CN109295054A

CN109295054A - 用于靶向病原体基因RNA的gRNA及基于C2c2的病原体基因的检测方法、检测试剂盒

Info

Publication number: CN109295054A
Application number: CN201810874297.2A
Authority: CN
Inventors: 陈侃; 罗镇华
Original assignee: Guangzhou Universal Lihua Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Universal Lihua Technology Co Ltd
Priority date: 2017-07-25
Filing date: 2018-07-25
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2038-07-25
Also published as: CN109295054B

Abstract

本发明提供了一种用于靶向病原体基因RNA的gRNA，本发明还提供了一种基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)‑C2c2系统的人病原体基因检测方法、检测试剂盒。本发明提供了检测方法，综合了gRNA靶向识别病原体基因转录产物RNA(靶标RNA序列)的优势以及当CRISPR‑C2c2复合物检测到靶标RNA序列时，复合物会切割带有检测标记的报告RNA，释放可检测信号的特点，将CRISPR‑C2c2系统应用在病原体基因检测中，灵敏度高、准确度高，是一种具有巨大商业应用价值的检测方法及检测试剂盒。

Description

用于靶向病原体基因RNA的gRNA及基于C2c2的病原体基因的检测方法、检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测及基因修饰领域，涉及一种用于特异性靶向病原体基因RNA的gRNA，及一种基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)系统的病原体基因检测方法、检测试剂盒；特别涉及一种用于特异性靶向病原体抗性基因和/或特异基因RNA的gRNA，及一种基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)系统的病原体抗性基因和/或特异基因检测方法、检测试剂盒。

背景技术

规律成簇间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas)是古菌和细菌的抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的获得性免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA或RNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。

CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能；第二大类是由单个效应蛋白(如Cas9,Cpf1,C2c1等)来发挥功能。其中，Cas9,Cpf1,C2c1均具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性。目前，Cas9和Cpf1蛋白作为基因组编辑工具被广泛应用，克服了传统基因编辑技术步骤繁琐、耗时长、效率低等缺点，以其较少的成分、便捷的操作以及较高的效率满足了大多数领域的基因编辑需求，并有着潜在且巨大的临床应用价值。

在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR-Cas9是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strand breaks,DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接 (Non-homologous end joining,NHEJ),造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除。CRISPR/Cas9 是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。

CRISPR/Cas是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA(guide RNA， gRNA)和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA将被看作病毒或外源DNA，被精确剪切。但是， CRISPR/Cas9的应用也有一些限制条件。首先，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列(NGG)。其次，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。如果在基因的上下游各设计一条向导RNA(向导 RNA1，向导RNA2)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。而生物体自身存在着 DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒(供体DNA分子)，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变。对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。随着研究的深入，CRISPR/Cas技术已经被广泛的应用。除了基因敲除，基因替换等基础编辑方式，它还可以被用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗。

Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA——gRNA(CRISPR RNA)和 tragRNA(trans-activating gRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称gRNA(guide RNA)。因此，gRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9 能否特异性敲除目标基因的先决条件，无论是脱靶还是错误靶向，都会影响CRISPR-Cas9对目标基因的特异性敲除。因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的gRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术。

2015年，一种全新的第二类CRISPR-Cas系统-Ⅵ型系统被发现，该系统中的效应蛋白被命名为C2c2。张锋团队于2015年11月5日在《Mol Cell》发表的一篇题为“Discoveryand Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems”的文章。根据文章可知，这个系统的突破性意义就在于它可以对靶 RNA进行编辑，而不是传统的DNA的编辑。该系统基本的工作流程与CRISPR/Cas9类似，还是借助CRISPR 序列的“黑名单”系统对入侵者进行打击。但是gRNA形成的方式与CRISPR/Cas9系统不同：C2c2蛋白会与成熟的gRNA复合，在不借助tragRNA的情况下与外源单链RNA结合，gRNA则会与PFS片段(类似PAM)附近的互补区域杂交。最后，外源单链RNA会被剪切，其基因表达也会被沉默。然而，在切割靶RNA的同时，激活了的C2c2还会降解靶RNA邻近的RNA,称之为“附属切割”。这种只靶向作用于 RNA并协助执行基因组指令的能力能够让人们特异性地和高通量地操纵或标记RNA，以及更加广泛地操纵基因功能。而后的研究进一步发现，Ⅵ型CRISPR-Cas系统是一种新型靶向RNA的CRISPR系统，而 C2c2是一种以RNA为导向靶向和降解RNA的核酸内切酶，有望被开发作为RNA研究的工具，扩展CRISPR 系统在基因编辑方面的运用。

2016年10月13日，Doudna团队在《Nature》发表的一篇题为“Two distinct RNaseactivities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”的论文以及2017年1月12日在Cell杂志发表de中科院生物物理研究所王艳丽课题组的标题为“Two Distant Catalytic Sites Are Responsible for C2c2 RNase Activities”的研究都表明gRNAhC2c2通过两个独立的活性结构域来发挥其两种不同的RNA酶切活性，这为研究C2c2发挥RNA酶活性的分子机制提供了重要的结构生物学基础。

王艳丽课题组通过深入的研究，解析了C2c2与gRNA的二元复合物的晶体结构以及C2c2蛋白的晶体结构，揭示了C2c2包含一个gRNA识别的结构域即REC结构域，和一个核酸酶结构域即NUC结构域。 REC结构域包含N端结构域(N-terminal domain)和Helical-1结构域，NUC结构域包含了两个HEPN结构域、Helical-2结构域以及连接两个HEPN结构域的连接结构域。负责切割前体gRNA和靶标RNA的活性区分别位于Helical-1和HEPN结构域上。gRNA的结合会引起C2c2蛋白的构象变化，这种变化很可能会稳定gRNA的结合，进而对激活C2c2切割靶RNA的活性，降解靶RNA及靠近靶RNA的其他RNA。以上研究通过结构和生化研究揭示了C2c2剪切pre-gRNA以及切割靶标RNA的分子机制，对认识细菌抵抗RNA病毒入侵的分子基础具有十分重要的意义。同时也为改造CRISPR-C2c2系统，为其在基因编辑领域的运用提供了强有力的结构基础，有助于加速对病毒感染引发的疾病的理解、治疗和预防。另外，Doudna 教授的研究还发现，可以利用C2c2的此种“附属切割”的效应集合报告RNA来检测靶RNA的存在与否。

