KR102523302B1 - 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 높은 특이성과 높은 활성을 가지는, 표적 특이적 유전자 가위 시스템을 선별하는 방법으로, 구체적으로는 오프 타겟(off-target) 활성 및 온 타겟팅(on-target) 활성을 동시에 확인하는 다중 타겟 시스템을 이용하여 표적 특이적 유전자 가위 시스템을 스크리닝하여 선별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 통해 오프 타겟(off-target) 효과는 감소하고 온 타겟(on-target)의 효과는 증가된 표적 특이적 유전자 가위를 선별할 수 있다.

Description

온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도
본 발명은 높은 특이성과 높은 활성을 가지는, 표적 특이적 유전자 가위 시스템을 선별하는 방법으로, 구체적으로는 오프 타겟(off-target) 활성 및 온 타겟(on-target) 활성을 동시에 확인하는 다중 타겟 시스템을 이용하여 표적 특이적 유전자 가위 시스템을 스크리닝하여 선별하는 방법에 관한 것이다.
CRISPR-Cas 시스템은 타겟하는 유전자 또는 핵산에 상보적인 서열을 가지는 가이드(guide) RNA와 상기 타겟하는 유전자 또는 핵산을 절단하는 효소인 CRISPR 효소(enzyme)로 구성되고, 상기 가이드 RNA와 CRISPR 효소는 CRISPR 복합체(complex)를 형성하며, 상기 형성된 CRISPR 복합체에 의해 타겟하는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킨다.
하지만, 상기와 같은 타겟하는 유전자 또는 핵산을 변형시키는 효과와 더불어 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산을 변형시키는 문제가 아직까지 해결되지 않고 있다.
상기 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산은 가이드 RNA와 일부 상보적인 서열을 포함함으로써 상기 가이드 RNA와 부분적인 상호작용이 가능하고, 이러한 상호작용에 의해 CRISPP 복합체가 해당 유전자, 즉, 원하지 않는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시키게 된다. 이러한 효과를 오프 타겟(off-target) 효과라고 한다.
그러므로, CRISPR-Cas 시스템을 이용하여 타겟하는 유전자 또는 핵산을 변형시키는 효율을 증대하기 위해 온-타겟(on-target) 효과를 높이거나, 또는 원하지 않은 유전자 또는 핵산의 변형으로 초래될 수 있는 유전적 결함 등의 문제점을 해결하기 위해 CRISPR-Cas 시스템의 오프-타겟(off-target) 효과를 감소 또는 제거하는 것이 중요하다. 또한 상기와 같은 CRISPR-Cas 시스템의 오프-타겟 효과를 감소시킴에 따른 타겟하는 유전자 또는 핵산을 정확하게 변형시킬 수 있는 정확성 및 특이성을 함께 기대할 수 있다.
이러한 CRISPR-Cas 시스템의 오프-타겟 효과를 감소 또는 제거 및/또는 CRISPR-Cas 시스템의 정확성 및 특이성 향상을 위해서, 오프-타겟 효과가 적은 guideRNA 선정(즉, 오프-타겟 효과가 적은 타겟 선정) 또는 변형 및 CRISPR 효소의 활성(또는 효율)과 특이성을 조절하는 것이 중요한 부분으로 여겨지고 있다.
CRISPR 효소의 활성 또는 특이성을 조절하기 위해, 세포 내에 Cas9의 농도를 조절하거나, Cas9 니카아제(니카아제(nickase))를 이용한 단일 가닥 DNA 손상(single stranded DNA break)을 일으키는 방법, 촉매 불활성된 Cas9에 FokI 뉴클레아제 ㄷ도메인을 융합하여 생성된 융합 단백질을 이용하는 방법 및 가이드 RNA의 5' 말단의 일부 서열이 제거된 짧아진 (truncated 가이드 RNA를 이용하는 등의 다양한 전략들이 시도되고 개발되고 있다.
이에 본 발명자들은 높은 특이성(specificity) 또는/및 활성(activity)를 가지는 표적 특이성 유전자 가위를 선별하기 위한 스크리닝 방법을 개발하였고, 이를 이용하여 다양한 개량 유전자 가위의 후보군에서 우수한 표적 특이적 유전자 가위를 효과적으로 선별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
특허문헌
WO 2013-098244
WO 2015-123339
WO 2014-093661
WO 2014-204724
KR 10-2016-0058703
비특허문헌
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본 발명은 하나 이상의 온-타겟 및 하나 이상의 오프-타겟을 포함하는 다중 타겟을 이용한 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 하나 이상의 온-타겟 및 하나 이상의 오프-타겟을 포함하는 다중 타겟을 이용한 표적 특이적 유전자 가위의 선별 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 다중 타겟을 이용한 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 또는/및 선별하기 위한 키트 또는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 또는/및 선별하기 위한 다중 타겟을 포함하는 세포 또는/및 세포의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 다중 타겟을 이용한 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 및 선별 시스템, 그리고 이를 이용하여 선별된 유전자 가위의 모든 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하기 위한 스크리닝 시스템 및 이의 다양한 용도를 제공한다.
표적 특이적 유전자 가위는 표적을 특이적으로 인지하는 부분과 인지된 표적을 절단 또는 변형시키는 부분으로 구성될 수 있으며, 상기 스크리닝 시스템을 통해 표적을 특이적으로 인지하는 부분 또는/및 인지된 표적을 절단 또는 변형시키는 부분을 스크리닝 및/또는 선별할 수 있다.
스크리닝 시스템
본 발명에서 "표적 특이적 유전자 가위를 선별하기 위한 스크리닝 시스템"은 높은 특이성과 높은 활성을 가지는, 표적 특이적 유전자 가위를 선별하기 위해 사용되는 조성물, 키트, 및 이를 이용하는 방법, 그리고 이러한 과정 중에서 도출되는 다양한 중간 산물들을 모두 포함하는 개념이다.
그러므로, 본 명세서 "시스템"으로 기재되어 있는 발명에 대해서는 본 발명이 목적하는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는데 이용되는 것이라면, 해당 발명들의 태양에 맞도록 조성물 또는 방법으로 해석될 수 있다.
본 발명의 일 태양은 표적 특이적 유전자 가위 시스템을 스크리닝하는 방법 및 이에 사용되는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은 상기 스크리닝 방법을 통해 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는 방법 및 이에 사용되는 조성물에 관한 것이다.
바람직한 일 구체예로서 본 발명은
다음을 포함하는, 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하기 위한 스크리닝 시스템 또는 조성물을 제공한다:
i) 타겟을 인지하는 부분과 인지한 타겟을 절단 또는 변형시키는 부분로 구성된 유전자 가위; 및
ii) 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 포함하는 다중 타겟, 이 때, 상기 다중 타겟은 하나 이상의 온-타겟 및 하나 이상의 오프-타겟을 포함한다.
바람직한 다른 구체예로서 본 발명은
다음을 포함하는, 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하기 위한 스크리닝 시스템 또는 조성물을 제공한다:
i) 타겟을 인지하는 부분과 인지한 타겟을 절단 또는 변형시키는 부분로 구성된 유전자 가위; 및
ii) 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 포함하는 다중 타겟, 이 때, 상기 다중 타겟은 하나의 온-타겟 및 하나 이상의 오프-타겟을 포함한다.
바람직한 또 다른 구체예로서 본 발명은
다음을 포함하는, 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하기 위한 스크리닝 시스템 또는 조성물을 제공한다:
i) 타겟을 인지하는 부분과 인지한 타겟을 절단 또는 변형시키는 부분로 구성된 유전자 가위; 및
ii) 하나의 선별 요소(selection element)를 포함하는 다중 타겟, 이 때, 상기 다중 타겟은 하나의 온-타겟 및 하나의 오프-타겟을 포함한다.
상기 스크리닝 시스템은 표적 다양한 후보군들 중에서 높은 특이성 및/또는 높은 활성을 가지는 우수한 표적 특이적 유전자 가위를 선별하기 위해 사용될 수 있다.
유전자 가위
“표적 특이적 유전자 가위”는 목적(표적 또는 타겟)하는 게놈 상의 핵산(DNA 또는 RNA)의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 뉴클레아제를 의미한다. 본 발명에서 상기 표적 특이적 유전자 가위는 특정 뉴클레아제가 목적하는 기능을 할 수 있도록 필요한 다른 요소를 함께 포함하는 개념으로도 사용된다.
상기 뉴클레아제는 게놈 상의 특정 표적 서열을 인식하는 도메인(부분)과 절단하는 도메인(부분)이 융합된 뉴클레아제가 포함될 수 있으며, 그 예로 메가뉴클레아제(meganuclease), 게놈상의 특정 표적 서열을 인식하는 도메인인 식물 병원성 유전자에서 유래한 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)인 TAL 작동자 (transcription activator-like effector) 도메인과 절단 도메인이 융합된 융합 단백질, 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease), 또는 RGEN (RNA-guided engineered nuclease)이 제한 없이 포함될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 RGEN을 이용할 수 있다.
본 발명에서 “RGEN”은 표적 특이적 가이드 RNA 및 CRISPR 효소으로 이루어진 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다.
본 발명의 “CRISPR-Cas 시스템”은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소를 코딩하는 서열을 포함하여 이의 발현 또는 활성 유도에 관여하는 모든 요소를 포함하는 것이다. 상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터 시스템(vector system)일 수 있다.
상기 벡터 시스템은 포함되는 구성요소들이 서로 작동적으로 연결된다. "작동적으로 연결된"은 서열이 목적하는 기능을 코딩하도록 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들면, 목적하는 유전자, 예를 들면, 선별가능한 마커에 대한 코딩 서열은, 연결된 프로모터 및/또는 조절 영역이 코딩 서열의 발현을 기능적으로 조절하는 경우, 이의 프로모터 및/또는 조절 서열과 작동적 연결 상태에 있다. 이는 또한 이들이 동일한 연결 프로모터 및/또는 조절 영역에 의해 조절될수 있도록 코딩 서열 사이의 연결을 지칭하고; 코딩 서열 사이의 이러한 연결은 또한 프레임 또는 동일한 코딩프레임에서 연결되는 것으로 지칭될 수 있다. "작동적으로 연결된"은 또한 기능적, 그러나 비-코딩 서열, 예를 들면, 자가 증식 서열 또는 복제 기원의 연결을 지칭한다. 이러한 서열은, 이들이 이들의 정상 기능을 수행할 수 있는 경우, 예를 들면, 숙주 세포에서 상기 서열을 포함하는 벡터의 복제, 증식 및/또는 분리를 가능하게 하는 경우, 작동적 연결 상태에 있다.
또한, 본 발명의 “CRISPR-Cas 시스템”은 가이드 RNA의 서열 및 CRISPR 효소의 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하여 이의 발현 또는 활성 유도에 관여하는 모든 요소를 포함하는 것으로서, 상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소가 복합체(complex)를 형성하는 RNP(ribonucleoprotein) 시스템일 수 있다. 이때, 상기 RNP는 단백질-RNA 복합체로, RNA와 RNA-결합(binding) 단백질의 상호작용에 의해 형성되는 복합체의 형태를 의미한다.
본 발명의 “CRISPR 효소”는 CRISPR-Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 가이드 RNA와 복합체를 형성하여 활성화된 CRISPR-Cas 시스템 또는 불활성화된 CRISPR-Cas 시스템을 형성한다.
이 때, 상기 불활성화된 CRISPR-Cas 시스템은 CRISPR 효소의 기능 전부 또는 일부가 불활성화된 CRISPR 효소를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 의미하며, 일부가 불활성화된 CRISPR-Cas 시스템은 단일 가닥의 핵산을 절단하는 니카아제(니카아제(nickase))로 작용할 수 있다.
일 예로, CRISPR 효소가 Cas9인 경우, Cas9 단백질에 D10A, H840A 변이(mutation)를 도입하여 제조할 수 있으며, D10A Cas9 단백질, H840A Cas9 단백질, 즉 Cas9 단백질 중 하나의 활성 부위에만 변이를 도입해 만든 Cas9 단백질은 가이드 RNA와 결합하였을 때, 니카아제(nickase)로 작용할 수 있다.
또 다른 예로, Cas9 단백질에 D10A와 H840A 돌연변이를 모두 도입하며 D10A/H10A Cas9 단백질, 즉 Cas9 단백질의 두 활성 부위에 모두 돌연변이를 도입해 만든 불활성 Cas9 단백질(dead Cas9, dCas9)은 가이드 RNA와 결합하였을 때, 표적 유전자 또는 핵산 서열을 절단하지 않는 핵산 결합 복합체로 작용할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산 또는 폴리펩타이드(또는 단백질)로, 대표적으로 Type II CRISPR 효소 또는 Type V CRISPR 효소가 많이 사용된다.
상기 Type II CRISPR 효소으로는 Cas9이 있으며, 상기 Cas9은 Actinobacteria (예, Actinomyces naeslundii) Cas9, Aquificae Cas9, Bacteroidetes Cas 9, Chlamydiae Cas9, Chloroflexi Cas9, Cyanobacteria Cas9, Elusimicrobia Cas9, Fibrobacteres Cas9, Firmicutes Cas9 (예, Streptococcus pyogenes Cas9, Streptococcus thermophilus Cas9, Listeria innocua Cas9, Streptococcus agalactiae Cas9, Streptococcus mutans Cas9 및 Enterococcus faecium Cas9), Fusobacteria Cas9, Proteobacteria (예, Neisseria meningitides, Campylobacter jejuni) Cas9, Spirochaetes (예, Treponema denticola) Cas9 등 다양한 미생물 유래의 Cas9일 수 있다.
"Cas9"은 가이드 RNA와 결합하여 타겟하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치를 절단 또는 변형시키는 효소로서, 가이드 RNA가 상보적인 결합을 하는 핵산 가닥(strand)을 절단할 수 있는 HNH 도메인, 가이드 RNA와 비상보적인 결합을 하는 핵산 가닥(strand)을 절단할 수 있는 RuvC 도메인, 타겟을 인식하는 REC 도메인 및 PAM을 인식하는 PI 도메인으로 구성될 수 있다. 구체적인 Cas9의 구조적 특성은 Hiroshi Nishimasu et al. (2014) Cell 156:935-949를 참고할 수 있다.
또한, 상기 Type V CRISPR 효소으로는 Cpf1이 있으며, 상기 Cpf1은 Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium 또는 Acidaminococcus 유래의 Cpf1일 수 있다.
상기 Cpf1은 Cas9의 RuvC 도메인에 상응하는 유사한 RuvC 도메인이 있으며, Cas9의 HNH 도메인은 결핍되어 있고, 대신에 Nuc 도메인을 포함하며, 타겟을 인식하는 REC 도메인과 WED 도메인 및 PAM을 인식하는 PI 도메인으로 구성될 수 있다. 구체적인 Cpf1의 구조적 특성은 Takashi Yamano et al. (2016) Cell 165:949-962를 참고할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산 서열 내에 PAM(Protospacer adjacent motif)를 인식할 수 있으며, 상기 PAM은 CRISPR 효소의 종류 또는/및 유래에 따라 다를 수 있다.
예를 들어, CRISPR 효소가 SpCas9 인 경우 PAM은 5'-NGG-3'일 수 있고, StCas9인 경우 PAM은 5'-NNAGAAW-3'(W = A or T)일 수 있고, NmCas9인 경우 PAM은 5'-NNNNGATT-3'일 수 있고, CjCas9의 경우 PAM은 5'-NNNVRYAC-3' (V = G or C or A, R = A or G, Y = C or T)일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다. 또한, CRISPR 효소가 FnCpf1인 경우 PAM은 5' TTN-3'일 수 있고, AsCpf1 또는 LbCpf1인 경우 PAM은 5'-TTTN-3'일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다.
상기 CRISPR 효소의 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 “가이드 RNA”는 표적 유전자 또는 핵산 특이적 RNA를 의미하며, CRISPR 효소과 결합하여 CRISPR 효소를 표적 유전자 또는 핵산으로 인도할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함하는 crRNA와 CRISPR 효소과 결합하는 tracrRNA로 구성될 수 있으며, 이 때 상기 crRNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열과 상보적인 결합을 하는 부분인 가이드 서열(guide sequence)을 포함한다.
상기 가이드 서열은 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열에 상보적인 서열을 가지며, 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열을 인지하는 역할을 한다. 또한, 상기 crRNA는 tracrRNA의 일부분에 대해 상보적인 서열을 가지는 부분을 포함하여 tracrRNA와 일부 상보적인 결합을 할 수 있다.
이때, 상기 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA가 각각 따로 존재하는 이중(dual) 가이드 RNA이거나, crRNA와 tracrRNA가 연결되어 있는 단일(single) 가이드 RNA일 수 있으며, 단일(single) 가이드 RNA인 경우 링커(linker)를 포함할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 CRISPR 효소의 종류에 따라 crRNA만 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 표적 특이적 유전자 가위는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)일 수 있다.
ZFN은 선택된 유전자 및 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인 내의 표적 부위에 결합하도록 조작된 징크-핑거 단백질을 포함한다. 징크-핑거 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al, (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416을 참고한다. 자연 발생된 징크 핑거 단백질과 비교하여, 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 타입의 선택을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중(또는 사중) 뉴클레오타이드 서열, 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 이용을 포함하며, 이때 각 삼중 또는 사중 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 서열과 연합된다.
표적 서열의 선택, 융합 단백질(및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구성은 당업자에 공지되어 있으며, 전문이 참고자료로 첨부되는 미국특허출원 공개 2005/0064474 및 2006/0188987에 상세하게 설명된다.
또한, 이러한 참고문헌 및 다른 문헌에 개시된 대로, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 징크 핑거 단백질들이 임의의 적절한 링커 서열, 예를 들면 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 링커에 의해 함께 연결될 수 있다. 6개 이상의 아미노산 길이의 링커 서열의 예는 미국특허 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949을 참고한다. 여기 설명된 단백질들은 단백질의 각 징크 핑거 사이에 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
또한, ZFN 및/또는 메가뉴클레아제와 같은 표적 특이적 유전자 가위는 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인을 포함할 수 있다.
주지된 대로, 예를 들면 징크 핑거 DNA 결합 도메인과 한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인 또는 메가뉴클레아제 DNA 결합 도메인과 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인과 같이, 절단 도메인은 DNA 결합 도메인에 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제나 엑소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유래할 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종에 존재하며, DNA에 서열-특이적으로 결합하여(표적 부위에서), 바로 결합 부위나 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 어떤 제한 효소(예, Type IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며, 분리 가능한 결합과 절단 가능한 도메인을 가진다. 예를 들면, Type IIS 효소 FokI은 한 가닥 상의 인식 부위로부터 9 개 뉴클레오타이드에서 그리고 나머지 한 가닥 상의 인식 부위로부터 13 개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중가닥 절단을 촉매한다. 따라서, 일 구현예에서, 융합 단백질은 최소 1 개의 Type IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인과 하나 이상의 아연-핑거 결합 도메인(조작될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는)을 포함한다.
본 발명의 TALE 도메인은 하나 이상의 TALE-반복 모듈을 통해 서열-특이적 방식으로 뉴클레오타이드에 결합하는 단백질 도메인을 가리킨다. 상기 TALE 도메인은 적어도 하나의 TALE-반복 모듈, 바람직하게는 1 내지 30 개의 TALE-반복 모듈을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서, "TAL 이펙터 도메인" 및 "TALE 도메인"이라는 용어는 호환 가능하다. 상기 TALE 도메인은 TALE-반복 모듈의 절반을 포함할 수 있다.
다중 타겟
본 발명은 온-타겟(on-target) 효과(활성) 및/또는 오프 타겟(off-target) 효과(활성)을 동시에 확인하는 다중 타겟(multi-target) 또는 동시 타겟(simultaneous target) 시스템을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 “타겟”은 표적 특이적 유전자 가위에 의해 절단 또는 변형되어야 하는 대상으로, 표적 또는 목적 유전자 또는 핵산 또는 이들의 서열과 혼용될 수 있다.
표적 특이적 유전자 가위의 "타겟"을 인지하는 부분은 타겟 유전자 또는 핵산 서열과 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 상기 핵산은 RNA, DNA 또는 RNA/DNA 하이브리드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "다중 타겟"은 하나 이상의 온 타겟(on-target) 효과 및 하나 이상의 오프 타겟(off-target) 효과를 포함하는 개념으로서, 테스트 유전자 가위의 온 타겟(on-target) 효과 및 오프 타겟(off-target) 효과를 동시에 또는 각각 확인할 수 있는 시스템을 형성하는 표적(타겟)을 의미한다.
그러므로 "다중 타겟"은 표적 특이적 유전자 가위에 의해 표적되는 유전자 또는 핵산 서열일 수 있으며, 상기 다중 타겟은 둘 이상의 타겟일 수 있으며, 상기 다중 타겟은 온-타겟과 오프-타겟으로 구성될 수 있다.
