CN115386597A - 一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用 - Google Patents
一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115386597A CN115386597A CN202211138207.6A CN202211138207A CN115386597A CN 115386597 A CN115386597 A CN 115386597A CN 202211138207 A CN202211138207 A CN 202211138207A CN 115386597 A CN115386597 A CN 115386597A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- transfection
- cells
- gene vector
- brain
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title claims abstract description 129
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title abstract description 12
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 69
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 69
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 129
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 93
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 50
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 14
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 8
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 claims description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 3
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 claims description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003352 adrenal gland pheochromocytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 58
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 35
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 35
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 34
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 25
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 24
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 23
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 16
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 13
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 12
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 10
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 7
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 7
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 5
- 101000575685 Homo sapiens Synembryn-B Proteins 0.000 description 5
- 102100026014 Synembryn-B Human genes 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 5
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 5
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 3
- RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N avermectin B1a Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N 0.000 description 3
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 3
- 238000007428 craniotomy Methods 0.000 description 3
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 239000012112 Alexa Fluor 633 Substances 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- -1 MBP Proteins 0.000 description 2
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 2
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000021824 exploration behavior Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 230000003137 locomotive effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- ZNEMGFATAVGQSF-UHFFFAOYSA-N 1-(2-amino-6,7-dihydro-4H-[1,3]thiazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound NC=1SC2=C(CN(CC2)C(CC=2OC(=NN=2)C=2C=NC(=NC=2)NC2CC3=CC=CC=C3C2)=O)N=1 ZNEMGFATAVGQSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KUDUQBURMYMBIJ-UHFFFAOYSA-N 2-prop-2-enoyloxyethyl prop-2-enoate Chemical compound C=CC(=O)OCCOC(=O)C=C KUDUQBURMYMBIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 1
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 1
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 1
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 1
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 description 1
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000599858 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 1
- 101000978730 Homo sapiens Nephrin Proteins 0.000 description 1
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102100023195 Nephrin Human genes 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 description 1
- 102100035459 Pyruvate dehydrogenase protein X component, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- SNCZNSNPXMPCGN-UHFFFAOYSA-N butanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(N)=O SNCZNSNPXMPCGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- IWBOPFCKHIJFMS-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl) ether Chemical compound NCCOCCOCCN IWBOPFCKHIJFMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用，所述转染辅助试剂包括聚乙二醇和/或其衍生物。本发明创造性地利用聚乙二醇作为辅助试剂进行基因转染，发现：(1)聚乙二醇或其衍生物可显著提高基因载体对体外细胞的转染效率，其中包括一些基因载体无法转染的细胞；(2)聚乙二醇或其衍生物可显著提高基因载体对活体组织的转染效率，并促进基因载体在活体组织中局域表达，从而在目标组织中实现高效、精准转基因表达；(3)聚乙二醇或其衍生物可长期促进基因载体高效、精准转染活体组织，并不会在活体组织中引发显著的副作用，例如细胞凋亡、严重的免疫反应、动物行为功能显著改变。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术与基因技术领域，涉及一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用。
背景技术
野生型腺相关病毒(AAV)是一种非致病性、复制缺陷型的单链DNA细小病毒，其基因组大小约为4.7kb，主要包含ITR、Rep和Cap三部分。其中ITR是末端反向重复序列，对病毒的复制和包装起着决定性作用；Rep编码了与AAV复制、包装和基因组整合相关的蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)；而Cap编码了组成病毒衣壳的三个结构性蛋白(VP1、VP2和VP3，比例为1：1：10)，这三个结构性蛋白经过相互作用可以构成对称的二十面体结构。野生型AAV最早于1965年作为腺病毒制备过程的一种污染成分在实验室被发现，它需要辅助因子(如：腺病毒、痘苗病毒和单纯疱疹病毒)的参与才能完成复制；当没有辅助因子存在时，它只能潜伏感染细胞。
重组腺相关病毒(rAAV)是在野生型AAV基础上改造而成的基因载体，它具有良好的生物安全性，对宿主细胞不致病，免疫原性低，一般不会整合到宿主细胞基因组中。在转染细胞时，rAAV首先会与细胞膜表面的特异性受体蛋白结合，将细胞内相关的信号通路激活，从而激发细胞的内吞作用将其吞入细胞；之后在高尔基体等细胞器的辅助下，rAAV会进入细胞核并发生裂解，待单链DNA复制成双链DNA后，即可进行报告蛋白的表达。rAAV能够实现对宿主细胞长期稳定的转基因表达，其宿主细胞范围广泛(包括多种细胞系、肌肉、肺、肝、视网膜和中枢神经系统等)，由rAAV介导的转基因表达已经被广泛应用于基础研究和临床治疗等领域，比如：基于细胞的基因治疗、细胞遗传学、基因编辑、神经元形态和神经元群体成像、神经回路调控、神经性疾病模型开发和治疗等。
尽管如此，利用rAAV载体递送基因进行转基因表达仍然存在许多问题需要解决。比如：(1)rAAV对许多体外培养细胞的感染效率低，对部分细胞甚至无法转染。(2)利用rAAV转染活体神经系统时，为了产生足够量的转基因表达，通常需要向目标脑区注射大剂量高滴度AAV。一方面，由于病毒载体在体内运输效率有限，相当一部分病毒载体无法传递到细胞核，它们会被宿主细胞蛋白酶降解，从而触发机体免疫反应。另一方面，高滴度rAAV转染神经系统时会损伤神经元，使之退回到不成熟状态，神经元内部许多基因被上调，其中包括一些胶质基因。这会导致具有胶质细胞启动子的基因序列泄露到神经元进行转基因表达，从而间接改变了rAAV的细胞类型取向性，误导实验结果。(3)脑立体定位注射病毒载体是目前最常规的转染神经系统的方法，然而病毒载体在充满脑脊液的神经组织中会迅速扩散，引发大范围非目标组织被转染，这对于研究小体积核团在大脑中的功能，以及研究大脑中距离较近脑区之间的投射关系十分不利。