2017年4月13日，Science杂志发表一项题为“Nucleic acid detection withCRISPR-Cas13a(即C2c2)”的重要研究进展。来自Broad研究所、McGovern研究所等机构的一个科学家小组改造了靶向RNA的 CRISPR系统，使其成为了快速、便宜且高度灵敏的诊断工具。这一发现有望为科学研究以及全球公共卫生带来变革性的影响。CRISPR先驱张锋以及Broad研究所的James J.Collins是该研究的共同通讯作者。 Broad研究院的研究人员指出，利用一种新CRISPR技术：CRISPR-Cas13a/C2c2，可以高灵敏度检测包括寨卡病毒感染，登革热病毒感染等在内的疾病，其原理在于将CRISPR-Cas13a与等温核酸扩增结合，检测特异性的RNA和DNA。

研究人员指出Cas13a有独特的性质，Cas13a与DNA靶向CRISPR酶(如Cas9和Cpf1)不同，这种酶在切割其靶向RNA后可保持活性，而且可能表现出混杂行为(promiscuousbehavior)，继续切割其它非靶向RNA，这被张锋实验室称为“附属切割”(collateralcleavage，生物通译)。这种活性是新开发的核酸检测平台SHERLOCK(Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)的关键特征，此外， SHERLOCK还包含有一个切割时发出荧光的报告RNA。当Cas13a检测到靶标RNA序列时，其RNase活性就会切割报告RNA，释放可检测的荧光信号。“我们知道Cas13a具有灵敏的附属活性，但最初我们分析其特征时，发现其灵敏度还不够，”张锋实验室另外一位研究生：Jonathan Gootenberg说。为了解决这个问题，该小组与James Collins合作，采用了Collin研究组之前研发的纸质寨卡病毒检测技术。将这两种技术结合起来的新系统能够以极低浓度检测单RNA和单DNA分子。

病原菌中的多重抗生素抗性的出现和传播是全球性的健康危机。比如，β-内酰胺抗生素是用于治疗细菌感染的最成功的药物之一并且占据了全球抗生素市场总额的大约65％。在1940年公开了观察β-内酰胺酶的首篇报告之后，也就是引入首个商用抗生素(青霉素)的前一年，超过1,200个不同的β-内酰胺酶(bla) 基因已经在临床菌株中得到鉴别，显示了bla基因由于其连续突变所致的显著多样性。

为实现病原体的早期检测并使耐药菌传播减至最小，开发低成本、准确、高效、快速地检测抗性基因及病原体相关特异基因的诊断方法非常重要。使用经典的基于培养的表型试验测定易感性或抗性是临床微生物实验室中使用的一般方法，但由于酶表达的可变水平以及一些抗生素组合的不良特异性，传统的检测方法耗时并且准确性不高。基于分子的诊断方法可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对医院和社区环境中的感染控制、预防、治疗很有意义。

申请人研究发现，目前还未有基于CRISPR-C2c2系统的病原体基因检测方法的相关报道。正如设计、制备出精确、特异性靶向目标基因的gRNA是CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术，高效、特异性靶向目标病原体基因基因的gRNA也是CRISPR-C2c2识别靶基因的关键，并进一步使得基于CRISPR-C2c2系统的病原体基因基因的编辑、修饰、检测成为可能。

因此，拟申请一种基于CRISPR-C2c2系统的病原体基因检测方法、检测试剂盒及用于特异性靶向病原体基因RNA的gRNA。

在本文中提及或通过引用结合在本文中的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，通过引用并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于特异性靶向病原体基因RNA的gRNA及基于CRISPR-C2c2 系统的病原体基因检测方法、检测试剂盒。

若无特殊说明，本发明所述的技术方案优选采用CRISPR-C2c2系统。

本发明第一方面提供了一种特异性识别靶核苷酸的gRNA序列，所述的靶核苷酸为病原体基因对应的 RNA序列，所述gRNA对应的编码DNA序列包括表2中SEQ ID NO.85-SEQID NO.844所示核苷酸序列中的一条或多条。

本发明一实施例中，所述病原体基因为病原体抗性基因和/或病原体特异基因。

本发明一实施例中，所述病原体基因包括表1中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.84所示核苷酸序列的一条或多条。

本发明一实施例中，所述“病原体基因对应的RNA序列”为病原体基因对应的转录物。

本发明实施方式中，术语“gRNA对应的编码DNA序列”经过转录后即获得本发明第一方面所述gRNA 序列，具体地，可采用将gRNA对应的编码DNA序列克隆到包含T7启动子的载体中，或通过PCR、退火、合成等方式直接在gRNA对应的编码DNA的前端加上T7启动子，经转录可获得转录产物gRNA序列。

值得注意的是，本申请人针对表1中SEQ ID NO.1-84所示的每一条病原体基因均设计了多条gRNA，每条gRNA均可独立地、特异性识别该行对应的病原体基因。

例如，所述病原体基因为intI1，gRNA对应的编码DNA序列包括表2中SEQ IDNO.85-SEQ ID NO.94所示核苷酸序列中的一条或多条。所述病原体基因为intI2，gRNA对应的编码DNA序列包括表2中SEQ ID NO95-SEQ ID NO.104所示核苷酸序列中的一条或多条。以此类推，本领域技术人员可以理解的是，表1中SEQ ID NO.1-84所示的每一条病原体基因均分别对应表2中的一条或多条gRNA。申请人不一一说明。

本发明一实施例中，gRNA可通过完全互补或基本互补、或以一定互补百分比特异性识别所述靶核苷酸序列。

本发明所提供的gRNA与所述靶核苷酸序列具有足够互补性以便与该靶核苷酸序列杂交并且指导 CRISPR-C2c2与该靶核苷酸序列的特异性结合。在一些实施例中，gRNA与其相应的靶核苷酸序列之间的互补程度是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。

