ；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：００５５５７）のエクソン３を標的とする。注入された胚に由来する胚盤胞は、いくつかの態様において、代理母に移植され、新生仔が得られる。いくつかの態様において、ヌル欠失を有するマウスは、ＮＳＧ（商標）に対して戻し交配される。Ｆ０およびＦ１同腹仔は、例えば、ＰＣＲおよびサンガー配列決定によって遺伝子ノックアウトの成功について試験され得る。例えば、変異対立遺伝子からマウスＦｌｔ３野生型対立遺伝子を検出するために、ＰＣＲ反応において、プライマー（５’－ＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＣ－３’、配列番号３）および（５’－ＡＴＣＣＣＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ－３’、配列番号４）が使用され得る（表１）。ＷＴ対立遺伝子は７９９ｂｐ長のＤＮＡ断片を生じるのに対して、変異した対立遺伝子は３６３ｂｐ長のＤＮＡ断片を生じる。
トランスジェニックマウスモデル
トランスジェニックマウスモデル（Ｔｇマウス）は、例えば、遺伝子配列を導入遺伝子で置換することによって、または遺伝子座内に見出されない遺伝子配列を付加することによって、遺伝子配列を修飾するために作製され得る。本明細書で提供されるＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、トランスジェニック対立遺伝子を含む。これらのマウスモデルは、マウスゲノム中に導入された外因性核酸を含む。
本明細書で提供されるように使用される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡのキメラであり得る。いくつかの態様において、核酸（例えば、ＤＮＡ）は、特定の目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む。遺伝子は、ヌクレオチドの別個の配列であり、その順序は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中の単量体の順序を決定する。遺伝子は、典型的にはタンパク質をコードする。遺伝子は、内因性（宿主生物中に天然に存在する）または外因性（自然にまたは遺伝子操作を通じて宿主生物に導入される）であり得る。対立遺伝子は、変異によって生じ、染色体上の同じ遺伝子座に見られる遺伝子の２つまたはそれを超える代替形態のうちの１つである。遺伝子は、いくつかの態様において、プロモーター配列、コード領域（例えば、エクソン）、非コード領域（例えば、イントロン）、および調節領域（調節配列とも呼ばれる）を含む。当技術分野で公知であるように、プロモーター配列は、そこで遺伝子の転写が始まるＤＮＡ配列である。プロモーター配列は、典型的には、転写開始部位のすぐ上流（の５’末端）に位置する。エクソンは、アミノ酸をコードする遺伝子の領域である。イントロン（および他の非コードＤＮＡ）は、アミノ酸をコードしない遺伝子の領域である。
ヒト遺伝子を含むマウスは、ヒト導入遺伝子を含むと考えられる。導入遺伝子は、宿主生物に対して外因性の遺伝子である。すなわち、導入遺伝子は、自然にまたは遺伝子操作を通じて宿主生物に導入された遺伝子である。導入遺伝子は、宿主生物（導入遺伝子を含む生物、例えばマウス）中に天然には存在しない。
トランスジェニックマウスモデルを作製する方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。
本明細書に記載されるＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスは、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と、ＩＬ３をコードする核酸と、ＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸と、ＳＣＦをコードする核酸と、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子のＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）とマウスＨ２－Ｄｂのα３、細胞質および膜貫通ドメインとをコードする核酸とを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスは、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と、ヒトＩＬ３をコードする核酸と、ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸と、ヒトＳＣＦをコードする核酸と、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子のＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）とマウスＨ２－Ｄｂのα３、細胞質および膜貫通ドメインとをコードする核酸とを含む。いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスは、ヒトＩＬ３導入遺伝子と、ヒトＧＭ－ＣＳＦ導入遺伝子と、ヒトＳＣＦ導入遺伝子と、ヒトＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ導入遺伝子（ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子のＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）とマウスＨ２－Ｄｂのα３、細胞質および膜貫通ドメインとをコードする導入遺伝子）とを含む。いくつかの態様において、ヒトＩＬ３導入遺伝子、ヒトＧＭ－ＣＳＦ導入遺伝子、ヒトＳＣＦ導入遺伝子、および／またはヒトＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ導入遺伝子などの導入遺伝子は、マウスゲノムに組み込まれる。ヒトＩＬ３、ＣＳＦ２およびＫＩＴＬＧ導入遺伝子は、参照により本明細書に組み入れられる、（Ｎｉｃｏｌｉｎｉ，Ｃａｓｈｍａｎ，Ｈｏｇｇｅ，Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，＆Ｅａｖｅｓ，２００４）に記載されている。ヒトＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ導入遺伝子が記載されており（Ｐａｓｃｏｌｏら、１９９７；Ｔａｋａｋｉら、２００６）、参照により本明細書に組み入れられる。
ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスは、いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＨＬＡ－Ａ２／ＨＨＤマウス（ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：０１４５７０）をＳＧＭ３Ｆマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ－Ｆｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ）に交雑することによって作製される。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスは、それぞれがヒトインターロイキン－３（ＩＬ３）遺伝子、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）遺伝子またはヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）遺伝子のうちの１つを有するように設計された３つの別個の導入遺伝子を有する。各遺伝子の発現は、ヒトサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー配列によって駆動され、その後にヒト成長ホルモンカセットおよびポリアデニル化（ポリＡ）配列が続く。