因此，如何提供一种可以实现更加高效转染体外细胞，更加精准且高效转染活体组织，并不引发副作用的基因转染方法，成为了本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用。
本发明所述转染效率是指体外转染和/或体内转染中成功转染的细胞所占百分比；所述转染精度是指病毒在体内转染中转染的组织或器官的范围。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂，所述转染辅助试剂包括聚乙二醇(PEG)和/或其衍生物。
所述衍生物包括一端有活性基团的PEG衍生物(如Glucose PEG NHS Ester，Methoxy PEG Carboxyl，Methoxy PEG Succinimidyl Carbonate，Methoxy PEG Thiol等)、同官能团双取代衍生物(如Carboxyl PEG Carboxyl，Amine PEG Amine，Acrylate PEGAcrylate等)，Y-型PEG衍生物(如Y-Shape PEG NHS Ester，Y-Shape PEG Carboxyl，Y-Shape PEG Maleimide，Y-Shape PEG Acetaldehyde，Y-Shape PEG Propionaldehyde，Y-Shape PEG Amine等)等，优选聚乙二醇(PEG)。
优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为1000-10000，例如1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000等，优选为2000-6000。
当聚乙二醇的平均分子量为2000-6000范围内时，其提高基因载体转染效率及转染精度的效果更好，当聚乙二醇的平均分子量为4000时，其提高基因载体转染效率及转染精度的效果最好。
优选地，所述基因载体包括质粒、逆转录病毒、单纯孢疹病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒中的任意一种或至少两种的组合，优选为腺相关病毒。
优选地，所述腺相关病毒包括人源性血清型腺相关病毒和/或非人灵长类动物源性血清型腺相关病毒，优选为人源性血清型腺相关病毒(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV12、AAV12)。
优选地，所述腺相关病毒的启动子包括CMV、hSyn、GFAP、CaMKIIα、TH、c-fos、NSE、MBP、TBG、aMHC、Rpe65、PDX1、SM22a、CD68、ICAM2、MCK或NPHS1中的任意一种，优选为CMV、hSyn、GFAP、CaMKIIα、TH、c-fos、NSE或MBP中的任意一种，进一步优选为CMV或hSyn。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂在基因转染中的应用，所述基因转染包括体外转染和/或体内转染。
第三方面，本发明提供一种体外转染方法，所述体外转染方法包括将如第一方面所述的提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂、基因载体与细胞混合，进行转染。
所述混合可以为直接混合或间接混合。
优选地，所述细胞包括易被病毒转染的细胞和/或难以被病毒转染的细胞。
所述易被病毒转染的细胞包括但不限于宫颈癌细胞(Hela)、人体肾脏细胞系(HEK293T)、人支气管上皮细胞(HBEC)、人肝癌细胞(HepG2)、人成骨肉瘤细胞(Saos-2)、人骨肉瘤细胞(U2OS)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、非洲绿猴SV40转化的肾细胞(COS-7)、小鼠成纤维细胞系(3T3)、星形胶质细胞(Astrocyte)等，本领域技术人员应当知晓，除上述细胞外，本领域其他易被病毒转染的细胞均可行，均在本发明的保护范围内。
所述难以被病毒转染的细胞包括但不限于人慢性髓原白血病细胞(K562)、肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)、上皮性结直肠细胞(Caco-2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、定向造血干细胞(Hematopoietic Progenitor)、胚胎干细胞(ES cell)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人结肠癌细胞(HT29)、人结直肠腺癌细胞(CaCo-2)等，本领域技术人员应当知晓，除上述细胞外，本领域其他难以被病毒转染的细胞均可行，均在本发明的保护范围内。
优选地，所述混合后得到的转染体系中，所述转染辅助试剂的质量分数为0.1％-20％，例如0.1％、0.2％、0.5％、0.7％、1％、1.2％、1.5％、1.7％、2％、2.2％、2.5％、2.8％、3％、3.2％、3.5％、3.7％、4％、4.2％、4.5％、4.8％、5％、5.2％、5.5％、5.7％、6％、6.2％、6.5％、6.7％、7％、7.2％、7.5％、7.7％、8％、8.2％、8.5％、8.7％、9％、9.2％、9.5％、9.7％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％等，优选为0.2％-4.8％，进一步优选为2.8％-4.2％。
优选地，所述混合的时间为1s-72h，例如1s、30s、1min、10min、40min、1h、3h、5h、7h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h、72h等，优选为12h-36h。
第四方面，本发明提供一种体内转染方法，所述体内转染方法包括将如第一方面所述的提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂与基因载体送入活体组织或活体器官中，进行转染。
可以将所述转染辅助试剂与基因载体分别送入或混合后一同送入，所述送入的方式例如注射等。
优选地，若将所述转染辅助试剂与基因载体混合后送入，则所述转染辅助试剂在混合体系中的质量分数为1％-99％，例如1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、99％等，优选为20％-60％。
优选地，所述活体组织或活体器官包括脑、脊椎、肝脏、肾脏、心脏、肺、眼睛、肌肉、胰腺或血管中的任意一种或至少两种的组合，优选为脑。
优选地，所述转染的时间为1周-5年，例如1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、1年、2年、3年、4年、5年等，优选为2-10周。