本发明实施例中，“互补”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克碱基配对或其他非传统类型形成一个或多个氢键。“互补百分比”表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、 80％、90％、和100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度。

本发明一实施方式中，所述gRNA是靶向序列与gRNA骨架序列连接组成成熟的gRNA序列。

本发明一实施方式中，所述靶向序列对应的编码DNA序列为如表2中SEQ IDNO.85-SEQ ID NO.844 所示核苷酸序列中的一条或多条。

常见的gRNA骨架序列包括但不限于：

5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC。

在不借助tracrRNA的情况下，C2c2蛋白(即Cas13a)会与gRNA复合，形成Cas13a-gRNA复合物，当Cas13a-gRNA复合物检测到靶核苷酸(本发明记为第一目标核酸)时，其RNase活性就会断裂、切割或标记靶核苷酸和报告RNA(本发明记为第二目标核酸，所述报告RNA为本发明后续第二方面、第三方面及第四方面中所述的“与靶核苷酸相关的序列”的具体实施方式的一种)；其中，第一目标核酸带有PFS片段 (类似PAM)，可以被Cas13a-gRNA复合体中的gRNA特异性识别。

本发明一实施方式中，被第二目标核酸可为带荧光标记的报告RNA链，报告RNA链在被剪切后，会发出荧光，因此，通过检测荧光可检测、判断第一目标核苷酸。

本发明一实施方式中，Cas13a-gRNA复合体对第一目标核酸的识别是特异性的。

本发明一实施方式中，Cas13a-gRNA复合体对第二目标核酸的切割是非特异性的。

本发明实施方式中，所述“Cas13a-gRNA复合体/物”、“CRISPR-Cas13a复合体/物”、“CRISPR-C2c2 复合体/物”概念可以互换。

在本发明实施方式中，术语“靶核苷酸”、“第一目标核酸”、“第二目标核酸”是指核糖核苷酸或其类似物。以下是“靶核苷酸”、“第一目标核酸”或“第二目标核酸”的非限制性实例：信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、ssRNA、或任何分离的RNA(具体地，包括单链RNA或带单链RNA的双链RNA)。“靶核苷酸”、“第一目标核酸”、“第二目标核酸”可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸可以通过分子标记(如荧光标记，或其他可检测的分子标记)来进一步修饰。

在本发明实施方式中，术语“靶核苷酸”和“靶多核苷酸”可以互换。

本发明第二方面提供了一种CRISPR-C2c2系统，包括：

1)C2c2效应蛋白；

2)一种或多种核酸，其中，所述一种或多种核酸包含至少一种如第一方面所述的gRNA序列；

所述C2c2蛋白与gRNA结合形成CRISPR-C2c2复合物，并且当所述CRISPR-C2c2复合物与第一方面所述的靶核苷酸结合时，所述CRISPR-C2c2复合物对所述靶核苷酸和/或与靶核苷酸相关的序列进行修饰。

在本发明优选实施方式中，所述的修饰是引入断裂、切割或标记。

本发明第二方面一实施例中，所述靶核苷酸包括第一方面所述的靶核苷酸(靶RNA)和/或报告RNA。

本发明第三方面提供了一种非天然存在的或工程化的组合物，所述组合物包含一个或多个载体，该一个或多个载体包含组分I和组分II：

所述组分I包括第一调节元件，以及与所述第一调节元件可操作地连接的编码C2c2蛋白的编码序列；所述组分II包括第二调节元件，以及与所述第二调节元件可操作地连接的编码gRNA的编码序列，其中，所述gRNA包含如第一方面所述的gRNA序列；

其中，组分I和II位于相同或不同载体上；

本发明第三方面一实施例中，所述靶核苷酸包括第一方面所述的靶核苷酸(靶RNA)和/或报告RNA。

在本发明实施方式中，术语“载体”是指一种核酸分子，它能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的) 的核酸分子；包括DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。可选地，一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链 DNA环。可选地，另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。在重组DNA技术中使用的普通表达栽体通常是质粒形式。

通常，在载体内，“可操作地连接”旨在表示核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至一个或多个调节元件(可选地，载体处于一种体外转录/翻译系统中可以表达该核苷酸序列；可选地，当该载体被引入到宿主细胞中时可以表达该核苷酸序列)。

在本发明实施方式中，术语“表达”是指从DNA模板转录成多核苷酸(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。

本文使用的术语“非天然存在的”或“工程化的”可互换地使用，当指核酸分子或多肽时，表示该核酸分子或多肽至少基本上从它们在自然界中或如发现于自然界中的与其结合的至少另一种组分游离出来。

在本发明优选实施方式中，所述的第一调节元件包括一个或多个pol III启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol III启动子)、一个或多个pol II启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol II启动子)、一个或多个pol I启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol I启动子)、或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于 U6和H1启动子。pol II启动子的实例包括但不限于逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV 增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见，例如，波沙特(Boshart)等人，《细胞》 (Cell)41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK) 启动子、和EF1α启动子。

在本发明一些实施方式中，编码C2c2蛋白的编码序列经密码子优化，以便在特定的细胞如真核细胞中表达。这些真核细胞可以是特定生物的那些或来源于特定生物，如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、或非人类灵长动物。一般而言，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰一个核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于具有特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于(除其他之外) 被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，中村Y.(Nakamura Y.)等人，“从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用： 2000年的状态”(Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:statusfor the year 2000) 《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)28：292(2000年)。用于密码子优化特定的数列以便在特定的宿主细胞中表达的计算机算法也是可得的，如基因制造(GeneForge)(Aptagen公司；雅各布斯(Jacobus)，PA)，也是可得的。在一些实施例中，在编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、 20、25、50个、或更多个、或所有密码子)相应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。