상기 온 타겟(on-target)은 표적 특이적 유전자 가위가 상보적으로 결합하는 타겟 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치를 의미하며, 상기 오프-타겟(off-target)은 표적 특이적 유전자 가위가 부분적으로 상보적인 결합을 하는, 목적하지 않지만 가위의 활성이 일어나는 타겟 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치를 의미한다. 상기 오프-타겟은 상기 표적 특이적 유전자 가위가 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치; 또는 상기 온-타겟의 핵산 서열과 100% 미만의 서열 상동성을 가지지는 핵산 서열이다. 상기 온-타겟의 핵산 서열과 100% 미만의 서열 상동성을 가지지는 핵산 서열이란 온-타겟 핵산 서열과 유사한 핵산 서열로, 하나 이상의 다른 염기서열을 포함하거나 하나 이상의 염기서열이 삭제된 핵산 서열일 수 있다.
상기 다중 타겟은 하나 이상의 온 타겟(on-target)과 하나 이상의 오프-타겟(off-target)으로 구성될 수 있으며, 각각 온 타겟과 오프-타겟의 수는 제한하지 않고, 또한 각각의 온 타겟과 오프-타겟의 수가 동일하지 않을 수 있다. 즉, 한 개의 온 타겟과 두 개의 오프-타겟을 포함하는 다중 타겟일 수 있으며, 또는 두 개의 온 타겟과 다섯 개의 오프-타겟을 포함하는 다중 타겟일 수 있고, 이에 제한되지 않고 다중 타겟을 설계할 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝 시스템은 선별의 신뢰성을 높이기 위하여, 표적 특이적 유전자 가위에 의해 절단 또는 변형되어야 하는 대상을 복수(plural)의 표적, 목적 유전자, 핵산 또는 이들의 서열로 설계할 수 있다. 상기 복수의 표적은 타겟의 수가 둘 이상인 것을 의미하며, 타겟의 수가 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상일 수 있으며, 그 수를 제한하지 않는다.
이 때, 상기 복수의 표적 및 상기 다중 타겟을 함께 고려하여 시스템의 구성을 설계할 수 있다.
상기 다중 타겟은 온 타겟(on-target) 및 오프 타겟(off-target) 효과를 확인할 수 있는 선별 요소(selection element)와 연결되어 있다.
선별 요소(selection element)
본 발명의 “선별 요소(selection element)”는 표적 특이적 유전자 가위에 의해 타겟 유전자 또는 핵산 서열의 절단 또는 변형의 유무를 검출하기 위한 마커를 의미한다. 그러므로 "선별 마커(selection marker)"로 혼용하여 사용될 수 있다
상기 선별 요소의 발현의 유무를 통해 표적 특이적 유전자 가위에 의해 타겟 유전자 또는 핵산서열의 절단 또는 변형의 유무를 검출할 수 있다. 즉, 온 타겟(on-target) 효과의 증가 여부 및/또는 오프 타겟(off-target) 효과의 감소 여부를 검출할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 “독소 유전자(toxin gene)”는 독성 물질(단백질)을 인코딩하는 유전자 또는 핵산 서열로, 상기 독소 유전자의 발현을 통해 독성 물질이 생성되고, 생성된 독성 물질에 의해 독소 유전자을 포함하는 세포의 생존을 조절할 수 있다. 또는 상기 독소 유전자은 독소 유전자을 포함하는 세포 생존에 필요한 물질의 합성 또는 분해에 영향을 미쳐 세포의 생존을 조절할 수 있는 물질일 수 있다.
상기 독소 유전자는 Hok, fst, TisB, LdrD, FlmA, Ibs, TxpA/BrnT, SymE, XCV1262, CcdB, ParE, MazF, yafO, HicA, Kid, Zeta, DarT, Sxt gene, hypoxanthine phosphoribosyl transferase(HPRT) gene 또는 URA3일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
숙주가 대장균인 경우 상기 독소 유전자 ccdB를 사용할 수 있다.
숙주 세포가 포유류 세포인 경우 상기 독소 유전자 HPRT(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)를 사용할 수 있다.
숙주가 효모인 경우 상기 독소 유전자 URA3를 사용할 수 있다.
상기 “항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)”은 항생제에 노출 상태에서 항생제 저항성을 가지는 형질을 발현하도록 하는 유전자 또는 핵산 서열일 수 있다.
상기 항생제는 카나마이신(kanamycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 암피실린(ampicillin), 카르베니실린(carbenicillin), 블레오마이신(bleomycin), 에리트로마이신(erythromycin), 폴리믹신(polymyxin) B, 테트라사이클린(tetracycline), 제오신(zeocin), 퓨로마이신(puromycin) 또는 클로람페니콜(chloramphenicol)일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 “형광 단백질(fluorescent protein)”는 형광을 발현하는 단백질로, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein) 또는 OFP(orange fluorescent protein)일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 tag는 AviTag, Calmodulin-tag, polyglutamate tag, E-tag, FLAG-tag, HA-tag, His-tag, Myc-tag, NE-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, Strep-tag, TC tag, V5 tag, VSV-tag, Xpress tag, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Biotin Carboxyl Carrier Protein(BCCP), Glutathione-S-transferase(GST)-tag, HaloTag, Maltose binding protein(MBP)-tag, Nus-tag, Thioredoxin-tag, chitin binding protein(CBP), thioredoxin(TRX) 또는 poly(NANP)일 수 있다. 또한, 상기 tag는 형광 단백질을 이용할 수 있다.
본 발명의 구체예로서, 상기 선별 요소는 유전자 가위의 온-타겟 효과 및 오프-타겟 효과에 대하여 하나의 선별 요소 또는 2종 이상의 선별 요소가 사용될 수 있다.
일 예로, 상기 선별 요소로 lacZ 유전자를 사용하는 경우, lacZ를 포함하는 타겟 유전자 또는 핵산 서열을 표적 특이적 유전자 가위로 절단 또는 변형시키면 lacZ를 발현하지 않게 되고, 이것을 블루 화이트 스크린(Blue white screen) 방법으로 검출할 수 있다. 상기 블루 화이트 스크린 방법은 lacZ gene으로부터 발현되는 β-갈락토시다아제(galactosidase)를 이용하여 스크리닝하는 방법으로, 색이 없는 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside(X-gal)는 β-갈락토시다아제에 의해 잘리게 되면 5-bromo-4-chloro-indoxyl을 형성하게 되는데, 저절로 이량체가 되고 산화되어 밝은 색을 내는 녹지 않는 색소인 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo를 형성한다. 따라서 X-gal의 존재하에서 β-갈락토시다아제가 발현된 세포가 파란색을 띄는 것을 이용하여 lacZ 유전자의 발현의 유무를 확인할 수 있으며, 이를 이용해 lacZ 유전자을 포함하는 타겟 유전자 또는 핵산 서열의 절단 또는 변형을 예측할 수 있다.
다른 예로, 선별 요소로 독소 유전자을 포함하는 온 타겟과 세포의 게놈 내에 존재하는 오프-타겟을 이용하여 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 경우, 상기 온 타겟을 포함하는 벡터와 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 벡터를 세포에 도입하면, 높은 특이성을 보이는 표적 특이적 유전자 가위는 온 타겟를 절단하므로 독소 유전자의 발현이 억제되고, 반면에 오프-타겟은 절단하지 않으므로 게놈을 절단되지 않을 것으로 예측할 수 있다. 그러므로, 온 타겟만 절단하고 오프-타겟을 절단하지 않는 높은 특이성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위가 도입된 세포는 생존할 수 있고, 온 타겟과 오프-타겟 모두 절단된 세포는 오프-타겟 절단으로 게놈이 절단되어 생존하지 못 할 것이므로 구별될 수 있다.
또 다른 예로, 선별 요소로 독소 유전자을 포함하는 온 타겟과 선별 요소로 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 오프-타겟을 이용하여 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 경우, 상기 온 타겟을 포함하는 벡터와 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 벡터를 세포에 도입하면, 높은 특이성을 보이는 표적 특이적 유전자 가위는 온 타겟를 절단하므로 독소 유전자의 발현이 억제되고, 반면에 오프-타겟은 절단하지 않으므로 형광 단백질을 발현할 것으로 예측할 수 있다. 그러므로, 온 타겟만 절단하고 오프-타겟을 절단하지 않는 높은 특이성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위가 도입된 세포는 생존할 수 있고 또한 형광 단백질로 구별될 수 있다.
따라서, 이러한 선별 요소의 발현의 유무를 통해 온 타겟만을 효과적으로 절단하는 높은 특이성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별할 수 있다.
유전자 가위의 선별
상기 스크리닝 시스템을 이용하여 테스트 유전자 가위 중에서 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 세포를 선별하고, 이로부터 목적하는 유전자 가위를 선별(동정, identifying)할 수 있다.
일 구체예로서, 본 발명은
a) 상기 스크리닝 시스템의 i) 및 ii) 구성 요소를 세포 내로 도입하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 선별 요소의 발현 유무에 따른 온-타겟 효과 및/또는 오프-타겟 효과를 확인하여 세포를 선별하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 선별된 세포 내 존재하는 유전자 가위를 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위로 선별하는 단계를 포함하는, 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는 방법을 제공한다.
상기 i), ii) 구성 요소를 세포 내로 도입하는 것은 공지의 방법을 이용할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 형질감염된다. 적합한 형질감염 방법은 인산칼슘-매개된 형질감염, 뉴클레오펙션, 전기천공법, 양이온성 중합체 형질감염 (가령, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민), 바이러스 형질도입, 비로솜 형질감염,비리온 형질감염, 리포솜 형질감염, 양이온성 리포솜 형질감염, 면역리포솜 형질감염, 비리포솜 지질 형질감염,덴드리머 형질감염, 열 쇼크 형질감염, 마그네토펙션, 리포펙션, 유전자 총 전달, 임팔레펙션, 소노포레이션,광학적 형질감염, 그리고 핵산의 소유 작용제-증강된 흡수를 포함한다. 형질감염 방법은 당분야에서 널리 공지된다 (가령, "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001을 참조할 수 있다). 바람직한 일 실시예에서는 i) 및 ii) 구성 요소를 전기천공법으로 세포 내로 도입할 수 있다.
구체예에서, i), ii) 구성 요소를 인코딩하는 DNA는 벡터 내에 존재할 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 인공/꼬마염색체, 트랜스포손, 그리고 바이러스 벡터(가령, 렌티바이러스 벡터, 아데노 연관된 바이러스 벡터 등)를 포함한다.
본 발명의 “벡터”는 원하는(목적하는, 특정한, 필요한) 핵산을 이동시키기 위해 활용되는 운반체 핵산 분자로, 상기 벡터는 단일가닥 핵산, 이중가닥 핵산 또는 부분적 이중가닥 핵산일 수 있으며, 또한 상기 벡터는 하나 또는 그 이상의 프리 엔드, 비-프리엔드(no free ends)(e.g. circular)로 구성될 수 있다.
“프로모터”는 유전자의 발현을 조절하는 조절 요소로 벡터에 포함될 수 있다. 상기 프로모터는 벡터가 도입되는 세포에 따라 다양할 수 있다. 상기 프로모터는 pol III promoter(예를 들면, U6 프로모터 또는 H1 프로모터 등), pol II promoter(예를 들면, retroviral Rous sarcoma virus (RSV) LTR 프로모터, cytomegalovirus (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, dihydrofolate reductase 프로모터, β-acting 프로모터, phosphoglycerol kinase (PGK) 프로모터 또는 EF1α 프로모터 등) 또는 pol I 프로모터일 수 있다.
다른 구체예에서, i) 구성 요소로서 CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소가 복합체(complex)를 형성하는 RNP(ribonucleoprotein) 형태로 존재할 수 있다.
한편, b)단계에서 선별 요소의 발현 유무에 따라 온-타겟 효과 증진 및 오프-타겟 효과 감소를 나타내는 세포를 선별한다.
그리고, c)단계에서 상기 선별된 세포로부터 수득한 유전자 가위를 시퀀싱하여 그의 서열을 수득함으로써, 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 수득한다. 이러한 방법으로 수득한 표적 특이적 유전자 가위의 서열을 이용하여 유전자 교정(gene editing) 등에 사용하는 유전자 가위를 제조할 수 있다.
수득한 유전자 가위의 서열을 수득하는 방법으로 예를 들어 하기와 같은 방법으로 진행할 수 있다.
즉, 예를 들어, 전기천공법으로 처리한 대장균을 카나마이신(Kanamycin)과 클로람페니콜(Chloramphenicol), 아라비노즈(Arabinose)를 포함한 LB 아가 플레이트에 30℃에서 16시간 동안 배양하여, 콜로니들이 눈에 보일 정도의 크기로 생기면 이를 하나씩 클로람페니콜을 포함한 10ml LB 버퍼에 접종한후 42℃, 쉐이킹 인큐베이터( shaking incubator)에서 12시간동안 배양한다. 원심분리를 통해 대장균 펠렛을 얻은 후 이를 미니프렙(Miniprep) 키트를 이용하여 플라스미드를 추출한다. 추출된 플라스미드는, 예를 들어 Sanger sequencing 방법을 이용하여 시퀀싱할 수 있다. 프라이머의 경우는 Cas9 N-term과 C-term 바깥쪽에 존재하는 CMV-F, BGH-R등의 유니버셜 시퀀싱 프라이머(Universal sequencing primer)와 Cas9 중간부분의 시퀀싱 프라이머들을 이용할 수 있다.
스크리닝 키트
또한, 본 발명은 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 함유하는 다중 타겟을 포함하는, 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위 선별용 스크리닝 키트를 제공한다. 상기 키트는 조성물의 형태일 수 있다.
이 때, 상기 다중 타겟은 하나 이상의 온-타겟 및 하나 이상의 오프-타겟을 포함하고, 이에 대한 설명은 앞서 기재한 바와 같다.
필요에 따라, 본 발명의 키트는 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 함유하는 다중 타겟을 포함하는 1액형 키트로 구성하여 제공할 수 있다.
필요에 따라, 본 발명의 키트는 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 함유하는 다중 타겟 및 숙주 세포를 각각 포함하는 2액형 키트로 구성하여 제공할 수 있다.
이 때 상기 키트는 선별 요소를 포함하는 다중 타겟을 숙주 세포 내에 포함시켜 1액형으로 제공할 수도 있다. 예를 들어, 별도의 플라스미드로 숙주 세포 내에 포함시킬 수도 있고, 숙주 세포 게놈 내로 통합시켜 제공할 수도 있다.
필요에 따라, 본 발명의 키트는 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 함유하는 다중 타겟, 숙주 세포 및 테스트 유전자 가위를 각각 포함하는 3액형 키트로 구성하여 제공할 수 있다.
이 때 상기 키트는 선별 요소를 포함하는 다중 타겟을 숙주 세포 내에 포함시켜 2액형으로 제공할 수도 있다. 예를 들어, 별도의 플라스미드로 숙주 세포 내에 포함시킬 수도 있고, 숙주 세포 게놈 내로 통합시켜 제공할 수도 있다.
이와 같이, 본 발명은 높은 특이성과 높은 활성을 가지는, 표적 특이적 유전자 가위 시스템을 선별하는 시스템에 관한 것으로, 바람직하게는 오프 타겟(off-target) 활성 및 온 타겟(on-target) 활성을 동시에 확인하는 다중 타겟을 이용하여 표적 특이적 유전자 가위 시스템을 스크리닝하여 선별하는 시스템 및 이의 다양한 용도를 모두 포함한다.
본 발명의 원리가 이용된 예시적인 구현예를 설명하는 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 본 발명의 특징 및 이점을 더욱 잘 이해할 것이다. 이들 및 다른 구현예가 개시되거나 하기의 상세한 설명으로부터 명백하고 그에 의해 포함된다.
표적 특이적 유전자 가위를 이용한 유전자 교정 또는 조작시 발생하는 오프-타겟(off-target)의 문제가 여전히 존재하고 있다. 이를 극복하기 위해서는 오프-타겟을 발생시키지 않는 높은 특이성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 개발하는 것이 중요하다.
이에 본 발명은 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝하기 위한 시스템을 개발하였다. 본 발명의 스크리닝 시스템은 오프-타겟 효과는 감소하고 온 타겟의 효과는 증가된 표적 특이적 유전자 가위를 선별할 수 있는 시스템으로, 다중 타겟을 이용함으로써 오프-타겟 효과 감소와 온 타겟의 효과 증가를 동시에 만족시키는 높은 특이성 또는/및 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝하여 선별하는데 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 다중 타겟을 설계할 때, 다중 타겟에 포함되는 선별 요소를 실험 목적에 맞게 다양하게 설계할 수 있으며, 선별 요소에 따라 다양한 검출 방법을 이용하여 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는데 활용될 수 있다.
도 1은 다중 타겟을 이용한 CRISPR-Cas 시스템의 스크리닝 방법을 도식화한 것이다.
플라스미드 A는 아라비노스(Arabinose)프로모터 하에 독성 ccdB 유전자 및 NGG pam를 가진 타겟사이트를 포함하고 있다. 플라스미드 B는 PltetO-1 프로모터 하에 sgRNA를 포함하고 있으며 cas9의 존재 하에 플라스미드 A의 타겟사이트를 자를 수 있다. E.coli 게놈 DNA서열은 sgRNA 서열과 미스매치한다. 플라스미드 C는 CMV-pltetO-1 듀얼 프로모터 하에 Cas9 라이브러리 서열을 포함한다.
도 2는 다중 타겟 중 오프-타겟 핵산 서열의 설계에 따른 CRISPR-Cas9 system의 스크리닝 결과를 나타낸 그래프이다.
E.coli 의 게놈 DNA에 삽입된 EMX-1서열과 2개의 미스매치 서열을 포함하는 플라스미드 B를 이용한 대조 실험의 결과이다. CK는 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 카나마이신(Kanamycin)을 포함하는 LB 아가 배지에서의 단위당 콜로니 형성 개수이며, CKA는 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 카나마이신(Kanamycin) 및 아라비노스(Arabinose)를 포함하는 LB 아가 배지에서의 단위당 콜로니 형성 개수를 의미한다. 2개의 미스매치가 시드지역(56-WT-CAS9)근처에 위치해 있을 때, Cas9이 도입된 E.coli는 0.1%미만으로 살아남았다. 반면에 Cas9 대신에 음성 대조군인 공벡터(null vector)가 도입된 경우, E.coli의 0.01%정도 살아남았다. 상기 음성 대조군의 결과는 플라스미드 A가 작용하지 않음에 따른 효과로 백그라운드로 간주된다.
도 3은 다중 타겟 중 오프-타겟 핵산 서열의 설계에 따른 CRISPR-Cas9 system의 스크리닝 결과를 나타낸 그래프이다.
E.coli 의 게놈 DNA 안에 삽입된 EMX-1 서열과 1개의 미스매치 서열을 가지는 플라스미드 B를 이용한 대조 실험의 결과이다. 상기 도면의 CK는 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 카나마이신(Kanamycin)을 포함하는 LB 아가 배지에서의 단위당 콜로니 형성 개수이며, CKA는 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 카나마이신(Kanamycin) 및 아라비노스(Arabinose)를 포함하는 LB 아가 배지에서의 단위당 콜로니 형성 개수를 의미한다. 1개의 미스매치가 시드지역(7-WT-CAS9)근처에 위치해 있을 때, Cas9이 도입된 E.coli는 0.1%미만으로 살아남았다. 반면에 Cas9 대신에 음성 대조군인 공벡터(null vector)가 도입된 경우, E.coli의 0.01%정도 살아남았다. 상기 음성 대조군의 결과는 플라스미드 A가 작용하지 않음에 따른 효과로 백그라운드로 간주된다.
도 4는 다중 타겟을 이용한 CRISPR-Cas9 system의 Cas9 변이체의 스크리닝 결과를 나타낸 그래프이다.
플라스미드 A 및 B와 하나의 미스매치(7)를 포함하는 BW251414-EMX1(7)와 3개의 타입(Mutant strain: agilent사의 XL-1 Red 컴피턴트 세포(competent cell)로부터 유래됨. Aagilent: agilent사의 Genemorph II error prone PCR 키트. Titanium: Clontech사의 Diversify PCR 무작위 돌연변이유발 키트)의 라이브러리의 스크리닝. 1G1S(7) (1Generation1Series): BW25141-EMX1 (7)에 대한 라이브러리 스크리닝 결과. 1G2S(7): 1G1S(7)스크리닝의 BW25141-EMX1 (7)에 대한 스크리닝 결과. 1G3S(7): 1G2S(7) 스크리닝의 BW25141-EMX1 (7)에 대한 스크리닝 결과. 1G4S(17): 1G3S(7)스크리닝의 BW25141-EMX1 (17)에 대한 스크리닝 결과. 1G5S(17): 1G4S(17)의 스크리닝의 BW25141-EMX1 (17)에 대한 스크리닝 결과.
도 5는 다중 타겟을 이용한 CRISPR-Cas9 system의 Cas9 변이체의 스크리닝 결과를 나타낸 그래프이다.
