ES2886448T3 - Composición para escindir un ADN diana que comprende un ARN guía específico para el ADN diana y el ácido nucleico que codifica la proteína CAS o proteína CAS, y uso de los mismos - Google Patents

Composición para escindir un ADN diana que comprende un ARN guía específico para el ADN diana y el ácido nucleico que codifica la proteína CAS o proteína CAS, y uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Una composición de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente interespaciadas Tipo II (CRISPR)/proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) para escindir un ADN diana en una célula vegetal, en la que el ADN diana es ADN endógeno, y en la que la composición comprende un complejo de: (a) un polipéptido de proteína 9 (Cas9) asociada a CRISPR; y (b) un ARN guía específico para el ADN diana, en el que el ARN guía es: (i) un ARN guía dual que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) y un ARNcr trans activador (ARNtracr); o (ii) un ARN guía de cadena sencilla que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) fusionado a un ARNcr trans activador (ARNtracr), en la que la composición comprende adicionalmente polietilenglicol (PEG).

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para escindir un ADN diana que comprende un ARN guía específico para el ADN diana y el ácido nucleico que codifica la proteína CAS o proteína c As , y uso de los mismos
Campo técnico
Como se define en las reivindicaciones, la presente invención se refiere en general a la edición dirigida del genoma en plantas. Más particularmente, la presente invención se refiere en general a una composición para escindir un ADN diana en células u organismos eucariotas que comprende un ARN guía específico para el ADN diana y ácido nucleico o proteína Cas9 que codifica la proteína Cas9, y uso de los mismos.
Técnica antecedente
Las CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Interespaciadas) son loci que contienen múltiples repeticiones directas cortas que se encuentran en los genomas de aproximadamente el 40% de las bacterias secuenciadas y el 90% de las arqueas secuenciadas. CRISPR funciona como un sistema inmunitario procariota, ya que confiere resistencia a elementos genéticos exógenos tales como plásmidos y fagos. El sistema CRISPR proporciona una forma de inmunidad adquirida. Los segmentos cortos de ADN extraño, llamados separadores, se incorporan al genoma entre las repeticiones CRISPR y sirven como memoria de exposiciones pasadas. Los separadores CRISPR se utilizan luego para reconocer y silenciar elementos genéticos exógenos de una manera análoga al ARNi en organismos eucariotas.
Cas9, un componente proteico esencial en el sistema CRISPR/Cas Tipo II, forma una endonucleasa activa cuando forma un complejo con dos ARN denominados ARN CRISPR (ARNcr) y ARNcr trans-activador (ARNtracr), cortando de esta manera elementos genéticos extraños en fagos invasores o plásmidos para proteger las células anfitrionas. El ARNcr se transcribe a partir del elemento CRISPR en el genoma del anfitrión, que fue previamente capturado de tales invasores extraños. Recientemente, Jinek et al. (1) demostraron que un ARN quimérico de cadena sencilla producido al fusionar una porción esencial de ARNcr y ARNtracr podría reemplazar los dos ARN en el complejo Cas9/ARN para formar una endonucleasa funcional.
Los sistemas CRISPR/Cas ofrecen una ventaja a las proteínas de unión al ADN efectoras con dedo de zinc y activador de transcripción similar, ya que la especificidad de sitio en las proteínas CRISPR-Cas de unión a nucleótidos se rige por una molécula de ARN en lugar de la proteína de unión a ADN, que puede ser más difícil de diseñar y sintetizar.
Shan et al., Nature Biotechnology, vol. 31, no. 8, 08 August 2013, pages 686 - 688; Li et al., Nature Biotechnology, vol.
31, no. 8, 08 August 2013, pages 688 - 691; Nekrasov et al., Nature Biotechnology, vol. 31, no. 8, 08 August 2013, pages 691 - 693; Feng et al., Cell Research, vol. 23, no. 10, 20 August 2013, pages 1229 - 1232; Jiang et al., Nucleic Acids Research, vol. 41, no. 20, 02 de septiembre de 2013, páginas e188 - e188; y Miao et al., Cell Research, vol. 23, no. 10, 3 de septiembre de 2013, páginas 1233 - 1236 se refieren a la modificación del genoma mediada por CRISPR/Cas9 en plantas utilizando plásmidos de ADN que codifican Cas9 y ARNgu como vectores para la transformación de células vegetales.
Sin embargo, hasta ahora, no se ha desarrollado la edición del genoma en plantas utilizando una partícula de ribonucleoproteína, o RNP, que comprenda una endonucleasa guiada por a Rn (RGEN) basada en el sistema CRISPR/Cas.
Mientras tanto, el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es uno de los métodos más antiguos, convenientes y menos costosos de genotipado que todavía se utiliza ampliamente en biología molecular y genética, pero que a menudo está limitado por la falta de sitios apropiados reconocidos por endonucleasas de restricción.
Las mutaciones inducidas por nucleasa diseñadas por ingeniería se detectan mediante varios métodos, que incluyen ensayos de endonucleasa I T7 sensible a emparejamientos incorrectos (T7E1) o de nucleasa de Surveyor, RFLP, electroforesis capilar de productos de PCR fluorescentes, secuenciación didesoxi y secuenciación profunda. Los ensayos T7E1 y Surveyor se utilizan ampliamente, pero son engorrosos. Adicionalmente, estas enzimas tienden a subestimar las frecuencias de mutación porque las secuencias mutantes pueden formar homodúplex entre sí y no pueden distinguir los clones mutantes bialélicos homocigotos de las células de tipo silvestre. RFLP está libre de estas limitaciones y, por lo tanto, es un método de elección. De hecho, RFLP fue uno de los primeros métodos para detectar mutaciones mediadas por nucleasa diseñadas por ingeniería en células y animales. Desafortunadamente, sin embargo, RFLP está limitado por la disponibilidad de sitios de restricción apropiados. Es posible que no haya sitios de restricción disponibles en el sitio diana de interés.
Divulgación de invención
Hasta ahora, no se ha desarrollado un método de edición y genotipado del genoma en plantas que utilice un RNP que comprenda una endonucleasa guiada por ARN (RGEN) basada en el sistema CRISPR/Cas.
Bajo estas circunstancias, los presentes inventores han realizado muchos esfuerzos para desarrollar un método de edición del genoma en plantas basado en el sistema CRISPR/Cas y finalmente establecieron una endonucleasa guiada por ARN programable que escinde el ADN de una manera dirigida en plantas.
Además, los presentes inventores han realizado muchos esfuerzos para desarrollar un método novedoso de uso de endonucleasas guiadas por ARN (RGEN) en el análisis RFLP. Han utilizado RGEN para genotipar mutaciones recurrentes encontradas en cáncer y aquellas inducidas en células y organismos por nucleasas diseñadas por ingeniería que incluyen las propias RGEN, completando de esta manera la presente invención.
Resumen de la invención
Es un objeto de la presente invención es proporcionar una composición para escindir un ADN diana en plantas, o para introducir dos fragmentos en un ADN diana en plantas, que comprende un ARN guía específico para el ADN diana y Cas9.
Es otro objeto de la invención es proporcionar un protoplasto vegetal modificado utilizando la composición de la invención. Es un objeto adicional de la invención es proporcionar un método para escindir un ADN diana y un método para introducir dos fragmentos en diferentes hebras de un ADN diana, en un protoplasto vegetal. Es aún un objeto adicional de la invención es proporcionar un kit para escindir un ADN diana en una célula vegetal.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición de CRISPR/Cas9 para escindir un ADN diana en una célula vegetal, en la que el ADN diana es ADN endógeno, y en la que la composición comprende un complejo de (a) un polipéptido de proteína 9 (Cas9) asociada a CRISPR; y (b) un ARN guía específico para el ADN diana, en el que el ARN guía es (i) un ARN guía dual que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) y un ARNcr trans activador (ARNtracr); o (ii) un ARN guía de cadena sencilla que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) fusionado a un ARNcr trans activador (ARNtracr), en el que la composición comprende adicionalmente polietilenglicol (PEG).
En una realización, la composición comprende dos ARN guía, en el que cada ARN guía es específico para una de las hebras del ADN diana y en el que el polipéptido de Cas9 es una Cas9 nickasa.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un protoplasto vegetal que comprende (i) un ADN diana, en el que el ADN diana es ADN endógeno, y (ii) la composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la invención.
En un tercer, la invención proporciona un método para escindir un ADN diana en un protoplasto vegetal, en el que el ADN diana es ADN endógeno, preferiblemente ADN genómico, el método comprende introducir en el protoplasto vegetal un complejo de (a) un polipéptido de Cas9; y (b) un ARN guía específico para el ADN diana, en el que el ARN guía es (i) un ARN guía dual que comprende un a Rn de CRISPR (ARNcr) y un ARNcr trans activador (ARNtracr); o (ii) un ARN guía de cadena sencilla que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) fusionado a un ARNcr trans activador (ARNtracr), en el que la introducción es mediante transfección mediada por polietilenglicol (PEG).
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para introducir dos fragmentos en diferentes hebras de un ADN diana en un protoplasto vegetal, en el que el ADN diana es ADN endógeno, preferiblemente ADN genómico, el método comprende introducir en el protoplasto vegetal un complejo de (a) un polipéptido de Cas9, en el que el polipéptido de Cas9 es una Cas9 nickasa; y (b) dos ARN guía, en el que cada uno de los dos ARN guía es específico para una de las hebras del ADN diana, en el que el ARN guía es (i) un ARN guía dual que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) y un ARNcr trans activador (ARNtracr); o (ii) un ARN guía de cadena sencilla que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) fusionado a un ARNcr trans activador (ARNtracr), en el que la introducción es mediante transfección mediada por polietilenglicol (PEG).
En una realización del método anterior, los dos fragmentos se separan por al menos 100 pares base.
En ciertas realizaciones, la tranfección medida por PEG comprende transfección en un tampón de transfección al 40 %. En ciertas realizaciones, el tampón de transfección al 40 % comprende PEG4000 al 40 %, mannitol 200 mM y CaCl2 100 mM.
En un quinto aspecto, la invención proporciona un kit para escindir un ADN diana en una célula vegetal que comprende la composición de la invención.
En ciertas realizaciones, la proteína Cas9 es del género Streptococcus. En ciertas realizaciones, la proteína Cas9 es de Streptococcus pyogenes.
En ciertas realizaciones, la Cas9 nickasa es una forma mutante de Cas9 en la que el residuo de aspartato catalítico se cambia a cualquier otro aminoácido, preferiblemente alanina.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de Cas9 comprende una proteína Cas9 y una señal de localización nuclear (NLS), en la que la NLS está en el terminal N de la proteína Cas9.
En ciertas realizaciones, el ARNcr comprende dos nucleótidos de guanina adicionales en su extremo 5'.
En ciertas realizaciones, se determina la especificidad por el ARNcr, que comprende una región complementaria al ADN diana, en la que la región es de hasta 20 nucleótidos en longitud.
En ciertas realizaciones, el ADN diana es ADN genómico.
En ciertas realizaciones, el ADN diana comprende un motivo adyacente a un protoespaciador trinucleótido (PAM) reconocido por Cas9, en la que el PAM consiste en el trinucleótido 5-NGG-3'.
En ciertas realizaciones, la célula vegetal es un protoplasto.
La composición de la invención también se denomina aquí como “sistema”, “Composición de RGEN”, o “RGEN(s)”.
Se debe entender que cualquier referencia en el presente documento a embriones excluye a los embriones humanos, e igualmente se debe entender que cualquier referencia a animales excluye a los humanos.
Las composiciones de la invención se pueden utilizar para inducir mutagénesis dirigida en células vegetales.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra la escisión catalizada por Cas9 del ADN plasmídico in vitro. (a) Representación esquemática del ADN diana y secuencias de ARN quimérico. Los triángulos rojos indican los sitios de escisión. La secuencia PAM reconocida por Cas9 se muestra en negrita. Las secuencias del ARN guía derivadas de ARNcr y ARNtracr se muestran en recuadro y subrayadas, respectivamente. (b) Escisión in vitro del ADN plasmídico por Cas9. Se incubó un plásmido circular intacto o un plásmido digerido con ApaLI con Cas9 y ARN guía.
La Fig. 2 muestra la mutagénesis inducida por Cas9 en un sitio diana episomal. (a) Descripción esquemática de los ensayos basados en células utilizando un indicador RFP-GFP. GFP no se expresa a partir de este indicador porque la secuencia de GFP se fusiona con la secuencia de RFP fuera del marco. La proteína de fusión RFP-GFP se expresa solo cuando el sitio diana entre las dos secuencias se escinde por una nucleasa específica de sitio. (b) Citometría de flujo de células transfectadas con Cas9. Se indica el porcentaje de células que expresan la proteína de fusión RFP-GFP.
La Fig. 3 muestra mutaciones impulsadas por RGEN en sitios cromosómicos endógenos. (a) Locus CCR5. (b) Locus C4BPB. (Arriba) El ensayo T7E1 se utilizó para detectar mutaciones impulsadas por RGEN. Las flechas indican la posición esperada de las bandas de ADN escindidas por T7E1. Se calcularon las frecuencias de mutación (Indeles (%)) al medir las intensidades de la banda. (Abajo) Secuencias de ADN de los clones mutantes y de tipo silvestre (WT) de CCR5 y C4BPB. La región de la secuencia diana complementaria al ARN guía se muestra en el recuadro. La secuencia de PAM se muestra en negrita. Los triángulos indican el sitio de escisión. Las bases correspondientes a las microhomologías están subrayadas. La columna de la derecha indica el número de bases insertadas o suprimidas.
La Fig. 4 muestra que las mutaciones fuera de diana impulsadas por RGEN son indetectables. (a) Secuencias en diana y fuera de diana posibles. El genoma humano se buscó in silico en busca de posibles sitios fuera de diana. Se identificaron cuatro sitios, cada uno de los cuales tiene emparejamientos erróneos de 3 bases con el sitio en diana de CCR5. Las bases que no emparejadas están subrayadas. (b) Se utilizó el ensayo T7E1 para investigar si estos sitios estaban mutados en células transfectadas con el complejo de Cas9/ARN. No se detectaron mutaciones en estos sitios. N/A (no aplicable), un sitio intergénico. (c) Cas9 no indujo supresiones cromosómicas asociadas fuera de diana. La RGEN y ZFN específicas de CCR5 se expresaron en células humanas. Se utilizó PCR para detectar la inducción de supresiones cromosómicas de 15 kb en estas células.