受精したＣ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ／ＨｅＮ卵母細胞中に導入遺伝子を微量注入した。いくつかの態様において、３つすべての導入遺伝子（３ＧＳ）を有する得られたファウンダーは、数世代にわたってＢＡＬＢ／ｃ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに戻し交配され、その後、複数（例えば、少なくとも１１）世代にわたってＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスに戻し交配される（Ｎｉｃｏｌｉｎｉら、２００４；Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈら、２０１０）。次いで、これらのマウスは、例えば、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：００５５５７）に交配され、次いで、すべての子孫が３ＧＳおよびＩＬ２ｒｇを標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配され得る。トランスジェニックマウスは、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスを確立するために少なくとも１世代にわたってＮＳＧマウスに交配され得る。ＮＳＧＦマウスは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して作製され得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびマウスＦｌｔ３を標的とするｓｇＲＮＡは、いくつかの態様において、受精したＮＳＧ卵母細胞中に同時注入される。Ｆｌｔ３欠失を有する得られたファウンダーは、ＮＳＧマウスに交配され、次いで、すべての子孫がＦｌｔ３を標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配され得る。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスは、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆマウスを確立するために、複数（例えば、２）世代にわたってＮＳＧＦマウスに交配され得る。Ｈ－２Ｄｂ－／－Ｂ２ｍ－／－マウスにおけるＨＬＡ－Ａ２／ＨＨＤトランスジェニック発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を回復させ、ＨＬＡ－Ａ２．１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞応答を可能にする（Ｐａｓｃｏｌｏら、１９９７）。次いで、ＮＳＧ－ＨＬＡ－Ａ２／ＨＨＤマウスは、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスを確立するために、複数（例えば、少なくとも４）世代にわたってＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆマウスに交配され得る。
ヒト免疫系モデル
本開示のＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、いくつかの態様において、ヒトＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）およびヒト自然免疫系の発達を支えるために使用される。ヒト免疫系には、自然免疫系と適応免疫系が含まれる。自然免疫系は、免疫細胞を感染部位に動員すること、補体カスケードの活性化、白血球による異物の同定および身体からの異物の除去、適応免疫系の活性化、ならびに感染因子に対する物理的および化学的障壁として作用することを担う。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、常在マウスＨＰＣを死滅させるために致死量未満で放射線照射され（例えば、１００～３００ｃＧｙ）、次いで、放射線照射されたマウスは、ヒト自然免疫系の発達を開始させるために、ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣ（例えば、５万～２０万個のＨＰＣ）を移植される。したがって、いくつかの態様において、マウスは、ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣをさらに含む。ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣは、ヒト胎児肝臓、臍帯血、動員される末梢血および骨髄を含むがこれらに限定されない任意の供給源に由来し得る。いくつかの態様において、ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣは、ヒト臍帯血に由来する。
ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣの多様な免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞）への分化は、連続する発達段階が複数のサイトカインによって調節される複雑な過程である。この過程は、表面抗原分類（ＣＤ）抗原などの細胞表面抗原を通じてモニターすることができる。例えば、ＣＤ４５は、ＨＰＣ、マクロファージ、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞の表面上に発現されるので、生着を示すマーカーとして使用することができる。Ｔ細胞上では、ＣＤ４５は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、細胞増殖および細胞分化を調節する。いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、ヒトＣＤ４５＋細胞を含む。いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルはまた、肺、胸腺、脾臓、リンパ節および／または小腸中の、ただしこれらに限定されない組織へのヒトＣＤ４５＋細胞の生着を示す。
ＣＤ４５＋細胞が成熟するにつれて、ＣＤ４５＋細胞は、様々な発達段階および分化している細胞型を示す追加のバイオマーカーを発現し始める。例えば、発達しているＴ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８も発現する。別の例として、発達している骨髄系細胞はＣＤ３３＋を発現する。本明細書中のマウスモデルは、いくつかの態様において、ヒトＣＤ４５＋細胞だけでなく、二重陽性ヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞および二重陽性ヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋骨髄系細胞も含む。
したがって、いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋細胞の集団はヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において、ヒトＣＤ４５＋細胞の集団は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、増加した百分率のヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。
いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋細胞の集団はヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋骨髄系細胞を含む。いくつかの態様において、ヒトＣＤ４５＋細胞の集団は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、増加した百分率のヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋骨髄系細胞を含む。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋骨髄系細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋骨髄系細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋骨髄系細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋骨髄系細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。
いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋細胞の集団はヒトＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。いくつかの態様において、ヒトＣＤ４５＋細胞の集団は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、増加した百分率のヒトＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。
本明細書で提供されるＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、驚くべきことに、樹状細胞（例えば、形質細胞様樹状細胞および骨髄樹状細胞）、ナチュラルキラー細胞および単球由来マクロファージ（単球マクロファージ）の生着も支えることができる。形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は高レベルのインターフェロンαを分泌し；骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）は、インターロイキン１２、インターロイキン６、腫瘍壊死因子およびケモカインを分泌し；ナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞などの損傷した宿主細胞を破壊し；マクロファージは、かなりの数の細菌または他の細胞または微生物を貪食する。
いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、増加した百分率のヒトＣＤ１１ｃ＋骨髄樹状細胞を含む。いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおけるヒトＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ－ＤＲ＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおけるヒトＣＤ１１Ｃ＋ＨＬＡ－ＤＲ＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおけるヒトＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ－ＤＲ＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおけるヒトＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ－ＤＲ＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおけるヒトＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ－ＤＲ＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。
いくつかの態様において、本開示のＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、ＨＬＡ－Ａ２適合の造血系列の生着を支えるために使用される。
トランスジェニック動物を作製する方法
いくつかの局面において、ヒト導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作製する方法が本明細書で提供される。トランスジェニック動物は、本明細書では、外来（外因性）核酸（例えば、導入遺伝子）がそのゲノムに挿入されている（組み込まれている）動物を指す。いくつかの態様において、トランスジェニック動物は、マウスまたはラットなどのトランスジェニック齧歯動物である。いくつかの態様において、トランスジェニック動物はマウスである。トランスジェニック動物の作製のために使用される３つの従来の方法には、ＤＮＡ微量注入（Ｇｏｒｄｏｎ＆Ｒｕｄｄｌｅ，１９８１）、参照により本明細書に組み入れられる）、胚性幹細胞媒介遺伝子導入（Ｇｏｓｓｌｅｒ，Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｋｏｒｎ，Ｓｅｒｆｌｉｎｇ，＆Ｋｅｍｌｅｒ，１９８６）、参照により本明細書に組み入れられる）、およびレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，１９７６）、参照により本明細書に組み入れられる）が含まれ、これらのいずれもが本明細書に提供されているように使用され得る。電気穿孔も、トランスジェニックマウス（それぞれが参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１６／０５４０３２号および国際公開第２０１７／１２４０８６号を参照されたい。）を作製するために使用され得る。
核酸は、いくつかの態様において、導入遺伝子、例えば、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーター（例えば、構成的に活性なプロモーター）を含む導入遺伝子を含む。いくつかの態様において、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製するために使用される核酸は、例えば、核酸が動物ゲノム中にランダムに組み込まれる受精胚の前核／核に送達されるプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）または酵母人工染色体（ＹＡＣ）などのベクター上に存在する。いくつかの態様において、受精胚は、単一細胞胚（例えば、接合子）である。いくつかの態様において、受精胚は、多細胞胚（例えば、胚盤胞などの、接合子に続く発達段階）である。いくつかの態様において、本開示のマウスモデルを作製するために、（例えば、ＢＡＣ上に担持される）核酸がマウスの受精胚に送達される。受精胚の注入後に、受精胚は、偽妊娠雌に導入され得、その後、偽妊娠雌は目的のポリペプチドをコードする核酸を含む子孫を出産する。核酸の存在または非存在は、例えば、任意の数の遺伝子型判定法（例えば、配列決定および／またはゲノムＰＣＲ）を用いて確認され得る。
内因性Ｆｌｔ３対立遺伝子を不活性化する方法も本明細書で提供される。いくつかの態様において、内因性Ｆｌｔ３対立遺伝子は、トランスジェニック動物において不活性化されている。いくつかの態様において、遺伝子／ゲノム編集方法が、遺伝子（対立遺伝子）不活性化のために使用される。本明細書で記載されるように使用され得る操作されたヌクレアーゼベースの遺伝子編集系には、例えば、クラスター化して規則的に配置された短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれる。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる（Ｃａｒｒｏｌｌ，２０１１；Ｇａｊ，Ｇｅｒｓｂａｃｈ，＆Ｂａｒｂａｓ，２０１３；Ｊｏｕｎｇ＆Ｓａｎｄｅｒ，２０１３）を参照されたい。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルの内因性Ｆｌｔ３対立遺伝子を不活性化するために、ＣＲＩＳＰＲ系が使用される。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる（Ｈａｒｍｓら、２０１４；Ｉｎｕｉら、２０１４）を参照されたい）。例えば、Ｆｌｔ３遺伝子中への正確なゲノム編集を生成するために、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはタンパク質および１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をマウス胚中に直接注入することができる。これらの胚から発生するマウスは、所望の変異を保有しているかどうかを決定するために、遺伝子型決定または配列決定することができ、所望の変異を保有しているマウスは、生殖細胞系列伝達を確認するために交配され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子編集のためのＲＮＡによってガイドされるＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されてきた原核生物における天然に存在する防御機構である。操作されたＣＲＩＳＰＲ系は、２つの主要成分：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）を含有する。ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ結合のための足場配列と、修飾されるべきゲノム標的を規定するユーザによって定義されるヌクレオチドスペーサー（例えば、約１５～２５ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド）とで構成される短い合成ＲＮＡである。したがって、ｇＲＮＡ中に存在する標的配列を単に変更することによって、Ｃａｓタンパク質のゲノム標的を変更することができる。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３から選択される。いくつかの態様において、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９である。
ガイドＲＮＡは、標的核酸配列にハイブリダイズする（結合する）スペーサー配列と、エンドヌクレアーゼを結合し、エンドヌクレアーゼを標的核酸配列にガイドするＣＲＩＳＰＲリピート配列とを少なくとも含む。当業者に理解されるように、各ｇＲＮＡは、そのゲノム標的配列（例えば、Ｆｌｔ３対立遺伝子の領域）に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａら、２０１１；Ｊｉｎｅｋら、２０１２）を参照されたい。いくつかの態様においては、本明細書に提供される方法で使用されるｇＲＮＡは、マウスＦｌｔ３対立遺伝子の領域（例えば、エクソン３）に結合する。いくつかの態様において、マウスＦｌｔ３対立遺伝子の領域に結合するｇＲＮＡは、５’－ＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡ－３’（配列番号２）のヌクレオチド配列を含む。
使用の方法
本明細書で提供されるＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスモデルは、いくつもの用途に使用され得る。例えば、特定の作用物質（例えば、治療剤）または医学的処置（例えば、組織移植）がどのようにヒト自然免疫系（例えば、ヒト自然免疫細胞応答）およびヒト適応免疫系（例えば、抗体応答）に影響を及ぼすかを試験するために、マウスモデルが使用され得る。
いくつかの態様においては、ヒト自然免疫系の発達に対する作用物質の効果を評価するために、マウスモデルが使用される。したがって、本明細書では、マウスモデルに作用物質を投与すること、およびマウスにおけるヒト自然免疫系の発達に対する作用物質の効果を評価することを含む方法が提供される。作用物質の効果は、例えば、ヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）およびヒト適応免疫応答（例えば、抗体産生）を測定することによって評価され得る。作用物質の非限定的な例としては、抗癌剤および抗炎症剤などの治療剤、ならびに免疫原性組成物（例えば、ワクチン）などの予防剤が挙げられる。
他の態様において、マウスモデルは、ヒト腫瘍に対する免疫療法応答を評価するために使用される。したがって、本明細書では、ヒト腫瘍を有するマウスモデルに作用物質を投与することと、マウスにおけるヒト自然免疫系に対するおよび／または腫瘍に対する作用物質の効果を評価することとを含む方法が提供される。作用物質の効果は、ヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答、ヒト適応免疫応答（例えば、抗体産生）および／または腫瘍細胞応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）を測定することによって評価され得る。いくつかの態様において、作用物質は抗癌剤である。
さらに他の態様において、マウスモデルは、感染性微生物に対するヒト自然免疫応答を評価するために使用される。したがって、本明細書では、マウスモデルを感染性微生物（例えば、細菌および／またはウイルス）に曝露すること、およびヒト自然免疫応答に対する感染性微生物の影響を評価することを含む方法が提供される。感染性微生物の影響は、ヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）を測定することによって評価され得る。これらの方法は、マウスに薬物または抗微生物剤（例えば、抗菌剤または抗ウイルス剤）を投与すること、および感染性微生物に対する薬物または抗微生物剤の効果を評価することをさらに含み得る。
なおさらなる態様において、マウスモデルは、組織移植に対するヒト免疫応答を評価するために使用される。したがって、組織（例えば、同種異系組織）をマウスモデルに移植すること、およびヒト自然免疫応答に対する移植された組織の影響を評価することを含む方法が本明細書で提供される。移植された組織の影響は、移植された組織に対するヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）およびヒト適応免疫応答（例えば、抗体産生）を測定することによって評価され得る。
実施例
実施例１．ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｄｖｓ／ＳｚＪＦｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ（ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２）マウスモデル
ヒト化マウス研究の１つの重要な側面は、ヒトＭＨＣに関連したヒト適応免疫の成熟である（Ｂｉｌｌｅｒｂｅｃｋら、２０１３；Ｄａｎｎｅｒら、２０１１；Ｎａｊｉｍａら、２０１６）。ヒトＨＬＡ上での抗原提示を支えるために、およびＨＰＣドナーをマウスと適合させるために、本発明者らは、ＳＧＭ３Ｆ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ－Ｆｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ）マウスをＨＬＡ－Ａ０２０１トランスジェニックマウス（ＮＳＧ－Ａ２（ＨＨＤ））と交配させ、すべての子孫がホモ接合になるまで同系交配させてＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｄｖｓ／ＳｚＪＦｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ（ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２）を得た（図１Ａ）。ＳＧＭ３Ｆマウスは、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターロイキン（ＩＬ）－３のトランスジェニック発現を有するＮＳＧマウス（ＮＳＧ－ＳＧＭ３、ＳＧＭ３）（Ｎｉｃｏｌｉｎｉら、２００４；Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈら、２０１０）とＦｌｔ３変異マウスを有するＮＳＧマウス（ＮＳＧＦ）との特徴を兼ね備えた。ヒトＨＬＡ－Ａ０２０１の発現を確認するために、本発明者らは、マウス骨髄細胞におけるＨＬＡ－Ａ２の表面発現を測定および確認した（図１Ｂ）。ヒト免疫系の生着を支える能力を試験するために、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスを致死量未満で放射線照射し、ヒト胎児肝臓、臍帯血または成人骨髄からの１×１０５個のＨＬＡ－Ａ２＋ＣＤ３４＋ＨＰＣを移植した。胎児肝臓および臍帯血ＨＰＣの両方を与えたマウスは、血中で同等の免疫細胞組成を示したが、骨髄ＨＰＣを与えたマウスではより少ないＣＤ３＋Ｔ細胞が見られた（図１Ｃ）。さらに、ＦＬ、ＣＢまたはＢＭ ＨＰＣの移植の６ヶ月後に、本発明者らは、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよびＣＤ３＋Ｔ細胞を含む、自然免疫応答および適応免疫応答の両方にとって重要である異なるヒト免疫細胞を有する肺において大量のｈＣＤ４５＋免疫細胞を観察した（データは示さず）。重要なことに、ＨＬＡ－Ａ２＋ＣＢ ＨＰＣの移植の６ヶ月後に、ＨＬＡ－Ａ２に特異的なＢＢ７．２抗体を使用してＨＬＡ－Ａ２＋ＨＰＣで再構成されたｈＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスのマウス胸腺上皮細胞上で、胸腺におけるＨＬＡ－Ａ２発現が、検出され（データは示さず）、これにより、ヒトＨＬＡ－Ａ２との関連でのＴ細胞の成熟が可能になる。
実施例２．ヒト臍帯血または胎児肝臓ＨＰＣを移植されたヒト化ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおけるヒト生着の比較。
ヒト胎児組織の利用可能性が限られているために、ヒト化マウスを構築するための臍帯血由来ＨＰＣの使用を検証した。４～５の異なる臍帯血または胎児肝臓ドナーを移植されたマウスのコホートからの異なる細胞型対して対照比較を行った。データは、胎児肝臓ＨＰＣを移植されたヒト化マウスが、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞およびｈＣＤ３＋Ｔ細胞の拡大増殖のために、移植の１２週後に、わずかにより高いｈＣＤ４５＋生着を示したに過ぎないことを示す（図２Ａ～２Ｂ）。胎児肝臓ＨＰＣを移植されたマウスでは、ｈＣＤ４＋Ｔ細胞のわずかな増加が観察されたが、ｈＣＤ８＋Ｔ細胞の総数に差は見られなかった（図２Ｃ）。適応体液性応答を開始する上での胎児肝臓または臍帯血由来ヒトＨＰＣの機能的能力を比較するために、ヒト抗体を産生するヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスの能力を評価した。この目的のために、ＥＬＩＳＡによって移植後１２週での血漿中の総ヒトＩｇを測定した。図２Ｄに示されるように、両群のマウスは、血漿中に同程度の量のヒトＩｇＭを分泌し、総ヒトＩｇＧおよびＩｇＡサブクラスのレベルも同様であった。したがって、抗体分泌の能力およびＩｇクラススイッチは、ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおいては、異なるＨＰＣ源間で同等であった。全体として、ＨＰＣ源間での変動性よりも、同じＨＰＣ源から異なるドナー間で、マウスにおけるより高いレベルの変動性が生じることが観察された。この分析は、臍帯血ＨＰＣが、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスにおいて胎児肝臓ＨＰＣと同等のヒト生着を提供することを示した。
マウスモデルＳＧＭ３Ｆの作製：ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：０１３０６２）をＮＳＧＦ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ－Ｆｌｔ３ｅｍ１Ａｋｐ）マウスに交雑することによって、ＮＳＧ－ＳＧＭ３－Ｆｌｔ３ｋｏまたはＳＧＭ３Ｆマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ－Ｆｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ）を作製し、すべての子孫がホモ接合になるまで同系交配した。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスは、それぞれがヒトインターロイキン－３（ＩＬ３）遺伝子、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）遺伝子またはヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）遺伝子のいずれかを有するように設計された３つの別個の導入遺伝子を有した。各遺伝子の発現は、ヒトサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー配列によって駆動され、その後にヒト成長ホルモンカセットおよびポリアデニル化（ポリＡ）配列が続く。受精したＣ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ／ＨｅＮ卵母細胞中に導入遺伝子を微量注入した。３つすべての導入遺伝子（３ＧＳ）を有する得られたファウンダーは、数世代にわたってＢＡＬＢ／ｃ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに戻し交配され、その後、少なくとも１１世代にわたってＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスに戻し交配された（Ｎｉｃｏｌｉｎｉら、２００４）。これらのマウスは、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：００５５５７）に交配され、次いで、すべての子孫が３ＧＳおよびＩＬ２ｒｇを標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配された。Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに到着したら、トランスジェニックマウスをＮＳＧマウスに一世代交配させて、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスを樹立した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＮＳＧマウスの受精卵中のマウスＦｌｔ３のエクソン３を標的とするｓｇＲＮＡ（５’－ＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡ－３’、配列番号２）を使用するＣＲＩＳＰＲによって、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用してＮＳＧＦマウスを作製した。注入された胚に由来する胚盤胞を代理母に移植し、新生仔を得た。ヌル欠失を有するマウスをＮＳＧに戻し交配した。Ｆ０およびＦ１同腹仔の尾部の先端を切除し、ＰＣＲおよびサンガー配列決定によって遺伝子ノックアウトの成功について試験した。変異対立遺伝子からマウスＦｌｔ３野生型対立遺伝子を検出するために、ＰＣＲ反応において、プライマー（５’－ＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＣ－３’、配列番号３）および（５’－ＡＴＣＣＣＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ－３’、配列番号４）を使用した（表１）。ＷＴ対立遺伝子は７９９ｂｐ長のＤＮＡ断片を生じるのに対して、変異した対立遺伝子は３６３ｂｐ長のＤＮＡ断片を生じる。
マウスモデルＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２の作製：ＮＳＧ－ＨＬＡ－Ａ２／ＨＨＤマウス（ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：０１４５７０）をＮＳＧ－ＳＧＭ３－Ｆｌｔ３ｋｏまたはＳＧＭ３Ｆマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ－Ｆｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ）に交雑することによって、ＮＳＧ－ＳＧＭ３－Ｆｌｔ３ｋｏ－Ａ２またはＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｄｖｓ／ＳｚＪＦｌｔ３ｅｍ１ＡｋｐＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ）を作製した。ＮＳＧ－ＳＧＭ３－Ｆｌｔ３ｋｏマウスは、それぞれがヒトインターロイキン－３（ＩＬ３）遺伝子、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）遺伝子またはヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）遺伝子のいずれかを有するように設計された３つの別個の導入遺伝子を有した。各遺伝子の発現は、ヒトサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー配列によって駆動され、その後にヒト成長ホルモンカセットおよびポリアデニル化（ポリＡ）配列が続く。受精したＣ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ／ＨｅＮ卵母細胞中に導入遺伝子を微量注入した。３つすべての導入遺伝子（３ＧＳ）を有する得られたファウンダーは、数世代にわたってＢＡＬＢ／ｃ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに戻し交配され、その後、少なくとも１１世代にわたってＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスに戻し交配された（Ｎｉｃｏｌｉｎｉら、２００４）。これらのマウスは、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：００５５５７）に交配され、次いで、すべての子孫が３ＧＳおよびＩＬ２ｒｇを標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配された。Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに到着したら、トランスジェニックマウスをＮＳＧマウスに一世代交配させて、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスを樹立した。ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して、ＮＳＧＦマウスを作製した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびマウスＦｌｔ３を標的とするｓｇＲＮＡは、受精したＮＳＧ卵母細胞中に同時注入された。Ｆｌｔ３欠失を有する得られたファウンダーは、ＮＳＧマウスに交配され、次いで、すべての子孫がＦｌｔ３を標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配された。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスは、ＮＳＧ－ＳＧＭ３－Ｆｌｔ３ｋｏマウスを確立するために、２世代にわたってＮＳＧＦマウスに交配された。ＮＳＧ－ＨＬＡ－Ａ２／ＨＨＤマウスは、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子のＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）とマウスＨ２－Ｄｂのα３、細胞質および膜貫通ドメインとをコードするＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ導入遺伝子を有した（Ｐａｓｃｏｌｏら、１９９７；Ｓｈｕｌｔｚら、２０１０）。ＮＳＧ－ＨＬＡ－Ａ２／ＨＨＤマウスを４世代にわたってＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆマウスに交配して、ＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆ－Ａ２マウスを確立した。
追加の材料および方法
ヒト化マウス
Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手したＮＳＧバックグラウンドのマウスの異なる系統に対してヒト化マウスを作製した。すべてのプロトコルは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１４００５）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ（１０１１６３－０２２０＆１０１８３１－０３２１；Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＣＴ）の動物実験委員会によって検討され、承認された。４週齢でガンマ線照射を用いて、致死量未満の放射線（体重１グラム当たり１０ｃＧｙ）をマウスに照射した。胎児肝臓または正期臍帯血からの１０万個のＣＤ３４＋ＨＰＣ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＲｅｓｏｕｒｃｅｓまたはＬｏｎｚａ）を、２００μＬのＰＢＳ中で尾静脈静脈内（ＩＶ）注射によって与えた。あるいは、マウスには、示されるように骨髄からの成人ＣＤ３４＋ＨＰＣ（Ｌｏｎｚａ）が与えられた。生着を評価するために、ＨＰＣ移植後４～１２週でマウスを採血し、個々の実験計画に従って安楽死させた。
フローサイトメトリー分析
マウスを安楽死させ、血液をヘパリンで採取した。骨（大腿骨および脛骨）、脾臓および肺を収集して単一細胞懸濁液を作製した。５０μｇ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および２４Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）で、脾臓を３７℃で１０分間消化した。５０μｇ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅおよび２４Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）で、肺を３７℃で３０分間消化した後、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で機械的に解離させた。まず、マウスＦｃブロッカー（ＢＤ）で細胞を処置し、次いで、抗体カクテルで氷上にて３０分間染色した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＬＳＲＩＩまたはＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩ（ＢＤ）で試料を取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。ヒトＨＬＡ－０２０１の発現のために、マウスＣＤ４５－ＢＶ４２１（３０－Ｆ１１、ＢＤ）およびヒトＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ（ＢＢ７．２、ＢＤ）に対する抗体で細胞を染色した。血液中でのヒト生着のために、マウスＣＤ４５－ＢＶ６５０（３０－Ｆ１１、ＢＤ）およびヒトＣＤ４５－ＢＶ５１０（ＨＩ３０、ＢＤ）、ＣＤ３３－ＰＥ（Ｐ６７．６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１４－ＰＥ－Ｃｙ７（ＭｑＰ９、ＢＤ）、ＣＤ１９－ＡＰＣ（ＨＩＢ１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＣＤ３－ＡＰＣ－Ｈ７（ＳＫ７、ＢＤ）に対する抗体で細胞を染色した。
免疫蛍光染色
組織をＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｕ．Ｓ．Ａ．）に包埋し、液体窒素中で急速凍結した。凍結切片を６μｍで切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔを加えたスライド上で風乾し、冷アセトンで５分間固定した。まず、０．０３％ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で組織切片を１５分間処置した後、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ＢｕｓｔｅｒおよびＦｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋ（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処置した。次いで、ヒトＣＤ３に対するモノクローナル抗体（ＵＣＨＴ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｃに対するモノクローナル抗体（Ｓ－ＨＣＬ－３、ＢＤ）、ＨＬＡ－Ａ２に対するモノクローナル抗体（ＢＢ７．２、ＢＤ）、ＨＬＡ－ＤＲに対するモノクローナル抗体（Ｌ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または汎サイトケラチンに対するモノクローナル抗体（ＡＥ１／ＡＥ３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、切片を室温で１時間染色した後、アイソタイプ特異的な二次抗体で、室温で３０分間染色した。それぞれのアイソタイプ抗体を対照として使用した。最後に、１μｇ／ｍｌの４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で切片を対比染色し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を載せ、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳ ＡＦ２．０ソフトウェアを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡またはＺＥＮソフトウェアを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ蛍光顕微鏡を使用して可視化した。
統計解析
統計解析は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）で行う。任意の２つの群間の比較は、マン・ホイットニー検定または両側ｔ検定を使用して解析する。任意の３またはそれを超える群間の比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって解析する。
表１．マウス遺伝子型のためのプライマーのリスト。
配列
配列番号１、Ｆｌｔ３ｅｍ１Ａｋｐ
配列番号２、マウスＦｌｔ３に対するｇＲＮＡ、５’－ＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡ－３’
配列番号３～４、５’－ＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＣ－３’（配列番号３）および５’－ＡＴＣＣＣＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ－３’（配列番号４）を含むマウスＦｌｔ３に対するＰＣＲプライマー
参考文献
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み入れられ、一部の事例では文書全体を包含し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、反対の意味が明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
そうでないことが明確に示されていない限り、１より多くの工程または行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、その方法の工程または行為の順序は、その方法の工程または行為が記述されている順序に必ずしも限定されないことも理解されたい。
特許請求の範囲および上記の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などのすべての移行句は、非限定的である、すなわち、含むが限定されないことを意味すると理解されるべきである。米国特許庁特許審査便覧セクション２１１１．０３に記載されているように、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句のみが、それぞれ限定的または準限定的な移行句であるものとする。
数値の前の「約」および「実質的に」という用語は、記載された数値の±１０％を意味する。
値の範囲が提供されている場合、その範囲の上端と下端の間およびその範囲の上端と下端を含む各値が本明細書において具体的に企図され、記載される。

Claims (25)

  1. 非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスであって、
    不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子と；
    不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子と；
    不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と；
    ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸と；
    ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸と；
    ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をコードする核酸と；
    ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子のＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）とマウスＨ２－Ｄｂのα３細胞質および膜貫通ドメイン（ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）とをコードする核酸と
    を含む、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス。
  2. 前記マウスが、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と；ヒトＩＬ３をコードする核酸と；ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸と；ヒトＳＣＦをコードする核酸と；ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍをコードする核酸とを含むＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ）マウスである、請求項１に記載のマウス。
  3. 前記ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍをコードする核酸が、ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍをコードする導入遺伝子を含む、請求項１または２に記載のマウス。
  4. 前記マウスが、前記ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍをコードする導入遺伝子を発現する、請求項１～３のいずれか一項に記載のマウス。
  5. 骨髄マウスＣＤ４５＋細胞が、４週齢において、検出可能なレベルのＨＬＡ－Ａ２を発現する、請求項１～４のいずれか一項に記載のマウス。
  6. 前記マウスが放射線照射されており、ヒト造血前駆細胞（ＨＰＣ）を移植されており、および前記ヒトＨＰＣがヒトＣＤ４５＋細胞として移植する、請求項１～５のいずれか一項に記載のマウス。
  7. 前記ヒトＨＰＣが、胎児肝臓、臍帯血または骨髄からのものであり、前記マウス中の前記移植されたヒトＣＤ４５＋細胞が、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３３＋骨髄系細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞の混合された集団を含む、請求項６に記載のマウス。
  8. 前記ヒトＨＰＣが、胎児肝臓、臍帯血または骨髄からのものであり、前記マウスの肺組織が、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞を含む、請求項６に記載のマウス。
  9. 前記ヒトＨＰＣがＨＬＡ－Ａ２＋であり、前記マウスがＨＬＡ－Ａ２＋マウス胸腺上皮細胞を含む、請求項６に記載のマウス。
  10. 不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と、ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸と、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸と、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をコードする核酸とを含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウス中に、ＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍをコードする導入遺伝子を導入することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
  11. ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸と、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸と、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をコードする核酸と、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子とを含むＮＳＧ－ＳＧＭ３Ｆマウスを、前記ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子の前記ＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）と前記マウスＨ２－Ｄｂの前記α３、細胞質および膜貫通ドメインとをコードする導入遺伝子を含むＮＳＧ－ＨＬＡ－Ａ２／ＨＨＤマウスと交雑させることを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
  12. （ａ）ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ遺伝的背景と、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子と、ヒトＩＬ３をコードする核酸と、ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸と、ヒトＳＣＦをコードする核酸とを有するファウンダーマウスを発生させることと；
    （ｂ）Ｆ１子孫マウスを作製するために、前記ファウンダーマウスを、前記ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子の前記ＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）と前記マウスＨ２－Ｄｂの前記α３細胞質および膜貫通ドメインをコードする導入遺伝子を含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスに交配させることと；
    （ｃ）前記不活性化されたＦｌｔ３対立遺伝子と、ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸と、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸と、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をコードする核酸と、前記ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子の前記ＭＨＣクラス１、α１およびα２結合ドメインに共有結合されたヒトＢ２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）（Ｂ２Ｍ）と前記マウスＨ２－Ｄｂの前記α３、細胞質および膜貫通ドメインとをコードする導入遺伝子とについてホモ接合であるＦ２子孫マウスを作製するために、前記Ｆ１子孫マウスを同系交配することと；
    を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
  13. 子孫マウスを作製するために、Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌについてホモ接合であり、Ｆｌｔ３ｅｍ１Ａｋｐについてホモ接合であり、Ｉｌ－３についてホモ接合であり、ＧＭ－ＣＳＦについてホモ接合であり、ＳＣＦについてホモ接合であり、およびＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍをコードする導入遺伝子についてホモ接合である雌マウスを、Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｘ連鎖Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌについてヘミ接合であり、Ｆｌｔ３ｅｍ１Ａｋｐについてホモ接合であり、Ｉｌ－３についてホモ接合であり、ＧＭ－ＣＳＦについてホモ接合であり、ＳＣＦについてホモ接合であり、およびＨＬＡ－Ａ２／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍをコードする導入遺伝子についてホモ接合である雄マウスと交配させることを含む方法。
  14. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスから得られた細胞。
  15. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスから得られた細胞と同じ遺伝子型を有する細胞を含むマウス。
  16. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスの子孫マウス。
  17. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
  18. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスを繁殖させる方法。
  19. 子孫マウスを作製するために、先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスを第２のマウスと交配させることを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記第２のマウスが、先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスである、請求項１９に記載の方法。
  21. 放射線照射されたマウスを作製するために、先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスに致死量未満で放射線照射することを含む方法。
  22. 前記マウスにヒト造血前駆細胞（ＨＰＣ）を投与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記マウスに目的の作用物質を投与することをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 前記マウス中のヒト免疫細胞に対する前記作用物質の効果を評価することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ヒト免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージから選択される、請求項２４に記載の方法。
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