第五方面，本发明提供聚乙二醇和/或其衍生物在制备转染辅助试剂中的应用，其特征在于，所述转染辅助试剂用于提高基因载体转染效率和/或转染精度。
优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为1000-10000，例如1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000等，优选为2000-6000。
优选地，所述基因载体包括质粒、逆转录病毒、单纯孢疹病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒中的任意一种或至少两种的组合，优选为腺相关病毒。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地利用PEG或其衍生物作为辅助试剂进行基因转染，发现：
(1)PEG或其衍生物可显著提高基因载体对体外细胞的转染效率，其中包括一些在无辅助转染试剂情况下仅用基因载体无法转染的细胞(K562细胞、PC12细胞等)。
(2)PEG或其衍生物可显著提高基因载体对活体组织或活体器官的转染效率，并促进基因载体在活体组织或活体器官中局域表达，从而在目标组织/器官中实现高效、精准转基因表达。
(3)PEG或其衍生物可长期促进基因载体高效、精准转染活体组织，并不会在活体组织中引发显著的副作用，例如细胞凋亡、严重的免疫反应、动物行为功能显著改变。
本发明创造性地提供一种利用PEG或其衍生物作为辅助试剂进行基因转染的方法。本发明通过在病毒溶液中或细胞培养基中溶解少量PEG或其衍生物，显著提升了AAV对体外培养细胞(包括一些无法转染的细胞)的转染效率。本发明通过在病毒溶液中溶解少量PEG或其衍生物，显著提升了AAV对活体组织(或器官)的转染效率，以脑组织为例，本发明利用PEG或其衍生物作为辅助试剂，不仅显著提高了AAV对脑组织的转染效率，更是促进了AAV长期、精准转染大脑中小体积核团，而且不产生任何副作用。本发明提出的基因转染方法在精准基因治疗、精细神经环路研究等领域具有非常重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中，AAV-CMV::GFP和AAV-CMV::GFP/PEG病毒溶液在Hela细胞、HEK293T细胞、K562细胞和PC12细胞中GFP荧光蛋白的表达情况，CMV：广谱启动子，GFP：绿色荧光蛋白。
图2为实施例1中，AAV-CMV::GFP和AAV-CMV::GFP/PEG病毒溶液在Hela细胞、HEK293T细胞、K562细胞和PC12细胞中转染效率的统计结果。
图3为实施例2中，PEG质量分数分别为0.2％、0.9％、1.6％和3.6％时，AAV-CMV::GFP/PEG病毒溶液在Hela细胞中GFP荧光蛋白的表达情况。
图4为实施例2中，PEG质量分数分别为0.2％、0.9％、1.6％和3.6％时，AAV-CMV::GFP/PEG病毒溶液在Hela细胞中转染效率的统计结果。
图5为实施例3中，滴度为4.2×1011v·g/mL的AAV-hSyn::EGFP病毒溶液转染小鼠大脑3周时，EGFP荧光蛋白的表达情况，从左至右PEG质量分数分别为0％，20％和40％，图中比例尺为200μm。
图6为实施例3中，滴度为4.2×1011v·g/mL的AAV-hSyn::EGFP病毒溶液转染小鼠大脑3周时(注射体积为300nL)，EGFP荧光蛋白的表达情况，左脑病毒溶液不含PEG，右脑病毒溶液中PEG质量分数为40％，hSyn：神经元特异性启动子，EGFP：增强型绿色荧光蛋白。
图7为实施例3中，滴度为4.2×1011v·g/mL的AAV-hSyn::EGFP病毒溶液转染小鼠大脑3周时(注射体积为1000nL)，EGFP荧光蛋白的表达情况，左脑病毒溶液不含PEG，右脑病毒溶液中PEG质量分数为40％，hSyn：神经元特异性启动子，EGFP：增强型绿色荧光蛋白。
图8为实施例3中，滴度为4.2×1011v·g/mL的AAV-hSyn::EGFP病毒溶液转染小鼠大脑3周时，EGFP表达范围的统计结果。
图9为实施例4中，滴度为4.2×1011v·g/mL的AAV-hSyn::EGFP病毒溶液转染小鼠大脑3周后，通过免疫荧光方法标记脑片中神经元的荧光结果，NeuN：神经元特异核蛋白。
图10为实施例4中，滴度为4.2×1011v·g/mL的AAV-hSyn::EGFP病毒溶液转染小鼠大脑3周后的转染效率统计结果。
图11为实施例5中，滴度为4.2×1011v·g/mL的AAV-hSyn::EGFP病毒溶液转染小鼠大脑3周和8周时，EGFP荧光蛋白的表达情况。左图病毒溶液不含PEG，右图病毒溶液中PEG质量分数为40％。
图12为实施例6中，滴度为4.2×1011v·g/mL的AAV-hSyn::EGFP病毒溶液转染小鼠大脑3周和8周后，通过免疫荧光方法标记脑片中星形胶质细胞的荧光结果。
图13为实施例7中，滴度为4.2×1011v·g/mL的不含PEG和含有PEG质量分数为40％的AAV-hSyn::EGFP病毒溶液转染小鼠大脑3周和8周后，行为学实验中小鼠运动速度和休息时间的统计结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1.PEG提高AAV对多种细胞系的转染效率。
(1)细胞培养。
用含有10％胎牛血清、1％双抗的DMEM培养基培养HeLa、HEK293T细胞。用含有5％胎牛血清、10％灭活马血清和1％双抗的1640培养基培养PC12。用含有10％胎牛血清、1％双抗的1640培养基培养K562细胞。培养箱CO2浓度为5％，温度为37℃。
(2)无辅助转染试剂的AAV转染液转染细胞
将1mL状态良好的Hela细胞、HEK293T细胞、PC12细胞或K562细胞接种到24孔板中，细胞数量为104个。
用1×PBS将rAAV9-CMV::GFP转染液滴度稀释至5×1010v·g/mL。
v·g是指viral genomes，病毒基因。
然后将稀释后的rAAV9-CMV::GFP转染液加入到接种过细胞的24孔板中，最终的转染复数为5×105v·g/cell。
然后将24孔板置于细胞培养箱中培养，CO2浓度为5％，温度为37℃。
培养24h后，换新鲜培养基，继续培养48h。
然后用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)观察GFP荧光表达。显微镜的激发光选择488nm激光，物镜倍数使用10×或20×。观察结果见图1。
然后用ImageJ软件对荧光照片中所有细胞和GFP阳性细胞计数。每组实验参数重复3次。对于PC12细胞，每次实验随机计数3个细胞数量大于500的区域。对于HeLa细胞，HEK293T细胞和K562细胞，每次实验随机计数3个细胞数量大于1000的区域。
(3)AAV/PEG转染液转染细胞。
其方法与(2)无辅助转染试剂的AAV转染液转染细胞的区别仅在于，加入PEG作为辅助试剂进行转染，其他参照(2)，具体如下：