La Fig. 5 muestra el direccionamiento del gen Foxn1 inducido por RGEN en ratones. (a) Un diagrama esquemático que representa un ARNgu de exón 2 del gen PAM de Foxn1 de ratón en el exón 2 se muestra en rojo y la secuencia en el ARNgu que es complementaria al exón 2 está subrayada. Los triángulos indican los sitios de escisión. (b) Ensayos de T7E1 representativos que demuestran las eficiencias de direccionamiento de genes de ARNm de Cas9 más ARNg específico de Foxn1 que se suministraron mediante inyección intracitoplasmática en embriones de ratón en etapa de una célula. Los números indican ratones ubicadores independientes generados a partir de la dosis más alta. Las flechas indican bandas escindidas por T7E1. (c) Las secuencias de ADN de alelos mutantes observadas en tres ubicadores mutantes Foxn1 identificados en el número de apariciones se muestran entre paréntesis. (d) Genotipado por PCR de las progenies F1 derivadas del cruce del ubicador #108 de Foxn1 y FVB/NTac de tipo silvestre. Nótese la segregación de los alelos mutantes encontrados en el ubicador #108 de Foxn1 en las progenies.
La Fig. 6 muestra el direccionamiento del gen Foxnl en embriones de ratón mediante inyección intracitoplasmática de ARNm de Cas9 y ARNgu de Foxn1. (a) Un resultado representativo de un ensayo T7E1 que monitoriza la tasa de mutación después de inyectar la dosis más alta. Las flechas indican bandas escindidas por T7E1. (b) Un resumen de los resultados del ensayo T7E1. Se indican las fracciones mutantes entre los embriones cultivados in vitro obtenidos después de inyección intracitoplasmática de las dosis de RGEN indicadas. (c) Secuencias de ADN de alelos mutantes Foxn1 identificados a partir de un subconjunto de embriones mutantes positivos para T7E1. La secuencia diana del alelo de tipo silvestre se indica en el recuadro.
La Fig. 7 muestra el direccionamiento del gen Foxn1 en embriones de ratón utilizando la proteína Cas9 recombinante: complejo de Foxn1-ARNgu. (a) y (b) son resultados de ensayos T7E1 representativos y sus resúmenes. Los embriones se cultivaron in vitro después de que se sometieron a inyección pronuclear (a) o intracitoplasmática (b). Los números en rojo indican ratones ubicadores mutantes positivos para T7E1. (c) Secuencias de ADN de alelos mutantes de Foxn1 identificadas a partir de embriones cultivados in vitro que se obtuvieron mediante la inyección de pronúcleo de proteína Cas9 recombinante: complejo de Foxn1-ARNgu a la dosis más alta. La secuencia diana del alelo de tipo silvestre se indica en el recuadro.
La Fig. 8 muestra la transmisión de la línea germinal de los alelos mutantes encontrados en el ubicador #2 mutante Foxn1. (a) análisis de fPCR. (b) Genotipado por PCR de FVB/NTac de tipo silvestre, el ratón ubicador y sus progenies F1.
La Fig. 9 muestra genotipos de embriones generados al cruzar ubicadores mutantes Prkdc. Los ubicadores mutantes •*, Q Q Prkdc L 25 y -15 se cruzaron y se aislaron embriones E13.5. (a) análisis de fPCR del ubicador L 25 y ubicador -15 de tipo silvestre. Nótese que, debido a las limitaciones técnicas del análisis de fPCR, estos resultados mostraron pequeñas diferencias con respecto a las secuencias precisas de los alelos mutantes; por ejemplo, a partir del análisis de secuencia, se identificaron A269/A61/WT y A5+1/+7/+12/WT en los ubicadores C. 25 y O -15 , respectivamente, (b) Genotipos de los embriones generados.
La Fig. 10 muestra una mutación dirigida inducida por el complejo de proteína Cas9/ARNgu.
La Fig. 11 muestra mutaciones inducidas por la proteína Cas9 recombinante en protoplastos de Arabidopsis.
La Fig. 12 muestra secuencias mutantes inducidas por la proteína Cas9 recombinante en el gen BRI1 de Arabidopsis.
La Fig. 13 muestra el ensayo T7E1 que muestra la interrupción del gen CCR5 endógeno en células 293 mediante el tratamiento de Cas9-mal-9R4L y el complejo de ARNgu/C9R4LC.
La Fig. 14 (a, b) muestra las frecuencias de mutación en los sitios en diana y fuera de diana de las RGEN indicadas en Fu et al. (2013). Ensayos T7E1 que analizan el ADN genómico de las células K562 (R) transfectadas en serie con 20 pg de plásmido que codifica Cas9 y con 60 pg y 120 pg de ARNcr y ARNtracr de GX-ig transcritos in vitro, respectivamente (1 x 106 células), o (D) cotransfectadas con 1 pg de plásmido que codifica Cas9 y 1 pg de plásmido de expresión de ARNgu de GX-ig (2 x 105 células).
La Fig. 15 (a, b) muestra la comparación de la estructura del ARN guía. Las frecuencias de mutación de las RGEN indicadas en Fu et al. (2013) se midieron en sitios en diana y fuera de diana utilizando el ensayo T7E1. Las células K562 se cotransfectaron con el plásmido que codifica Cas9 y el plásmido que codifica el ARNgu de GX-ig o el ARNgu de GGX20. Los sitios fuera de diana (OT1-3, etc.) se marcaron como en Fu et al. (2013).
La Fig. 16 muestra la escisión del ADN in vitro por las nickasas Cas9. (a) Descripción esquemática de la nucleasa Cas9 y la nickasa Cas9 emparejada. Las secuencias de PAM y los sitios de escisión se muestran en el recuadro. (b) Sitios diana en el locus AAVS1 humano. La posición de cada sitio diana se muestra en un triángulo. (c) Descripción esquemática de las reacciones de escisión del ADN. Los tintes FAM (mostrados en el recuadro) se unieron a ambos extremos 5' el sustrato de ADN. (d) DSB y SSB analizadas mediante electroforesis capilar fluorescente. Los sustratos de ADN marcados con fluorescencia se incubaron con nucleasas o nickasas Cas9 antes de electroforesis.
La Fig. 17 muestra la comparación del comportamiento de la nucleasa y nickasa Cas9. (a) Frecuencias de mutación en diana asociadas con nucleasas Cas9 (WT), nickasas (D10A) y nickasas emparejadas Se indican nickasas emparejadas que producirían salientes 5' salientes 3' (b) Análisis de los efectos fuera de diana de las nucleasas Cas9 y las nickasas emparejadas. Se analizaron un total de siete sitios potenciales fuera de diana para tres ARNgu.
La Fig. 18 muestra nickasas Cas9 emparejadas probadas en otros loci humanos endógenos. (a, c) Los sitios diana de ARNgu en los loci CCR5 y BRCA2 humanos. Las secuencias de PAM se indican en rojo. (b, d) Las actividades de edición del genoma en cada sitio diana se detectaron mediante el ensayo T7E1. La reparación de dos fragmentos que producirían salientes de 5' condujo a la formación de indeles con mucha más frecuencia que las que producían salientes de 3'.
La Fig. 19 muestra que las nickasas Cas9 emparejadas median la recombinación homóloga. (a) Estrategia para detectar recombinación homóloga. El ADN del donante incluía un sitio de enzima de restricción XbaI entre dos brazos de homología, mientras que el sitio diana endógeno carecía de este sitio. Se utilizó un ensayo de PCR para detectar secuencias que habían sufrido una recombinación homóloga. Para evitar la amplificación del ADN del donante contaminante, se utilizaron cebadores específicos del ADN genómico. (b) Eficiencia de la recombinación homóloga. Sólo los amplicones de una región en la que se había producido una recombinación homóloga podían digerirse con XbaI; las intensidades de las bandas de escisión se utilizaron para medir la eficacia de este método.
La Fig. 20 muestra el corte y empalme de ADN inducido por nickasas Cas9 emparejadas. (a) Los sitios diana de las nickasas emparejadas en el locus AAVS1 humano. Se muestran las distancias entre el sitio AS2 y cada uno de los otros sitios. Las flechas indican cebadores de PCR. (b) Supresiones genómicas detectadas utilizando PCR. Los asteriscos indican productos de PCR específicos de supresión. (c) Secuencias de ADN de productos de PCR específicos de supresión obtenidos utilizando ARNgu de AS2 y L1. Las secuencias de PAM del sitio diana se muestran en un recuadro y las secuencias de emparejamiento de ARNgu se muestran en letras mayúsculas. Las secuencias de emparejamiento de ARNgu intactas están subrayadas. (d) Un modelo esquemático de supresiones cromosómicas emparejadas mediadas por nickasas Cas9. Las hebras de ADN recién sintetizadas se muestran en el recuadro.
La Fig. 21 muestra que las nickasas Cas9 emparejadas no inducen translocaciones. (a) Descripción esquemática de las translocaciones cromosómicas entre los sitios en diana y fuera de diana. (b) Amplificación por PCR para detectar translocaciones cromosómicas. (c) Translocaciones inducidas por nucleasas Cas9 pero no por el par de nickasa.
La Fig. 22 muestra un diagrama conceptual de los ensayos T7E1 y RFLP. (a) Comparación de reacciones de escisión del ensayo en cuatro escenarios posibles después del tratamiento con nucleasa diseñada por ingeniería en una célula diploide: (A) tipo silvestre, (B) una mutación monoalélica, (C) diferentes mutaciones bialélicas (hetero) y (D) mutaciones bialélicas idénticas (homo). Las líneas negras representan productos de PCR derivados de cada alelo; Los recuadros de trazos y puntos indican mutaciones de inserción/supresión generadas por NHEJ. (b) Resultados esperados de la digestión de T7E1 y RGEN resueltos por electroforesis.
La Fig. 23 muestra un ensayo de escisión in vitro de un plásmido linealizado que contiene el sitio diana C4BPB que lleva indeles. Secuencias de ADN de sustratos de plásmido individuales (panel superior). La secuencia PAM está subrayada. Las bases insertadas se muestran en el recuadro. Las flechas (panel inferior) indican las posiciones esperadas de las bandas de ADN escindidas por la RGEN específica de tipo silvestre después de electroforesis.
La Fig. 24 muestra la genotipado de mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas por ingeniería en células a través de RFLP mediada por RGEn . (a) Genotipo de clones de células K562 mutantes de C4BPB. (b) Comparación del ensayo T7E1 sensible a emparejamiento erróneo con análisis de RFLP mediado por RGEN. Las flechas negras indican el producto de escisión por tratamiento de Enzima T7E1 o RGEN.
La Fig. 25 muestra el genotipado de mutaciones inducidas por RGEN mediante la técnica de RGEN-RFLP. (a ) Análisis de clones interrumpidos en C4BPB utilizando ensayos de RGEN-RFLP y T7E1. Las flechas indican las posiciones esperadas de las bandas de ADN escindidas por de o T7E1. (b) Comparación cuantitativa del análisis de RGEN-RFLP con ensayos de T7E1. Se mezclaron muestras de ADN genómico de células K562 de tipo silvestre y con interrupción de C4BPB en diversas relaciones y se sometieron a amplificación por PCR. (c) Genotipado de mutaciones inducidas por RGEN en el gen HLA-B en células HeLa con análisis RFLP y T7E1.
La Fig. 26 muestra el genotipado de mutaciones inducidas por nucleasas diseñadas por ingeniería en organismos mediante RFLP mediada por RGEN. (a) Genotipo de ratones ubicadores mutantes Pibfl. (b) Comparación del ensayo de T7E1 sensible al emparejamiento erróneo con el análisis de RFLP mediada por RGEN. Las flechas negras indican el producto de escisión por tratamiento de la enzima T7E1 o RGEN.
La Fig. 27 muestra el genotipado mediado por RGEN de mutaciones inducidas por ZFN. El sitio diana de ZFN se muestra en el recuadro. Las flechas negras indican bandas de ADN escindidas por T7E1.
La Fig. 28 muestra sitios polimórficos en una región del gen HLA-B humano. La secuencia, que rodea el sitio diana de RGEN, es la de un amplicón de PCR de células HeLa. Las posiciones polimórficas se muestran en el recuadro. El sitio diana de RGEN y la secuencia de PAM se muestran en recuadros de trazos y negrita, respectivamente. Las secuencias de cebadores están subrayadas.
La Fig. 29 muestra el genotipado de mutaciones oncogénicas mediante análisis de RGEN-RFLP. (a) Las RGEN detectaron una mutación recurrente (c. supresión 133-135 de TCT) en el gen CTNNB1 humano en células HCT116. Se utilizaron células HeLa como control negativo. (b) Genotipado de la mutación de sustitución de KRAS (c.34 G> A) en la estirpe celular de cáncer A549 con RGEN que contienen ARN guía con emparejado erróneo. Los nucleótidos con emparejado erróneo se muestran en el recuadro. Se utilizaron células HeLa como control negativo. Las flechas indican bandas de ADN escindidas por RGEN. Se muestran las secuencias de ADN confirmadas por secuenciación de Sanger.
La Fig. 30 muestra el genotipado del alelo CCR5 delta32 en células HEK293T mediante análisis de RGEN-RFLP. (a) Ensayos de RGEN-RFLP de estirpes celulares. Se utilizaron células K562, SKBR3 y HeLa como controles de tipo silvestre. Las flechas indican bandas de ADN escindidas por RGEN. (b) Secuencia de ADN de los alelos CCR5 y delta32 de tipo silvestre. Tanto en los sitios en diana como fuera de diana de las RGEN utilizadas en el análisis RFLP están subrayados. En el recuadro se muestra un emparejamiento erróneo de un solo nucleótido entre los dos sitios. La secuencia de PAM está subrayada. (c) Escisión in vitro de plásmidos que albergan alelos CCR5 WT o del32 utilizando la RGEN específica de tipo silvestre. (d) Confirmación de la presencia de un sitio fuera de diana de la RGEN específica de CCR5-delta32 en el locus CCR5. Ensayos de escisión in vitro de plásmidos que albergan secuencias en diana o fuera de diana utilizando diversas cantidades de la RGEN específica de del32.