在本发明实施方式中，术语“C2c2”、“C2c2蛋白”、“C2c2效应蛋白”、“Cas13a”、“Cas13a蛋白”、“Cas13a效应蛋白”可以互换；C2c2蛋白是一个RNA-靶向的RNase，切割ssRNA(单链小分子RNA)。现有文献公开的C2c2蛋白同样适用本发明实施例，所述现有文献包括但不限于：

1、Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2CRISPR-Cas Systems，Nature，2016 Oct 13；

2、C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targetingCRISPR effector，Science，2016 Aug 5；

3、Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNAprocessing and RNA detection， Nature，2016 Oct 13；

4、Two Distant Catalytic Sites Are Responsible for C2c2 RNaseActivities，Cell，2017 Jan 12。

在本发明一实施方式中，C2c2蛋白为源自Leptotrichia wadei F0279或Leptotrichia shahii的Cas13a蛋白基因，即分别为LwCas13a、LshCas13a。

在本发明一实施方式中，C2c2蛋白包括C2c2蛋白的同系物或其修饰形式。

在本发明一实施方式中，所述组分I还包括任何其他蛋白质或多肽结构域的编码序列，以及任选地在任何两个结构域之间的连接序列，所述连接序列具体地，可编码如C2c2蛋白与任何其他蛋白质或多肽结构域的连接肽段，并获得融合蛋白。可以融合到C2c2蛋白上的蛋白质结构域的实例包括但不限于表位标签、报告基因序列、以及具有下列活性的一者或多者的蛋白质结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感病毒血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G 标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括，但不限于，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白 (GFP)、HcRed、DsRed、青荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、以包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白。

C2c2蛋白还可以融合一种蛋白质或蛋白质片段，所述蛋白质或蛋白质片段结合DNA分子或结合其他细胞分子，其包括，但不限于，麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-tag、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合物、 GAL4DNA结合结构域融合物、以及单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合物。在本发明一些实施例中，所述融合蛋白质为分子标记，使用标记的C2c2蛋白可用来鉴定靶序列的位置。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用，是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物；这些修饰例如二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他修饰，如与检测分子标记组分的结合。

在本发明优选实施方式中，所述的第二调节元件为T7启动子。

在本发明优选实施方式中，所述的第一或二调节元件还包括增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。这样的调节序列例如描述于戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》 (GENEEXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(1990)中。调节元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。调节元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。

本发明第四方面提供了一种修饰与第一方面所述的靶核苷酸相关的序列的方法，所述方法包括递送包含1)及2)的组合物，使包含1)及2)的组合物与所述靶核苷酸及所述与靶核苷酸相关的序列接近:

1)C2c2效应蛋白；

本发明第四方面一实施例中，所述靶核苷酸包括第一方面所述的靶核苷酸(靶RNA)和/或报告RNA。

在本发明一实施方式中，组分I进一步包括可操作地连接到该第一调节元件的两个或更多个编码 gRNA的编码序列，当表达时，该两个或更多个gRNA中的每一个引导CRISPR-C2c2复合物与不同靶核苷酸序列特异性结合(该结合反应可发生在在宿主细胞中、体外转录/翻译系统中或其他本领域技术人员根据具体实验需求配置的反应溶液)。

在本发明实施方式中，术语“使包含1)及2)的组合物与所述靶核苷酸及所述与报告RNA接近”是指将组分递送到离体(in vitro)或体内(in vivo)环境中，离体环境如本领域技术人员根据具体实验需求配置的反应溶液,体内环境比如细胞内；所述的术语“接近”是指在离体(in vitro)或体内(in vivo)环境中，各组分可以与所述靶核苷酸及所述与报告RNA的序列接触，并在一定的条件下发生本领域技术人员可以预料的反应。

在本发明实施方式中，本发明提供了以下方法，包括向宿主细胞递送一个或多个多核苷酸、一个或多个载体、一个或多个转录本、和/或一个或多个转录的蛋白。在一些方面，本发明进一步提供了通过这样的方法产生的细胞以及包括这样的细胞或由这样的细胞产生的生物体(例如动物、植物、或真菌)。

在本发明实施方式中，将与gRNA组合的CRISPR-C2c2复合物递送至细胞。可以使用常规的病毒和非病毒基的基因转移方法将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。

可以使用这样的方法向培养物中或宿主生物中的细胞给予编码CRISPR-C2c2系统的组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如在此描述的载体的转录本)、裸核酸以及与递送赋形剂(如脂质体) 复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，在被递送至细胞后它们具有游离型或整合型基因组。关于基因递送系统的综述，参见安德(Anderson)，《科学》(Science)256:808-813(1992)；纳贝尔(Nabel)& 费尔格纳(Felgner)，TIBTECH 11:211-217(1993)；三谷(Mitani)&卡斯基(Caskey)，TIBTECH 11:162-166(1993)；狄龙(Dillon)，TIBTECH 11:167-175(1993)；米勒(Miller)，《自然》 (Nature)357:455-460(1992)；范·布朗特(Van Brunt)，《生物技术》(Biotechnology)6(10):1149-1154(1988)；维涅(Vigne)，《恢复神经学和神经科学》(Restorative Neurology andNeurosciece)8:35-36(1995)；克雷默 (Kremer)&佩里科德特(Perricaudet)，《英国医学公报》(British Medical Bulletin)51(1):31-44(1995)；哈嗒嗒(Haddada)等人，在《微生物学和免疫学当前主题》(Current Topics in Microbiologyand Immunology) 中多尔夫勒(Doerfler)和博姆(编辑)(1995)；以及余(Yu)等人，《基因疗法》(Gene Therapy)1:13-26(1994)。

核酸的非病毒递送方法包括脂转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸共轭物、裸DNA、人工病毒体以及DNA的试剂增强性摄取。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355中并且脂转染试剂是市售的(例如，TransfectamTM和 LipofectinTM)。适于多核苷酸的有效的受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner(费尔格纳)，WO 91/17424；WO 91/16024的那些。递送可以针对细胞(例如体外或离体给予)或靶组织(例如体内给予)。