将1mL状态良好的Hela细胞、HEK293T细胞、PC12细胞或K562细胞接种到24孔板中，细胞数量为104个。
向PBS溶液中加入一定量的rAAV9-CMV::GFP病毒和一定质量的聚乙二醇4000(PEG4000)，配置成rAAV滴度为5×1010v·g/mL，PEG4000浓度为40％的原溶液。
用1×PBS将上述rAAV9-CMV::GFP/PEG4000溶液加入到24孔板中，最终的转染复数为5×105v·g/cell，PEG质量分数为3.6％。
然后将24孔板置于细胞培养箱中培养，CO2浓度为5％，温度为37℃。
培养24h后，换新鲜培养基，继续培养48h。
然后用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)观察GFP荧光表达。显微镜的激发光选择488nm激光，物镜倍数使用10×或20×。观察结果见图1。
然后用ImageJ软件对荧光照片中所有细胞和GFP阳性细胞计数。每组实验参数重复3次。对于PC12细胞，每次实验随机计数3个细胞数量大于500的区域。对于HeLa细胞，HEK293T细胞和K562细胞，每次实验随机计数3个细胞数量大于1000的区域。
(4)分析比较数据。
将GFP阳性细胞数量与所有细胞数量的比值定义为AAV为细胞的转染效率，并计算标准误差，然后在Origin软件中将相应结果绘制成柱状图进行比较(见图2)。
结果显示：加入PEG进行转染，显著地提高了AAV对多种细胞系的转染效率。
实施例2.PEG的分子量及添加量对AAV在细胞中转染效率的影响。
(1)用含有10％胎牛血清、1％双抗的DMEM培养基培养HeLa细胞。培养箱CO2浓度为5％，温度为37℃。
(2)将1mL状态良好的Hela细胞接种到24孔板中，细胞数量为104个。
(3)用1×PBS将rAAV9-CMV::GFP转染液滴度稀释至1011v·g/mL。
(4)然后将稀释后的rAAV9-CMV::GFP转染液加入到24孔板中。
(5)然后向24孔板加入不同量的PEG4000，使PEG最终质量分数分别为0.2％、0.9％，1.6％和3.6％，最终的转染复数为5×105v·g/cell。
(6)然后将24孔板置于细胞培养箱中培养，CO2浓度为5％，温度为37℃。
(7)培养24h后，换新鲜培养基，继续培养48h。
(8)然后用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)观察GFP荧光表达。显微镜的激发光选择488nm激光，物镜倍数使用10×或20×。观察结果见图3。
(9)然后用ImageJ软件对荧光照片中所有细胞和GFP阳性细胞计数。每组实验参数重复3次，每次实验随机计数3个细胞数量大于1000的区域。
(10)将GFP阳性细胞数量与所有细胞数量的比值定义为AAV对Hela细胞的转染效率，并计算标准误差。结果见图4。
结果显示：PEG的加入量对转染效率有较大的影响，加入的质量分数为3.6％时，AAV对细胞系的转染效率最高。继续增加PEG浓度会导致毒性的产生，因此体外转染中PEG4000的优选浓度为3.6％。
实施例3.PEG促进AAV在活体大脑中局域转基因表达。
(1)配制AAV/PEG混合转染液。
用天平准确称取4克PEG4000后，将其倒入15mL离心管，然后加入适量1×PBS溶解PEG4000。使用涡旋仪震荡或金属浴加热等方式促进PEG4000溶解，待完全溶解后，用1×PBS将其精确定容至10mL，并用涡旋仪摇匀，得到质量分数为40％的PEG4000溶液。
用移液枪精确取3mL质量分数为40％的PEG4000溶液，并使用1×PBS将其定容至6mL，用涡旋仪摇匀，得到质量分数为20％的PEG4000溶液。
分别用1×PBS、20％PEG和40％PEG将rAAV9-hSyn::EGFP的滴度从1.4×1014v·g/mL稀释至4.2×1011v·g/mL。用涡旋仪摇匀后，得到各组病毒溶液，保存至4℃冰箱，当天使用。
(2)小鼠开颅手术。
从公司购买7-8周龄的雄性C57小鼠，在实验室环境饲养3天后，通过腹腔注射方式对其注射阿弗丁麻药，注射剂量为0.04mL/g，分两次注射。待小鼠深度麻醉后，剃净小鼠头皮上方毛发。用耳棒将小鼠固定到脑立体定位仪上，用棉签蘸取碘伏对头皮消毒后，剪开小鼠头皮，暴露颅骨。然后通过三维坐标将小鼠颅骨调平，并在目标脑区上方做好标记。然后在体式显微镜下，通过颅钻去除标记处颅骨，暴露出颅窗。所用颅钻直径约为0.4mm，颅窗为边长约为1mm的正方形。小心剥开颅骨下方硬脑膜后，用湿棉签覆盖裸露的脑组织。
(3)脑定位注射。
将量程为10μL的Hamilton注射器与33号进样针装配，进样针外径为210μm。将微量注射泵活动端固定到脑立体定位仪活动臂上。将微量注射器与微量注射泵连接。然后在微量注射器显示屏上设置参数，吸取步骤(1)所配制的病毒溶液，吸取速度设置为0.1μL/s。然后通过脑立体定位仪活动臂将进样针植入目标脑区。在显示屏上设置注射参数，注射速度为0.1μL/min，注射体积为300nL或1000nL。病毒溶液注射结束后，为了防止病毒溶液回流，需要原位停留10min再将进样针缓慢拔出脑组织。最后用单组份隔离胶填充颅窗，并缝合头皮。
(4)取脑。
待病毒转染大脑3周后，再次腹腔注射麻药麻醉小鼠。然后经心灌注20mL生理盐水，排尽小鼠身体中血液。然后缓慢经心灌注20mL多聚甲醛溶液，对小鼠进行前固定。放置半小时后，小心去除小鼠大脑，并用多聚甲醛溶液过夜浸泡，进行后固定。
(5)脑片样品制备。
配置质量分数为30％的蔗糖溶液。然后将经过过夜后固定的小鼠大脑用30％蔗糖进行脱水处理。脱水时间约为24小时。待脑组织在30％蔗糖溶液中沉底后，将其取出，用OCT包埋，在-25℃时速冻1小时。然后用冷冻切片机将其切成30μm厚的脑片样品，贴附到载玻片上。最后用移液枪滴加防荧光猝灭剂，盖上盖玻片，并用指甲油固定盖玻片四角。
(6)荧光照片获取及分析处理。
通过激光共聚焦显微镜观察步骤(5)制备的脑片样品，并拍照。显微镜的激发光选择488nm激光，物镜倍数使用5×或20×。荧光表达结果见图5、图6和图7。取6张脑片，通过ImageJ软件统计EGFP荧光表达范围。最后通过Origin软件将结果绘制成柱状图进行比较。见图8。
结果显示：加入PEG后AAV转染效率呈现局域高效特点，而无辅助转染试剂的AAV的转染效率都呈现弥散低密度特点，说明PEG显著促进了AAV在活体大脑中局域转基因表达。
实施例4.PEG促进AAV在活体大脑中高密度转基因表达。
(1)脑片样品制备：
按照实施例3所述方法配制滴度为4.2×1011v·g/mL的病毒转染液，其中PEG4000质量分数分别为0％和40％。并分别向小鼠大脑注射300nL或1000nL上述转染液。待病毒表达3周后，按照实施例3所述步骤将小鼠大脑冷冻切片至30μm厚的脑片，贴附于载玻片上，然后用疏水笔在脑片周围画圈，并避光保存于4℃湿度盒中。
(2)免疫荧光染色：