La Fig. 31 muestra el genotipado de una mutación puntual de KRAS (c. 34 G> A). (a) Análisis de RGEN-RFLP de la mutación KRAS (c.34 G> A) en estirpes celulares de cáncer. Los productos de PCR de las células HeLa (utilizadas como control de tipo silvestre) o las células A549, que son homocigotas para la mutación puntual, se digirieron con RGEN con ARNcr perfectamente emparejado específico para la secuencia de tipo silvestre o la secuencia mutante. Se confirmaron los genotipos de KRAS en estas células por secuenciación de Sanger. (b) Los plásmidos que albergan las secuencias de KRAS de tipo silvestre o mutante se digirieron utilizando RGEN con ARNcr perfectamente emparejados o ARNcr atenuados de una base con emparejamiento erróneo. Los ARNcr atenuados que se eligieron para la genotipado están marcados en el recuadro encima de los geles.
La Fig. 32 muestra el genotipado de una mutación puntual de PIK3CA (c.3140 A> G). (a) Análisis de RGEN-RFLP de la mutación PIK3CA (c.3140 A> G) en estirpes celulares de cáncer. Los productos de PCR de células HeLa (utilizadas como control de tipo silvestre) o células HCT116 que son heterocigotas para la mutación puntual se digirieron con RGEN con ARNrc perfectamente emparejado específico para la secuencia de tipo silvestre o la secuencia mutante Se confirmaron los genotipos de PIK3CA en estas células por secuenciación de Sanger. (b) Los plásmidos que albergan las secuencias de PIK3CA de tipo silvestre o mutante se digirieron utilizando RGEN con ARNcr perfectamente emparejados o ARNcr atenuados, de una base con emparejamiento erróneo. Los ARNcr atenuados que se eligieron para la genotipado están marcados en el recuadro encima de los geles.
La Fig. 33 muestra el genotipado de mutaciones puntuales recurrentes en estirpes celulares de cáncer. (a) Ensayos de RGEN-RFLP de mutaciones puntuales oncogénicas recurrentes en genes IDH (c.394C> T, (b) PIK3CA (c.3140A> G, (c) NRAS (c.181C> A, (d) y BRAF (c.1799T>A. Se muestran los genotipos de cada estirpe celular confirmada por la secuenciación de Sanger. Los nucleótidos con emparejamiento erróneo se muestran en el recuadro. Las flechas negras indican las bandas de ADN escindidas por las RGEn .
Descripción detallada
De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona una composición para escindir el ADN diana en plantas, de este modo como un protoplasto vegetal que comprende la composición, como se define en las reivindicaciones. Además, la presente invención proporciona un uso de la composición para escindir el ADN diana en plantas.
En la presente invención, la composición también se denomina composición de endonucleasa guiada por ARN (RGEN).
Las ZFN y TALEN permiten la mutagénesis dirigida en células de mamíferos, organismos modelo, plantas y ganado, pero las frecuencias de mutación obtenidas con nucleasas individuales son muy diferentes entre sí. Adicionalmente, algunas ZFN y TALEN no muestran ninguna actividad de edición del genoma. La metilación del ADN puede limitar la unión de estas nucleasas diseñadas por ingeniería a los sitios diana. Además, es técnicamente desafiante y requiere mucho tiempo hacer nucleasas personalizadas.
Los presentes inventores han desarrollado una nueva composición de endonucleasa guiada por ARN basada en la proteína Cas9 para superar las desventajas de las ZFN y TALEN.
Antes de la presente invención, se conocía una actividad endonucleasa de las proteínas Cas. Sin embargo, no se ha sabido si la actividad endonucleasa de la proteína Cas funcionaría en una célula eucariota debido a la complejidad del genoma eucariota. Adicionalmente, hasta ahora, no se ha desarrollado una composición que comprenda la proteína Cas o el ácido nucleico que codifica la proteína Cas y un ARN guía específico para el ADN diana para escindir un ADN diana en células u organismos eucariotas.
En comparación con las ZFN y TALEN, la presente composición de RGEN basada en la proteína Cas9 se puede personalizar más fácilmente porque solo se reemplaza el componente de ARN guía sintético para producir una nueva nucleasa de edición del genoma. No se requieren etapas de subclonación para hacer endonucleasas guiadas por ARN personalizadas. Además, el tamaño relativamente pequeño del gen Cas (por ejemplo, 4.2 kpb para Cas9) en comparación con un par de genes TALEN (~6 kpb) proporciona una ventaja para esta composición de endonucleasa guiada por ARN en algunas aplicaciones tales como el suministro de genes mediado por virus. Adicionalmente, esta endonucleasa guiada por ARN no tiene efectos fuera de diana y, por lo tanto, no induce mutaciones, supresiones, inversiones y duplicaciones no deseadas. Estas características hacen que la presente composición de endonucleasa guiada por ARN sea una herramienta escalable, versátil y conveniente para el diseño por ingeniería del genoma en células y organismos eucariotas. Además, RGEN se puede diseñar para dirigirse a cualquier secuencia de ADN, casi cualquier polimorfismo de un solo nucleótido o pequeña inserción/supresión (indel) se puede analizar mediante RFLP mediado por RGEN. La especificidad de las RGEN está determinada por el componente de ARN que se hibrida con una secuencia de ADN diana de hasta 20 pares de bases (pb) de longitud y por la proteína Cas9 que reconoce el motivo adyacente al protoseparador (PAM). Las RGEN se reprograman fácilmente al reemplazar el componente de ARN. Por lo tanto, las RGEN proporcionan una plataforma para utilizar análisis RFLP simples y robustos para diversas variaciones de secuencia.
El ADN diana puede ser un ADN endógeno o un ADN artificial, preferiblemente un ADN endógeno.
Como se utiliza en el presente documento, el término “proteína Cas9” se refiere a un componente de proteína esencial en el sistema CRISPR/Cas9, forma una endonucleasa activa o nickasa cuando forma un complejo con dos ARN denominados ARN CRISPR (ARNcr) y ARNcr transactivador (ARNtracr).
La información sobre el gen y la proteína de Cas está disponible en GenBank del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), sin limitación.
Los genes asociados a CRISPR (cas) que codifican proteínas Cas se asocian a menudo con matrices de separadores de repetición CRISPR. Se han descrito más de cuarenta familias de proteínas Cas diferentes. De estas familias de proteínas, Cas1 parece ser ubicua entre los diferentes sistemas CRISPR/Cas. Hay tres tipos de sistema CRISPR-Cas. Entre ellos, el sistema CRISPR/Cas de tipo II que involucra la proteína Cas9 y el ARNcr y ARNtracr es representativo y es bien conocido. Se han utilizado combinaciones particulares de genes cas y estructuras repetidas para definir 8 subtipos de CRISPR (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern y Mtube).
La proteína Cas se puede vincular a un dominio de transducción de proteínas. El dominio de transducción de proteínas puede ser poliarginina o una proteína TAT derivada del VIH, pero no se limita a ellos.
En la presente invención, la proteína Cas9 puede ser cualquier proteína Cas9 siempre que tenga una actividad endonucleasa o nickasa cuando forma un complejo con un ARN guía.
El término proteína Cas9 puede incluir variantes de la misma. La variante de la proteína Cas9 puede ser una forma mutante de Cas9 en la que el residuo de aspartato catalítico se cambia a cualquier otro aminoácido. Preferiblemente, el otro aminoácido puede ser una alanina, pero no se limita a ello.
Adicionalmente, la proteína Cas9 puede ser la aislada de un organismo tal como Streptococcus sp., Preferiblemente Streptococcus pyogens o una proteína recombinante, pero no se limita a ello.
La proteína Cas9 derivada de Streptococcus pyogens puede reconocer el trinucleótido NGG. La proteína Cas9 puede comprender una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 109, pero no se limita a la misma.
El término “recombinante” cuando se utiliza con referencia, por ejemplo, a una célula, ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heteróloga o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula se deriva de una célula de este modo modificada. De este modo, por ejemplo, se puede generar una proteína Cas9 recombinante al reconstituir la secuencia que codifica la proteína Cas9 utilizando la tabla de codones humanos.
La secuencia que codifica Cas9 se puede derivar de Streptococcus sp., y preferiblemente derivarse de Streptococcus pyogenes. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica Cas9 puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID. NO: 1. Más aún, el ácido nucleico que codifica Cas9 puede comprender la secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos 50 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, o 99 % a la SEQ ID NO: 1, pero no se limita a la misma. El ácido nucleico que codifica Cas9 puede comprender la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO 108, 110, 106 o 107.
Como se utiliza en el presente documento, el término “ARN guía” se refiere a un ARN que es específico para el ADN diana y puede formar un complejo con la proteína Cas9 y llevar la proteína Cas9 al ADN diana.
En la presente invención, el ARN guía puede consistir en dos moléculas de ARN, es decir, ARN CRISPR (ARNcr) y ARNcr transactivador (ARNtracr) o ser un ARN de cadena sencilla (ARNgu) producido por fusión de una porción esencial de ARNcr y ARNtracr.
El ARN guía puede ser un ARN dual que comprende un ARNcr y un ARNtracr.
Si el ARN guía comprende la porción esencial de ARNcr y ARNtracr y una porción complementaria a una diana, se puede utilizar cualquier ARN guía en la presente invención.
El ARNcr puede hibridar con un ADN diana.
La RGEN puede consistir en proteína Cas9 y ARN dual (ARNcr invariable y ARNcr específico de diana), o proteína Cas9 y ARNgu (fusión de una porción esencial de ARNtra invariable y ARNcr específico de diana), y se puede reprogramar fácilmente al reemplazar ARNcr.
El ARN guía comprende además uno o más nucleótidos adicionales en el extremo 5' del ARN guía de cadena sencilla o el ARNcr del a Rn dual.
Preferiblemente, el ARN guía comprende adicionalmente 2 nucleótidos de guanina adicionales en el extremo 5' del ARN guía de cadena sencilla o el ARNcr del ARN dual.
El ARN guía se puede transferir a una célula u organismo en forma de ARN o ADN que codifica el ARN guía. El ARN guía puede estar en forma de ARN aislado, ARN incorporado en un vector viral o codificado en un vector. Preferiblemente, el vector puede ser un vector viral, un vector plasmídico o un vector de agrobacterium, pero no se limita a ellos.
Un ADN que codifica el ARN guía puede ser un vector que comprende una secuencia que codifica el ARN guía. Por ejemplo, el ARN guía puede transferirse a una célula u organismo al transfectar la célula u organismo con el ARN guía aislado o el ADN plásmido que comprende una secuencia que codifica el ARN guía y un promotor.
Alternativamente, el ARN guía se puede transferirse a una célula u organismo utilizando el suministro de genes mediado por virus.
Cuando el ARN guía se transfecta en forma de ARN aislado en una célula u organismo, el ARN guía se puede preparar mediante transcripción in vitro utilizando cualquier sistema de transcripción in vitro conocido en la técnica. El ARN guía se transfiere preferiblemente a una célula en forma de ARN aislado en lugar de en forma de plásmido que comprende la secuencia codificante de un ARN guía. Como se utiliza en el presente documento, el término “ARN aislado” puede ser intercambiable por “ARN desnudo”. Esto ahorra tiempo y dinero porque no requiere una etapa de clonación. Sin embargo, no se excluye el uso de ADN plasmídico o suministro de genes mediado por virus para la transfección del ARN guía.
La presente composición de RGEN que comprende la proteína Cas9 y un ARN guía puede escindir específicamente un ADN diana debido a una especificidad del ARN guía para una diana y una actividad endonucleasa o nickasa de la proteína Cas9.
Como se utiliza en el presente documento, el término “escisión” se refiere a la ruptura de la estructura principal covalente de una molécula de nucleótido.
En la presente invención, se puede preparar un ARN guía para que sea específico para cualquier diana que se deba escindir. Por lo tanto, la presente composición de RGEN puede escindir cualquier a Dn diana al manipular o genotipar la porción específica de la diana del ARN guía.
El ARN guía y la proteína Cas9 pueden funcionar como un par. Como se utiliza en el presente documento, el término “nickasa Cas9 emparejada” se puede referir al ARN guía y la proteína Cas9 que funcionan como un par. El par comprende dos ARN guía. El ARN guía y la proteína Cas9 pueden funcionar como un par e inducir dos fragmentos en diferentes hebras de ADN. Los dos fragmentos pueden estar separados por al menos 100 bps, pero no se limitan a estos.
En los ejemplos, los presentes inventores confirmaron que las nickasas Cas9 emparejadas permiten mutagénesis dirigida y grandes supresiones de segmentos cromosómicos de hasta 1 kpb en células humanas. Es importante destacar que las nickasas emparejadas no indujeron indeles en sitios fuera de diana en los que sus correspondientes nucleasas inducen mutaciones. Adicionalmente, a diferencia de las nucleasas, las nickasas emparejadas no promovieron translocaciones no deseadas asociadas con escisiones de ADN fuera de diana. En principio, las nickasas emparejadas duplican la especificidad de la mutagénesis mediada por Cas9 y ampliarán la utilidad de las enzimas guiadas por ARN en aplicaciones que requieren una edición precisa del genoma, tal como la terapia génica y celular.
En una realización específica, el ARN guía puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, en la que la parte de la posición de nucleótidos 3~22 es una porción específica de diana y, por lo tanto, la secuencia de esta porción se puede cambiar dependiendo de la diana.