脂质:核酸复合物(包括靶向的脂质体，如免疫脂质复合物)的制备是本领域的技术人员熟知的(参见例如，克丽丝特尔(Crystal)，《科学》(Science)270:404-410(1995)；布莱泽(Blaese)等人，《癌症基因疗法》 (Cancer Gene Ther.)2:291-297(1995)；贝尔(Behr)等人，《生物共轭化学》(Bioconjugate Chem.)5:382-389(1994)；雷米(Remy)等人，《生物共轭化学》5:647-654(1994)；高(Gao)等人，《基因疗法》(Gene Therapy)2:710-722(1995)；艾哈迈德(Ahmad)等人，《癌症研究》(Cancer Res.)52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、 4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。

本发明第五方面提供了一种真核宿主细胞，包含组分I和/或组分II：

所述组分I包括第一调节元件，以及与所述第一调节元件可操作地连接的编码C2c2蛋白的编码序列；所述组分II包括第二调节元件，以及与所述第二调节元件可操作地连接的编码gRNA的编码序列，其中，所述gRNA包含第一方面所述的gRNA序列；

其中，组分I和II位于相同或不同载体上；

本发明第五方面一实施例中，所述靶核苷酸包括第一方面所述的靶核苷酸(靶RNA)和/或报告RNA。

在本发明一实施方式中，所述真核宿主细胞，包含组分I和组分II。

在本发明一实施方式中，组分I进一步包括可操作地连接到该第一调节元件的两个或更多个编码 gRNA的编码序列，当表达时，该两个或更多个gRNA中的每一个引导CRISPR-C2c2复合物在真核宿主细胞中与不同靶核苷酸序列特异性结合。

本发明第六方面提供了一种检测试剂盒，包含第一方面提供的gRNA序列、第二方面提供的 CRISPR-C2c2系统、第三方面提供的非天然存在的或工程化的组合物、第五方面提供的真核宿主细胞中的一种或多种。

本发明一实施方式中，所述试剂盒还包括常规配套的反应试剂和/或反应设备。例如，试剂盒可以提供一种或多种反应或存储缓冲液。可以按在具体测定中可用的形式或按在使用之前需要添加一种或多种其他组分的形式(例如按浓缩或冻干形式)提供试剂。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。在一些实施例中，该缓冲液是碱性的。在一些实施例中，该缓冲液具有从约7至约10的pH。在一些实施例中，该试剂盒包括一个或多个寡核苷酸，该一种或多种核酸包含至少一种gRNA，所述gRNA包含如第一方面所述的gRNA序列。

本发明所述试剂盒中的各组分可以单独地或组合地提供，并且可以被提供于任何适合的容器中，如小瓶、瓶子、管或纸板。

本发明第七方面提供了一种基于CRISPR-C2c2系统的病原体基因的检测方法，包含：

1)制备或提供待测样品，其中，所述待测样品包括DNA和/或RNA；

2)提供包含a)、b)、及c)的组合物，组分a)包括C2c2效应蛋白；组分b)包括一种或多种核酸，其中，所述一种或多种核酸包含至少一种gRNA，所述gRNA包含第一方面所述的gRNA序列；组分c)包括修饰有分子检测标记的报告RNA；

3)反应体系中，使包含a)b)c)的组合物与所述待测样品接触，所述C2c2蛋白与gRNA结合形成CRISPR-C2c2复合物，所述CRISPR-C2c2复合物与所述的靶核苷酸结合，并对所述修饰有分子检测标记的报告RNA进行剪切，产生可被检测的分子检测标记；

4)检测所述分子检测标记，获得检测结果。

本发明一实施方式中，所述靶核苷酸为连接有T7启动子的DNA片段经T7聚合酶转录获得的RNA。

可选地，所述DNA片段经提取或纯化获得，并修饰有T7启动子。可选地，所述提取或纯化的DNA片段经过PCR扩增、NASBA等温扩增或重组酶聚合酶RPA扩增处理，并修饰有T7启动子。

本发明一实施方式中，所述反应体系包括Cas13a检测体系。在本发明一具体实施例中，所述的Cas13a 检测体系包括：45nM纯化的LwCas13a，22.5nM gRNA，125nM在LwCas13a切割时可发出荧光的报告RNA 链(RNAse Alert v2,Thermo Scientific)，2μL小鼠源RNase抑制剂(New England Biolabs)，100ng总人源RNA(纯化自HEK293FT培养基)，不同数量的靶核酸，及核酸酶检测缓冲液(40mM Tris-HCl,60mM NaCl,6mM MgCl 2,pH 7.3)。

本发明一实施方式中，所述反应体系包括RPA-DNA扩增体系、T7聚合酶将DNA转录为RNA反应体系和Cas13a检测体系。在本发明一具体实施例中，所述的反应体系(50μL体系)包括：0.48μM正向引物， 0.48μM反向引物，1x RPA补液缓冲液，不同量的DNA，45nMLwCas13a重组蛋白，22.5nM gRNA，250ng 总人RNA，200nM RNA报告子(RNase alert v2)，4μL鼠源RNase抑制剂(New England Biolabs)，2mM ATP， 2mM GTP，2mM UTP，2mM CTP，1μLT7聚合酶混合物(New England Biolabs)，5mMMgCl₂和14mM MgAc。

本发明第八方面提供了一种基于CRISPR-C2c2系统的病原体基因的检测试剂盒，包括第一方面提供的 gRNA序列、第二方面提供的CRISPR-C2c2系统、第三方面提供的非天然存在的或工程化的组合物、第五方面提供的真核宿主细胞中的一种或多种。

本发明一实施方式中，所述第八方面提供了的试剂盒还包括：PCR扩增、NASBA等温扩增或重组酶聚合酶RPA、环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)中的一种或多种试剂。

本发明一实施方式中，所述第八方面提供了的试剂盒还包括T7聚合酶。

本发明第九方面提供了一种如第一方面所述gRNA序列的应用，包括：

(i)与C2c2形成复合物，结合分子标记技术，如荧光标记技术，显现与所述gRNA序列特异性结合的目标RNA在胞内的运输和/或定位；

(ii)与C2c2形成复合物，捕获特异性转录物，所述特异性转录物与所述gRNA序列特异性结合(通过dC2c2的直接下拉或使用dC2c2将生物素连接酶活性定位到特定转录物)。

附图说明

图1-图9为本发明实施例提供的SEQ ID NO.1-874所示各gRNA序列靶向目标基因的荧光检测结果。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

若无特别说明，本发明实施例中所用试剂及耗材均为市售商品。

除非另有说明，本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch) 和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛 (Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

本发明一具体实施方式中，本发明实施例提供了一种用于靶向病原体基因RNA的gRNA。本发明实施例还提供了一种基于C2c2的病原体基因的检测方法、检测试剂盒，并将2017年4月13日，Science杂志发表一项题为“Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a”文章(后续称为“文献1”)公开的实验方法中的一个或多个步骤通过引用并入本实施方式。包括但不限于如下步骤的一个或多个步骤：

一、Cas13a(即C2c2)基因克隆及蛋白表达

采用源自Leptotrichia wadei F0279和Leptotrichia shahii的Cas13a蛋白基因，经过密码子优化，使基因更适合在哺乳动物细胞中表达。优化后的Cas13a蛋白基因克隆入pACYC184骨架(该骨架包括由J23119启动子驱动表达的间隔序列，所述间隔序列为β-内酰胺酶靶向或非靶向间隔区)。

经过密码子优化的Cas13a蛋白基因克隆到原核表达质粒载体，所述原核表达质粒载体可采用带6-His 组氨酸标签的pET质粒，方便蛋白纯化表达。表达菌采用Rosetta2(DE3)。

本发明实施例所采用质粒包括：

pC004质粒图谱：https://benchling.com/s/lPJ1cCwR(即带β-内酰胺酶扫描位点的pACYC184)

pC009质粒图谱：https://benchling.com/s/seq-ylkMuglYmiG4A3VhShZg(LshCas13a基因插入带β-内酰胺酶扫描位点的pACYC184质粒)

pC010质粒图谱：https://benchling.com/s/seq-2WApFr3zni1GOACyQY8a(LshCas13a基因插入不带β- 内酰胺酶扫描位点的pACYC184质粒)

pC011质粒图谱：https://benchling.com/s/seq-2WApFr3zni1GOACyQY8a(LwCas13a基因插入带β-内酰胺酶扫描位点的pACYC184质粒)

pC012质粒图谱：https://benchling.com/s/seq-2WApFr3zni1GOACyQY8a(LwCas13a基因插入不带β- 内酰胺酶扫描位点的pACYC184质粒)

pC013质粒图谱：https://benchling.com/s/seq-2WApFr3zni1GOACyQY8a(LwCas13a基因插入带 Twin-Strep标签的pACYC184质粒)

将Cas13a蛋白重组表达载体转化后，进行蛋白表达、SDS-PAGE检测以及凝胶柱纯化，获得的纯化后的Cas13a蛋白放-80℃保存。

二、靶RNA的制备gRNA制备靶核苷酸：

提取

靶核苷酸经过PCR扩增、重组酶聚合酶扩增(RPA)，NASBA等温扩增或、环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)方式扩增靶DNA。胶分离以及纯化(采用MinElute gel extraction kit(Qiagen)试剂盒)，纯化后的dsDNA与T7聚合酶30℃孵育过夜(采用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesiskit(New England Biolabs)试剂盒)，然后用MEGAclear Transcription Clean-up kit(Thermo Fisher)试剂盒纯化RNA，从而获得靶核RNA。

NASBA等温扩增

4℃下，配置扩增体系如下:

上述混合体系在65℃条件下放置2min；然后41℃下，2分钟；

上述混合体系中再加入5ul酶混合物(Life Sciences,NEC-1-24)，获得20μL总反应体系。65℃条件下反应2小时。

重组酶聚合酶扩增RPA(Recombinase Polymerase Amplification)

采用NCBI Primer blast设计RPA引物，扩增片段大小为80-180nt，引物的变性温度可为54-67℃、 Opt＝60，长度为30-35nt、Opt＝32，引物中GC含量为40-60％，根据设计序列合成DNA引物。

分别参考Basic和BasicRT(TwistDx)试剂盒进行RPA反应，不同的是，在模板片段加入之前，先加入280mM的MgAc，即乙酸镁。在37℃下反应2小时。

三、gRNA的制备

制备gRNA:参照HiScribeT7Quick High Yield RNA Synthesis kit(New EnglandBiolabs)试剂盒说明书，将带T7启动子的DNA片段、T7引物、T7聚合酶混合，37℃孵育过夜；再采用RNAXP clean beads(Beckman Coulter)试剂盒纯化，获得纯化的gRNAs。

四、检测病原体基因

病原体基因检测体系包括：45nM纯化的LwCas13a，22.5nM gRNA，125nM在LwCas13a切割时可发出荧光的报告RNA链(RNAse Alert v2,Thermo Scientific)，2μl小鼠源RNase抑制剂(New England Biolabs)，靶 RNA，及核酸酶检测缓冲液(40mM Tris-HCl,60mMNaCl,6mM MgCl 2,pH 7.3)。反应体系置于荧光分析仪(BioTek)，在37℃(除非另有说明)下反应1-3小时，荧光动力检测5分钟一次。

五、SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)一步法检测病原体基因

可选地，前述的DNA扩增、T7聚合酶将DNA转录为RNA、以及Cas13a检测体系可以配置到同一个体系中反应。可选地，该一体化体系配置包括：

50μL体系中：

0.48μM正向引物，0.48μM反向引物，1x RPA补液缓冲液，不同量的DNA，45nMLwCas13a重组蛋白，22.5nM gRNA，250ng总人RNA，200nM RNA报告子(RNase alert v2)，4μl鼠源RNase抑制剂(New England Biolabs)，2mM ATP，2mM GTP，2mM UTP，2mM CTP，1μl T7聚合酶混合物(New England Biolabs)，5mM MgCl₂和14mM MgAc。反应体系置于荧光分析仪(BioTek)，在37℃(除非另有说明)下反应1-3小时，荧光动力检测5分钟一次。

六、SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)冷冻干燥和纸张沉积

将玻璃纤维滤纸(Whatman，1827-021)高压灭菌90分钟(Consolidated Stills和杀菌剂，MKII)并在 5％无核酸酶的BSA(EMD Millipore，126609-10GM)中封闭，过夜。用无核酸酶的水(Life technologies， AM9932)清洗纸一次后，通过用4％RNAsecure TM(Lifetechnologies，AM7006)孵育(60℃)除去核糖核酸酶20分钟，用无核酸酶的水冲洗纸3次以除去RNAsecure的痕迹。处理纸使用前，先在80℃下在热板上干燥20分钟(Cole-Parmer，IKAC-Mag HS7)。将1.8μLCas13a反应混合物(如前所述)放置在黑色，透明底部384孔板(Corning，3544)中的盘(2mm)上。对于将SHERLOCK的冷冻干燥试验，含有反应混合物盘的板快速冷冻在液氮中，如前所述，冷冻干燥过夜。RPA样品在无核酸酶的水中稀释1:10，并将1.8μL 的混合物装载到纸盘上并使用孔板检测仪(plate reader，BioTek Neo)在37℃下孵育。

七、分析SHERLOCK荧光数据

为了计算去除背景的荧光数据，方便不同条件之间的比较，样品的初始荧光被去除。背景荧光(无靶核苷酸或无gRNA的条件下)会从样品中去除，从而获得扣除背景荧光的数据。

本领域技术人员可以理解的是，可以采用本领域常规的替代方法替换本发明实施例中常规的Cas13a 基因的克隆、重组表达载体的构建、Cas13a蛋白的表达及纯化、靶核苷酸/目标基因片段的扩增等步骤中的一种或多种，以期获得类似或等同的效果。

本领域技术人员可以理解的是，正如文献1公开的：针对不同的靶核苷酸，gRNA以及Protospacer flanking site(PFS)的序列非常重要。PFS是靶标位点附近存在的特异性基序，是Cas13a的强核糖核酸酶活性所必需的。尽管这种基序类似于PAM序列，PAM是DNA靶向的第二类crispr-cas体系的重要序列，但PFS 与PAM在功能上是不同的，因为PFS不参与阻止内源性系统中CRISPR基因座的自我靶向。PFS对Cas13a的重要性：比如gRNA靶复合体的形成和切割活性中的影响需要未来更多的研究。

本发明实施例提供的用于靶向病原体基因RNA的gRNA、基于C2c2的病原体基因的检测方法、检测试剂盒检测的病原体基因包括但不限于表1所示病原体基因。

本发明实施例中，表1、2、3中各碱基的大小写没有特殊含义。本领域技术人员可以理解的是，本发明实施例表1-5中各碱基的大小可以由大写变为小写或小写变为大小，含义不变。

本发明实施例中，各病原体基因包含的靶核苷酸序列如表1所示：

表1.各病原体基因包含的靶核苷酸序列

本发明实施例中，针对表1中所示的每一条靶核苷酸序列提供了特异性识别所述靶基因的一条或多条gRNA序列，如下表2-5所示：

表2.特异性识别表1中靶基因对应的RNA的一条或多条gRNA序列

效果实施例

本发明一具体实施方式中，本发明实施例提供了一种用于靶向肿瘤相关突变基因RNA的gRNA、一种基于C2c2的肿瘤相关突变基因的检测方法、检测试剂盒，包括但不限于如下步骤的一个或多个步骤：

本实施例仅作为本发明技术方案的一种具体实现方式，不具体限定本发明的保护范围。

一、Cas13a(即C2c2)基因克隆及蛋白表达

Cas13a(即C2c2)基因克隆及蛋白表达、活性检测(efficiency assay)参考“Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a，Jonathan S Gootenberg,Science,2017.4.13”(文献1)公开的实验方法和步骤。

若无特殊说明，本发明采用的常规试剂均为市售商品。

本发明实施例涉及的相关引物说明：

和gRNA相关引物序列：

T7Lwa DRgRNA FP：

TAATACgACTCACTATAggggggATTTAgACTACCCCAAAAACgAAggggACTAAAAC

crRNA/gRAN引物：

5’-表2中的SEQ ID NO.1-874所示gRNA序列的反向互补序列-

GTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCT-3’。

和靶标序列相关的引物序列:

T7FP：TAATACgACTCACTATAggg

靶标引物序列:

5’-TCGAG-表2中的SEQ ID NO.1-874所示gRNA序列-ATTTAGCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’。

采用源自Leptotrichia wadei F0279的Cas13a蛋白基因，经过密码子优化，使基因更适合在哺乳动物细胞中表达。优化后的Cas13a蛋白基因克隆入pACYC184骨架(该骨架包括由J23119启动子驱动表达的间隔序列，所述间隔序列为β-内酰胺酶靶向或非靶向间隔区)。

本发明实施例所采用质粒包括：

pC012质粒图谱：https://benchling.com/s/seq-2WApFr3zni1GOACyQY8a(LwCas13a基因插入不带β-内酰胺酶扫描位点的pACYC184质粒)

二、待检测位点模版前处理

10μM T7引物，10μM靶标引物，2x KOD FX buffer，200μM dNTP，0.1μL KOD FX(KODFX， KFX-101，TOYOBO)，加水至10μL。以PCR程序：94℃10s，60℃10s，68℃20s扩增6个循环。反应完成后加水至50μL，-20℃保存备用。

分别合成靶标引物序列，各靶标引物序列分别包含表2中的SEQ ID NO.1-874所示gRNA序列。

三、crRNA制备

10μM T7引物，10μM crRNA引物，2x KOD FX buffer，200μM dNTP，0.5μL KOD FX(KOD FX， KFX-101，TOYOBO)，加水至50μL。以PCR程序：94℃10s，60℃10s，68℃20s扩增6个循环。以Qiaquick PCR Purification试剂盒(Qiaquick PCR Purification，28104，Qiagen)进行产物纯化，以15μL TE洗脱。体外转录：2μg PCR产物，10μL 5x transcriptionbuffer，ATP、GTP、UTP、CTP(NTP Set,100mM Solution， R0481，Thermo)各1μL，1.5μL T7RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase(20U/μL)，EP0111，Thermo)，加水至50μL。37℃反应16小时。反应结束后加入2μL Turbo DNase(TURBO DNase(2U/μL)，AM2239， Thermo)37℃孵育2小时。上述反应产物以RNeasy Mini Kit(Rneasy Mini Kit，76106，Qiagen)以试剂盒提供方案进行纯化，并以20μL RNase free水洗脱crRNA，-20℃保存备用。

分别合成crRNA引物序列，各crRNA引物序列分别包含与表3中的SEQ ID NO.1-874所示gRNA序列反向互补的序列(特别说明的是，本发明表3中的SEQ ID NO.1-874所示gRNA序列为gRNA的编码序列，需要经过转录，才能获得gRNA)

四、检测体系(50μL)

1μL待检测样品，45nM LwCas13a，22.5nM crRNA，25ng人类总RNA，125nMsubstrate reporter (RNaseAlert Lab Test Kit v2，4479768，Thermo)，缓冲液buffer(20mM HEPES,60mM NaCl,6mM MgCl2, pH 6.8)，1μL RNA酶抑制剂(RNasin RibonucleaseInhibitors，N2515，Promega)，1mM ATP，1mM GTP， 1mM UTP，1mM CTP(NTP Set,100mMSolution，R0481，Thermo)，1.5μL T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase(20U/μL)，EP0111，Thermo)。

五、读板

以VICTOR X5读板机进行记录，激发波长490/发射波长520、从孔顶读数、读数时间每孔1秒，板托温度设定为37℃，每5分钟读一次数值，连续记录2小时。

本实施例针对表2中的SEQ ID NO.1-874所示每条gRNA序列重复上述效果实施例步骤二至五，重复4次取平均值，荧光强度去除背景后如图1至图9所示。图1-9中，横坐标为表2中的SEQ ID NO.1-874对应的SEQ ID NO.编号；纵坐标为去除背景的荧光强度。NC为负对照(检测体系中无靶RNA)。由图1-图9可知，本发明提供的gRNA的特异性非常强，可以非常特异性地识别靶向序列，成功检测靶向基因。

Claims

1.一种特异性识别靶核苷酸的gRNA序列，其特征在于，所述的靶核苷酸为病原体基因对应的RNA序列，所述gRNA对应的编码DNA序列包括表2中SEQ ID NO.85-SEQ ID NO.844所示核苷酸序列中的一条或多条。

2.一种CRISPR-C2c2系统，其特征在于，包括：

1)C2c2效应蛋白；

2)一种或多种核酸，其中，所述一种或多种核酸包含至少一种如权利要求1所述的gRNA序列；

所述C2c2蛋白与gRNA结合形成CRISPR-C2c2复合物，并且当所述CRISPR-C2c2复合物与权利要求1所述的靶核苷酸结合时，所述CRISPR-C2c2复合物对所述靶核苷酸和/或与靶核苷酸相关的序列进行修饰。

3.一种非天然存在的或工程化的组合物，其特征在于，所述组合物包含一个或多个载体，该一个或多个载体包含组分I和组分II：

所述组分I包括第一调节元件，以及与所述第一调节元件可操作地连接的编码C2c2蛋白的编码序列；所述组分II包括第二调节元件，以及与所述第二调节元件可操作地连接的编码gRNA的编码序列，其中，所述gRNA包含如权利要求1所述的gRNA序列；

其中，组分I和II位于相同或不同载体上；

4.一种修饰与权利要求1所述的靶核苷酸相关的序列的方法，其特征在于，所述方法包括递送包含1)及2)的组合物，使包含1)及2)的组合物与所述靶核苷酸及所述与靶核苷酸相关的序列接近：

1)C2c2效应蛋白；

5.一种真核宿主细胞，其特征在于，包含组分I和/或组分II：

所述组分I包括第一调节元件，以及与所述第一调节元件可操作地连接的编码C2c2蛋白的编码序列；所述组分II包括第二调节元件，以及与所述第二调节元件可操作地连接的编码gRNA的编码序列，其中，所述gRNA包含权利要求1所述的gRNA序列；

其中，组分I和II位于相同或不同载体上；

6.如权利要求2-5中的任一项，其特征在于，所述的修饰是引入断裂、切割或标记。

7.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1提供的gRNA序列、权利要求2提供的CRISPR-C2c2系统、权利要求3提供的非天然存在的或工程化的组合物、权利要求5提供的真核宿主细胞中的一种或多种。

8.一种基于CRISPR-C2c2系统的病原体基因的检测方法，其特征在于，包含：

2)提供包含a)、b)、及c)的组合物，组分a)包括C2c2效应蛋白；组分b)包括一种或多种核酸，其中，所述一种或多种核酸包含至少一种gRNA，所述gRNA包含权利要求1所述的gRNA序列；组分c)包括修饰有分子检测标记的报告RNA；

4)检测所述分子检测标记，获得检测结果。

9.一种基于CRISPR-C2c2系统的病原体基因的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1提供的gRNA序列、权利要求2提供的CRISPR-C2c2系统、权利要求3提供的非天然存在的或工程化的组合物、权利要求5提供的真核宿主细胞中的一种或多种；还包括T7聚合酶。

10.一种如权利要求1所述gRNA序列的应用，其特征在于，包括：

(i)所述gRNA与C2c2形成复合物，结合分子标记技术，显现与所述gRNA序列特异性结合的目标RNA在胞内的运输和/或定位；

(ii)所述gRNA与C2c2形成复合物，捕获特异性转录物，所述特异性转录物与所述gRNA序列特异性结合。