接下来通过免疫荧光染色方法标记神经元特异性核蛋白NeuN，反映脑片中神经元的分布情况。具体染色实验流程如下：首先用质量分数为3％的牛血清蛋白(BSA)将TritonX-100稀释至0.3％体积分数。然后用移液枪向脑片滴加100μL体积分数为0.3％的TritonX-100，对神经细胞穿膜处理15min。然后换3％的BSA封闭样品1h，以占据脑片上非特异性结合位点。然后选择可特异性识别NeuN的鼠源单克隆一抗(Millipore,MAB377)标记神经元，一抗用3％牛血清蛋白按体积比1:200稀释稀释抗体。在4℃冰箱孵育过夜后，用1×PBS清洗3遍，每遍15min。然后选择带有Alexa Fluor 633荧光基团的羊抗鼠二抗(Thermal Fisher,A-21050)室温避光孵育脑片2h，其中二抗用3％的牛血清蛋白按照体积比1:1000稀释。二抗孵育结束后，用1×PBS清洗三遍，每遍15min。然后向脑片样品滴加防荧光猝灭剂保护荧光，缓慢盖好盖玻片，并用指甲油固定盖玻片四角。
(3)荧光照片获取及分析处理：
通过激光共聚焦显微镜观察经过免疫荧光染色的脑片样品，并拍照。物镜倍数选择20×，并分别以488nm和633nm激光激发EGFP荧光和Alexa Fluor633荧光。取6张脑片(典型荧光表达结果见图9)，通过ImageJ软件统计EGFP荧光表达范围内的EGFP/NeuN共阳性细胞数量和NeuN阳性细胞数量，并定义二者比值为转染效率。最后通过Origin软件将结果绘制成柱状图进行比较。见图10。
结果显示：加入PEG后，AAV转染效率明显提高，说明PEG能够显著促进AAV在活体大脑中高密度转基因表达。
实施例5.PEG长期促进AAV局域高效转染活体大脑。
(1)按照实施例3所述方法配制滴度为4.2×1011v·g/mL的病毒转染液，其中PEG4000质量分数分别为0％和40％。并向小鼠大脑注射300nL所述病毒转染液体。待病毒表达3周和8周后按照实施例3所述方法将小鼠取脑、切成脑片、并制成脑片样品。
(2)通过激光共聚焦显微镜观察脑片样品的荧光蛋白表达情况。共聚焦显微镜的激发波长选择488nm，物镜倍数选择20×，并选择3×3大图拼接功能进行大范围神经元的表征，结果见图11。
从EGFP荧光表达结果来看，在第3周和第8周，AAV/PEG的转染效率都呈现局域高效特点，而无辅助转染试剂的AAV的转染效率都呈现弥散低密度特点。此结果充分证实了PEG能够长期促进AAV局域高效转染活体大脑。
实施例6.验证PEG在活体大脑良好的生物相容性：免疫反应。
(1)配制AAV/PEG混合转染液。
同实施例3所述步骤(1)配制滴度为4.2×1011v·g/mL的病毒转染液，其中PEG4000质量分数分别为0％和40％。
(2)小鼠开颅手术。
从公司购买7-8周龄的雄性C57小鼠，在实验室环境饲养3天后，通过腹腔注射方式对其注射阿弗丁麻药，注射剂量为0.04mL/g，分两次注射。提前对手术器械进行高温高压灭菌。待小鼠深度麻醉后，剃净小鼠头皮上方毛发。通过耳棒将小鼠固定到脑立体定位仪上，用棉签蘸取碘伏对头皮消毒后，然后用直头剪刀剪开小鼠头皮暴露颅骨。然后通过三维坐标将小鼠颅骨调平，并在目标脑区上方做好标记。然后在体式显微镜下，通过颅钻去除标记处颅骨，暴露出颅窗。所用颅钻直径约为0.4mm，颅窗为边长约为1mm的正方形。小心剥开颅骨下方硬脑膜后，用湿棉签覆盖裸露的脑组织。
(3)脑定位注射。
将量程为10μL的Hamilton注射器与33号进样针装配，进样针外径为210μm。将微量注射泵活动端固定到脑立体定位仪活动臂上。将微量注射器与微量注射泵连接。然后在微量注射器显示屏上设置参数，吸取步骤(1)所配制的病毒溶液，吸取速度设置为0.1μL/s。然后通过脑立体定位仪活动臂将进样针植入目标脑区。在显示屏上设置注射参数，注射速度为0.1μL/min，注射体积为300nL。病毒溶液注射结束后，为了防止病毒溶液回流，需要原位停留10min再将进样针缓慢拔出脑组织。最后用单组份隔离胶填充颅窗，并缝合头皮。
(4)取脑。
待病毒转染大脑3周和8周后，再次腹腔注射麻药麻醉小鼠。然后经心灌注20mL生理盐水，排尽小鼠身体中血液。然后缓慢经心灌注20mL多聚甲醛溶液，对小鼠进行前固定。放置半小时后，小心取出小鼠大脑，并用多聚甲醛溶液过夜浸泡，进行后固定。
(5)脑片样品制备。
配置质量分数为30％的蔗糖溶液。然后将经过过夜后固定的小鼠大脑用30％蔗糖进行脱水处理。脱水时间约为24小时。待脑组织在30％蔗糖溶液中沉底后，将其取出，用OCT包埋，在-25℃时速冻1小时。然后用冷冻切片机将其切成30μm厚的脑片样品，贴附到载玻片上，然后用疏水笔在脑片周围画圈，并避光保存于4℃湿度盒中。
(6)免疫荧光染色：
接下来通过免疫荧光染色方法标记胶质纤维酸性蛋白GFAP，反映脑片中星形胶质细胞的分布情况。具体染色实验流程如下：首先用质量分数为3％的牛血清蛋白(BSA)将Triton X-100稀释至0.3％体积分数。然后用移液枪向脑片滴加100μL体积分数为0.3％的Triton X-100，对脑片中细胞穿膜处理15min。然后换3％的BSA封闭样品1h，以占据脑片上非特异性结合位点。然后选择可特异性识别GFAP的兔源一抗(Sigma-Aldrich,HPA056030)标记星形胶质细胞，一抗用3％牛血清蛋白按体积比1:1000稀释稀释抗体。在4℃冰箱孵育过夜后，用1×PBS清洗3遍，每遍15min。然后选择带有Alexa Fluor 594荧光基团的羊抗兔二抗(Thermal Fisher,A-11012)室温避光孵育脑片2h，其中二抗用3％的牛血清蛋白按照体积比1:1000稀释。二抗孵育结束后，用×PBS清洗三遍，每遍15min。然后向脑片样品滴加防荧光猝灭剂保护荧光，缓慢盖好盖玻片，并用指甲油固定盖玻片四角。
(7)荧光照片获取及分析处理：
通过激光共聚焦显微镜观察脑片样品中星形胶质细胞，以反应大脑中免疫反应情况。共聚焦显微镜的激发波长选择633nm，物镜倍数选择20×，并选择3×3大图拼接功能。结果见图12。
从GFAP荧光染色结果来看，在第3周和第8周时，注射AAV/PEG和注射AAV引发的免疫反应无明显差别。因此少量PEG的引入不会显著加剧小鼠大脑中的免疫反应。
实施例7.验证PEG在活体大脑良好的生物相容性：动物行为。
(1)配制AAV/PEG混合转染液。
同实施例3所述步骤(1)配制滴度为4.2×1011v·g/mL的病毒转染液，其中PEG4000质量分数分别为0％和40％。
(2)小鼠开颅手术。
从公司购买7-8周龄的雄性C57小鼠，在实验室环境饲养3天后，通过腹腔注射方式对其注射阿弗丁麻药，注射剂量为0.04mL/g，分两次注射。提前对手术器械进行高温高压灭菌。待小鼠深度麻醉后，剃净小鼠头皮上方毛发。通过耳棒将小鼠固定到脑立体定位仪上，用棉签蘸取碘伏对头皮消毒后，然后用直头剪刀剪开小鼠头皮暴露颅骨。然后通过三维坐标将小鼠颅骨调平，并在目标脑区上方做好标记。然后在体式显微镜下，通过颅钻去除标记处颅骨，暴露出颅窗。所用颅钻直径约为0.4mm，颅窗为边长约为1mm的正方形。小心剥开颅骨下方硬脑膜后，用湿棉签覆盖裸露的脑组织。
(3)脑定位注射。