Como se utiliza en el presente documento, una célula u organismo eucariota puede ser células de levadura, hongo, protozoos, plantas, plantas superiores e insectos o anfibios, o células de mamíferos como CHO, HeLa, HEK293 y COS-1, por ejemplo, células cultivadas (in vitro), células de injerto y cultivo de células primarias (in vitro y ex vivo), y células in vivo, y también células de mamíferos, que incluyen humanas, que se utilizan comúnmente en la técnica, sin limitación.
Se encontró que la proteína Cas9/ARN guía de cadena sencilla podían generar rupturas de doble hebra de ADN específicas de sitio in vitro y en células de mamífero, cuya reparación espontánea inducía mutaciones genómicas dirigidas a frecuencias altas.
Más aún, se descubrió que se podrían inducir ratones con genes inactivados mediante la inyección de complejos de proteína Cas9/ARN guía o ARNm de Cas9/ARN guía en un embrión de una célula y se podrían generar mutaciones transmisibles de la línea germinal mediante el sistema Cas9/ARN guía.
El uso de la proteína Cas9 en lugar de un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 para inducir una mutagénesis dirigida es ventajoso porque no se introduce ADN exógeno en un organismo. Por lo tanto, la composición que comprende la proteína Cas9 y un ARN guía se puede utilizar para desarrollar cultivos terapéuticos o de valor agregado, ganado, aves, peces, mascotas, etc.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición para inducir mutagénesis dirigida en plantas, como se define en las reivindicaciones. Además, la presente invención proporciona un uso de la composición para inducir mutagénesis dirigida en plantas.
Un ARN guía, un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 son como se describió anteriormente.
La composición de la invención se puede proporcionar en un kit para escindir un ADN diana o inducir mutagénesis dirigida en plantas.
Un ARN guía, un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 son como se describió anteriormente.
El kit puede comprender un ARN guía y una proteína Cas9 como componentes separados o como una composición.
El presente kit puede comprender algunos componentes adicionales necesarios para transferir el ARN guía y el componente de Cas9 a una célula u organismo. Por ejemplo, el kit puede comprender un tampón de inyección, tal como un tampón de inyección tratado con DEPC, y materiales necesarios para el análisis de la mutación de un ADN diana, pero no se limitan a estos.
La composición de la invención se puede utilizar en un método para preparar un protoplasto vegetal que comprende transfectar la planta con un complejo que comprende la proteína Cas9 y un ARN guía.
Un ARN guía, un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 son como se describió anteriormente.
Generalmente, un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 y un ARN o ADN guía que codifica el ARN guía se pueden transferir a una célula mediante varios métodos conocidos en la técnica, tales como microinyección, electroporación, tratamiento con DEAE-dextrano, lipofección, transfección mediada por nanopartículas, transducción mediada por dominio de transducción de proteínas, suministro de genes mediado por virus y transfección mediada por PEG en protoplasto, y así sucesivamente, pero sin limitarse a esto. También, una proteína Cas9 que codifica un ácido nucleico o una proteína Cas9 y un ARN guía pueden transferirse a un organismo mediante varios métodos conocidos en la técnica para administrar un gen o una proteína tal como una inyección. Un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 o una proteína Cas9 se puede transferir a una célula en forma de complejo con un ARN guía, o por separado. La proteína Cas9 fusionada a un dominio de transducción de proteínas tal como Tat también se puede suministrar de manera eficiente a las células.
Preferiblemente, la célula u organismo eucariótico se cotransfecta o transfecta en serie con una proteína Cas9 y un ARN guía.
La transfección en serie se puede realizar mediante transfección con ácido nucleico que codifica la proteína Cas9 primero, seguido de una segunda transfección con ARN guía desnudo. Preferiblemente, la segunda transfección es después de 3, 6, 12, 18, 24 horas, pero no se limita a esto.
Las células eucariotas divulgadas en el presente documento pueden ser células de levadura, hongos, protozoos, plantas superiores e insectos o anfibios, o células de mamíferos tales como CHO, HeLa, HEK293 y COS-1, por ejemplo, células cultivadas (in vitro), células de injerto y cultivo de células primarias (in vitro y ex vivo) y células in vivo, y también células de mamíferos, que incluyen las humanas, que se utilizan comúnmente en la técnica, sin limitación. Adicionalmente, el organismo puede ser levadura, hongo, protozoo, planta, planta superior, insecto, anfibio o mamífero.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para escindir un ADN diana o inducir mutagénesis dirigida en protoplastos vegetales, que comprenden una etapa de tratamiento de un protoplasto vegetal que comprende un ADN diana con una composición de la invención.
La etapa de tratar un protoplasto vegetal con la composición se puede realizar al transferir la presente composición que comprende un ARN guía específico para el ADN diana y la proteína Cas9 al protoplasto vegetal.
Como se describió anteriormente, dicha transferencia se puede realizar mediante transfección mediada por PEG.
Las composiciones de RGEN de la invención se pueden utilizar para producir una planta regenerada a partir de los protoplastos modificados por genoma preparados mediante el método de la invención.
Ejemplos
A continuación, se describirá la presente invención con más detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos y no se pretende que la invención quede limitada por estos Ejemplos.
Ejemplo 1: Ensayo de edición de genoma (ejemplo de referencia)
1-1. Actividad de escisión del ADN de la proteína Cas9
En primer lugar, se probó la actividad de escisión del ADN de Cas9 derivado de Streptococcus pyogenes en presencia 0 ausencia de un ARN guía quimérico in vitro.
Con este fin, se utilizó proteína Cas9 recombinante que se expresó y se purificó a partir de E. coli para escindir un ADN plasmídico circular o predigerido que contenía la secuencia diana CCR5 humana de 23 pares de bases (pb). Una secuencia diana de Cas9 consiste en una secuencia de ADN de 20 pb complementaria a ARNcr o un ARN guía quimérico y el motivo adyacente al protoseparador (PAM) trinucleótido (5'-NGG-3') reconocido por el propio Cas9 (Fig. 1A).
Específicamente, la secuencia que codifica Cas9 (4.104 pb), derivada de la cepa Streptococcus pyogenes M1 GAS (NC_002737.1), se reconstituyó utilizando la tabla de uso de codones humanos y se sintetizó utilizando oligonucleótidos. En primer lugar, se ensamblaron segmentos de ADN de 1 kb utilizando oligonucleótidos de ~35-mer superpuestos y polimerasa Phusion (New England Biolabs) y se clonaron en el vector T (SolGent). Se ensambló una secuencia Cas9 de longitud completa utilizando cuatro segmentos de ADN de 1 kpb mediante PCR superpuesta. El segmento de ADN que codifica Cas9 se subclonó en p3s, que se derivó de pcDNA3.1 (Invitrogen). En este vector, se agregó una etiqueta peptídica (NH2-GGSGPPKKKRKVYPYDVPDYA-COOH, SEQ ID NO: 2) que contenía el epítopo HA y una señal de localización nuclear (NLS) al terminal C de Cas9. La expresión y localización nuclear de la proteína Cas9 en células HEK 293T se confirmaron mediante transferencia Western utilizando anticuerpo anti-HA (Santa Cruz).
A continuación, se subclonó el casete Cas9 en pET28-b(+) y se transformó en BL21 (DE3). La expresión de Cas9 se indujo utilizando IPTG 0.5 mM durante 4 h a 25a La proteína Cas9 que contiene la etiqueta His6 en el terminal C se purificó utilizando resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen) y se dializó contra HEPES 20 mM (pH 7.5), KC1 150 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10 % (1). Se incubó Cas9 purificado (50 nM) con ADN plasmídico superenrollado o predigerido (300 ng) y ARN quimérico (50 nM) en un volumen de reacción de 20 pl en tampón NEB 3 durante 1 h a 37 h. El ADN digerido se analizó mediante electroforesis utilizando geles de agarosa al 0.8%.
Cas9 escindió el ADN plasmídico de manera eficaz en la posición esperada solo en presencia del ARN sintético y no escindió un plásmido de control que carecía de la secuencia diana (Fig. 1B).
1-2. Escisión del ADN mediante el complejo de Cas9/ARN guía en células humanas
Se utilizó un indicador de RFP-GFP para investigar si el complejo de Cas9/ARN guía puede escindir la secuencia diana incorporada entre las secuencias RFP y GFP en células de mamífero.
En este indicador, la secuencia de GFP se fusiona con la secuencia de RFP fuera del marco (2). La GFP activa se expresa solo cuando la secuencia diana es escindida por nucleasas específicas de sitio, lo que provoca pequeñas inserciones o supresiones (indeles) de cambio de marco alrededor de la secuencia diana a través de la reparación de unión terminal no homóloga (NHEJ) propensa a errores de la ruptura de la doble hebra (DSB) (Fig. 2).
Los plásmidos del indicador de RFP-GFP utilizados en este estudio se construyeron como se describió previamente (2). Los oligonucleótidos correspondientes a los sitios diana (Tabla 1) se sintetizaron (Macrogen) y se hibridaron. Los oligonucleótidos hibridados se ligaron en un vector indicador digerido con EcoRI y BamHI.
Se cotransfectaron células HEK 293T con el plásmido que codifica Cas9 (0.8 pg) y el plásmido indicador RFP-GFP (0.2 mg) en una placa de 24 pocillos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Mientras tanto, el ARN quimérico transcrito in vitro se había preparado como sigue. El ARN se transcribió in vitro mediante reacciones de escorrentía utilizando el kit MEGAshortscript T7 (Ambion) de acuerdo con el manual del fabricante. Las plantillas para la transcripción de ARN in vitro se generaron al hibridar dos ADN de hebra sencilla complementarios o mediante amplificación por PCR (Tabla 1). El ARN transcrito se resolvió en un gel desnaturalizante de urea-PAGE al 8%. La rodaja de gel que contenía ARN se cortó y se transfirió a tampón de elución de sonda. El ARN se recuperó en agua libre de nucleasas seguido de extracción con fenol: cloroformo, extracción con cloroformo y precipitación con etanol. Los ARN purificados se cuantificaron mediante espectrometría.
A las 12 h después de la transfección, se transfectó ARN quimérico (1 |jg) preparado mediante transcripción in vitro utilizando Lipofectamine 2000.
En la post-transfección 3d, las células transfectadas se sometieron a citometría de flujo y se contaron las células que expresan tanto RFP como GFP.
Se encontró que las células que expresan GFP se obtuvieron solo cuando las células se transfectaron primero con el plásmido Cas9 y luego con el ARN guía 12 h después (Fig. 2), demostrando que las RGEN podían reconocer y escindir la secuencia de ADN diana en células humanas cultivadas. Por tanto, las células que exponen GFP se obtuvieron mediante transfección en serie del plásmido Cas9 y el ARN guía en lugar de cotransfección.
Tabla 1
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1-3. Interrupción dirigida de genes endógenos en células de mamíferos por RGEN
Para probar si las RGEN se podrían utilizar para la interrupción dirigida de genes endógenos en células de mamíferos, se analizó el ADN genómico aislado de las células transfectadas utilizando la endonucleasa I T7 (T7E1), una endonucleasa sensible al emparejamiento erróneo que reconoce y escinde específicamente los heterodúplex formados por la hibridación de las secuencias de ADN de tipo silvestre y mutante (3).
Para introducir DSB en células de mamífero utilizando RGEN, se transfectaron 2x106 células K562 con 20 |jg de plásmido que codifica Cas9 utilizando el 4D-Nucleofector, Kit SF Cell Line 4D-Nucleofector X, Programa FF-120 (Lonza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para este experimento, se cultivaron células K562 (ATCC, CCL-243) en RPMI-1640 con FBS al 10 % y la mezcla de penicilina/estreptomicina (100 U/ml y 100 jg/ml, respectivamente).
Después de 24 h, se nucleofectaron 10-40 jg de ARN quimérico transcrito in vitro en 1x106 células K562. El ARN quimérico transcrito in vitro se preparó como se describe en el Ejemplo 1-2.
Las células se recolectaron dos días después de la transfección de ARN y se aisló el ADN genómico. La región que incluía el sitio diana se amplificó por PCR utilizando los cebadores descritos en la Tabla 1. Los amplicones se sometieron al ensayo T7E1 como se describió anteriormente (3). Para el análisis de secuenciación, los productos de PCR correspondientes a modificaciones genómicas se purificaron y clonaron en el vector T-Blunt utilizando el kit T-Blunt PCR Cloning (SolGent). Los productos clonados se secuenciaron utilizando el cebador M13.
Se encontró que las mutaciones se indujeron solo cuando las células se transfectaron en serie con el plásmido que codifica Cas9 y luego con ARN guía (Fig. 3). Las frecuencias de mutación (Indeles (%) en la Fig. 3A) estimadas a partir de las intensidades relativas de la banda de ADN eran dependientes de la dosis de ARN, que varía entre el 1.3 % y el 5.1 %. El análisis de secuenciación de ADN de los amplicones de PCR corroboró la inducción de mutaciones mediadas por RGEN en los sitios endógenos. Se observaron indeles y microhomologías, características del NHEJ propenso a error, en el sitio diana. La frecuencia de mutación medida por secuenciación directa fue del 7.3% (= 7 clones mutantes/96 clones), a la par con las obtenidas con nucleasas de dedos de zinc (ZFN) o nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (TALEN).
Se requirió la transfección en serie del plásmido Cas9 y el ARN guía para inducir mutaciones en las células. Pero cuando los plásmidos que codifican el ARN guía, la transfección en serie fue innecesaria y las células se cotransfectaron con el plásmido Cas9 y el plásmido que codifica el ARN guía.
Mientras tanto, tanto las ZFN como las TALEN se han desarrollado con éxito para interrumpir el gen CCR5 humano (3-6), que codifica un receptor de quimiocina acoplado a proteína G, un correceptor esencial de la infección por VIH. Una ZFN específica de c CR5 se encuentra ahora bajo investigación clínica en los EE.UU. Para el tratamiento del SIDA (7). Estas ZFN y TALEN, sin embargo, tienen efectos fuera de diana, que inducen mutaciones locales en sitios cuyas secuencias son homólogas a la secuencia en diana (6, 8-10) y reordenamientos del genoma que surgen de la reparación de dos DSB simultáneas inducidas en sitios en diana y fuera de diana (11-12). Los sitios fuera de diana más llamativos asociados con estas nucleasas diseñadas por ingeniería específicas de CCR5 residen en el locus CCR2, un homólogo cercano de CCR5, ubicado 15 kpb en dirección ascendente de CCR5. Para evitar mutaciones fuera de diana en el gen CCR2 y supresiones, inversiones y duplicaciones no deseadas del segmento cromosómico de 15 kpb entre los sitios CCR5 en diana y CCR2 fuera de diana, los presentes inventores eligieron intencionalmente el sitio diana de nuestra RGEN específica de CCR5 para reconocer una región dentro de la secuencia CCR5 que no tiene homología aparente con la secuencia CCR2.
Los presentes inventores investigaron si la RGEN específica de CCR5 tenía efectos fuera de diana. Con este fin, buscamos sitios potenciales fuera de diana en el genoma humano al identificar los sitios que son más homólogos a la secuencia objetivo de 23 pb prevista. Como era de esperar, no se encontraron dichos sitios en el gen CCR2. En su lugar, se encontraron cuatro sitios, cada uno de los cuales tiene emparejamientos erróneos de 3 bases con el sitio en diana (Fig. 4A). Los ensayos de T7E1 mostraron que no se detectaron mutaciones en estos sitios (sensibilidad del ensayo, ~0.5 %), lo que demuestra exquisitas especificidades de las RGEN (Fig. 4B). Adicionalmente, se utilizó PCR para detectar la inducción de supresiones cromosómicas en células transfectadas por separado con plásmidos que codifican ZFN y RGEN específicas de CCR5. Mientras que la ZFN indujo supresiones, la RGEN no (Fig. 4C).
A continuación, se reprogramaron las RGEN al reemplazar el ARN guía específico de CCR5 por un ARN recién sintetizado diseñado para dirigirse al gen C4BPB humano, que codifica la cadena beta de la proteína de unión a C4b, un factor de transcripción. Esta RGEN indujo mutaciones en el sitio diana cromosómico en las células K562 a altas frecuencias (Fig. 3B). Las frecuencias de mutación medidas por el ensayo T7E1 y por secuenciación directa fueron 14 % y 8.3 % (= 4 clones mutantes/48 clones), respectivamente. De cuatro secuencias mutantes, dos clones contenían una inserción de única o dos bases precisamente en el sitio de escisión, un patrón que también se observó en el sitio diana CCR5. Estos resultados indican que las RGEN escinden el ADN diana cromosómico en las posiciones esperadas en las células.
Ejemplo 2: Edición del genoma mediado por RGEN proteico (ejemplo de referencia)
Las RGEN se pueden suministrar en células de muchas formas diferentes. Las RGEN consisten en proteína Cas9, ARNcr y ARNtracr. Los dos ARN se pueden fusionar para formar un ARN guía de cadena sencilla (ARNgu). Un plásmido que codifica Cas9 bajo un promotor tal como CMV o CAG se puede transfectar en células. El ARNcr, ARNtracr o ARNgu también se pueden expresar en células utilizando plásmidos que codifican estos ARN. Sin embargo, el uso de plásmidos a menudo da como resultado la integración de la totalidad o parte de los plásmidos en el genoma del anfitrión. Las secuencias bacterianas incorporadas en el ADN plasmídico pueden provocar una respuesta inmunitaria no deseada in vivo. Las células transfectadas con plásmido para terapia celular o animales y plantas derivados de células transfectadas con ADN deben pasar por un procedimiento de regulación costoso y prolongado antes de la aprobación del mercado en la mayoría de los países desarrollados. Adicionalmente, el ADN plasmídico puede persistir en las células durante varios días después de la transfección, agravando los efectos de las RGEN fuera de diana.
En el presente documento, utilizamos proteína Cas9 recombinante complejada con ARN guía transcrito in vitro para inducir la interrupción dirigida de genes endógenos en células humanas. La proteína Cas9 recombinante fusionada con la etiqueta de hexa-histidina se prensó con expresó y se purificó a partir de E. coli utilizando cromatografía de afinidad de iones Ni estándar y filtración en gel. La proteína Cas9 recombinante purificada se concentró en tampón de almacenamiento (HEPES 20 mM pH 7.5, KCl 150 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10%). El complejo de proteína Cas9/ARNgu se introdujo directamente en las células K562 mediante nucleofección: se transfectaron 1x106 células K562 con 22.5-225 (1.4-14 |jM) de proteína Cas9 mezclada con 100 ug (29 j M) de ARNgu transcrito in vitro (o ARNcr 40 ug y ARNtracr 80 ug) en 100 j l de solución utilizando 4D-Nucleofector, kit SF Cell Line 4D-Nucleofector X, Programa FF-120 (Lonza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la nucleofección, las células se colocaron en medio de crecimiento en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 48 h. Cuando se transfectaron 2 x 105 células K562 con un protocolo reducido a escala 1/5, se utilizaron 4.5-45 jg de proteína Cas9 mezclada con 6-60 ug de ARNgu transcrito in vitro (o ARNcr 8 jg y ARNtracr 16 jg ) y se nucleofectaron en 20 j l de solución. A continuación, las células nucleofectadas se colocaron en medio de crecimiento en placas de 48 pocillos. Después de 48 h, se recolectaron las células y se aisló el ADN genómico. La región de ADN genómico que abarca el sitio diana se amplificó por PCR y se sometió al ensayo T7E1.
Como se muestra en la Fig. 10, el complejo de proteína Cas9/ARNgu indujo una mutación dirigida en el locus CCR5 a frecuencias que variaban del 4.8 al 38 % en una forma dependiente de dosis de ARNgu o proteína Cas9, a la par con la frecuencia obtenida con transfección de plásmido de Cas9 (45 %). El complejo de proteína Cas9/ARNcr/ARNtracr fue capaz de inducir mutaciones con una frecuencia del 9.4%. La proteína Cas9 sola no logró inducir mutaciones. Cuando se transfectaron 2x105 células con dosis reducidas a escala 1/5 de proteína Cas9 y ARNgu, las frecuencias de mutación en el locus CCR5 variaron de 2.7 a 57 % de una manera dependiente de la dosis, mayor que la obtenida con la cotransfección del plásmido Cas9 y plásmido ARNgu (32 %).
También probamos el complejo de proteína Cas9/ARNgu que se dirige al gen ABCC11 y encontramos que este complejo inducía indeles con una frecuencia del 35 %, lo que demuestra la utilidad general de este método.
Tabla 2
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Ejemplo 3: Edición del genoma guiado por ARN en ratones (ejemplo de referencia)
Para examinar el potencial de direccionamiento de genes de las RGEN en embriones de ratón en estadio pronuclear (PN), el gen forkhead box N1 (Foxn1), que es importante para el desarrollo del timo y la diferenciación de queratinocitos (Nehls et al., 1996), y se utilizó el gen de proteína quinasa, activado por ADN de polipéptido catalítico (Prkdc), que codifica una enzima crítica para la reparación y recombinación de la d Sb de ADN (Taccioli et al., 1998).
Para evaluar la actividad de edición del genoma de Foxn1-RGEN, inyectamos ARNm de Cas9 (solución de 10 ng/jl) con varias dosis del ARNgu (Fig. 5a) en el citoplasma de embriones de ratón en etapa PN, y llevaron a cabo ensayos de endonucleasa I T7 (T7E1) (Kim et al. 2009) utilizando ADN genómicos obtenidos de embriones cultivados in vitro (Fig. 6a).
Alternativamente, inyectamos directamente la RGEN en forma de proteína Cas9 recombinante (0.3 a 30 ng/jl) complejada con el exceso molar doble de ARNgu específico de Foxn1 (0.14 a 14 ng/jl) en el citoplasma o pronúcleo de embriones de ratón unicelulares, y mutaciones analizadas en el gen Foxn1 utilizando embriones cultivados in vitro (Fig. 7).
Específicamente, el ARNm y ARNgu de Cas9 se sintetizaron in vitro a partir de plantillas de ADN lineal utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra (Ambion) y el kit MEGAshortscript T7 (Ambion), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes, y se diluyeron con las cantidades adecuadas de tampón de inyección tratado con pirocarbonato de dietilo (DEPC, Sigma) (EDTA 0.25 mM, Tris 10 mM, pH 7.4). Las plantillas para la síntesis de ARNgu se generaron utilizando los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 3. La proteína Cas9 recombinante se obtuvo de ToolGen, Inc.
Tabla 3
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Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Administración de fármacos y Alimentos de Corea (KFDA). Los protocolos fueron revisados y aprobados por los Comités Institucionales de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de la Universidad de Yonsei (Número de permiso: 2013-0099). Todos los ratones se mantuvieron en la instalación libre de patógenos específicos del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de Yonsei. Se utilizaron cepas de ratón FVB/NTac (Taconic) e ICR como donantes de embriones y madres adoptivas, respectivamente. Ratones hembra FVB/NTac (7-8 semanas de edad) se superovularon por inyecciones intraperitoneales de 5 UI de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG, Sigma) y 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG, Sigma) a intervalos de 48 horas. Las hembras superovuladas se aparearon con machos sementales FVB/NTac y se recolectaron embriones fertilizados de oviductos.
Se inyectaron ARNm de Cas9 y ARNgu en medio M2 (Sigma) en el citoplasma de huevos fertilizados con pronúcleos bien reconocidos utilizando un micromanipulador accionado por piezo (Prime Tech).
En el caso de la inyección de proteína Cas9 recombinante, el complejo de proteína Cas9 recombinante: Foxn1-ARNgu se diluyó con tampón de inyección tratado con DEPC (EDTA 0.25 mM, Tris 10 mM, pH 7.4) y se inyectó en pronúcleos machos utilizando un micromanipulador NK2 TransferMan y microinyector FemtoJet (Eppendorf).
Los embriones manipulados se transfirieron en los oviductos de madres adoptivas pseudopreñadas para producir animales vivos, o se cultivaron in vitro para análisis adicionales.
Para cribar ratones F0 y embriones de ratón cultivados in vitro con mutaciones inducidas por RGEN, se realizaron ensayos de T7E1 como se describió previamente utilizando muestras de ADN genómico de biopsias de cola y lisados de embriones completos (Cho et al., 2013).
Brevemente, la región genómica que abarca el sitio diana de RGEN se amplificó por PCR, se fundió y se volvió a hibridar para formar ADN heterodúplex, que se trató con endonucleasa 1 T7 (New England Biolabs) y luego se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los sitios potenciales fuera de diana se identificaron mediante la búsqueda con pajarita 0.12.9 y también se monitorizaron de manera similar mediante ensayos T7E1. Los pares de cebadores utilizados en estos ensayos se enumeraron en las Tablas 4 y 5.
Tabla 4
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Tabla 5
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Los ubicadores mutantes identificados mediante el ensayo T7E1 se analizaron adicionalmente mediante fPCR. Las regiones apropiadas de ADN genómico se secuenciaron como se describió anteriormente (Sung et al., 2013). Para el genotipado por PCR de rutina de las progenies F1, se utilizaron los siguientes pares de cebadores para alelos de tipo silvestre y mutante: 5'-CTACTCCCTCCGCAGTCTGA-3' (SEQ ID NO: 69) y 5'-CCAGGCCTAGGTTCCAGGTA-3' (SEQ ID NO: 70) para el gen Foxn1, 5'-CCCCAGCATTGCAGATTTCC-3' (SEQ ID NO: 71) y 5'-AGGGCTTCTTCTCTACAATCACG-3' (SEQ ID NO: 72) para el gen Prkdc.
En el caso de la inyección de ARNm de Cas9, las fracciones mutantes (el número de embriones mutantes/el número de embriones totales) eran dependientes de dosis, que varía del 33 % (1 ng/pl de ARNgu) y el 91 % (100 ng/pl) (Fig. 6b). El análisis de secuencia confirmó mutaciones en el gen Foxn1; la mayoría de las mutaciones eran pequeñas supresiones (Fig. 6c), que recuerdan a las inducidas por ZFN y TALEN (Kim et al., 2013).
En el caso de la inyección de proteína Cas9, estas dosis y métodos de inyección afectaron mínimamente la supervivencia y el desarrollo de embriones de ratón in vitro: más del 70 % de los embriones inyectados con RGEN eclosionaron normalmente en ambos experimentos. De nuevo, las fracciones mutantes obtenidas con la inyección de proteína Cas9 eran dependientes de dosis y alcanzaron hasta el 88 % con la dosis más alta mediante inyección de pronúcleo y hasta el 71 % mediante inyección intracitoplasmática (Figuras 7a y 7b). De manera similar a los patrones de mutación inducidos por el ARNm de Cas9 más el ARNgu (Fig. 6c), aquellos inducidos por el complejo de proteína Cas9-ARNgu eran en su mayoría pequeñas supresiones (Fig. 7c). Estos resultados demuestran claramente que las RGEN tienen una alta actividad de direccionamiento de genes en embriones de ratón.
Alentados por las altas frecuencias de mutantes y la baja citotoxicidad inducida por las RGEN, producimos animales vivos al transferir los embriones de ratón a los oviductos de madres adoptivas pseudopreñadas.
En particular, las tasas de natalidad fueron muy altas, que varía entre el 58 % y el 73 %, y no se vieron afectadas por las dosis crecientes de Foxn1-ARNgu (Tabla 6).
Tabla 6
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De 147 recién nacidos, obtuvimos 99 ratones ubicadores mutantes. De acuerdo con los resultados observados en los embriones cultivados (Fig. 6b), las fracciones mutantes fueron proporcionales a las dosis de Foxn1-ARNgu y alcanzaron hasta 93 % (100 ng/pl de Foxn1-ARNgu) (Tablas 6 y 7, Fig. 5b).
Tabla 7
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Para generar ratones dirigidos a Prkdc, aplicamos una concentración 5 veces mayor de ARNm de Cas9 (50 ng/pl) con dosis crecientes de ARNgu Prkdc (50, 100 y 250 ng/pl). Nuevamente, las tasas de natalidad fueron muy altas, que varía entre el 51 % y el 60 %, lo suficiente para producir un número suficiente de recién nacidos para el análisis (Tabla 6). La fracción mutante fue del 57 % (21 ubicadores mutantes entre 37 recién nacidos) a la dosis máxima de ARNgu Prkdc. Estas tasas de natalidad obtenidas con RGEN fueron aproximadamente de 2 a 10 veces más altas que aquellas con TALEN indicadas en nuestro estudio anterior (Sung et al., 2013). Estos resultados demuestran que las RGEN son potentes reactivos dirigidos a genes con una toxicidad mínima.
Para probar la transmisión de la línea germinal de los alelos mutantes, cruzamos el ubicador mutante Foxn1 #108, un mosaico con cuatro alelos diferentes (Fig. 5c y Tabla 8) con ratones de tipo silvestre, y monitorizamos los genotipos del descendiente F1.
Tabla 8
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Como se esperaba, todas las progenies eran mutantes heterocigotas que poseían el alelo de tipo silvestre y uno de los alelos mutantes (Fig. 5d). También confirmamos la transmisión de línea germinal en ratones ubicadores independientes de Foxn1 (Fig. 8) y Prkdc (Fig. 9). Hasta donde sabemos, estos resultados proporcionan la primera evidencia de que los alelos mutantes inducidos por RGEN se transmiten de manera estable a las progenies F1 en animales.
Ejemplo 4: Edición del genoma guiada por ARN en plantas
4-1. Producción de proteína Cas9
La secuencia codificante de Cas9 (4104 pb), derivada de Streptococcus pyogenes cepa M1 GAS (NC_002737.1), se clonó en el plásmido pET28-b(+). Se incluyó una secuencia de direccionamiento nuclear (NLS) en el extremo N de la proteína para asegurar la localización de la proteína en el núcleo. El plásmido pET28-b (+) que contenía Cas9 ORF se transformó en BL21(DE3). A continuación, se indujo Cas9 utilizando IPTG 0.2 mM durante 16 horas a 18 °C y se purificó utilizando perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteína Cas9 purificada se concentró utilizando Ultracel - 100K (Millipore).
4-2. Producción de ARN guía
La secuencia genómica del gen de Arabidopsis que codifica el BRI1 se cribó para detectar la presencia de un motivo NGG, el llamado motivo adyacente al protoseparador (PAM), en un exón que se requiere para el direccionamiento de Cas9. Para interrumpir el gen BRI1 en Arabidopsis, identificamos dos sitios diana de RGEN en un exón que contienen el motivo NGG. Los ARNgu se produjeron in vitro utilizando ADN de plantilla. Cada plantilla de ADN se generó por extensión con dos oligonucleótidos parcialmente superpuestos (Macrogen, Tabla X1) y polimerasa Phusion (Thermo Scientific) utilizando las siguientes condiciones: 98 °C 30 segundos {98 °C 10 segundos, 54 °C 20 segundos, 72 °C 2 min}x20, 72 °C 5 min.
Tabla 9
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El ADN extendido se purificó y se utilizó como una plantilla para la producción in vitro de los ARN guía utilizando el kit MEGAshortscript T7 (Life Technologies). A continuación, se purificó el ARN guía mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Para preparar complejos Cas9/ARNgu, se mezclaron 10 ul de proteína Cas9 purificada ( l2 pg/pl) y 4 ul de cada uno de dos ARNgu (11 pg/pl) en 20 pl de tampón NEB3 (New England Biolabs) y se incubaron durante 10 min a 37 °C.
4-3. Transfección del complejo de Cas9/ARNgu a protoplasto
Las hojas de plántulas de Arabidopsis de 4 semanas cultivadas asépticamente en placas de Petri se digirieron en solución enzimática (celulosa R10 al 1 %, macerozima R10 al 0.5 %, manitol 450 mM, MES 20 mM pH 5.7 y sal CPW) durante 8~16 horas a 25 °C con 40 rpm agitando en la oscuridad. Las soluciones de enzima/protoplasto se filtraron y se centrifugaron a 100 x g durante3-5min. Los protoplastos se resuspendieron en solución de CPW después de contar las células bajo el microscopio (X100) utilizando un hemacitómetro. Finalmente, los protoplastos se resuspendieron a 1X106/ml en solución de Mm G (HEPES 4 mM pH 5.7, manitol 400 mM y MgCl2 15 mM). Para transfectar los protoplastos con el complejo de Cas9/ARNgu, 200 pL (200.000 protoplastos) de la suspensión de protoplasto se mezclaron suavemente con 3.3 o 10 uL de complejo de Cas9/ARNgu [proteína Cas9 (6 pg/pL) y dos ARNgu (2.2 pg/pL cada uno)] y 200 ul de tampón de transfección de polietilenglicol al 40 % (PEG4000 al 40 %, manitol 200 mM y CaCl2 100 mM) en tubos de 2 ml. Después de 5~20 min de incubación a temperatura ambiente, la transfección se detuvo al agregar tampón de lavado con una solución W5 (MES 2 mM pH 5.7, NaCl 154 mM, CaCl2 125 mM y KCl 5 mM). A continuación, los protoplastos se recolectaron mediante centrifugación durante 5 min a 100 X g, se lavaron con 1 ml de solución W5 y se centrifugaron durante otros 5 min a 100 X g. La densidad de los protoplastos se ajustó a 1 X 105/ml y se cultivaron en medio líquido KM 8p modificado con glucosa 400 mM.
4- 4. Detección de mutaciones en protoplastos y plantas de Arabidopsis
Después de 24 horas o 72 horas después de la transfección, se recolectaron los protoplastos y se aisló el ADN genómico. La región de ADN genómico que abarca los dos sitios diana se amplificó por p Cr y se sometió al ensayo T7E1. Como se muestra en la Figura 11, los indeles fueron inducidos por RGEN a altas frecuencias que variaron desde el 50 % hasta el 70 %. Sorprendentemente, las mutaciones se indujeron a las 24 horas después de la transfección. Aparentemente, la proteína Cas9 funciona inmediatamente después de la transfección. Los productos de PCR se purificaron y clonaron en el kit T-Blunt PCR Cloning (Solgent). Los plásmidos se purificaron y se sometieron a secuenciación de Sanger con el cebador M13F. Una secuencia mutante tenía una supresión de 7 pb en un sitio (Fig. 12). Las otras tres secuencias mutantes tenían supresiones de segmentos de ADN de ~220 pb entre los dos sitios de RGEN.
Ejemplo 5: Transducción de la proteína Cas9 utilizando un dominio de transducción de proteína o péptido que penetra en las células (ejemplo de referencia)
5- 1. Construcción del plásmido que codifica His-Cas9
Se preparó Cas9 con una cisteína en el terminal C mediante amplificación por PCR utilizando el plásmido Cas9 previamente descrito {Cho, 2013 #166} como plantilla y se clonó en el vector pET28-(a) (Novagen, Merk Millipore, Alemania) que contenía etiqueta His en el terminal N.
5-2. Cultivo de células
Se cultivaron 293T (estirpe celular de riñón embrionario humano) y HeLa (estirpe celular de cáncer de ovario humano) en DMEM (GIBCO-BRL Rockville) suplementado con FBS al 10 % y penicilina y estreptomicina al 1 %.
5-3. Expresión y purificación de la proteína Cas9.
Para expresar la proteína Cas9, se transformaron células de E. coli BL21 con el vector pET28- (a) que codifica Cas9 y se sembraron sobre medio de agar Luria-Bertani (LB) que contenía 50 pg/ml de kanamicina (Amresco, Solon, OH). Al día siguiente, se recolectó una sola colonia y se cultivó en caldo LB que contenía 50 pg/ml de kanamicina a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, este cultivo iniciador a 0.1 DO600 se inoculó en caldo Luria que contenía 50 pg/ml de kanamicina y se incubó durante 2 horas a 37 °C hasta que la DO600 alcanzó 0.6-0.8. Para inducir la expresión de la proteína Cas9, las células se cultivaron a 30 °C durante la noche después de la adición de isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (Promega, Madison, WI) hasta la concentración final de 0.5 mM.
Las células se recolectaron mediante centrifugación a 4000 rpm durante 15-20 minutos, se resuspendieron en un tampón de lisis (Tris-Cl 20 mM pH 8.0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, cóctel inhibidor de proteasa IX, 1 mg/ml de lisozima) y lisado por sonicación (40% de trabajo, pulso de 10 segundos, descanso de 30 segundos, durante 10 minutos sobre hielo). La fracción soluble se separó como sobrenadante después de centrifugar a 15.000 rpm durante 20 minutos a 4 °C. La proteína Cas9 se purificó a 4 °C utilizando una columna que contenía resina de agarosa Ni-NTA (QIAGEN) y un instrumento AKTA prime (AKTA prime, GE Healthcare, Reino Unido). Durante esta etapa de cromatografía, se cargaron fracciones de proteína soluble sobre una columna de resina de agarosa Ni-NTA (GE Healthcare, Reino Unido) a una índice de fluidez de 1 ml/min. La columna se lavó con un tampón de lavado (Tris-Cl 20 mM pH 8.0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, cóctel inhibidor de proteasa IX) y la proteína unida se eluyó a una índice de fluidez de 0.5 ml/min con un tampón de elución (Tris 20 mM -Cl pH 8.0, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, cóctel inhibidor de proteasa IX). La fracción eluida agrupada se concentró y se dializó frente a tampón de almacenamiento (Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, KCl 200 mM, EDTA 0.1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0.5 mM, glicerol al 20 %). La concentración de proteína se cuantificó mediante el ensayo de Bradford (Biorad, Hercules, CA) y la pureza se analizó mediante SDS-PAGE utilizando albúmina de suero bovino como control.
5-4. Conjugación de Cas9 a 9R4L
Se mezclaron suavemente 1 mg de proteína Cas9 diluida en PBS a la concentración de 1 mg/ml y 50 pg de péptido maleimida-9R4L en 25 pl de DW (Peptron, Corea) utilizando un rotor a temperatura ambiente durante 2 horas y a 4 °C durante la noche. Para eliminar la maleimida-9R4L no conjugada, las muestras se dializaron utilizando una membrana de corte de peso molecular de 50 kD frente a DPBS (pH 7.4) a 4 °C durante 24 horas. Se recolectó la proteína Cas9-9R4L de la membrana de diálisis y se determinó la cantidad de proteína utilizando el ensayo de Bradford.
5-5. Preparación de ARNgu-9R4L
Se agregó suavemente ARNgu (1 pg) a diversas cantidades de péptido C9R4LC (que variaba de una relación en peso de 1 a 40) en 100 pl de DPBS (pH 7.4). Esta mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se diluyó a 10 veces utilizando agua desionizada libre de ARNasa. El diámetro hidrodinámico y el potencial z de las nanopartículas formadas se midieron utilizando dispersión de luz dinámica (Zetasizer-nanoanalizador ZS; Malvern instruments, Worcestershire, Reino Unido).
5-6. Tratamientos con proteína Cas9 y ARNgu
Se trataron las células con Cas9-9R4L y ARNgu-C9R4LC de la siguiente manera: se agregaron 1 pg de ARNgu y 15 pg de péptido C9R4LC a 250 ml de medio OPTIMEM y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. A las 24 horas después de la siembra, las células se lavaron con medio OPTIMEM y se trataron con el complejo de ARNgu-C9R4LC durante 4 horas a 37 °C. Las células se lavaron de nuevo con medio OPTIMEM y se trataron con Cas9-9R4L durante 2 horas a 37 °C. Después del tratamiento, el medio de cultivo se reemplazó con medio completo que contenía suero y se incubó a 37 °C durante 24 horas antes del siguiente tratamiento. Se siguió el mismo procedimiento para múltiples tratamientos de Cas9 y ARNgu durante tres días consecutivos.
5-7. Cas9-9R4L y ARNgu-9R4L pueden editar genes endógenos en células de mamífero cultivadas sin el uso de herramientas de suministro adicionales
Para determinar si Cas9-9R4L y ARNgu-9R4L pueden editar genes endógenos en células de mamífero cultivadas sin el uso de herramientas de suministro adicionales, tratamos 293 células con Cas9-9R4L y ARNgu-9R4L dirigidas al gen CCR5 y analizamos el ADN genómico. El ensayo T7E1 mostró que el 9% del gen CCR5 se interrumpió en las células tratadas con Cas9-9R4L y ARNgu-9R4L y que no se observó la interrupción del gen CCR5 en las células de control, que incluyen las no tratadas, tratadas con Cas9-9R o ARNgu-9R4L, o tratadas con Cas-9 sin modificar y ARNgu (Fig. 13), lo que sugiere que el tratamiento con proteína Cas9-9R4L y ARNgu conjugado con 9R4L, pero no con Cas9 y ARNgu sin modificar, puede conducir a una edición del genoma eficiente en células de mamíferos.