플라스미드 A 및 B와 두개의 미스매치(56)를 포함하는 BW251414-EMX1(56) 과 3개의 타입(Mutant strain: agilent사의 XL-1 Red 컴피턴트 세포(competent cell)로부터 유래됨. Agilent: agilent사의 Genemorph II error prone PCR 키트. Titanium: Clontech사의 Diversify PCR 무작위 돌연변이 유발 키트)의 라이브러리의 스크리닝. 1G1S(1718) (1Generation1Series): BW25141-EMX1 (1718)에 대한 라이브러리 스크리닝 결과. 1G2S(1718): 1G1S(1718) 스크리닝의 BW25141-EMX1 (1718)에 대한 스크리닝 결과. 1G3S(1718): 1G2S(1718) 스크리닝의 BW25141-EMX1 (1718) 에 대한 스크리닝 결과. 2G1S(7): 1G3S(17)의 셔플링 된 라이브러리의 BW25141-EMX1 (7)에 대한 스크리닝 결과. 2G2S(7): 2G1S(7) 스크리닝의 BW25141-EMX1 (7) 에 대한 스크리닝 결과. 2G3S(7): 2G2S(7) 스크리닝의 BW25141-EMX1 (7)에 대한 스크리닝 결과. 2G4S(7): 2G3S(7) 스크리닝의 BW25141-EMX1 (7)에 대한 스크리닝 결과. 2G5S(17): 2G4S(7) 스크리닝의 BW25141-EMX1 (17)에 대한 스크리닝 결과. 2G6S(17): 2G5S(17) 스크리닝의 BW25141-EMX1 (17)에 대한 스크리닝 결과.
도 6 및 도 7은 특정 유전자(EMX1 및 T-DMD)를 대상으로 하는 다중 타겟을 통한 CRISPR-Cas9 system의 Cas9 변이체의 감소된 오프 타겟 활성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
2가지 방법으로 동시에 진행한 스크리닝으로 얻어진 풀상태의 library를 이용하여 DMD 유전자의 on-target, off-target 활성를 측정 결과를 나타냄(도 6)
2가지 방법으로 동시에 진행한 스크리닝으로 얻어진 풀상태의 library를 이용하여 EMX1 유전자의 on-target, off-target 활성를 측정 결과를 나타냄(도 7)
도 8 및 도 9는 스크리닝을 통해 선별된 3개의 클론을 이용해 포유동물세포에서 DMD 유전자와 EMX1 유전자 각각에 대해 on-target과 off-target실험을 수행한 결과로, 향상된 특이성을 확인한 결과이다.
HEK 293t 세포에서 인간EMX-1을 타겟으로 하는 3개의 다른 클론(#1, #20 and #35)의 on target 과 off target 활성을 나타냄(도 8)
HEK 293t 세포에서 인간 T-DMD를 타겟으로 하는 3개의 다른 클론들(#1, #20 and #35)의 on target과 off target 활성을 나타냄(도 9)
발명의 실시를 위한 최선의 형태
용어의 정의
"절단하다 (cleave)", "절단" 및/또는 "절단하는"은 특정 핵산에서 절단을 생성하는 작용을 지칭한다. 절단 (cleavage, break)은 당해 기술분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이 블런트 말단 또는 스티키 말단(즉, 5' 또는 3' 오버행)을 남길 수 있다. 상기 용어는 또한 단일 가닥 DNA 절단 [닉 ("nick")] 및 이중 가닥 DNA 절단을 포함한다.
"재조합 세포"는 유전자 조작 기술(즉, 재조합 기술)을 사용하여 모 세포를 유전적으로 변형함으로써 생성되는 숙주 세포를 지칭한다. 재조합 세포는 모 세포의 게놈에 대한 뉴클레오티드 서열의 부가, 결실 및/또는 변형을 포함할 수 있다.
"상동성"은 2개 이상의 핵산 서열, 또는 2개 이상의 아미노산 서열 사이의 동일성을 지칭한다. 서열 동일성은 동일성(또는 유사성 또는 상동성) %로 측정할 수 있으며; %가 높을수록, 상기 서열은 서로 동일성이 더 높다. 핵산 또는 아미노산 서열의 호모로그 또는 오르쏘로그(ortholog)는, 표준 방법을 이용해 정렬하는 경우, 서열 동일성이 상대적으로 높다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 여러 가지 프로그램 및 정렬 알고리즘은 문헌[참조: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. Biosc. 8, 155-65, 1992; 및 Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]에 기술되어 있으며, 서열 정렬 방법 및 상동성 계산법에 관한 상세 사항이 기술되어 있다. 문헌[참조: NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]은 서열 분석 프로그램인 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 사용하기 위해 미국 생물학 정보 센터(National Center for Biological Information) (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, Md. 20894) 및 인터넷을 포함하는 다양한 공급원에서 이용가능하다. 부가적인 정보는 NCBI 웹 사이트에서 찾을 수 있다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여, 복합체를 형성하고, 이 복합체는 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기 쌍형성, 후그스타인(Hoogstein) 결합 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일의 자가 혼성화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
"발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예를 들어, mRNA 또는 기타 RNA전사물로) 전사되는 과정 및/또는 이후에 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사물 및 인코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"로 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된다면, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"선별 요소(selection element) 또는 선별 마커(selelction marker)"는 본원에 기재된 바와 같은 유전자 가위의 온 타겟 효과 및/또는 오프 타겟 효과를 확인하여 선별하는 지침으로서 기능하는 유전자를 지칭한다. 선별 요소로는, 이로써 제한되지 않지만, 독소 유전자(toxin gene), 형광 마커, 발광 마커 및 약물 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 형광 마커는, 이로써 제한되지 않지만, 형광 단백질, 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP), 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(dsRFP) 등을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 발광 마커는, 이로써 제한되지 않지만, 루시퍼라제 등의 발광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 조성물과 사용하기에 적합한 약물 선별가능한 마커는, 이로써 제한되지 않지만, 항생물질에 대한 내성 유전자, 예를 들면, 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 하이드로마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜 및 네오마이신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선별은 포지티브 선별일 수 있고; 즉, 마커를 발현하는 세포는 집단으로부터 단리되어, 예를 들면, 선별가능한 마커를 포함하는 농후화된 세포 집단을 생성한다. 다른 예에서, 선별은 네가티브 선별일 수 있고; 즉, 집단은 세포로부터 단리되어, 예를 들면, 선별가능한 마커를 포함하지 않는 농후화된 세포 집단을 생성한다. 분리는 사용된 선별가능한 마커에 적절한 임의의 편리한 분리 기술에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 형광 마커가 사용되는 경우, 세포는 형광 활성화된 세포 분류 (sorting)에 의해 분리될 수 있는 반면, 세포 표면 마커가 삽입되는 경우, 세포는 친화성 분리 기술, 예를 들면, 자기 분리, 친화성 크로마토그래피, 고체 매트릭스에 부착된 친화성 시약을 사용한 "패닝" 또는 기타 편리한 기술에 의해 이종성 집단으로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전체학 및 재조합 DNA의 통상의 기술을 사용한다
이하, 본 발명의 원리가 이용된 예시적인 구현예를 통해 상세히 설명한다.
스크리닝 시스템
1. 스크리닝 시스템(Screening system)
본 발명은 하나 이상의 온-타겟 및 하나 이상의 오프-타겟을 포함하는 다중 타겟을 이용한 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 시스템에 관한 것이다.
"표적 특이적 유전자 가위의 스크리닝 시스템"은 높은 특이성과 높은 활성을 가지는, 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝하기 위해 사용되는 조성물, 키트, 및 이를 이용하는 방법, 그리고 이러한 과정 중에서 도출되는 다양한 중간 산물들을 모두 포함하는 개념이다. 본 명세서 "시스템"으로 기재되어 있는 발명에 대해서는 본 발명이 목적하는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝하는데 이용되는 것이라면, 해당 발명들의 태양에 맞도록 조성물 또는 방법으로 해석될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 일 구현예는
다음을 포함하는, 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하기 위한 스크리닝 조성물이다:
i) 타겟을 인지하는 부분과 인지한 타겟을 절단 또는 변형시키는 부분로 구성된 유전자 가위; 및
ii) 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 포함하는 다중 타겟, 이 때, 상기 다중 타겟은 하나 이상의 온-타겟 및 하나 이상의 오프-타겟을 포함한다.
1-1. 표적 특이적 유전자 가위: CRISPR-Cas 시스템)
"표적 특이적 유전자 가위"는 표적을 특이적으로 인지하는 부분과 인지된 표적을 절단 또는 변형시키는 부분으로 구성될 수 있다.
상기 표적을 특이적으로 인지하는 부분은 타겟 유전자 또는 핵산 서열에 따라 변화할 수 있다.
상기 인지된 표적을 절단 또는 변형시키는 부분은 인지된 표적을 절단 또는 변형시킬 수 있다. 이때, 상기 표적을 특이적으로 인지하는 부분과 인지된 표적을 절단 또는 변형시키는 부분은 각각 분리되어 존재하거나 또는 하나의 구조체로서 기능적으로 나누어 존재할 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위는 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPR associated protein) 시스템, ZFN(Zinc finger nuclease), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), FokI, 엔도뉴클레아제(endonuclease) 또는 이들의 조합일 수 있으며, 바람직하게는 CRISPR-Cas 시스템일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드(guide)RNA와 CRISPR 효소(enzyme)으로 구성될 수 있다.
이때, 상기 가이드 RNA는 표적을 특이적으로 인지하는 부분일 수 있으며, 상기 CRISPR 효소는 인지된 표적을 절단 또는 변형시키는 부분일 수 있다.
1-1-1 가이드 RNA
상기 가이드 RNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산서열에 상보적인 결합을 하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산서열에 상보적인 서열을 포함하는 crRNA와 CRISPR 효소과 결합하는 tracrRNA로 구성될 수 있다.
이때 상기 crRNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산서열과 상보적인 결합을 하는 부분인 가이드 서열(guide sequence)을 포함한다. 상기 가이드 서열은 타겟하는 유전자 또는 핵산서열에 상보적인 서열을 가지며, 타겟하는 유전자 또는 핵산서열을 인지하는 역할을 할 수 있다.
상기 가이드 서열의 크기는 5 내지 50, 5 내지 40, 5 내지 30, 또는 5 내지 20 bps 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 5 내지 20 bps의 크기를 가질 수 있다.
상기 가이드 서열의 핵산 서열은 타겟하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치와 50 내지 100% 상보적인 결합을 하는 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 crRNA는 tracrRNA의 일부분에 대해 상보적이 서열을 가지는 부분을 포함하고, 따라서 상기 crRNA는 tracrRNA와 일부 상보적인 결합을 할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA가 각각 독립적으로 존재하는 이중(dual) 가이드 RNA일 수 있다. 또는 상기 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA가 연결되어 있는 단일(single) 가이드 RNA일 수 있다. 이때 상기 단일 가이드 RNA는 링커(linker)를 포함할 수 있다.
또한 상기 가이드 RNA는 CRISPR 효소의 종류에 따라 crRNA만을 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 화학적 변형을 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 화학적 변형은 상기 가이드 RNA가 포함하는 핵산 중 하나 또는 둘 이상의 핵산에 phosphorothioate linkage, locked nucleic acid(LNA), 2’-O-methyl 3’phosphorothioate(MS) 또는 2’-O-methyl 3’thioPACE(MSP) 변형되는 것을 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 5' 말단의 일부 서열이 제거된 (truncated) 가이드 RNA일 수 있다.
상기 가이드 RNA는 타겟 유전자 또는 핵산 서열에 따라 가이드 RNA의 핵산 서열을 설계할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 벡터에 포함될 수 있으며, 이때 상기 벡터는 PltetO-1, arapBAD, rhampBAD 또는 T7 프로모터와 가이드 RNA을 발현하기 위해 같은 적합한 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 인공적으로 합성된 것일 수 있다.
1-1-2 CRISPR 효소
상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산일 수 있다.
상기 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 이 때 상기 벡터는 CMV 또는 CAG와 같은 CRISPR 효소를 발현시키기에 적합한 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 도입하고자 하는 대상에 맞게 코돈 최적화된 것일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 Type II CRISPR 효소 또는 Type V CRISPR 효소일 수 있다.
상기 Type II CRISPR 효소는 Cas9일 수 있다.
상기 Type V CRISPR 효소는 Cpf1 효소 일 수 있다.
상기 Cas9는 SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9), SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9), StCas9(Streptococcus thermophiles Cas9), NmCas9(Neisseria meningitides Cas9), CjCas9(Campylobacter jejuni Cas9) 또는 이들의 오르쏘로그(orthologs)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 바람직하게는 SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9) 또는 CjCas9(Campylobacter jejuni Cas9)일 수 있다.
상기 Cas9는 활성(active) Cas9 또는 불활성(inactive) Cas9 일 수 있다.
상기 불활성 Cas9는 완전히 불활성화된 Cas9 및 부분적으로 불활성화된 Cas9 (예, 니카아제(nickase))을 포함할 수 있다.
상기 Cas9는 RuvC, HNH, REC 또는/및 PI 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 변이될 수 있다.
상기 Cas9는 SpCas9의 아미노산 중 D10, E762, H840, N854, N863 및 D986로 구성된 아미노산 그룹 또는 다른 Cas9 오르쏘로그의 이에 대응되는 아미노산 그룹 중에 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 Cas9는 SpCas9의 아미노산 중 R780, K810, K848, K855 및 H982로 구성된 아미노산 그룹 또는 다른 Cas9 오르쏘로그의 이에 대응되는 아미노산 그룹 중에 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 Cas9는 SpCas9의 아미노산 중 G1104, S1109, L1111, D1135, S1136, G1218, N1317, R1335 및 T1337 로 구성된 아미노산 그룹 또는 다른 Cas9 오르쏘로그의 이에 대응되는 아미노산 그룹 중에 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 Cpf1는 FnCpf1(Francisella novicida Cpf1), AsCpf1(Acidaminococcus sp. Cpf1), LbCpf1(Lachnospiraceae bacterium Cpf1) 또는 오르쏘로그(orthologs)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 Cpf1는 활성(active) Cpf1 또는 불활성(inactive) Cpf1 일 수 있다.
상기 불활성(inactive) Cpf1 효소는 완전히 불활성화된 Cpf1 및 부분적으로 불활성화된 Cpf1(예, 니카아제(nickase))을 포함할 수 있다.
상기 Cpf1는 RuvC, Nuc, WED, REC 또는/및 PI 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 변이될 수 있다.
상기 Cpf1는 FnCpf1의 아미노산 중 D917, E1006 또는 D1255; AsCpf1의 아미노산 중 D908, E993 또는 D1263; LbCpf1의 아미노산 중 D832, E925, D947 또는 D1180; 또는 다른 Cpf1 오르쏘로그의 이에 대응되는 아미노산 그룹 중에 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산 서열 내에 PAM(Protospacer adjacent motif)를 인식할 수 있다.
상기 PAM은 CRISPR 효소의 유래에 따라 다를 수 있다.
예를 들어, CRISPR 효소가 SpCas9 인 경우 PAM은 5'-NGG-3'일 수 있고, StCas9인 경우 PAM은 5'-NNAGAAW-3'(W = A or T)일 수 있고, NmCas9인 경우 PAM은 5'-NNNNGATT-3'일 수 있고, CjCas9의 경우 PAM은 5'-NNNVRYAC-3' (V = G or C or A, R = A or G, Y = C or T)일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다. 또한, CRISPR 효소가 FnCpf1인 경우 PAM은 5' TTN-3'일 수 있고, AsCpf1 또는 LbCpf1인 경우 PAM은 5'-TTTN-3'일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 기능적 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 CRISPR 효소는 활성 CRISPR 효소 또는 불활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 HFD(heterologous functional domain)일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사 활성(transcription activation activity), 전사 억제 활성(transcription repression activity), 전사 해제인자 활성(transcription release factor activity), 히스톤 변형 활성(histone modification activity), RNA 절단 활성, DNA 절단 활성, 핵산 결합 활성 및 분자 스위치(molecular switches) (e.g., 광유도성)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase), 디메틸라아제(demethylase), 포스파아제(phosphase), 티미딘 키나아제(thymidine kinase), 시스테인 디아미나아제(cysteine deaminase), 시티딘 디아미나아제(cytidine deaminase)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 CRISPR 효소에 기능적 도메인을 연결하기 위해, CRISPR 효소과 기능적 도메인 사이에 링커(linker)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 링커는 (A)n, (G)n, GGGS, (GGS)n, (GGGGS)n, (EAAAK)n, SGGGS, GGSGGSGGS, SGSETPGTSESATPES, XTEN 또는 (XP)n 일 수 있으며, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상일 일 수 있다. 하지만 이에 제한하지 않는다.
상기 CRISPR 효소는 NLS(nuclear localization sequence)를 추가로 포함할 수 있다.
1-1-3 CRISPR 효소의 변이
상기 CRISPR 효소는 활성(active) CRISPR 효소 또는 불활성(inactive) CRISPR 효소일 수 있다.
상기 불활성(inactive) CRISPR 효소는 완전히 불활성화된 CRISPR 효소 및 부분적으로 불활성화된 CRISPR 효소(예, 니카아제(nickase))을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 변이된 CRISPR 효소일 수 있다. 즉, 자연적으로 발생하지 않는 CRISPR 효소일 수 있다.
이때, 상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 아미노산이 적어도 하나 이상 변이된 것으로, 상기 변이는 아미노산 치환, 제거 또는 부가 등일 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 RuvC 도메인은 RuvCI, RuvCII 또는 RuvCIII 도메인일 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 HNH 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 REC 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 PI 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 Nuc 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 WED 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
또한, 상기 CRISPR 효소는 변이된 CRISPR 효소s의 일부를 각각 취합하여 재조합된 CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 자연상태에서 존재하는 CRISPR 효소(즉, wild type CRISPR 효소)의 RuvC 도메인, HNH 도메인 및 PI 도메인을 각각 CRISPR 효소 변이체 1의 RuvC 도메인과 CRISPR 효소 변이체 2의 HNH 도메인 및 CRISPR 효소 변이체 3의 PI 도메인으로 교체 또는 재조합할 수 있다. 또는 CRISPR 효소 변이체 1의 1에서 500번까지의 아미노산 서열(또는 이를 코딩하는 핵산 서열)과 CRISPR 효소 변이체 2의 501번부터 1000번까지 아미노산 서열(또는 이를 코딩하는 핵산 서열)과 CRISPR 효소 변이체 3의 1001번부터 끝까지의 아미노산 서열(또는 이를 코딩하는 핵산 서열)로 조합하여 CRISPR 효소 변이체 1, 2 및 3과는 다른 새로운 CRISPR 변이체를 만들 수 있다.
또 다른 예로, CRISPR 효소 변이체 1의 일부, 예를 들어 50에서 700번까지의 아미노산 서열(또는 이를 코딩하는 핵산 서열)을 CRISPR 효소 변이체 2의 50에서 700번까지의 아미노산 서열(또는 이를 코딩하는 핵산 서열)로 교체 또는 재조합 할 수 있다.
또한 상기 CRISPR 효소는 서로 다른 종류의 CRISPR 효소의 조합에 의해 생성된 CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, Cas9의 RuvC 도메인을 Cpf1의 RuvC 도메인으로 교체 또는 재조합 될 수 있다.
또한 상기 CRISPR 효소는 활성 CRISPR 효소 또는 불활성 CRISPR 효소에 기능적 도메인을 추가로 포함한 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 HFD(heterologous functional domain)일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사 활성(transcription activation activity), 전사 억제 활성(transcription repression activity), 전사 해제인자 활성(transcription release factor activity), 히스톤 변형 활성(histone modification activity), RNA 절단 활성, DNA 절단 활성, 핵산 결합 활성 및 분자 스위치(molecular switches) (e.g., 광유도성)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase), 디메틸라아제(demethylase), 포스파아제(phosphase), 티미딘 키나아제(thymidine kinase), 시스테인 디아미나아제(cysteine deaminase), 시티딘 디아미나아제(cytidine deaminase)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 CRISPR 효소에 기능적 도메인을 연결하기 위해, CRISPR 효소과 기능적 도메인 사이에 링커를 추가로 포함할 수 있다.
상기 링커는 (A)n, (G)n, GGGS, (GGS)n, (GGGGS)n, (EAAAK)n, SGGGS, GGSGGSGGS, SGSETPGTSESATPES, XTEN 또는 (XP)n 일 수 있으며, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상일 일 수 있다. 하지만 이에 제한하지 않는다.
예를 들어 상기 CRISPR 효소 변이체는 불활성 효소에 전사 억제(transcription repression) 도메인을 포함하는 것으로, 상기 CRISPR 효소 변이체가 타겟 유전자 또는 핵산 서열의 발현을 억제하게 하는 변이체일 수 있다. 또한, 상기 CRISPR 효소 변이체는 불활성 효소에 시티딘 디아미나아제(cytidine deaminase)를 포함하는 것으로, 상기 CRISPR 효소 변이체가 타겟 유전자 또는 핵산 서열의 특정 염기서열을 변경하여 해당 유전자 또는 핵산 서열의 발현을 억제 또는 증가시킬 수 있는 변이체일 수 있다.
1-1-4 CRISPR 효소의 변이 효과
상기 변이된 CRISPR 효소는 타겟하는 유전자 또는 핵산(즉, 온 타겟)에 대한 절단 효과가 증가하도록 변이된 것일 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 타겟하는 유전자 또는 핵산(즉, 온 타겟)에 대한 절단 효과가 감소하도록 변이된 것일 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산(즉, 오프-타겟)에 대한 절단 효과가 증가하도록 변이된 것일 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산(즉, 오프-타겟)에 대한 절단 효과가 감소하도록 변이된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산에 결합하는(binding)하는 능력이 증가하도록 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산에 결합하는(binding)하는 능력이 감소하도록 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산 서열 내에 PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식하는 능력이 증가하도록 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산 서열 내에 PAM을 인식하는 능력이 감소하도록 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 헬리카아제 동역학(helicase kinetics)이 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 변형에 따른 구조적 재배열(conformation rearrangement)을 포함할 수 있다.
1-2. CRISPR 복합체 (CRISPR complex)
상기 CRISPR 효소과 가이드 RNA는 CRISPR 복합체를 형성할 수 있다.
상기 CRISPR 복합체는 세포 밖에서 형성될 수 있다.
상기 CRISPR 복합체는 세포 내의 세포질에서 형성될 수 있다.
상기 CRISPR 복합체는 세포 내의 핵 안에서 형성될 수 있다.
상기 CRISPR 복합체에서, CRISPR 효소는 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열 내에 존재하는 PAM을 인식할 수 있다.
상기 CRISPR 복합체에서, 가이드 RNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열에 상보적인 결합을 할 수 있다.
상기 CRISPR 복합체가 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열에 결합하면, 상기 CRISPR 복합체의 CRISPR 효소에 의해 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열은 절단 또는 변형될 수 있다.
이때 상기 표적 특이적 유전자 가위는 세포 내로 도입될 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위의 세포 내 도입은 바이러스 벡터 시스템, ribonucleoprotein(RNP), 나노파티클, 리포솜 등을 이용한 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기 천공법(electroporation) 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
1-3 다중 타겟(Multi-target)
상기 타겟은 표적 특이적 유전자 가위에 의해 표적되는 유전자 또는 핵산 서열일 수 있다.
상기 다중 타겟은 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열(즉, 온 타겟)과 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산 서열(즉, 오프-타겟)으로 구성될 수 있다.
상기 다중 타겟은 하나 이상의 온 타겟과 하나 이상의 오프-타겟으로 구성될 수 있다. 일 구체예로서, 상기 다중 타겟은 하나의 온 타겟과 하나 이상의 오프-타겟으로 구성될 수 있다. 다른 구체예로서, 상기 다중 타겟은 하나의 온 타겟과 하나의 오프-타겟으로 구성될 수 있다.
상기 다중 타겟은 세포 내에 존재하거나 또는 외부에서 도입될 수 있다.
상기 다중 타겟이 세포 내에 존재하는 경우, 상기 다중 타겟은 숙주 세포의 게놈에 존재할 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 오프 타겟이 숙주 세포의 게놈에 존재할 수 있다.
상기 다중 타겟이 외부에서 세포로 도입되는 경우, 상기 다중 타겟은 vector system을 이용하여 도입될 수 있다.
상기 다중 타겟이 외부에서 세포로 도입되는 경우, 상기 다중 타겟은 벡터 시스템(vector system)을 이용하여 도입될 수 있다.
상기 다중 타겟이 외부에서 세포로 도입되는 경우, 상기 다중 타겟은 타겟마다 다른 벡터를 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 즉, 상기 다중 타겟이 하나의 온 타겟과 하나의 오프-타겟으로 구성된 경우, 상기 벡터는 온 타겟을 포함한 벡터와 오프-타겟을 포함하는 벡터로 구성될 수 있다.
상기 다중 타겟의 세포 내 도입은 바이러스 벡터 시스템, 나노파티클, 리포솜 등을 이용한 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기 천공법(electroporation) 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
1-3-1 온 타겟(on-target)
상기 온 타겟은 표적 특이적 유전자 가위가 상보적으로 결합하는 타겟 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 온 타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 상보적인 서열을 가지는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 온 타겟은 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열(guide sequence)과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
이때, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열은 5 내지 50 bps일 수 있으며, 또한 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열 길이에 따라 그 길이가 조절될 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 온 타겟은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 온 타겟은 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열과 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 온 타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 5'-말단에 위치할 수 있다.
이때, 상기 온 타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 3'-말단에 위치할 수 있다.
상기 온 타겟은 (N)5~50-PAM 또는 PAM-(N)5~50 일 수 있으며, 이때 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다.
또한, 상기 온 타겟은 세포 내의 게놈 내에 위치할 수 있다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
이때 상기 온 타겟은 선별 요소(selection element)를 포함할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 독소 유전자은 Hok, fst, TisB, LdrD, FlmA, Ibs, TxpA/BrnT, SymE, XCV1262, CcdB, ParE, MazF, yafO, HicA, Kid, Zeta, DarT 또는 Sxt gene일 수 있으며, 바람직하게는 CcdB일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 독소 유전자은 온 타겟의 유래에 따라(즉, 오리진에 따라) 변경시킬 수 있다. 즉, 상기 독소 유전자는 숙주 세포의 종류에 따라 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
숙주가 대장균인 경우 상기 독소 유전자 ccdB를 사용할 수 있다.
숙주 세포가 포유류 세포인 경우 상기 독소 유전자 HPRT(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)를 사용할 수 있다.
숙주가 효모인 경우 상기 독소 유전자 URA3를 사용할 수 있다.
상기 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)는 항생제의 종류에 따라 다양하게 설계할 수 있다.
상기 항생제는 카나마이신(kanamycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 암피실린(ampicillin), 카르베니실린(carbenicillin), 블레오마이신(bleomycin), 에리트로마이신(erythromycin), 폴리믹신(polymyxin) B, 테트라사이클린(tetracycline), 제오신(zeocin), 퓨로마이신(puromycin) 또는 클로람페니콜(chloramphenicol)일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 “형광 단백질(fluorescent protein)”는 형광을 발현하는 단백질로, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein) 또는 OFP(orange fluorescent protein)일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 태그(tag)는 AviTag, Calmodulin-tag, polyglutamate tag, E-tag, FLAG-tag, HA-tag, His-tag, Myc-tag, NE-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, Strep-tag, TC tag, V5 tag, VSV-tag, Xpress tag, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Biotin Carboxyl Carrier Protein(BCCP), Glutathione-S-transferase(GST)-tag, HaloTag, Maltose binding protein(MBP)-tag, Nus-tag, Thioredoxin-tag, chitin binding protein(CBP), thioredoxin(TRX) 또는 poly(NANP)일 수 있다.
이때 상기 선별 요소를 포함하는 온 타겟이 표적 특이적 유전자 가위에 의해 잘리거나 변형될 때, 상기 선별 요소가 발현되지 않을 수 있다.
1-3-2 오프 타겟(off-target)
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위가 부분적으로 상보적인 결합을 하는 비타겟 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 오프-타겟은 상기 온 타겟에서 하나 이상의 다른 염기 서열을 포함하는 핵산의 서열일 수 있다.
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 부분적으로 상보적인 서열을 가지는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 부분적으로 상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
이때, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열은 5 내지 50 bps일 수 있으며, 또한 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열 길이에 따라 그 길이가 조절될 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열과 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 오프-타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 5'-말단에 위치할 수 있다.
이때, 상기 오프-타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 3'-말단에 위치할 수 있다.
상기 오프-타겟은 (N)5~50-PAM 또는 PAM-(N)5~50 일 수 있으며, 이때 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다.
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 하나 이상의 비상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 100% 미만의 상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다. 상기 100% 미만의 서열 상동성을 가지지는 핵산 서열이란 온-타겟 핵산 서열과 유사한 핵산 서열로, 하나 이상의 다른 염기서열을 포함하거나 하나 이상의 염기서열이 삭제된 핵산 서열일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 하나이상의 비상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 100% 미만의 상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열 중 하나 이상의 미스매치된(mismatched) 핵산 서열을 포함할 수 있다.
이때 상기 오프-타겟은 세포 내의 게놈 내에 위치할 수 있다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
이때 상기 오프-타겟은 선별 요소를 포함할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
이때 상기 선별 요소를 포함하는 오프-타겟이 표적 특이적 유전자 가위에 의해 잘리거나 변형될 때, 상기 선별 요소가 발현되지 않을 수 있다.
이때 상기 선별 요소를 포함하는 오프-타겟이 표적 특이적 유전자 가위에 의해 잘리거나 변형되지 않을 때, 상기 선별 요소가 발현될 수 있다.
1-4 선별 요소(selection element)의 효과
본 발명의 “선별 요소(selection element)”는 표적 특이적 유전자 가위에 의해 타겟 유전자 또는 핵산 서열의 절단 또는 변형의 유무를 검출하기 위한 마커를 의미한다. 그러므로 "선별 마커(selection marker)"로 혼용하여 사용될 수 있다
상기 선별 요소의 발현의 유무를 통해 표적 특이적 유전자 가위에 의해 타겟 유전자 또는 핵산서열의 절단 또는 변형의 유무를 검출할 수 있다. 즉, 온 타겟(on-target) 효과의 증가 여부 및/또는 오프 타겟(off-target) 효과의 감소 여부를 검출할 수 있다.
온 타겟 또는/및 오프-타겟에 포함된 선별 요소는 표적 특이적 유전자 가위의 높은 특이성 또는 높은 활성을 판단하는 요소가 될 수 있다.
일 예로, 선별 요소로 독소 유전자(toxin gene)를 포함하는 온 타겟과 선별 요소로 항생제 내성 유전자를 포함하는 오프-타겟을 이용해 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 경우, 상기 온 타겟과 오프-타겟을 포함하는 각각의 벡터 및 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 벡터를 세포에 도입하면 높은 특이성을 보이는 표적 특이적 유전자 가위는 온 타겟를 절단하므로 독소 유전자의 발현이 억제되고, 반면에 오프-타겟은 절단하지 않으므로 항생제 내성 유전자가 발현할 것으로 예측할 수 있다. 그러므로 온 타겟만 절단하고 오프-타겟을 절단하지 않는 높은 특이성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위가 도입된 세포는 항생제를 처리하였을 때 생존할 수 있다. 따라서, 이러한 선별 요소의 발현의 유무를 통해 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 할 수 있다.
다른 예로, 선별 요소로 독소 유전자을 포함하는 온 타겟과 세포의 게놈 내에 존재하는 오프-타겟을 이용하여 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 경우, 상기 온 타겟을 포함하는 벡터와 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 벡터를 세포에 도입하면, 높은 특이성을 보이는 표적 특이적 유전자 가위는 온 타겟를 절단하므로 독소 유전자의 발현이 억제되고, 반면에 오프-타겟은 절단하지 않으므로 게놈을 절단되지 않을 것으로 예측할 수 있다. 그러므로, 온 타겟만 절단하고 오프-타겟을 절단하지 않는 높은 특이성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위가 도입된 세포는 생존할 수 있고, 온 타겟과 오프-타겟 모두 절단된 세포는 오프-타겟 절단으로 게놈이 절단되어 생존하지 못 할 것이므로 구별될 수 있다.
또 다른 예로, 선별 요소로 독소 유전자을 포함하는 온 타겟과 선별 요소로 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 오프-타겟을 이용하여 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 경우, 상기 온 타겟을 포함하는 벡터와 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 벡터를 세포에 도입하면, 높은 특이성을 보이는 표적 특이적 유전자 가위는 온 타겟를 절단하므로 독소 유전자의 발현이 억제되고, 반면에 오프-타겟은 절단하지 않으므로 형광 단백질을 발현할 것으로 예측할 수 있다. 그러므로, 온 타겟만 절단하고 오프-타겟을 절단하지 않는 높은 특이성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위가 도입된 세포는 생존할 수 있고 또한 형광 단백질로 구별될 수 있다.
이처럼, 상기 선별 요소에 따라 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 방법은 다양하게 설계가 가능하다.
2. 스크리닝 방법
상기 스크리닝 시스템을 이용하여 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝할 수 있다.
일 태양으로, 본 발명은 다수의 표적 특이적 유전자 가위 테스트군 중에서 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 방법"은 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 세포를 선별하는 것을 의미한다. 즉, 구체적인 유전자 가위의 동정(identifying) 단계의 이전 단계를 의미한다.
특히, 상기 방법은 표적 특이적 유전자 가위의 개량에 의해 제조한 다양한 유전자 가위의 변이체들 및 유전자 가위 라이브러리 중에서 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는데 매우 유용하다
2-1. 스크리닝 방법의 제1 구체예
일 구체예로서,
표적 특이적 유전자 가위의 다양한 "변이체"들 중에서 높은 특이성 및 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝하는 방법으로 활용될 수 있다.
상기 방법은
i) 하나이상의 온 타겟 및 하나이상의 오프-타겟을 포함하는 다중 타겟; 및
ii) 표적 특이적 유전자 가위 변이체
를 이용한 방법으로,
a) 상기 i), ii) 구성 요소를 세포 내로 도입하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 온 타겟만 변형된 세포를 선별하는 단계
를 포함한다.
2-1-1 구성요소
이때, 상기 구성 요소 i)은 벡터 시스템을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 i)에서 온 타겟과 오프-타겟은 각각의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)의 표적 특이적 유전자 가위는 CRISPR-Cas 시스템일 수 있으며, 그 외에도 ZFN, TALEN, FokI 또는 이의 혼합일 수 있고, 이에 제한하지 않는다.
상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA와 CRISPR 효소로 구성될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)의 표적 특이적 유전자 가위 변이체는 CRISPR-Cas 시스템의 변이체일 수 있으며, 바람직하게는 CRISPR 효소의 변이체일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 상기 유전자 가위 변이체는 전자기파, UV, 방사선, 화학물질, 외부/내부 유전자 작용 등에 의해 생성될 수 있다. 일 실시예에서는 WT CRISPR-Cas 시스템에 UV를 조사시킴으로써 변이체들을 수득하였다
상기 CRISPR 효소는 Cas9일 수 있고, 상기 CRISPR 효소의 변이체는 Cas9의 변이체일 수 있다.
상기 Cas9의 변이체는 온 타겟 효과를 증가 또는 감소시킨 변이체일 수 있다. 이때, 온 타겟 효과는 Cas9에 의해 온 타겟 위치가 절단 또는 변형되는 것을 의미한다.
상기 Cas9의 변이체는 오프-타겟 효과를 증가 또는 감소시킨 변이체일 수 있다. 이때, 오프-타겟 효과는 Cas9에 의해 오프-타겟 위치가 절단 또는 변형되는 것을 의미한다.
바람직하게는 상기 Cas9의 변이체는 온 타겟 효과를 증가 또는/및 오프-타겟 효과를 감소시키는 변이체일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 벡터 시스템을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA와 CRISPR 효소는 같은 벡터 또는 다른 벡터에 포함될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 RNP(ribonucleoprotein) system을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA와 CRISPR 효소가 RNA-단백질 복합체 형태일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 인공적으로 합성된 것일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA은 인공적으로 합성된 것일 수 있고, CRISPR 효소도 인위적으로 합성된 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 온 타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 오프-타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 부분적으로 상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 오프-타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 하나 이상의 비상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 온 타겟 또는/및 오프-타겟은 선별 요소를 포함할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
2-1-2 방법
이때, 상기 a) 단계에서 상기 구성 요소 i) 및 ii)를 세포에 도입시킬 때,
상기 구성 요소 i) 및 ii)는 바이러스 벡터 시스템, ribonucleoprotein(RNP), 나노파티클, 리포솜 등을 이용한 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기 천공법(electroporation) 등에 의해 세포 내로 도입될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
한편, 상기 오프-타겟은 세포의 게놈 내에 존재할 수 있다.
상기 구성 요소 i) 중 오프-타겟이 세포 게놈 내에 존재하는 경우, 상기 구성 요소 i)의 온 타겟을 포함한 벡터와 구성 요소 ii)를 세포 내로 도입할 수 있다.
한편, 상기 온 타겟은 세포의 게놈 내에 존재할 수 있다.
상기 구성 요소 i) 중 온 타겟이 세포 게놈 내에 존재하는 경우, 상기 구성 요소 i)의 오프-타겟을 포함한 벡터와 구성 요소 ii)를 세포 내로 도입할 수 있다.
상기 b) 단계에서,
상기 a) 단계에서 구성 요소 i) 및 ii)가 도입된 세포 중에서, 상기 구성 요소 ii)에 의해 상기 구성 요소 i) 중 온 타겟만을 절단된 세포를 선별할 수 있다.
상기 온 타겟만 절단된 세포는 온 타겟에 포함된 선별 요소의 발현 억제에 의해 선별될 수 있다.
예를 들어, 온 타겟이 독소 유전자을 포함한 경우, 온 타겟이 절단됨에 따라 독소 유전자의 발현 억제로 세포가 생존할 수 있다.
또한 상기 구성 요소 i) 중 오프-타겟은 구성 요소 ii)에 의해 절단되지 않은 세포를 선별할 수 있다.
상기 오프-타겟이 절단되지 않은 세포는 오프-타겟이 절단되지 않으므로 선별 요소의 발현을 통해 선별될 수 있다.
예를 들어, 오프-타겟이 항생제 내성 유전자를 포함한 경우, 오프-타겟이 절단되지 않음에 따라 항생제 내성 유전자의 발현을 통해 항생제 존재 하에서 항생제 내성을 가지는 세포를 선별할 수 있다.
또는 상기 오프-타겟이 세포 내의 게놈 내에 위치하는 경우, 상기 구성 요소 ii)에 의해 절단되지 않으므로 세포의 게놈이 정상적으로 유지되어 세포가 생존할 수 있다.
이때, 상기 b) 단계에서 선별된 세포는 상기 구성 요소 ii)에 의해 상기 구성 요소 i)의 온 타겟은 절단되고, 오프-타겟은 절단되지 않은 세포일 수 있다. 이러한 세포는 선별 요소에 의해 구별될 수 있다.
따라서 이와 같은 스크리닝 방법을 이용하여, 다양한 표적 특이적 유전자 가위 변이체들 중에 온 타겟만 효과적으로 절단시키는 높은 특이성 및 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝할 수 있으며, 이때 다양한 선별 요소를 이용하여 다양한 검출 방법으로 스크리닝 방법을 설계할 수 있다.
2-2. 스크리닝 방법의 제2 구체예
또 다른 일 구체예로서,
표적 특이적 유전자 가위 "라이브러리"에서 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝하는 방법으로 활용될 수 있다.
상기 방법은
i) 하나이상의 온 타겟 및 하나이상의 오프-타겟을 포함하는 다중 타겟; 및
ii) 표적 특이적 유전자 가위 라이브러리
를 이용한 방법으로,
a) 상기 i), ii) 구성 요소를 세포 내로 도입하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 온 타겟 만 변형된 세포를 선별하는 단계
를 포함하는 스크리닝 방법이다.
2-2-1 구성요소
이때, 상기 구성 요소 i)은 벡터 시스템을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 i)에서 온 타겟과 오프-타겟은 각각의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)의 표적 특이적 유전자 가위는 CRISPR-Cas 시스템일 수 있으며, 그 외에도 ZFN, TALEN, FokI 또는 이의 혼합일 수 있고, 이에 제한하지 않는다.
상기 표적 특이적 유전자 가위 라이브러리는 CRISPR-Cas 시스템 라이브러리일 수 있다. 상기 유전자 가위 라이브러리는 직접 제작할 수도 있고, 상용일 수도 있으며, 데이터베이스로부터 수득할 수도 있다.
상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA와 CRISPR 효소으로 구성될 수 있다.
상기 CRISPR-Cas 시스템 라이브러리는 가이드 RNA 라이브러리 또는/및 CRISPR 효소 라이브러리일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 벡터 시스템을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA와 CRISPR 효소는 같은 벡터 또는 다른 벡터에 포함될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 RNP(ribonucleoprotein) system을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA와 CRISPR 효소가 RNA-단백질 복합체 형태일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 인공적으로 합성된 것일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA은 인공적으로 합성된 것일 수 있고, CRISPR 효소도 인위적으로 합성된 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 온 타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 오프-타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 부분적으로 상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 오프-타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 하나 이상의 비상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 온 타겟 또는/및 오프-타겟은 선별 요소를 포함할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
2-2-2 방법
이때, 상기 a) 단계에서 상기 구성 요소 i) 및 ii)를 세포에 도입시킬 때,
상기 구성 요소 i) 및 ii)는 바이러스 벡터 시스템, ribonucleoprotein(RNP), 나노파티클, 리포솜 등을 이용한 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기 천공법(electroporation) 등에 의해 세포 내로 도입될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
한편, 상기 오프-타겟은 세포의 게놈 내에 존재할 수 있다.
상기 구성 요소 i) 중 오프-타겟이 세포 게놈 내에 존재하는 경우, 상기 구성 요소 i)의 온 타겟을 포함한 벡터와 구성 요소 ii)를 세포 내로 도입할 수 있다.
한편, 상기 온 타겟은 세포의 게놈 내에 존재할 수 있다.