将量程为10μL的Hamilton注射器与33号进样针装配，进样针外径为210μm。将微量注射泵活动端固定到脑立体定位仪活动臂上，并将微量注射器与微量注射泵连接。然后在微量注射器显示屏上设置吸取速度设置为0.1μL/s。对于对照组小鼠，吸取不含PEG的病毒溶液，然后通过脑立体定位仪活动臂将进样针依次植入小鼠左脑和右脑目标脑区进行注射。对于实验组小鼠，吸取PEG质量分数为40％的病毒溶液，然后通过脑立体定位仪活动臂将进样针依次植入小鼠左脑和右脑目标脑区进行注射。在显示屏上设置注射参数，注射速度为0.1μL/min，注射体积为300nL。注射结束后，为了防止注射液回流，需要原位停留10min再将进样针缓慢拔出脑组织。最后用单组份隔离胶填充颅窗，并缝合头皮。
(4)旷场行为学。
手术三周后，将小鼠放到50×50cm2旷场行为箱中自由活动15min，以适应环境。然后打开SuperMaze视频追踪软件，记录小鼠15min的重心坐标和对应时间。实验组和对照组小鼠各4只，分别在白天和晚上各进行一次测试，从而避免个体节律差异带来的实验误差。每次更换小鼠，都需向旷场行为箱喷洒75％的医用酒精去除异味。
(5)运动数据处理与分析。
通过SuperMaze软件分析15min内小鼠的平均运动速度和休息时间，并计算标准差。通过Origin软件将分析结果绘制成柱状图，对比两组小鼠的运动能力。结果见图13。
结果显示，两组小鼠的运动速度和休息时间无显著差异。因此少量PEG的引入不会显著影响小鼠的大脑功能。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (9)
1.一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂，其特征在于，所述转染辅助试剂包括聚乙二醇和/或其衍生物。
2.如权利要求1所述的提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂，其特征在于，所述聚乙二醇的平均分子量为1000-10000，优选为2000-6000。
3.如权利要求1或2所述的提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂，其特征在于，所述基因载体包括质粒、逆转录病毒、单纯孢疹病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒中的任意一种或至少两种的组合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂在基因转染中的应用，所述基因转染包括体外转染和/或体内转染。
5.一种体外转染方法，其特征在于，所述体外转染方法包括将如权利要求1-3中任一项所述的提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂、基因载体与细胞混合，进行转染。
6.如权利要求5所述的体外转染方法，其特征在于，所述细胞包括易被病毒转染的细胞和/或难以被病毒转染的细胞；
所述易被病毒转染的细胞包括宫颈癌细胞、人体肾脏细胞系、人支气管上皮细胞、人肝癌细胞、人成骨肉瘤细胞、人骨肉瘤细胞、人脐静脉内皮细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞、小鼠成纤维细胞系或星形胶质细胞中的任意一种；
所述难以被病毒转染的细胞包括人慢性髓原白血病细胞、肾上腺嗜铬细胞瘤细胞、上皮性结直肠细胞、人乳腺癌细胞、定向造血干细胞、胚胎干细胞，中国仓鼠卵巢细胞、人结肠癌细胞或人结直肠腺癌细胞中的任意一种。
7.如权利要求5或6所述的体外转染方法，其特征在于，所述混合后得到的转染体系中，所述转染辅助试剂的质量分数为0.1％-20％，优选为0.2％-4.8％，进一步优选为2.8％-4.2％。
8.一种体内转染方法，其特征在于，所述体内转染方法包括将如权利要求1-3中任一项所述的提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂与基因载体送入活体组织或活体器官中，进行转染。
9.如权利要求8所述的体内转染方法，其特征在于，所述活体组织或活体器官包括脑、脊椎、肝脏、肾脏、心脏、肺、眼睛、肌肉、胰腺或血管中的任意一种或至少两种的组合。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211138207.6A CN115386597A (zh) | 2022-09-19 | 2022-09-19 | 一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211138207.6A CN115386597A (zh) | 2022-09-19 | 2022-09-19 | 一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115386597A true CN115386597A (zh) | 2022-11-25 |
Family
ID=84126825
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211138207.6A Pending CN115386597A (zh) | 2022-09-19 | 2022-09-19 | 一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115386597A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101402938A (zh) * | 2008-11-17 | 2009-04-08 | 中国科学院植物研究所 | 一种制备原生质体的方法 |
| US20130023051A1 (en) * | 2009-12-21 | 2013-01-24 | Keygene N.V. | Techniques for transfecting protoplasts |
| CN104968784A (zh) * | 2012-10-23 | 2015-10-07 | 基因工具股份有限公司 | 包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合物及其用途 |
| CN111450411A (zh) * | 2020-04-09 | 2020-07-28 | 国家纳米科学中心 | 一种复合神经电极及其制备方法 |
-
2022
- 2022-09-19 CN CN202211138207.6A patent/CN115386597A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101402938A (zh) * | 2008-11-17 | 2009-04-08 | 中国科学院植物研究所 | 一种制备原生质体的方法 |