Ejemplo 6: Control de la mutación fuera de diana de acuerdo con la estructura del ARN guía (ejemplo de referencia)
Recientemente, tres grupos informaron que las RGEN tenían efectos fuera de diana en las células humanas. Para nuestra sorpresa, las RGEN indujeron mutaciones de manera eficiente en sitios fuera de diana que difieren en 3 a 5 nucleótidos de los sitios en diana. Sin embargo, notamos que había varias diferencias entre nuestras RGEN y aquellas utilizadas por otros. Primero, utilizamos ARN dual, que es ARNcr más ARNtracr, en lugar de ARN de guía única (ARNgu) que se compone de porciones esenciales de ARNcr y ARNtracr. En segundo lugar, transfectamos células K562 (pero no células HeLa) con ARNcr sintético en lugar de plásmidos que codifican ARNcr. Las células HeLa se transfectaron con plásmidos que codifican ARNcr. Otros grupos utilizaron plásmidos que codifican ARNgu. En tercer lugar, nuestro ARN guía tenía dos nucleótidos de guanina adicionales en el extremo 5', que son necesarios para la transcripción eficaz de la polimerasa T7 in vitro. No se incluyeron dichos nucleótidos adicionales en el ARNgu utilizado por otros. Por tanto, la secuencia de ARN de nuestro ARN guía se puede mostrar como 5'-GGX20, mientras que 5'-GX-ig, en la que X20 o GX19 corresponde a la secuencia diana de 20 pb, representa la secuencia utilizada por otros. El primer nucleótido de guanina es necesario para la transcripción de la ARN polimerasa en las células. Para probar si los efectos de RGEN fuera de diana se pueden atribuir a estas diferencias, elegimos cuatro RGEN que indujeron mutaciones fuera de diana en células humanas a altas frecuencias (13). Primero, comparamos nuestro método de utilizar ARN dual transcrito in vitro con el método de transfección de plásmidos que codifican ARNgu en células K562 y medimos las frecuencias de mutación en los sitios en diana y fuera de diana mediante el ensayo T7E1. Tres RGEN mostraron frecuencias de mutación comparables en sitios en diana y fuera de diana, independientemente de la composición del ARN guía. Curiosamente, una RGEN (sitio 1 de VEFGA) no indujo indeles en un sitio fuera de diana validado, que difiere en tres nucleótidos del sitio en diana (denominado OT1-11, Fig. 14), cuando se utilizó ARN dual sintético. Pero el ARN dual sintético no discriminó el otro sitio fuera de diana validado (OT1-3), que difiere en dos nucleótidos del sitio en diana.
A continuación, probamos si la adición de dos nucleótidos de guanina en el extremo 5' del ARNgu podría hacer que las RGEN sean más específicas al comparar el ARNgu 5'-GGX20 (o 5'-GGGXig) con el ARNgu 5'-GXig. Cuatro ARNgu de GXig complejados con Cas9 indujeron indeles de manera igualmente eficiente en sitios en diana y fuera de diana, tolerando hasta cuatro emparejamientos erróneos de nucleótidos. En marcado contraste, los ARNgu de GGX20 discriminaban eficazmente los sitios fuera de diana. De hecho, el ensayo T7E1 apenas detectó indeles inducidos por RGEN en seis de los siete sitios fuera de diana validados cuando utilizamos los cuatro ARNgu de GGX20 (Fig. 15). Sin embargo, notamos que dos ARNgu de GGX20 (sitios VEGFA 1 y 3) eran menos activos en los sitios diana que los ARNgu de GX-ig correspondientes. Estos resultados muestran que los nucleótidos adicionales en el extremo 5' pueden afectar las frecuencias de mutación en los sitios en diana y fuera de diana, quizás al alterar la estabilidad, la concentración o la estructura secundaria del ARN guía.
Estos resultados sugieren que tres factores -el uso de ARN guía sintético en lugar de plásmidos que codifican ARN guía, ARN dual en lugar de ARNgu, y ARNgu de GGX20 en lugar de ARNgu de GX-ig- tienen efectos acumulativos sobre la discriminación de sitios fuera de diana.
Ejemplo 7: nickasas Casg emparejadas (ejemplo de referencia)
En principio, las rupturas de cadena sencilla (SSB) no pueden ser reparadas por NHEJ propenso a error pero aún desencadenan reparación dirigida por homología de alta fidelidad (HDR) o reparación por escisión de base. Pero la mutagénesis dirigida inducida por nickasa a través de HDR es mucho menos eficiente que la mutagénesis inducida por nucleasa. Razonamos que las nickasas Casg emparejadas producirían DSB compuestas, que desencadenan la reparación del ADN a través de NHEJ o HDR, lo que conduce a una mutagénesis eficiente (Fig. 16A). Además, las nickasas emparejadas duplicarían la especificidad de la edición del genoma basada en Casg.
En primer lugar, probamos varias nucleasas y nickasas Casg diseñadas para sitios diana en el locus AAVS1 (Fig. 16B) in vitro mediante electroforesis capilar fluorescente. A diferencia de las nucleasas Casg que escindieron ambas hebras de sustratos de ADN, las nickasas Casg compuestas de ARN guía y una forma mutante de Casg en la que un residuo de aspartato catalítico se cambia a una alanina (D10A Casg) escindió solo una hebra, produciendo fragmentos específicos de sitio (Fig. .16C, D). Curiosamente, sin embargo, algunas nickasas (AS1, AS2, AS3 y S6 en la Fig. 17A) indujeron indeles en los sitios diana en células humanas, lo que sugiere que los fragmentos se pueden convertir a DSB, aunque de manera ineficaz, in vivo. Las nickasas Casg emparejadas que producían dos fragmentos adyacentes en hebras de ADN opuestas produjeron indeles a frecuencias que variaban desde el 14 % hasta el g1 %, comparables a los efectos de las nucleasas emparejadas (Fig. 17A). La reparación de dos fragmentos que producirían salientes 5' condujo a la formación de indeles con mucha más frecuencia que las que producen salientes 3' en tres loci genómicos (Fig. 17A y Fig. 18). Además, las nickasas emparejadas permitieron la edición del genoma dirigida a través de la reparación dirigida por homología de manera más eficiente que las nickasas individuales (Fig. 1g).
A continuación, medimos las frecuencias de mutación de nickasas y nucleasas emparejadas en sitios fuera de diana utilizando secuenciación profunda. Las nucleasas Casg complejadas con tres ARNgu indujeron mutaciones fuera de diana en seis sitios que difieren en uno o dos nucleótidos de sus correspondientes sitios en diana con frecuencias que varían desde el 0.5 % hasta el 10 % (Fig. 17B). Por el contrario, las nickasas Casg emparejadas no produjeron indeles por encima del límite de detección del 0.1 % en ninguno de los seis sitios fuera de diana. El sitio S2 Fuera-1 que difiere en un solo nucleótido en la primera posición en el PAM (es decir, N en NGG) de su sitio en diana se puede considerar como otro sitio en diana. Como se esperaba, la nucleasa Cas9 complejada con el ARNgu S2 fue igualmente eficiente en este sitio y el sitio en diana. En marcado contraste, D10A Cas9 complejado con los ARNgu de S2 y AS2 discriminó este sitio del sitio en diana por un factor de 270 veces. Esta nickasa emparejada también discriminó los sitios fuera de diana AS2 (Fuera-1 y Fuera-9 en la Fig. 17B) del sitio en diana por factores de 160 veces y 990 veces, respectivamente.
Ejemplo 8: Corte y empalme de ADN cromosómico inducido por nickasas Cas9 emparejadas (ejemplo de referencia)
Se han informado dos DSB concurrentes producidas por nucleasas diseñadas por ingeniería tales como ZFN y TALEN pueden promover grandes supresiones de los segmentos cromosómicos intervinientes. Probamos si dos SSB inducidos por nickasas Cas9 emparejadas también pueden producir supresiones en células humanas. Utilizamos PCR para detectar eventos de supresión y encontramos que siete nickasas emparejadas inducían supresiones de segmentos cromosómicos de hasta 1.1 kpb tan eficientemente como lo hacían las nucleasas Cas9 emparejadas (Fig. 20A, B). Las secuencias de ADN de los productos de PCR confirmaron los eventos de supresión (Fig. 20C). Curiosamente, la secuencia de emparejamiento de ARNgu permaneció intacta en dos de los siete amplicones de PCR específicos de supresión (subrayados en la Fig. 20C). Por el contrario, los pares de nucleasas Cas9 no produjeron secuencias que contuvieran sitios diana intactos. Este hallazgo sugiere que dos fragmentos distantes no se convirtieron en dos DSB separadas para promover supresiones del segmento cromosómico intermedio. Además, es poco probable que dos fragmentos separados por más de 100 pb puedan producir una DSB compuesta con grandes salientes bajo condiciones fisiológicas porque la temperatura de fusión es muy alta.
Proponemos que dos fragmentos distantes se reparan mediante el desplazamiento de la hebra en una dirección de cabeza a cabeza, lo que da como resultado la formación de una DSB en el medio, cuya reparación a través de NHEJ provoca pequeñas supresiones (Fig. 20D). Debido a que los dos sitios diana permanecen intactos durante este proceso, las nickasas pueden inducir SSB nuevamente, desencadenando el ciclo repetidamente hasta que se eliminan los sitios diana. Este mecanismo explica por qué dos fragmentos desplazados que producen salientes 5' pero no los que producen salientes 3' indujeron indeles de manera eficiente en tres loci.
Luego investigamos si las nucleasas y nickasas Cas9 pueden inducir translocaciones cromosómicas no deseadas que resultan de la reparación de NHEJ de escisiones de ADN en diana y fuera de diana (Fig. 21A). Pudimos detectar translocaciones inducidas por nucleasas Cas9 utilizando PCR (Fig. 21B, C). No se amplificaron dichos productos de PCR utilizando ADN genómico aislado de células transfectadas con los plásmidos que codifican el par de nickasas Cas9 AS2+S3. Este resultado está en consonancia con el hecho de que las nickasas AS2 y S3, a diferencia de sus correspondientes nucleasas, no produjeron indeles en sitios fuera de diana (Fig. 17B).
Estos resultados sugieren que las nickasas Cas9 emparejadas permiten mutagénesis dirigida y grandes supresiones de segmentos cromosómicos de hasta 1 kpb en células humanas. Es importante destacar que las nickasas emparejadas no indujeron indeles en sitios fuera de diana en los que sus correspondientes nucleasas inducen mutaciones. Adicionalmente, a diferencia de las nucleasas, las nickasas emparejadas no promovieron translocaciones no deseadas asociadas con escisiones de ADN fuera de diana. En principio, las nickasas emparejadas duplican la especificidad de la mutagénesis mediada por Cas9 y ampliarán la utilidad de las enzimas guiadas por ARN en aplicaciones que requieren una edición precisa del genoma, tal como la terapia génica y celular. Una advertencia de este enfoque es que se necesitan dos ARNgu altamente activos para hacer un par de nickasas eficiente, lo que limita los sitios diana. Como se muestra en este y otros estudios, no todos los ARNgu son igualmente activos. Cuando se utilizan clones individuales en lugar de poblaciones de células para estudios o aplicaciones adicionales, la elección de ARN guía que representan secuencias únicas en el genoma y el uso de ARN guía optimizados serían suficientes para evitar mutaciones fuera de diana asociadas con nucleasas Cas9. Proponemos que tanto las nucleasas Cas9 como las nickasas emparejadas son opciones poderosas que facilitarán la edición precisa del genoma en células y organismos.
Ejemplo 9: Genotipado con endonucleasas guiadas por ARN derivadas de CRISPR/Cas (ejemplo de referencia)
A continuación, razonamos que las RGEN se pueden utilizar en el análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), reemplazando las enzimas de restricción convencionales. Las nucleasas diseñadas por ingeniería que incluyen RGEN inducen indeles en los sitios diana, cuando las DSB causadas por las nucleasas son reparadas por el sistema de unión de extremos no homólogos propenso a error (NHEJ). Las RGEN que están diseñadas para reconocer las secuencias diana no pueden escindir secuencias mutantes con indeles, pero escindirán de manera eficiente las secuencias diana de tipo silvestre.
9-1. Componentes de RGEN
Se prepararon ARNcr y ARNtracr mediante transcripción in vitro utilizando el kit MEGAshortcript T7 (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARN transcritos se resolvieron en un gel desnaturalizante de urea-PAGE al 8%. La rodaja de gel que contenía ARN se cortó y se transfirió a tampón de elución. El ARN se recuperó en agua libre de nucleasas seguido de extracción con fenol: cloroformo, extracción con cloroformo y precipitación con etanol. El ARN purificado se cuantificó mediante espectrometría. Las plantillas para ARNcr se prepararon al hibridar un oligonucleótido cuya secuencia se muestra como 5'GAAATTAATACGACTCACTATAGGX2oGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTG-3'(SEQ ID NO: 76), en el que X20 es la secuencia diana, y su oligonucleótido complementario. La plantilla para ARNtracr se sintetizó mediante extensión de oligonucleótidos directos e inversos
(5T -GA AATT AATACGA CTC ACT ATAGO AACC AT7C AAAAC A GCATAGC AAjGTT AAAATAAGGCTAGTCCG-.V (SEQ ID NO: 77) y
5'-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCC TTATTTTAACTTGCTATG-3'(SEQ ID NO: 78) utilizando polimerasa Phusion (New England Biolabs).
9-2. Purificación de proteína Cas9 recombinante
La construcción de ADN Cas9 utilizada en nuestro Ejemplo anterior, que codifica Cas9 fusionado a la etiqueta His6 en el extremo C terminal, se insertó en el vector de expresión pET-28a. La proteína Cas9 recombinante se expresó en E. coli cepa BL21 (DE3) cultivada en medio LB a 25 °C durante 4 horas después de la inducción con IPTG 1 mM. Las células se recolectaron y se resuspendieron en tampón que contenía Tris 20 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, immidazol 5 mM y PMSF 1 mM. Las células se congelaron en nitrógeno líquido, se descongelaron a 4 °C y se sometieron a sonicación. Después de centrifugación, la proteína Cas9 en el lisado se unió a resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen), se lavó con tampón que contenía Tris 20 mM pH 8.0, NaCl 500 mM e immidazol 20 mM, y se eluyó con tampón que contenía Tris 20 mM pH 8.0, NaCl 500 mM e immidazol 250 mM. La proteína Cas9 purificada se dializó frente a HEPES 20 mM (pH 7.5), KCl 150 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10 % y se analizó mediante SDS-PAGE.
9-3. Ensayo de endonucleasa T7 I
El ensayo de T7E1 se realizó como sigue. En resumen, los productos de PCR amplificados con ADN genómico se desnaturalizaron a 95 °C, se volvieron a hibridar a 16 °C y se incubaron con 5 unidades de T7 Endonuclease I (New England BioLabs) durante 20 min a 37 °C. Los productos de reacción se resolvieron utilizando electroforesis en gel de agarosa del 2 al 2.5 %.
9-4. Ensayo de RGEN-RFLP
Los productos de PCR (100-150 ng) se incubaron durante 60 min a 37 °C con concentraciones optimizadas (Tabla 10) de proteína Cas9, ARNtracr, ARNcr en 10 pl de tampón NEB 3 (IX). Después de la reacción de escisión, se agregó ARNasa A (4 pg) y la mezcla de reacción se incubó durante 30 min a 37 °C para eliminar el ARN. Las reacciones se detuvieron con tampón de solución de parada 6X que contenía glicerol al 30 %, SDS al 1.2% y EDTA 100 mM. Los productos se resolvieron con electroforesis en gel de agarosa al 1-2.5 % y se visualizaron con tinción con EtBr.
Tabla 10
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Tabla 11
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9-5. Ensayo de escisión de plásmido
El plásmido linealizado tratado con enzimas de restricción (100 ng) se incubó durante 60 min a 37 °C con proteína Cas9 (0.1 |jg), ARNtracr (60 ng) y ARNcr (25 ng) en 10 j l de tampón NEB 3 (IX). Las reacciones se detuvieron con una solución de parada 6X que contenía glicerol al 30 %, SDS al 1.2% y EDTA 100 mM. Los productos se resolvieron con electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizaron con tinción con EtBr.
9-6. Estrategia de RFLP
Se pueden crear fácilmente nuevas RGEN con las especificidades de ADN deseadas al reemplazar el ARNcr; no se requiere una purificación de novo de proteínas personalizadas una vez que la proteína Cas9 recombinante está disponible. Las nucleasas diseñadas por ingeniería, que incluyen las RGEN, inducen pequeñas inserciones o supresiones (indeles) en los sitios diana cuando las DSB causadas por las nucleasas se reparan mediante uniones terminales no homólogas propensas a error (NHEJ). Las RGEN que están diseñadas para reconocer las secuencias diana escinden las secuencias de tipo silvestre de manera eficiente pero no pueden escindir secuencias mutantes con indeles (Fig. 22).
En primer lugar, probamos si las RGEN pueden escindir plásmidos de forma diferencial que contienen secuencias diana de C4BPB de tipo silvestre o modificadas que albergan indeles de 1 a 3 bases en el sitio de escisión. Ninguno de los seis plásmidos con estos indeles fue escindido por una RGEN5 específica de C4BPB compuesto de ARNcr específico de diana, ARNtracr y proteína Cas9 recombinante (Fig. 23). Por el contrario, el plásmido con la secuencia diana intacta fue escindido de manera eficiente por esta RGEN.
9-7. Detección de mutaciones inducidas por las mismas RGEN utilizando RFLP mediado por RGEN
A continuación, para probar la viabilidad del RFLP mediado por RGEN para la detección de mutaciones inducidas por las mismas RGEn , utilizamos clones de células cancerosas humanas K562 modificadas genéticamente establecidas utilizando un gen C4BPB dirigido a RGEN (Tabla 12).
Tabla 12
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Los clones mutantes de C4BPB utilizados en este estudio tienen varias mutaciones que van desde una supresión de 94 pb hasta una inserción de 67 pb (Fig. 24A). Es importante destacar que todas las mutaciones ocurridas en clones mutantes dieron como resultado la pérdida del sitio diana de RGEN. Entre los 6 clones de C4BPB analizados, 4 clones tienen alelos tanto de tipo silvestre como mutantes (+/-) y 2 clones tienen solo alelos mutantes (-/-).
Los productos de PCR que abarcan el sitio diana de RGEN amplificado a partir de ADN genómico K562 de tipo silvestre fueron digeridos completamente por la RGEN compuesta de ARNrc específico de diana, ARNtracr y proteína Cas9 recombinante expresada y purificada a partir de E. coli (Fig. 24B/Línea 1). Cuando los clones mutantes de C4BPB se sometieron a análisis RFLP utilizando la RGEN, los amplicones de PCR de los clones /- que contenían alelos mutantes y de tipo silvestre se digirieron parcialmente, y los de -/- clonados que no contenían el alelo de tipo silvestre no se digirieron en todos, sin proporcionar productos de escisión correspondientes a la secuencia de tipo silvestre (Fig. 24B). Incluso una inserción de una sola base en el sitio diana bloqueaba la digestión (clones #12 y #28) de alelos mutantes amplificados por la C4BPB RGEN, que muestran la alta especificidad del RFLP mediado por RGEN. Sometimos los amplicones de PCR al ensayo de T7E1 sensible a emparejamiento erróneo en paralelo (Fig. 24B). En particular, el ensayo T7E1 no pudo distinguir los clones -/- de los clones /-. Para empeorar las cosas, el ensayo T7E1 no puede distinguir los clones mutantes homocigotos que contienen la misma secuencia mutante de los clones de tipo silvestre, porque la hibridación de la misma secuencia mutante formará un homodúplex. Por tanto, el RFLP mediado por RGEN tiene una ventaja crítica sobre el ensayo de nucleasa sensible a emparejamiento erróneo convencional en el análisis de clones mutantes inducidos por nucleasas diseñadas por ingeniería, que incluyen ZFN, TALEN y RGEN.
9-8. Ensayo cuantitativo para análisis de RGEN-RFLP
También investigamos si el análisis de RGEN-RFLP es un método cuantitativo. Las muestras de ADN genómico aisladas del clon nulo de C4BPB y las células de tipo silvestre se mezclaron en diversas proporciones y se utilizaron para amplificaciones por PCR. Los productos de la PCR se sometieron a genotipado de RGEN y al ensayo T7E1 en paralelo (Fig. 25b). Como se esperaba, la escisión del ADN por la RGEN fue proporcional a la relación de tipo silvestre a mutante. En contraste, los resultados del ensayo T7E1 se correlacionaron pobremente con las frecuencias de mutación inferidas de las relaciones y fueron inexactos, especialmente en un porcentaje alto de mutantes, una situación en la que las secuencias mutantes complementarias se pueden hibridar entre sí para formar homodúplex.
9-9. Análisis de los ubicadores de ratones mutantes utilizando un genotipado RFLP mediado por RGEN
También aplicamos el genotipado de RFLP mediado por RGEN (genotipado de RGEN para abreviar) al análisis de los ubicadores de ratón mutantes que se habían establecido mediante la inyección de TALEN en embriones unicelulares de ratón (Fig. 26A). Diseñamos y utilizamos una RGEN que reconoció el sitio diana TALEN en el gen Pibfl (Tabla 10). Se aisló ADN genómico de un ratón de tipo silvestre y ratones mutantes y se sometió a genotipado de RGEN después de la amplificación por PCR. El genotipado de RGEN detectó con éxito varias mutaciones, que variaron de supresiones de uno a 27 pb (Fig. 26B). A diferencia del ensayo T7E1, el genotipado de RGEN permitió la detección diferencial del ubicador /- y -/-.
9-10. Detección de mutaciones inducidas en células humanas mediante una ZFN específica de CCR5 utilizando RGEN
Además, utilizamos RGEN para detectar mutaciones inducidas en células humanas por una ZFN específica de CCR5, que representa otra clase más de nucleasas diseñadas por ingeniería (Fig. 27). Estos resultados muestran que las RGEN pueden detectar mutaciones inducidas por nucleasas distintas de las propias RGEN. De hecho, esperamos que se puedan diseñar las RGEN para detectar mutaciones inducidas por la mayoría, si no todas, las nucleasas diseñadas por ingeniería. La única limitación en el diseño de un ensayo de genotipado de RGEN es el requisito del dinucleótido GG o AG (CC o CT en la hebra complementaria) en la secuencia PAM reconocida por la proteína Cas9, que ocurre una vez cada 4 pb en promedio. Se espera que los indeles inducidos en cualquier lugar dentro de la región de la semilla de varias bases en ARNcr y las nucleótidos PAM interrumpan la escisión del ADN catalizada por RGEN. De hecho, identificamos al menos un sitio de RGEN en la mayoría (98 %) de los sitios ZFN y TALEN.
9-11. Detección de polimorfismos o variaciones utilizando RGEN
A continuación, diseñamos y probamos una nueva RGEN que se dirige a un locus altamente polimórfico, HLA-B, que codifica Antígeno B Leucocitario Humano (también conocido como proteína MHC de clase I) (Fig.28). Se transfectaron células HeLa con plásmidos de RGEN y el ADN genómico se sometió a análisis T7E1 y RGEN-RFLP en paralelo. T7E1 produjo bandas falsas positivas que resultaron de polimorfismos de secuencia cerca del sitio diana (Fig. 25c). Sin embargo, como se esperaba, la misma RGEN utilizada para la interrupción génica escindió completamente los productos de PCR de las células de tipo silvestre, pero parcialmente los de las células transfectadas con RGEN, lo que indica la presencia de indeles inducidos por RGEN en el sitio diana. Este resultado muestra que el análisis de RGEN-RFLP tiene una clara ventaja sobre el ensayo T7E1, especialmente cuando no se sabe si los genes diana tienen polimorfismos o variaciones en las células de interés.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente interespaciadas Tipo II (CRISPR)/proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) para escindir un ADN diana en una célula vegetal, en la que el ADN diana es ADN endógeno, y en la que la composición comprende un complejo de:
(a) un polipéptido de proteína 9 (Cas9) asociada a CRISPR; y
(b) un ARN guía específico para el ADN diana,
en el que el ARN guía es:
(i) un ARN guía dual que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) y un ARNcr trans activador (ARNtracr); o (ii) un ARN guía de cadena sencilla que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) fusionado a un ARNcr trans activador (ARNtracr),
en la que la composición comprende adicionalmente polietilenglicol (PEG).
2. La composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 1, en la que la composición comprende dos ARN guía, en la que cada ARN guía es específico para una de las hebras del ADN diana, y en la que el polipéptido de Cas9 es una Cas9 nickasa.
3. Un protoplasto vegetal que comprende (i) un ADN diana, en el que el ADN diana es ADN endógeno, y (ii) la composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 1 o 2.
4. Un método para escindir un ADN diana en un protoplasto vegetal, en el que el ADN diana es ADN endógeno, el método comprende introducir en el protoplasto vegetal un complejo de:
(a) un polipéptido de proteína 9 (Cas9) asociada a CRISPR; y
(b) un ARN guía específico para el ADN diana,
en el que el ARN guía es:
(i) un ARN guía dual que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) y un ARNcr trans activador (ARNtracr); o (ii) un ARN guía de cadena sencilla que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) fusionado a un ARNcr trans activador (ARNtracr),
en la que la introducción es mediante transfección mediada por polietilenglicol (PEG).
5. Un método para introducir dos fragmentos en diferentes hebras de un ADN diana en un protoplasto vegetal, en el que el ADN diana es ADN endógeno, el método comprende introducir en el protoplasto vegetal un complejo de: (a) un polipéptido de proteína 9 (Cas9) asociada a CRISPR, en el que el polipéptido de Cas9 es una Cas9 nickasa; y (b) dos a Rn guía, en los que cada uno de los dos ARN guía es específico para una de las hebras del ADN diana, en el que el ARN guía es:
(i) un ARN guía dual que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) y un ARNcr trans activador (ARNtracr); o (ii) un ARN guía de cadena sencilla que comprende un ARN de CRISPR (ARNcr) fusionado a un ARNcr trans activador (ARNtracr),
en el que la introducción es mediante transfección mediada por polietilenglicol (PEG).
6. El método de la reivindicación 5, en el que los dos fragmentos se separan por al menos 100 pares base.
7. El método de las reivindicaciones 4 a 6, en el que la tranfección medida por PEG comprende transfección en un tampón de transfección al 40 %.
8. El método de la reivindicación 7, en el que el tampón de transfección de PEG al 40 % comprende PEG4000 al 40 %, mannitol 200 mM y CaCl2 100 mM.
9. Un kit para escindir un ADN diana en una célula vegetal que comprende la composición de la reivindicación 1 o 2.
10. La composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 1 o 2, el protoplasto vegetal de la reivindicación 3, el método de las reivindicaciones 4 a 8, o el kit de la reivindicación 9, en el que la proteína Cas9 es del género Streptococcus.
11. La composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 1 o 2, el protoplasto vegetal de la reivindicación 3, el método de las reivindicaciones 4 a 8, o el kit de la reivindicación 9, en el que la proteína Cas9 es de Streptococcus pyogenes.
12. La composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 2, el protoplasto vegetal de la reivindicación 3, el método de las reivindicaciones 5 a 8, o el kit de la reivindicación 9, en el que la Cas9 nickasa es una forma mutante de Cas9, en la que el residuo de aspartato catalítico se cambia a cualquier otro aminoácido, preferiblemente alanina.
13. La composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 1 o 2, el protoplasto vegetal de la reivindicación 3, el método de las reivindicaciones 4 a 8, o el kit de la reivindicación 9, en el que el polipéptido de Cas9 comprende una proteína Cas9 y una señal de localización nuclear (NLS), en el que la NLS está en el terminal N de la proteína Cas9.
14. La composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 1 o 2, el protoplasto vegetal de la reivindicación 3, el método de las reivindicaciones 4 a 8, o el kit de la reivindicación 9, en el que el ARNcr comprende dos nucleótidos de guanina adicionales en su extremo 5'.
15. La composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 1 o 2, el protoplasto vegetal de la reivindicación 3, el método de las reivindicaciones 4 a 8, o el kit de la reivindicación 9, en el que se determina la especificidad por el ARNcr, que comprende una región complementaria al ADN diana, en la que la región es de hasta 20 nucleótidos en longitud.
16. La composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 1 o 2, el protoplasto vegetal de la reivindicación 3, el método de las reivindicaciones 4 a 8, o el kit de la reivindicación 9, en el que el ADN diana es ADN genómico.
17. La composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 1 o 2, el protoplasto vegetal de la reivindicación 3, el método de las reivindicaciones 4 a 8, o el kit de la reivindicación 9, en el que el ADN diana comprende un motivo adyacente a un protoespaciador trinucleótido (PAM) reconocido por Cas9, en el que el PAM consiste en el trinucleótido 5'-NGG-3'.
18. La composición de Tipo II CRISPR/Cas9 de la reivindicación 1 o 2, o el kit de la reivindicación 9, en el que la célula vegetal es un protoplasto.
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