상기 구성 요소 i) 중 온 타겟이 세포 게놈 내에 존재하는 경우, 상기 구성 요소 i)의 오프-타겟을 포함한 벡터와 구성 요소 ii)를 세포 내로 도입할 수 있다.
상기 b) 단계에서,
상기 a) 단계에서 구성 요소 i) 및 ii)가 도입된 세포 중에서, 상기 구성 요소 ii)에 의해 상기 구성 요소 i) 중 온 타겟만을 절단된 세포를 선별할 수 있다.
상기 온 타겟만 절단된 세포는 온 타겟에 포함된 선별 요소의 발현 억제에 의해 선별될 수 있다.
예를 들어, 온 타겟이 독소 유전자을 포함한 경우, 온 타겟이 절단됨에 따라 독소 유전자의 발현 억제로 세포가 생존할 수 있다.
또한 상기 구성 요소 i) 중 오프-타겟은 구성 요소 ii)에 의해 절단되지 않은 세포를 선별할 수 있다.
상기 오프-타겟이 절단되지 않은 세포는 오프-타겟이 절단되지 않으므로 선별 요소의 발현을 통해 선별될 수 있다.
예를 들어, 오프-타겟이 항생제 내성 유전자를 포함한 경우, 오프-타겟이 절단되지 않음에 따라 항생제 내성 유전자의 발현을 통해 항생제 존재 하에서 항생제 내성을 가지는 세포를 선별할 수 있다.
또는 상기 오프-타겟이 세포 내의 게놈 내에 위치하는 경우, 상기 구성 요소 ii)에 의해 절단되지 않으므로 세포의 게놈이 정상적으로 유지되어 세포가 생존할 수 있다.
이때, 상기 b) 단계에서 선별된 세포는 상기 구성 요소 ii)에 의해 상기 구성 요소 i)의 온 타겟은 절단되고, 오프-타겟은 절단되지 않은 세포일 수 있다. 이러한 세포는 선별 요소에 의해 구별될 수 있다.
따라서 상기와 같은 스크리닝 방법을 이용하여 선별된 상기 세포를 통해 표적 특이적 유전자 가위 라이브러리 중 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝할 수 있으며, 이때 다양한 선별 요소를 이용하여 다양한 검출 방법으로 스크리닝 방법을 설계할 수 있다.
선별 시스템
3. 표적 특이적 유전자 가위의 선별 시스템(Selection system)
상기 스크리닝 시스템을 이용하여 테스트 유전자 가위 중에서 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 세포를 선별하고, 나아가 이로부터 목적하는 유전자 가위를 선별(동정, identifying)할 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 하나 이상의 온-타겟 및 하나 이상의 오프-타겟을 포함하는 다중 타겟을 이용한 표적 특이적 유전자 가위의 선별 시스템에 관한 것이다.
"표적 특이적 유전자 가위의 선별 시스템"은 높은 특이성과 높은 활성을 가지는, 표적 특이적 유전자 가위를 선별하고 이의 구체적인 구성을 확인하기 위해 사용되는 조성물, 키트, 및 이를 이용하는 방법, 그리고 이러한 과정 중에서 도출되는 다양한 중간 산물들을 모두 포함하는 개념이다. 본 명세서 "시스템"으로 기재되어 있는 발명에 대해서는 본 발명이 목적하는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는데 이용되는 것이라면, 해당 발명들의 태양에 맞도록 조성물 또는 방법으로 해석될 수 있다.
상기 선별 시스템은 다중 타겟과 표적 특이적 유전자 가위로 구성될 수 있다.
3-1. 표적 특이적 유전자 가위(CRISPR-Cas 시스템)
이때, 상기 표적 특이적 유전자 가위는 표적을 특이적으로 인지하는 부분과 인지된 표적을 절단 또는 변형시키는 부분으로 구성될 수 있다.
상기 표적을 특이적으로 인지하는 부분은 타겟 유전자 또는 핵산 서열에 따라 변화할 수 있다.
상기 인지된 표적을 절단 또는 변형시키는 부분은 인지된 표적을 절단 또는 변형시킬 수 있다. 이때, 상기 표적을 특이적으로 인지하는 부분과 인지된 표적을 절단 또는 변형시키는 부분은 각각 분리되어 존재하거나 또는 하나의 구조체로서 기능적으로 나누어 존재할 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위는 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPR associated protein) 시스템, ZFN(Zinc finger nuclease), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), FokI, 엔도뉴클레아제(endonuclease) 또는 이들의 조합일 수 있으며, 바람직하게는 CRISPR-Cas 시스템일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드(guide) RNA와 CRISPR 효소으로 구성될 수 있다.
이때, 상기 가이드 RNA는 표적을 특이적으로 인지하는 부분일 수 있으며, 상기 CRISPR 효소는 인지된 표적을 절단 또는 변형시키는 부분일 수 있다.
3-1-1 가이드 RNA
상기 가이드 RNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산서열에 상보적인 결합을 하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산서열에 상보적인 서열을 포함하는 crRNA와 CRISPR 효소과 결합하는 tracrRNA로 구성될 수 있다.
이때 상기 crRNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산서열과 상보적인 결합을 하는 부분인 가이드 서열(guide sequence)을 포함한다. 상기 가이드 서열은 타겟하는 유전자 또는 핵산서열에 상보적인 서열을 가지며, 타겟하는 유전자 또는 핵산서열을 인지하는 역할을 할 수 있다.
상기 가이드 서열의 크기는 5 내지 50, 5 내지 40, 5 내지 30, 또는 5 내지 20 bps 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 5 내지 20 bps의 크기를 가질 수 있다.
상기 가이드 서열의 핵산 서열은 타겟하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치와 50 내지 100% 상보적인 결합을 하는 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 crRNA는 tracrRNA의 일부분에 대해 상보적이 서열을 가지는 부분을 포함하고, 따라서 상기 crRNA는 tracrRNA와 일부 상보적인 결합을 할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA가 각각 따로 존재하는 이중(dual) 가이드 RNA일 수 있다. 또는 상기 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA가 연결되어 있는 단일(single) 가이드 RNA일 수 있다. 이때 상기 단일 가이드 RNA는 링커를 포함할 수 있다.
또한 상기 가이드 RNA는 CRISPR 효소의 종류에 따라 crRNA만을 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 화학적 변형을 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 화학적 변형은 상기 가이드 RNA가 포함하는 핵산 중 하나 또는 둘 이상의 핵산에 phosphorothioate linkage, locked nucleic acid(LNA), 2’-O-methyl 3’phosphorothioate(MS) 또는 2’-O-methyl 3’thioPACE(MSP) 변형되는 것을 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 5' 말단의 일부 서열이 제거된 (truncated) 가이드 RNA일 수 있다.
상기 가이드 RNA는 타겟 유전자 또는 핵산 서열에 따라 가이드 RNA의 핵산 서열을 설계할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 벡터에 포함될 수 있으며, 이때 상기 벡터는 PltetO-1, arapBAD, rhampBAD 또는 T7 프로모터와 가이드 RNA을 발현하기 위해 같은 적합한 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 인공적으로 합성된 것일 수 있다.
3-1-2 CRISPR 효소(CRISPR enzyme)
상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산일 수 있다.
상기 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 이 때 상기 벡터는 CMV 또는 CAG와 같은 CRISPR 효소를 발현시키기에 적합한 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 도입하고자 하는 대상에 맞게 코돈 최적화된 것일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 Type II CRISPR 효소 또는 Type V CRISPR 효소일 수 있다.
상기 Type II CRISPR 효소는 Cas9일 수 있다.
상기 Type V CRISPR 효소는 Cpf1 효소 일 수 있다.
상기 Cas9는 SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9), SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9), StCas9(Streptococcus thermophiles Cas9), NmCas9(Neisseria meningitides Cas9), CjCas9(Campylobacter jejuni Cas9) 또는 이들의 오르쏘로그(orthologs)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 바람직하게는 SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9) 또는 CjCas9(Campylobacter jejuni Cas9)일 수 있다.
상기 Cas9는 활성(active) Cas9 또는 불활성(inactive) Cas9 일 수 있다.
상기 불활성 Cas9는 완전히 불활성화된 Cas9 및 부분적으로 불활성화된 Cas9 (예, 니카아제(nickase))을 포함할 수 있다.
상기 Cas9는 RuvC, HNH, REC 또는/및 PI 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 변이될 수 있다.
상기 Cas9는 SpCas9의 아미노산 중 D10, E762, H840, N854, N863 및 D986로 구성된 아미노산 그룹 또는 다른 Cas9 오르쏘로그의 이에 대응되는 아미노산 그룹 중에 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 Cas9는 SpCas9의 아미노산 중 R780, K810, K848, K855 및 H982로 구성된 아미노산 그룹 또는 다른 Cas9 오르쏘로그의 이에 대응되는 아미노산 그룹 중에 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 Cas9는 SpCas9의 아미노산 중 G1104, S1109, L1111, D1135, S1136, G1218, N1317, R1335 및 T1337 로 구성된 아미노산 그룹 또는 다른 Cas9 오르쏘로그의 이에 대응되는 아미노산 그룹 중에 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 Cpf1는 FnCpf1(Francisella novicida Cpf1), AsCpf1(Acidaminococcus sp. Cpf1), LbCpf1(Lachnospiraceae bacterium Cpf1) 또는 오르쏘로그(orthologs)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 Cpf1는 활성(active) Cpf1 또는 불활성(inactive) Cpf1 일 수 있다.
상기 불활성(inactive) Cpf1 효소는 완전히 불활성화된 Cpf1 및 부분적으로 불활성화된 Cpf1(예, 니카아제(nickase))을 포함할 수 있다.
상기 Cpf1는 RuvC, Nuc, WED, REC 또는/및 PI 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 변이될 수 있다.
상기 Cpf1는 FnCpf1의 아미노산 중 D917, E1006 또는 D1255; AsCpf1의 아미노산 중 D908, E993 또는 D1263; LbCpf1의 아미노산 중 D832, E925, D947 또는 D1180; 또는 다른 Cpf1 오르쏘로그의 이에 대응되는 아미노산 그룹 중에 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산 서열 내에 PAM(Protospacer adjacent motif)를 인식할 수 있다.
상기 PAM은 CRISPR 효소의 유래에 따라 다를 수 있다.
예를 들어, CRISPR 효소가 SpCas9 인 경우 PAM은 5'-NGG-3'일 수 있고, StCas9인 경우 PAM은 5'-NNAGAAW-3'(W = A or T)일 수 있고, NmCas9인 경우 PAM은 5'-NNNNGATT-3'일 수 있고, CjCas9의 경우 PAM은 5'-NNNVRYAC-3' (V = G or C or A, R = A or G, Y = C or T)일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다. 또한, CRISPR 효소가 FnCpf1인 경우 PAM은 5' TTN-3'일 수 있고, AsCpf1 또는 LbCpf1인 경우 PAM은 5'-TTTN-3'일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 기능적 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 CRISPR 효소는 활성 CRISPR 효소 또는 불활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 HFD(heterologous functional domain)일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사 활성(transcription activation activity), 전사 억제 활성(transcription repression activity), 전사 해제인자 활성(transcription release factor activity), 히스톤 변형 활성(histone modification activity), RNA 절단 활성, DNA 절단 활성, 핵산 결합 활성 및 분자 스위치(molecular switches) (e.g., 광유도성)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase), 디메틸라아제(demethylase), 포스파아제(phosphase), 티미딘 키나아제(thymidine kinase), 시스테인 디아미나아제(cysteine deaminase), 시티딘 디아미나아제(cytidine deaminase)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 CRISPR 효소에 기능적 도메인을 연결하기 위해, CRISPR 효소과 기능적 도메인 사이에 링커(linker)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 링커는 (A)n, (G)n, GGGS, (GGS)n, (GGGGS)n, (EAAAK)n, SGGGS, GGSGGSGGS, SGSETPGTSESATPES, XTEN 또는 (XP)n 일 수 있으며, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상일 일 수 있다. 하지만 이에 제한하지 않는다.
상기 CRISPR 효소는 NLS(nuclear localization sequence)를 추가로 포함할 수 있다.
3-1-3 CRISPR 효소의 변이
상기 CRISPR 효소는 활성(active) CRISPR 효소 또는 불활성(inactive) CRISPR 효소일 수 있다.
상기 불활성 CRISPR 효소는 완전히 불활성화된 CRISPR 효소 및 부분적으로 불활성화된 CRISPR 효소(예, 니카아제(nickase))을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 변이된 CRISPR 효소일 수 있다. 즉, 자연적으로 발생하지 않는 CRISPR 효소일 수 있다.
이때, 상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 아미노산이 적어도 하나이상 변이된 것으로, 상기 변이는 아미노산 치환, 제거 또는 부가 등일 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 RuvC 도메인은 RuvCI, RuvCII 또는 RuvCIII 도메인일 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 HNH 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 REC 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 PI 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 Nuc 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 자연적으로 발생하는 CRISPR 효소의 PI 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
또한 상기 CRISPR 효소는 변이된 CRISPR 효소s의 일부를 각각 취합하여 재조합된 CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 자연상태에서 존재하는 CRISPR 효소(즉, wild type CRISPR 효소)의 RuvC 도메인, HNH 도메인 및 PI 도메인을 각각 CRISPR 효소 변이체 1의 RuvC 도메인과 CRISPR 효소 변이체 2의 HNH 도메인 및 CRISPR 효소 변이체 3의 PI 도메인으로 교체 또는 재조합할 수 있다. 또는 CRISPR 효소 변이체 1의 1에서 500번까지의 아미노산 서열(또는 이를 코딩하는 핵산 서열)과 CRISPR 효소 변이체 2의 501번부터 1000번까지 아미노산 서열(또는 이를 코딩하는 핵산 서열)과 CRISPR 효소 변이체 3의 1001번부터 끝까지의 아미노산 서열(또는 이를 코딩하는 핵산 서열)로 조합하여 CRISPR 효소 변이체 1, 2 및 3과는 다른 새로운 CRISPR 변이체를 만들 수 있다.
또 다른 예로, CRISPR 효소 변이체 1의 일부, 예를 들어 50에서 700번까지의 아미노산 서열(또는 이를 코딩하는 핵산 서열)을 CRISPR 효소 변이체 2의 50에서 700번까지의 아미노산 서열(또는 이를 코딩하는 핵산 서열)로 교체 또는 재조합할 수 있다.
또한 상기 CRISPR 효소는 서로 다른 종류의 CRISPR 효소의 조합에 의해 생성된 CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, Cas9의 RuvC 도메인을 Cpf1의 RuvC 도메인으로 교체 또는 재조합 될 수 있다.
또한 상기 CRISPR 효소는 활성 CRISPR 효소 또는 불활성 CRISPR 효소에 기능적 도메인을 추가로 포함한 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 HFD(heterologous functional domain)일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사 활성(transcription activation activity), 전사 억제 활성(transcription repression activity), 전사 해제인자 활성(transcription release factor activity), 히스톤 변형 활성(histone modification activity), RNA 절단 활성, DNA 절단 활성, 핵산 결합 활성 및 분자 스위치(molecular switches) (e.g., 광유도성)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase), 디메틸라아제(demethylase), 포스파아제(phosphase), 티미딘 키나아제(thymidine kinase), 시스테인 디아미나아제(cysteine deaminase), 시티딘 디아미나아제(cytidine deaminase)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 CRISPR 효소에 기능적 도메인을 연결하기 위해, CRISPR 효소과 기능적 도메인 사이에 링커를 추가로 포함할 수 있다.
상기 링커는 (A)n, (G)n, GGGS, (GGS)n, (GGGGS)n, (EAAAK)n, SGGGS, GGSGGSGGS, SGSETPGTSESATPES, XTEN 또는 (XP)n 일 수 있으며, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상일 일 수 있다. 하지만 이에 제한하지 않는다.
예를 들어 상기 CRISPR 효소 변이체는 불활성 효소에 전자 억제(transcription repression) 도메인을 포함하는 것으로, 상기 CRISPR 효소 변이체가 타겟 유전자 또는 핵산 서열의 발현을 억제하게 하는 변이체일 수 있다. 또한, 상기 CRISPR 효소 변이체는 불활성 효소에 시티딘 디아미나아게(cytidine deaminase)를 포함하는 것으로, 상기 CRISPR 효소 변이체가 타겟 유전자 또는 핵산 서열의 특정 염기서열을 변경하여 해당 유전자 또는 핵산 서열의 발현을 억제 또는 증가시킬 수 있는 변이체일 수 있다.
3-1-4 CRISPR 효소의 변이 효과
상기 변이된 CRISPR 효소는 타겟하는 유전자 또는 핵산(즉, 온 타겟)에 대한 절단 효과가 증가하도록 변이된 것일 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 타겟하는 유전자 또는 핵산(즉, 온 타겟)에 대한 절단 효과가 감소하도록 변이된 것일 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산(즉, 오프-타겟)에 대한 절단 효과가 증가하도록 변이된 것일 수 있다.
상기 변이된 CRISPR 효소는 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산(즉, 오프-타겟)에 대한 절단 효과가 감소하도록 변이된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산에 결합하는(binding)하는 능력이 증가하도록 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산에 결합하는(binding)하는 능력이 감소하도록 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산 서열 내에 PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식하는 능력이 증가하도록 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산 서열 내에 PAM을 인식하는 능력이 감소하도록 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 헬리카아제 동역학(helicase kinetics)이 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 CRISPR 효소는 변형에 따른 구조적 재배열(conformation rearrangement)을 포함할 수 있다.
3-2. CRISPR 복합체 (CRISPR complex)
상기 CRISPR 효소과 가이드 RNA는 CRISPR 복합체를 형성할 수 있다.
상기 CRISPR 복합체는 세포 밖에서 형성될 수 있다.
상기 CRISPR 복합체는 세포 내의 세포질에서 형성될 수 있다.
상기 CRISPR 복합체는 세포 내의 핵 안에서 형성될 수 있다.
상기 CRISPR 복합체에서, CRISPR 효소는 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열 내에 존재하는 PAM을 인식할 수 있다.
상기 CRISPR 복합체에서, 가이드 RNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열에 상보적인 결합을 할 수 있다.
상기 CRISPR 복합체가 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열에 결합하면, 상기 CRISPR 복합체의 CRISPR 효소에 의해 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열은 절단 또는 변형될 수 있다.
이때 상기 표적 특이적 유전자 가위는 세포 내로 도입될 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위의 세포 내 도입은 바이러스 벡터 시스템, ribonucleoprotein(RNP), 나노파티클, 리포솜 등을 이용한 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기 천공법(electroporation) 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
3-3 다중 타겟
이때, 상기 타겟은 표적 특이적 유전자 가위에 의해 표적되는 유전자 또는 핵산 서열일 수 있다.
상기 다중 타겟은 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열(즉, 온 타겟)과 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산 서열(즉, 오프-타겟)으로 구성될 수 있다.
상기 다중 타겟은 하나 이상의 온 타겟과 하나 이상의 오프-타겟으로 구성될 수 있다. 일 구체예로서, 상기 다중 타겟은 하나의 온 타겟과 하나 이상의 오프-타겟으로 구성될 수 있다. 다른 구체예로서, 상기 다중 타겟은 하나의 온 타겟과 하나의 오프-타겟으로 구성될 수 있다.
상기 다중 타겟은 세포 내에 존재하거나 또는 외부에서 도입될 수 있다.
상기 다중 타겟이 세포 내에 존재하는 경우, 상기 다중 타겟은 숙주 세포의 게놈에 존재할 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 오프 타겟이 숙주 세포의 게놈에 존재할 수 있다.
상기 다중 타겟이 외부에서 세포로 도입되는 경우, 상기 다중 타겟은 벡터 시스템(vector system)을 이용하여 도입될 수 있다.
상기 다중 타겟이 외부에서 세포로 도입되는 경우, 상기 다중 타겟은 타겟마다 다른 벡터를 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 즉, 상기 다중 타겟이 하나의 온 타겟과 하나의 오프-타겟으로 구성된 경우, 상기 벡터는 온 타겟을 포함한 벡터와 오프-타겟을 포함하는 벡터로 구성될 수 있다.
상기 다중 타겟의 세포 내 도입은 바이러스 벡터 시스템, 나노파티클, 리포솜 등을 이용한 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기 천공법(electroporation) 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
3-3-1 온 타겟
상기 온 타겟은 표적 특이적 유전자 가위가 상보적으로 결합하는 타겟 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 온 타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 상보적인 서열을 가지는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 온 타겟은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열(guide sequence)과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
이때, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열은 5 내지 50 bps일 수 있으며, 또한 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열 길이에 따라 그 길이가 조절될 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 온 타겟은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 온 타겟은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열과 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 온 타겟의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 5' 말단에 위치할 수 있다.
이때, 상기 온 타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 3'말단에 위치할 수 있다.
상기 온 타겟은 (N)5~50-PAM 또는 PAM-(N)5~50 일 수 있으며, 이때 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다.
이 때 상기 온 타겟은 세포 내의 게놈 내에 위치할 수 있다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
이때 상기 온 타겟은 선별 요소를 포함할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 독소 유전자은 Hok, fst, TisB, LdrD, FlmA, Ibs, TxpA/BrnT, SymE, XCV1262, CcdB, ParE, MazF, yafO, HicA, Kid, Zeta, DarT 또는 Sxt 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 독소 유전자은 온 타겟의 유래에 따라(즉, 오리진에 따라) 변경시킬 수 있다. 즉, 상기 독소 유전자는 숙주 세포의 종류에 따라 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
숙주가 대장균인 경우 상기 독소 유전자 ccdB를 사용할 수 있다.
숙주 세포가 포유류 세포인 경우 상기 독소 유전자 HPRT(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)를 사용할 수 있다.
숙주가 효모인 경우 상기 독소 유전자 URA3를 사용할 수 있다.
상기 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)는 항생제의 종류에 따라 다양하게 설계할 수 있다.
상기 항생제는 카나마이신(kanamycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 암피실린(ampicillin), 카르베니실린(carbenicillin), 블레오마이신(bleomycin), 에리트로마이신(erythromycin), 폴리믹신(polymyxin) B, 테트라사이클린(tetracycline), 제오신(zeocin), 퓨로마이신(puromycin) 또는 클로람페니콜(chloramphenicol)일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 fluorescent protein는 green fluorescent protein(GFP), red fluorescent protein(RFP), yellow fluorescent protein(YFP), cyan fluorescent protein(CFP), blue fluorescent protein(BFP) 또는 orange fluorescent protein(OFP)일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 태그(tag)는 AviTag, Calmodulin-tag, polyglutamate tag, E-tag, FLAG-tag, HA-tag, His-tag, Myc-tag, NE-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, Strep-tag, TC tag, V5 tag, VSV-tag, Xpress tag, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Biotin Carboxyl Carrier Protein(BCCP), Glutathione-S-transferase(GST)-tag, HaloTag, Maltose binding protein(MBP)-tag, Nus-tag, Thioredoxin-tag, chitin binding protein(CBP), thioredoxin(TRX) 또는 poly(NANP)일 수 있다.
이때 상기 선별 요소를 포함하는 온 타겟이 표적 특이적 유전자 가위에 의해 잘리거나 변형될 때, 상기 선별 요소가 발현되지 않을 수 있다.
3-3-2 오프 타겟
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위가 부분적으로 상보적인 결합을 하는 비타겟 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 오프-타겟은 상기 온 타겟에서 하나 이상의 다른 염기 서열을 포함하는 핵산의 서열일 수 있다.
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 부분적으로 상보적인 서열을 가지는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 부분적으로 상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
이때, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열은 5 내지 50 bps일 수 있으며, 또한 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열 길이에 따라 그 길이가 조절될 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열과 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 오프-타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 5'-말단에 위치할 수 있다.
이때, 상기 오프-타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 3'-말단에 위치할 수 있다.
상기 오프-타겟은 (N)5~50-PAM 또는 PAM-(N)5~50 일 수 있으며, 이때 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다.
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 하나 이상의 비상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 100% 미만의 상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다. 상기 100% 미만의 서열 상동성을 가지지는 핵산 서열이란 온-타겟 핵산 서열과 유사한 핵산 서열로, 하나 이상의 다른 염기서열을 포함하거나 하나 이상의 염기서열이 삭제된 핵산 서열일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 하나이상의 비상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 100% 미만의 상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열 중 하나 이상의 미스매치된(mismatched) 핵산 서열을 포함할 수 있다.
이때 상기 오프-타겟은 세포 내의 게놈 내에 위치할 수 있다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
이때 상기 오프-타겟은 선별 요소를 포함할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
이때 상기 선별 요소를 포함하는 오프-타겟이 표적 특이적 유전자 가위에 의해 잘리거나 변형될 때, 상기 선별 요소가 발현되지 않을 수 있다.
이때 상기 선별 요소를 포함하는 오프-타겟이 표적 특이적 유전자 가위에 의해 잘리거나 변형되지 않을 때, 상기 선별 요소가 발현될 수 있다.
3-4 선별 요소의 효과
본 발명의 “선별 요소(selection element)”는 표적 특이적 유전자 가위에 의해 타겟 유전자 또는 핵산 서열의 절단 또는 변형의 유무를 검출하기 위한 마커를 의미한다. 그러므로 "선별 마커(selection marker)"로 혼용하여 사용될 수 있다
상기 선별 요소의 발현의 유무를 통해 표적 특이적 유전자 가위에 의해 타겟 유전자 또는 핵산서열의 절단 또는 변형의 유무를 검출할 수 있다. 즉, 온 타겟(on-target) 효과의 증가 여부 및/또는 오프 타겟(off-target) 효과의 감소 여부를 검출할 수 있다.
온 타겟 또는/및 오프-타겟에 포함된 선별 요소는 표적 특이적 유전자 가위의 높은 특이성 또는 높은 활성을 판단하는 요소가 될 수 있다.
일 예로, 선별 요소로 독소 유전자(toxin gene)를 포함하는 온 타겟과 선별 요소로 항생제 내성 유전자를 포함하는 오프-타겟을 이용해 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 경우, 상기 온 타겟과 오프-타겟을 포함하는 각각의 벡터 및 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 벡터를 세포에 도입하면 높은 특이성을 보이는 표적 특이적 유전자 가위는 온 타겟를 절단하므로 독소 유전자의 발현이 억제되고, 반면에 오프-타겟은 절단하지 않으므로 항생제 내성 유전자가 발현할 것으로 예측할 수 있다. 그러므로 온 타겟만 절단하고 오프-타겟을 절단하지 않는 높은 특이성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위가 도입된 세포는 항생제를 처리하였을 때 생존할 수 있다. 따라서, 이러한 선별 요소의 발현의 유무를 통해 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 할 수 있다.
다른 예로, 선별 요소로 독소 유전자을 포함하는 온 타겟과 세포의 게놈 내에 존재하는 오프-타겟을 이용하여 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 경우, 상기 온 타겟을 포함하는 벡터와 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 벡터를 세포에 도입하면, 높은 특이성을 보이는 표적 특이적 유전자 가위는 온 타겟를 절단하므로 독소 유전자의 발현이 억제되고, 반면에 오프-타겟은 절단하지 않으므로 게놈을 절단되지 않을 것으로 예측할 수 있다. 그러므로, 온 타겟만 절단하고 오프-타겟을 절단하지 않는 높은 특이성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위가 도입된 세포는 생존할 수 있고, 온 타겟과 오프-타겟 모두 절단된 세포는 오프-타겟 절단으로 게놈이 절단되어 생존하지 못 할 것이므로 구별될 수 있다.
또 다른 예로, 선별 요소로 독소 유전자을 포함하는 온 타겟과 선별 요소로 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 오프-타겟을 이용하여 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 하는 경우, 상기 온 타겟을 포함하는 벡터와 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 벡터를 세포에 도입하면, 높은 특이성을 보이는 표적 특이적 유전자 가위는 온 타겟를 절단하므로 독소 유전자의 발현이 억제되고, 반면에 오프-타겟은 절단하지 않으므로 형광 단백질을 발현할 것으로 예측할 수 있다. 그러므로, 온 타겟만 절단하고 오프-타겟을 절단하지 않는 높은 특이성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위가 도입된 세포는 생존할 수 있고 또한 형광 단백질로 구별될 수 있다.
따라서, 상기 온 타겟 또는/및 오프-타겟에 포함된 선별 요소는 표적 특이적 유전자 가위의 높은 특이성 또는 높은 활성을 판단하여 선별하는 기준이 될 수 있다.
4. 유전자 가위 선별 방법
상기 선별 시스템을 이용하여 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별할 수 있다.
일 태양으로, 본 발명은 다수의 표적 특이적 유전자 가위 테스트군 중에서 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "표적 특이적 유전자 가위를 선별하는 방법"은 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 포함하는 세포를 선별한 후, 더 나아가 구체적인 유전자 가위의 구성을 확인(identifying)하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 방법에 의해 우수한 표적 특이적 유전자 가위의 서열 정보까지 수득할 수 있다.
특히, 상기 방법은 표적 특이적 유전자 가위의 개량에 의해 제조한 다양한 유전자 가위의 변이체들 및 유전자 가위 라이브러리 중에서 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는데 매우 유용하다.
4-1. 선별 방법의 제1 구체예
일 구체예로서,
표적 특이적 유전자 가위의 다양한 "변이체"들 중에서 높은 특이성 및 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는 방법으로 활용될 수 있다.
상기 방법은
i) 하나이상의 온 타겟 및 하나이상의 오프-타겟을 포함하는 다중 타겟; 및
ii) 표적 특이적 유전자 가위 변이체
를 이용한 방법으로,
a) 상기 i), ii) 구성 요소를 세포 내로 도입하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 선별 요소의 발현 유무에 따른 온-타겟 효과 및 오프-타겟 효과를 확인하여 세포를 선별하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 선별된 세포 내 존재하는 유전자 가위를 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위로 선별하는 단계
를 포함하는 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위의 선별 방법이다.
4-1-1 구성요소
이때, 상기 구성 요소 i)은 벡터 시스템을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 i)에서 온 타겟과 오프-타겟은 각각의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)의 표적 특이적 유전자 가위는 CRISPR-Cas 시스템일 수 있으며, 그 외에도 ZFN, TALEN, FokI 등일 수 있고, 이에 제한하지 않는다.
상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA와 CRISPR 효소으로 구성될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)의 표적 특이적 유전자 가위 변이체는 CRISPR-Cas 시스템의 변이체일 수 있으며, 바람직하게는 CRISPR 효소의 변이체일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 상기 유전자 가위 변이체는 전자기파, UV, 방사선, 화학물질, 외부/내부 유전자 작용 등에 의해 생성될 수 있다. 일 실시예에서는 WT CRISPR-Cas 시스템에 UV를 조사시킴으로써 변이체들을 수득하였다.
상기 CRISPR 효소는 Cas9일 수 있고, 상기 CRISPR 효소의 변이체는 Cas9의 변이체일 수 있다.
상기 Cas9의 변이체는 온 타겟 효과를 증가 또는 감소시킨 변이체일 수 있다. 이때, 온 타겟 효과는 Cas9에 의해 온 타겟 위치가 절단 또는 변형되는 것을 의미한다.
상기 Cas9의 변이체는 오프-타겟 효과를 증가 또는 감소시킨 변이체일 수 있다. 이때, 오프-타겟 효과는 Cas9에 의해 오프-타겟 위치가 절단 또는 변형되는 것을 의미한다.
바람직하게는 상기 Cas9의 변이체는 온 타겟 효과를 증가 또는/및 오프-타겟 효과를 감소시키는 변이체일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 벡터 시스템을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA와 CRISPR 효소는 같은 벡터 또는 다른 벡터에 포함될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 RNP(ribonucleoprotein) system을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA와 CRISPR 효소가 RNA-단백질 복합체 형태일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 인공적으로 합성된 것일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA은 인공적으로 합성된 것일 수 있고, CRISPR 효소도 인위적으로 합성된 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 온 타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 오프-타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 부분적으로 상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 오프-타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 하나 이상의 비상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 온 타겟 또는/및 오프-타겟은 선별 요소를 포함할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
4-1-2 방법
이때, 상기 a) 단계에서 상기 구성 요소 i) 및 ii)를 세포에 도입시킬 때,
상기 구성 요소 i) 및 ii)는 바이러스 벡터 시스템, ribonucleoprotein(RNP), 나노파티클, 리포솜 등을 이용한 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기 천공법(electroporation) 등에 의해 세포 내로 도입될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
한편, 상기 오프-타겟은 세포의 게놈 내에 존재할 수 있다.
상기 구성 요소 i) 중 오프-타겟이 세포 게놈 내에 존재하는 경우, 상기 구성 요소 i)의 온 타겟을 포함한 벡터와 구성 요소 ii)를 세포 내로 도입할 수 있다.
한편, 상기 온 타겟은 세포의 게놈 내에 존재할 수 있다.
상기 구성 요소 i) 중 온 타겟이 세포 게놈 내에 존재하는 경우, 상기 구성 요소 i)의 오프-타겟을 포함한 벡터와 구성 요소 ii)를 세포 내로 도입할 수 있다.
이때 상기 b) 단계에서,
상기 a) 단계에서 구성 요소 i) 및 ii)가 도입된 세포 중에서, 상기 구성 요소 ii)에 의해 상기 구성 요소 i) 중 온 타겟만을 절단된 세포를 선별할 수 있다.
상기 온 타겟만 절단된 세포는 온 타겟에 포함된 선별 요소의 발현 억제에 의해 선별될 수 있다.
예를 들어, 온 타겟이 독소 유전자을 포함한 경우, 온 타겟이 절단됨에 따라 독소 유전자의 발현 억제로 세포가 생존할 수 있다.
또한 상기 구성 요소 i) 중 오프-타겟은 구성 요소 ii)에 의해 절단되지 않은 세포를 선별할 수 있다.
상기 오프-타겟이 절단되지 않은 세포는 오프-타겟이 절단되지 않으므로 선별 요소의 발현을 통해 선별될 수 있다.
예를 들어, 오프-타겟이 항생제 내성 유전자를 포함한 경우, 오프-타겟이 절단되지 않음에 따라 항생제 내성 유전자의 발현을 통해 항생제 존재 하에서 항생제 내성을 가지는 세포를 선별할 수 있다.
또는 상기 오프-타겟이 세포 내의 게놈 내에 위치하는 경우, 상기 구성 요소 ii)에 의해 절단되지 않으므로 세포의 게놈이 정상적으로 유지되어 세포가 생존할 수 있다.
이때, 상기 b) 단계에서 선별된 세포는 상기 구성 요소 ii)에 의해 상기 구성 요소 i)의 온 타겟은 절단되고, 오프-타겟은 절단되지 않은 세포일 수 있다. 이러한 세포는 선별 요소에 의해 구별될 수 있다.
이때 상기 c) 단계에서,
상기 b) 단계에서 선별된 세포를 이용하여 상기 선별된 세포에 도입된 상기 구성 요소 ii), 즉, 표적 특이적 유전자 가위를 확인할 수 있다.
상기 b) 단계에서 선별된 세포를 이용하여 상기 선별된 세포에 도입된 상기 구성 요소 ii), 즉, 표적 특이적 유전자 가위는 온 타겟만 선택적으로 절단 또는 변형하는 표적 유전자 가위일 수 있다.
c)단계에서 상기 선별된 세포로부터 수득한 유전자 가위를 시퀀싱하여 그의 서열을 수득함으로써, 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 수득할 수 있다.
예를 들어, 전기천공법으로 처리한 대장균을 카나마이신(Kanamycin)과 클로람페니콜(Chloramphenicol), 아라비노즈(Arabinose)를 포함한 LB 아가 플레이트에 30℃에서 16시간 동안 배양하여, 콜로니들이 눈에 보일 정도의 크기로 생기면 이를 하나씩 클로람페니콜을 포함한 10ml LB 버퍼에 접종한후 42℃, 쉐이킹 인큐베이터( shaking incubator)에서 12시간동안 배양한다. 원심분리를 통해 대장균 펠렛을 얻은 후 이를 미니프렙(Miniprep) 키트를 이용하여 플라스미드를 추출한다. 추출된 플라스미드는, 예를 들어 Sanger sequencing 방법을 이용하여 시퀀싱할 수 있다. 프라이머의 경우는 Cas9 N-term과 C-term 바깥쪽에 존재하는 CMV-F, BGH-R등의 Universal sequencing primer와 Cas9 중간부분의 sequencing primer들을 이용할 수 있다.
본 방법의 일 구체예로서, 도 1을 참조하여 설명하면, 상기 표적 특이적 유전자 가위를 확인하는 방법은 플라스미드 B와 C의 표식 마커인 카나마이신(Kanamycin)과 클로람페니콜(Chloramphenicol), 아라비노즈(Arabinose) 프로모터를 작동시키는 아라비노즈를 포함한 LB 아가 플레이트(Agar plate)에서 전기천공법(electroporation)을 통해플라스미드 A, B, C를 모두 도입하고, 한 시간 동안 무수 테트라사이클린(Anhydrous tetracycline)을 포함한 SOC에서 인큐베이션된 대장균을 분주하면 플라스미드 A가 플라스미드 C의 유전자가위에 의해 절단되었지만 게놈DNA는 절단되지 않은 대장균만 살아남게 된다.
따라서 상기와 같은 방법을 이용하여 선별된 상기 세포를 통해 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별할 수 있다.
4-2. 선별 방법의 제2 구체예
또 다른 일 구체예로서,
표적 특이적 유전자 가위 "라이브러리"에서 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는 방법으로 활용될 수 있다.
상기 방법은
i) 하나이상의 온 타겟 및 하나이상의 오프-타겟을 포함하는 다중 타겟; 및
ii) 표적 특이적 유전자 가위 라이브러리
를 이용한 방법으로,
a) 상기 i), ii) 구성 요소를 세포 내로 도입하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 온 타겟 만 변형된 세포를 선별하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 선별된 세포를 이용하여 상기 구성 요소 ii)를 확인하는 단계
를 포함하는 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위의 선별 방법이다.
4-2-1 구성요소
이때, 상기 구성 요소 i)은 벡터 시스템을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 i)에서 온 타겟과 오프-타겟은 각각의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)의 표적 특이적 유전자 가위는 CRISPR-Cas 시스템일 수 있으며, 그 외에도 ZFN, TALEN, FokI 등일 수 있고, 이에 제한하지 않는다.
상기 표적 특이적 유전자 가위 라이브러리는 CRISPR-Cas 시스템 라이브러리일 수 있다. 상기 유전자 가위 라이브러리는 직접 제작할 수도 있고, 상용일 수도 있으며, 데이터베이스로부터 수득할 수도 있다.
상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA와 CRISPR 효소으로 구성될 수 있다.
상기 CRISPR-Cas 시스템 라이브러리는 가이드 RNA 라이브러리 또는/및 CRISPR 효소 라이브러리일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 벡터 시스템을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA와 CRISPR 효소는 같은 벡터 또는 다른 벡터에 포함될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 RNP(ribonucleoprotein) system을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA와 CRISPR 효소가 RNA-단백질 복합체 형태일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 인공적으로 합성된 것일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 온 타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 오프-타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 부분적으로 상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 오프-타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 하나 이상의 비상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 온 타겟 또는/및 오프-타겟은 선별 요소를 포함할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
4-2-2 방법
이때, 상기 a) 단계에서 상기 구성 요소 i) 및 ii)를 세포에 도입시킬 때,
상기 구성 요소 i) 및 ii)는 바이러스 벡터 시스템, ribonucleoprotein(RNP), 나노파티클, 리포솜 등을 이용한 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기 천공법(electroporation) 등에 의해 세포 내로 도입될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
한편, 상기 오프-타겟은 세포의 게놈 내에 존재할 수 있다.
상기 구성 요소 i) 중 오프-타겟이 세포 게놈 내에 존재하는 경우, 상기 구성 요소 i)의 온 타겟을 포함한 벡터와 구성 요소 ii)를 세포 내로 도입할 수 있다.
한편, 상기 온 타겟은 세포의 게놈 내에 존재할 수 있다.
상기 구성 요소 i) 중 온 타겟이 세포 게놈 내에 존재하는 경우, 상기 구성 요소 i)의 오프-타겟을 포함한 벡터와 구성 요소 ii)를 세포 내로 도입할 수 있다.
상기 b) 단계에서,
상기 a) 단계에서 구성 요소 i) 및 ii)가 도입된 세포 중에서, 상기 구성 요소 ii)에 의해 상기 구성 요소 i) 중 온 타겟만을 절단된 세포를 선별할 수 있다.
상기 온 타겟만 절단된 세포는 온 타겟에 포함된 선별 요소의 발현 억제에 의해 선별될 수 있다.
예를 들어, 온 타겟이 독소 유전자을 포함한 경우, 온 타겟이 절단됨에 따라 독소 유전자의 발현 억제로 세포가 생존할 수 있다.
또한 상기 구성 요소 i) 중 오프-타겟은 구성 요소 ii)에 의해 절단되지 않은 세포를 선별할 수 있다.
상기 오프-타겟이 절단되지 않은 세포는 오프-타겟이 절단되지 않으므로 선별 요소의 발현을 통해 선별될 수 있다.
예를 들어, 오프-타겟이 항생제 내성 유전자를 포함한 경우, 오프-타겟이 절단되지 않음에 따라 항생제 내성 유전자의 발현을 통해 항생제 존재 하에서 항생제 내성을 가지는 세포를 선별할 수 있다.
또는 상기 오프-타겟이 세포 내의 게놈 내에 위치하는 경우, 상기 구성 요소 ii)에 의해 절단되지 않으므로 세포의 게놈이 정상적으로 유지되어 세포가 생존할 수 있다.
이때, 상기 b) 단계에서 선별된 세포는 상기 구성 요소 ii)에 의해 상기 구성 요소 i)의 온 타겟은 절단되고, 오프-타겟은 절단되지 않은 세포일 수 있다. 이러한 세포는 선별 요소에 의해 구별될 수 있다.
이때 상기 c) 단계에서,
상기 b) 단계에서 선별된 세포를 이용하여 상기 선별된 세포에 도입된 상기 구성 요소 ii), 즉, 표적 특이적 유전자 가위를 확인할 수 있다.
상기 b) 단계에서 선별된 세포를 이용하여 상기 선별된 세포에 도입된 상기 구성 요소 ii), 즉, 표적 특이적 유전자 가위는 온 타겟만 선택적으로 절단 또는 변형하는 표적 유전자 가위일 수 있다.
c)단계에서 상기 선별된 세포로부터 수득한 유전자 가위를 시퀀싱하여 그의 서열을 수득함으로써, 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 수득할 수 있다.
예를 들어, 전기천공법으로 처리한 대장균을 카나마이신(Kanamycin)과 클로람페니콜(Chloramphenicol), 아라비노즈(Arabinose)를 포함한 LB 아가 플레이트에 30℃에서 16시간 동안 배양하여, 콜로니들이 눈에 보일 정도의 크기로 생기면 이를 하나씩 클로람페니콜을 포함한 10ml LB 버퍼에 접종한후 42℃, 쉐이킹 인큐베이터( shaking incubator)에서 12시간동안 배양한다. 원심분리를 통해 대장균 펠렛을 얻은 후 이를 미니프렙(Miniprep) 키트를 이용하여 플라스미드를 추출한다. 추출된 플라스미드는, 예를 들어 Sanger sequencing 방법을 이용하여 시퀀싱할 수 있다. 프라이머의 경우는 Cas9 N-term과 C-term 바깥쪽에 존재하는 CMV-F, BGH-R등의 Universal sequencing primer와 Cas9 중간부분의 sequencing primer들을 이용할 수 있다.
본 방법의 일 구체예로서, 도 1을 참조하여 설명하면, 상기 표적 특이적 유전자 가위를 확인하는 방법은 플라스미드 B와 C의 표식 마커인 카나마이신(Kanamycin)과 클로람페니콜(Chloramphenicol), 아라비노즈(Arabinose) 프로모터를 작동시키는 아라비노즈를 포함한 LB 아가 플레이트(Agar plate)에서 전기천공법(electroporation)을 통해플라스미드 A, B, C를 모두 도입하고, 한 시간 동안 무수 테트라사이클린(Anhydrous tetracycline)을 포함한 SOC에서 인큐베이션된 대장균을 분주하면 플라스미드 A가 플라스미드 C의 유전자가위에 의해 절단되었지만 게놈DNA는 절단되지 않은 대장균만 살아남게 된다.
따라서 상기와 같은 방법을 이용하여 선별된 상기 세포를 통해 표적 특이적 유전자 가위 라이브러리 중 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위를 선별할 수 있다.
5. 조성물 또는 키트
본 발명의 또 다른 태양은 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 함유하는 다중 타겟을 포함하는, 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위 선별용 스크리닝 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 조성물의 형태일 수 있다.
일 구체예서, 상기 조성물 또는 키트는
i) 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 함유하는 다중 타겟; 및
ii) 표적 특이적 유전자 가위 및/또는 iii) 숙주 세포로 구성될 수 있다.
본 발명의 높은 특이성 또는 높은 활성을 가지는 표적 특이적 유전자 가위 선별용 스크리닝 키트 또는 조성물은 필수 구성으로서, 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 함유하는 다중 타겟을 포함하고, 선택적으로 표적 특이적 유전자 가위 및/또는 숙주 세포를 포함한다.
필요에 따라, 본 발명의 키트는 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 함유하는 다중 타겟을 포함하는 1액형 키트로 구성하여 제공할 수 있다.
필요에 따라, 본 발명의 키트는 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 함유하는 다중 타겟 및 숙주 세포를 각각 포함하는 2액형 키트로 구성하여 제공할 수 있다.
이 때 상기 키트는 선별 요소를 포함하는 다중 타겟을 숙주 세포 내에 포함시켜 1액형으로 제공할 수도 있다. 예를 들어, 별도의 플라스미드로 숙주 세포 내에 포함시킬 수도 있고, 숙주 세포 게놈 내로 통합시켜 제공할 수도 있다.
필요에 따라, 본 발명의 키트는 하나 이상의 선별 요소(selection element)를 함유하는 다중 타겟, 숙주 세포 및 테스트 유전자 가위를 각각 포함하는 3액형 키트로 구성하여 제공할 수 있다.
이 때 상기 키트는 선별 요소를 포함하는 다중 타겟을 숙주 세포 내에 포함시켜 2액형으로 제공할 수도 있다. 예를 들어, 별도의 플라스미드로 숙주 세포 내에 포함시킬 수도 있고, 숙주 세포 게놈 내로 통합시켜 제공할 수도 있다.
이때, 상기 구성 요소 i)은 벡터 시스템을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 i)에서 하나 이상의 온 타겟과 하나 이상의 오프-타겟은 각각의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)의 표적 특이적 유전자 가위는 CRISPR-Cas 시스템일 수 있으며, 그 외에도 ZFN, TALEN, FokI 등일 수 있고, 이에 제한하지 않는다.
상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA와 CRISPR 효소으로 구성될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 벡터 시스템을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA와 CRISPR 효소는 같은 벡터 또는 다른 벡터에 포함될 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 ribonucleoprotein(RNP) system을 이용할 수 있고, 상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA와 CRISPR 효소가 RNA-protein complex 형태일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)는 인공적으로 합성된 것일 수 있다.
상기 구성 요소 ii)가 CRISPR-Cas 시스템인 경우, 가이드 RNA은 인공적으로 합성된 것일 수 있고, CRISPR 효소도 인위적으로 합성된 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 온 타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 오프-타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 부분적으로 상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 오프-타겟은 상기 구성 요소 ii)의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 하나 이상의 비상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 구성 요소 i)에서, 상기 온 타겟 또는/및 오프-타겟은 선별 요소와 연결되어 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 구성 요소 iii) 숙주 세포는 선별 요소의 발현에 적합한 임의의 세포일 수 있다. 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다.
예를 들어, 독소 유전자 ccdB를 사용하는 경우 숙주로 대장균을 사용할 수 있고, HPRT(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)를 사용하는 경우 숙주 세포를 포유류 유래 세포를 사용할 수 있으며, 독소 유전자 URA3를 사용하는 경우 숙주를 효모로 사용할 수 있다.
이 밖에도 본 발명의 당업자들이 유전자 가위의 스크리닝 및 선별에 적합한 종류의 세포를 임의로 선택하여 사용할 수 있음은 자명할 것이다.
또한, 상기 조성물 또는 키트는 필요에 따라 버퍼(buffer), 선별을 위한 다양한 물질(예를 들면, 항생제, X-gal 등) 또는 세포 내 도입을 위해 사용되는 다양한 시약(예를 들면, 트랜스펙션 시약, 리포펙타민 등)을 추가로 포함할 수 있다.
6. 세포(주) 또는 세포 생산방법
또한, 본 발명은 표적 특이적 유전자 가위를 스크리닝 또는/및 선별하기 위한 다중 타겟을 포함하는 세포 또는/및 세포의 생산 방법을 제공한다.
상기 세포는 다중 타겟을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이 때 다중 타겟은 세포 내 게놈에 존재하거나 또는 외부에서 세포 내로 도입된 것일 수 있다.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
6-1 다중 타겟
상기 타겟은 표적 특이적 유전자 가위에 의해 표적되는 유전자 또는 핵산 서열일 수 있다.
상기 다중 타겟은 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열(즉, 온 타겟)과 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산 서열(즉, 오프-타겟)으로 구성될 수 있다.
상기 다중 타겟은 하나 이상의 온 타겟과 하나 이상의 오프-타겟으로 구성될 수 있다.
상기 다중 타겟이 외부에서 세포로 도입되는 경우, 상기 다중 타겟은 벡터 시스템을 이용하여 도입될 수 있다.
상기 다중 타겟이 외부에서 세포로 도입되는 경우, 상기 다중 타겟은 타겟마다 다른 벡터를 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 즉, 상기 다중 타겟이 하나의 온 타겟과 하나의 오프-타겟으로 구성된 경우, 상기 벡터는 온 타겟을 포함한 벡터와 오프-타겟을 포함하는 벡터로 구성될 수 있다.
6-1-1 온 타겟
상기 온 타겟은 표적 특이적 유전자 가위가 상보적으로 결합하는 타겟 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 온 타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 상보적인 서열을 가지는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 온 타겟은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
이때, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열은 5 내지 50 bps일 수 있으며, 또한 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열 길이에 따라 그 길이가 조절될 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 온 타겟은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 온 타겟은 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열과 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 온 타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 5'-말단에 위치할 수 있다.
이때, 상기 온 타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 3'-말단에 위치할 수 있다.
상기 온 타겟은 (N)5~50-PAM 또는 PAM-(N)5~50 일 수 있으며, 이때 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다.
이때 상기 온 타겟은 세포 내의 게놈 내에 위치할 수 있다.
이때 상기 온 타겟은 선별 요소를 포함할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
상기 선별 요소를 포함하는 온 타겟이 표적 특이적 유전자 가위에 의해 잘리거나 변형될 때, 상기 선별 요소가 발현되지 않을 수 있다.
6-1-2 오프 타겟
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위가 부분적으로 상보적인 결합을 하는 비타겟 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 오프-타겟은 상기 온 타겟에서 하나이상의 다른 염기 서열을 포함하는 핵산의 서열일 수 있다.
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 부분적으로 상보적인 서열을 가지는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 부분적으로 상보적인 결합을 하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
이때, 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 유전자 또는 핵산의 서열은 5 내지 50 bps일 수 있으며, 또한 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열 길이에 따라 그 길이가 조절될 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열과 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 오프-타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 5'-말단에 위치할 수 있다.
이때, 상기 오프-타겟의 가이드 RNA 또는가이드 RNA의 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 핵산 서열은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열의 3'-말단에 위치할 수 있다.
상기 오프-타겟은 (N)5~50-PAM 또는 PAM-(N)5~50 일 수 있으며, 이때 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다.
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 하나 이상의 비상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 오프-타겟은 표적 특이적 유전자 가위의 표적을 특이적으로 인지하는 부분의 핵산 서열과 100% 미만의 상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 하나이상의 비상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 가이드 서열의 핵산 서열과 100% 미만의 상보적인 결합을 포함하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치일 수 있다.
상기 표적 특이적 유전자 가위가 CRIPSR-Cas 시스템일 경우, 상기 오프-타겟은 CRISPR 효소가 인지하는 PAM 서열 중 하나이상의 미스매치된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
이때 상기 오프-타겟은 세포 내의 게놈 내에 위치할 수 있다.
상기 오프-타겟은 선별 요소를 추가로 포함할 수 있다.
상기 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 또는 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
이때 상기 선별 요소를 포함하는 오프-타겟이 표적 특이적 유전자 가위에 의해 잘리거나 변형될 때, 상기 선별 요소가 발현되지 않을 수 있다.
이때 상기 선별 요소를 포함하는 오프-타겟이 표적 특이적 유전자 가위에 의해 잘리거나 변형되지 않을 때, 상기 선별 요소가 발현될 수 있다.
상기 세포는 표적 특이적 유전자 가위의 타겟에 따라 다양하게 설계된 다중 타겟을 포함할 수 있다.
또한 상기 세포는 다중 타겟 중 일부 타겟만을 포함할 수 있다.
즉, 상기 세포는 다중 타겟 중 온 타겟만 포함하거나 또는 오프-타겟만을 포함할 수 있다.
6-2 생산 방법
상기 세포의 생산 방법은 다중 타겟을 포함하는 벡터 시스템은 세포 내로 도입하는 방법을 이용할 수 있다.
상기 다중 타겟의 세포 내 도입은 바이러스 벡터 시스템, 나노파티클, 리포솜 등을 이용한 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기 천공법(electroporation) 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
또한 상기 다중 타겟의 세포 내 도입은 다중 타겟을 동시에 도입할 수 있다.
즉, 상기 다중 타겟인 온 타겟을 포함하는 벡터와 오프-타겟을 포함하는 벡터를 동시에 세포 내로 도입할 수 있다.
상기 다중 타겟의 세포 내 도입은 다중 타겟을 각각 따로 도입할 수 있다.
즉, 상기 다중 타겟 중 온 타겟을 포함하는 벡터를 먼저 세포 내로 도입한 후 오프-타겟을 포함하는 벡터를 도입할 수 있다. 또는 상기 다중 타겟 중 오프-타겟을 포함하는 벡터를 먼저 세포 내로 도입한 후 온 타겟을 포함하는 벡터를 도입할 수 있다.
또한, 상기 다중 타겟의 세포 내 도입은 다중 타겟 중 일부만 도입할 수 있다.
즉, 상기 다중 타겟 중 온 타겟을 포함하는 벡터만을 세포 내로 도입할 수 있다. 또는 상기 다중 타겟 중 오프-타겟을 포함하는 벡터만을 세포 내로 도입할 수 있다.
본 발명의 시스템이 임의의 유전자 가위 테스군 중에서 높은 특이성과 높은 활성을 가지는, 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다. 또한 본 발명의 시스템을 사용하여 선별된 유전자 가위는 유전자 교정 또는 조작시 오프-타겟 효과는 감소시키고 온 타겟의 효과는 증가시킬 것이다.
발명의 실시를 위한 형태
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 동상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.
실시예 1. E.coli에서의 cas9 변이체(variants) 스크리닝
1-1 대조군 실험
CATCAACATCGAATACATGA NAG(서열번호 1)는 K12 E. coli 게놈 DNA에서 발견되는 반복되는 서열이다. 상기 서열은 NGG와 유사한 NAG의 PAM 서열을 포함하고 있어 CRISPR-CAS9 enzyme에 의해 낮은 효율로 잘린다고 알려져 있다.
상기 서열로부터 20mer의 가이드 서열인 CATCAACATCGAATACATGA(서열번호 2)는 플라스미드 B에서 sgRNA로 사용되었다. sgRNA가 타겟하는 23mer의 타겟 서열인 CATCAACATCGAATACATGA TGG(서열번호 3)는 타겟 사이트로서 plasmid A로 삽입되었다. 이 타겟 서열은 NAG 대신에 높은 절단 효율이 예상되는 NGG를 PAM 사이트로 가지고 있다.
상기 플라스미드 A와 B는 전기천공법을 사용하여 BW25141 E. coli로 함께 도입되었다. 상기 플라스미드 A와 B가 도입된 세포는 앰피실린(Ampicilline)과 카나마이신(Kanamycin) 항생제를 포함하는 LB 배지에서 37℃ 조건하에 배양되었다. 상기 세포 배양을 통해 콜로니를 성장시킨 후, 상기 콜로니를 표준 방법을 이용하여 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포를 만들었다.
양성 대조군으로 WT CAS9를 포함하는 플라스미드 C 또는 음성 대조군으로 공벡터(null vector)를 플라스미드 A와 B를 포함하는 일렉트로컴피턴트 세포에 도입시켰다. SOC 배지에서 1시간 동안 배양한 후, 배양된 세포의 절반은 클로람페니콜(Chloramphenicol)을 포함하는 LB 배지에서 배양하였고, 배양된 세포의 나머지 절반은 클로람페니콜(Chloramphenicol), 카나마이신(Kanamycin), 10mM 아라비노스(arabinose) 및 100ng/ml 무수테트라시클린(anhydrotetracycline, ATC)를 포함하는 LB 배지에서 배양하였다.
그 결과, 상기 플라스미드 C 및 공벡터(null vector)가 각각 도입된 세포 모두, 클로람페니콜이 포함된 LB 배지에서 약 10,000개의 콜로니를 확인할 수 있었고, 반면에 클로람페니콜, 카나마이신, 아라비노스 및 무수테트라시클린이 포함된 LB 배지에서는 콜로니가 발견되지 않았다. 상기와 같은 결과는 아래에 설명하였다.
WT CAS9을 포함하는 플라스미드 C가 도입된 세포에서, 발현된 WT CAS9는 대체된 PAM 서열인 NAG에 대한 잔여 활성(residual activity)을 가지므로 NAG가 포함된 E. coli 게놈 DNA 서열을 절단시켰다. 반면에 아무것도 포함하지 않는 플라스미드 C(즉, 공벡터(null vector))가 도입된 세포에서, 절단 활성이 없으므로 독소(toxin) 유전자를 포함하는 플라스미드 A를 절단하지 못하기 때문에 아라비노스(arabinose)를 포함하는 LB 배지에서 독소(toxin) 유전자의 발현이 유도되어 세포사멸을 나타났다.
또 다른 대조군으로 E. coli 게놈 DNA에 존재하지 않는 서열인 ctagatgagaccggatccggtctccTGG(서열번호 4) 및 ctagatgagaccggatccggtctcc(서열번호 5)를 각각 포함하는 플라스미드 A'와 B'를 양성 대조군으로 사용하였다. WT CAS9을 포함하는 플라스미드 C를 도입한 후, 클로람페니콜만 포함된 LB 배지와 클로람페니콜, 카나마이신, 아라비노스 및 무수테트라시클린이 포함된 LB 배지에서 모두 각각 약 10,000개의 콜로니를 관찰되었다. 이는 WT CAS9이 게놈 DNA를 손상시키지 않으면서 효율적으로 플라스미드 A를 절단한 결과로 사료된다.
1-2 돌연변이
상기의 성공적인 대조군 실험 이후, 낮은 오류율을 갖는 실험방법을 이용하는 Agilent의 Genemorph II 키트를 사용하여 WT CAS9의 서열의 PCR 증폭에 의한 무작위 돌연변이를 도입하였다. PCR 생성물은 이중 절단된 플라스미드 C의 골격(backbone)에 라이게이션(ligation)시켰다. 상기 라이게이션 시켜 생성된 플라스미드는 고효율 일렉트로컴포넌트 세포로 도입시켜 1,000,000 사이즈의 라이브러리를 구축하였다. 상기 무작위 라이브러리는 앞서 만든 플라스미드 A와 B를 포함하는 일렉트로컴포넌트 세포로 도입시켰다.
그 후 앞선 실험과 동일하게 두 가지 배지에서 상기 세포를 배양하였다. 그 결과 클로람페니콜만 포함된 LB 배지에서 약 2,500개의 콜로니가 확인되었고, 반면에 클로람페니콜, 카나마이신, 아라비노스 및 무수테트라시클린이 포함된 LB배지에서는 180개의 콜로니가 나타났다. 각각의 클로니는 클로람페니콜이 포함된 LB 배지에서 배양하여 무작위 돌연변이를 포함하는 플라스미드 C를 발현시켰다. 상기 배양된 콜로니에서 획득한 무작위 돌연변이들의 전체 서열은 일반적인 PAM서열인 NGG에 대한 활성이 가지는 반면, 유사하나 일반적이지 않은 PAM 서열인 NAG에 대해서는 억제된 활성을 보이는 효과적인 돌연변이로 확인되었다.
상기의 실험을 통해 가이드 시퀀스에 대한 특이성을 가지는 cas9 변이체를 발견할 수 있었다. 이때 sgRNA의 서열에 대한 미스매치 서열은 E.coli 내생의(endogenous) 게놈 DNA 서열 또는 외부에서 E.coli로 도입되어 삽입된 인공 서열일 수 있다.
상기와 같은 스크리닝 방법을 이용하여 일반적인 PAM 서열인 NGG에 대한 활성을 가지면서, 반면에 유사하나 일반적이지 않은 PAM 서열인 NAG에 대해서 활성이 감소된 다수의 cas9 변이체를 성공적으로 확인하였다.
실시예 2 : 유전자 가위의 선별
WT EMX1 유전자에서 타겟 위치의 가이드 서열에 대해 하나의 미스매치를 가지는 20mer의 sgRNA는 이전의 연구에서 미스매치가 없는, 즉 완전히 매치되는 sgRNA를 이용하는 경우에 비해 낮은 활성을 가짐을 확인하였다. 상기 WT EMX1 유전자는 포유동물세포의 게놈 DNA에 존재하는 것으로, 상기 포유동물세포의 게놈 DNA에서 WT EMX1 유전자를 포함하는 500mer의 염기서열을 증폭하여 얻어진 PCR 생성물을 표준방법(McKenzie GJ et al., BMC Microbiol. 2006, 6, 39)을 이용하여 E.coli(BW25141)의 게놈 DNA안에 삽입하였다. 그 결과로 얻어진 균주는 BW25141-EMX1로 명명하여 이후 사용하였다.
타겟 서열인 gagtccgagcagaagaagaaggg(서열번호 6)에 대하여 1 또는 2개의 미스매치를 포함하는 20mer의 가이드 서열:
본 발명의 실시예에서,
56: gagtccgagcagaaAGagaa(서열번호 7);
1718: gaACccgagcagaagaagaa(서열번호 8);
7: gagtccgagcagaGgaagaa(서열번호 9);
17: gagCccgagcagaagaagaa(서열번호 10))
은 플라스미드 B에서 sgRNA로 사용되었다. 상기 sgRNA에 대응되는 23mer의 타겟 서열(즉, 56(gagtccgagcagaGgaagaa ggg), 1718(gaACccgagcagaagaagaa ggg), 7(gagtccgagcagaGgaagaa ggg), 17(gagCccgagcagaagaagaa ggg))은 타겟 위치로서 플라스미드 A에 삽입되었다.
상기와 같이 생성된 플라스미드 A와 B는 전기천공법을 이용하여 BW25141-EMX1 E. coli 균주에 함께 도입시켰다. 상기 플라스미드 A와 B가 도입된 세포는 앰피실린(Ampicilline)과 카나마이신(Kanamycin) 항생제가 포함된 LB 배지에서 37℃ 조건하에 배양되었다. 콜로니를 배양한 후 표준 프로토콜을 사용하여 일렉트로컴포넌트 세포를 제작하였다. 상기 세포 배양을 통해 콜로니를 성장시킨 후, 상기 콜로니를 표준 방법을 이용하여 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포를 만들었다.
i) 56 과 1718의 대조군 반응
대조군 반응을 위해, WT CAS9를 포함하는 플라스미드 C 또는 음성 대조군인 공벡터(null vector)를 플라스미드 A 및 B가 포함된 상기 일렉트로컴포넌트 세포로 도입시켰다. 상기 플라스미드 C 또는 공벡터(null vector)가 도입된 세포는 1,000 ng/ml 무수테트라시클린(Anhydrous-tetracycline)이 포함된 SOC 배지에서 1시간 동안 배양한 후, 배양된 세포의 절반은 Chloramphenicol이 포함된 LB 배지에서 배양하였고, 배양된 세포의 나머지 절반은 클로람페니콜, 카나마이신, 10mM 아라비노스 및 1,000 ng/ml 무수테트라시클린가 포함된 LB 배지에서 배양하였다.
E.coli 의 게놈 DNA에 삽입된 EMX-1서열에 대해 2개의 미스매치 서열을 포함하는 플라스미드 B,즉, 56을 포함하는 플라스미드 B와 1718을 포함하는 플라스미드 B에 대한 대조 실험을 수행한 결과는 클로람페니콜과 카나마이신이 포함된 LB 아가 배지(CK)에서의 단위당 콜로니 형성 개수와 클로람페니콜, 카나마이신, 아라비노스 및 1,000 ng/ml 무수테트라시클린가 포함된 LB 아가 배지(CKA-1,000ng/ml ATC)에서의 단위당 콜로니 형성 개수를 비교하여 나타내었다(도 2).
2개의 미스매치가 시드 지역(56-WT-CAS9) 근처에 위치할 때, Cas9이 도입된 E.coli는 0.1%미만으로 살아남았다. 반면에 Cas9 대신에 음성 대조군인 공벡터(null vector)가 도입된 경우, E.coli의 0.01%정도 살아남았다. 상기 음성 대조군의 결과는 플라스미드 A가 작용하지 않음에 따른 효과로 백그라운드로 간주된다.
ii) 7 과 17의 대조군 반응
대조군 반응을 위해, WT CAS9를 포함하는 플라스미드 C 또는 음성 대조군인 공벡터(null vector)를 플라스미드 A 및 B가 포함된 상기 일렉트로컴포넌트 세포로 도입시켰다. 상기 플라스미드 C 또는 공벡터(null vector)가 도입된 세포는 10 ng/ml 무수테트라시클린(Anhydrous-tetracycline)이 포함된 SOC 배지에서 1시간 동안 배양한 후, 배양된 세포의 절반은 Chloramphenicol이 포함된 LB 배지에서 배양하였고, 배양된 세포의 나머지 절반은 클로람페니콜, 카나마이신, 10mM 아라비노스 및 10 ng/ml 무수테트라시클린가 포함된 LB 배지에서 배양하였다.
E.coli 의 게놈 DNA에 삽입된 EMX-1서열에 대해 1개의 미스매치 서열을 포함하는 플라스미드 B,즉, 7을 포함하는 플라스미드 B와 17을 포함하는 플라스미드 B에 대한 대조 실험을 수행한 결과는 클로람페니콜과 카나마이신이 포함된 LB 아가 배지(CK)에서의 단위당 콜로니 형성 개수와 클로람페니콜, 카나마이신, 아라비노스 및 10 ng/ml 무수테트라시클린가 포함된 LB 아가 배지(CKA-10ng/ml ATC)에서의 단위당 콜로니 형성 개수를 비교하여 나타내었다(도 3).
1개의 미스매치가 시드 지역(7-WT-CAS9) 근처에 위치할 때, Cas9이 도입된 E.coli는 0.1%미만으로 살아남았다. 반면에 Cas9 대신에 음성 대조군인 공벡터(null vector)가 도입된 경우, E.coli의 0.01%정도 살아남았다. 상기 음성 대조군의 결과는 플라스미드 A가 작용하지 않음에 따른 효과로 백그라운드로 간주된다.
iii) 56 과 1718의 스크리닝
성공적인 상기의 대조군 실험 후에, 무작위 돌연변이를 세가지 다른 방법에 의해 도입하였다.
1. Agilent 의 Genemorph II 키트를 사용한 WT CAS9 서열의 PCR 증폭
2. Clontech의 Diversify PCR Random Mutagenesis 키트
3. 낮은 오류률을 가지는 표준 실험방법을 이용하여 Agilent의 돌연변이 생성 E.coli 균주(XL1-red)
상기 방법에 의해 얻어진 각각의 PCR 생성물은 이중 절단된 플라스미드 C의 골격(backbone)에 라이게이션(ligation)시켰다. 상기 라이게이션 시켜 생성된 플라스미드는 고효율 일렉트로컴포넌트 세포로 도입시켜 각각 2,000,000 사이즈의 각각의 라이브러리를 구축하였다. 상기 각각의 무작위 라이브러리는 앞서 만든 플라스미드 A(56 포함)와 플라스미드 B(56 포함)를 포함하는 BW25141-EMX1로 만들어진 일렉트로컴포넌트 세포로 도입시켰다.
각각의 무작위 라이브러리가 도입된 세포는 클로람페니콜, 카나마이신 및 아라비노스가 포함된 배지(CKA)에서 배양하여 콜로니를 형성하였고, 상기 형성된 콜로니 수를 새고, 형성된 콜로니를 수집하여 통합 라이브러리를 형성하였다.
상기 획득한 라이브러리는 온도에 민감성을 가지는 오리진(origin)을 포함하는 sgRNA 벡터를 선택적으로 제거하기 위해 클로람페니콜이 포함된 LB 배지에서 42℃ 조건하에 배양하였다. 배양 후, 라이브러리 벡터를 수득하기 위하여 miniprep을 사용하여 정제하였다.
정제를 통해 획득한 라이브러리 벡터는 또 다른 선별을 위해 상기와 동일한 방법으로 플라스미드 A(1718 포함)와 플라스미드 B(1718 포함)를 포함하는 BW25141-EMX1를 이용하여 동일하여 수행하였다.
상기 라이브러리 벡터의 선별은 CKA/CK 콜로니의 비율이 100%에 근접할 때까지 계속 수행되었다.
iv) 셔플링 반응
상기 선택을 통해 얻어진 라이브러리는 추가적인 변형을 포함하는 표준 셔플링 방법을 이용하여 셔플링 반응에 사용하였다. 보통 PCR 생성물이 1kb 보다 클 경우, 셔플링의 효율은 상당히 떨어진다고 알려져 있다. 그러므로 4,300bp의 길이를 가지는 Cas9 벡터는 셔플링 반응이 쉽게 잘 일어나지 않는다.
Cas9 벡터를 5개의 조각(fragment)들로 나누고, 각각의 PCR 조각(fragment)들을 표준방법을 이용하여 셔플링 하였다. 그 다음, 상기 셔플링 혼합물을 함께 넣고 다시 PCR 반응을 수행하였다. 그로 인해 얻어진 PCR 생성물은 Cas9의 5' 말단과 3'말단을 타겟하는 프라이머를 이용하여 증폭하였고, 증폭된 PCR 생성물은 아가로스 겔을 이용한 생성물의 사이즈를 확인함으로써, 셔플링 라이브러리의 생성을 확인하였다.
v) 7, 17의 스크리닝
56 및 1718을 이용한 스크리닝 반응과 유사하게 플라스미드 A(7 또는 17 포함) 및 플라스미드 B(7 또는 17 포함)를 포함하는 EMX1-BW25141을 이용하여 셔플링 라이브러리와 Agilent 와 Clontech 키트를 사용하여 만든 상기 무작위 돌연변이 라이브러리를 반복하여 스크리닝하였다. 상기 스크리닝 반응은 안정된 비율에 도달할 때까지 반복하였다. 그 결과로 얻어진 콜로니는 표준 시퀸싱 방법을 사용하여 분석하였다.
vi) 검증
상기 2가지 방법(1-미스매치(7 또는 17) 스크리닝 및 2-미스매치(56 또는 1718) 스크리닝을 통한 셔플링+1-미스매치(7 또는 17) 스크리닝)으로 동시에 진행하여 얻어진 풀(full) 상태의 library를 이용하여 DMD 유전자와 EMX1 유전자 각각에 대해 on-target과 off-target실험을 수행하였다.
그 결과 2-미스매치(56 또는 1718)로 스크리닝을 시작하였을 때 WT Cas9에 비해 off-target 효과가 더 확연히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6, 7).
상기 스크리닝을 통해 선별된 3개의 클론을 이용해 포유동물세포에서 향상된 특이성을 확인하는 실험을 수행하였다. DMD 유전자와 EMX1 유전자 각각에 대해 on-target과 off-target실험을 수행하였다.
상기 2가지 방법으로 동시에 진행한 스크리닝으로 얻어진 풀상태의 라이브러리를 이용하여 DMD 유전자의 on-target, off-target 활성을 측정한 결과, 2 Mismatch로 screening을 시작하였을 때 WT Cas9에 비해 off-target 활성이 더 확연히 주는 것을 확인할 수 있었다(도 8).
상기 2가지 방법으로 동시에 진행한 스크리닝으로 얻어진 풀상태의 라이브러리를 이용하여 EMX1 유전자의 on-target, off-target 활성을 측정한 결과, 2 Mismatch로 스크리닝을 시작하였을 때 WT Cas9에 비해 off-target 활성이 더 확연히 주는 것을 확인할 수 있다(도 9).
이러한 결과를 통해, 두 유전자에서 모두 WT-spCas9보다 향상된 특이성을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 3 : 포유동물세포 스크리닝
실시예 1 및 2와 같은 실험을 포유동물세포를 이용하여 수행할 수 있다.
HPRT 유전자는 독성유전자 ccdB처럼 사용될 수 있다. HPRT와 미스매치를 가지는 gRNA의 서열은 티미딘 키나아제(Thymidine Kinase)와 시스테인 디아미네이즈(cysteine deaminase)(개시 코돈 이후)의 5'말단과 결합되고, 지오신(zeocin) 또는 퓨로마이신(puromycin)과 같은 선택 마커가 포함된 전체 서열은 표준 방법을 사용하여 HELA 세포와 같은 포유동물세포로 삽입될 수 있으며, 그로 인해 얻어진 세포는 항생제를 이용하여 선별하여 안정한 세포주를 만들 수 있다.
Cas9 변이체를 포함하는 벡터는 트랜스포손(transposon, 이때 유전자전위효소(transposase) 포함하며, 예를 들면 Piggybac, sleepingbeauty 등일 수 있음) 또는 바이러스(렌티(lenti))를 사용하여 표준 방법에 의해 세포주의 게놈 DNA 안에 삽입될 수 있다. HPRT을 타켓하는 sgRNA 벡터는 세포주에 형질도입 될 수 있고, 6 싸이오구아닌(Thioguanine) 및 간사이클로비르(ganciclovir) 또는 5-플로로사이토신(Fluorocytosine)을 이용하여 HPRT와 TK 또는 CD를 각각 선별할 수 있다.
이렇게 선별된 콜로니는 특이성이 향상된 Cas9 변이체를 포함한다. 상기 스크리닝 방법은 TK 또는 CD 없이 사용할 수 있고, 증가된 활성을 갖는 Cas9을 찾기 위해 무시 할 수 있을 만한 활성을 보이는 sgRNA를 사용할 수 있다.
본 발명의 시스템이 임의의 유전자 가위 테스군 중에서 높은 특이성과 높은 활성을 가지는, 표적 특이적 유전자 가위를 선별하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다. 또한 본 발명의 시스템을 사용하여 선별된 유전자 가위는 유전자 교정 또는 조작시 오프-타겟 효과는 감소시키고 온 타겟의 효과는 증가시킬 것이다.
<110> TOOLGEN INCORPORATED <120> A Method for screening target specific Nuclease using multi-target system of on-target and off-target, and the Use thereof <130> OPP17-033-PCT <150> PCT/US 62/350,282 <151> 2016-06-15 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 catcaacatc gaatacatga nag 23 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single guide RNA sequence <400> 2 catcaacatc gaatacatga 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target site sequence <400> 3 catcaacatc gaatacatga tgg 23 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence <400> 4 ctagatgaga ccggatccgg tctcctgg 28 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence <400> 5 ctagatgaga ccggatccgg tctcc 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target site sequence <400> 6 gagtccgagc agaagaagaa ggg 23 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single guide RNA sequence <400> 7 gagtccgagc agaaagagaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single guide RNA sequence <400> 8 gaacccgagc agaagaagaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single guide RNA sequence <400> 9 gagtccgagc agaggaagaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single guide RNA sequence <400> 10 gagcccgagc agaagaagaa 20

Claims (24)

  1. 다음을 포함하는, CRISPR 효소의 특이성 또는 활성을 평가하는 방법:
    1) 적어도 하나의 세포를 준비하는 과정,
    이때, 상기 세포는 제1 플라스미드 및 게놈을 포함하고,
    상기 제1 플라스미드는 제1 핵산 및 상기 제1 핵산과 작동적으로 연결된 제1 선별 요소를 포함하고,
    상기 제1 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 및 루시퍼라아제(luciferase) 중 선택된 것이고,
    상기 게놈은 상기 제1 핵산과 100% 미만의 서열 상동성을 가지는 제 2 핵산을 포함함;
    2) CRISPR 복합체를 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산 각각에 접촉시키는 과정,
    이때, 상기 CRISPR 복합체는 가이드 RNA 및 상기 CRISPR 효소를 포함하고,
    상기 제1 핵산은 상기 CRISPR 복합체의 온 타겟이고,
    상기 제2 핵산은 상기 CRISPR 복합체의 오프 타겟임;
    3) 상기 각 세포에 대해 a) 상기 제2 핵산인 오프 타겟이 절단되어 상기 세포가 사멸되었는지 여부, 및 b) 상기 제1 핵산인 온 타겟이 절단되어 상기 제1 선별 요소가 발현되지 않았는 지 여부를 확인하는 과정; 및
    4) 상기 확인 결과를 기초로 상기 CRISPR 효소의 특이성 또는 활성을 평가하는 과정.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 선별 요소가 독소 유전자이고,
    상기 독소 유전자는 상기 세포의 종류에 따라 선택되고,
    이때, 상기 세포가 대장균(Escherichia coli)인 경우, 상기 독소 유전자는 ccdB이고,
    상기 세포가 포유류 세포인 경우 상기 독소 유전자는 HPRT(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)이고,
    상기 세포가 효모인 경우 상기 독소 유전자는 URA3인 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 CRISPR 효소는 Cas9 또는 Cpf1인 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 CRISPR 효소는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 방법:
    SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9), SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9), StCas9(Streptococcus thermophiles Cas9), NmCas9(Neisseria meningitides Cas9), 및 CjCas9(Campylobacter jejuni Cas9).
  7. 다음을 포함하는, CRISPR 효소의 특이성 또는 활성을 평가하는 방법:
    1) 적어도 하나의 세포를 준비하는 과정,
    이때, 상기 세포는 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드를 포함하고,
    상기 제1 플라스미드는 제1 핵산 및 상기 제1 핵산과 작동적으로 연결된 제1 선별 요소를 포함하고,
    상기 제2 플라스미드는 제2 핵산 및 상기 제2 핵산과 작동적으로 연결된 제2 선별 요소를 포함하고,
    상기 제1 선별요소 및 상기 제2 선별요소는 각각 독립적으로 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 및 루시퍼라아제(luciferase) 중 선택된 것이고,
    상기 제2 핵산은 제1 핵산과 100% 미만의 서열 상동성을 가지며,
    상기 제1 선별 요소 및 제2 선별 요소는 서로 다른 것임;
    2) CRISPR 복합체를 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산 각각에 접촉시키는 과정,
    이때, 상기 CRISPR 복합체는 가이드 RNA 및 상기 CRISPR 효소를 포함하고,
    상기 제1 핵산은 상기 CRISPR 복합체의 온 타겟이고,
    상기 제2 핵산은 상기 CRISPR 복합체의 오프 타겟임;
    3) 각 상기 세포에 대해, a) 상기 제1 핵산인 온 타겟이 절단되어 상기 제1 선별 요소가 발현되지 않았는 지 여부, 및 b) 상기 제2 핵산인 오프 타겟이 절단되어 상기 제2 선별요소가 발현되지 않았는지 여부를 확인하는 과정; 및
    4) 상기 확인 결과를 기초로 상기 CRISPR 효소의 특이성 또는 활성을 평가하는 과정.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서,
    상기 제1 선별 요소가 독소 유전자이고,
    상기 독소 유전자는 상기 세포의 종류에 따라 선택되고,
    이때, 상기 세포가 대장균(Escherichia coli)인 경우, 상기 독소 유전자는 ccdB이고,
    상기 세포가 포유류 세포인 경우 상기 독소 유전자는 HPRT(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)이고,
    상기 세포가 효모인 경우 상기 독소 유전자는 URA3인 방법.
  10. 삭제
  11. 제7항에 있어서,
    상기 CRISPR 효소는 Cas9 또는 Cpf1인 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 CRISPR 효소는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 방법:
    SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9), SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9), StCas9(Streptococcus thermophiles Cas9), NmCas9(Neisseria meningitides Cas9), 및 CjCas9(Campylobacter jejuni Cas9).
  13. 다음을 포함하는, CRISPR 복합체의 특이성 또는 활성을 평가하기 위한 세포:
    제1 플라스미드,
    이때, 상기 제1 플라스미드는 제1 핵산 및 상기 제1 핵산과 작동적으로 연결된 제1 선별 요소를 포함하고,
    상기 제1 선별 요소는 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 및 루시퍼라아제(luciferase) 중 선택된 것임 ; 및
    게놈,
    이때, 상기 게놈은 상기 제1 핵산과 100% 미만의 서열 상동성을 가지는, 인위적으로 삽입된 제2 핵산을 포함함;
    이때, 상기 제1 핵산은 상기 CRISPR 복합체의 온 타겟이고,
    상기 제2 핵산은 상기 CRISPR 복합체의 오프 타겟임.
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서,
    상기 제1 선별 요소가 독소 유전자이고,
    상기 독소 유전자는 상기 세포의 종류에 따라 선택되고,
    이때, 상기 세포가 대장균(Escherichia coli)인 경우, 상기 독소 유전자는 ccdB이고,
    상기 세포가 포유류 세포인 경우 상기 독소 유전자는 HPRT(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)이고,
    상기 세포가 효모인 경우 상기 독소 유전자는 URA3인 세포.
  16. 다음을 포함하는, CRISPR 복합체의 특이성 또는 활성을 평가하기 위한 세포:
    제1 플라스미드,
    이때, 상기 제1 플라스미드는 제1 핵산 및 상기 제1 핵산과 작동적으로 연결된 제1 선별 요소를 포함함; 및
    제2 플라스미드,
    이때, 상기 제2 플라스미드는 제2 핵산 및 상기 제2 핵산과 작동적으로 연결된 제2 선별 요소를 포함하고,
    이때, 상기 제2 핵산은 상기 제1 핵산과 100% 미만의 서열 상동성을 가지고,
    상기 제1 선별요소 및 상기 제2 선별요소는 각각 독립적으로 독소 유전자(toxin gene), 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene), 형광 단백질(fluorescent protein)을 코딩하는 유전자, 태깅 유전자(tagging gene), lacZ 유전자 및 루시퍼라아제(luciferase) 중 선택된 것이고,
    상기 제2 선별 요소는 상기 제1 선별 요소와는 다른 것임,
    이때, 상기 제1 핵산은 상기 CRISPR 복합체의 온 타겟이고,
    상기 제2 핵산은 상기 CRISPR 복합체의 오프 타겟임.
  17. 삭제
  18. 제16항에 있어서,
    상기 제1 선별 요소는 독소 유전자로, 상기 세포의 종류에 따라 선택되는데,
    이때, 상기 세포가 대장균(Escherichia coli)인 경우, 상기 독소 유전자는 ccdB이고,
    상기 세포가 포유류 세포인 경우 상기 독소 유전자는 HPRT(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)이고,
    상기 세포가 효모인 경우 상기 독소 유전자는 URA3인 세포.
  19. 제13항 또는 제16항의 세포를 포함하는, CRISPR 효소의 특이성 또는 활성을 평가하기 위한 키트.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
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