| US20130023051A1 (en) * | 2009-12-21 | 2013-01-24 | Keygene N.V. | Techniques for transfecting protoplasts |
| CN104968784A (zh) * | 2012-10-23 | 2015-10-07 | 基因工具股份有限公司 | 包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合物及其用途 |
| CN111450411A (zh) * | 2020-04-09 | 2020-07-28 | 国家纳米科学中心 | 一种复合神经电极及其制备方法 |
| WO2021203615A1 (zh) * | 2020-04-09 | 2021-10-14 | 国家纳米科学中心 | 一种复合神经电极及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LIANG ZOU, ET AL.: "PEG‑mediated transduction of rAAV as a platform for spatially confined and efficient gene delivery", BIOMATERIALS RESEARCH, vol. 26, no. 69, pages 1 - 13 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kilpatrick et al. | Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear | |
| Hamm et al. | Efficient transfection method for primary cells | |
| Chen et al. | Gene transfer and expression in oligodendrocytes under the control of myelin basic protein transcriptional control region mediated by adeno-associated virus | |
| Pang et al. | Comparative analysis of in vivo and in vitro AAV vector transduction in the neonatal mouse retina: effects of serotype and site of administration | |
| CN107438671A (zh) | 变体RNAi | |
| Wu et al. | Transduction of human neural progenitor cells using recombinant adeno-associated viral vectors | |
| CN108697774A (zh) | 治疗mps i-相关失明的aav-idua载体 | |
| Cushnie et al. | Using rAAV2-retro in rhesus macaques: promise and caveats for circuit manipulation | |
| O'Connor et al. | Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations | |
| CA3022667A1 (en) | Organotypic pig retina culture system | |
| McClements et al. | Tropism of AAV vectors in photoreceptor-like cells of human iPSC-derived retinal organoids | |
| Matsuzaki et al. | Transduction profile of the marmoset central nervous system using adeno-associated virus serotype 9 vectors | |
| Huet et al. | Application of targeting-optimized chronos for stimulation of the auditory pathway | |
| Kornum et al. | Adeno-associated viral vector serotypes 1 and 5 targeted to the neonatal rat and pig striatum induce widespread transgene expression in the forebrain | |
| CN115386597A (zh) | 一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用 | |
| Wang et al. | Slow infusion of recombinant adeno-associated viruses into the mouse cerebrospinal fluid space | |
| Chen et al. | A novel retrograde AAV variant for functional manipulation of cortical projection neurons in mice and monkeys | |
| Bockstael et al. | Recombinant AAV delivery to the central nervous system | |
| Maturana et al. | Single‐Cell Quantification of Triple‐AAV Vector Genomes Coexpressed in Neurons | |
| CN116949041A (zh) | 人工设计mRNA UTR核苷酸序列及其用途 | |
| Nunez-Toldra et al. | Living myocardial slices for the study of nucleic acid-based therapies | |
| Baum et al. | Gene therapy of salivary diseases | |
| CN106497930A (zh) | 骨骼肌细胞高效特异性启动子及其应用 | |
| CN116171325A (zh) | 用于eEF1A2的基因疗法载体及其用途 | |
| Suhonen et al. | Ex vivo and in vivo gene delivery to the brain |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |