CN116064532A - 用于切割靶dna的组合物及其用途 - Google Patents

用于切割靶dna的组合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116064532A
CN116064532A CN202211116560.4A CN202211116560A CN116064532A CN 116064532 A CN116064532 A CN 116064532A CN 202211116560 A CN202211116560 A CN 202211116560A CN 116064532 A CN116064532 A CN 116064532A
Authority
CN
China
Prior art keywords
composition
dna
guide rna
crrna
plant cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211116560.4A
Other languages
English (en)
Inventor
金进秀
曹承于
金素贞
J·M·金
金爽中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toolgen Inc
Original Assignee
Toolgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50544909&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN116064532(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Toolgen Inc filed Critical Toolgen Inc
Publication of CN116064532A publication Critical patent/CN116064532A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin

Abstract

本发明涉及真核细胞或生物体中的靶向基因组编辑。更具体地，本发明涉及用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物及其用途，所述组合物包含特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。

Description

用于切割靶DNA的组合物及其用途
本申请是申请日为2013年10月23日的、发明名称为“用于切割靶DNA的组合物及其用途”的中国专利申请CN 201910950792.1的分案申请。
技术领域
本发明涉及真核细胞或生物体中的靶向基因组编辑。更具体地说，本发明涉及一种用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物及其用途，所述组合物包括特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
背景技术
CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是含有多个短同向重复的基因座，其被发现存在于约40％测序细菌的基因组中和90％测序古细菌的基因组中。CRISPR作为原核的免疫系统发挥功能，其赋予对外来遗传元件例如质粒和噬菌体的抵抗性。CRISPR系统提供了一种获得性免疫形式。外源DNA的短片段(称为间隔区)整合在CRISPR重复序列之间的基因组中，作为过去暴露的记忆。然后CRISPR间隔区以类似于真核生物中RNAi的方式用于识别和沉默外来遗传元件。
Cas9，II型CRISPR/Cas系统中一种重要的蛋白质成分，当与称为CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的两个RNA复合时，形成活性核酸内切酶，从而切断入侵噬菌体或质粒中的外源遗传元件，以保护宿主细胞。crRNA从宿主基因组中的CRISPR元件转录，其中该CRISPR元件之前自外源入侵物捕获。最近，Jinek等(1)证明，通过融合crRNA和tracrRNA的必要部分产生的单链嵌合RNA可以取代Cas9/RNA复合体中的两个RNA以形成功能性核酸内切酶。
CRISPR/Cas系统相对于锌指和转录激活因子样效应物DNA结合蛋白提供了优势——因为在核苷酸结合CRISPR-Cas蛋白中的位点特异性由RNA分子调控而不是DNA结合蛋白调控(这在设计和合成上是更具挑战性的)。
然而，到现在为止，尚未开发出使用基于CRISPR/Cas系统的RNA向导核酸内切酶(RGEN)的基因组编辑方法。
同时，限制性片段长度多态性(RFLP)是最古老，最方便，和最便宜的基因分型方法之一，其仍然广泛应用于分子生物学和遗传学，但其往往受限于缺乏适当的限制性内切酶识别位点。
可以通过各种方法检测由工程化核酸酶诱导的突变，其中包括错配敏感的T7核酸内切酶I(T7E1)或Surveyor核酸酶测定法，RFLP，荧光PCR产物的毛细管电泳，双脱氧测序和深度测序。T7E1和Surveyor测定法广泛使用，但很繁琐。此外，这些酶倾向于低估突变频率，这是因为突变序列可彼此形成同源双链，从而不能从野生型细胞中区分纯合双等位基因突变体克隆。RFLP没有这些限制，因而是首选的方法。实际上，RFLP是检测细胞和动物中由工程化核酸酶介导的突变的最早方法之一。然而，不幸的是，RFLP受限于适当限制性位点的可得性。在所关注的靶位点有可能没有限制性位点。
发明内容
技术问题
到现在为止，尚未开发使用基于CRISPR/Cas系统的RNA向导核酸内切酶(RGEN)进行基因组编辑和基因分型的方法。
在这种情况下，本发明人进行了大量努力来开发基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑方法，最终建立了一个可程序化的RNA向导核酸内切酶，该RNA向导核酸内切酶可以在真核细胞和生物体中以靶向方式切割DNA。
另外，本发明人进行了大量努力，开发一种新的在RFLP分析中利用RNA向导核酸内切酶(RGEN)的方法。其利用RGEN，对癌症中发现的以及细胞和生物体中由工程化核酸酶(包括RGEN自身)诱导的频发突变进行基因分型，从而完成了本发明。
技术方案
本发明的一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的组合物，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的试剂盒，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的试剂盒，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的再一目的是提供一种制备含有Cas蛋白质和向导RNA的真核细胞或生物体的方法，所述方法包括用Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质以及向导RNA或编码向导RNA的DNA共转染或顺序转染真核细胞或生物体的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种真核细胞或生物体，其含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的方法，所述方法包括步骤：用组合物转染含有靶DNA的真核细胞或生物体，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的方法，所述方法包括步骤：用组合物处理真核细胞或生物体，其中所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的再一个目的是提供胚胎、基因组修饰的动物或基因组修饰的植物，其包括由组合物编辑的基因组，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种制备基因组修饰的动物的方法，所述方法包括步骤：将含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质的组合物，引入动物胚胎中；和将胚胎转移到假孕代母的输卵管中，以产生基因组修饰的动物。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异，所述组合物包含特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种使用RNA向导核酸内切酶(RGEN)对细胞中由工程化的核酸酶诱导的突变或天然存在的突变或变异进行基因分型的方法，其中所述RGEN包含特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供对细胞中由工程化的核酸酶诱导的突变或天然存在的突变或变异进行基因分型的试剂盒，所述试剂盒含有RNA向导核酸内切酶(RGEN)，其中所述RGEN含有特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质。
本发明的一个目的是提供在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的组合物，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供在真核细胞或生物体中切割靶DNA的试剂盒，所述试剂盒含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的试剂盒，所述试剂盒含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一目的是提供制备含有Cas蛋白质和向导RNA的真核细胞或生物体的方法，所述方法包括用Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质以及向导RNA或编码向导RNA的DNA共转染或顺序转染真核细胞或生物体的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种真核细胞或生物体，其含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的方法，所述方法包括用组合物转染含有靶DNA的真核细胞或生物体的步骤，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的方法，所述方法包括用组合物处理真核细胞或生物体的步骤，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供胚胎、基因组修饰的动物、或基因组修饰的植物，其包含由组合物编辑的基因组，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种制备基因组修饰的动物的方法，所述方法包括步骤：将含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质的组合物，引入动物胚胎中；和将胚胎转移到假孕代母的输卵管，以产生基因组修饰的动物。
本发明的另一个目的是提供在分离的生物样品中基因分型突变或变异的组合物，所述组合物含有特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供在分离的生物样品中对病原微生物的核酸序列进行基因分型的组合物，所述组合物含有特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种在分离的生物样品中基因分型突变或变异的试剂盒，所述试剂盒含有组合物，特别地含有RNA向导核酸内切酶(RGEN)，其中，所述RGEN包含特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质。
本发明的另一个目的是提供在分离的生物样品中基因分型突变或变异的方法，该方法使用组合物，特别地所述组合物包含RNA向导核酸内切酶(RGEN)，其中，所述RGEN包含特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质。
有益效果
包含特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质的用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA或诱导靶向诱变的本发明组合物、包含所述组合物的本发明试剂盒、以及诱导靶向诱变的本发明方法，提供了新的方便的基因组编辑工具。另外，因为可以设计定制RGEN以靶向任何DNA序列，所以几乎任何单核苷酸多态性或小的插入/缺失(indel)均可以通过RGEN介导的RFLP进行分析，因此，本发明的组合物和方法可以用于检测和切割天然存在的变异和突变。
附图简述
图1显示Cas9催化的体外质粒DNA切割。(a)靶DNA和嵌合RNA序列的示意图。红色三角指示切割位点。Cas9识别的PAM序列以粗体显示。向导RNA中源自crRNA和tracrRNA的序列分别以框和下划线显示。(b)Cas9体外切割质粒DNA。完整的环状质粒或ApaLI消化的质粒与Cas9和向导RNA孵育。
图2显示Cas9在附加体(episomal)靶位点诱导的诱变。(a)使用RFP-GFP报告分子的基于细胞测定法的概略示意图。因为GFP序列在读框外融合至RFP序列，故GFP不从该报告分子表达。只有当两个序列之间的靶位点被位点特异性核酸酶切割后，RFP-GFP融合蛋白才表达。(b)转染了Cas9的细胞的流式细胞术。显示表达RFP-GFP融合蛋白的细胞的百分比。
图3显示在内源染色体位点上由RGEN驱动的突变。(a)CCR5基因座。(b)C4BPB基因座。(顶部)使用T7E1测定法检测RGEN驱动的突变。箭头指示由T7E1切割的DNA条带的预期位置。通过测量条带强度，计算突变频率(Indel(％))。(底部)CCR5和C4BPB野生型(WT)和突变克隆的DNA序列。互补于向导RNA的靶序列区域示于框中(in boc)。PAM序列以粗体显示。三角形指示切割位点。对应于微同源性(microhomologies)的碱基加下划线。右手列显示插入或缺失碱基的数目。
图4显示不能检测到RGEN驱动的脱靶(off-target)突变。(a)标靶(On-target)序列和潜在的脱靶序列。在硅片上搜索人类基因组，以寻找潜在的脱靶位点。鉴定了四个位点，其中每个携带3个碱基的与CCR5标靶位点的错配。错配碱基加下划线。(b)使用T7E1测定法调查这些位点是否在转染Cas9/RNA复合体的细胞中发生突变。在这些位点没有检测到突变。N/A(不适用)，基因间位点。(c)Cas9没有诱导脱靶相关的染色体缺失。在人细胞中表达CCR5特异的RGEN和ZFN。使用PCR检测在这些细胞中15-kb染色体缺失的诱导。
图5显示小鼠中RGEN诱导的Foxn1基因打靶。(a)描绘了特异于小鼠Foxn1基因外显子2的sgRNA的示意图。外显子2中的PAM表示为红色，sgRNA中互补于外显子2的序列加下划线。三角形指示切割位点。(b)代表性的T7E1测定，表明通过胞质内注射而递送至一细胞阶段的小鼠胚胎中的Cas9 mRNA+Foxn1特异性sgRNA的基因打靶效率。数字指示由最高剂量产生的独立建立者小鼠。箭头指示由T7E1切割的条带。(c)b中鉴定的三个Foxn1突变建立者小鼠中观察到的突变等位基因的DNA序列。发生数显示在括号中。(d)对Foxn1建立者小鼠#108和野生型FVB/NTac杂交产生的F1后代进行的PCR基因分型。注意，存在于Foxn1建立者小鼠#108中的突变等位基因在后代中分离。
图6显示通过胞质内注射Cas9 mRNA和Foxn1-sgRNA在小鼠胚胎中的Foxn1基因打靶。(a)代表性T7E1测定的结果，其监测注射最高剂量后的突变率。箭头指示由T7E1切割的条带。(b)T7E1检测结果总结。显示在胞质内注射所示剂量RGEN后获得的体外培养胚胎中的突变体分数。(c)从T7E1阳性突变胚胎子集鉴定的Foxn1突变等位基因的DNA序列。野生型等位基因的靶序列表示在框内。
图7显示使用重组Cas9蛋白质:Foxn1-sgRNA复合体在小鼠胚胎中的Foxn1基因打靶。(a)和(b)是代表性T7E1测定结果和其总结。胚胎进行原核(a)或胞质内注射(b)后体外培养。红色数字表示T7E1阳性突变建立者小鼠。(c)从体外培养的胚胎鉴定的Foxn1突变等位基因的DNA序列，该胚胎通过以最高剂量原核注射重组Cas9蛋白质：Foxn1-sgRNA复合体获得。野生型等位基因的靶序列表示在框内。
图8显示在Foxn1突变建立者#12中发现的突变等位基因的种系传播。(a)fPCR分析。(b)PCR基因分型野生型FVB/NTac、建立者小鼠和他们的F1后代。
图9显示通过杂交Prkdc突变建立者小鼠产生的胚胎的基因型。Prkdc突变建立者小鼠
Figure BDA0003845556540000081
和♀15杂交并分离E13.5胚胎。(a)fPCR分析野生型，建立者小鼠
Figure BDA0003845556540000082
建立者小鼠♀15。需要注意的是，由于fPCR分析的技术局限性，这些结果显示出与突变等位基因的精确序列有微小差别；例如，从序列分析，在建立者小鼠
Figure BDA0003845556540000083
和♀15中分别鉴定了Δ269/Δ61/WT和Δ5+1/+7/+12/WT。(b)产生的胚胎的基因型。
图10显示Cas9蛋白质/sgRNA复合体诱导的靶向突变。
图11表示重组Cas9蛋白质在拟南芥原生质体中诱导的突变。
图12表示重组Cas9蛋白质在拟南芥BRI1基因中诱导的突变序列。
图13显示T7E1测定，其表明在293细胞中通过Cas9-mal-9R4L和sgRNA/C9R4LC复合体处理破坏内源性CCR5基因。
图14(a，b)显示Fu等(2013)报道的RGEN在标靶位点和脱靶位点上的突变频率。T7E1测定分析了来自K562细胞的基因组DNA，所述K562细胞顺序转染了20μg Cas9编码质粒和分别为60μg和120μg的体外转录的GX19 crRNA和tracrRNA(1×106个细胞)(R)，或共转染了1μgCas9编码质粒和1μg GX19 sgRNA表达质粒(2×105个细胞)(D)。
图15(a，b)显示向导RNA结构的比较。使用T7E1测定法，测量了标靶和脱靶位点上的Fu等(2013)报道的RGEN的突变频率。K562细胞共转染了Cas9编码质粒和编码GX19 sgRNA或GGX20 sgRNA的质粒。脱靶位点(OT1-3等)如Fu等(2013)中标记。
图16显示Cas9切口酶在体外DNA切割。(a)Cas9核酸酶和配对的Cas9切口酶的示意图概略。PAM序列和切割位点显示在框中。(b)人类AAVS1基因座中的靶位点。每个靶位点的位置以三角形表示。(c)DNA切割反应的示意图概略。FAM染料(示于框内)连接至DNA底物的两个5'末端。(d)使用荧光毛细管电泳分析DSB和SSB。荧光标记的DNA底物在电泳前与Cas9核酸酶或切口酶孵育。
图17显示Cas9核酸酶和切口酶的行为比较。(a)与Cas9核酸酶(WT)、切口酶(D10A)、和配对切口酶相关的标靶突变频率。显示产生5'突出端或3'突出端的配对切口酶。(b)Cas9核酸酶和配对切口酶的脱靶效应分析。分析了三个sgRNA的总共7个潜在的脱靶位点。
图18显示在其他内源性人基因座测试的配对Cas9切口酶。(a，c)在人CCR5和BRCA2基因座上的sgRNA靶位点。PAM序列显示为红色。(b，d)通过T7E1测定法检测每个靶位点上的基因组编辑活性。产生5'突出端的两个缺口的修复比产生3'突出端的两个缺口的修复导致了频繁得多的indel形成。
图19显示配对Cas9切口酶介导同源重组。(a)检测同源重组的策略。供体DNA包括两个同源臂之间的XbaI限制性酶切位点，而内源性靶位点缺乏这个限制性酶切位点。PCR测定法用来检测已经进行同源重组的序列。为了防止污染供体DNA的扩增，使用对基因组DNA特异的引物。(b)同源重组的效率。只有发生了同源重组的区域的扩增子可以用XbaI消化；切割条带的强度被用来测量该方法的效率。
图20显示由配对Cas9切口酶诱导的DNA拼接。(a)人AAVS1基因座中配对切口酶的靶位点。示出了AS2位点和其他各位点之间的距离。箭头指示PCR引物。(b)用PCR检测基因组缺失。星号表示缺失特异的PCR产物。(c)使用AS2和L1 sgRNA获得的缺失特异性PCR产物的DNA序列。靶位点PAM序列显示在框内，sgRNA匹配序列以大写字母表示。完整的sgRNA匹配序列带下划线。(d)配对Cas9切口酶介导的染色体缺失的示意模型。新合成的DNA链示于框中。
图21显示配对Cas9切口酶不诱导易位。(a)标靶位点和脱靶位点之间染色体易位的示意图概略。(b)PCR扩增以检测染色体易位。(c)由Cas9核酸酶而不是由切口酶对诱导的易位。
图22显示T7E1和RFLP测定法的概念图。(a)二倍体细胞中工程化的核酸酶处理后四个可能的情况中测定切割反应的比较：(A)野生型，(B)单等位基因突变，(C)不同的双等位基因突变(杂合)，和(D)相同的双等位基因突变(纯合)。黑线代表源自每个等位基因的PCR产物；短虚线框和点框指示由NHEJ产生的插入/缺失突变。(b)由电泳解析的T7E1和RGEN消化物的预期结果。
图23示出含有C4BPB靶位点(带有indel)的线性化质粒的体外切割测定。各质粒底物的DNA序列(上图)。PAM序列加下划线。插入碱基显示在框中。箭头(下图)指示用野生型特异的RGEN切割的DNA条带在电泳后的预期位置。
图24显示通过RGEN介导的RFLP对细胞中由工程化的核酸酶诱导的突变进行的基因分型。(a)C4BPB突变体K562细胞克隆的基因型。(b)比较错配敏感性T7E1测定法与RGEN介导的RFLP分析。黑色箭头指示通过T7E1酶或RGEN处理的切割产物。
图25显示通过RGEN-RFLP技术基因分型RGEN诱导的突变。(a)使用RGEN-RFLP和T7E1测定法分析C4BPB破坏的克隆。箭头指示RGEN或T7E1切割的DNA条带的预期位置。(b)定量比较RGEN-RFLP分析与T7E1测定法。以不同比例混合来自野生型和C4BPB破坏的K562细胞的基因组DNA样品，并进行PCR扩增。(c)用RFLP和T7E1测定法对HeLa细胞中HLA-B基因中RGEN诱导的突变进行的基因分型。
图26显示通过RGEN介导的RFLP对生物体中由工程化的核酸酶诱导的突变进行的基因分型。(a)Pibf1突变体建立者小鼠的基因型。(b)比较错配敏感性T7E1测定法与RGEN介导的RFLP分析。黑色箭头指示T7E1酶或RGEN处理的切割产物。
图27显示对ZFN诱导的突变进行RGEN介导的基因分型。ZFN靶位点示于框中。黑色箭头指示由T7E1切割的DNA条带。
图28显示在人HLA-B基因区域中的多态性位点。包围RGEN靶位点的序列，是来自HeLa细胞的PCR扩增子的序列。多态性位置显示在框中。RGEN靶位点和PAM序列分别示于虚线框和粗体框中。引物序列加下划线。
图29显示通过RGEN-RFLP分析致癌突变的基因分型。(a)通过RGEN检测HCT116细胞中人CTNNB1基因中的频发突变(TCT的c.133-135缺失)。HeLa细胞用作阴性对照。(b)用包含错配向导RNA的RGEN在A549癌细胞系中基因分型KRAS取代突变(c.34G>A)。错配的核苷酸示于框中。HeLa细胞用作阴性对照。箭头表示RGEN切割的DNA条带。示出通过Sanger测序证实的DNA序列。
图30显示通过RGEN-RFLP分析在HEK293T细胞中基因分型CCR5delta32等位基因。(a)细胞系的RGEN-RFLP测定。K562，SKBR3和HeLa细胞被用作野生型对照。箭头指示RGEN切割的DNA条带。(b)野生型和delta32 CCR5等位基因的DNA序列。在RFLP分析中使用的RGEN的标靶和脱靶位点加下划线。两个位点之间的单核苷酸错配显示在框中。PAM序列加下划线。(c)使用野生型特异的RGEN在体外切割携带WT或del32 CCR5等位基因的质粒。(d)确认在CCR5基因座上存在CCR5-delta32特异的RGEN的脱靶位点。使用各种量的del32特异的RGEN对带有标靶序列或脱靶序列的质粒进行体外切割测定。
图31显示KRAS点突变(c.34G>A)的基因分型。(a)癌细胞系中KRAS突变(c.34G>A)的RGEN-RFLP分析。用具有特异于野生型序列或突变序列的完美匹配的crRNA的RGEN，消化来自HeLa细胞(用作野生型对照)或A549细胞(点突变纯合)的PCR产物。在这些细胞中KRAS基因型通过Sanger测序证实。(b)使用带有完美匹配的crRNA或减弱的单碱基错配的crRNA的RGEN消化质粒(其携带野生型或突变的KRAS序列)。被选择用于基因分型的减弱的crRNA在凝胶上方的框中标出。
图32显示PIK3CA点突变(c.3140A>G)基因分型。(a)癌细胞系中PIK3CA突变(c.3140A>G)的RGEN-RFLP分析。用具有特异于野生型序列或突变序列的完美匹配的crRNA的RGEN，消化来自HeLa细胞(用作野生型对照)或HCT116细胞(杂合点突变)的PCR产物。在这些细胞中PIK3CA基因型通过Sanger测序证实。(b)使用带有完美匹配的crRNA或减弱的单碱基错配的crRNA的RGEN，消化携带野生型或突变PIK3CA序列的质粒。被选择用于基因分型的减弱的crRNA在凝胶上方的框中标出。
图33显示在癌细胞系中频发点突变的基因分型。RGEN-RFLP测定在(a)IDH(c.394c>T)，(b)PIK3CA(c.3140A>G)，(c)NRAS(c.181C>A)，和(d)BRAF基因(c.1799T>A)中的频发致癌点突变。显示用Sanger测序证实的每个细胞系的基因型。错配核苷酸示于框中。黑色箭头指示由RGEN切割的DNA条带。
优选实施方式
根据本发明的一个方面，本发明提供了用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA、和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。另外，本发明提供该组合物用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA的用途，所述组合物包括特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA、和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
在本发明中，该组合物也被称为RNA向导核酸内切酶(RGEN)组合物。
ZFN和TALEN能够在哺乳动物细胞，模式生物，植物和家畜中实现靶向诱变，但用各核酸酶得到的突变频率彼此大不相同。此外，一些ZFN和TALEN不显示任何基因组编辑活性。DNA甲基化可能会限制这些工程化的核酸酶与靶位点结合。此外，产生定制核酸酶在技术上是富于挑战且费时的。
本发明人已开发了基于Cas蛋白质的新的RNA向导核酸内切酶组合物，以克服ZFN和TALEN的缺点。
在本发明之前，Cas蛋白质的核酸内切酶活性是已知的。然而，由于真核基因组的复杂性，并不知道Cas蛋白质的核酸内切酶活性是否会在真核细胞中起作用。此外，到现在为止，还没有开发在真核细胞或生物体中切割靶DNA的包含Cas蛋白质或Cas蛋白编码核酸和特异于靶DNA的向导RNA的组合物。
相比ZFN和TALEN，基于Cas蛋白质的本发明RGEN组合物可以更容易地定制，这是因为：为产生新的基因组编辑核酸酶，可以仅替换合成的向导RNA成分。不涉及亚克隆步骤来产生定制RNA向导核酸内切酶。此外，与一对TALEN基因(～6kbp)相比，Cas基因相对小的尺寸(例如，Cas9为4.2kbp)在一些应用(如病毒介导的基因递送)中为该RNA向导核酸内切酶组合物提供了优点。另外，该RNA向导核酸内切酶没有脱靶效应，因此不引起不需要的突变、缺失、倒位和重复。这些特性使本发明的RNA向导核酸内切酶组合物成为在真核细胞和生物体中进行基因组工程化的一种可扩展的通用方便工具。另外，RGEN可以设计成靶向任何DNA序列，几乎任何单核苷酸多态性或小的插入/缺失(indel)均可以通过RGEN介导的RFLP进行分析。RGEN的特异性由RNA成分和Cas9蛋白质决定，其中所述RNA成分与长度不超过20个碱基对(bp)的靶DNA序列杂交，所述Cas9蛋白质识别原间隔区邻近基序(protospacer-adjacent motif(PAM))。通过替换RNA成分可以容易地重新编程RGEN。因此，RGEN提供了一个将简单稳靠的RFLP分析用于各种序列变异的平台。
靶DNA可以是内源性DNA或人工DNA，优选内源性DNA。
如本文所用，术语“Cas蛋白”指CRISPR/CAS系统中的必要蛋白质成分，当与称为CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的2个RNA复合时Cas蛋白形成活性核酸内切酶或切口酶。
Cas基因和蛋白质的信息可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank中获得，没有限制。
编码Cas蛋白质的CRISPR相关(cas)基因通常与CRISPR重复序列-间隔区阵列相关。已经描述了多于四十个不同的Cas蛋白质家族。在这些蛋白质家族中，Cas1似乎遍布各种不同的CRISPR/CAS系统中。有三种类型CRISPR-Cas系统。其中，涉及Cas9蛋白质和crRNA和tracrRNA的II型CRISPR/Cas系统是代表性的，是众所周知的。cas基因和重复结构的特定组合被用来定义8种CRISPR亚型(Ecoli，Ypest，Nmeni，Dvulg，Tneap，Hmari，Apern和Mtube)。
Cas蛋白质可以连接到蛋白质转导结构域。蛋白质转导结构域可以是聚精氨酸或源自HIV的TAT蛋白，但不限于此。
本发明组合物可包含蛋白质形式或编码Cas蛋白质的核酸形式的Cas成分。
在本发明中，Cas蛋白质可以是任何Cas蛋白质，只要当其与向导RNA复合时具有核酸内切酶或切口酶活性即可。
优选地，Cas蛋白质是Cas9蛋白质或其变体。
Cas9蛋白质的变体可以是Cas9的突变体形式，其中催化性天冬氨酸残基改变为任何其它氨基酸。优选地，所述其它氨基酸可以是丙氨酸，但不限于此。
此外，Cas蛋白质可以是从生物体如链球菌属物种(Streptococcus sp.)，优选化脓性链球菌(Streptococcus pyogens)中分离的蛋白质、或重组蛋白质，但并不限于此。
源自化脓性链球菌的Cas蛋白质可识别NGG三核苷酸。Cas蛋白质可包括SEQ IDNO：109的氨基酸序列，但不限于此。
术语“重组”，当用于例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质、或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或该细胞源自此修饰的细胞。因此，例如，可以通过使用人密码子表重构Cas蛋白质编码序列而产生重组Cas蛋白质。
就本发明而言，Cas蛋白质编码核酸可以是载体形式，如包含在启动子如CMV或CAG下的Cas编码序列的质粒。当Cas蛋白质是Cas9时，Cas9编码序列可源自链球菌属，优选源自化脓性链球菌。例如，Cas9编码核酸可以包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。此外，Cas9编码核酸可包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少50％同源性的核苷酸序列，优选与SEQ ID NO：1具有至少60，70，80，90，95，97，98，或99％的同源性，但不限于此。Cas9编码核酸可以包含SEQID NOs.108、110，106或107的核苷酸序列。
如本文所用，术语“向导RNA”指的是特异于靶DNA的RNA，其可以与Cas蛋白质形成复合体并把Cas蛋白质带至靶DNA。
在本发明中，向导RNA可以由两个RNA，即CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)组成，或者向导RNA可以是通过融合crRNA和tracrRNA的必要部分而产生的单链RNA(sgRNA)。
向导RNA可以是包含crRNA和tracrRNA的双重RNA(dualRNA)。
如果向导RNA包含crRNA和tracrRNA的必要部分和互补于靶的部分，则任何向导RNA都可以在本发明中使用。
所述crRNA可与靶DNA杂交。
RGEN可由Cas蛋白质和dualRNA(不变的tracrRNA和靶特异性crRNA)组成，或由Cas蛋白质和sgRNA(不变的tracrRNA和靶特异性crRNA的必要部分的融合物)组成，并且可以通过替换crRNA而容易地重新编程。
向导RNA可以在单链向导RNA或dualRNA的crRNA的5'末端还包含一个或多个附加的核苷酸。
优选，向导RNA可以在单链向导RNA或dualRNA的crRNA的5'末端还包含2个附加的鸟嘌呤核苷酸。
向导RNA可以以编码该向导RNA的RNA或DNA的形式转移到细胞或生物体中。向导RNA可以是分离的RNA、并入病毒载体的RNA的形式、或者在载体中编码。优选地，载体可以是病毒载体、质粒载体、或农杆菌载体，但不限于此。
编码向导RNA的DNA可以是包含编码向导RNA序列的载体。例如，可以通过用分离的向导RNA或包含编码向导RNA的序列和启动子的质粒DNA转染细胞或生物体，将向导RNA转染到细胞或生物体。
可替代地，可以使用病毒介导的基因递送，将向导RNA转移到细胞或生物体。
当向导RNA以分离RNA的形式转染细胞或生物体时，可使用本领域中已知的任何体外转录系统通过体外转录来制备向导RNA。向导RNA优选以分离RNA的形式，而不是以包含向导RNA的编码序列的质粒的形式，转移到细胞。如本文所用，术语“分离RNA”可与“裸露的RNA”互换使用。因为不需要克隆步骤，这能节省成本和时间。然而，不排除使用质粒DNA或病毒介导的基因传递来转染向导RNA。
由于向导RNA对靶的特异性和Cas蛋白质的核酸内切酶或切口酶活性，本发明的包含Cas蛋白质或Cas蛋白质编码核酸和向导RNA的RGEN组合物可特异地切割靶DNA。
如本文所用，术语“切割”是指核苷酸分子共价骨架的断裂。
在本发明中，向导RNA可以制备为特异于任何待切割的靶。因此，本发明的RGEN组合物可以通过操作或基因分型向导RNA的靶特异性部分，切割任何靶DNA。
向导RNA和Cas蛋白质可以以对子(pair)发挥作用。如本文所用，术语“配对Cas切口酶”可以指以对子发挥作用的向导RNA和Cas蛋白质。该对子(pair)包括两个向导RNA。向导RNA和Cas蛋白质可以以对子发挥作用，在不同DNA链上诱导两个缺口。这两个缺口可以分开至少100个bps，但不限于此。
在实施例中，本发明人证实，配对Cas切口酶允许在人类细胞中实现靶向诱变和高达1-kbp的染色体片段的大缺失。重要的是，配对切口酶不在脱靶位点诱导indel，而其相应的核酸酶在脱靶位点处诱导突变。此外，不同于核酸酶，配对切口酶不促进与脱靶DNA切割相关的不需要的易位。原则上，配对切口酶使Cas9介导的诱变的特异性加倍，可以扩大RNA向导酶在需要精确基因组编辑的应用(如基因和细胞治疗)中的用途。
在本发明中，组合物可用于体外对真核细胞或生物体的基因组作基因分型。
在一个具体的实施方案中，向导RNA可以包含SEQ ID.No.1的核苷酸序列，其中的核苷酸位置3～22的部分为靶特异性部分，因此，该部分的序列可以根据靶而改变。
如本文所使用的，没有限制地，真核细胞或生物体可以是酵母、真菌、原生动物、植物、高等植物、和昆虫、或两栖动物细胞、或哺乳动物细胞例如CHO、HeLa、HEK293和COS-1，例如，培养的细胞(体外)、移植细胞和原代细胞培养物(体外和离体)、和体内细胞，以及本领域中通常使用的哺乳动物细胞，包括人类细胞。
在一个具体的实施方案中，发现Cas9蛋白质/单链向导RNA可以在体外和在哺乳动物细胞中产生位点特异性DNA双链断裂，其自发修复以高频率诱导靶向基因组突变。
此外，发现，可通过向一细胞阶段的胚胎注射Cas9蛋白质/向导RNA复合体或Cas9mRNA/向导RNA诱导基因敲除小鼠，并可以通过Cas9/向导RNA系统生成种系可传递的突变。
使用Cas蛋白质而不是编码Cas蛋白质的核酸诱导靶向诱变是有利的，这是因为不向生物体中引入外源DNA。因此，包括Cas蛋白质和向导RNA的组合物可以用于开发治疗剂或增值农作物、家畜、家禽、鱼、宠物等。
根据本发明的另一个方面，本发明提供用于在真核细胞或生物体中诱导定向诱变的组合物，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。另外，本发明提供组合物用于在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的用途，所述组合物包含特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
向导RNA、Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质在以上描述。
根据本发明的另一个方面，本发明提供用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA或诱导靶向诱变的试剂盒，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA和Cas蛋白编码核酸或Cas蛋白质。
向导RNA，Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质在以上描述。
所述试剂盒可包括作为分开成分或作为一种组合物的向导RNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
本发明的试剂盒可以包含将向导RNA和Cas成分转移至细胞或生物体所必需的一些其它成分。例如，试剂盒可包括注射缓冲液如DEPC处理的注射缓冲液、以及分析靶DNA突变所必需的物质，但不限于此。
根据另一个方面，本发明提供制备包含Cas蛋白质和向导RNA的真核细胞或生物体的方法，所述方法包括用Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质和向导RNA或编码所述向导RNA的DNA共转染或顺序转染真核细胞或生物体的步骤。
向导RNA，Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质在以上描述。
在本发明中，Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质和向导RNA或编码该向导RNA的DNA，可以通过本领域中已知的各种方法转移到细胞中，如微注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖处理、脂转染、纳米颗粒介导的转染、蛋白质转导结构域介导的转导、病毒介导的基因递送、和PEG介导的原生质体转染，等等，但不限于此。另外，Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质和向导RNA可通过本领域中已知的各种施用基因或蛋白质的方法(如注射)而转移到生物体。Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质可以以与向导RNA复合体的形式，或单独地，被转移到细胞中。融合至蛋白质转导结构域(如Tat)的Cas蛋白质也可以被有效地递送到细胞中。
优选地，真核细胞或生物体被Cas9蛋白质和向导RNA共转染或顺序转染。
顺序转染可通过如下进行：用Cas蛋白质编码核酸进行第一转染，接着用裸向导RNA进行第二转染。优选地，第二转染在3，6，12，18，24小时之后，但并不限于此。
根据另一个方面，本发明提供真核细胞或生物体，其包含特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
可以通过将组合物转移至细胞或生物体中制备真核细胞或生物体，所述组合物包含特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
真核细胞可以是酵母、真菌、原生动物、高等植物、昆虫、或两栖动物细胞或哺乳动物细胞，例如CHO、HeLa、HEK293和COS-1，例如，培养的细胞(体外)、移植细胞和原代细胞培养物(在体外和离体)、和体内细胞，也可以是在本领域中通常使用的哺乳动物细胞，包括人类细胞，等等，没有限制。进一步地生物体可以是酵母、真菌、原生动物、植物、高等植物、昆虫、两栖动物、或哺乳动物。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA或诱导靶向诱变的方法，所述方法包括用组合物处理含有靶DNA的细胞或生物体的步骤，所述组合物包含特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
用组合物处理细胞或生物体的步骤可通过将本发明的组合物转移到细胞或生物体中进行，所述组合物包含特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白。
如上述，这种转移可以通过微注射、转染、电穿孔等等来进行。
根据本发明的另一个方面，本发明提供包含通过本发明RGEN组合物编辑的基因组的胚胎，所述RGEN组合物包含特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
任何胚胎均可以在本发明中使用，对于本发明，胚胎可以是小鼠胚胎。胚胎可通过如下产生：向4～7周雌性小鼠注射PMSG(孕母马血清促性腺激素)和hCG(人绒毛膜促性腺激素)，可以将超排卵雌性小鼠与雄性小鼠交配，并可从输卵管收集受精的胚胎。
引入胚胎的本发明RGEN组合物可通过Cas蛋白质作用来切割与向导RNA互补的靶DNA，引起靶DNA中的突变。因此，引入了本发明RGEN组合物的胚胎具有编辑的基因组。
在一个具体实施方案中，已发现，本发明RGEN组合物可导致小鼠胚胎突变，所述突变可以被传递给后代。
将RGEN组合物引入胚胎的方法可以是本领域已知的任何方法，如微注射、干细胞插入、逆转录病毒插入等等。优选，可使用微注射技术。
根据另一个方面，本发明提供通过将胚胎转移至动物输卵管而获得的基因组修饰动物，其中所述胚胎包含由本发明RGEN组合物编辑的基因组。
在本发明中，术语“基因组修饰动物”是指其基因组在胚胎阶段已被本发明RGEN组合物修饰的动物，动物的种类没有限制。
基因组修饰的动物具有通过基于本发明RGEN组合物的靶向诱变引起的突变。所述突变可以是缺失、插入、易位、倒位中的任一种。突变的位点取决于RGEN组合物的向导RNA序列。
具有基因突变的基因组修饰动物可用于确定该基因的功能。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了制备基因组修饰动物的方法，所述方法包括将本发明RGEN组合物(其包含特异于靶DNA的向导RNA或编码该向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质)引入动物胚胎的步骤；和将胚胎转移到假孕代母输卵管的步骤，以产生基因组修饰动物。
引入本发明RGEN组合物的步骤可通过本领域中已知的任何方法来完成，例如微注射、干细胞插入、逆转录病毒插入等等。
根据本发明的另一个方面，本发明提供从基因组修饰的原生质体再生的植物，所述原生质体通过用于产生含有RGEN组合物的真核细胞的方法制备。
根据本发明的另一个方面，本发明提供用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异的组合物，所述组合物含有特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白。另外，本发明提供用于在分离的生物样品中基因分型病原微生物的核酸序列的组合物，所述组合物包含特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
向导RNA、Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质在以上描述。
本文所用术语“基因分型”指的是“限制性片段长度多态性(RFLP)分析”。
RFLP可用于1)检测由工程化的核酸酶诱导的细胞或生物体中的indel，2)对细胞或生物体中天然存在的突变或变异进行基因分型，或3)对感染的病原微生物(包括病毒或细菌等)的DNA进行基因分型。
可通过工程化的核酸酶在细胞中诱导突变或变异。
工程化的核酸酶可以是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、或RGEN，但不限于此。
如本文所用术语“生物样品”包括进行分析的样品，如组织、细胞、全血、SEMM、血浆、唾液、痰、脑脊液或尿液，但并不限于此。
突变或变异可以是天然存在的突变或变异。
突变或变异由病原微生物引起。即，突变或变异由于病原微生物的感染而发生，当检测病原微生物时，该生物样品被鉴定为受感染。
病原微生物可以是病毒或细菌，但不限于此。
工程化核酸酶诱导的突变可通过各种方法检测，其中包括错配敏感的Surveyor或T7内切核酸酶I(T7E1)测定法、RFLP分析、荧光PCR、DNA熔解分析和Sanger和深度测序(deepsequencing)。T7E1和Surveyor测定法广泛使用，但往往低估突变频率，因为这些测定法可以检测异源双链(由突变体和野生型序列杂交形成或由两个不同突变体序列杂交形成)；但它们无法检测由两个相同突变体序列杂交形成的同源双链。因此，这些测定法不能从野生型细胞中区分纯合双等位基因突变体克隆，也不能从杂合单等位基因突变体中区分杂合双等位基因突变体(图22)。此外，核酸酶靶位点附近的序列多态性可以造成混淆的结果，因为所述酶可切割由这些不同野生型等位基因杂交形成的异源双链。RFLP分析没有这些限制，并因此是首选的方法。实际上，RFLP分析是最早用于检测工程化核酸酶介导的突变的方法之一。然而不幸的是，其受到适当限制性位点可得性的限制。
根据本发明的另一个方面，本发明提供用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异的试剂盒，所述试剂盒包括用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异的组合物。另外，本发明提供用于在分离的生物样品中基因分型病原微生物中的核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包括特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
向导RNA，Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质在以上描述。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了在分离的生物样品中基因分型突变或变异的方法，该方法使用组合物用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异。另外，本发明提供在分离的生物样品中基因分型病原微生物中的核酸序列的方法，其包括特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
向导RNA，Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质在以上描述。
发明具体实施方式
以下，参照实施例对本发明进行更详细地描述。然而，这些实施例仅用于举例说明的目的，且本发明不意图受这些实施例的限制。
实施例1：基因组编辑测定
1-1.Cas9蛋白质的DNA切割活性
首先，测试了在体外在存在或不存在嵌合的向导RNA时源自化脓性链球菌的Cas9的DNA切割活性。
为此，使用在大肠杆菌中表达并纯化的重组Cas9蛋白质切割预先消化的或环状质粒DNA，所述质粒DNA包含23个碱基对(bp)的人CCR5靶序列。Cas9靶序列由互补于crRNA或嵌合向导RNA的20-bp DNA序列和Cas9本身识别的三核苷酸(5'-NGG-3')原间隔区邻近基序(PAM)组成(图1A)。
具体地，源自化脓性链球菌菌株M1 GAS(NC_002737.1)的Cas9编码序列(4104bp)使用人类密码子使用表重构，并使用寡核苷酸合成。首先，使用重叠的～35mer寡核苷酸和Phusion聚合酶(New England Biolabs)组装1-kb DNA片段，并克隆到T-载体(SolGent)。通过重叠PCR，使用四个1-kbp的DNA片段，组装全长Cas9序列。所述Cas9编码DNA片段亚克隆到p3s，所述p3s来自pcDNA3.1(Invitrogen)。在此载体中，包含HA表位和核定位信号(NLS)的肽标签(NH2-GGSGPPKKKRKVYPYDV PDYA-COOH，SEQ ID NO：2)加至Cas9的C末端。通过蛋白印迹，使用抗HA抗体(Santa Cruz)，确认HEK 293T细胞中Cas9蛋白质的表达和核定位。
然后，将Cas9盒亚克隆到pET28-b(+)，并转化到BL21(DE3)。使用0.5mM IPTG在25℃下诱导Cas9表达4小时。使用Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)纯化在C末端含有His6标签的Cas9蛋白质，并在20mM HEPES(pH值7.5)，150mM KCl，1mM DTT和10％甘油中透析(1)。纯化的Cas9(50nM)与超螺旋或预先消化的质粒DNA(300ng)及嵌合RNA(50nM)在20微升反应体积中在NEB缓冲液3中在37℃下孵育1小时。用0.8％琼脂糖凝胶电泳，分析消化的DNA。
只有在合成的RNA存在时Cas9才在预期位置有效地切割质粒DNA，但不切割缺乏靶序列的对照质粒(图1B)。
1-2.Cas9/向导RNA复合体在人类细胞中切割DNA
RFP-GFP报告分子用来研究Cas9/向导RNA复合体是否能在哺乳动物细胞中切割在RFP和GFP序列之间引入的靶序列。
在该报告分子中，将GFP序列与RFP序列在读框外融合(2)。只有当靶序列被位点特异性核酸酶切割，通过双链断裂(DSB)的易错非同源末端连接(NHEJ)修复在靶序列周围造成移码小插入或缺失(indel)，活性GFP才表达(图2)。
在本研究中使用的RFP-GFP报告分子质粒如前所述构建(2)。合成对应于靶位点的寡核苷酸(表1)(Macrogen)并退火。将退火的寡核苷酸连接至用EcoRI和BamHI消化的报告分子载体。
用Cas9编码质粒(0.8μg)和RFP-GFP报告分子质粒(0.2μg)在24孔板中使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)共转染HEK 293T细胞。
同时，如下制备体外转录的嵌合RNA。根据制造商的手册，使用MEGAshortscriptT7试剂盒(Ambion)，使用Runoff反应，体外转录RNA。通过退火两个互补的单链DNA或通过PCR扩增，生成用于RNA体外转录的模板(表1)。转录的RNA在8％变性尿素PAGE凝胶中分离。切出含RNA的凝胶切片并转移至探针洗脱缓冲液。回收RNA于无核酸酶的水中，然后用苯酚:氯仿提取，氯仿提取和乙醇沉淀。由光谱法定量纯化的RNA。
在转染后第12小时，将体外转录制备的嵌合RNA(1μg)用Lipofectamine 2000转染。
在转染后第3天，对转染的细胞进行流式细胞分析，对同时表达RFP和GFP的细胞进行计数。
结果发现，只有当首先用Cas9质粒转染、然后12小时后用向导RNA转染细胞，才获得了表达GFP的细胞(图2)，表明RGEN可以在培养的人细胞中识别并切割靶DNA序列。由此，表达GFP的细胞通过Cas9质粒和向导RNA的顺序转染获得而不是通过共转染获得。
表1
Figure BDA0003845556540000241
Figure BDA0003845556540000251
1-3.通过RGEN靶向破坏哺乳动物细胞中的内源基因
为了测试RGEN是否可用于靶向破坏哺乳动物细胞中的内源基因，使用T7内切核酸酶I(T7E1)(一种错配敏感的内切核酸酶，其特异性识别并切割由野生型和突变体DNA序列杂交形成的异源双链)分析了分离自转染细胞的基因组DNA(3)。
为了使用RGEN在哺乳动物细胞中引入DSB，根据生产商的方案，使用4D-Nucleofector，SF细胞系4D-Nucleofector X试剂盒，Program FF-120(Lonza)，用20μgCas9编码质粒转染2×106K562细胞。对于本实验，K562(ATCC，CCL-243)细胞在含有10％FBS和青霉素/链霉素混合物(分别为100U/ml和100μg/ml)的RPMI-1640上培养。
24小时后，将10-40μg体外转录的嵌合RNA核感染至1×106K562细胞。如在实施例1-2中描述的制备体外转录的嵌合RNA。
RNA转染后两天收集细胞，分离基因组DNA。包括靶位点的区域使用表1所述的引物进行PCR扩增。如前所述(3)，对扩增子进行T7E1测定。为了测序分析，纯化对应于基因组修饰的PCR产物并使用T-平端PCR克隆试剂盒(SolGent)克隆至T-平端载体。克隆产物用M13引物测序。
结果发现，只有用Cas9编码质粒、然后用向导RNA顺序转染细胞时，才诱导了突变(图3)。从相对DNA条带强度估计的突变频率(图3A中indel(％))是RNA剂量依赖的，范围从1.3％到5.1％。PCR扩增子的DNA测序分析证实了在内源性位点处诱导了RGEN介导的突变。在靶位点观察到易错NHEJ特征性的indel和微同源性。通过直接测序检测的突变频率为7.3％(＝7突变克隆/96个克隆)，与使用锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)所获得的突变频率相媲美。
需要顺序转染Cas9质粒和向导RNA以诱导细胞中的突变。但是，当质粒编码向导RNA时，顺序转染则不是必要的，细胞可用Cas9质粒和向导RNA编码质粒共转染。
已成功地开发了ZFN和TALEN来破坏人CCR5基因(3-6)，该基因编码G蛋白偶联趋化因子受体——HIV感染的一个主要的共受体。目前CCR5特异性ZFN在美国正处于艾滋病治疗的临床研究阶段(7)。然而，这些ZFN和TALEN具有脱靶效应，在序列与标靶序列同源的位点上诱导局部突变(6，8-10)并诱导基因组重排(其起因于对标靶和脱靶位点上诱导的两个并行DSB的修复)(11-12)。与这些CCR5特异性工程化核酸酶相关的最显着的脱靶位点位于CCR2基因座中，CCR2是CCR5的密切同源物，位于CCR5上游15kbp。为避免CCR2基因上的脱靶突变和不需要的CCR5标靶和CCR2脱靶位点之间15-kbp染色体片段的缺失、倒位，和复制，本发明人有意选择我们的CCR5特异性RGEN的靶位点来识别CCR5序列中的区域，该区域与CCR2序列没有明显的同源性。
本发明人研究了CCR5特异性RGEN是否有脱靶效应。为此，通过鉴定与预定23-bp靶序列最同源的位点，搜索了人类基因组中潜在的脱靶位点。正如预期的那样，在CCR2基因中没有发现这样的位点。但发现了四个位点，其中每一个均携带与标靶位点的3个碱基错配(图4A)。T7E1分析表明，在这些位点中没有检测到突变(检测灵敏度，～0.5％)，这表明RGEN极高的特异性(图4B)。此外，用PCR检测了细胞中染色体缺失的诱导，所述细胞分开转染了编码ZFN的质粒和CCR5特异性RGEN。ZFN诱导缺失，而RGEN不诱导缺失(图4C)。
接着，通过用设计以靶向人C4BPB基因的新合成RNA代替CCR5特异性向导RNA来重新编程RGEN，所述人C4BPB基因编码C4b结合蛋白(一种转录因子)的β链。该RGEN在K562细胞中以高频率诱导了染色体靶位点上的突变(图3B)。由T7E1测定法和直接测序测得的突变频率分别为14％和8.3％(＝4突变克隆/48克隆)。在四个突变序列中，两个克隆精确地在切割位点含有单碱基或两碱基插入，该模式也在CCR5靶位点上观察到。这些结果表明，RGEN在细胞中于预期位置切割染色体靶DNA。
实施例2：蛋白质性RGEN介导的基因组编辑
RGEN可以以多种不同形式递送到细胞。RGEN由Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA组成。两个RNA可以融合形成单链向导RNA(sgRNA)。在启动子如CMV或CAG下编码Cas9的质粒可以被转染到细胞中。crRNA，tracrRNA，或sgRNA也可以使用编码这些RNA的质粒在细胞中表达。但是，使用质粒经常导致质粒全部或部分整合在宿主基因组中。掺入质粒DNA中的细菌序列可能在体内引起不希望的免疫应答。用于细胞治疗的质粒转染的细胞或源自DNA转染细胞的动物和植物在大多数发达国家在市场批准之前必须经过一个昂贵且冗长的管理程序。此外，质粒DNA能在转染后数天存在于细胞中，从而加重RGEN的脱靶效应。
这里，我们使用与体外转录的向导RNA复合的重组Cas9蛋白质，以诱导人细胞内源基因的靶向破坏。融合六个组氨酸标签的重组Cas9蛋白质在大肠杆菌中表达，并使用标准镍离子亲和层析和凝胶过滤从大肠杆菌纯化。纯化的重组Cas9蛋白在存储缓冲液(20mMHEPES pH 7.5，150mM KCl，1mM DTT和10％甘油)中浓缩。Cas9蛋白质/sgRNA复合体通过核转染直接导入K562细胞：使用4D-Nucleofector，SF细胞系4D-Nucleofector X试剂盒，Program FF-120(Lonza)，根据制造商的方案，使用100μl溶液中与100ug(29μM)体外转录的sgRNA(或40ug crRNA和80ug tracrRNA)混合的22.5-225(1.4-14μM)Cas9蛋白质，转染1×106个K562细胞。核转染(nucleofection)后，将细胞置于6孔板的生长培养基中温育48小时。当使用1/5按比例下调的方案转染2×105个K562细胞时，使用4.5-45μg Cas9蛋白质和6-60ug体外转录的sgRNA(或8μg crRNA和16μgtracrRNA)的混合物，在20μl溶液中进行核转染。然后将核转染的细胞置于48孔板的生长培养基中。48小时后，收集细胞并分离基因组DNA。PCR扩增跨靶位点的基因组DNA区域，并进行T7E1测定。
如图10所示，Cas9蛋白质/sgRNA复合体在CCR5基因座上诱导了靶向突变，诱变频率以sgRNA或Cas9蛋白质剂量依赖性方式从4.8至38％，该频率与Cas9质粒转染所获得的频率相当(45％)。Cas9蛋白质/crRNA/tracrRNA复合体能够以9.4％频率诱导突变。Cas9蛋白质单独不能诱导突变。当使用1/5按比例下调的Cas9蛋白质和sgRNA剂量转染2×105个细胞时，CCR5基因座上的突变频率以剂量依赖性方式为2.7至57％，大于共转染Cas9质粒和sgRNA质粒获得的频率(32％)。
我们还测试了靶向ABCC11基因的Cas9蛋白质/sgRNA复合体，发现该复合体以35％的频率诱导Indel，这表明该方法的普遍适用性。
[表2]向导RNA序列
Figure BDA0003845556540000291
实施例3：小鼠中RNA指导的基因组编辑
为了检验在原核(PN)阶段小鼠胚胎中RGEN的基因靶向潜力，使用了叉头框N1(Foxn1)基因(其对胸腺发育和角质细胞分化是重要的(Nehls等,1996))和蛋白激酶的DNA激活的催化多肽(Prkdc)基因(其编码对DNA DSB修复和重组重要的酶(Taccioli等，1998))。
为了评估Foxn1-RGEN的基因组编辑活性，我们将Cas9 mRNA(10ng/μl溶液)与各种剂量的sgRNA注射到PN-阶段小鼠胚胎的细胞质中(图5a)，并使用从体外培养的胚胎获得的基因组DNA进行了T7内切核酸酶(T7E1)测定(Kim等人，2009年)(图6a)。
可替代地，我们直接将RGEN以重组Cas9蛋白质(0.3至30ng/μl)与2倍摩尔过量的Foxn1特异性sgRNA(0.14至14ng/μl)的复合物形式注射到一细胞小鼠胚胎的细胞质或原核中，并使用体外培养的胚胎分析了Foxn1基因中的突变(图7)。
具体地说，分别使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra试剂盒(Ambion)和MEGAshortscript T7试剂盒(Ambion)，根据制造商的说明，从线性DNA模板体外合成了Cas9mRNA和sgRNA，并用合适量的焦碳酸二乙酯(DEPC，Sigma)处理的注射缓冲液(0.25mM EDTA,10mM Tris,pH 7.4)进行稀释。使用表3所列的寡核苷酸产生用于sgRNA合成的模板。重组Cas9蛋白质从ToolGen,Inc.获得。
[表3]
表3
Figure BDA0003845556540000301
Figure BDA0003845556540000311
所有动物实验均按照韩国食品和药物管理局(KFDA)的指导方针进行。实验方案被延世大学实验动物研究中心的动物护理和使用委员会(IACUC)审查并批准(许可证编号：2013-0099)。所有小鼠维持在延世实验动物研究中心的无特定病原体的设施中。FVB/NTac(Taconic)和ICR小鼠品系分别被用作胚胎供体和代母。雌性FVB/NTac小鼠(7-8周龄)通过以48小时间隔腹膜内注射5IU孕马血清促性腺激素(PMSG，Sigma)和5IU人绒毛膜促性腺激素(hCG，Sigma)而超排卵。超排卵雌性小鼠与FVB/Ntac雄性小鼠种畜交配，从输卵管收集受精胚胎。
利用压电驱动的微操作机(Prime Tech)将M2培养基(Sigma)中的Cas9 mRNA和sgRNA注射到具有清楚辨认的原核的受精卵的细胞质中。
在注射重组Cas9蛋白质的情况下，所述重组Cas9蛋白质:Foxn1-sgRNA复合体用DEPC处理的注射缓冲液(0.25mM EDTA,10mM Tris,pH 7.4)稀释，并用TransferMan NK2微操作机和FemtoJet微注射器(Eppendorf)注射到雄性原核中。
将操作的胚胎移入假孕代母的输卵管中以产生活的动物，或在体外培养用于进一步分析。
为了筛选具有RGEN诱发的突变的F0小鼠和体外培养的小鼠胚胎，如前所述(Cho等,2013)，使用来自尾活检物的基因组DNA样品和全胚胎裂解物进行T7E1测定法。
简言之，PCR扩增包含RGEN靶位点的基因组区域、解链、并再退火以形成异源双链DNA，用T7内切核酸酶1(New England Biolabs)处理，然后通过琼脂糖凝胶电泳分析。通过bowtie 0.12.9搜索鉴定了潜在的脱靶位点，这些位点也类似地通过T7E1测定法监测。在这些测定中使用的引物对列于表4和5。
[表4]
用于T7E1测定中的引物
Figure BDA0003845556540000321
[表5]
用于扩增脱靶位点的引物
Figure BDA0003845556540000322
Figure BDA0003845556540000331
T7E1测定法鉴定的突变体建立者小鼠通过fPCR进一步分析。基因组DNA的合适区域如前所述(Sung等,2013)进行测序。对于F1后代的常规PCR基因分型，以下引物对用于野生型和突变体等位基因：5'-CTACTCCCTCCGCAGTCTGA-3'(SEQ ID NO：69)和5'-CCAGGCCTAGGTTCCAGGTA-3'(SEQ ID NO:70)用于Foxn1基因，5'-CCCCAGCATTGCAGATTTCC-3'(SEQ ID NO:71)和5'-AGGGCTTCTTCTCTACAATCACG-3'(SEQ ID NO：72)用于Prkdc基因。
在注射Cas9 mRNA的情况下，突变体分数(突变体胚胎数/总胚胎数)是剂量依赖性的，范围从33％(1ng/μl sgRNA)至91％(100ng/μl)(图6b)。序列分析证实了Foxn1基因中的突变；大多数突变是小缺失(图6c)，让人联想起ZFN和TALENS诱导的那些(Kim等,2013)。
在注射Cas9蛋白质的情况下，这些注射剂量和方法极小地影响体外小鼠胚胎的生存和发育：在两个实验中70％以上注射RGEN的胚胎正常孵化。再次，用Cas9蛋白质注射所得突变体的分数是剂量依赖性的，通过原核注射在最高剂量下达到多达88％，通过胞质内注射达到多达71％(图7a和7b)。与Cas9 mRNA加sgRNA诱导的突变模式类似(图6c)，Cas9蛋白质-sgRNA复合体诱导的突变大多是小缺失(图7c)。这些结果清楚地表明，RGEN在小鼠胚胎中具有高的基因靶向活性。
受到RGEN诱发的高突变频率和低毒性的鼓舞，我们将小鼠胚胎移至假孕代母的输卵管中产生了活的动物。
值得注意的是，出生率非常高，从58％至73％，并且没有受到增加的Foxn1-sgRNA剂量的影响(表6)。
[表6]
在FVB/NTac小鼠中RGEN介导的基因靶向
Figure BDA0003845556540000341
在147只新生小鼠中，我们获得99只突变建立者小鼠。与在培养的胚胎中观察到的结果一致(图6c)，突变体分数与Foxn1-sgRNA剂量成比例，最多达93％(100ng/μl Foxn1-sgRNA)(表6和7，图5b)。
[表7]
从T7E1阳性突变体建立者小鼠子集鉴定的Foxn1突变体等位基因的DNA序列
Figure BDA0003845556540000351
Figure BDA0003845556540000361
Figure BDA0003845556540000371
为了产生Prkdc靶向小鼠，我们采用了浓度高5倍的Cas9 mRNA(50ng/μl)和递增剂量的Prkdc-sgRNA(50、100和250ng/μl)。再次，出生率是非常高的，范围从51％至60％，足以产生足够数量的新生小鼠用于分析(表6)。在最大剂量的Prkdc-sgRNA时突变体分数为57％(37只新生小鼠中21只突变体建立者小鼠)。由RGEN获得的这些出生率比我们以前研究报道的由TALEN获得的出生率高约2至10倍(Sung等,2013)。这些结果表明，RGEN是有效的基因靶向试剂，具有极小的毒性。
为了测试突变体等位基因的种系传递，我们使Foxn1突变体建立者小鼠#108(具有四个不同等位基因的嵌合体(图5c和表8))与野生型小鼠杂交，并监测F1后代的基因型。
[表8]
Foxn1突变体小鼠的基因型
Figure BDA0003845556540000381
Figure BDA0003845556540000391
下划线的等位基因进行了测序。
红色的等位基因通过测序检测，但没有进行fPCR。
*只测序了一个克隆。
**没有通过fPCR检测。
如预期的，所有的后代都是具有野生型等位基因和一个突变体等位基因的杂合突变体(图5d)。我们还证实了在独立的Foxn1(图8)和Prkdc(图9)建立者小鼠中的种系传递。根据我们所知，这些结果提供了RGEN诱导的突变体等位基因在动物中稳定地传递到F1后代的第一证据。
实施例4：在植物中RNA引导的基因组编辑
4-1.Cas9蛋白质的生产
源自化脓性链球菌菌株M1 GAS(NC_002737.1)的Cas9编码序列(4104bps)克隆到pET28-b(+)质粒。在蛋白质N末端包括核靶向序列(NLS)，以确保将蛋白质定位至细胞核。含有Cas9 ORF的pET28-b(+)质粒转化到BL21(DE3)中。然后在18℃用0.2mM IPTG诱导Cas9进行16小时，并使用Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen)按照制造商的说明纯化。使用Ultracel 100K(Millipore)浓缩纯化的Cas9蛋白质。
4-2.向导RNA的生产
筛选编码BRI1的拟南芥基因的基因组序列，检查外显子中NGG基序的存在，所述基序，即所谓的原间隔区邻近基序(PAM)，是Cas9靶向所必需的。为了破坏拟南芥中的BRI1基因，我们在包含NGG基序的外显子中鉴定了2个RGEN靶位点。用模板DNA体外生成sgRNA。每个模板DNA通过两个部分重叠的寡核苷酸(Macrogen，表X1)和Phusion聚合酶(ThermoScientific)，通过延伸而产生，其中使用了以下条件：-98℃30sec{98℃ 10sec,54℃20sec,72℃ 2min}x20,72℃ 5min。
[表9]
制备用于体外转录的模板DNA的寡核苷酸
Figure BDA0003845556540000401
纯化延伸的DNA，并用作模板，使用MEGAshortscript T7试剂盒(LifeTechnologies)体外生产向导RNA。然后通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀，纯化向导RNA。为了制备Cas9/sgRNA复合体，10ul纯化的Cas9蛋白质(12μg/μl)和两个sgRNA(11μg/μl)各4ul混合于20μl NEB3缓冲液(New England Biolabs)中，并在37℃下孵育10分钟。
4-3.Cas9/sgRNA复合体转染原生质体
在培养皿中无菌生长的4周龄拟南芥幼苗的叶子，在酶溶液(1％纤维素R10，0.5％离析酶R10，450mM甘露醇，20mM MES pH 5.7和CPW盐)中，25℃暗处以40rpm振荡，消化8～16小时。过滤酶/原生质体溶液，并在100×g下离心3～5分钟。在显微镜(X100)下使用血细胞计数器计数细胞后，将原生质体再悬浮在CPW溶液中。最后，原生质体以1×106/ml再悬浮于MMG溶液(4mM HEPES pH 5.7，400mM甘露醇和15mM MgCl2)中。为了用Cas9/sgRNA复合体转染原生质体，将200μL原生质体悬浮液(200,000原生质体)与3.3或10μL Cas9/sgRNA复合体[Cas9蛋白质(6μg/μL)和两个sgRNA(各2.2μg/μL)]和200ul 40％聚乙二醇转染缓冲液(40％PEG4000，200mM甘露糖醇和100mM CaCl2)在2ml管中轻轻混合。在室温下孵育5～20分钟后，通过加入含有W5溶液(2mM MES pH 5.7,154mM NaCl,125mM CaCl2和5mM KCl)的洗涤缓冲液，终止转染。然后通过在100×g下离心5分钟收集原生质体，用1ml W5溶液洗涤，在100×g下再离心5分钟。将原生质体的密度调节至1×105/ml并将其培养在含400mM葡萄糖的修饰的KM 8p液体培养基中。
4-4.拟南芥原生质体和植物中突变的检测
转染后24小时或72小时后，收集原生质体并分离基因组DNA。对跨越两个靶位点的基因组DNA区域进行PCR扩增，并进行T7E1测定。如图11所示，RGEN以高频率诱导indel，频率从50％至70％。令人惊奇的是，在转染后24小时诱导了突变。显然，Cas9蛋白质在转染后立即发挥功能。纯化PCR产物，并克隆到T平端PCR克隆试剂盒(Solgent)。纯化质粒并用M13F引物进行Sanger测序。一个突变体序列在一个位点具有7-bp缺失(图12)。其他三个突变体序列在两个RGEN位点之间具有～220-bp的DNA片段缺失。
实施例5：使用细胞穿透肽或蛋白质转导结构域转导Cas9蛋白质
5-1.His-Cas9编码质粒的构建
使用先前描述的Cas9质粒{Cho,2013#166}作为模板，通过PCR扩增，制备在C末端具有半胱氨酸的Cas9，并克隆到pET28-(a)载体(Novagen,Merk Millipore,Germany)中，在N-末端含有His-标签。
5-2.细胞培养
293T(人胚肾细胞系)和HeLa(人卵巢癌细胞系)生长在补充有10％FBS和1％青霉素和链霉素的DMEM(GIBCO-BRL Rockville)中。
5-3.Cas9蛋白质的表达和纯化
为了表达Cas9蛋白质，用编码Cas9的pET28-(a)载体转染大肠杆菌BL21细胞，铺板至含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂培养基(Amresco,Solon,OH)。第二天，挑取单菌落并在含有50μg/mL卡那霉素的LB肉汤中在37℃过夜培养。第二天，将0.1OD 600的起子培养物接种到含有50μg/mL卡那霉素的Luria肉汤中，在37℃培养2小时，直到OD 600达到0.6-0.8。为了诱导Cas9蛋白质表达，加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(Promega,Madison,WI)至终浓度0.5mM后，将细胞在30℃过夜培养。
通过在4000rpm离心15-20分钟收集细胞，再悬浮于裂解缓冲液(20mM Tris-ClpH8.0，300mM NaCl,20mM咪唑，1X蛋白酶抑制剂混合物，1mg/ml溶菌酶)，并通过超声处理裂解(40％占空(duty)，10秒脉冲，30秒间歇，放置于冰上10分钟)。在4℃在15000rpm下离心20分钟后分离作为上清液的可溶级分。使用含Ni-NTA琼脂糖树脂的柱(QIAGEN)和AKTA prime仪器(AKTA prime,GE Healthcare,UK)，在4℃下纯化Cas9蛋白质。在层析步骤期间，可溶性蛋白质级分以1mL/min的流速上样到Ni-NTA琼脂糖树脂柱(GE Healthcare，UK)。将柱用洗涤缓冲液(20mM Tris-Cl pH8.0，300mM NaCl，20mM咪唑，1X蛋白酶抑制剂混合物)洗涤，结合的蛋白质以0.5ml/min的流速用洗脱缓冲液(20mM Tris-Cl pH 8.0，300mM NaCl，250mM咪唑，1X蛋白酶抑制剂混合物)洗脱。将合并的洗脱级分浓缩并相对于存储缓冲液(50mMTris-HCl，pH8.0，200mMKCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5mM PMSF，20％甘油)透析。通过Bradford测定法(Biorad,Hercules,CA)进行蛋白质浓度定量，使用牛血清白蛋白作为对照，通过SDS-PAGE分析纯度。
5-4.Cas9与9R4L的缀合
使用转子在室温下2小时并在4℃下过夜，轻轻混合以浓度1mg/mL稀释在PBS中的1mg Cas9蛋白质和25μL DW50中的50μg马来酰亚胺-9R4L肽(Peptron,Korea)。为了除去未结合的马来酰亚胺-9R4L，将样品用50kDa分子量截断膜对DPBS(pH 7.4)在4℃下进行24小时透析。从透析膜收集Cas9-9R4L蛋白质并用Bradford测定法测定蛋白质量。
5-5.sgRNA-9R4L的制备
sgRNA(1μg)轻轻加入到100μl DPBS(pH 7.4)中的各种量C9R4LC肽(从1至40的重量比)中。将该混合物在室温下孵育30分钟，使用无RNA酶的去离子水稀释10倍。用动态光散射(Zetasizer-nano analyzer ZS；Malvern instruments,Worcestershire,UK)，测定所形成的纳米粒子的流体动力学直径和z电位。
5-6.Cas9蛋白质和sgRNA处理
如下所述用Cas9-9R4L和sgRNA-C9R4LC处理细胞：将1μg sgRNA和15μg C9R4LC肽加入到250mL OPTIMEM培养基中，并在室温下孵育30分钟。在接种后24小时，用OPTIMEM培养基洗涤细胞并用sgRNA-C9R4LC复合体在37℃下处理4小时。将细胞用OPTIMEM培养基再次洗涤并用Cas9-9R4L在37℃下处理2小时。处理后，培养基用含血清的完全培养基取代，并在下一次处理前在37℃下孵育24小时。连续3天以相同的程序实施Cas9和sgRNA的多次处理。
5-7.Cas9-9R4L和sgRNA-9R4L能编辑培养的哺乳动物细胞中的内源基因而不使用额外的递送工具
为了确定Cas9-9R4L和sgRNA-9R4L在不使用额外的递送工具时是否可以编辑培养的哺乳动物细胞中的内源基因，我们用Cas9-9R4L和靶向CCR5基因的sgRNA-9R4L处理了293个细胞，并分析了基因组DNA。T7E1测定表明，在以Cas9-9R4L和sgRNA-9R4L两者处理的细胞中9％的CCR5基因被破坏，而在对照细胞(包括未经处理的细胞，用Cas9-9R或sgRNA-9R4L处理的细胞，或用未修饰的Cas9和sgRNA两者处理的细胞(图13))中没有观察到CCR5基因的破坏，这表明，用Cas9-9R4L蛋白质和与9R4L缀合的sgRNA(而不是未修饰的Cas9和sgRNA)处理可以导致哺乳动物细胞中高效的基因组编辑。
实施例6：根据向导RNA结构控制脱靶突变
最近，三个小组报道了RGEN在人细胞中具有脱靶效应。出乎我们意料的是，RGEN在与标靶位点相差3至5个核苷酸的脱靶位点有效地诱导了突变。然而，我们注意到，我们所使用的RGEN和其他人使用的RGEN有一些差异。首先，我们用dualRNA——其是crRNA加tracrRNA，而不是由crRNA和tracrRNA的必要部分组成的单向导RNA(sgRNA)。第二，我们用合成的crRNA而非crRNA编码质粒转染K562细胞(而不是HeLa细胞)。用crRNA编码质粒转染HeLa细胞。其他小组使用sgRNA编码质粒。第三，我们的向导RNA在5'末端有两个附加的鸟嘌呤核苷酸，这对于T7聚合酶的体外有效转录是必需的。在其他人使用的sgRNA中没有包括这样的额外核苷酸。因此，我们的向导RNA的RNA序列可以表示为5'-GGX20，而5'-GX19代表其他人使用的序列，其中X20或GX19对应于20-bp靶序列。第一个鸟嘌呤核苷酸是细胞中由RNA聚合酶转录所需的。为了测试脱靶RGEN效应是否可归因于这些差异，我们选择了在人类细胞中以高频率诱导脱靶突变的4个RGEN(13)。首先，我们在K562细胞中比较了使用体外转录dualRNA的我们的方法与转染sgRNA编码质粒的方法，通过T7E1测定法测定了在标靶和脱靶位点的突变频率。三个RGEN显示了在标靶和脱靶位点可比较的突变频率，与向导RNA组成无关。有趣的是，当使用合成的dualRNA时，一个RGEN(VEFGA位点1)在一个验证的脱靶位点上没有诱导Indel，该脱靶位点与标靶位点有三个核苷酸不同(称为OT1-11，图14)。但合成的dualRNA没有辨别出其它验证的脱靶位点(OT1-3)，所述脱靶位点与标靶位点有两个核苷酸不同。
下一步，通过比较5'-GGX20(或5'-GGGX19)sgRNA与5'-GX19 sgRNA，我们测试了在sgRNA的5'末端添加两个鸟嘌呤核苷酸是否可以使RGEN更特异。四个复合Cas9的GX19 sgRNA同等有效地在标靶和脱靶位点诱导了Indel，容忍多达四个碱基错配。与之形成鲜明对比，GGX20 sgRNA有效区别脱靶位点。事实上，当我们使用四个GGX20 sgRNA时，T7E1测定在七个验证的脱靶位点的六个中几乎没有检测到RGEN诱导的indel(图15)。然而，我们注意到，两个GGX20 sgRNA(VEGFA位点1和3)在标靶位点的活性比对应的GX19 sgRNA的活性低。这些结果表明，或许通过改变向导RNA的稳定性、浓度或二级结构，在5'端的额外核苷酸可以影响在标靶和脱靶位点的突变频率。
这些结果表明，三个因素——使用合成的向导RNA而不是向导RNA编码质粒，使用dualRNA而非sgRNA，以及使用GGX20 sgRNA而非GX19sgRNA——在脱靶位点的辨别上有累积效应。
实施例7：配对的Cas9切口酶
原则上，单链断裂(SSB)不能被易错NHEJ修复，但仍引发高保真同源定向修复(HDR)或碱基切除修复。但通过HDR的切口酶诱导的定向诱变比核酸酶诱导的诱变效率低得多。我们推理，配对Cas9切口酶可以产生复合DSB，其触发通过NHEJ或HDR的DNA修复，导致有效的诱变(图16A)。此外，配对切口酶使基于Cas9的基因组编辑的特异性增倍。
我们首先通过荧光毛细管电泳在体外测试了几种设计为靶向AAVS1基因座中靶位点的Cas9核酸酶和切口酶(图16B)。与Cas9核酸酶(其切割DNA底物的两条链)不同，Cas9切口酶由向导RNA和Cas9的突变体形式组成，在所述Cas9突变体中催化性天冬氨酸残基改变为丙氨酸(D10ACas9)，该Cas9切口酶仅切割一条链，产生位点特异性缺口(图16C，D)。然而，有趣的是，一些切口酶(在图17A中的AS1，AS2，AS3，和S6)在人类细胞中在靶位点诱导了Indel，这表明缺口可以体内转化为DSB，尽管低效。在相对的DNA链上产生两个相邻缺口的配对Cas9切口酶以从14％至91％的频率产生Indel，相当于配对核酸酶(图17A)的效应。在三个基因组基因座上，产生5'突出端的两个切口的修复，比产生3'突出端的两个切口的修复，以更高频率地导致Indel形成(图17A和图18)。此外，配对切口酶比单一切口酶能够更高效地通过同源定向修复进行靶向基因组编辑(图19)。
接下来，我们使用深度测序测定了脱靶位点上配对切口酶与核酸酶的突变频率。与三个sgRNA复合的Cas9核酸酶在六个位点诱导了脱靶突变，所述位点与其相应的标靶位点相差一个或两个核苷酸，突变频率范围从0.5％至10％(图17B)。与此相反，配对Cas9切口酶在六个脱靶位点的任何一个上均未产生0.1％检测限以上的Indel。S2 Off-1位点(其与其标靶位点在PAM的第一位置(即，NGG中的N)上相差一个核苷酸)可以被认为是另一个标靶位点。正如所料，与S2 sgRNA复合的Cas9核酸酶在该位点和标靶位点上具有相同的效率。与之形成鲜明对比，与S2和AS2 sgRNA复合的D10A Cas9以270倍的因数区分该位点和标靶位点。该配对切口酶还分别以160倍和990倍的因数区分AS2脱靶位点(图17B中的Off-1和Off-9)和靶位点。
实施例8：配对Cas9切口酶诱导的染色体DNA剪接
已经报道，由工程化的核酸酶ZFN和TALEN产生的两个并行DSB能促进介于中间的染色体片段的大缺失。我们测试了由配对Cas9切口酶诱导的两个SSB是否也能在人细胞中产生缺失。我们使用PCR检测缺失事件，发现7个配对切口酶与配对Cas9核酸酶以同样效率诱导了高达1.1-kbp染色体片段的缺失(图20A，B)。PCR产物的DNA序列证实了该缺失事件(图20C)。有趣的是，在七个缺失特异性PCR扩增子的两个中sgRNA匹配序列保持完整(20C中下划线所示)。与此相反，Cas9核酸酶对没有产生含有完整靶位点的序列。这一发现表明，远离的两个缺口没有转化为两个分开的DSB以促进居间染色体片段的缺失。此外，因为解链温度非常高，不可能相隔100bp以上的两个切口在生理条件下造成具有大突出端的复合DSB。
我们提出，两个远离的缺口通过头对头方向的链置换而被修复，导致在中间形成DSB，其通过NHEJ的修复引起小的缺失(图20D)。因为在这个过程中两个靶位点保持完整，切口酶能再次诱导SSB，反复触发循环，直到靶位点缺失。这一机制解释了为什么产生5'突出端的两个并列缺口但不是产生3'突出端的两个并列缺口在三个基因座有效诱导了Indel。
然后我们调查了Cas9核酸酶和切口酶是否能诱发由于标靶和脱靶DNA切割的NHEJ修复而导致的不希望的染色体易位(图21A)。使用PCR，我们能够检测到Cas9核酸酶诱导的易位(图21B，C)。使用分离自转染了编码AS2+S3 Cas9切口酶对的质粒的细胞的基因组DNA，没有扩增出这样的PCR产物。这一结果与以下事实一致，即，不同于其相应的核酸酶，AS2和S3切口酶在脱靶位点不产生Indel(图17B)。
这些结果表明，配对Cas9切口酶允许在人类细胞中的靶向诱变和高达1-kbp染色体片段的大缺失。重要的是，配对切口酶在脱靶位点没有引起Indel，而在该脱靶位点处其相应的核酸酶诱发突变。此外，与核酸酶不同，配对切口酶不促进与脱靶DNA切割相关的不想要的易位。原则上，配对切口酶使Cas9介导的诱变的特异性加倍，这将扩大RNA向导酶在需要精确基因组编辑应用(如基因和细胞治疗)中的效用。这种方法的一个附加说明是，需要两个高活性sgRNA构成有效的切口酶对，这限制了可靶向的位点。如该研究和其他研究所示，并非所有sgRNA都具有同样活性。当单克隆而不是细胞群被用于进一步的研究或应用时，代表基因组中独特序列的向导RNA的选择以及优化的向导RNA的使用将足以避免与Cas9核酸酶相关的脱靶突变。我们提出，Cas9核酸酶和配对切口酶均为有利于细胞和生物体中精确基因组编辑的强大选项。
实施例9：用CRISPR/Cas衍生的RNA向导核酸内切酶的基因分型
接着，我们推定RGEN可代替常规的限制酶用于限制性片段长度多态性(RFLP)分析中。当由核酸酶引起的DSB由易错非同源末端连接(NHEJ)系统修复时，包括RGEN的工程化核酸酶将在靶位点诱导Indel。被设计识别靶序列的RGEN不能切割带有indel的突变序列，但能有效地切割野生型靶序列。
9-1.RGEN成分
使用MEGAshortcript T7试剂盒(Ambion)，根据制造商的说明书，通过体外转录制备crRNA和tracrRNA。转录的RNA在8％变性尿素PAGE凝胶上分离。切出含RNA的凝胶片，并转移到洗脱缓冲液。将RNA回收至无核酸酶水中，然后用苯酚：氯仿提取，氯仿提取和乙醇沉淀。用光谱法定量纯化的RNA。通过退火序列如下所示的寡核苷酸和其互补寡核苷酸，制备crRNA的模板：5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGG X20GTTTTAGAGCTA TGCTGTTTTG-3'(SEQ IDNO:76)，其中X 20是靶序列。使用Phusion聚合酶(New England Biolabs)，通过正向和反向寡核苷酸的延伸，合成了tracrRNA模板：
(5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG-3'(SEQ ID NO：77)和5'-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGA CTAGCCTTATTTTAACTTGCTATG-3'(SEQ ID NO：78))。
9-2.重组Cas9蛋白质纯化
在我们以前的实施例中使用的Cas9 DNA构建体(其编码在C末端融合His6标签的Cas9)插入至pET-28a表达载体。重组Cas9蛋白质表达于大肠杆菌菌株BL21(DE3)，用1mMIPTG诱导后在25℃培养在LB培养基中4小时。收获细胞，并再悬浮于包含20mM Tris PH8.0，500mM NaCl，5mM咪唑和1mM PMSF的缓冲液中。将细胞在液氮中冷冻，在4℃解冻，并超声处理。离心后，将裂解物中的Cas9蛋白质结合至Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)上，用含有20mM Tris pH8.0，500mM NaCl和20mM咪唑的缓冲液洗涤，并用包含20mM Tris pH 8.0，500mM NaCl和250mM咪唑的缓冲液洗脱。纯化的Cas9蛋白质对20mM HEPES(pH 7.5)，150mMKCl，1mM DTT和10％甘油进行透析，并通过SDS-PAGE分析。
9-3.T7内切核酸酶I测定
T7E1测定如下进行。简要地说，用基因组DNA扩增的PCR产物在95℃变性，在16℃退火，并在37℃与5单位T7内切核酸酶I(New England BioLabs)孵育20分钟。将反应产物用2％至2.5％的琼脂糖凝胶电泳分离。
9-4.RGEN-RFLP分析
PCR产物(100-150ng)在37℃下与优化浓度(表10)的Cas9蛋白质、tracrRNA，crRNA在10μl NEB缓冲液3(1X)中孵育60分钟。切割反应后，加入RNA酶A(4μg)，并将反应混合物在37℃孵育30分钟，以除去RNA。用含有30％甘油，1.2％SDS和100mM EDTA的6X终止溶液缓冲液终止反应。产物用1-2.5％琼脂糖凝胶电泳分离，并用EtBr染色以显现。
[表10]
RFLP测定中RGEN成分的浓度
Figure BDA0003845556540000491
[表11]
引物
Figure BDA0003845556540000501
Figure BDA0003845556540000511
9-5.质粒切割测定
限制性内切酶处理的线性化质粒(100ng)在37℃下与Cas9蛋白质(0.1μg)、tracrRNA(60ng)和crRNA(25ng)在10μg NEB3缓冲液(1X)中孵育60分钟。用含有30％甘油，1.2％SDS和100mM EDTA的6X终止溶液终止反应。产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，并用EtBr染色而显现。
9-6.RFLP策略
具有所需DNA特异性的新RGEN可以通过替换crRNA而容易地创建；一旦获得重组Cas9蛋白质，则不需要从头纯化定制蛋白质。当核酸酶引起的DSB通过易错非同源末端连接(NHEJ)修复时，包括RGEN的工程化核酸酶在靶位点诱发小的插入或缺失(indel)。设计成识别靶序列的RGEN有效切割野生型序列，但不切割具有indel的突变序列(图22)。
我们首先测试RGEN能否差异地切割包含野生型或修饰C4BPB靶序列(其在切割位点具有1至3个碱基Indel)的质粒。具有这些Indel的六个质粒中没有一个被靶特异性crRNA、tracrRNA和重组Cas9蛋白质组成的C4BPB特异性RGEN5切割(图23)。与此相反，具有完整靶序列的质粒被该RGEN有效切割。
9-7.使用RGEN介导的RFLP检测由同一RGEN诱导的突变
接下来，为了测试RGEN介导的RFLP检测由同一RGEN诱导的突变的可行性，我们利用了通过RGEN靶向C4BPB基因建立的基因修饰的K562人癌细胞克隆(表12)。
[表12]
在这项研究中使用的RGEN的靶序列
基因 靶序列 SEQ ID NO
人C4BPB <![CDATA[<u>AATGACCACTACATCCTCAA</u>GGG]]> 104
小鼠Pibf1 <![CDATA[<u>AGATGATGTCTCATCATCAG</u>AGG]]> 105
本研究中使用的C4BPB突变体克隆具有范围从94bp缺失至67bp插入的各种突变(图24A)。重要的是，发生在突变体克隆中的所有突变均导致了RGEN靶位点的丧失。在分析的6个C4BPB克隆中，4个克隆具有野生型和突变体等位基因(+/-)，2个克隆仅具有突变体等位基因(-/-)。
用靶特异性crRNA、tracrRNA和从大肠杆菌表达和纯化的重组蛋白Cas9组成的RGEN，完全消化从野生型K562基因组DNA扩增的跨RGEN靶位点的PCR产物(图24B/第1道)。当使用RGEN对C4BPB突变体克隆进行RFLP分析时，含有野生型和突变体等位基因的+/-克隆的PCR扩增子被部分消化，不含有野生型等位基因的-/-克隆的扩增子根本不被消化，不产生对应于野生型序列的切割产物(图24B)。甚至在靶位点的单碱基插入也阻碍C4BPB RGEN对扩增的突变体等位基因的消化(#12和#28克隆)，表明RGEN介导的RFLP的高特异性。我们对PCR扩增子平行地进行错配敏感的T7E1测定(图24B)。值得注意的是，T7E1测定无法区分-/-克隆和+/-克隆。更糟的是，T7E1测定不能区分含有相同突变序列的纯合突变体克隆和野生型克隆，原因是相同突变序列的退火将形成同源双链体。因此，RGEN介导的RFLP比常规的错配敏感的核酸酶测定法在分析工程化核酸酶(包括ZFN，TALEN和RGEN)诱导的突变体克隆方面更优越。
9-8.RGEN-RFLP分析的定量测定
我们还调查了RGEN-RFLP分析是否是一个定量的方法。从C4BPB无效克隆和野生型细胞中分离的基因组DNA样品以各种比例混合，并用于PCR扩增。对PCR产物平行进行RGEN基因分型和T7E1测定(图25b)。正如所料，由RGEN切割的DNA与野生型对突变的比率成比例。与此相反，T7E1测定结果与从该比率推断的突变频率具有很差的相关性，特别是在高突变％——互补突变序列可相互杂交形成同源双链的情形——是不准确的。
9-9.使用RGEN介导的RFLP基因分型分析突变体建立者小鼠
我们还应用RGEN介导的RFLP基因分型(简称RGEN基因分型)，进行了突变体建立者小鼠的分析，该小鼠通过向小鼠一细胞胚胎中注射TALEN而建立(图26A)。我们设计并使用了识别Pibf1基因中的TALEN靶位点的RGEN(表10)。从野生型小鼠和突变体小鼠中分离基因组DNA，在PCR扩增后进行RGEN基因分型。RGEN基因分型成功地检测了各种突变，从1至27-bp的缺失(图26B)。不同于T7E1测定法，RGEN基因分型能够差异检测+/-与-/-建立者。
9-10.使用RGEN检测CCR5特异性ZFN在人细胞中诱导的突变
此外，我们使用RGEN检测CCR5特异性ZFN(代表另一类工程化的核酸酶)在人细胞中诱导的突变(图27)。这些结果表明，RGEN可检测由RGEN自身外的其它核酸酶诱导的突变。事实上，我们预期RGEN可被设计为检测由大多数(即使不是全部的话)工程化核酸酶诱导的突变。在RGEN基因分型测定的设计中唯一的限制是：要求在Cas9蛋白质识别的PAM序列中有GG或AG(互补链上为CC或CT)二核苷酸，其平均每4bp出现一次。预期，在crRNA和PAM核苷酸中在几个碱基的种子区域内的任何位置处诱导的Indel都将破坏RGEN催化的DNA切割。事实上，我们在大多数(98％)ZFN和TALEN位点鉴定到至少一个RGEN位点。
9-11.使用RGEN检测多态性或变异
接下来，我们设计并测试了靶向高度多态性基因座HLA-B(其编码人白细胞抗原B(又名MHC I类蛋白))的新RGEN(图28)。用RGEN质粒转染HeLa细胞，对基因组DNA平行进行T7E1和RGEN-RFLP分析。T7E1产生了假阳性条带，这些条带由于靶位点附近的序列多态性而导致(图25c)。但是，正如预期的，用于基因破坏的相同RGEN完全切割来自野生型细胞的PCR产物，但部分切割来自RGEN转染细胞的PCR产物，表明在靶位点存在RGEN诱导的Indel。这一结果表明，RGEN-RFLP分析比T7E1测定法有着明显的优势，特别是当不知道在所感兴趣的细胞中靶基因是否具有多态性或变异时。
9-12.通过RGEN-RFLP分析检测在癌症中的频发突变和天然存在的多态性
RGEN-RFLP分析的应用超出基因分型工程化核酸酶诱导的突变。我们试图利用RGEN基因分型检测癌症中的频发突变和天然存在的多态性。我们选择了人类结直肠癌细胞系HCT116，其在编码β-联蛋白的致癌基因CTNNB1上带有功能获得型3bp缺失。从HCT116基因组DNA扩增的PCR产物被野生型特异性和突变体特异性的RGEN部分切割，与HCT116细胞中的杂合基因型相符(图29A)。与之形成鲜明对比，从仅带有野生型等位基因的HeLa细胞的DNA扩增的PCR产物完全被野生型特异性RGEN消化，而根本不被突变特异性RGEN切割。
我们还注意到，HEK293细胞在CCR5基因中具有32bp缺失(del32)，CCR5基因编码重要的HIV感染共受体：纯合的del32 CCR5携带者对HIV感染具免疫性。我们设计了一个特异于del32等位基因的RGEN和特异于野生型等位基因的另一RGEN。正如预期的，野生型特异性RGEN完全切割来自K562，SKBR3或HeLa细胞(用作野生型对照)的PCR产物，但是部分切割来自HEK293细胞的PCR产物(图30a)，证实了在HEK293细胞中存在不可切割的del32等位基因。然而，出乎意料的是，del32特异性RGEN同样有效地切割来自野生型细胞的PCR产物和来自HEK293细胞的PCR产物。有趣的是，该RGEN在标靶位点的紧下游具有一个带有单碱基错配的脱靶位点(图30)。这些结果表明，RGEN可以用来检测天然存在的Indel，但由于其脱靶效应而不能区分具有单核苷酸多态性或点突变的序列。
为了使用RGEN基因分型致癌的单核苷酸变异，我们通过采用单碱基错配向导RNA代替完全匹配的RNA来减弱RGEN活性。含有特异于野生型序列或突变体序列的完全匹配的向导RNA的RGEN切割两个序列(图31a和32a)。与此相反，含有单碱基错配的向导RNA的RGEN区分了两个序列，从而能够对人癌细胞系中KRAS、PIK3CA和IDH1基因中的三个频发致癌点突变进行基因分型(图29b和图33a，b)。此外，使用识别NAG PAM序列的RGEN，我们能够检测BRAF和NRAS基因中的点突变(图33c，d)。我们相信，我们能够使用RGEN-RFLP对几乎所有(如果不是全部的话)的人和其他基因组中的突变或多态性进行基因分型。
上述数据提出，RGEN可以提供一个使用简单且稳健的RFLP分析用于各种序列变异的平台。在重编程靶序列方面具有高度灵活性，RGEN可用于检测各种遗传变异(单核苷酸变异，小的插入/缺失，结构变异)，如疾病相关的复发突变、药物反应相关的患者基因型、以及由工程化的核酸酶在细胞中诱导的突变。这里，我们使用RGEN基因分型检测了由工程化的核酸酶在细胞和动物中诱导的突变。原则上，也可以使用RGEN特异性地检测和切割天然存在的变体和突变。
根据上面的描述，本领域技术人员应当理解，在实施本发明时可使用本文所述实施方案的各种变体方案，而不偏离权利要求中限定的本发明的技术构思或者基本特征。在这方面，上述实施例仅用于举例说明的目的，并且本发明不旨在受这些实施例的限制。本发明的范围应被理解为包括在权利要求或者其等同构思的含义和范围上衍生的所有修改或修饰形式。
本发明包括如下实施方案：
1.一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物，其包含特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA、和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
2.根据实施方案1所述的组合物，其中所述靶DNA是内源性靶DNA。
3.根据实施方案1所述的组合物，其中所述向导RNA是含有crRNA和tracrRNA的dualRNA。
4.根据实施方案1所述的组合物，其中所述向导RNA是单链向导RNA(sgRNA)。
5.根据实施方案4所述的组合物，其中所述单链向导RNA含有crRNA和tracrRNA的部分。
6.根据实施方案1所述的组合物，其中所述向导RNA在单链向导RNA或dualRNA的crRNA的5'末端还包含一个或多个附加的核苷酸。
7.根据实施方案1所述的组合物，其中所述向导RNA在单链向导RNA或dualRNA的crRNA的5'末端还包含2个附加的鸟嘌呤核苷酸。
8.根据实施方案1所述的组合物，其在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变。
9.根据实施方案1所述的组合物，其用于对真核细胞或生物体中的基因组进行体外基因分型。
10.根据实施方案1所述的组合物，其中向导RNA和Cas蛋白质可以以对子的形式发挥作用，其中该对子包含在不同的链上诱导两个缺口的两个向导RNA。
11.根据实施方案1所述的组合物，其中向导RNA可以是分离的RNA的形式，或者在载体中编码，其中载体是病毒载体、质粒载体或农杆菌载体。
12.根据实施方案1所述的组合物，其包含特异于靶DNA的向导RNA和Cas9蛋白质。
13.根据实施方案1所述的组合物，其用于离体或体内切割真核细胞或生物体中的靶DNA。
14.根据实施方案1所述的组合物，其中Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质源自链球菌属细菌。
15.根据实施方案14所述的组合物，其中链球菌属细菌是化脓性链球菌。
16.根据实施方案15所述的组合物，其中Cas蛋白质识别NGG三核苷酸。
17.根据实施方案1所述的组合物，其中Cas蛋白质是Cas9蛋白质或其变体。
18.根据实施方案1所述的组合物，其中Cas蛋白质连接至蛋白质转导结构域。
19.根据实施方案17所述的组合物，其中Cas9蛋白质变体是Cas9的突变体形式，其中催化性天冬氨酸残基转变为任何其它氨基酸。
20.根据实施方案19所述的组合物，其中氨基酸是丙氨酸。
21.根据实施方案1所述的组合物，其中Cas蛋白质编码核酸包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与SEQ ID NO.1具有至少50％同源性的核苷酸序列。
22.根据实施方案1至22任一项所述的组合物用于在真核细胞或生物体中靶向诱变的用途。
23.用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA的试剂盒，其含有根据实施方案1至21任一项所述的组合物。
24.一种制备含有Cas蛋白质和向导RNA的真核细胞或生物体的方法，所述方法包括用Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质以及向导RNA或编码向导RNA的DNA共转染或顺序转染真核细胞或生物体的步骤。
25.根据实施方案24的方法，其中所述向导RNA是含有crRNA和tracrRNA的dualRNA。
26.根据实施方案24所述的方法，其中所述向导RNA是单链向导RNA。
27.根据实施方案26所述的方法，其中所述单链向导RNA含有crRNA和tracrRNA的部分。
28.根据实施方案24所述的方法，其中所述向导RNA在单链向导RNA或dualRNA的crRNA的5'末端还包含一个或多个附加的核苷酸。
29.根据实施方案24所述的方法，其中所述向导RNA在单链向导RNA或dualRNA的crRNA的5'末端还包含2个附加的鸟嘌呤核苷酸。
30.根据实施方案24所述的方法，其中真核细胞或生物体共转染或顺序转染Cas9蛋白质和向导RNA。
31.根据实施方案24所述的方法，其中顺序转染通过如下进行：用Cas蛋白质编码核酸进行第一转染，接着用裸向导RNA进行第二转染。
32.根据实施方案24所述的方法，其中Cas蛋白质是Cas9蛋白质或其变体。
33.根据实施方案24所述的方法，其中Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质源自链球菌属细菌。
34.根据实施方案33所述的方法，其中链球菌属细菌是化脓性链球菌。
35.根据实施方案32所述的方法，其中Cas9蛋白质变体是Cas9的突变体形式，其中催化性天冬氨酸残基转变为任何其它氨基酸。
36.根据实施方案35所述的方法，其中氨基酸是丙氨酸。
37.根据实施方案24所述的方法，其中向导RNA和Cas蛋白质以对子的形式发挥作用，其中该对子含有在不同的DNA链上诱导两个缺口的两个向导RNA。
38.根据实施方案37所述的方法，其中两个缺口至少分开100bp。
39.根据实施方案24所述的方法，其中转染通过选自以下的方法进行:微注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖处理、脂转染、纳米颗粒介导的转染、蛋白质转导结构域介导的转导、病毒介导的基因递送和PEG介导的原生质体转染。
40.一种含有Cas蛋白质和向导RNA的真核细胞或生物体，其通过根据实施方案24至39任一项所述的方法制备。
41.一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的方法，所述方法包括用根据实施方案1至21任一项的组合物转染含有靶DNA的真核细胞或生物体的步骤。
42.根据实施方案41所述的方法，其中真核生物体是哺乳动物或植物。
43.根据实施方案41所述的方法，其中向导RNA和Cas蛋白质以对子的形式发挥作用，其中该对子含有在不同的DNA链上诱导两个缺口的两个向导RNA。
44.根据实施方案43所述的方法，其中两个缺口至少分开100bp。
45.根据实施方案41所述的方法，其中转染是共转染或顺序转染。
46.根据实施方案45所述的方法，其中顺序转染可通过如下进行：用Cas蛋白质编码核酸进行第一转染，接着用裸向导RNA进行第二转染。
47.根据实施方案41所述的方法，其还包括分析切割模式的步骤，其中所述模式指示基因组中突变或变异的检测。
48.一种胚胎，其含有通过根据实施方案1至21任一项的组合物编辑的基因组。
49.一种基因组修饰的动物，其通过将实施方案48的胚胎转移到输卵管中获得。
50.一种植物，其由实施方案24至39任一项所述的方法制备的基因组修饰的原生质体再生。
51.一种制备基因组修饰动物的方法，所述方法包括将根据实施方案1至21任一项所述的组合物引入动物胚胎的步骤；和将胚胎转移到假孕代母输卵管中以产生基因组修饰动物的步骤。
52.一种用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异的组合物，所述组合物含有特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白。
53.根据实施方案52所述的组合物，其中突变或变异由工程化的核酸酶在细胞中诱导。
54.根据实施方案52所述的组合物，其中突变或变异是天然存在的突变或变异。
55.一种用于在分离的生物样品中基因分型病原微生物中的核酸序列的组合物，所述组合物包含特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
56.一种用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异的试剂盒，其包含实施方案52至55任一项所述的组合物。
57.一种用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异的方法，其使用实施方案52至55任一项所述的组合物。
[参考文献]
1.M.Jinek等,Science 337,816(Aug 17,2012).
2.H.Kim,E.Um,S.R.Cho,C.Jung,J.S.Kim,Nat Methods 8,941(Nov,2011).3.H.J.Kim,H.J.Lee,H.Kim,S.W.Cho,J.S.Kim,Genome Res 19,1279(Jul,2009).
4.E.E.Perez等,Nat Biotechnol 26,808(Jul,2008).
5.J.C.Miller等,Nat Biotechnol 29,143(Feb,2011).
6.C.Mussolino等,Nucleic Acids Res 39,9283(Nov,2011).
7.J.Cohen,Science 332,784(May 13,2011).
8.V.Pattanayak,C.L.Ramirez,J.K.Joung,D.R.Liu,Nat Methods 8,765(Sep,2011).
9.R.Gabriel等,Nat Biotechnol 29,816(Sep,2011).
10.E.Kim等,Genome Res,(Apr 20,2012).
11.H.J.Lee,J.Kweon,E.Kim,S.Kim,J.S.Kim,Genome Res 22,539(Mar,2012).
12.H.J.Lee,E.Kim,J.S.Kim,Genome Res 20,81(Jan,2010).
13.Fu Y,Foden JA,Khayter C,Maeder ML,Reyon D,Joung JK,Sander JD.High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in humancells.Nat Biotech advance online publication(2013)

Claims (82)

1.用于在真核细胞或真核生物中切割靶脱氧核糖核酸(DNA)的组合物，其包含：
特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA，和Cas蛋白质-编码核酸或Cas蛋白质；
其中该向导RNA是包含与靶DNA杂交的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)的dualRNA，或者包含crRNA和tracrRNA的部分和与靶DNA杂交的单链向导RNA(sgRNA)；且靶DNA是真核细胞的DNA。
2.权利要求1的组合物，其中所述靶DNA包含含有与crRNA或sgRNA互补的核酸序列的核苷酸的链，以及含有原间隔区邻近基序(protospacer-adjacent motif,PAM)的链。
3.权利要求1的组合物，其中所述crRNA或sgRNA包含与靶DNA互补的20个核苷酸。
4.权利要求1的组合物，其中所述Cas9蛋白质还在C末端或N末端包含核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。
5.权利要求4的组合物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
6.权利要求1的组合物，其中所述靶DNA是真核细胞的内源DNA。
7.权利要求1的组合物，其中所述Cas蛋白质-编码核酸或Cas蛋白质来自于链球菌属(genus Streptococcus)。
8.权利要求7的组合物，其中所述链球菌属是化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)。
9.权利要求2的组合物，其中所述PAM是三核苷酸(trinucleotide)5'-NGG-3'。
10.权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述靶DNA的切割是DNA双链的位点特异性切割。
11.用于在真核细胞或真核生物中切割靶DNA的试剂盒，其包含权利要求1-9中任一项的组合物。
12.动物胚胎，其包含通过权利要求1-9中任一项的组合物编辑的基因组，其中所述动物不是人。
13.通过将权利要求12的胚胎转入动物输卵管获得的基因组修饰的动物，其中所述动物不是人。
14.制备基因组修饰的动物的方法，包括：
将权利要求中1-9任一项的组合物引入动物胚胎；和将胚胎转入假孕代母的输卵管以产生基因组修饰的动物，
其中该动物和假孕代母不是人类。
15.分离的真核细胞或真核生物，包括Cas蛋白质-编码核酸或Cas蛋白质，以及向导RNA或编码向导RNA的DNA，其中该向导RNA是包含与靶DNA杂交的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)的dualRNA，或者是包含crRNA和tracrRNA的部分和与靶DNA杂交的单链向导RNA(sgRNA)；且该真核生物不是人。
16.权利要求15的分离的真核细胞或真核生物，其中所述靶DNA包含含有与crRNA或sgRNA互补的核酸序列的核苷酸的链，以及含有原间隔区邻近基序(PAM)的链；且该真核生物不是人。
17.权利要求15的分离的真核细胞或真核生物，其中所述crRNA或sgRNA包含与靶DNA互补的20个核苷酸；且该真核生物不是人。
18.权利要求15的分离的真核细胞或真核生物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞；且该真核生物不是人。
19.权利要求15的分离的真核细胞或真核生物，其中所述靶DNA是真核细胞的内源DNA；且该真核生物不是人。
20.权利要求15的分离的真核细胞或真核生物，其中所述Cas蛋白质-编码核酸或Cas蛋白质来自于链球菌属(genus Streptococcus)；且该真核生物不是人。
21.权利要求20的分离的真核细胞或真核生物，其中所述链球菌属是化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)；且该真核生物不是人。
22.权利要求15的分离的真核细胞或真核生物，其中所述PAM是三核苷酸5'-NGG-3'；且该真核生物不是人。
23.权利要求15-22中任一项的分离的真核细胞或真核生物，其中所述Cas9蛋白质还在C末端或N末端包含核定位信号(nuclear localization signal,NLS)；且该真核生物不是人。
24.用于在真核细胞或真核生物中切割靶脱氧核糖核酸(DNA)的组合物，其包含：
特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA，和
Cas蛋白质-编码核酸或Cas蛋白质；
其中该向导RNA是包含与靶DNA杂交的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)的dualRNA，或者是包含crRNA和tracrRNA的至少部分和靶DNA杂交的单链向导RNA(sgRNA)；
该sgRNA或crRNA的5’-末端还包含至少一个附加的核苷酸；且
靶DNA是真核细胞的DNA。
25.权利要求24的组合物，其中所述附加的核苷酸是两个鸟嘌呤。
26.权利要求24的组合物，其中所述靶DNA包含含有与crRNA或sgRNA互补的核酸序列的核苷酸的链，以及含有原间隔区邻近基序(protospacer-adjacent motif,PAM)的链。
27.权利要求24的组合物，其中所述crRNA或sgRNA包含与靶DNA互补的20个核苷酸。
28.权利要求24的组合物，其中所述Cas蛋白质-编码核酸或Cas蛋白质来自于链球菌属(genus Streptococcus)。
29.权利要求28的组合物，其中所述链球菌属是化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)。
30.权利要求26的组合物，其中所述PAM是三核苷酸(trinucleotide)5'-NGG-3'。
31.权利要求24的组合物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
32.权利要求24的组合物，其中所述靶DNA是真核细胞的内源DNA。
33.权利要求24的组合物，其中所述Cas9蛋白质还在C末端或N末端包含核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。
34.在分离的真核细胞或真核生物中切割靶DNA的方法，包括权利要求24-33中任一项的组合物转染进入包含靶DNA的该分离的真核细胞或真核生物，其中所述真核生物不是人。
35.权利要求34的方法，其中所述真核生物是人以外的哺乳动物或是植物。
36.权利要求34的方法，其中所述转染是共转染或顺序转染。
37.权利要求36的方法，其中所述转染是先转染Cas蛋白质-编码核酸后转染向导RNA的顺序转染。
38.权利要求34的方法，其中所述靶DNA的切割是DNA双链的位点特异性切割。
39.包含由权利要求24-33中任一项的组合物编辑的基因组的动物的胚胎，其中所述动物不是人。
40.通过将权利要求39的胚胎转入动物的输卵管获得的基因组修饰的动物，其中所述动物不是人。
41.制备基因组修饰的动物的方法，包括：
将权利要求24-33中任一项的组合物引入动物的胚胎；和
将胚胎转入假孕代母的输卵管以生成基因组修饰的动物，
其中该动物和假孕代母不是人类。
42.分离的真核细胞或真核生物，其包含Cas蛋白质-编码核酸或Cas蛋白质，以及向导RNA或编码向导RNA的DNA，
其中该向导RNA是包含与靶DNA杂交的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)的dualRNA，或者是包含crRNA和tracrRNA的至少部分和靶DNA杂交的单链向导RNA(sgRNA)；
该sgRNA或crRNA的5’-末端还包含至少一个附加的核苷酸；和
该真核生物不是人。
43.权利要求42的分离的真核细胞或真核生物，其中所述附加的核苷酸是两个鸟嘌呤。
44.权利要求42的分离的真核细胞或真核生物，其中所述crRNA或sgRNA包含与靶DNA互补的20个核苷酸。
45.权利要求42-44中任一项的分离的真核细胞或真核生物，其中所述Cas9蛋白质还在C末端或N末端包含核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。
46.用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异的组合物，其包含：
特异于靶DNA序列的向导RNA，和
Cas蛋白，
其中所述向导RNA是包含能与靶DNA序列杂交的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)的双重RNA，或是能与靶DNA序列杂交的包含所述crRNA和所述tracrRNA的部分的单链向导RNA(sgRNA)，
其中所述crRNA或sgRNA的5’末端包含两个鸟嘌呤，
其中所述基因分型用于限制性片段长度多态性(RFLP)分析。
47.权利要求46的组合物，其中所述突变或变异是由细胞中的核酸酶诱导的。
48.权利要求46的组合物，其中所述突变或变异是天然存在的突变或变异。
49.用于在分离的生物样品中对病原微生物的核酸序列进行基因分型的组合物，其包含：
特异于靶DNA序列的向导RNA，和
Cas9蛋白,
其中所述向导RNA是包含能与靶DNA序列杂交的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)的双重RNA，或是能与靶DNA序列杂交的包含所述crRNA和所述tracrRNA的部分的单链向导RNA(sgRNA)，
其中所述crRNA或sgRNA的5’末端包含两个鸟嘌呤，
其中所述基因分型用于限制性片段长度多态性(RFLP)分析。
50.用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异的试剂盒，其包含权利要求46-48任一项的组合物。
51.权利要求46-48任一项的组合物在分离的生物样品中基因分型突变或变异的方法。
52.权利要求47的组合物，其中所述核酸选自锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease,ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like EffectorNucleases,TALENs)或RNA-引导核酸内切酶(RGEN)。
53.权利要求46-49和52任一项的组合物，其中所述Cas9蛋白在C-末端或N-末端包含核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。
54.用于修饰植物细胞基因组DNA的组合物，其包含：
Cas9蛋白-向导RNA复合物，
其中所述Cas9蛋白包含核定位信号(Nuclei localization Signal；NLS)，
其中所述向导RNA包含crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(transactivating crRNA)，所述crRNA包含与所述植物细胞基因组DNA的至少部分杂交的互补部分(complementaryportion)，且crRNA和tracrRNA各自包含能够与Cas9蛋白相互作用的部分，和
所述向导RNA是双重RNA或单链RNA，其中该双重RNA包含不连接的crRNA和tracrRNA，且所述单链RNA包含彼此连接的crRNA和tracrRNA，
其中所述Cas9蛋白-向导RNA复合物由能与Cas9蛋白相互作用的crRNA和tracrRNA的部分和Cas9蛋白形成，
其中所述组合物不包含DNA，且
其中所述修饰(modification)是DNA序列中的至少一个或多个核苷酸(nucleotide)缺失(deletion)、插入(insertion)、替换(substitution)或indel(insertion anddeletion；indel),
所述修饰是在植物细胞基因组DNA中形成,
修饰植物细胞基因组DNA的组合物。
55.权利要求54的组合物，还包含:
用于植物细胞转染(transfection)的缓冲液,修饰植物细胞基因组DNA的组合物。
56.权利要求55的组合物，其中所述缓冲液包含聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG),修饰植物细胞基因组DNA的组合物。
57.权利要求54的组合物，其中所述修饰在基因组DNA中引入基因敲除,修饰植物细胞基因组DNA的组合物。
58.权利要求54的组合物，其中所述修饰与基因组DNA中基因的表达与否有关,修饰植物细胞基因组DNA的组合物。
59.修饰植物细胞基因组DNA的方法，其包括：
制备包含Cas9蛋白-向导RNA复合物的组合物；和
将所述组合物引入植物细胞，
其中所述Cas9蛋白包含核定位信号(Nuclei localization Signal；NLS)，
其中所述向导RNA包含crRNA和tracrRNA，所述crRNA包含与所述植物细胞基因组DNA的至少部分杂交的互补部分，且所述crRNA和tracrRNA各自包含能够与Cas9蛋白相互作用的部分，和
所述向导RNA是双重RNA或单链RNA，其中所述双重RNA包含不连接的crRNA和tracrRNA，且所述单链RNA包含彼此连接的crRNA和tracrRNA，
其中所述Cas9蛋白-向导RNA复合物由能与Cas9蛋白相互作用的crRNA和tracrRNA的部分和Cas9蛋白形成，
其中所述组合物不包含DNA，且
其中所述修饰(modification)是DNA序列中的至少一个或多个核苷酸(nuleotide)缺失(deletion)、插入(insertion)、替换(substitution)或indel(insertion anddeletion；indel)，
所述修饰是在植物细胞基因组DNA中形成，
修饰植物细胞基因组DNA的方法。
60.权利要求59的方法，其中使用用于植物细胞转染的缓冲液将所述组合物引入植物细胞，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
61.权利要求60的方法，其中所述缓冲液包含聚乙二醇(PEG)，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
62.权利要求59的方法，其中通过微注射(microinjection)、电穿孔(electroporation)、DEAE-葡聚糖处理(DEAE-dextran treatment)、脂转染(lipofection)、纳米颗粒介导的转染和蛋白质转导结构域介导的转导中的至少一种方法将所述组合物引入植物细胞，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
63.权利要求59的方法，其中在引入所述组合物前，所述植物细胞以原生质体(protoplast)形式提供，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
64.权利要求63的方法，其中向植物细胞应用特定的酶以消化细胞壁，从而将所述植物细胞提供为原生质体，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
65.权利要求64的方法，其中所述特定的酶包含在酶溶液中，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
66.权利要求65的方法，其中所述酶溶液包含纤维素酶(cellulase)和离析酶(macerozyme)中的至少一种，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
67.权利要求59的方法，其中所述引入包括提供将所述组合物与原生质体接触的条件(condition)，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
68.权利要求67的方法，其中所述条件将所述组合物与所述原生质体的接触维持一定时间段(time duration)，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
69.权利要求68的方法，其中在所述一定时间段之后去除所述条件，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
70.权利要求69的方法，其中通过应用洗脱缓冲液去除所述条件，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
71.权利要求70的方法，其中在应用所述洗涤缓冲液后，所述原生质体不再被所述组合物转染，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
72.权利要求71的方法，其中包含在所述组合物中的所述Cas9蛋白-向导RNA复合物在所述一定时间段内被引入所述原生质体，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
73.权利要求72的方法，其中引入所述原生质体的所述Cas9蛋白-向导RNA复合物在接触后被激活24小时，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
74.权利要求73的方法，其中所述Cas9蛋白-向导RNA复合物在接触后引入原生质体的核24小时以修饰所述植物细胞的基因组DNA，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
75.权利要求74的方法，其中通过在接触后将所述Cas9蛋白-向导RNA复合物激活24小时以引入indel，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
76.权利要求75的方法，其中所述indel未在接触后24小时引入，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
77.权利要求59的方法，其中在引入后所述引入植物细胞的Cas9蛋白-向导RNA复合物被激活24小时，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
78.权利要求77的方法，其中在引入后通过激活所述Cas9蛋白-向导RNA复合物24小时引入indel，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
79.权利要求78的方法，其中所述indel未在引入后24小时引入，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
80.权利要求59的方法，其中所述修饰与基因组DNA中基因的表达与否有关，修饰植物细胞基因组DNA的方法。
81.用于修饰真核细胞基因组DNA的组合物，其包含：
Cas9蛋白-向导RNA复合物，
其中所述Cas9蛋白包含核定位信号(Nuclei localization Singal；NLS)，
其中所述向导RNA包含crRNA和tracrRNA，所述crRNA包含与所述真核细胞基因组DNA的至少部分杂交的互补部分，且crRNA和tracrRNA各自包含能够与Cas9蛋白相互作用的部分，和
所述向导RNA是双重RNA或单链RNA，其中该双重RNA包含未连接的crRNA和tracrRNA，且所述单链RNA包含彼此连接的crRNA和tracrRNA，
其中所述Cas9蛋白-向导RNA复合物由能与Cas9蛋白相互作用的crRNA和tracrRNA的部分和Cas9蛋白形成，
其中所述组合物不包含DNA，且
其中所述修饰(modification)是DNA序列中的至少一个或多个核苷酸(nucleotide)缺失(deletion)、插入(insertion)、替换(substitution)或indel(insertion anddeletion；indel),
所述修饰是在真核细胞基因组DNA中形成,
修饰真核细胞基因组DNA的组合物。
82.体外或离体修饰真核细胞基因组DNA的方法，其包括：
制备包含Cas9蛋白-向导RNA复合物的组合物；和
将所述组合物引入真核细胞，
其中所述Cas9蛋白包含核定位信号(Nuclei Localization Signal；NLS)，
其中所述向导RNA包含crRNA和tracrRNA，所述crRNA包含与所述真核细胞基因组DNA的至少部分杂交的互补部分，且所述crRNA和tracrRNA各自包含能够与Cas9蛋白相互作用的部分，和
所述向导RNA是双重RNA或单链RNA，其中所述双重RNA包含不连接的crRNA和tracrRNA，且所述单链RNA包含彼此连接的crRNA和tracrRNA，
其中所述Cas9蛋白-向导RNA复合物由能与Cas9蛋白相互作用的crRNA和tracrRNA的部分和Cas9蛋白形成，
其中所述组合物不包含DNA，且
其中所述修饰(modification)是DNA序列中的至少一个或多个核苷酸(nucleotide)缺失(deletion)、插入(insertion)、替换(substitution)或indel(insertion anddeletion；indel)，
所述修饰是在真核细胞基因组DNA中形成。
CN202211116560.4A 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的组合物及其用途 Pending CN116064532A (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261717324P 2012-10-23 2012-10-23
US61/717,324 2012-10-23
US201361803599P 2013-03-20 2013-03-20
US61/803,599 2013-03-20
US201361837481P 2013-06-20 2013-06-20
US61/837,481 2013-06-20
CN201380066348.4A CN104968784B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 包含向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的组合物及其用途
PCT/KR2013/009488 WO2014065596A1 (en) 2012-10-23 2013-10-23 Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380066348.4A Division CN104968784B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 包含向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的组合物及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116064532A true CN116064532A (zh) 2023-05-05

Family

ID=50544909

Family Applications (9)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510884156.5A Active CN105441440B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合物及其用途
CN201910137869.3A Active CN110066775B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的组合物及其用途
CN201910950935.9A Pending CN110669758A (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna 的组合物及其用途
CN201380066348.4A Active CN104968784B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 包含向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的组合物及其用途
CN201910950792.1A Active CN110592089B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的组合物及其用途
CN202211117242.XA Pending CN116064533A (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的组合物及其用途
CN201910950683.XA Pending CN110643600A (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的系统及其用途
CN202211116560.4A Pending CN116064532A (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的组合物及其用途
CN201910950859.1A Active CN110669746B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的组合物及其用途

Family Applications Before (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510884156.5A Active CN105441440B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合物及其用途
CN201910137869.3A Active CN110066775B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的组合物及其用途
CN201910950935.9A Pending CN110669758A (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna 的组合物及其用途
CN201380066348.4A Active CN104968784B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 包含向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的组合物及其用途
CN201910950792.1A Active CN110592089B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的组合物及其用途
CN202211117242.XA Pending CN116064533A (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的组合物及其用途
CN201910950683.XA Pending CN110643600A (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的系统及其用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910950859.1A Active CN110669746B (zh) 2012-10-23 2013-10-23 用于切割靶dna的组合物及其用途

Country Status (16)

Country Link
US (9) US20150284727A1 (zh)
EP (7) EP3733847B1 (zh)
JP (7) JP6517143B2 (zh)
KR (5) KR101656237B1 (zh)
CN (9) CN105441440B (zh)
AU (5) AU2013335451B2 (zh)
BR (1) BR112015008708A2 (zh)
CA (2) CA2888190A1 (zh)
DE (2) DE202013012610U1 (zh)
DK (1) DK2912175T3 (zh)
ES (3) ES2690386T3 (zh)
HK (4) HK1212732A1 (zh)
PL (1) PL2912175T3 (zh)
PT (1) PT2912175T (zh)
SG (3) SG10201809564YA (zh)
WO (1) WO2014065596A1 (zh)

Families Citing this family (360)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
SG10201702445TA (en) 2012-04-25 2017-04-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
CN116622704A (zh) * 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
CN105441440B (zh) 2012-10-23 2020-12-15 基因工具股份有限公司 包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合物及其用途
KR102531576B1 (ko) * 2012-12-06 2023-05-11 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
EP2932421A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP4234696A3 (en) * 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
ES2576128T3 (es) 2012-12-12 2016-07-05 The Broad Institute, Inc. Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
JP6552965B2 (ja) * 2012-12-12 2019-07-31 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
ES2883590T3 (es) * 2012-12-12 2021-12-09 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
CN113528577A (zh) * 2012-12-12 2021-10-22 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
RU2766685C2 (ru) 2012-12-17 2022-03-15 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Рнк-направляемая инженерия генома человека
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
AU2014235794A1 (en) 2013-03-14 2015-10-22 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
MX2015011985A (es) * 2013-03-15 2016-04-07 Univ Minnesota Ingenieria genomica de plantas utilizando sistemas crispr/cas.
CN115261411A (zh) * 2013-04-04 2022-11-01 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
LT3456831T (lt) 2013-04-16 2021-09-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tikslinis žiurkės genomo modifikavimas
US20160186208A1 (en) * 2013-04-16 2016-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal
WO2014186686A2 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
WO2014191518A1 (en) * 2013-05-29 2014-12-04 Cellectis A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
CN105451778B (zh) * 2013-06-04 2021-08-03 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-导向的转录调控
EP3008186B1 (en) 2013-06-14 2018-11-28 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
CN105793425B (zh) 2013-06-17 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CA2915834A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
CN116042726A (zh) * 2013-07-09 2023-05-02 哈佛大学校长及研究员协会 多重rna向导的基因组工程
EP3019595A4 (en) 2013-07-09 2016-11-30 THERAPEUTIC USES OF A GENERIC CHANGE WITH CRISPR / CAS SYSTEMS
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
CN105848793B (zh) 2013-08-16 2019-03-05 麻省理工学院 材料选择性的递送至细胞
EP3611268A1 (en) 2013-08-22 2020-02-19 E. I. du Pont de Nemours and Company Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
WO2015040402A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Kymab Limited Methods. cells & organisms
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
WO2015066119A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri
DK3066201T3 (en) 2013-11-07 2018-06-06 Editas Medicine Inc CRISPR-RELATED PROCEDURES AND COMPOSITIONS WITH LEADING GRADES
US10787684B2 (en) * 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
WO2015088643A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
ES2700596T3 (es) 2013-12-11 2019-02-18 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para la modificación dirigida de un genoma
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
JP6712948B2 (ja) 2013-12-12 2020-06-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
CA2932439A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
AU2014361781B2 (en) 2013-12-12 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR -Cas systems and compositions for genome editing
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
EP3690044B1 (en) 2014-02-11 2024-01-10 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
RU2016136977A (ru) 2014-02-18 2018-03-20 Дьюк Юниверсити Композиции для инактивации репликации вируса и способы их получения и применения
EP3971283A1 (en) 2014-02-27 2022-03-23 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for site directed genomic modification
EP3114227B1 (en) 2014-03-05 2021-07-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
EP3553176A1 (en) 2014-03-10 2019-10-16 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
EP3981876A1 (en) 2014-03-26 2022-04-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
CA2944978C (en) 2014-04-08 2024-02-13 North Carolina State University Methods and compositions for rna-directed repression of transcription using crispr-associated genes
WO2015179540A1 (en) * 2014-05-20 2015-11-26 Regents Of The University Of Minnesota Method for editing a genetic sequence
WO2015183025A1 (ko) * 2014-05-28 2015-12-03 주식회사 툴젠 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 민감한 검출 방법
WO2015188065A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
ES2784754T3 (es) 2014-06-06 2020-09-30 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para modificar un locus objetivo
CA2951707A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
CN106536056B (zh) 2014-06-13 2021-07-16 儿童医学中心公司 分离线粒体的产品和方法
SI3354732T1 (sl) 2014-06-23 2020-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Z nukleazo posredovan DNA sklop
WO2015200555A2 (en) * 2014-06-25 2015-12-30 Caribou Biosciences, Inc. Rna modification to engineer cas9 activity
US20150376587A1 (en) * 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
SI3161128T1 (sl) 2014-06-26 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopki in sestavki za ciljano genetsko spremembo in postopki uporabe
CN106687594A (zh) 2014-07-11 2017-05-17 纳幕尔杜邦公司 用于产生对草甘膦除草剂具有抗性的植物的组合物和方法
WO2016011080A2 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
EP3172321B2 (en) * 2014-07-21 2023-01-04 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
JP6715419B2 (ja) * 2014-08-06 2020-07-01 トゥールジェン インコーポレイテッド カンピロバクター・ジェジュニｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムに由来するｒｇｅｎを使用したゲノム編集
US10280402B2 (en) 2014-08-06 2019-05-07 College Of Medicine Pochon Cha University Industry-Academic Cooperation Foundation Immune-compatible cells created by nuclease-mediated editing of genes encoding HLA
US11071289B2 (en) 2014-08-14 2021-07-27 Biocytogen Boston Corp DNA knock-in system
US9970030B2 (en) 2014-08-27 2018-05-15 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing CAS9-mediated engineering efficiency
WO2016033298A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 North Carolina State University Novel cas9 proteins and guiding features for dna targeting and genome editing
US10570418B2 (en) 2014-09-02 2020-02-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification
CA2956487A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
CN104212836A (zh) * 2014-09-18 2014-12-17 东华大学 一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法
WO2016061416A1 (en) 2014-10-15 2016-04-21 Sage Science, Inc. Apparatuses, methods and systems for automated processing of nucleic acids and electrophoretic sample preparation
EP3561052A1 (en) 2014-10-15 2019-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating or maintaining pluripotent cells
US11111472B2 (en) 2014-10-31 2021-09-07 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of biomolecules to immune cells
DK3597740T3 (da) * 2014-11-06 2022-06-20 Dupont Us Holding Llc Peptidmedieret indføring af rna-styret endonuklease i celler
WO2016073990A2 (en) * 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
US11352666B2 (en) 2014-11-14 2022-06-07 Institute For Basic Science Method for detecting off-target sites of programmable nucleases in a genome
CN107109486B (zh) * 2014-11-14 2021-08-13 基础科学研究院 用于检测基因组中遗传剪刀的脱靶位点的方法
RS58893B1 (sr) 2014-11-21 2019-08-30 Regeneron Pharma Postupci i kompozicije za ciljanu genetičku modifikaciju korišćenjem parnih vodećih rnk
CN107250148B (zh) 2014-12-03 2021-04-16 安捷伦科技有限公司 具有化学修饰的指导rna
US9888673B2 (en) 2014-12-10 2018-02-13 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
JP6814142B2 (ja) * 2014-12-16 2021-01-13 ダニスコ・ユーエス・インク 真菌ゲノム改変システムおよび使用方法
JP2017538427A (ja) * 2014-12-18 2017-12-28 インテグレイテッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレイテッド Ｃｒｉｓｐｒ系組成物及び使用方法
EP3234111A1 (en) 2014-12-19 2017-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
CN107208113A (zh) 2014-12-19 2017-09-26 瑞泽恩制药公司 用于通过单步多重靶向进行靶向遗传修饰的方法和组合物
WO2016115179A1 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Gene editing through microfluidic delivery
UA125246C2 (uk) * 2015-03-16 2022-02-09 Інстітьют Оф Генетікс Енд Дівелопментл Байолоджі, Чайніз Екадемі Оф Сайнсис Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів
WO2016150855A1 (en) * 2015-03-20 2016-09-29 Danmarks Tekniske Universitet Crispr/cas9 based engineering of actinomycetal genomes
WO2016154579A2 (en) * 2015-03-26 2016-09-29 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-mediated gene conversion
WO2016160389A1 (en) 2015-03-27 2016-10-06 E I Du Pont De Nemours And Company Soybean u6 small nuclear rna gene promoters and their use in constitutive expression of small rna genes in plants
KR102648489B1 (ko) 2015-04-06 2024-03-15 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
AU2016253150B2 (en) 2015-04-24 2022-04-21 Editas Medicine, Inc. Evaluation of Cas9 molecule/guide RNA molecule complexes
AU2016261358B2 (en) 2015-05-11 2021-09-16 Editas Medicine, Inc. Optimized CRISPR/Cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
KR101785847B1 (ko) 2015-05-12 2017-10-17 연세대학교 산학협력단 선형 이중가닥 ＤＮＡ를 활용한 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ 시스템을 이용한 표적 유전체 교정
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
KR102451796B1 (ko) 2015-05-29 2022-10-06 노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티 크리스퍼 핵산을 사용하여 박테리아, 고세균, 조류 및 효모를 스크리닝하는 방법
CN108368502B (zh) 2015-06-03 2022-03-18 内布拉斯加大学董事委员会 使用单链dna的dna编辑
AU2016276702B2 (en) 2015-06-09 2022-07-28 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for improving transplantation
EP3307872B1 (en) 2015-06-15 2023-09-27 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
CN108290933A (zh) 2015-06-18 2018-07-17 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
JP2018519811A (ja) 2015-06-29 2018-07-26 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 修飾ｃｒｉｓｐｒ ｒｎａ及び修飾単一ｃｒｉｓｐｒ ｒｎａならびにその使用
JP6925984B2 (ja) 2015-07-09 2021-08-25 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 無核細胞への物質の送達
EP3329001B1 (en) * 2015-07-28 2021-09-22 Danisco US Inc. Genome editing systems and methods of use
WO2017023803A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Regents Of The University Of Minnesota Modified cells and methods of therapy
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
EP4043074A1 (en) 2015-08-14 2022-08-17 The University of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
CA2996001A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
EP3344575B1 (en) 2015-09-04 2020-04-15 SQZ Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall
WO2017053312A1 (en) * 2015-09-21 2017-03-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
EP3786294A1 (en) 2015-09-24 2021-03-03 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
WO2017058751A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
CN108368516A (zh) * 2015-10-06 2018-08-03 基础科学研究院 用于从原生质体生成整个植物的方法
US20180273960A1 (en) * 2015-10-20 2018-09-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for marker-free genome modification
JP7109784B2 (ja) 2015-10-23 2022-08-01 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子編集のための進化したＣａｓ９蛋白質
DK3350327T3 (en) 2015-10-23 2019-01-21 Caribou Biosciences Inc CONSTRUCTED CRISPR CLASS-2-NUCLEIC ACID TARGETING-NUCLEIC ACID
AU2016349288A1 (en) 2015-11-03 2018-05-31 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
KR101885901B1 (ko) * 2015-11-13 2018-08-07 기초과학연구원 5' 말단의 인산기가 제거된 rna를 포함하는 리보핵산단백질 전달용 조성물
EP3414255B1 (en) * 2015-11-20 2021-09-22 Washington University Preparative electrophoretic method for targeted purification of genomic dna fragments
EP3383411A4 (en) 2015-11-30 2019-07-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS RELATING TO CHONDRISOMES FROM CULTIVATED CELLS
CN106811479B (zh) * 2015-11-30 2019-10-25 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用
US9771600B2 (en) 2015-12-04 2017-09-26 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
CN106845151B (zh) * 2015-12-07 2019-03-26 中国农业大学 CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置
WO2017099494A1 (ko) * 2015-12-08 2017-06-15 기초과학연구원 Cpf1을 포함하는 유전체 교정용 조성물 및 그 용도
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
JP7012645B2 (ja) 2016-01-11 2022-01-28 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー キメラタンパク質および免疫治療の方法
EA201891619A1 (ru) 2016-01-11 2019-02-28 Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Химерные белки и способы регулирования экспрессии генов
JP2019501659A (ja) * 2016-01-15 2019-01-24 ザ ジャクソン ラボラトリー Ｃａｓ９タンパク質のマルチサイクルエレクトロポレーションによる遺伝子修飾非ヒト哺乳動物
EP3433364A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
BR112018069795A2 (pt) * 2016-03-30 2019-01-29 Intellia Therapeutics Inc formulações de nanopartículas lipídicas para componentes de crispr/cas
WO2017180694A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules gene editing systems, and methods of use thereof
WO2017189525A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
CN107326046A (zh) * 2016-04-28 2017-11-07 上海邦耀生物科技有限公司 一种提高外源基因同源重组效率的方法
EP3457840B1 (en) 2016-05-20 2024-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
CN117431234A (zh) * 2016-05-27 2024-01-23 阿迪根有限公司 用于基因组编辑分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒
EP3272867B1 (en) 2016-06-02 2019-09-25 Sigma Aldrich Co. LLC Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
KR102523302B1 (ko) * 2016-06-15 2023-04-20 주식회사 툴젠 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도
US20190330603A1 (en) * 2016-06-17 2019-10-31 Genesis Technologies Limited Crispr-cas system, materials and methods
EP3455357A1 (en) 2016-06-17 2019-03-20 The Broad Institute Inc. Type vi crispr orthologs and systems
AU2017282623B2 (en) * 2016-06-20 2023-09-21 Keygene N.V. Method for targeted DNA alteration in plant cells
CN109688820B (zh) 2016-06-24 2023-01-10 科罗拉多州立大学董事会（法人团体） 用于生成条形码化组合文库的方法
WO2018009525A1 (en) * 2016-07-05 2018-01-11 The Johnson Hopkins University Crispr/cas9-based compositions and methods for treating cancer
BR112019000430A2 (pt) 2016-07-13 2019-07-09 Dsm Ip Assets Bv sistema crispr-cas para uma célula hospedeira de algas
JP7004651B2 (ja) * 2016-07-19 2022-02-04 株式会社バイオダイナミクス研究所 長鎖一本鎖ｄｎａを調製する方法
KR101961332B1 (ko) 2016-07-28 2019-03-22 기초과학연구원 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 안질환 치료용 약학 조성물
KR20190041476A (ko) 2016-07-29 2019-04-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 C-절단된 피브릴린-1의 발현을 유도하는 돌연변이를 포함하는 마우스
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
KR101856345B1 (ko) * 2016-08-24 2018-06-20 경상대학교산학협력단 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 이중-넉아웃 고양이를 제조하는 방법
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
CA3039409A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
US11242542B2 (en) 2016-10-07 2022-02-08 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
KR101997116B1 (ko) 2016-10-14 2019-07-05 연세대학교 산학협력단 Kras 유전자에 상보적인 가이드 rna 및 이의 용도
WO2018071868A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 President And Fellows Of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
GB2573406B (en) 2016-10-18 2021-11-10 Univ Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy
CA3042259A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Flagship Pioneering Innovations V. Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
CN109906030B (zh) 2016-11-04 2022-03-18 安健基因公司 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
EP3539980A4 (en) * 2016-11-14 2020-10-07 Toolgen Incorporated CONTROL SYSTEM WITH ARTIFICALLY MANIPULATED SC FUNCTION
US11136567B2 (en) 2016-11-22 2021-10-05 Integrated Dna Technologies, Inc. CRISPR/CPF1 systems and methods
US11293022B2 (en) 2016-12-12 2022-04-05 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing enhancement
KR101748575B1 (ko) * 2016-12-16 2017-06-20 주식회사 엠젠플러스 Ins 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법
US20200208166A1 (en) * 2016-12-22 2020-07-02 Toolgen Incorporated Oleic Acid-Enriched Plant Body Having Genetically Modified FAD2 And Production Method Thereof
JP2020504612A (ja) * 2016-12-23 2020-02-13 インスティテュート フォー ベーシック サイエンスＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ 動物胚の塩基編集用組成物および塩基編集方法
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
JP6994730B2 (ja) * 2016-12-26 2022-02-04 独立行政法人酒類総合研究所 ゲノム編集タンパク質の直接導入による糸状菌ゲノム編集方法
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
KR102515727B1 (ko) * 2017-01-11 2023-03-30 주식회사 툴젠 중첩된 가이드핵산을 이용한 표적 핵산에 특정 핵산 서열을 삽입하기 위한 조성물 및 방법
MX2019008675A (es) 2017-01-23 2019-09-18 Regeneron Pharma Variantes de hidroxiesteroide 17-beta deshidrogenasa 13 (hsd17b13) y usos de estas.
CA3051585A1 (en) 2017-01-28 2018-08-02 Inari Agriculture, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
JP2020508693A (ja) * 2017-03-06 2020-03-26 インスティテュート フォー ベーシック サイエンスＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集用組成物およびこれを用いたゲノム編集方法
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
KR20190127797A (ko) 2017-03-10 2019-11-13 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 시토신에서 구아닌으로의 염기 편집제
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
CA3057192A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
JP2020515250A (ja) 2017-04-07 2020-05-28 セージ サイエンス， インコーポレイテッド 統合型電気泳動ｄｎａ精製を使用する遺伝的構造変動を検出するためのシステムおよび方法
WO2018189360A1 (en) * 2017-04-13 2018-10-18 Cellectis New sequence specific reagents targeting ccr5 in primary hematopoietic cells
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
EP3615672A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN108977442B (zh) * 2017-06-05 2023-01-06 广州市锐博生物科技有限公司 用于dna编辑的系统及其应用
EP3635102A1 (en) 2017-06-05 2020-04-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4galt1 variants and uses thereof
CN110997908A (zh) 2017-06-09 2020-04-10 爱迪塔斯医药公司 工程化的cas9核酸酶
US20200123203A1 (en) 2017-06-13 2020-04-23 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions comprising curons and uses thereof
CA3067382A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
CN107488710B (zh) * 2017-07-14 2020-09-22 上海吐露港生物科技有限公司 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒
EP3652312A1 (en) 2017-07-14 2020-05-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
MX2020001178A (es) 2017-07-31 2020-09-25 Regeneron Pharma Celulas madre embrionarias de raton transgenico con cas y ratones y usos de los mismos.
CN110891419A (zh) 2017-07-31 2020-03-17 瑞泽恩制药公司 评价crispr/cas-诱导的与外源供体核酸的体内重组
JP2020533957A (ja) 2017-07-31 2020-11-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｃｒｉｓｐｒリポーター非ヒト動物およびその使用
WO2019024081A1 (zh) 2017-08-04 2019-02-07 北京大学 特异性识别甲基化修饰dna碱基的tale rvd及其应用
WO2019028686A1 (zh) 2017-08-08 2019-02-14 北京大学 基因敲除方法
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
WO2019051419A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 University Of North Texas Health Science Center MODIFIED CASE VARIANTS9
WO2019052577A1 (zh) 2017-09-18 2019-03-21 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种基因编辑t细胞及其用途
US11572574B2 (en) 2017-09-28 2023-02-07 Toolgen Incorporated Artificial genome manipulation for gene expression regulation
JP2020536501A (ja) * 2017-09-28 2020-12-17 ツールゲン インコーポレイテッドＴｏｏｌｇｅｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 遺伝子発現調節のための人為的なゲノム操作
CN111163633B (zh) 2017-09-29 2022-09-09 瑞泽恩制药公司 包含人源化ttr基因座的非人类动物及其使用方法
KR102207352B1 (ko) * 2017-09-29 2021-01-26 서울대학교산학협력단 Klotho 유전자 넉아웃 질환모델 동물 및 이의 용도
JP2021500863A (ja) * 2017-09-29 2021-01-14 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド ゲノム編集用のポリヌクレオチド、組成物および方法
CA3082251A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN109722415B (zh) 2017-10-27 2021-01-26 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种造血干细胞的培养组合物、培养基以及造血干细胞的培养方法
BR112020008201A2 (pt) 2017-10-27 2020-10-06 The Regents Of The University Of California substituição-alvo de receptores de células t endógenos
CN108192956B (zh) * 2017-11-17 2021-06-01 东南大学 一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用
AU2018370588B2 (en) 2017-11-21 2022-09-08 Genkore Co. Ltd. Composition for Genome Editing Using Crispr/CPF1 System and Use Thereof
US20200362366A1 (en) 2018-01-12 2020-11-19 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
JP7075170B2 (ja) * 2018-01-23 2022-05-25 インスティチュート フォー ベーシック サイエンス 延長された単一ガイドｒｎａ及びその用途
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
WO2019156475A1 (ko) * 2018-02-06 2019-08-15 주식회사 진씨커 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 키트 및 이를 이용한 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 방법
KR102086689B1 (ko) * 2018-02-06 2020-03-09 주식회사 진씨커 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 키트 및 이를 이용한 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 방법
CA3089331A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
GB2587970B (en) 2018-04-19 2023-02-08 Univ California Compositions and methods for gene editing
WO2019206233A1 (zh) * 2018-04-25 2019-10-31 中国农业大学 一种RNA编辑的CRISPR/Cas效应蛋白及系统
EP3794130A4 (en) 2018-05-16 2022-07-27 Synthego Corporation METHODS AND SYSTEMS FOR DESIGN AND USE OF GUIDE RNA
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
KR102035654B1 (ko) * 2018-07-23 2019-10-24 대한민국 항균 펩타이드를 생산하는 돌연변이 곤충 세포주 또는 이의 제조방법
US11479762B1 (en) 2018-08-31 2022-10-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
AU2019341000B2 (en) * 2018-09-12 2023-03-16 Institute For Basic Science Composition for inducing death of cells having mutated gene, and method for inducing death of cells having modified gene by using composition
WO2020072248A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system
KR102081962B1 (ko) * 2018-10-11 2020-02-26 충남대학교 산학협력단 아밀로이드 전구 단백질 유전자를 절단하기 위한 조성물
SG11202103732RA (en) 2018-10-18 2021-05-28 Intellia Therapeutics Inc Nucleic acid constructs and methods of use
MX2021004277A (es) 2018-10-18 2021-09-08 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y metodos para expresar el factor ix.
CN113195721A (zh) 2018-10-18 2021-07-30 英特利亚治疗股份有限公司 治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物和方法
CN114207130A (zh) 2018-10-18 2022-03-18 英特利亚治疗股份有限公司 用于从白蛋白基因座进行转基因表达的组合物和方法
EP3875469A4 (en) * 2018-10-29 2022-08-17 China Agricultural University NEW CRISPR/CAS12F ENZYME AND SYSTEM
US20220010321A1 (en) * 2018-11-01 2022-01-13 Keygene N.V. Dual guide rna for crispr/cas genome editing in plants cells
EP3650557B1 (en) * 2018-11-07 2021-10-20 Justus-Liebig-Universität Gießen Method for determination of restriction efficiency of endonucleases mediating double-strand breaks in dna target sequences
JP7426101B2 (ja) * 2018-11-16 2024-02-01 国立大学法人大阪大学 ゲノム編集された細胞を製造する方法
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
US11166996B2 (en) 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
EP3896155A4 (en) * 2018-12-12 2022-08-17 Kyushu University, National University Corporation PRODUCTION PROCESS FOR GENOMEEDIT CELLS
BR112021011372A2 (pt) 2018-12-14 2021-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novos sistemas crispr-cas para edição de genoma
KR20210105914A (ko) 2018-12-20 2021-08-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 뉴클레아제-매개 반복부 팽창
AU2020206997A1 (en) * 2019-01-07 2021-08-26 Crisp-Hr Therapeutics, Inc. A non-toxic Cas9 enzyme and application thereof
CN109868275A (zh) * 2019-03-12 2019-06-11 中国农业大学 CRISPR/Cas9介导的羊FGF5基因敲除和定点整合MTNR1A基因的方法
EP3769090B1 (en) 2019-03-18 2023-11-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
KR20210141522A (ko) 2019-03-18 2021-11-23 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 타우 시딩 또는 응집의 유전적 변형제를 식별하기 위한 CRISPR/Cas 스크리닝 플랫폼
MX2021011426A (es) 2019-03-19 2022-03-11 Broad Inst Inc Metodos y composiciones para editar secuencias de nucleótidos.
JP2022527809A (ja) 2019-04-03 2022-06-06 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗体コード配列をセーフハーバー遺伝子座に挿入するための方法および組成物
JP7065260B2 (ja) 2019-04-04 2022-05-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 標的化ベクターへの標的化改変の瘢痕のない導入のための方法
SG11202108454RA (en) 2019-04-04 2021-09-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
US20220193142A1 (en) 2019-04-30 2022-06-23 Edigene Inc. Method for predicting effectiveness of treatment of hemoglobinopathy
US11692197B2 (en) 2019-05-06 2023-07-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Delivery of biological molecules to plant cells
CN111304180B (zh) * 2019-06-04 2023-05-26 山东舜丰生物科技有限公司 一种新的dna核酸切割酶及其应用
EP3801011A1 (en) 2019-06-04 2021-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
CN113939595A (zh) 2019-06-07 2022-01-14 瑞泽恩制药公司 包括人源化白蛋白基因座的非人动物
AU2020290509A1 (en) 2019-06-14 2021-11-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Models of tauopathy
CA3138663A1 (en) 2019-06-25 2020-12-30 Inari Agriculture Technology, Inc. Improved homology dependent repair genome editing
CN115244176A (zh) * 2019-08-19 2022-10-25 钟明宏 向导rna-cas蛋白复合物的缀合物
WO2021043278A1 (zh) 2019-09-04 2021-03-11 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 基于脱靶评估评价基因编辑治疗的方法
JP2022548031A (ja) 2019-09-13 2022-11-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子によって送達されるｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムを使用する動物における転写調節
AU2020355000A1 (en) 2019-09-23 2022-03-17 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein B (APOB) gene expression
EP4041894A1 (en) 2019-09-23 2022-08-17 Omega Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING HEPATOCYTE NUCLEAR FACTOR 4-ALPHA (HNF4a) GENE EXPRESSION
EP4038190A1 (en) 2019-10-03 2022-08-10 Artisan Development Labs, Inc. Crispr systems with engineered dual guide nucleic acids
WO2021092130A1 (en) * 2019-11-05 2021-05-14 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions and methods for rna-encoded dna-replacement of alleles
WO2021092513A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
JP7448120B2 (ja) * 2019-11-14 2024-03-12 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 プラズマを用いてゲノム編集酵素を植物細胞内に導入する方法
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
WO2021108442A2 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 The Regents Of The University Of California Modulators of cas9 polypeptide activity and methods of use thereof
WO2021136415A1 (zh) 2019-12-30 2021-07-08 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种纯化ucart细胞的方法与应用
WO2021136176A1 (zh) 2019-12-30 2021-07-08 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的通用型car-t及其制备方法和应用
US20230063739A1 (en) * 2020-01-14 2023-03-02 Toolgen Incorporated Cells having high adaptability under hypoxic conditions, and use thereof
US20230053781A1 (en) 2020-01-14 2023-02-23 Toolgen Incorporated Pharmaceutical composition for preventing or treating alzheimer's and use thereof
WO2021163515A1 (en) * 2020-02-12 2021-08-19 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Crispr-cas9 mediated disruption of alcam gene inhibits adhesion and trans-endothelial migration of myeloid cells
KR20210109384A (ko) 2020-02-27 2021-09-06 주식회사 엘지화학 원형질체를 활용한 식물 유전자 교정 효율 증대 방법
US11965161B2 (en) 2020-03-04 2024-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for sensitization of tumor cells to immune therapy
AU2021234302A1 (en) 2020-03-11 2022-11-10 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
WO2021195079A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
US20210319851A1 (en) 2020-04-03 2021-10-14 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
IL297761A (en) 2020-05-08 2022-12-01 Broad Inst Inc Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence
CN111690720B (zh) * 2020-06-16 2021-06-15 山东舜丰生物科技有限公司 利用修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法
US20240002839A1 (en) 2020-12-02 2024-01-04 Decibel Therapeutics, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
KR20220081949A (ko) * 2020-12-09 2022-06-16 재단법인 아산사회복지재단 온-타겟 활성이 유지되고 오프-타겟 활성이 감소된 가이드 rna 및 이의 용도
WO2022140560A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. In vitro assembly of anellovirus capsids enclosing rna
WO2022147133A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
KR102285906B1 (ko) * 2021-02-18 2021-08-04 주식회사 엔에이피 수생태계 교란어종 관리를 위한 큰입배스 불임 유도용 조성물
WO2022240846A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
KR102616916B1 (ko) * 2021-05-11 2023-12-21 주식회사 애이마 발암성 돌연변이 유전자 검출용 가이드 rna 내지 이의 용도
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
WO2022256448A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
EP4347826A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
KR102618072B1 (ko) 2021-06-15 2023-12-28 대한민국 작물의 개화조절 관련 유전자 교정용 가이드 rna 및 이의 용도
CA3223311A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 Andrea BARGHETTI Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
WO2023283359A2 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
CA3225330A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Toolgen Incorporated Mesenchymal stem cell having oxidative stress resistance, preparation method therefor, and use thereof
CN117730144A (zh) 2021-07-29 2024-03-19 株式会社图尔金 具有血液相容性的间充质干细胞、其制备方法及用途
CN113584134B (zh) * 2021-09-06 2024-01-30 青岛金斯达生物技术有限公司 一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用
AU2022343300A1 (en) 2021-09-10 2024-04-18 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
WO2023064924A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Codiak Biosciences, Inc. Modified producer cells for extracellular vesicle production
WO2023077053A2 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
WO2023077148A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2023108047A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
WO2023122764A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
WO2023122800A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 University Of Massachusetts Therapeutic treatment for fragile x-associated disorder
WO2023129974A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
WO2023150181A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2023150623A2 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertion for treatment of pompe disease
WO2023167882A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Artisan Development Labs, Inc. Composition and methods for transgene insertion
CN114410609B (zh) * 2022-03-29 2022-07-12 舜丰生物科技(海南)有限公司 一种活性提高的Cas蛋白以及应用
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023205844A1 (en) * 2022-04-26 2023-11-02 Peter Maccallum Cancer Institute Nucleic acids and uses thereof
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023225665A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Lyell Immunopharma, Inc. Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023225410A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Artisan Development Labs, Inc. Systems and methods for assessing risk of genome editing events
WO2023230549A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes
WO2023230573A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of immune responses
WO2023230566A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating cytokines
WO2023230578A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating circulating factors
WO2023230570A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2024006955A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024031053A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aggregation-resistant variants of tdp-43
CN115386597A (zh) * 2022-09-19 2022-11-25 国家纳米科学中心 一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0262516A2 (en) * 1986-09-29 1988-04-06 Miles Inc. Genetic transformation of lactic acid bacteria
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
IL90161A0 (en) 1988-05-13 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of hepatitis b s and pres2 proteins in methylotrophic yeasts
US5767367A (en) * 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US6040295A (en) * 1995-01-13 2000-03-21 Genemedicine, Inc. Formulated nucleic acid compositions and methods of administering the same for gene therapy
JPH1080274A (ja) 1996-09-06 1998-03-31 Hirofumi Hamada 核移行シグナルを結合したテトラサイクリン・トランスアクチベーター
FR2753204B1 (fr) 1996-09-11 1998-12-04 Transgene Sa Procede de preparation d'adn plasmidique
AU4012100A (en) 1999-03-16 2000-10-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pseudotyped lentiviral vectors and uses thereof
WO2002067966A1 (en) 2001-02-22 2002-09-06 Purdue Research Foundation Compositions based on vanilloid-catechin synergies for prevention and treatment of cancer
AU2002246012A1 (en) 2001-02-24 2002-09-12 Mologen Forschungs-, Entwicklungs- Und Vertriebs Gmbh Beta-endorphin/crf gene therapy for locally combating pain
AU2011203213A1 (en) 2002-08-28 2011-08-04 Chromocell Corporation Selection and Isolation of Living Cells Using mRNA-Binding Probes
JP2005006578A (ja) * 2003-06-20 2005-01-13 Nippon Genetech Co Ltd イン・ビトロ転写反応を利用した機能性ｒｎａ分子の製造方法
CA2541126A1 (en) 2003-10-03 2005-04-21 Veijlen N.V. Animal feed composition
WO2005054494A2 (en) 2003-11-26 2005-06-16 University Of Massachusetts Sequence-specific inhibition of small rna function
US20050220796A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Dynan William S Compositions and methods for modulating DNA repair
US20070048741A1 (en) 2005-08-24 2007-03-01 Getts Robert C Methods and kits for sense RNA synthesis
WO2007024029A1 (en) 2005-08-26 2007-03-01 Kyoto University Antiviral agent and viral replication inhibitor
DK2860267T3 (en) 2007-03-02 2019-04-23 Dupont Nutrition Biosci Aps CULTURES WITH IMPROVED PROFESS RESISTANCE
CA2937438C (en) 2007-09-27 2020-07-07 Dow Agrosciences Llc Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes
US20100067918A1 (en) 2008-04-18 2010-03-18 New Jersey Institute Of Technology Ultra-miniaturized thz communication device and system
WO2010001189A1 (en) 2008-07-03 2010-01-07 Cellectis The crystal structure of i-dmoi in complex with its dna target, improved chimeric meganucleases and uses thereof
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
EP2184292A1 (en) 2008-11-10 2010-05-12 Ulrich Kunzendorf Anti-Apoptotic Fusion Proteins
US8388824B2 (en) 2008-11-26 2013-03-05 Enthone Inc. Method and composition for electrodeposition of copper in microelectronics with dipyridyl-based levelers
KR20100080068A (ko) * 2008-12-31 2010-07-08 주식회사 툴젠 신규한 징크 핑거 뉴클레아제 및 이의 용도
WO2011007193A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Cellectis Viral vectors encoding a dna repair matrix and containing a virion-associated site specific meganuclease for gene targeting
WO2011056186A1 (en) * 2009-10-26 2011-05-12 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Microrna affinity assay and uses thereof
US10087431B2 (en) * 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
JP5841996B2 (ja) 2010-04-13 2016-01-13 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ 異種タンパク質を発現するための内因性プロモーターの使用
SG185481A1 (en) * 2010-05-10 2012-12-28 Univ California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
US9512444B2 (en) 2010-07-23 2016-12-06 Sigma-Aldrich Co. Llc Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids
CN102358902B (zh) * 2011-04-02 2013-01-02 西南大学 家蚕丝素重链基因突变序列及突变的方法和应用
US20140115726A1 (en) 2011-04-05 2014-04-24 Cellectis New tale-protein scaffolds and uses thereof
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
DK2852540T3 (en) 2012-05-23 2016-10-10 Carrier Corp Climate controlled cargo container
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
KR20150023670A (ko) * 2012-06-12 2015-03-05 제넨테크, 인크. 조건적 녹아웃 대립유전자의 생성 방법 및 이를 위한 조성물
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
CN116622704A (zh) * 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
EP2880171B1 (en) 2012-08-03 2018-10-03 The Regents of The University of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
CN104704110B (zh) * 2012-08-29 2018-06-01 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗遗传性病状的方法和组合物
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
CN105264067B (zh) 2012-09-07 2020-11-10 美国陶氏益农公司 Fad3性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白
UA118090C2 (uk) * 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
CN105441440B (zh) 2012-10-23 2020-12-15 基因工具股份有限公司 包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合物及其用途
KR102531576B1 (ko) 2012-12-06 2023-05-11 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
EP2932421A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
JP6552965B2 (ja) 2012-12-12 2019-07-31 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
CN113528577A (zh) 2012-12-12 2021-10-22 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
ES2576128T3 (es) * 2012-12-12 2016-07-05 The Broad Institute, Inc. Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
ES2883590T3 (es) 2012-12-12 2021-12-09 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US8889559B2 (en) 2012-12-12 2014-11-18 Micron Technology, Inc. Methods of forming a pattern on a substrate
RU2766685C2 (ru) 2012-12-17 2022-03-15 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Рнк-направляемая инженерия генома человека
ES2705033T3 (es) * 2012-12-27 2019-03-21 Keygene Nv Método para eliminar un ligamiento genético en una planta
CN103233028B (zh) * 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
AU2014235794A1 (en) * 2013-03-14 2015-10-22 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
MX2015011985A (es) * 2013-03-15 2016-04-07 Univ Minnesota Ingenieria genomica de plantas utilizando sistemas crispr/cas.
US20140349405A1 (en) * 2013-05-22 2014-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
US20150067922A1 (en) * 2013-05-30 2015-03-05 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
CN105451778B (zh) * 2013-06-04 2021-08-03 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-导向的转录调控
CN105793425B (zh) 2013-06-17 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
CA2915834A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
EP3011035B1 (en) 2013-06-17 2020-05-13 The Broad Institute, Inc. Assay for quantitative evaluation of target site cleavage by one or more crispr-cas guide sequences
RU2725502C2 (ru) 2013-06-17 2020-07-02 Те Брод Инститьют Инк. Доставка, конструирование и оптимизация систем, способы и композиции для целенаправленного воздействия и моделирования заболеваний и нарушений постмитотических клеток
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
CN103343120B (zh) * 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
EP3611268A1 (en) * 2013-08-22 2020-02-19 E. I. du Pont de Nemours and Company Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
US10570418B2 (en) * 2014-09-02 2020-02-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150101476A (ko) 2015-09-03
SG11201503059XA (en) 2015-06-29
CN110669746A (zh) 2020-01-10
US20210047647A1 (en) 2021-02-18
AU2015218519A1 (en) 2015-09-17
DE202013012597U1 (de) 2017-11-21
KR20150101446A (ko) 2015-09-03
DK2912175T3 (en) 2018-10-22
CN116064533A (zh) 2023-05-05
HK1257302A1 (zh) 2019-10-18
EP2912175B1 (en) 2018-08-22
CA2888190A1 (en) 2014-05-01
EP3733847B1 (en) 2022-06-01
KR20150101478A (ko) 2015-09-03
EP3733847A1 (en) 2020-11-04
ES2690386T3 (es) 2018-11-20
US20240052356A1 (en) 2024-02-15
EP3346003B1 (en) 2021-06-09
CN105441440B (zh) 2020-12-15
CN105441440A (zh) 2016-03-30
AU2013335451A1 (en) 2015-05-07
CA3233048A1 (en) 2014-05-01
SG10201809564YA (en) 2018-11-29
HK1223125A1 (zh) 2017-07-21
JP2020078303A (ja) 2020-05-28
KR102052286B1 (ko) 2019-12-06
US10851380B2 (en) 2020-12-01
KR101706085B1 (ko) 2017-02-14
KR20150101477A (ko) 2015-09-03
CN110643600A (zh) 2020-01-03
JP2023166401A (ja) 2023-11-21
PL2912175T3 (pl) 2019-03-29
US20150284727A1 (en) 2015-10-08
CN110592089B (zh) 2022-11-01
US20230374525A1 (en) 2023-11-23
BR112015008708A2 (pt) 2017-09-26
HK1257301A1 (zh) 2019-10-18
JP2018019698A (ja) 2018-02-08
CN104968784B (zh) 2019-11-05
JP2022095663A (ja) 2022-06-28
CN110669746B (zh) 2024-04-16
CN110066775B (zh) 2024-03-19
AU2013335451B2 (en) 2016-09-15
AU2017254854A1 (en) 2017-11-16
ES2926021T3 (es) 2022-10-21
AU2022204902A1 (en) 2022-08-18
HK1212732A1 (zh) 2016-06-17
DE202013012610U1 (de) 2017-11-24
JP2016027807A (ja) 2016-02-25
KR101656236B1 (ko) 2016-09-12
EP4180526A3 (en) 2023-06-14
EP4357457A2 (en) 2024-04-24
ES2886448T3 (es) 2021-12-20
EP4342987A2 (en) 2024-03-27
US20210047648A1 (en) 2021-02-18
SG10201809566SA (en) 2018-11-29
JP2023166400A (ja) 2023-11-21
US20240026367A1 (en) 2024-01-25
KR101656237B1 (ko) 2016-09-12
JP6517143B2 (ja) 2019-05-22
EP4180526A2 (en) 2023-05-17
EP3372679A1 (en) 2018-09-12
PT2912175T (pt) 2018-11-05
KR102182847B1 (ko) 2020-11-27
US20150322457A1 (en) 2015-11-12
AU2017254854B2 (en) 2019-12-05
CN104968784A (zh) 2015-10-07
US20230374524A1 (en) 2023-11-23
EP3346003A1 (en) 2018-07-11
EP2912175A1 (en) 2015-09-02
CN110592089A (zh) 2019-12-20
KR20180029092A (ko) 2018-03-19
CN110669758A (zh) 2020-01-10
CN110066775A (zh) 2019-07-30
EP2912175A4 (en) 2015-12-09
WO2014065596A1 (en) 2014-05-01
US20150344912A1 (en) 2015-12-03
JP2016500003A (ja) 2016-01-07
AU2020201485A1 (en) 2020-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105441440B (zh) 包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合物及其用途
KR102575769B1 (ko) 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
CA2888190C (en) Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination