KR20220081949A - 온-타겟 활성이 유지되고 오프-타겟 활성이 감소된 가이드 rna 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 온-타겟 활성이 유지되고 오프-타겟 활성이 감소된 가이드 RNA 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 오프-타겟 유전자 영역에 대해 원래 (original) 하나의 미스매치를 포함하고, 타겟 유전자 영역 및 오프-타겟 유전자 영역에 대해 의도적인 (intentional) 하나 또는 두 개의 미스매치를 포함하되, 이때, 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 프로토스페이서-인접 모티프 (protospacer-adjacent motif)로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 하나 또는 두 개에 도입되는 가이드 RNA 및 이의 제조방법, 상기 가이드 RNA를 이용한 CRISPR 시스템의 정확도를 향상시키는 방법, 유전질환 및 암 발생의 원인이 되는 점 돌연변이(point mutation)를 야생형 유전자 및 염기서열로부터 구분하거나 후천성면역결핍증의 타겟 유전자인 CCR5를 고도의 상동성 CCR2 유전자로부터 구분할 수 있는 가이드 RNA를 포함하여 질병을 예방, 치료 또는 진단하기 위한 조성물, 상기 가이드 RNA를 이용한 유전자 표적 방법 및 유전자 교정 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 온-타겟 활성이 유지되고 오프-타겟 활성이 감소된 가이드 RNA 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 오프-타겟 유전자 영역에 대해 원래 (original) 하나의 미스매치를 포함하는 가이드 RNA를 수정하여, 타겟 유전자 영역 및 오프-타겟 유전자 영역에 대해 각각 의도적인 (intentional) 하나 또는 두 개의 미스매치를 포함하는 가이드 RNA 및 이의 제조방법, 상기 가이드 RNA를 이용한 CRISPR 시스템의 정확도를 향상시키는 방법, 상기 가이드 RNA를 포함하는 점 돌연변이 (point mutation)로 야기되는 질환의 예방, 치료 또는 진단용 조성물, 상기 가이드 RNA를 이용한 유전자 표적 방법 및 유전자 교정 방법을 제공한다.
CRISPR-Cas 시스템은 타겟하는 유전자 또는 핵산에 상보적인 서열을 갖는 가이드 (guide) RNA와 상기 타겟하는 유전자 또는 핵산을 절단하는 효소인 CRISPR 효소(enzyme)로 구성되고, 상기 가이드 RNA와 CRISPR 효소는 CRISPR 복합체(complex)를 형성하며, 상기 형성된 CRISPR 복합체에 의해 타겟하는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킨다.
하지만, 상기와 같은 타겟하는 유전자 또는 핵산을 변형시키는 효과와 더불어 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산을 변형시키는 문제가 아직까지 해결되지 않고 있다.
상기 타겟하지 않는 유전자 또는 핵산은 가이드 RNA와 일부 상보적인 서열을 포함함으로써 상기 가이드 RNA와 부분적인 상호작용이 가능하고, 이러한 상호작용에 의해 CRISPP 복합체가 해당 유전자, 즉, 원하지 않는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시키게 된다. 이러한 효과를 오프-타겟(off-target) 효과라고 한다.
그러므로, CRISPR-Cas 시스템을 이용하여 타겟하는 유전자 또는 핵산을 변형시키는 효율을 증대하기 위해 온-타겟(on-target) 효과를 높이거나, 또는 원하지 않은 유전자 또는 핵산의 변형으로 초래될 수 있는 유전적 결함 등의 문제점을 해결하기 위해 CRISPR-Cas 시스템의 오프-타겟(off-target) 효과를 감소 또는 제거하는 것이 중요하다. 또한 상기와 같은 CRISPR-Cas 시스템의 오프-타겟 효과를 감소시킴에 따라 타겟하는 유전자 또는 핵산을 정확하게 변형시킬 수 있는 정확성 및 특이성을 함께 기대할 수 있다.
이러한 CRISPR-Cas 시스템의 오프-타겟 효과를 감소 또는 제거하거나 CRISPR-Cas 시스템의 정확성 및 특이성 향상을 위해서, 오프-타겟 효과가 적은 가이드 RNA 선정(즉, 오프-타겟 효과가 적은 타겟 선정) 또는 변형 및 CRISPR 효소의 활성(또는 효율)과 특이성을 조절하는 것이 중요한 부분으로 여겨지고 있다.
한편, CRISPR 효소 중 Type II CRISPR 효소인 Cas9은 일반적으로 단일 미스매치를 허용할 수 있으며, 바람직하지 않은 오프-타겟 효과는 다중 미스매치 (multiple mismatches)에 따라 급격하게 감소된다. 이에 따라, 본 발명자들은 단일 뉴클레오타이드 치환이 가이드 RNA에 의도적으로 도입되는 경우, 온-타겟에 대한 활성에 영향을 미치지 않으면서 가이드 RNA의 오프-타겟 활성을 감소시킬 수 있을 것으로 가정하였으며 (도 1), 이러한 가설을 실험을 통해 입증하여 온-타겟 활성이 유지되고 오프-타겟 활성이 감소된, 신규한 가이드 RNA를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
Bioinformatics, 34, 2018, i757-i765
따라서, 본 발명의 목적은 온-타겟 활성을 유지하면서 오프-타겟에 대한 활성만 감소된 가이드 RNA 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 가이드 RNA를 이용한 CRISPR 시스템의 정확도를 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 가이드 RNA를 포함하는 유전자 교정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 가이드 RNA를 포함하는 점 돌연변이로 야기되는 질환 또는 후천성면역결핍증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 가이드 RNA를 포함하는 점 돌연변이로 야기되는 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 가이드 RNA를 이용한 유전자 표적 방법 및 유전자 교정 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 타겟 유전자 영역에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA로서, 상기 뉴클레오타이드 서열이 다음의 특징을 포함하는 가이드 RNA를 제공한다:
i) 오프-타겟 유전자 영역에 대해 원래 (original) 하나의 미스매치를 포함하고;
ii) 타겟 유전자 영역 및 오프-타겟 유전자 영역에 대해 의도적인 (intentional) 하나 또는 두 개의 미스매치를 포함하며;
상기 원래 하나의 미스매치와 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 서로 상이한 위치에 도입된다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 원래 하나의 미스매치와 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 각각 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 프로토스페이서-인접 모티프 (protospacer-adjacent motif)로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 서로 상이한 위치에 도입될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 원래 하나의 미스매치와 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 각각 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 프로토스페이서-인접 모티프 (protospacer-adjacent motif)로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 도입될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 타겟 유전자는 CCR5이고, 상기 오프-타겟 유전자는 CCR2일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 의도적인 미스매치가 도입될 수 있고, 상기 서열번호 1 내지 19의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외된다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 가이드 RNA는:
서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +15 위치 및 +17 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +11 위치 및 +13 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +8 위치 및 +10 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 및 +3 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +14 위치 및 +16 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +13 위치 및 +15 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +15 위치 및 +17 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +12 위치 및 +14 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +4 위치 및 +6 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +2 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +19 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +9 위치 및 +11 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +13 위치 및 +15 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +9 위치 및 +11 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +13 위치 및 +15 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +18 위치 및 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +18 위치 및 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나; 또는
서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +19 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입될 수 있고,
상기 서열번호 1 내지 19의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외된다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입될 수 있고, 상기 서열번호 1 내지 19의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외된다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가이드 RNA는 서열번호 20 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 가이드 RNA는 서열번호 96 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 타겟 유전자는 점 돌연변이 (point mutation)를 포함하는 유전자이고, 상기 오프-타겟 유전자는 야생형 유전자일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 타겟 유전자는 KRAS G12D, G12C 또는 G12V 점 돌연변이를 포함하는 유전자이고, 상기 오프-타겟 유전자는 야생형 KRAS 유전자일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가이드 RNA는 서열번호 413 내지 416로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 의도적인 미스매치가 도입될 수 있고, 상기 서열번호 413 내지 416의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외된다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 가이드 RNA는:
서열번호 413의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +2 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 414의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +6 위치 및 +8 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 415의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +2 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나; 또는
서열번호 416의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +6 위치 및 +8 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가이드 RNA는 서열번호 413 내지 416로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입될 수 있고,
상기 서열번호 413 내지 416의 뉴클레오타이드 서열에서 PAM 서열은 제외된다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 가이드 RNA는 서열번호 427 내지 438로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가이드 RNA는 야생형 가이드 RNA의 온-타겟 활성의 50% 이상을 유지하고, 야생형 가이드 RNA에 비해 감소된 오프-타겟 활성을 나타내거나 오프-타겟 활성을 나타내지 않을 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 가이드 RNA의 제조방법을 제공한다:
(a) 타겟 유전자 영역에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 오프-타겟 유전자 영역에 대해서는 원래 (original) 하나의 미스매치를 포함하는 가이드 RNA를 선별하는 단계; 및
(b) 선별된 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 의도적인 미스매치를 도입하는 단계,
이때, 상기 원래 하나의 미스매치와 상기 하나 또는 두 개의 의도적인 미스매치는 서로 상이한 위치에 도입됨.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 방법으로부터 제조된 RNA는 야생형 가이드 RNA의 온-타겟 활성의 50% 이상을 유지하고, 야생형 가이드 RNA에 비해 감소된 오프-타겟 활성을 나타내거나, 오프-타겟 활성을 나타내지 않을 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 가이드 RNA를 이용한 CRISPR 시스템의 정확도를 향상시키는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 전술한 가이드 RNA를 포함하는, 유전자 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 전술한 가이드 RNA를 포함하는, 점 돌연변이 (point mutation)로 야기되는 질환 또는 후천성면역결핍증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및/또는 전술한 가이드 RNA를 포함하는, 점 돌연변이로 야기되는 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 점 돌연변이로 야기되는 질환은 암 또는 유전대사성 간질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가로, 본 발명은 전술한 가이드 RNA를 이용한 유전자 표적 방법 및/또는 유전자 교정 방법을 제공한다.
CRISPR-Cas9의 정확도를 올리기 위해 높은 정확도의 Cas9을 개발하려는 다양한 시도가 있었으나, 막대한 노력에 비해 다양한 단점들이 존재하며, 아직까지 널리 사용되고 있지 않다. 이러한 관점에서, 본 발명에 따른 가이드 RNA는 이미 검증된 높은 활성을 나타내는 야생형 Cas9와 함께 사용된다는 장점을 가지며, 후천성면역결핍증, 점 돌연변이로 야기되는 유전성 질환 및 암을 포함하는 질환의 예방, 치료 또는 진단 등에 폭넓게 활용될 수 있다.
도 1은 가이드 RNA의 스페이서 영역에서 의도적으로 생성된 단일 미스매치가 온-타겟 및 오프-타겟 부위에서 이의 활성에 미치는 영향에 대한 개략도를 나타낸다. 모델 가이드 RNA (WT)는 위치 10 (밝은 녹색)에서 미스매치가 있는 오프-타겟 부위를 가지며 동시에 강력한 온-타겟 및 오프-타겟 활성 (각각 파란선 및 붉은선)을 나타낸다. 만일 단일 뉴클레오타이드 치환 (복숭아색 사각형)이 스페이서 영역으로 도입되면, 가이드 RNA는 오프-타겟 부위는 두 개의 미스매치를 가질 것이다. 이는 온-타겟 및 오프-타겟 부위에서의 활성에 대한 단일 미스매치의 효과를 체계적으로 분석함으로써 최소한의 오프-타겟 활성 (별표)을 갖는 활성 가이드 RNA를 개발할 수 있을 것으로 예상된다.
도 2는 인간 CCR5 유전자의 오픈 리딩 프레임을 타겟하는 가이드 RNA의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 나타낸 것으로, a는 인간 CCR5 유전자에 특이적인 19개의 가이드 RNA의 위치 (노란색 화살표) 및 인간 CCR2 유전자에서 상응하는 오프-타겟 위치 (회색 화살표)를 나타낸다. 오프-타겟 부위는 단일 뉴클레오타이드만큼 상이하다. 화살표의 방향은 타겟 서열이 유전자의 정방향 가닥으로부터 유래되었는지 또는 역방향 가닥으로부터 유래되었는지를 나타낸다. 유전형 분석 (genotyping) 프라이머 쌍과 가이드 RNA는 색상별로 매치된다. B는 인간 CCR5 유전자를 타겟하는 가이드 RNA의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 측정하는 T7 엔도뉴클레아제 I (T7E1) 어세이 결과를 나타낸다 (M: 사이즈 마커, NT: 처리되지 않음).
도 3은 의도적 미스매치가 CCR5-RG1의 온-타겟 및 오프-타겟 활성에 미치는 영향을 나타낸 것으로, a는 CCR5-RG1 타겟 서열 및 이의 오프-타겟 서열 CCR2-RG1을 비교한 것이다. 위치 16의 원래 미스매치는 붉은색으로 표시되었다. B는 의도적인 미스매치를 포함하는 CCR5-RG1 변이체의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 측정하는 T7E1 어세이 결과를 나타낸다. 이 실험에서, 전이 돌연변이 (transition mutation) (예를 들어, A↔G and C↔T)만 테스트하였으나, 위치 16의 원래 미스매치는 바뀌지 않았다 (M: 사이즈 마커, NT: 처리되지 않음, EV: 공 벡터, WT: 야생형).
도 4는 의도적 미스매치가 CCR5-RG12의 온-타겟 및 오프-타겟 활성에 미치는 영향을 나타낸 것으로, a는 CCR5-RG12 타겟 서열 및 이의 오프-타겟 서열 CCR2-RG12을 비교한 것이다. 위치 10의 원래 미스매치는 붉은색으로 표시되었다. B는 의도적인 미스매치를 포함하는 CCR5-RG12 변이체의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 측정하는 T7E1 어세이 결과를 나타낸다. 이 실험에서, 의도적 돌연변이는 각각 원래 뉴클레오타이드를 3개의 다른 뉴클레오타이드 중 하나로 변경함으로써 도입되었으나, 위치 10에서의 원래 미스매치는 바뀌지 않았다 (NT: 처리되지 않음, WT: 야생형).
도 5는 야생형 CCR5-RG1 및 이의 변이체 일부 (4G, 6A, 7T 및 10A)와 야생형 CCR2-RG12 및 이의 변이체 일부 (2G, 3C, 12G 및 13T)의 T7E1 어세이 결과 및 딥 시퀀싱 결과를 동시에 나타낸 것이다.
도 6은 야생형 CCR5-RG3 및 이의 변이체 일부 (10A, 10T, 10C, 18A, 18T 및 18C)의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 야생형 CCR5-RG7 및 이의 변이체 일부 (10A, 10T, 10C, 18A, 18T 및 18C)의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 야생형 CCR5-RG2 및 이의 변이체 일부 (10T, 10G, 10C, 18A, 18T, 18G, 10G-18A, 10G-18T, 10G-18G)의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 야생형 CCR5-RG3 및 이의 변이체 일부 (10A 및 18A), CCR5-RG7 및 이의 변이체 일부 (10C 및 18A), 그리고 CCR5-RG2 및 이의 변이체 일부 (10G 및 10G-18A)의 T7E1 어세이 결과 및 딥 시퀀싱 결과를 동시에 나타낸 것이다.
도 10의 a는 야생형 KRAS 염기서열과 KRAS G12D 와 KRAS G12V의 점 돌연변이 염기서열을 나타낸 것이고, b는 BXPC3 세포주 및 HPAFII 세포주에서 각각 야생형 KRAS-G12D-RG1 및 KRAS-G12D-RG2의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이며, c는 KRAS-G12V-RG1 및 KRAS-G12V-RG2의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 11의 a는 야생형 KRAS 염기서열을 오프-타겟으로 하고, KRAS G12D 점 돌연변이를 포함하는 염기서열을 온-타겟하는 2종의 가이드 RNA (KRAS G12D-RG1 및 KRAS G12D-RG2) 설계 전략 및 이의 서열을 나타낸 것이고, b는 BxPC3 및 HPAFII 세포주에서 각각 야생형 KRAS-G12D-RG1 및 이의 변이체 (10A, 10G, 10C, 18A, 18G 및 18C)의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이며, c는 BxPC3 및 HPAFII 세포주에서 각각 야생형 KRAS-G12D-RG2 및 이의 변이체 (10A, 10T, 10G, 18T, 18G 및 18C)의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 12의 a는 3종류의 췌장암 세포주 (BxPC3, HPAFII 및 Panc-1)의 유전자형 분석 결과를 나타낸 것이고, b는 Panc-1 세포주에 야생형 KRAS-G12D-RG2 및 이의 변이체 KRAS-G12D-RG2-10A의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이며, c는 3종류의 췌장암 세포주 (BxPC3, HPAFII 및 Panc-1)에서 각각 야생형 KRAS-G12D-RG2 및 이의 변이체 KRAS-G12D-RG2-10A의 처리에 따른 KRAS 단백질 및 KRAS-G12D 돌연변이 단백질의 발현 차이를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이며, d는 3종류의 췌장암 세포주 (BxPC3, HPAFII 및 Panc-1)에서 야생형 KRAS-G12D-RG2 및 이의 변이체 KRAS-G12D-RG2-10A의 처리에 따른 세포 성장을 확인한 결과이다.
도 2는 인간 CCR5 유전자의 오픈 리딩 프레임을 타겟하는 가이드 RNA의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 나타낸 것으로, a는 인간 CCR5 유전자에 특이적인 19개의 가이드 RNA의 위치 (노란색 화살표) 및 인간 CCR2 유전자에서 상응하는 오프-타겟 위치 (회색 화살표)를 나타낸다. 오프-타겟 부위는 단일 뉴클레오타이드만큼 상이하다. 화살표의 방향은 타겟 서열이 유전자의 정방향 가닥으로부터 유래되었는지 또는 역방향 가닥으로부터 유래되었는지를 나타낸다. 유전형 분석 (genotyping) 프라이머 쌍과 가이드 RNA는 색상별로 매치된다. B는 인간 CCR5 유전자를 타겟하는 가이드 RNA의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 측정하는 T7 엔도뉴클레아제 I (T7E1) 어세이 결과를 나타낸다 (M: 사이즈 마커, NT: 처리되지 않음).
도 3은 의도적 미스매치가 CCR5-RG1의 온-타겟 및 오프-타겟 활성에 미치는 영향을 나타낸 것으로, a는 CCR5-RG1 타겟 서열 및 이의 오프-타겟 서열 CCR2-RG1을 비교한 것이다. 위치 16의 원래 미스매치는 붉은색으로 표시되었다. B는 의도적인 미스매치를 포함하는 CCR5-RG1 변이체의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 측정하는 T7E1 어세이 결과를 나타낸다. 이 실험에서, 전이 돌연변이 (transition mutation) (예를 들어, A↔G and C↔T)만 테스트하였으나, 위치 16의 원래 미스매치는 바뀌지 않았다 (M: 사이즈 마커, NT: 처리되지 않음, EV: 공 벡터, WT: 야생형).
도 4는 의도적 미스매치가 CCR5-RG12의 온-타겟 및 오프-타겟 활성에 미치는 영향을 나타낸 것으로, a는 CCR5-RG12 타겟 서열 및 이의 오프-타겟 서열 CCR2-RG12을 비교한 것이다. 위치 10의 원래 미스매치는 붉은색으로 표시되었다. B는 의도적인 미스매치를 포함하는 CCR5-RG12 변이체의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 측정하는 T7E1 어세이 결과를 나타낸다. 이 실험에서, 의도적 돌연변이는 각각 원래 뉴클레오타이드를 3개의 다른 뉴클레오타이드 중 하나로 변경함으로써 도입되었으나, 위치 10에서의 원래 미스매치는 바뀌지 않았다 (NT: 처리되지 않음, WT: 야생형).
도 5는 야생형 CCR5-RG1 및 이의 변이체 일부 (4G, 6A, 7T 및 10A)와 야생형 CCR2-RG12 및 이의 변이체 일부 (2G, 3C, 12G 및 13T)의 T7E1 어세이 결과 및 딥 시퀀싱 결과를 동시에 나타낸 것이다.
도 6은 야생형 CCR5-RG3 및 이의 변이체 일부 (10A, 10T, 10C, 18A, 18T 및 18C)의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 야생형 CCR5-RG7 및 이의 변이체 일부 (10A, 10T, 10C, 18A, 18T 및 18C)의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 야생형 CCR5-RG2 및 이의 변이체 일부 (10T, 10G, 10C, 18A, 18T, 18G, 10G-18A, 10G-18T, 10G-18G)의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 야생형 CCR5-RG3 및 이의 변이체 일부 (10A 및 18A), CCR5-RG7 및 이의 변이체 일부 (10C 및 18A), 그리고 CCR5-RG2 및 이의 변이체 일부 (10G 및 10G-18A)의 T7E1 어세이 결과 및 딥 시퀀싱 결과를 동시에 나타낸 것이다.
도 10의 a는 야생형 KRAS 염기서열과 KRAS G12D 와 KRAS G12V의 점 돌연변이 염기서열을 나타낸 것이고, b는 BXPC3 세포주 및 HPAFII 세포주에서 각각 야생형 KRAS-G12D-RG1 및 KRAS-G12D-RG2의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이며, c는 KRAS-G12V-RG1 및 KRAS-G12V-RG2의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 11의 a는 야생형 KRAS 염기서열을 오프-타겟으로 하고, KRAS G12D 점 돌연변이를 포함하는 염기서열을 온-타겟하는 2종의 가이드 RNA (KRAS G12D-RG1 및 KRAS G12D-RG2) 설계 전략 및 이의 서열을 나타낸 것이고, b는 BxPC3 및 HPAFII 세포주에서 각각 야생형 KRAS-G12D-RG1 및 이의 변이체 (10A, 10G, 10C, 18A, 18G 및 18C)의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이며, c는 BxPC3 및 HPAFII 세포주에서 각각 야생형 KRAS-G12D-RG2 및 이의 변이체 (10A, 10T, 10G, 18T, 18G 및 18C)의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 12의 a는 3종류의 췌장암 세포주 (BxPC3, HPAFII 및 Panc-1)의 유전자형 분석 결과를 나타낸 것이고, b는 Panc-1 세포주에 야생형 KRAS-G12D-RG2 및 이의 변이체 KRAS-G12D-RG2-10A의 T7E1 어세이 결과를 나타낸 것이며, c는 3종류의 췌장암 세포주 (BxPC3, HPAFII 및 Panc-1)에서 각각 야생형 KRAS-G12D-RG2 및 이의 변이체 KRAS-G12D-RG2-10A의 처리에 따른 KRAS 단백질 및 KRAS-G12D 돌연변이 단백질의 발현 차이를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이며, d는 3종류의 췌장암 세포주 (BxPC3, HPAFII 및 Panc-1)에서 야생형 KRAS-G12D-RG2 및 이의 변이체 KRAS-G12D-RG2-10A의 처리에 따른 세포 성장을 확인한 결과이다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 단일 뉴클레오타이드 치환이 가이드 RNA에 의도적으로 도입되는 경우, 온-타겟에 대한 심각한 활성 저하를 유발하지 않으면서 가이드 RNA의 오프-타겟 활성만을 감소시킬 수 있을 것으로 가정하였으며 (도 1), 이러한 가설을 입증함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 타겟 유전자 영역에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA로서, 상기 뉴클레오타이드 서열이 다음의 특징을 포함하는 가이드 RNA에 관한 것이다:
i) 오프-타겟 유전자 영역에 대해 원래 (original) 하나의 미스매치를 포함하고;
ii) 타겟 유전자 영역 및 오프-타겟 유전자 영역에 대해 의도적인 (intentional) 하나 또는 두 개의 미스매치를 포함하며;
상기 원래 하나의 미스매치와 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 서로 상이한 위치에 도입된다.
본 발명에서 용어 "가이드 RNA"는 타겟 유전자 또는 타겟 핵산에 특이적인 RNA를 의미하며, CRISPR 효소와 결합하여 CRISPR 효소를 타겟 유전자 또는 타겟 핵산으로 인도할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 타겟 유전자 또는 타겟 핵산 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CRISPR RNA (crRNA) 및 CRISPR 효소와 결합하는 trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)로 구성될 수 있으며, 이때 상기 crRNA는 타겟 유전자 또는 타겟 핵산 서열과 상보적인 결합을 하는 부분인 가이드 서열 (guide sequence)을 포함한다. 상기 가이드 서열은 타겟 유전자 또는 타겟 핵산 서열을 인지하는 역할을 한다.
본 발명의 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA의 필수적 부분의 융합에 의해 생성된 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 crRNA 및 tracrRNA가 각각 따로 존재하는 이중 RNA (dual RNA)일 수 있다.
본 발명에서 용어 "온-타겟 (on-target)"은 가이드 RNA가 상보적으로 결합하는 타겟 유전자 또는 타겟 핵산의 서열 또는 위치를 의미하며, 용어 "오프-타겟 (off-target)"은 가이드 RNA가 부분적으로 상보적인 결합을 함으로써, 목적하지 않지만 유전자 가위의 활성이 발생하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치를 의미한다.
본 발명에서 용어 "미스매치 (mismatch)"는 DNA 간 또는 DNA와 RNA 염기 간에 상보적인 결합에서 비상보적인 서열이 존재하는 부적정 염기쌍이 발생하는 것을 의미한다.
본 발명의 가이드 RNA에 있어서, 용어 "원래 (original) 하나의 미스매치"는 온-타겟 유전자 영역과 비교하였을 때 오프-타겟 유전자 영역의 뉴클레오타이드 서열에 하나의 뉴클레오타이드 차이가 존재하여 발생되는 미스매치를 의미하며, 원래 (original) 하나의 미스매치만을 포함하는 가이드 RNA는 온-타겟 유전자 영역에 완전히 상보적으로 결합하지만, 오프-타겟 유전자 영역에는 하나의 뉴클레오타이드 차이로 부분적으로 상보적인 결합을 한다. 원래 (original) 하나의 미스매치만을 포함하는 가이드 RNA는 온-타겟 유전자 영역에 완전히 상보적으로 결합하므로, 온-타겟 유전자 영역에 대해서는 미스매치가 도입되지 않은 야생형 가이드 RNA이다.
본 발명의 가이드 RNA에 있어서, 용어 "의도적인 (intentional) 하나 또는 두 개의 미스매치"는 원래 하나의 미스매치와 달리 인공적으로 도입된 하나 또는 두 개의 미스매치를 의미한다. 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치를 포함하는 가이드 RNA는 온-타겟 유전자 영역과 오프-타겟 유전자 영역 둘 다에 대해 공통적으로 하나 또는 두 개의 뉴클레오타이드 차이로 부분적으로 상보적인 결합을 한다.
결과적으로, 원래 하나의 미스매치와 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 서로 상이한 위치에 존재하며, 원래 하나의 미스매치와 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치를 포함하는 가이드 RNA는 온-타겟 유전자 영역에 대해서는 하나 또는 두 개의 뉴클레오타이드 차이로 부분적으로 상보적인 결합을 하고, 오프-타겟 유전자 영역에 대해서는 두 개 또는 세 개의 뉴클레오타이드 차이로 부분적으로 상보적인 결합을 한다.
본 발명의 가이드 RNA에 있어서, 상기 원래 하나의 미스매치와 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 각각 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 스페이서 영역에 존재하며, 바람직하게는 프로토스페이서-인접 모티프 (protospacer-adjacent motif)로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 이상에 존재할 수 있지만, 서로 상이한 위치에 존재한다. 보다 바람직하게는 상기 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 프로토스페이서-인접 모티프 (protospacer-adjacent motif)로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 도입될 수 있다.
본 발명자들은 도 2의 a에 나타난 바와 같이, 하나의 뉴클레오티드가 상이한 고도의 상동성 CCR2 유전자에서 오프-타겟 부위를 갖는 인간 CCR5의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)으로부터 19개의 타겟 서열을 추출하였고, 이들의 구체적인 서열은 표 5에 나타냈다. 이들 중 5개의 가이드 RNA, 즉 RG1-3, 7 및 12는 도 2의 b 및 표 5에서 확인되는 바와 같이 인간 Jurkat T 세포의 온-타겟 및 오프-타겟 부위에 높은 활성을 나타냈다.
가이드 RNA의 온-타겟 및 오프-타겟 활성에 대한 의도적 미스매치의 영향을 조사하기 위해, 도 3의 a에 나타난 바와 같이 위치 16 (PAM으로부터 +16 위치)에서 하나의 미스매치를 포함하는 야생형 버전인 CCR5-RG1에 대해 일련의 전이 돌연변이를 생성하였다. 도 3의 b 및 표 6에서 확인되는 바와 같이 추가의 돌연변이 도입은 의도적인 미스매치의 위치에 따라 상이한 정도로 CCR5-RG1의 오프-타겟 활성을 일관되게 억제하였다. 도 1에 나타난 바와 같이 타겟화된 딥 시퀀싱을 통해 야생형 CCR5-RG1의 온-타겟 및 오프 타겟 활성이 각각 76.5 % 및 8.6 %임을 확인하였다. 특히, 위치 4의 전이 돌연변이체 (4G)는 본래 타겟 부위 (55.5 %)에서 여전히 활성이었지만, 오프-타겟 활성은 1.5%로 현저하게 감소하였다.
또한, 본 발명자들은 CCR5-RG12에서도 의도적인 미스매치의 영향을 조사하였으며, 이는 도 4의 a에 나타난 바와 같이 위치 10 (PAM으로부터 +16 위치)에 원래 미스매치가 존재한다. 도 5에 나타나 바와 같이 딥 시퀀싱을 통해 야생형 CCR5-RG12의 오프-타겟 활성이 40.4%로 매우 강하다는 것을 확인하였다. 다음으로, 57개의 전이 돌연변이체 및 전좌 돌연변이체를 생성하였고 T7E1 어세이 (도 4의 b 및 표 7)를 이용하여 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 측정하였다. 이 실험에서, 13개의 돌연변이 가이드 RNA (6개의 전이 돌연변이체: 2G, 6G, 12G, 13G, 19A 및 20A; 및 8개의 전좌 돌연변이체: 3C, 12C/T, 13T, 18A, 19C 및 20C/T)가 야생형 CCR5-RG12와 유사한 온-타겟 활성을 나타내었고, 6개의 돌연변이 가이드 RNA (2G, 3C, 12G/C, 13T 및 18A)에 대해서는 명백한 오프-타겟 활성이 검출되지 않았다 (도 4의 b 및 표 7). 특히, 위치 12 (12G)에서의 의도적인 미스매치는 오프-타겟 활성을 40.4 %에서 0.8 %로 감소시켰지만, 온-타겟 활성은 크게 손상시키지 않았으며 (야생형 CCR5-RG12의 온-타겟 활성 66.5% vs 12G의 온-타겟 활성 49.8%), 이는 의도적 미스매치가 가이드 RNA의 온-타겟 활성에 영향을 미치지 않으면서 바람직하지 않은 오프-타겟 활성만 효과적으로 제거할 수 있음을 시사한다.
본 발명의 가이드 RNA에 있어서, 상기 원래 하나의 미스매치와 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 각각 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 스페이서 영역에 존재하며, 보다 바람직하게는 프로토스페이서-인접 모티프 (protospacer-adjacent motif)로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 도입될 수 있다.
본 발명자들은 실시예 4에 나타난 바와 같이, 의도적 미스매치의 위치에 따른 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 확인하였고, 그 결과 프로토스페이서-인접 모티프 (protospacer-adjacent motif)로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 어느 하나 또는 둘 다에 의도적 미스매치를 도입하였을 때 온-타겟 활성은 유지되지만 오프-타겟 활성은 크게 줄어든다는 것을 확인하였다 (도 6 내지 8). 이에 따라, +10 위치 및 +18 위치에 의도적 미스매치를 도입하여 제조되는 다양한 가이드 RNA는 유전자 교정 치료 시 야생형 유전자는 오프-타겟으로 하고, 점 돌연변이 유전자는 온-타겟으로 하여, 점 돌연변이로 야기되는 다양한 유전 질환에 대한 효과적인 치료법으로 적용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 제공되는 가이드 RNA는 예를 들어, a) CCR5를 타겟 유전자로 하고, CCR2를 오프-타겟 유전자로 하거나; b) 점 돌연변이가 발생하여 폐암을 유발하는 EGFR 유전자를 타겟 유전자로 하고, 야생형 EGFR 유전자를 오프-타겟 유전자로 하거나; c) 점 돌연변이가 발생하여 유전대사성 간질환인 윌슨병을 유발하는 ATP7B 유전자를 타겟 유전자로 하고, 야생형 ATP7B 유전자를 오프-타겟 유전자로 하거나; 또는 d) 점 돌연변이가 발생하여 췌장암, 대장암 또는 폐암을 유발하는 KRAS 유전자를 타겟 유전자로 하고, 야생형 KRAS 유전자를 오프-타겟 유전자로 할 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 가이드 RNA의 타겟 유전자가 CCR5이고 오프-타겟 유전자가 CCR2인 경우, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 의도적인 미스매치가 도입된 것일 수 있고, 상기 서열번호 1 내지 19의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외된다.
본 발명의 가이드 RNA에 있어서, 의도적인 미스매치는 전이 돌연변이 (transition mutation) 또는 전좌 돌연변이 (transversion mutation)를 유발하여 도입된 것일 수 있다.
예를 들어, 타겟 유전자가 CCR5이고 오프-타겟 유전자가 CCR2인 가이드 RNA의 구체적인 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +15 위치 및 +17 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +11 위치 및 +13 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +8 위치 및 +10 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 및 +3 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +14 위치 및 +16 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +13 위치 및 +15 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +15 위치 및 +17 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +12 위치 및 +14 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +4 위치 및 +6 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +2 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +19 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +9 위치 및 +11 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +13 위치 및 +15 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +9 위치 및 +11 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +13 위치 및 +15 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +18 위치 및 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +18 위치 및 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나; 또는
서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +19 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입될 수 있고;
상기 서열번호 1 내지 19의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외된다.
구체적으로, 이러한 가이드 RNA는 서열번호 20 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
다른 예로, 타겟 유전자가 CCR5이고 오프-타겟 유전자가 CCR2인 가이드 RNA의 구체적인 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입될 수 있고, 상기 서열번호 1 내지 19의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외된다.
구체적으로, 이러한 가이드 RNA는 서열번호 96 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 가이드 RNA의 타겟 유전자가 점 돌연변이, 예를 들어, KRAS G12D, G12C 또는 G12V 점 돌연변이를 포함하는 KRAS 유전자이고, 오프-타겟 유전자가 야생형 KRAS 유전자인 경우, 상기 가이드 RNA는 서열번호 413 내지 416로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 의도적인 미스매치가 도입될 수 있고, 상기 서열번호 413 내지 416의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외된다.
예를 들어, 타겟 유전자가 KRAS G12D, G12C 또는 G12V 점 돌연변이를 포함하는 KRAS 유전자이고, 오프-타겟 유전자가 야생형 KRAS 유전자인 가이드 RNA의 구체적인 뉴클레오타이드 서열은:
서열번호 413의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +2 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 414의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +6 위치 및 +8 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 415의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +2 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나; 또는
서열번호 416의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +6 위치 및 +8 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입될 수 있다.
다른 예로, 타겟 유전자가 KRAS G12D, G12C 또는 G12V 점 돌연변이를 포함하는 KRAS 유전자이고, 오프-타겟 유전자가 야생형 KRAS 유전자인 가이드 RNA의 구체적인 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 413 내지 416로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입될 수 있고, 상기 서열번호 413 내지 416의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외된다.
구체적으로, 이러한 가이드 RNA는 서열번호 427 내지 438로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 가이드 RNA는 야생형 가이드 RNA의 온-타겟 활성의 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상을 유지하고, 바람직하게는 70% 이상을 유지하고, 야생형 가이드 RNA에 비해 감소된 오프-타겟 활성을 나타내거나 오프-타겟 활성을 나타내지 않을 수 있다.
본 발명의 제2 측면은 다음의 단계를 포함하는 가이드 RNA의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 타겟 유전자 영역에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 오프-타겟 유전자 영역에 대해서는 원래 (original) 하나의 미스매치를 포함하는 가이드 RNA를 선별하는 단계; 및
(b) 선별된 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 의도적인 미스매치를 도입하는 단계,
이때, 상기 원래 하나의 미스매치와 상기 하나 또는 두 개의 의도적인 미스매치는 서로 상이한 위치에 도입됨.
본 발명의 제조방법으로부터 제조된 가이드 RNA는 야생형 가이드 RNA의 온-타겟 활성의 50% 이상을 유지하고, 야생형 가이드 RNA에 비해 감소된 오프-타겟 활성을 나타내거나, 오프-타겟 활성을 나타내지 않는다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 각 단계에 언급된 용어에 대한 설명과 제조되는 가이드 RNA의 구성 및 효과는 전술한 바와 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 제3 측면은 전술한 가이드 RNA를 이용한 CRISPR 시스템의 정확도를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
타겟 특이적 유전자 가위는 목적(표적 또는 타겟)하는 유전체 상의 핵산(DNA 또는 RNA)의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 뉴클레아제를 의미한다. 본 발명에서 상기 타겟 특이적 유전자 가위는 특정 뉴클레아제가 목적하는 기능을 발휘할 수 있도록 필요한 다른 요소를 함께 포함하는 개념으로도 사용된다.
상기 뉴클레아제는 게놈 상의 특정 표적 서열을 인식하는 도메인 (부분)과 절단하는 도메인 (부분)이 융합된 뉴클레아제가 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명의 CRISPR 시스템의 정확도를 향상시키는 방법에는 유전체 상의 핵산(DNA 또는 RNA)의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 뉴클레아제가 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 “CRISPR-Cas 시스템”은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소를 코딩하는 서열을 포함하여 이의 발현 또는 활성 유도에 관여하는 모든 요소를 포함하는 것이다. 상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소를 코딩하는 서 열을 포함하는 벡터 시스템(vector system)일 수 있다.
상기 벡터 시스템은 포함되는 구성요소들이 서로 작동적으로 연결된다. 용어 "작동적으로 연결된”은 서열이 목적하는 기능을 발휘하도록 핵산 서열이 기능적 연결된 것을 지칭한다. 예를 들면, 목적하는 유전자, 예를 들면, 선별가능한 마커에 대한 코딩 서열은, 연결된 프로모터 및/또는 조절 영역이 코딩 서열의 발현을 기능적으로 조절하는 경우, 이의 프로모터 및/또는 조절 서열과 작동적 연결 상태에 있다. 이는 또한 이들이 동일한 연결 프로모터 및/또는 조절 영역에 의해 조절될 수 있도록 코딩 서열 사이의 연결을 지칭하고; 코딩 서열 사이의 이러한 연결은 또한 프레임 또는 동일한 코딩프레임에서 연결되는 것으로 지칭될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된”은 또한 기능적, 그러나 비-코딩 서열, 예를 들면, 자가 증식 서열 또는 복제 기원의 연결을 지칭한다. 이러한 서열은, 이들이 정상 기능을 수행할 수 있는 경우, 예를 들면, 숙주세포에서 상기 서열을 포함하는 벡터의 복제, 증식 및/또는 분리를 가능하게 하는 경우, 작동적 연결 상태에 있다.
본 발명의 “CRISPR-Cas 시스템”은 가이드 RNA의 서열 및 CRISPR 효소의 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하여 이의 발현 또는 활성 유도에 관여하는 모든 요소를 포함하는 것으로서, 상기 CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소가 복합체(complex)를 형성하는 RNP(ribonucleoprotein) 시스템일 수 있다. 이때, 상기 RNP는 단백질-RNA 복합체로, RNA와 RNA-결합(binding) 단백질의 상호작용에 의해 형성되는 복합체의 형태를 의미한다.
상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 또는 폴리펩타이드(또는 단백질)로, 대표적으로 Type II CRISPR 효소 또는 Type V CRISPR 효소가 많이 사용된다.
Type II CRISPR 효소으로는 Cas9이 있으며, Cas9은 Actinobacteria (, Actinomyces naeslundii) Cas9, Aquificae Cas9, Bacteroidetes Cas 9, Chlamydiae Cas9, Chloroflexi Cas9, Cyanobacteria Cas9, Elusimicrobia Cas9, Fibrobacteres Cas9, Firmicutes Cas9 (예를 들어, Streptococcus pyogenes Cas9, Streptococcus thermophilus Cas9, Listeria innocua Cas9, Streptococcus agalactiae Cas9, Streptococcus mutans Cas9 및 Enterococcus faecium Cas9), Fusobacteria Cas9, Proteobacteria (예를 들어, Neisseria meningitides, Campylobacter jejuni) Cas9, Spirochaetes (예를 들어, Treponema denticola) Cas9 등 다양한 미생물 유래의 Cas9일 수 있다.
"Cas9”은 가이드 RNA와 결합하여 타겟하는 유전자 또는 핵산의 서열 또는 위치를 절단 또는 변형시키는 효소로서, 가이드 RNA가 상보적인 결합을 하는 핵산가닥(strand)을 절단할 수 있는 HNH 도메인, 가이드 RNA와 비상보적인 결합을 하는 핵산 가닥(strand)을 절단할 수 있는 RuvC 도메인, 타겟을 인식하는 REC 도메인 및 PAM을 인식하는 PI 도메인으로 구성 될 수 있다. 구체적인 Cas9의 구조적 특성은 문헌 [Hiroshi Nishimasu et al. (2014) Cell 156:935-949]를 참고할 수 있다.
또한, 상기 Type V CRISPR 효소으로는 Cpfl이 있으며, 상기 Cpfl은 Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium 또는 Acidaminococcus 유래의 Cpfl일 수 있다.
상기 Cpfl은 Cas9의 RuvC 도메인에 상응하는 유사한 RuvC 도메인이 있으며, Cas9의 HNH 도메인은 결핍되어 있고, 대신에 Nuc 도메인을 포함하며, 타겟을 인식하는 REC 도메인과 WED 도메인 및 PAM을 인식하는 PI 도메인으로 구성될 수 있다. 구체적인 Cpfl의 구조적 특성은 문헌 [Takashi Yamano et al. (2016) Cell 165:949-962]를 참고할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 유전자 또는 핵산 서열 내에 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 인식할 수 있으며, 상기 PAM은 CRISPR 효소의 종류 또는/및 유래에 따라 다를 수 있다.
예를 들어, CRISPR 효소가 SpCas9인 경우 PAM은 5'-NGG-3'일 수 있고, StCas9인 경우 PAM은 5'-NNAGAAW-3'(W = A 또는 T)일 수 있고, NmCas9인 경우 PAM은 5'-NNNNGATT-3'일 수 있고, CjCas9인 경우 PAM은 5'-NNNVRYAC-3' (V = G 또는 C 또는 A, R = A 또는 G, Y = C 또는 T)일 수 있으며, 이 때 상기 N은 A, Τ, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다. 또한, CRISPR 효소가 FnCpfl인 경우 PAM은 5' TTN-3'일 수 있고, AsCpfl 또는 LbCpfl인 경우 PAM은 5'-TTTN-3'일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, Τ, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다.
상기 CRISPR 효소의 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Infomiation)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제4 측면은 전술한 가이드 RNA를 포함하는 유전자 교정용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 유전자 교정용 조성물은 유전체 상의 핵산(게놈 DNA)의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 뉴클레아제를 추가로 포함할 수 있으며, 이에 대한 설명은 전술한 바와 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
예를 들어, 본 발명의 유전자 교정용 조성물은 Cas9 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 유전자 교정용 조성물은, 특히 유전자 교정 치료에 효과적으로 적용될 수 있다. 환자에게서 발견되는 병원성 돌연변이 (pathogenic mutation)의 약 50% 가량이 점 돌연변이 (point mutation)이며, 본 발명의 유전자 교정용 조성물은 점 돌연변이로 야기되는 질환의 유전자 교정 치료 시, 점 돌연변이가 발생한 유전자는 온-타겟이 되고, 야생형 유전자는 오프-타겟이 되어 야생형 서열 (wild-type sequence)을 보존할 수 있는 전략으로 사용되어, 치료 효과를 증진시킬 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 제5 측면은 전술한 가이드 RNA를 포함하는 점 돌연변이 (point mutation)로 야기되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및/또는 전술한 가이드 RNA를 포함하는 점 돌연변이로 야기되는 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 발명은 전술한 가이드 RNA를 포함하는, 점 돌연변이 (point mutation)로 야기되는 질환 또는 후천성면역결핍증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 용어 "예방"은 상기 약학 조성물의 투여에 의해 점 돌연변이로 야기되는 질환 또는 후천성면역결핍증을 억제하거나, 이의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 점 돌연변이로 야기되는 질환 또는 후천성면역결핍증의 증세가 호전되거 나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 점 돌연변이로 야기되는 질환 또는 후천성면역결핍증의 예방 또는 치료방법에 이용될 수 있으며, 구체적으로 상기 예방 또는 치료방법은 점 돌연변이로 야기되는 질환 또는 후천성면역결핍증이 발병되거나 또는 발병될 것으로 예상되는 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 상기 조성물을 도입하는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "개체"란, 점 돌연변이로 야기되는 질환 또는 후천성면역결핍증이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미하고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 유효성분으로 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 구체적으로 10 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 조성물을 0.001 내지 50% 중량 백분율로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 점 돌연변이로 야기되는 질환 또는 후천성면역결핍증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보 네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 기타 항암제, 방사선 치료, 외과적 수술과 병행될 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택 및 병행될 수 있다.
본 발명의 제5 측면과 관련하여, 본 발명은 전술한 가이드 RNA를 포함하는, 점 돌연변이로 야기되는 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
다르게는, 전술한 가이드 RNA 및 Cas9폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 점 돌연변이로 야기되는 질환의 진단용 키트를 제공한다.
다르게는, 전술한 가이드 RNA를 이용한 CRISPR-Cas 시스템으로 점 돌연변이로 야기되는 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 점 돌연변이로 야기되는 질환의 발병 여부, 경과 또는 예후를 확인하는 것이다.
본 발명의 가이드 RNA를 이용한 CRISPR-Cas 시스템은 공지된 다양한 검출 기술과 결합하여, 점 돌연변이로 야기되는 다양한 질환의 진단에 활용될 수 있다. 공지된 검출 기술로는 측방유동분석법 (LFA, Lateral Flow Assay), 색도분석법, 전기분석법, 전기화학센서, 형광 검출법, 미세유체 플랫폼 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 상기 진단용 조성물은 영상을 통하여 점 돌연변이로 야기되는 질환을 진단하기 위하여 분자 영상용 형광체와 결합할 수 있다.
상기 분자 영상용 형광체는 형광을 발생시키는 모든 물질을 말하며, 적색이나 근적외선 (near-infrared)의 형광을 발광하는 것이 바람직하며, 양자 수득량 (quantaum yield)이 높은 형광체가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 분자 영상용 형광체는 상기 진단용 조성물와 결합할 수 있는 형광체, 형광 단백질 또는 기타 영상용 물질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
형광체는 플루오레신 (fluorescein), 보디피 (BODYPY), 테트라메틸로드아민 (Trtramethylrhodamine), 알렉사 (Alexa), 시아닌 (Cyanine), 알로피코시아닌 (allopicocyanine) 또는 이들의 유도체가 바람직하나 이에 한정되 지 않는다.
형광 단백질은 Dronpa 단백질, 형광 발색 유전자 (EGFP), 적색 형광 프로테인 (red fluorescent protein, DsRFP), 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5 또는 기타 형광 단백질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
기타 영상용 물질은 산화철, 방사성 동위원소 등이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, MR, PET과 같은 영상 장 비에 응용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 진단용 조성물을 분리된 진핵 세포 또는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 점 돌연변이로 야기되는 질환의 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 점 돌연변이로 야기되는 질환은, 암 (예를 들어, 췌장암, 대장암, 폐암 등) 또는 유전대사성 간질환 (예를 들어, 윌슨병 (Wilson's disease))일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니며, 유전자 종류에 관계없이 점 돌연변이로 인해 야기되는 것으로 공지된 모든 관련 질환이 대상이 될 수 있다.
다르게는, 본 발명의 제5 측면은 전술한 가이드 RNA를 포함하는, 점 돌연변이로 야기되는 후천성면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
후천성면역결핍증 (Acquired Immune Deficiency Syndrome: AIDS)의 병인은 HIV (Human Immunodeficiency Virus)에 의한 감염이다. CCR5 유전자는 HIV의 수용체로 알려져 있으며, HIV는 수용체인 CCR5 (수용체 이름이자 이를 생성하는 유전자의 이름)를 통해 T 세포 내부로 들어간다. CCR2는 HIV 수용체가 아니지만 염기서열이 매우 비슷하여 CCR5를 타겟으로 제작된 가이드 RNA가 단일 염기서열 미스매치를 나타내는 CCR2의 염기서열에 오프-타겟 효과를 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명의 CCR5 유전자를 온-타겟 유전자로 하는 가이드 RNA는 CCR2 유전자에 속한 오프-타겟에는 효과가 없거나 매우 적어서 보다 안전하게 후천성면역결핍증의 예방 또는 치료에 활용될 수 있다.
본 발명의 후천선면역결핍증 예방 또는 치료용 조성물은 유전체 상의 핵산(DNA)의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 뉴클레아제를 추가로 포함할 수 있으며, 이에 대한 설명은 전술한 바와 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 제6 측면은 전술한 가이드 RNA를 이용한 유전자 표적 방법 및 교정 방법에 관한 것이다.
본 발명의 유전자 표적 방법 및 교정 방법을 수행하기 위해, 전술한 유전자 교정용 조성물이 사용될 수 있으며, 각 방법은 분리된 진핵세포 또는 인간을 제외한 진핵 유기체에 투여함으로써 실행된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
가이드 RNA의 설계 및 클로닝
인간 CCR5 유전체 DNA 서열 (NG_012637.1)의 코딩 영역으로부터 23-nt CRISPR-Cas9 타겟 서열을 추출하였다. 각 23-nt 서열은 20-nt 타겟 서열과 공통의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열 (NGG)을 포함하였다. PAM의 'GG'부분을 제외하고, CCR5로부터 21-nt 서열 세트를 S_CCR5로 표시하였다. 이어서, 각 서열에 
로 주석을 달았다. 유사하게, 인간 CCR2 유전체 DNA 서열 (NG_021428.1)의 코딩 영역으로부터 21-nt 서열 세트를 S_CCR2로 표시하였다. CCR5와 SCCR2를 비교함으로써, CCR2 유전자에서 오프-타겟 부위에 하나의 미스매치를 포함하는 CCR5-특이적 가이드 RNA를 확인하였다. 모든 과정은 맞춤형으로 개발된 Python package pycrispr (native python3)를 포함하는 Python을 사용하여 자동화되었다.
CCR5-특이적 가이드 RNA (표 1), CCR5-RG1 변이체 (표 2) 및 CCR5-RG12 변이체 (표 3)를 클로닝하는데 사용된 올리고머는 Cosmogenetech Inc. (서울, 대한민국)에 의뢰하여 합성하였으며, 각각 표 1 내지 3에 구체적인 서열을 나타내었다. 생성물은 문헌 [Sanjana, N.E., Shalem, O., and Zhang, F. Nat Methods. 11, 783-784 (2014)]에 기재된 바와 같이 lentiCRISPR v2 (Addgene 플라스미드 #52961)에 클로닝되었다.
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가이드
RNA 명칭 |
정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 |
| CCR5-RG1 | caccgCCTGCCTCCGCTCTACTCAC | 126 | aaacGTGAGTAGAGCGGAGGCAGGc | 127 |
| CCR5-RG2 | caccgTACTCACTGGTGTTCATCTT | 128 | aaacAAGATGAACACCAGTGAGTAc | 129 |
| CCR5-RG3 | caccgTGACATCTACCTGCTCAACC | 130 | aaacGGTTGAGCAGGTAGATGTCAc | 131 |
| CCR5-RG4 | caccgCCTGACAATCGATAGGTACC | 132 | aaacGGTACCTATCGATTGTCAGGc | 133 |
| CCR5-RG5 | caccgTGGTGACAAGTGTGATCACT | 134 | aaacAGTGATCACACTTGTCACCAc | 135 |
| CCR5-RG6 | caccgGTCATGGTCATCTGCTACTC | 136 | aaacGAGTAGCAGATGACCATGACc | 137 |
| CCR5-RG7 | caccgGGTGTCGAAATGAGAAGAAG | 138 | aaacCTTCTTCTCATTTCGACACCc | 139 |
| CCR5-RG8 | caccgTGATTGTTTATTTTCTCTTC | 140 | aaacGAAGAGAAAATAAACAATCAc | 141 |
| CCR5-RG9 | caccgCCTTCTCCTGAACACCTTCC | 142 | aaacGGAAGGTGTTCAGGAGAAGGc | 143 |
| CCR5-RG10 | caccgAACACCTTCCAGGAATTCTT | 144 | aaacAAGAATTCCTGGAAGGTGTTc | 145 |
| CCR5-RG11 | caccgATGCAGGTGACAGAGACTCT | 146 | aaacAGAGTCTCTGTCACCTGCATc | 147 |
| CCR5-RG12 | caccgTGCAGGTGACAGAGACTCTT | 148 | aaacAAGAGTCTCTGTCACCTGCAc | 149 |
| CCR5-RG13 | caccgCAGGCCAAAGAATTCCTGGA | 150 | aaacTCCAGGAATTCTTTGGCCTGc | 151 |
| CCR5-RG14 | caccgGAGAAAATAAACAATCATGA | 152 | aaacTCATGATTGTTTATTTTCTCc | 153 |
| CCR5-RG15 | caccgCCAGGTACCTATCGATTGTC | 154 | aaacGACAATCGATAGGTACCTGGc | 155 |
| CCR5-RG16 | caccgGGTACCTATCGATTGTCAGG | 156 | aaacCCTGACAATCGATAGGTACCc | 157 |
| CCR5-RG17 | caccgATGAACACCAGTGAGTAGAG | 158 | aaacCTCTACTCACTGGTGTTCATc | 159 |
| CCR5-RG18 | caccgAACACCAGTGAGTAGAGCGG | 160 | aaacCCGCTCTACTCACTGGTGTTc | 161 |
| CCR5-RG19 | caccgCCAGTGAGTAGAGCGGAGGC | 162 | aaacGCCTCCGCTCTACTCACTGGc | 163 |
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가이드
RNA 명칭 |
정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 |
| CCR5-RG1-1T | caccgCCAGTGAGTAGAGCGGAGGT | 164 | aaacACCTCCGCTCTACTCACTGGc | 165 |
| CCR5-RG1-2A | caccgCCAGTGAGTAGAGCGGAGAC | 166 | aaacGTCTCCGCTCTACTCACTGGc | 167 |
| CCR5-RG1-3A | caccgCCAGTGAGTAGAGCGGAAGC | 168 | aaacGCTTCCGCTCTACTCACTGGc | 169 |
| CCR5-RG1-4G | caccgCCAGTGAGTAGAGCGGGGGC | 170 | aaacGCCCCCGCTCTACTCACTGGc | 171 |
| CCR5-RG1-5A | caccgCCAGTGAGTAGAGCGAAGGC | 172 | aaacGCCTTCGCTCTACTCACTGGc | 173 |
| CCR5-RG1-6A | caccgCCAGTGAGTAGAGCAGAGGC | 174 | aaacGCCTCTGCTCTACTCACTGGc | 175 |
| CCR5-RG1-7T | caccgCCAGTGAGTAGAGTGGAGGC | 176 | aaacGCCTCCACTCTACTCACTGGc | 177 |
| CCR5-RG1-8A | caccgCCAGTGAGTAGAACGGAGGC | 178 | aaacGCCTCCGTTCTACTCACTGGc | 179 |
| CCR5-RG1-9G | caccgCCAGTGAGTAGGGCGGAGGC | 180 | aaacGCCTCCGCCCTACTCACTGGc | 181 |
| CCR5-RG1-10A | caccgCCAGTGAGTAAAGCGGAGGC | 182 | aaacGCCTCCGCTTTACTCACTGGc | 183 |
| CCR5-RG1-11G | caccgCCAGTGAGTGGAGCGGAGGC | 184 | aaacGCCTCCGCTCCACTCACTGGc | 185 |
| CCR5-RG1-12C | caccgCCAGTGAGCAGAGCGGAGGC | 186 | aaacGCCTCCGCTCTGCTCACTGGc | 187 |
| CCR5-RG1-13A | caccgCCAGTGAATAGAGCGGAGGC | 188 | aaacGCCTCCGCTCTATTCACTGGc | 189 |
| CCR5-RG1-14G | caccgCCAGTGGGTAGAGCGGAGGC | 190 | aaacGCCTCCGCTCTACCCACTGGc | 191 |
| CCR5-RG1-15A | caccgCCAGTAAGTAGAGCGGAGGC | 192 | aaacGCCTCCGCTCTACTTACTGGc | 193 |
| CCR5-RG1-17A | caccgCCAATGAGTAGAGCGGAGGC | 194 | aaacGCCTCCGCTCTACTCATTGGc | 195 |
| CCR5-RG1-18G | caccgCCGGTGAGTAGAGCGGAGGC | 196 | aaacGCCTCCGCTCTACTCACCGGc | 197 |
| CCR5-RG1-19T | caccgCTAGTGAGTAGAGCGGAGGC | 198 | aaacGCCTCCGCTCTACTCACTAGc | 199 |
| CCR5-RG1-20T | caccgTCAGTGAGTAGAGCGGAGGC | 200 | aaacGCCTCCGCTCTACTCACTGAc | 201 |
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가이드
RNA 명칭 |
정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 |
| CCR5-RG12-1A | caccgGGTGTCGAAATGAGAAGAAA | 202 | aaacTTTCTTCTCATTTCGACACCc | 203 |
| CCR5-RG12-1T | caccgGGTGTCGAAATGAGAAGAAT | 204 | aaacATTCTTCTCATTTCGACACCc | 205 |
| CCR5-RG12-1C | caccgGGTGTCGAAATGAGAAGAAC | 206 | aaacGTTCTTCTCATTTCGACACCc | 207 |
| CCR5-RG12-2T | caccgGGTGTCGAAATGAGAAGATG | 208 | aaacCATCTTCTCATTTCGACACCc | 209 |
| CCR5-RG12-2G | caccgGGTGTCGAAATGAGAAGAGG | 210 | aaacCCTCTTCTCATTTCGACACCc | 211 |
| CCR5-RG12-2C | caccgGGTGTCGAAATGAGAAGACG | 212 | aaacCGTCTTCTCATTTCGACACCc | 213 |
| CCR5-RG12-3T | caccgGGTGTCGAAATGAGAAGTAG | 214 | aaacCTACTTCTCATTTCGACACCc | 215 |
| CCR5-RG12-3G | caccgGGTGTCGAAATGAGAAGGAG | 216 | aaacCTCCTTCTCATTTCGACACCc | 217 |
| CCR5-RG12-3C | caccgGGTGTCGAAATGAGAAGCAG | 218 | aaacCTGCTTCTCATTTCGACACCc | 219 |
| CCR5-RG12-4A | caccgGGTGTCGAAATGAGAAAAAG | 220 | aaacCTTTTTCTCATTTCGACACCc | 221 |
| CCR5-RG12-4T | caccgGGTGTCGAAATGAGAATAAG | 222 | aaacCTTATTCTCATTTCGACACCc | 223 |
| CCR5-RG12-4C | caccgGGTGTCGAAATGAGAACAAG | 224 | aaacCTTGTTCTCATTTCGACACCc | 225 |
| CCR5-RG12-5T | caccgGGTGTCGAAATGAGATGAAG | 226 | aaacCTTCATCTCATTTCGACACCc | 227 |
| CCR5-RG12-5G | caccgGGTGTCGAAATGAGAGGAAG | 228 | aaacCTTCCTCTCATTTCGACACCc | 229 |
| CCR5-RG12-5C | caccgGGTGTCGAAATGAGACGAAG | 230 | aaacCTTCGTCTCATTTCGACACCc | 231 |
| CCR5-RG12-6T | caccgGGTGTCGAAATGAGTAGAAG | 232 | aaacCTTCTACTCATTTCGACACCc | 233 |
| CCR5-RG12-6G | caccgGGTGTCGAAATGAGGAGAAG | 234 | aaacCTTCTCCTCATTTCGACACCc | 235 |
| CCR5-RG12-6C | caccgGGTGTCGAAATGAGCAGAAG | 236 | aaacCTTCTGCTCATTTCGACACCc | 237 |
| CCR5-RG12-7A | caccgGGTGTCGAAATGAAAAGAAG | 238 | aaacCTTCTTTTCATTTCGACACCc | 239 |
| CCR5-RG12-7T | caccgGGTGTCGAAATGATAAGAAG | 240 | aaacCTTCTTATCATTTCGACACCc | 241 |
| CCR5-RG12-7C | caccgGGTGTCGAAATGACAAGAAG | 242 | aaacCTTCTTGTCATTTCGACACCc | 243 |
| CCR5-RG12-8T | caccgGGTGTCGAAATGTGAAGAAG | 244 | aaacCTTCTTCACATTTCGACACCc | 245 |
| CCR5-RG12-8G | caccgGGTGTCGAAATGGGAAGAAG | 246 | aaacCTTCTTCCCATTTCGACACCc | 247 |
| CCR5-RG12-8C | caccgGGTGTCGAAATGCGAAGAAG | 248 | aaacCTTCTTCGCATTTCGACACCc | 249 |
| CCR5-RG12-9A | caccgGGTGTCGAAATAAGAAGAAG | 250 | aaacCTTCTTCTTATTTCGACACCc | 251 |
| CCR5-RG12-9T | caccgGGTGTCGAAATTAGAAGAAG | 252 | aaacCTTCTTCTAATTTCGACACCc | 253 |
| CCR5-RG12-9C | caccgGGTGTCGAAATCAGAAGAAG | 254 | aaacCTTCTTCTGATTTCGACACCc | 255 |
| CCR5-RG12-11T | caccgGGTGTCGAATTGAGAAGAAG | 256 | aaacCTTCTTCTCAATTCGACACCc | 257 |
| CCR5-RG12-11G | caccgGGTGTCGAAGTGAGAAGAAG | 258 | aaacCTTCTTCTCACTTCGACACCc | 259 |
| CCR5-RG12-11C | caccgGGTGTCGAACTGAGAAGAAG | 260 | aaacCTTCTTCTCAGTTCGACACCc | 261 |
| CCR5-RG12-12T | caccgGGTGTCGATATGAGAAGAAG | 262 | aaacCTTCTTCTCATATCGACACCc | 263 |
| CCR5-RG12-12G | caccgGGTGTCGAGATGAGAAGAAG | 264 | aaacCTTCTTCTCATCTCGACACCc | 265 |
| CCR5-RG12-12C | caccgGGTGTCGACATGAGAAGAAG | 266 | aaacCTTCTTCTCATGTCGACACCc | 267 |
| CCR5-RG12-13T | caccgGGTGTCGTAATGAGAAGAAG | 268 | aaacCTTCTTCTCATTACGACACCc | 269 |
| CCR5-RG12-13G | caccgGGTGTCGGAATGAGAAGAAG | 270 | aaacCTTCTTCTCATTCCGACACCc | 271 |
| CCR5-RG12-13C | caccgGGTGTCGCAATGAGAAGAAG | 272 | aaacCTTCTTCTCATTGCGACACCc | 273 |
| CCR5-RG12-14T | caccgGGTGTCAAAATGAGAAGAAG | 274 | aaacCTTCTTCTCATTTTGACACCc | 275 |
| CCR5-RG12-14G | caccgGGTGTCTAAATGAGAAGAAG | 276 | aaacCTTCTTCTCATTTAGACACCc | 277 |
| CCR5-RG12-14C | caccgGGTGTCCAAATGAGAAGAAG | 278 | aaacCTTCTTCTCATTTGGACACCc | 279 |
| CCR5-RG12-15A | caccgGGTGTAGAAATGAGAAGAAG | 280 | aaacCTTCTTCTCATTTCTACACCc | 281 |
| CCR5-RG12-15T | caccgGGTGTTGAAATGAGAAGAAG | 282 | aaacCTTCTTCTCATTTCAACACCc | 283 |
| CCR5-RG12-15C | caccgGGTGTGGAAATGAGAAGAAG | 284 | aaacCTTCTTCTCATTTCCACACCc | 285 |
| CCR5-RG12-16A | caccgGGTGACGAAATGAGAAGAAG | 286 | aaacCTTCTTCTCATTTCGTCACCc | 287 |
| CCR5-RG12-16T | caccgGGTGGCGAAATGAGAAGAAG | 288 | aaacCTTCTTCTCATTTCGCCACCc | 289 |
| CCR5-RG12-16G | caccgGGTGCCGAAATGAGAAGAAG | 290 | aaacCTTCTTCTCATTTCGGCACCc | 291 |
| CCR5-RG12-17A | caccgGGTATCGAAATGAGAAGAAG | 292 | aaacCTTCTTCTCATTTCGATACCc | 293 |
| CCR5-RG12-17G | caccgGGTTTCGAAATGAGAAGAAG | 294 | aaacCTTCTTCTCATTTCGAAACCc | 295 |
| CCR5-RG12-17C | caccgGGTCTCGAAATGAGAAGAAG | 296 | aaacCTTCTTCTCATTTCGAGACCc | 297 |
| CCR5-RG12-18A | caccgGGAGTCGAAATGAGAAGAAG | 298 | aaacCTTCTTCTCATTTCGACTCCc | 299 |
| CCR5-RG12-18T | caccgGGGGTCGAAATGAGAAGAAG | 300 | aaacCTTCTTCTCATTTCGACCCCc | 301 |
| CCR5-RG12-18C | caccgGGCGTCGAAATGAGAAGAAG | 302 | aaacCTTCTTCTCATTTCGACGCCc | 303 |
| CCR5-RG12-19A | caccgGATGTCGAAATGAGAAGAAG | 304 | aaacCTTCTTCTCATTTCGACATCc | 305 |
| CCR5-RG12-19G | caccgGTTGTCGAAATGAGAAGAAG | 306 | aaacCTTCTTCTCATTTCGACAACc | 307 |
| CCR5-RG12-19C | caccgGCTGTCGAAATGAGAAGAAG | 308 | aaacCTTCTTCTCATTTCGACAGCc | 309 |
| CCR5-RG12-20A | caccgAGTGTCGAAATGAGAAGAAG | 310 | aaacCTTCTTCTCATTTCGACACTc | 311 |
| CCR5-RG12-20T | caccgTGTGTCGAAATGAGAAGAAG | 312 | aaacCTTCTTCTCATTTCGACACAc | 313 |
| CCR5-RG12-20C | caccgCGTGTCGAAATGAGAAGAAG | 314 | aaacCTTCTTCTCATTTCGACACGc | 315 |
가이드 RNA 타겟화 효율의 검증
2-1. T7E1 어세이 및 딥 시퀀싱 (Deep sequencing)
감염성 렌티바이러스는 문헌 [Devkota, S. et al. Int. J. Biochem. Cell Biol. 44, 1887-1896 (2012)]에 기재된 바와 같이 생산되었고, 인간 Jurkat T 세포 (문헌 [Cho, Y.S. et al. PLoS One. 11, e0161899 (2016)])를 감염시키는데 사용하였다. 퓨로마이신 (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 처리하여 감염된 세포를 선별한 후, 유전체 DNA 샘플을 준비하였다. 그 다음 T7 엔도뉴클레아제 1 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)을 사용하여 T7E1 어세이를 수행하였고, 결과를 문헌 [Sung, Y.H. et al. Genome Res. 24, 125-131 (2014)]에 기재된 바와 같이 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. ToolGen (서울, 대한민국)에서 Ilumina Miseq 시스템을 사용하여 딥 시퀀싱 (Deep sequencing)을 수행하였다. T7E1 어세이에 사용된 PCR 프라이머는 표 4에 나타냈다.
| 유전자 |
타겟
가이드 RNAs |
프라이머 명칭 | 정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 | 크기 (bp) |
| CCR5 | RG1-6 | CCR5-F1 /CCR5-R1 |
GACAGGGAAGCTAGCAGCAA | 316 | TTCCTGGGAGAGACGCAAAC | 317 | 693 |
| RG7-10 | CCR5-F3 /CCR5-R3 |
ATGTGAAGCAAATCGCAGCC | 318 | TCCCGAGTAGCAGATGACCA | 319 | 578 | |
| RG11-19 | CCR5-F7/CCR5-R7 | TAAAAGCCAGGACGGTCACC | 320 | CCACTTGAGTCCGTGTCACA | 321 | 665 | |
| CCR2 | RG1-6 | CCR2-F1 /CCR2-R1 |
TTCAGGGAGATGGCTGCAAG | 322 | CAGAAGCAAACACAGCCACC | 323 | 695 |
| RG7-10 | CCR2-F3 /CCR2-R3 |
TTTTGTGGGCAACATGCTGG | 324 | CTTCTCCCCAACGAAGGCAT | 325 | 766 | |
| RG11-19 | CCR2-F4/CCR2-R6 | TAAAAGCCAGGACGGTCACC | 326 | AAACCAGCCGAGACTTCCTG | 327 | 634 |
2-2. CCR2 유전자에 대해 하나의 미스매치를 포함하는 CCR5 특이적 가이드 RNA의 온-타겟 및 오프-타겟 활성의 확인
본 발명자들은 도 2의 a에 나타난 바와 같이, 하나의 뉴클레오티드가 상이한 고도의 상동성 CCR2 유전자에서 오프-타겟 부위를 갖는 인간 CCR5의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)으로부터 19개의 타겟 서열을 추출하였다. 이들 중 5개의 가이드 RNA, 즉 RG1-3, 7 및 12는 도 2의 b 및 표 6에서 확인되는 바와 같이 인간 Jurkat T 세포의 온-타겟 및 오프-타겟 부위에 높은 활성을 나타냈다.
| # | CCR5 유전자에 대한 온-타겟 (+PAM) |
서열번호 | CCR2 유전자에 대한 오프타겟(+PAM) |
서열번호 | T7E1 (CCR5) |
T7E1 (CCR2) |
| 1 | CCAGTGAGTAGAGCGGAGGC AGG | 1 | CCAGcGAGTAGAGCGGAGGC AGG | 328 | +++ | +++ |
| 2 | AACACCAGTGAGTAGAGCGG AGG | 2 | AACACCAGcGAGTAGAGCGG AGG | 329 | +++ | +++ |
| 3 | ATGAACACCAGTGAGTAGAG CGG | 3 | ATGAACACCAGcGAGTAGAG CGG | 330 | +++ | +++ |
| 4 | CCTGCCTCCGCTCTACTCAC TGG | 4 | CCTGCCTCCGCTCTACTCgC TGG | 331 | +++ | - |
| 5 | TACTCACTGGTGTTCATCTT TGG | 5 | TACTCgCTGGTGTTCATCTT TGG | 332 | ++ | - |
| 6 | TGACATCTACCTGCTCAACC TGG | 6 | TGACATtTACCTGCTCAACC TGG | 333 | +++ | - |
| 7 | GGTACCTATCGATTGTCAGG AGG | 7 | GGTAtCTATCGATTGTCAGG AGG | 334 | +++ | +++ |
| 8 | CCAGGTACCTATCGATTGTC AGG | 8 | CCAGGTAtCTATCGATTGTC AGG | 335 | ++ | ++ |
| 9 | CCTGACAATCGATAGGTACC TGG | 9 | CCTGACAATCGATAGaTACC TGG | 336 | +++ | ++ |
| 10 | TGGTGACAAGTGTGATCACT TGG | 10 | TGGTGACAAGTGTGATCACc TGG | 337 | +++ | - |
| 11 | GTCATGGTCATCTGCTACTC GGG | 11 | aTCATGGTCATCTGCTACTC GGG | 338 | ++ | +++ |
| 12 | GGTGTCGAAATGAGAAGAAG AGG | 12 | GGTGTCGAAAcGAGAAGAAG AGG | 339 | +++ | +++ |
| 13 | GAGAAAATAAACAATCATGA TGG | 13 | GAGAAAgTAAACAATCATGA TGG | 340 | +++ | + |
| 14 | TGATTGTTTATTTTCTCTTC TGG | 14 | TGATTGTTTAcTTTCTCTTC TGG | 341 | - | - |
| 15 | CAGGCCAAAGAATTCCTGGA AGG | 15 | CAGGCCgAAGAATTCCTGGA AGG | 342 | +++ | ++ |
| 16 | CCTTCTCCTGAACACCTTCC AGG | 16 | CaTTCTCCTGAACACCTTCC AGG | 343 | - | - |
| 17 | AACACCTTCCAGGAATTCTT TGG | 17 | AACACCTTCCAGGAATTCTT cGG | 344 | - | - |
| 18 | ATGCAGGTGACAGAGACTCT TGG | 18 | AcGCAGGTGACAGAGACTCT TGG | 345 | +++ | ++ |
| 19 | TGCAGGTGACAGAGACTCTT GGG | 19 | cGCAGGTGACAGAGACTCTT GGG | 346 | +++ | ++ |
2-3. 의도적 미스매치를 포함하는 CCR5-RG1 변이체의 온-타겟 및 오프-타겟 활성의 확인
가이드 RNA의 온-타겟 및 오프-타겟 활성에 대한 의도적 미스매치의 영향을 조사하기 위해, 도 3의 a에 나타난 바와 같이 위치 16 (PAM으로부터 +16 위치)에서 하나의 미스매치를 포함하는 야생형 버전인 CCR5-RG1에 대해 일련의 전이 돌연변이를 생성하였고, 이를 표 6에 나타냈다.
| 가이드 RNA 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| CCR5-RG1-1T | CCAGTGAGTA GAGCGGAGGT | 20 |
| CCR5-RG1-2A | CCAGTGAGTA GAGCGGAGAC | 21 |
| CCR5-RG1-3A | CCAGTGAGTA GAGCGGAAGC | 22 |
| CCR5-RG1-4G | CCAGTGAGTA GAGCGGGGGC | 23 |
| CCR5-RG1-5A | CCAGTGAGTA GAGCGAAGGC | 24 |
| CCR5-RG1-6A | CCAGTGAGTA GAGCAGAGGC | 25 |
| CCR5-RG1-7T | CCAGTGAGTA GAGTGGAGGC | 26 |
| CCR5-RG1-8A | CCAGTGAGTA GAACGGAGGC | 27 |
| CCR5-RG1-9G | CCAGTGAGTA GGGCGGAGGC | 28 |
| CCR5-RG1-10A | CCAGTGAGTA AAGCGGAGGC | 29 |
| CCR5-RG1-11G | CCAGTGAGTG GAGCGGAGGC | 30 |
| CCR5-RG1-12C | CCAGTGAGCA GAGCGGAGGC | 31 |
| CCR5-RG1-13A | CCAGTGAATA GAGCGGAGGC | 32 |
| CCR5-RG1-14G | CCAGTGGGTA GAGCGGAGGC | 33 |
| CCR5-RG1-15A | CCAGTAAGTA GAGCGGAGGC | 34 |
| CCR5-RG1-17A | CCAATGAGTA GAGCGGAGGC | 35 |
| CCR5-RG1-18G | CCGGTGAGTA GAGCGGAGGC | 36 |
| CCR5-RG1-19T | CTAGTGAGTA GAGCGGAGGC | 37 |
| CCR5-RG1-20T | TCAGTGAGTA GAGCGGAGGC | 38 |
야생형 CCR5-RG1 및 의도적 미스매치를 포함하는 이의 변이체의 엔도뉴클레아제 활성을 측정하는 T7E1 어세이의 결과에 기초하여 온-타겟 및 오프-타겟 효율을 활성 없음 (-)부터 가장 강한 활성 (+++)까지 임의로 분류하여 표 7에 나타내었다.
도 3의 b 및 표 7에서 확인되는 바와 같이 추가의 돌연변이 도입은 의도적인 미스매치의 위치에 따라 상이한 정도로 CCR5-RG1의 오프-타겟 활성을 일관되게 억제하였다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이 타겟화된 딥 시퀀싱을 통해 야생형 CCR5-RG1의 온-타겟 및 오프 타겟 활성이 각각 76.5 % 및 8.6 %임을 확인하였다. 특히, 위치 4의 전이 돌연변이체 (4G)는 본래 타겟 부위 (55.5 %)에서 여전히 활성이었지만, 오프-타겟 활성은 1.5%로 현저하게 감소하였다.
*: 가이드 RNA와 CCR5 및 CCR2 유전자 사이의 원래 미스매치.
2-4. 의도적 미스매치를 포함하는 CCR5-RG12 변이체의 온-타겟 및 오프-타겟 활성의 확인
본 발명자들은 CCR5-RG12에서도 의도적인 미스매치의 영향을 조사하였으며, 이는 도 4의 a에 나타난 바와 같이 위치 10 (PAM으로부터 +10 위치)에 원래 미스매치가 존재한다. 도 5에 나타나 바와 같이 딥 시퀀싱을 통해 야생형 CCR5-RG12의 오프-타겟 활성이 40.4%로 매우 강하다는 것을 확인하였다.
다음으로, 57개의 전이 돌연변이체 및 전좌 돌연변이체를 생성하였고, 이를 표 8에 나타내었다. T7e1 어세이 (도 4의 b 및 표 9)를 이용하여 57개의 변이체에 대한 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 측정하였다.
| 가이드 RNA 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| CCR5-RG12-1A | GGTGTCGAAATGAGAAGAAA | 39 |
| CCR5-RG12-1C | GGTGTCGAAATGAGAAGAAC | 40 |
| CCR5-RG12-1T | GGTGTCGAAATGAGAAGAAT | 41 |
| CCR5-RG12-2G | GGTGTCGAAATGAGAAGAGG | 42 |
| CCR5-RG12-2C | GGTGTCGAAATGAGAAGACG | 43 |
| CCR5-RG12-2T | GGTGTCGAAATGAGAAGATG | 44 |
| CCR5-RG12-3G | GGTGTCGAAATGAGAAGGAG | 45 |
| CCR5-RG12-3C | GGTGTCGAAATGAGAAGCAG | 46 |
| CCR5-RG12-3T | GGTGTCGAAATGAGAAGTAG | 47 |
| CCR5-RG12-4A | GGTGTCGAAATGAGAAAAAG | 48 |
| CCR5-RG12-4C | GGTGTCGAAATGAGAACAAG | 49 |
| CCR5-RG12-4T | GGTGTCGAAATGAGAATAAG | 50 |
| CCR5-RG12-5G | GGTGTCGAAATGAGAGGAAG | 51 |
| CCR5-RG12-5C | GGTGTCGAAATGAGACGAAG | 52 |
| CCR5-RG12-5T | GGTGTCGAAATGAGATGAAG | 53 |
| CCR5-RG12-6G | GGTGTCGAAATGAGGAGAAG | 54 |
| CCR5-RG12-6C | GGTGTCGAAATGAGCAGAAG | 55 |
| CCR5-RG12-6T | GGTGTCGAAATGAGTAGAAG | 56 |
| CCR5-RG12-7A | GGTGTCGAAATGAAAAGAAG | 57 |
| CCR5-RG12-7C | GGTGTCGAAATGACAAGAAG | 58 |
| CCR5-RG12-7T | GGTGTCGAAATGATAAGAAG | 59 |
| CCR5-RG12-8G | GGTGTCGAAATGGGAAGAAG | 60 |
| CCR5-RG12-8C | GGTGTCGAAATGCGAAGAAG | 61 |
| CCR5-RG12-8T | GGTGTCGAAATGTGAAGAAG | 62 |
| CCR5-RG12-9A | GGTGTCGAAATAAGAAGAAG | 63 |
| CCR5-RG12-9C | GGTGTCGAAATCAGAAGAAG | 64 |
| CCR5-RG12-9T | GGTGTCGAAATTAGAAGAAG | 65 |
| CCR5-RG12-11G | GGTGTCGAAGTGAGAAGAAG | 66 |
| CCR5-RG12-11C | GGTGTCGAACTGAGAAGAAG | 67 |
| CCR5-RG12-11T | GGTGTCGAATTGAGAAGAAG | 68 |
| CCR5-RG12-12G | GGTGTCGAGATGAGAAGAAG | 69 |
| CCR5-RG12-12C | GGTGTCGACATGAGAAGAAG | 70 |
| CCR5-RG12-12T | GGTGTCGATATGAGAAGAAG | 71 |
| CCR5-RG12-13G | GGTGTCGAAATGAGAAGAAG | 72 |
| CCR5-RG12-13C | GGTGTCGAAATGAGAAGAAG | 73 |
| CCR5-RG12-13T | GGTGTCGAAATGAGAAGAAG | 74 |
| CCR5-RG12-14A | GGTGTCAAAATGAGAAGAAG | 75 |
| CCR5-RG12-14C | GGTGTCCAAATGAGAAGAAG | 76 |
| CCR5-RG12-14T | GGTGTCTAAATGAGAAGAAG | 77 |
| CCR5-RG12-15A | GGTGTAGAAATGAGAAGAAG | 78 |
| CCR5-RG12-15G | GGTGTGGAAATGAGAAGAAG | 79 |
| CCR5-RG12-15T | GGTGTTGAAATGAGAAGAAG | 80 |
| CCR5-RG12-16A | GGTGACGAAATGAGAAGAAG | 81 |
| CCR5-RG12-16G | GGTGGCGAAATGAGAAGAAG | 82 |
| CCR5-RG12-16C | GGTGCCGAAATGAGAAGAAG | 83 |
| CCR5-RG12-17A | GGTATCGAAATGAGAAGAAG | 84 |
| CCR5-RG12-17C | GGTCTCGAAATGAGAAGAAG | 85 |
| CCR5-RG12-17T | GGTTTCGAAATGAGAAGAAG | 86 |
| CCR5-RG12-18A | GGAGTCGAAATGAGAAGAAG | 87 |
| CCR5-RG12-18G | GGGGTCGAAATGAGAAGAAG | 88 |
| CCR5-RG12-18C | GGCGTCGAAATGAGAAGAAG | 89 |
| CCR5-RG12-19A | GATGTCGAAATGAGAAGAAG | 90 |
| CCR5-RG12-19C | GCTGTCGAAATGAGAAGAAG | 91 |
| CCR5-RG12-19T | GTTGTCGAAATGAGAAGAAG | 92 |
| CCR5-RG12-20A | AGTGTCGAAATGAGAAGAAG | 93 |
| CCR5-RG12-20C | CGTGTCGAAATGAGAAGAAG | 94 |
| CCR5-RG12-20T | TGTGTCGAAATGAGAAGAAG | 95 |
마찬가지로, 야생형 CCR5-RG12 및 의도적 미스매치를 포함하는 이의 변이체의 엔도뉴클레아제 활성을 측정하는 T7E1 어세이의 결과에 기초하여, 온-타겟 및 오프-타겟 효율을 활성 없음 (-)부터 가장 강한 활성 (+++)까지 임의로 분류하여 표 9에 나타내었다.
이 실험에서, 13개의 돌연변이 가이드 RNA (6개의 전이 돌연변이체: 2G, 6G, 12G, 13G, 19A 및 20A; 및 8개의 전좌 돌연변이체: 3C, 12C/T, 13T, 18A, 19C 및 20C/T)가 야생형 CCR5-RG12와 유사한 온-타겟 활성을 나타내었고, 6개의 돌연변이 가이드 RNA (2G, 3C, 12G/C, 13T 및 18A)에 대해서는 명백한 오프-타겟 활성이 검출되지 않았다 (도 4의 b 및 표 9). 특히, 위치 12 (12G)에서의 의도적인 미스매치는 오프-타겟 활성을 40.4 %에서 0.8 %로 감소시켰지만, 온-타겟 활성은 크게 손상시키지 않았으며 (야생형 CCR5-RG12의 온-타겟 활성 66.5% vs 12G의 온-타겟 활성 49.8%), 이는 의도적 미스매치가 가이드 RNA의 온-타겟 활성에 영향을 미치지 않으면서 바람직하지 않은 오프-타겟 활성만 효과적으로 제거할 수 있음을 시사한다.
*: 가이드 RNA와 CCR5 및 CCR2 유전자 사이의 원래 미스매치. n.d. 측정되지 않음.
상기 실시예의 결과는 Cas9의 불충분한 정확도 (fidelity)가 하나의 뉴클레오티드 치환에 의해 생성된 의도적 미스매치에 의해 역설적으로 보상됨을 나타낸다. 점 돌연변이가 유전성 질환 및 암의 발생에 빈번하기 때문에, 본 발명의 가이드 RNA를 이용한 전략은 치료 유전자 편집, 특히 특유의 가이드 RNA가 필연적으로 야생형 및 돌연변이 서열을 모두 소화시키는 경우에 신뢰할 수 있는 돌파구를 제공한다.
의도적 미스매치의 위치에 따른 온-타겟 및 오프-타겟 활성의 확인 및 검증
상기 실시예의 결과들은 온-타겟에 대한 효과는 최소화하면서 오프-타겟에 대한 활성을 줄일 수 있는 의도적인 미스매치의 추가가 가능하다는 것을 증명하였으나, 미스매치 특이적인 위치를 특정하지는 못했다. 따라서, 본 실시예에서는 그러한 위치를 찾기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
가이드 RNA의 스페이서 서열 중에 PAM에 가까운 부분들에 미스매치가 존재할 경우 Cas9의 엔도뉴클레아제 활성 (endonuclease activity)이 현저히 줄어든다는 것은 잘 알려진 사실이므로(Nat Biotechnol. 2013 Mar;31(3):233-9.; Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):827-32.), 이 부위를 제외하고 상기 표 7과 9를 비교하였을 때, 위치 10과 위치 18에 미스매치를 인위적으로 집어넣었을 경우, 높은 온-타겟에 비해 매우 낮은 오프-타겟 효과가 나타난다는 것을 확인하였다. 따라서, 해당 두 위치에 추가되는 미스매치가 가이드 RNA의 정확도 (fidelity)에 큰 영향을 줄 것이라고 여겨진다.
상기 가설을 검증하기 위해, 표 5에서 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 효과에 큰 차이가 없었던 타겟 가이드 RNA RG3, RG7 및 RG2에서 위치 10 또는 18에 의도적인 미스매치를 추가하여 변이체를 생성하고 이들의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 추가로 확인하였다.
3-1. T7E1 어세이 및 딥 시퀀싱 (Deep sequencing)
실시예 2-1과 동일한 방법으로 T7E1 어세이 및 딥 시퀀싱 (Deep sequencing)을 수행하였다. 표 10은 RG2, RG3 및 RG7과 이들의 변이체들에 대한 T7E1 어세이에 사용된 PCR 프라이머를 나타낸다.
| 유전자 |
타겟
가이드 RNAs |
프라이머 | 정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 | Size (bp) |
| CCR5 | RG2,3,7 | CCR5-F1/CCR5-R1 | GACAGGGAAGCTAGCAGCAA | 407 | TTCCTGGGAGAGACGCAAAC | 408 | 693 |
| CCR2 | RG2,3,7 | CCR2-F1/CCR2-R1 | TTCAGGGAGATGGCTGCAAG | 409 | CAGAAGCAAACACAGCCACC | 410 | 695 |
3-2. 위치 10 및/또는 18에 의도적 미스매치를 포함하는 CCR5-RG3 변이체의 온-타겟 및 오프-타겟 활성의 확인
상기 가설을 검증하기 위해서 추가적인 실험을 진행했다. 도 6의 a에 나타난 바와 같이 RG3는 위치 9에 원래 미스매치가 있으나, 표 5에서 확인된 바와 같이 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 효과에는 큰 차이가 없었다. 따라서, CCR5-RG3에서 위치 10 또는 18에 의도적인 미스매치를 추가하여 변이체를 생성하고 이들의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 추가로 확인하였다. 도 6의 b와 같이 위치 10과 위치 18에 의도적인 미스매치를 추가한 결과, 모든 경우에 있어서 오프-타겟 활성이 거의 관찰되지 않았다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이 타겟화된 딥 시퀀싱을 통해 야생형 CCR5-RG3 온-타겟 및 CCR2-RG3 오프-타겟 활성이 각각 99.7% 및 90.1%로 매우 강하다는 것을 확인하였다. 위치 10과 위치 18에 의도적인 미스매치를 추가한 CCR5-RG3-10A 및 CCR5-RG3-18A 온타겟 활성은 각각 68% 및 37.4%를 유지하였고, CCR2-RG3-10A 및 CCR2-RG3-18A 오프-타겟 활성은 각각 0.8% 및 2.2%로 현저하게 감소하였다.
CCR5-RG3의 6종의 변이체 및 이들 가이드 RNA의 클로닝에 사용된 올리고머들은 각각 표 11 및 표 12에 나타내었다.
| 가이드 RNA 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| CCR5-RG3-10A | ATGAACACCAATGAGTAGAG | 96 |
| CCR5-RG3-10T | ATGAACACCATTGAGTAGAG | 97 |
| CCR5-RG3-10C | ATGAACACCACTGAGTAGAG | 98 |
| CCR5-RG3-18A | ATAAACACCAGTGAGTAGAG | 99 |
| CCR5-RG3-18T | ATTAACACCAGTGAGTAGAG | 100 |
| CCR5-RG3-18C | ATCAACACCAGTGAGTAGAG | 101 |
|
가이드
RNA 명칭 |
정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 |
| CCR5-RG3-10A | caccgATGAACACCAATGAGTAGAG | 347 | aaacCTCTACTCATTGGTGTTCATc | 348 |
| CCR5-RG3-10T | caccgATGAACACCATTGAGTAGAG | 349 | aaacCTCTACTCAATGGTGTTCATc | 350 |
| CCR5-RG3-10C | caccgATGAACACCACTGAGTAGAG | 351 | aaacCTCTACTCAGTGGTGTTCATc | 352 |
| CCR5-RG3-18A | caccgATAAACACCAGTGAGTAGAG | 353 | aaacCTCTACTCACTGGTGTTTATc | 354 |
| CCR5-RG3-18T | caccgATTAACACCAGTGAGTAGAG | 355 | aaacCTCTACTCACTGGTGTTAATc | 356 |
| CCR5-RG3-18C | caccgATCAACACCAGTGAGTAGAG | 357 | aaacCTCTACTCACTGGTGTTGATc | 358 |
3-3. 위치 10 및/또는 18에 의도적 미스매치를 포함하는 CCR5-RG7 변이체의 온-타겟 및 오프-타겟 활성의 확인
도 7의 a에 나타난 바와 같이 RG7은 위치 16에 미스매치가 존재하지만, 표 5에서 확인된 바와 같이 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 효과에는 큰 차이가 없었다. 따라서, CCR5-RG7에서 위치 10 및/또는 18에 의도적인 미스매치를 추가하여 변이체를 생성하고 이들의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 추가로 확인하였다. CCR5-RG7의 9종의 변이체 및 이들 가이드 RNA의 클로닝에 사용된 올리고머들은 각각 표 13 및 표 14에 나타내었다.
| 가이드 RNA 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| CCR5-RG7-10A | GGTACCTATCAATTGTCAGG | 102 |
| CCR5-RG7-10T | GGTACCTATCTATTGTCAGG | 103 |
| CCR5-RG7-10C | GGTACCTATCCATTGTCAGG | 104 |
| CCR5-RG7-18A | GGAACCTATCGATTGTCAGG | 105 |
| CCR5-RG7-18G | GGGACCTATCGATTGTCAGG | 106 |
| CCR5-RG7-18C | GGCACCTATCGATTGTCAGG | 107 |
| CCR5-RG7-10C-18A | GGAACCTATCCATTGTCAGG | 108 |
| CCR5-RG7-10C-18G | GGGACCTATCCATTGTCAGG | 109 |
| CCR5-RG7-10C-18C | GGCACCTATCCATTGTCAGG | 110 |
| 가이드 RNA 명칭 | 정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 |
| CCR5-RG7-10A | caccgGGTACCTATCAATTGTCAGG | 359 | aaacCCTGACAATTGATAGGTACCc | 360 |
| CCR5-RG7-10T | caccgGGTACCTATCTATTGTCAGG | 361 | aaacCCTGACAATAGATAGGTACCc | 362 |
| CCR5-RG7-10C | caccgGGTACCTATCCATTGTCAGG | 363 | aaacCCTGACAATGGATAGGTACCc | 364 |
| CCR5-RG7-18A | caccgGGAACCTATCGATTGTCAGG | 365 | aaacCCTGACAATCGATAGGTTCCc | 366 |
| CCR5-RG7-18G | caccgGGGACCTATCGATTGTCAGG | 367 | aaacCCTGACAATCGATAGGTCCCc | 368 |
| CCR5-RG7-18C | caccgGGCACCTATCGATTGTCAGG | 369 | aaacCCTGACAATCGATAGGTGCCc | 370 |
| CCR5-RG7-10C-18A | caccgGGAACCTATCCATTGTCAGG | 371 | aaacCCTGACAATGGATAGGTTCCc | 372 |
| CCR5-RG7-10C-18G | caccgGGGACCTATCCATTGTCAGG | 373 | aaacCCTGACAATGGATAGGTCCCc | 374 |
| CCR5-RG7-10C-18C | caccgGGCACCTATCCATTGTCAGG | 375 | aaacCCTGACAATGGATAGGTGCCc | 376 |
도 7의 b와 같이 위치 10과 위치 18에 의도적인 미스매치를 추가한 결과, 10A, 10T 및 18C의 경우 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 활성이 대부분 사라졌고, 10C, 18A 및 18G의 경우 온-타겟은 야생형과 거의 같은 수준의 활성을 가지고 있으나, 오프-타겟에 대한 활성이 대부분 사라지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이 타겟화된 딥 시퀀싱을 통해 야생형 CCR5-RG7 온-타겟 및 CCR2-RG7 오프-타겟 활성이 각각 87.1% 및 68.9%로 강하다는 것을 확인하였다. 위치 10과 위치 18에 의도적인 미스매치를 추가한 CCR5-RG7-10C 및 CCR5-RG7-18A 온타겟 활성은 각각 62.8% 및 77.4%를 유지하였고, CCR2-RG7-10C 및 CCR2-RG7-18A 오프-타겟 활성은 각각 1.9% 및 1.6%로 현저하게 감소하였다.
3-4. 위치 10 및/또는 18에 의도적 미스매치를 포함하는 CCR5-RG2 변이체의 온-타겟 및 오프-타겟 활성의 확인
도 8의 a에 나타난 바와 같이 RG2는 위치 12에 미스매치가 존재하지만, 표 5에서 확인된 바와 같이 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 활성이 동일한 수준으로 나타났다. 따라서, CCR5-RG2에서 위치 10 및/또는 18에 의도적인 미스매치를 추가하여 변이체를 생성하고 이들의 온-타겟 및 오프-타겟 활성을 추가로 확인하였다. CCR5-RG2의 15종의 변이체 및 이들 가이드 RNA의 클로닝에 사용된 올리고머들은 각각 표 15 및 표 16에 나타내었다.
| 가이드 RNA 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| CCR5-RG2-10T | AACACCAGTGTGTAGAGCGG | 111 |
| CCR5-RG2-10G | AACACCAGTGGGTAGAGCGG | 112 |
| CCR5-RG2-10C | AACACCAGTGCGTAGAGCGG | 113 |
| CCR5-RG2-18A | AAAACCAGTGAGTAGAGCGG | 114 |
| CCR5-RG2-18T | AATACCAGTGAGTAGAGCGG | 115 |
| CCR5-RG2-18G | AAGACCAGTGAGTAGAGCGG | 116 |
| CCR5-RG2-10T-18A | AAAACCAGTGTGTAGAGCGG | 117 |
| CCR5-RG2-10T-18T | AATACCAGTGTGTAGAGCGG | 118 |
| CCR5-RG2-10T-18G | AAGACCAGTGTGTAGAGCGG | 119 |
| CCR5-RG2-10G-18A | AAAACCAGTGGGTAGAGCGG | 120 |
| CCR5-RG2-10G-18T | AATACCAGTGGGTAGAGCGG | 121 |
| CCR5-RG2-10G-18G | AAGACCAGTGGGTAGAGCGG | 122 |
| CCR5-RG2-10C-18A | AAAACCAGTGCGTAGAGCGG | 123 |
| CCR5-RG2-10C-18T | AATACCAGTGCGTAGAGCGG | 124 |
| CCR5-RG2-10C-18G | AAGACCAGTGCGTAGAGCGG | 125 |
| 가이드 RNA 명칭 | 정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 |
| CCR5-RG2-10T | caccgAACACCAGTGTGTAGAGCGG | 377 | aaacCCGCTCTACACACTGGTGTTc | 378 |
| CCR5-RG2-10G | caccgAACACCAGTGGGTAGAGCGG | 379 | aaacCCGCTCTACCCACTGGTGTTc | 380 |
| CCR5-RG2-10C | caccgTGACATCTACCTGCTCAACC | 381 | aaacGGTTGAGCAGGTAGATGTCAc | 382 |
| CCR5-RG2-18A | caccgCCTGACAATCGATAGGTACC | 383 | aaacGGTACCTATCGATTGTCAGGc | 384 |
| CCR5-RG2-18T | caccgTGGTGACAAGTGTGATCACT | 385 | aaacAGTGATCACACTTGTCACCAc | 386 |
| CCR5-RG2-18G | caccgGTCATGGTCATCTGCTACTC | 387 | aaacGAGTAGCAGATGACCATGACc | 388 |
| CCR5-RG2-10T-18A | caccgAAAACCAGTGTGTAGAGCGG | 389 | aaacCCGCTCTACACACTGGTTTTc | 390 |
| CCR5-RG2-10T-18T | caccgAATACCAGTGTGTAGAGCGG | 391 | aaacCCGCTCTACACACTGGTATTc | 392 |
| CCR5-RG2-10T-18G | caccgAAGACCAGTGTGTAGAGCGG | 393 | aaacCCGCTCTACACACTGGTCTTc | 394 |
| CCR5-RG2-10G-18A | caccgAAAACCAGTGGGTAGAGCGG | 395 | aaacCCGCTCTACCCACTGGTTTTc | 396 |
| CCR5-RG2-10G-18T | caccgAATACCAGTGGGTAGAGCGG | 397 | aaacCCGCTCTACCCACTGGTATTc | 398 |
| CCR5-RG2-10G-18G | caccgAAGACCAGTGGGTAGAGCGG | 399 | aaacCCGCTCTACCCACTGGTCTTc | 400 |
| CCR5-RG2-10C-18A | caccgAAAACCAGTGCGTAGAGCGG | 401 | aaacCCGCTCTACGCACTGGTTTTc | 402 |
| CCR5-RG2-10C-18T | caccgAATACCAGTGCGTAGAGCGG | 403 | aaacCCGCTCTACGCACTGGTATTc | 404 |
| CCR5-RG2-10C-18G | caccgAAGACCAGTGCGTAGAGCGG | 405 | aaacCCGCTCTACGCACTGGTCTTc | 406 |
도 8의 b와 같이 위치 10과 위치 18에 의도적인 미스매치를 추가한 결과, 위치 10의 미스매치에서는 온-타겟 및 오프-타겟에 모두 활성 변화가 없었다. 또한, 위치 18에서는 모두 온-타겟 활성은 변화가 없었고, 18A와 18T의 경우 오프-타겟에 대한 활성이 존재하기는 하지만, 상당히 낮아졌다는 것을 확인할 수 있었다. 이에 도 8의 c와 같이, 위치 18 변이체들에 10G 미스매치를 추가하였다. 그 결과, 도 8의 c에서 확인되는 바와 같이, 10G/18A 미스매치의 경우 여전히 높은 온-타겟 활성을 유지하면서 10G와 18A 각각의 미스매치에 비해 오프-타겟 활성이 현저히 줄어들었다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이 타겟화된 딥 시퀀싱을 통해 야생형 CCR5-RG2 온-타겟 및 CCR2-RG2 오프-타겟 활성이 각각 78.9% 및 93.1%로 매우 강하다는 것을 확인하였다. 위치 10에 의도적인 미스매치를 추가한 CCR5-RG2-10G 온-타겟 및 CCR2-RG2-10G 오프-타겟 활성은 각각 92.5% 및 91.4%로 모두 활성 변화가 없었다. 그러나, 위치 10의 인위적 미스매치에 위치 18의 인위적 미스매치 중 하나를 추가하였을 때, CCR5-RG2-10G/18A 온-타겟 활성은 51.5%로 유지하면서, CCR2-RG2-10G/18A 오프-타겟 활성은 및 5.7%를 나타내어, 10G와 18A 각각의 미스매치에 비해 오프-타겟 활성이 현저히 감소하였다. 상기와 같은 결과를 통해, 위치 10과 위치 18에 추가되는 미스매치는 온-타겟 활성을 유지하면서 오프-타겟 활성을 현저하게 감소시키는 효과를 나타냄을 증명하였다.
결론적으로, 위치 10과 위치 18에 추가되는 미스매치는 온-타겟 활성을 유지하면서 오프-타겟 활성을 크게 줄이는 효과를 나타냄을 증명하였다.
점 돌연변이를 포함하는 KRAS 유전자에 대한 유전자가위 활성 확인
상기 실시예들을 통해 검증된 결과를 토대로, 암 발생의 원인이 되는 점 돌연변이 (point mutation)를 야생형 유전자 및 염기서열로부터 구분이 가능함을 증명하기 위해 KRAS 유전자를 타겟으로 선정하여 가이드 RNA를 설계 및 클로닝하였다. KRAS 유전자의 점 돌연변이는 췌장, 대장, 폐암에서 주로 발견되며, KRAS G12D, G12C, G12V 돌연변이가 높은 비율로 나타나는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 췌장암에서 주요 발병 원인인 KRAS G12D와 G12V를 온-타겟으로 하는 가이드 RNA를 설계하고, 위치 10과 위치 18에 의도적인 미스매치를 추가하였을 때, 야생형 유전자 및 이의 염기서열과 돌연변이 유전자 및 이의 염기서열을 구분하여 돌연변이를 특이적으로 자르는 선별 능력을 나타낼 수 있는지 검증하기 위해 추가 실험을 진행하였다.
도 10의 a는 야생형 KRAS 염기서열과 KRAS G12D 및 KRAS G12V의 점 돌연변이 염기서열을 나타낸다. 야생형 KRAS 염기서열을 가지는 췌장암 세포주 BxPC3에 매치되는 가이드 RNA, KRAS G12D 점 돌연변이 염기서열을 가지는 췌장암 세포주 HPAFII에 매치되는 가이드 RNA 및 KRAS G12V 점 돌연변이 염기서열을 가지는 췌장암 세포주 CFPAC에 매치되는 가이드 RNA를 표 17과 같이 설계하였다. KRAS G12D 및 KRAS G12V 특이적 가이드 RNA를 클로닝하는데 사용된 올리고머의 구체적인 서열은 표 18에 나타내었다.
| 세포주 | KRAS 유전자형 | Spacer + PAM | |||
| RG1 | 서열번호 | RG2 | 서열번호 | ||
| BXPC3 | 야생형 | CTTGTGGTAGTTGGAGCTGG TGG | 411 | GTAGTTGGAGCTGGTGGCGT AGG | 412 |
| HPAFII | NM_004985: c.35G>A, p.G12D | CTTGTGGTAGTTGGAGCTGa TGG | 413 | GTAGTTGGAGCTGaTGGCGT AGG | 414 |
| CFPAC | NM_004985: c.35G>T, p.G12V | CTTGTGGTAGTTGGAGCTGt TGG | 415 | GTAGTTGGAGCTGtTGGCGT AGG | 416 |
| sgRNA 명칭 | 정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 |
| KRAS-G12D-RG1 | CACCgCTTGTGGTAGTTGGAGCTGa | 417 | AAACtCAGCTCCAACTACCACAAGc | 418 |
| KRAS-G12D-RG2 | CACCgGTAGTTGGAGCTGaTGGCGT | 419 | AAACACGCCAtCAGCTCCAACTACc | 420 |
| KRAS-G12V-RG1 | CACCgCTTGTGGTAGTTGGAGCTGt | 421 | AAACaCAGCTCCAACTACCACAAGc | 422 |
| KRAS-G12V-RG2 | CACCgGTAGTTGGAGCTGtTGGCGT | 423 | AAACACGCCAaCAGCTCCAACTACc | 424 |
상기 설계된 가이드 RNA를 이용하여 야생형 KRAS 세포주 (오프-타겟)와 KRAS-G12D 및 G12V 점 돌연변이를 가지는 세포주 (온-타겟)에 대한 유전자가위 활성은 실시예 2-1과 동일한 방법으로 T7E1 어세이를 수행하여 확인하였다. T7E1 어세이에 사용된 PCR 프라이머는 표 19에 나타내었다.
| 유전자 |
타겟
sgRNAs |
프라이머 명칭 | 정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 | Size (bp) |
| KRAS | G12D, G12V | KrasG12 | TTTTCTTAAGCGTCGATGGAGGA | 425 | TCTACCCTCTCACGAAACTCTGA | 426 | 614 |
그 결과, 도 10의 b에서 확인되는 바와 같이, 야생형 KRAS-G12D-RG1 및 KRAS-G12D-RG2 가이드 RNA는 야생형 염기서열과 돌연변이 염기서열 모두에 유전자가위 활성을 나타내어, 오프-타겟 및 온-타겟 활성을 모두 가지는 것으로 확인이 되었다. 반면, 도 10의 c에서 확인되는 바와 같이, 야생형 KRAS-G12V-RG1 및 KRAS-G12V-RG2 가이드 RNA는 야생형 염기서열에서는 유전자가위 활성이 없고, 돌연변이 염기서열에서는 유전자가위 활성을 나타내어, 오프-타겟 활성이 없고 온-타겟 활성만을 가지는 것으로 확인되었다. 결과적으로, KRAS-G12V에 대해서는 가이드 RNA는 야생형 염기서열과 돌연변이 염기서열을 구분하여 자를 수 있는 적합한 가이드 RNA를 찾을 수 있었다. 그러나, KRAS-G12D의 가이드 RNA는 야생형 염기서열과 돌연변이 염기서열을 구분할 수 없었기 때문에, 위치 10과 위치 18에 의도적인 미스매치를 추가하여 오프-타겟 활성을 감소시키고자 하였다.
도 11의 a에 나타난 바와 같이, KRAS 야생형 염기서열과 KRAS G12D 점 돌연변이를 타겟하는 가이드 RNA 2개 KRAS G12D-RG1 및 KRAS G12D-RG2의 위치 10과 위치 18에 의도적인 미스매치를 추가하여, KRAS 야생형 염기서열을 가지는 췌장암 세포주인 BxPC3 (오프-타겟)와 KRAS G12D 점 돌연변이 염기서열을 가지는 췌장암 세포주인 HPAFII (온-타겟)에 대해 각각 유전자가위 활성을 확인하였다.
6종의 KRAS G12D-RG1 변이체와 6종의 KRAS G12D-RG2 변이체 및 이를 클로닝하는데 사용된 올리고머의 구체적인 서열은 각각 표 20 및 21에 나타내었다.
| 가이드 RNA 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| KRAS-G12D-RG1-10A | CTTGTGGTAGATGGAGCTGa | 427 |
| KRAS-G12D-RG1-10C | CTTGTGGTAGCTGGAGCTGa | 428 |
| KRAS-G12D-RG1-10G | CTTGTGGTAGGTGGAGCTGa | 429 |
| KRAS-G12D-RG1-18A | CTAGTGGTAGTTGGAGCTGa | 430 |
| KRAS-G12D-RG1-18C | CTCGTGGTAGTTGGAGCTGa | 431 |
| KRAS-G12D-RG1-18G | CTGGTGGTAGTTGGAGCTGa | 432 |
| KRAS-G12D-RG2-10A | GTAGTTGGAGATGaTGGCGT | 433 |
| KRAS-G12D-RG2-10T | GTAGTTGGAGTTGaTGGCGT | 434 |
| KRAS-G12D-RG2-10G | GTAGTTGGAGGTGaTGGCGT | 435 |
| KRAS-G12D-RG2-18T | GTTGTTGGAGCTGaTGGCGT | 436 |
| KRAS-G12D-RG2-18G | GTGGTTGGAGCTGaTGGCGT | 437 |
| KRAS-G12D-RG2-18C | GTCGTTGGAGCTGaTGGCGT | 438 |
| sgRNA 명칭 | 정방향 | 서열번호 | 역방향 | 서열번호 |
| KRAS-G12D-RG1-10A | CACCGCTTGTGGTAGATGGAGCTGa | 439 | AAACtCAGCTCCATCTACCACAAGc | 440 |
| KRAS-G12D-RG1-10C | CACCGCTTGTGGTAGCTGGAGCTGa | 441 | AAACtCAGCTCCAGCTACCACAAGc | 442 |
| KRAS-G12D-RG1-10G | CACCGCTTGTGGTAGGTGGAGCTGa | 443 | AAACtCAGCTCCACCTACCACAAGc | 444 |
| KRAS-G12D-RG1-18A | CACCGCTAGTGGTAGTTGGAGCTGa | 445 | AAACtCAGCTCCAACTACCACTAGc | 446 |
| KRAS-G12D-RG1-18C | CACCGCTCGTGGTAGTTGGAGCTGa | 447 | AAACtCAGCTCCAACTACCACGAGc | 448 |
| KRAS-G12D-RG1-18G | CACCGCTGGTGGTAGTTGGAGCTGa | 449 | AAACtCAGCTCCAACTACCACCAGc | 450 |
| KRAS-G12D-RG2-10A | CACCGGTAGTTGGAGATGaTGGCGT | 451 | AAACACGCCAtCATCTCCAACTACc | 452 |
| KRAS-G12D-RG2-10T | CACCGGTAGTTGGAGTTGaTGGCGT | 453 | AAACACGCCAtCAACTCCAACTACc | 454 |
| KRAS-G12D-RG2-10G | CACCGGTAGTTGGAGGTGaTGGCGT | 455 | AAACACGCCAtCACCTCCAACTACc | 456 |
| KRAS-G12D-RG2-18T | CACCGGTTGTTGGAGCTGaTGGCGT | 457 | AAACACGCCAtCAGCTCCAACAACc | 458 |
| KRAS-G12D-RG2-18G | CACCGGTGGTTGGAGCTGaTGGCGT | 459 | AAACACGCCAtCAGCTCCAACCACc | 460 |
| KRAS-G12D-RG2-18C | CACCGGTCGTTGGAGCTGaTGGCGT | 461 | AAACACGCCAtCAGCTCCAACGACc | 462 |
유전자가위 활성은 실시예 2-1과 동일한 방법으로 T7E1 어세이를 수행하여 확인하였으며, T7E1 어세이에 사용된 PCR 프라이머는 표 19와 같다.
도 11의 b에 나타난 바와 같이, KRAS G12D-RG1은 야생형 염기서열과 돌연변이 염기서열에 대해 모두 유전자가위 활성을 나타내어, 오프-타겟 및 온-타겟 활성을 모두 가지는 것으로 확인이 되었다. 반면, 위치 10과 위치 18에 의도적인 미스매치를 추가한 경우, 야생형 염기서열을 가지는 BxPC3에서는 유전자가위 활성이 사라지고, 점 돌연변이 서열을 가지는 HPAFII에서는 G12D-RG1-10C 1종을 제외한 나머지 5종에서 유전자 가위가 작동하여, 오프-타겟 활성이 사라지고 온-타겟 활성만을 가지는 것으로 확인되었다.
또한, 도 11의 c에 나타난 바와 같이, KRAS G12D-RG2은 야생형 염기서열과 돌연변이 염기서열에 대해 모두 유전자가위 활성을 나타내어, 오프-타겟 및 온-타겟 활성을 모두 가지는 것으로 확인이 되었다. 반면, 위치 10에 의도적인 미스매치를 추가한 경우, 야생형 염기서열을 가지는 BxPC3에서는 유전자가위 활성이 낮아지고, 점 돌연변이 서열을 가지는 HPAFII에서는 유전자가위 활성을 유지하여, 오프-타겟 활성이 감소되고 온-타겟 활성은 유지되는 것을 확인하였다. 위치 18에 의도적인 미스매치를 추가한 경우에는 유전자가위 활성에 차이가 없는 것을 확인하였다. 이러한 문제는 위치 18 미스매치에 위치 10 미스매치 변이체를 매치하여 해결할 수 있을 것으로 예상이 된다.
가이드 RNA를 이용한 종양 세포 성장 억제 효과 확인
KRAS 유전자를 넉아웃 (knockout) 시키면 종양 성장이 줄어든다는 것을 보고한 문헌 [MD Muzumdar et al. Survival of pancreatic cancer cells lacking KRAS function. Natcomm. 2017 Oct 23;8(1):1090.]을 토대로, 상기 실시예 4에서 설계된 가이드 RNA도 동일한 결과를 나타낼 수 있는지 확인하였다.
본 실시예에서는 도 11의 c에서 확인된 결과에 따라, 점 돌연변이 염기서열을 가지는 유전자에 대한 온-타겟 활성을 유지하고, 야생형 염기서열을 가지는 유전자에 대한 오프-타겟 활성이 가장 낮은 KRAS-G12D-RG2-10A를 사용하였고, 췌장암 세포주는 BxPC3, HPAFII 및 Panc-1을 사용하였다.
도 12의 a는 3가지 종류의 췌장암 세포주에 대한 유전자형 분석 결과를 보여준다. BxPC3는 야생형 KRAS 유전자에 동형 (homozygous)이고, HPAFII는 KRAS-G12D 돌연변이 유전자에 동형 (homozygous)이다. Panc-1은 KRAS-G12D 돌연변이 유전자에 이형 (heterozygous)으로 확인되었다.
Panc-1 세포주에 대해 KRAS-G12D-RG2 및 KRAS-G12D-RG2-10A의 유전자가위 활성을 실시예 2-1과 동일한 방법으로 T7E1 어세이를 수행하여 확인하였다. Panc-1 세포주는 야생형 KRAS 염기서열과 돌연변이 염기서열을 가지고 있어, 도 12의 b에 나타난 바와 같이 각각을 타겟하는 유전자가위 활성을 확인할 수 있었다.
BxPC3, HPAFII 및 Panc-1 세포주에서 KRAS-G12D-RG2와 KRAS-G12D-RG2-10A의 유전자가위 활성을 T7E1 어세이로 확인한 후, 실제로 단백질 발현에도 차이가 있는지 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 진행하였다. SDS 시료 준비와 웨스턴 블랏 분석은 기존에 문헌 [Sung et al., Pierce1, a novel p53 target gene contributing to the ultraviolet-induced DNA damage response. Cancer Res. 2010 Dec 15;70(24):10454-63.]에 보고한 바와 같이 수행하였다. 사용된 항체 정보는 다음과 같다: Kras (cell signaling #8955), Kras-G12D Mut (cell signaling #14429), β-actin (santa cruz #SC-47778).
3종류의 췌장암 세포주에 KRAS-G12D-RG2 및 KRAS-G12D-RG2-10A 가이드 RNA를 이용하여 KRAS 단백질과 KRAS-G12D 단백질의 발현 차이를 확인하였다. 먼저, 3종류의 세포주에 EV (empty vector), KRAS-G12D-RG2 또는 KRAS-G12D-RG2-10A 가이드 RNA를 발현시킬 수 있는 렌티바이러스를 감염시킨 후, 퓨로마이신 선별 (puromycin selection)을 진행하여 안정한 세포주를 확보하였다. KRAS 및 KRAS-G12D 돌연변이 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과, 도 12c에서 확인되는 바와 같이, 야생형 KRAS 염기서열 및 돌연변이 염기서열에서 모두 높은 유전자가위 활성을 보였던 KRAS-G12D-RG2가 처리된 경우, BxPC3 세포주와 HPAFII 세포주에서 모두 KRAS 단백질과 KRAS-G12D 돌연변이 단백질이 발현되지 않는 것을 알 수 있었다. 또한, Panc-1 세포주에서는 KRAS-G12D-RG2이 처리된 경우, KRAS 단백질이 발현하지만, EV 샘플에 비해 현저하게 발현이 감소되었고, KRAS-G12D 돌연변이 단백질은 발현되지 않는 것을 확인하였다. 의도적인 미스매치로 위치 10을 A로 변경한 KRAS-G12D-RG2-10A를 처리한 경우, 3종류의 세포주에서 모두 KRAS 단백질은 발현되면서, KRAS-G12D 돌연변이 단백질은 발현되지 않거나 현저하게 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 웨스턴 블랏 결과를 통해, KRAS-G12D-RG2-10A 가이드 RNA가 돌연변이 염기서열만 선택적으로 넉아웃시킬 수 있다는 것을 다시 한번 증명하였다.
추가적으로, 문헌 [MD Muzumdar et al. Survival of pancreatic cancer cells lacking KRAS function. Natcomm. 2017 Oct 23;8(1):1090.]에 보고된 바와 같이, 종양 성장도 감소하는지 확인하기 위해 CPDL (cumulative population doubling level)을 비교하였다.
도 12의 d에 나타난 바와 같이, 야생형 KRAS 염기서열 동형 유전자형을 가지는 BxPC3 세포주에서는 EV와 KRAS-G12D-RG2-10A가 처리된 경우, KRAS 단백질 발현이 유지되기 때문에 세포 성장에 차이가 없는 반면, KRAS-G12D-RG2가 처리된 경우 KRAS 유전자가 완전히 넉아웃 되었기 때문에 세포 성장이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
KRAS 돌연변이 염기서열 동형 유전자형을 가지는 HPAFII 세포주에서는 EV가 처리된 경우 BxPC3-EV 세포와 비슷한 세포 성장 패턴을 보였고, KRAS-G12D-RG2가 처리된 경우 BxPC3-KRAS-G12D-RG2 결과와 유사하게 세포 성장이 현저하게 감소하였다. KRAS-G12D-RG2-10A가 처리된 경우 KRAS 단백질 발현이 유지되고, KRAS-G12D 돌연변이 단백질 발현이 현저하게 감소하였기 때문에, HPAFII-EV 세포 보다는 세포 성장이 감소하였으나, KRAS 유전자가 완전히 넉아웃된 HPAFII-KRAS-G12D-RG2 보다는 세포 성장이 높은 것을 확인할 수 있었다.
KRAS 돌연변이 염기서열 이형 유전형을 가지는 Panc-1 세포주에 EV를 처리하는 경우 상기 2종의 세포주 보다 더 높은 세포 성장을 나타내었고, KRAS-G12D-RG2를 처리하는 경우 상기 2종의 세포주에서 확인 것과 다르게 세포 성장을 유지하였다. 이러한 결과는 KRAS 단백질이 완전하게 넉아웃 되지 않고 발현을 유지하고 있었기 때문에, 세포 성장이 감소하지 않는 것으로 판단할 수 있다. KRAS-G12D-RG2-10A를 처리한 경우에도, KRAS 단백질이 발현을 유지하고 있기 때문에 세포 성장을 유지하고 있는 결과를 확인할 수 있었고, HPAFII-KRAS-G12D-RG2 보다 높은 세포 성장 결과를 확인할 수 있었다. 이를 통해, KRAS-G12D-RG2-10A 가이드 RNA는 야생형 염기서열과 돌연변이 염기서열을 구분하여, KRAS 단백질은 발현하도록 하면서 KRAS-G12D 돌연변이 단백질만 완전하게 발현되지 않도록 넉아웃 시킴으로써, 세포 성장이 선택적으로 달라진다는 것을 증명하였다.
결론적으로, 추가적인 실험에서 위치 10과 위치 18에 추가되는 의도적인 미스매치를 이용하여 온-타겟 활성을 유지하면서, 오프-타겟 활성을 감소시킬 수 있는 가이드 RNA를 선별할 수 있고, 야생형 염기서열과 돌연변이 염기서열을 구분하여 돌연변이 부분만 넉아웃시킬 수 있는 가이드 RNA를 선별할 수 있다는 결과를 증명하였다. 따라서, 본 발명에 따른 가이드 RNA 제조방법을 이용하여, 높은 온-타겟 활성을 유지하면서 감소된 오프-타겟 활성을 갖는, 돌연변이 타겟 가이드 RNA를 선별하여 암 발생의 원인 중 하나인 점 돌연변이를 가지는 타겟 유전자를 교정하는데 이용할 수 있을 것으로 예상된다.
SEQUENCE LISTING
<110> THE ASAN FOUNDATION
University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation
Mobiis Co., Ltd.
<120> Guide RNA of which on-target activity is maintained and
off-target activity decrease and use thereof
<130> 1070329
<150> KR 10-2020-0171716
<151> 2020-12-09
<160> 470
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1 + (PAM)
<400> 1
ccagtgagta gagcggaggc agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2 + (PAM)
<400> 2
aacaccagtg agtagagcgg agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3 + (PAM)
<400> 3
atgaacacca gtgagtagag cgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG4 + (PAM)
<400> 4
cctgcctccg ctctactcac tgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG5 + (PAM)
<400> 5
tactcactgg tgttcatctt tgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG6 + (PAM)
<400> 6
tgacatctac ctgctcaacc tgg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7 + (PAM)
<400> 7
ggtacctatc gattgtcagg agg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG8 + (PAM)
<400> 8
ccaggtacct atcgattgtc agg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG9 + (PAM)
<400> 9
cctgacaatc gataggtacc tgg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG10 + (PAM)
<400> 10
tggtgacaag tgtgatcact tgg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG11 + (PAM)
<400> 11
gtcatggtca tctgctactc ggg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12 + (PAM)
<400> 12
ggtgtcgaaa tgagaagaag agg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG13 + (PAM)
<400> 13
gagaaaataa acaatcatga tgg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG14 + (PAM)
<400> 14
tgattgttta ttttctcttc tgg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG15 + (PAM)
<400> 15
caggccaaag aattcctgga agg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG16 + (PAM)
<400> 16
ccttctcctg aacaccttcc agg 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG17 + (PAM)
<400> 17
aacaccttcc aggaattctt tgg 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG18 + (PAM)
<400> 18
atgcaggtga cagagactct tgg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG19 + (PAM)
<400> 19
tgcaggtgac agagactctt ggg 23
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-1T
<400> 20
ccagtgagta gagcggaggt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-2A
<400> 21
ccagtgagta gagcggagac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-3A
<400> 22
ccagtgagta gagcggaagc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-4G
<400> 23
ccagtgagta gagcgggggc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-5A
<400> 24
ccagtgagta gagcgaaggc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-6A
<400> 25
ccagtgagta gagcagaggc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-7T
<400> 26
ccagtgagta gagtggaggc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-8A
<400> 27
ccagtgagta gaacggaggc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-9G
<400> 28
ccagtgagta gggcggaggc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-10A
<400> 29
ccagtgagta aagcggaggc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-11G
<400> 30
ccagtgagtg gagcggaggc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-12C
<400> 31
ccagtgagca gagcggaggc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-13A
<400> 32
ccagtgaata gagcggaggc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-14G
<400> 33
ccagtgggta gagcggaggc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-15A
<400> 34
ccagtaagta gagcggaggc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-17A
<400> 35
ccaatgagta gagcggaggc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-18G
<400> 36
ccggtgagta gagcggaggc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-19T
<400> 37
ctagtgagta gagcggaggc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-20T
<400> 38
tcagtgagta gagcggaggc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-1A
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<211> 20
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 117
aaaaccagtg tgtagagcgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10T-18T
<400> 118
aataccagtg tgtagagcgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10T-18G
<400> 119
aagaccagtg tgtagagcgg 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G-18A
<400> 120
aaaaccagtg ggtagagcgg 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G-18T
<400> 121
aataccagtg ggtagagcgg 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G-18G
<400> 122
aagaccagtg ggtagagcgg 20
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C-18A
<400> 123
aaaaccagtg cgtagagcgg 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C-18T
<400> 124
aataccagtg cgtagagcgg 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C-18G
<400> 125
aagaccagtg cgtagagcgg 20
<210> 126
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1 forward
<400> 126
caccgcctgc ctccgctcta ctcac 25
<210> 127
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1 reverse
<400> 127
aaacgtgagt agagcggagg caggc 25
<210> 128
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2 forward
<400> 128
caccgtactc actggtgttc atctt 25
<210> 129
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2 reverse
<400> 129
aaacaagatg aacaccagtg agtac 25
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3 forward
<400> 130
caccgtgaca tctacctgct caacc 25
<210> 131
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3 reverse
<400> 131
aaacggttga gcaggtagat gtcac 25
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG4 forward
<400> 132
caccgcctga caatcgatag gtacc 25
<210> 133
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG4 reverse
<400> 133
aaacggtacc tatcgattgt caggc 25
<210> 134
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG5 forward
<400> 134
caccgtggtg acaagtgtga tcact 25
<210> 135
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG5 reverse
<400> 135
aaacagtgat cacacttgtc accac 25
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG6 forward
<400> 136
caccggtcat ggtcatctgc tactc 25
<210> 137
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG6 reverse
<400> 137
aaacgagtag cagatgacca tgacc 25
<210> 138
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7 forward
<400> 138
caccgggtgt cgaaatgaga agaag 25
<210> 139
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7 reverse
<400> 139
aaaccttctt ctcatttcga caccc 25
<210> 140
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG8 forward
<400> 140
caccgtgatt gtttattttc tcttc 25
<210> 141
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG8 reverse
<400> 141
aaacgaagag aaaataaaca atcac 25
<210> 142
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG9 forward
<400> 142
caccgccttc tcctgaacac cttcc 25
<210> 143
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG9 reverse
<400> 143
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<210> 144
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG10 forward
<400> 144
caccgaacac cttccaggaa ttctt 25
<210> 145
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG10 reverse
<400> 145
aaacaagaat tcctggaagg tgttc 25
<210> 146
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG11 forward
<400> 146
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<210> 147
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG11 reverse
<400> 147
aaacagagtc tctgtcacct gcatc 25
<210> 148
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12 forward
<400> 148
caccgtgcag gtgacagaga ctctt 25
<210> 149
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12 reverse
<400> 149
aaacaagagt ctctgtcacc tgcac 25
<210> 150
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG13 forward
<400> 150
caccgcaggc caaagaattc ctgga 25
<210> 151
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG13 reverse
<400> 151
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<210> 152
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 152
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<210> 153
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG14 reverse
<400> 153
aaactcatga ttgtttattt tctcc 25
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG15 forward
<400> 154
caccgccagg tacctatcga ttgtc 25
<210> 155
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG15 reverse
<400> 155
aaacgacaat cgataggtac ctggc 25
<210> 156
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG16 forward
<400> 156
caccgggtac ctatcgattg tcagg 25
<210> 157
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG16 reverse
<400> 157
aaaccctgac aatcgatagg taccc 25
<210> 158
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 158
caccgatgaa caccagtgag tagag 25
<210> 159
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG17 reverse
<400> 159
aaacctctac tcactggtgt tcatc 25
<210> 160
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG18 forward
<400> 160
caccgaacac cagtgagtag agcgg 25
<210> 161
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG18 reverse
<400> 161
aaacccgctc tactcactgg tgttc 25
<210> 162
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG19 forward
<400> 162
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG19 reverse
<400> 163
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<210> 164
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 164
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-1T reverse
<400> 165
aaacacctcc gctctactca ctggc 25
<210> 166
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 166
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-2A reverse
<400> 167
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<210> 168
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-3A forward
<400> 168
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<210> 169
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-3A reverse
<400> 169
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<210> 170
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-4G forward
<400> 170
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<210> 171
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-4G reverse
<400> 171
aaacgccccc gctctactca ctggc 25
<210> 172
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-5A forward
<400> 172
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<210> 173
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-5A reverse
<400> 173
aaacgccttc gctctactca ctggc 25
<210> 174
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-6A forward
<400> 174
caccgccagt gagtagagca gaggc 25
<210> 175
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-6A reverse
<400> 175
aaacgcctct gctctactca ctggc 25
<210> 176
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-7T forward
<400> 176
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<210> 177
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-7T reverse
<400> 177
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<210> 178
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-8A forward
<400> 178
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<210> 179
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-8A reverse
<400> 179
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<210> 180
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 180
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-9G reverse
<400> 181
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<210> 182
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-10A forward
<400> 182
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-10A reverse
<400> 183
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<210> 184
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-11G forward
<400> 184
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-11G reverse
<400> 185
aaacgcctcc gctccactca ctggc 25
<210> 186
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 186
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<210> 187
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-12C reverse
<400> 187
aaacgcctcc gctctgctca ctggc 25
<210> 188
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-13A forward
<400> 188
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-13A reverse
<400> 189
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<210> 190
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 190
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-14G reverse
<400> 191
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-15A forward
<400> 192
caccgccagt aagtagagcg gaggc 25
<210> 193
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-15A reverse
<400> 193
aaacgcctcc gctctactta ctggc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 194
caccgccaat gagtagagcg gaggc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-17A reverse
<400> 195
aaacgcctcc gctctactca ttggc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 196
caccgccggt gagtagagcg gaggc 25
<210> 197
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-18G reverse
<400> 197
aaacgcctcc gctctactca ccggc 25
<210> 198
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 198
caccgctagt gagtagagcg gaggc 25
<210> 199
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-19T reverse
<400> 199
aaacgcctcc gctctactca ctagc 25
<210> 200
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-20T forward
<400> 200
caccgtcagt gagtagagcg gaggc 25
<210> 201
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG1-20T reverse
<400> 201
aaacgcctcc gctctactca ctgac 25
<210> 202
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-1A forward
<400> 202
caccgggtgt cgaaatgaga agaaa 25
<210> 203
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-1A reverse
<400> 203
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 204
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<210> 205
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-1T reverse
<400> 205
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 206
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 207
aaacgttctt ctcatttcga caccc 25
<210> 208
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 208
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<210> 209
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-2T reverse
<400> 209
aaaccatctt ctcatttcga caccc 25
<210> 210
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-2G forward
<400> 210
caccgggtgt cgaaatgaga agagg 25
<210> 211
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-2G reverse
<400> 211
aaaccctctt ctcatttcga caccc 25
<210> 212
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-2C forward
<400> 212
caccgggtgt cgaaatgaga agacg 25
<210> 213
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-2C reverse
<400> 213
aaaccgtctt ctcatttcga caccc 25
<210> 214
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-3T forward
<400> 214
caccgggtgt cgaaatgaga agtag 25
<210> 215
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-3T reverse
<400> 215
aaacctactt ctcatttcga caccc 25
<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-3G forward
<400> 216
caccgggtgt cgaaatgaga aggag 25
<210> 217
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-3G reverse
<400> 217
aaacctcctt ctcatttcga caccc 25
<210> 218
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-3C forward
<400> 218
caccgggtgt cgaaatgaga agcag 25
<210> 219
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-3C reverse
<400> 219
aaacctgctt ctcatttcga caccc 25
<210> 220
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-4A forward
<400> 220
caccgggtgt cgaaatgaga aaaag 25
<210> 221
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-4A reverse
<400> 221
aaaccttttt ctcatttcga caccc 25
<210> 222
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-4T forward
<400> 222
caccgggtgt cgaaatgaga ataag 25
<210> 223
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-4T reverse
<400> 223
aaaccttatt ctcatttcga caccc 25
<210> 224
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-4C forward
<400> 224
caccgggtgt cgaaatgaga acaag 25
<210> 225
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-4C reverse
<400> 225
aaaccttgtt ctcatttcga caccc 25
<210> 226
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-5T forward
<400> 226
caccgggtgt cgaaatgaga tgaag 25
<210> 227
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-5T reverse
<400> 227
aaaccttcat ctcatttcga caccc 25
<210> 228
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-5G forward
<400> 228
caccgggtgt cgaaatgaga ggaag 25
<210> 229
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-5G reverse
<400> 229
aaaccttcct ctcatttcga caccc 25
<210> 230
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-5C forward
<400> 230
caccgggtgt cgaaatgaga cgaag 25
<210> 231
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-5C reverse
<400> 231
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<210> 232
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 232
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<210> 233
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-6T reverse
<400> 233
aaaccttcta ctcatttcga caccc 25
<210> 234
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-6G forward
<400> 234
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<210> 235
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 235
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 240
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 242
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-8T reverse
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 246
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 250
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-9A reverse
<400> 251
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 252
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 253
aaaccttctt ctaatttcga caccc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 254
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-9C reverse
<400> 255
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 257
aaaccttctt ctcaattcga caccc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 258
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-11G reverse
<400> 259
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<210> 260
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 260
caccgggtgt cgaactgaga agaag 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 261
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 262
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-12T reverse
<400> 263
aaaccttctt ctcatatcga caccc 25
<210> 264
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-12G forward
<400> 264
caccgggtgt cgagatgaga agaag 25
<210> 265
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-12G reverse
<400> 265
aaaccttctt ctcatctcga caccc 25
<210> 266
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-12C forward
<400> 266
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-12C reverse
<400> 267
aaaccttctt ctcatgtcga caccc 25
<210> 268
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 268
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-13T reverse
<400> 269
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 270
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-13G reverse
<400> 271
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<210> 272
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-13C forward
<400> 272
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 273
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 275
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 277
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-14C forward
<400> 278
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-14C reverse
<400> 279
aaaccttctt ctcatttgga caccc 25
<210> 280
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 280
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<210> 281
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-15A reverse
<400> 281
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<210> 282
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-15T forward
<400> 282
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<210> 283
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-15T reverse
<400> 283
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<210> 284
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-15C forward
<400> 284
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<210> 285
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-15C reverse
<400> 285
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<210> 286
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 286
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-16A reverse
<400> 287
aaaccttctt ctcatttcgt caccc 25
<210> 288
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-16T forward
<400> 288
caccgggtgg cgaaatgaga agaag 25
<210> 289
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-16T reverse
<400> 289
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<210> 290
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-16G forward
<400> 290
caccgggtgc cgaaatgaga agaag 25
<210> 291
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-16G reverse
<400> 291
aaaccttctt ctcatttcgg caccc 25
<210> 292
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-17A forward
<400> 292
caccgggtat cgaaatgaga agaag 25
<210> 293
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-17A reverse
<400> 293
aaaccttctt ctcatttcga taccc 25
<210> 294
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-17G forward
<400> 294
caccgggttt cgaaatgaga agaag 25
<210> 295
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-17G reverse
<400> 295
aaaccttctt ctcatttcga aaccc 25
<210> 296
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-17C forward
<400> 296
caccgggtct cgaaatgaga agaag 25
<210> 297
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-17C reverse
<400> 297
aaaccttctt ctcatttcga gaccc 25
<210> 298
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-18A forward
<400> 298
caccgggagt cgaaatgaga agaag 25
<210> 299
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-18A reverse
<400> 299
aaaccttctt ctcatttcga ctccc 25
<210> 300
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-18T forward
<400> 300
caccgggggt cgaaatgaga agaag 25
<210> 301
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-18T reverse
<400> 301
aaaccttctt ctcatttcga ccccc 25
<210> 302
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-18C forward
<400> 302
caccgggcgt cgaaatgaga agaag 25
<210> 303
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-18C reverse
<400> 303
aaaccttctt ctcatttcga cgccc 25
<210> 304
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-19A forward
<400> 304
caccggatgt cgaaatgaga agaag 25
<210> 305
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-19A reverse
<400> 305
aaaccttctt ctcatttcga catcc 25
<210> 306
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-19G forward
<400> 306
caccggttgt cgaaatgaga agaag 25
<210> 307
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-19G reverse
<400> 307
aaaccttctt ctcatttcga caacc 25
<210> 308
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-19C forward
<400> 308
caccggctgt cgaaatgaga agaag 25
<210> 309
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-19C reverse
<400> 309
aaaccttctt ctcatttcga cagcc 25
<210> 310
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-20A forward
<400> 310
caccgagtgt cgaaatgaga agaag 25
<210> 311
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-20A reverse
<400> 311
aaaccttctt ctcatttcga cactc 25
<210> 312
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-20T forward
<400> 312
caccgtgtgt cgaaatgaga agaag 25
<210> 313
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-20T reverse
<400> 313
aaaccttctt ctcatttcga cacac 25
<210> 314
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-20C forward
<400> 314
caccgcgtgt cgaaatgaga agaag 25
<210> 315
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG12-20C reverse
<400> 315
aaaccttctt ctcatttcga cacgc 25
<210> 316
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-F1 primer
<400> 316
gacagggaag ctagcagcaa 20
<210> 317
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-R1 primer
<400> 317
ttcctgggag agacgcaaac 20
<210> 318
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-F3 primer
<400> 318
atgtgaagca aatcgcagcc 20
<210> 319
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-R3 primer
<400> 319
tcccgagtag cagatgacca 20
<210> 320
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-F7 primer
<400> 320
taaaagccag gacggtcacc 20
<210> 321
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-R7 primer
<400> 321
ccacttgagt ccgtgtcaca 20
<210> 322
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-F1 primer
<400> 322
ttcagggaga tggctgcaag 20
<210> 323
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-R1 primer
<400> 323
cagaagcaaa cacagccacc 20
<210> 324
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-F3 primer
<400> 324
ttttgtgggc aacatgctgg 20
<210> 325
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-R3 primer
<400> 325
cttctcccca acgaaggcat 20
<210> 326
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-F4 primer
<400> 326
taaaagccag gacggtcacc 20
<210> 327
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-R6 primer
<400> 327
aaaccagccg agacttcctg 20
<210> 328
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG1 + (PAM)
<400> 328
ccagcgagta gagcggaggc agg 23
<210> 329
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG2 + (PAM)
<400> 329
aacaccagcg agtagagcgg agg 23
<210> 330
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG3 + (PAM)
<400> 330
atgaacacca gcgagtagag cgg 23
<210> 331
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG4 + (PAM)
<400> 331
cctgcctccg ctctactcgc tgg 23
<210> 332
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG5 + (PAM)
<400> 332
tactcgctgg tgttcatctt tgg 23
<210> 333
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG6 + (PAM)
<400> 333
tgacatttac ctgctcaacc tgg 23
<210> 334
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG7 + (PAM)
<400> 334
ggtatctatc gattgtcagg agg 23
<210> 335
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG8 + (PAM)
<400> 335
ccaggtatct atcgattgtc agg 23
<210> 336
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG9 + (PAM)
<400> 336
cctgacaatc gatagatacc tgg 23
<210> 337
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG10 + (PAM)
<400> 337
tggtgacaag tgtgatcacc tgg 23
<210> 338
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG11 + (PAM)
<400> 338
atcatggtca tctgctactc ggg 23
<210> 339
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG12 + (PAM)
<400> 339
ggtgtcgaaa cgagaagaag agg 23
<210> 340
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG13 + (PAM)
<400> 340
gagaaagtaa acaatcatga tgg 23
<210> 341
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG14 + (PAM)
<400> 341
tgattgttta ctttctcttc tgg 23
<210> 342
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG15 + (PAM)
<400> 342
caggccgaag aattcctgga agg 23
<210> 343
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG16 + (PAM)
<400> 343
cattctcctg aacaccttcc agg 23
<210> 344
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG17 + (PAM)
<400> 344
aacaccttcc aggaattctt cgg 23
<210> 345
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG18 + (PAM)
<400> 345
acgcaggtga cagagactct tgg 23
<210> 346
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-RG19 + (PAM)
<400> 346
cgcaggtgac agagactctt ggg 23
<210> 347
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-10A forward
<400> 347
caccgatgaa caccaatgag tagag 25
<210> 348
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-10A reverse
<400> 348
aaacctctac tcattggtgt tcatc 25
<210> 349
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-10T forward
<400> 349
caccgatgaa caccattgag tagag 25
<210> 350
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-10T reverse
<400> 350
aaacctctac tcaatggtgt tcatc 25
<210> 351
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-10C forward
<400> 351
caccgatgaa caccactgag tagag 25
<210> 352
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-10C reverse
<400> 352
aaacctctac tcagtggtgt tcatc 25
<210> 353
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-18A forward
<400> 353
caccgataaa caccagtgag tagag 25
<210> 354
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-18A reverse
<400> 354
aaacctctac tcactggtgt ttatc 25
<210> 355
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-18T forward
<400> 355
caccgattaa caccagtgag tagag 25
<210> 356
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-18T reverse
<400> 356
aaacctctac tcactggtgt taatc 25
<210> 357
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-18C forward
<400> 357
caccgatcaa caccagtgag tagag 25
<210> 358
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG3-18C reverse
<400> 358
aaacctctac tcactggtgt tgatc 25
<210> 359
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10A forward
<400> 359
caccgggtac ctatcaattg tcagg 25
<210> 360
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10A reverse
<400> 360
aaaccctgac aattgatagg taccc 25
<210> 361
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10T forward
<400> 361
caccgggtac ctatctattg tcagg 25
<210> 362
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10T reverse
<400> 362
aaaccctgac aatagatagg taccc 25
<210> 363
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10C forward
<400> 363
caccgggtac ctatccattg tcagg 25
<210> 364
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10C reverse
<400> 364
aaaccctgac aatggatagg taccc 25
<210> 365
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-18A forward
<400> 365
caccgggaac ctatcgattg tcagg 25
<210> 366
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-18A reverse
<400> 366
aaaccctgac aatcgatagg ttccc 25
<210> 367
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-18G forward
<400> 367
caccggggac ctatcgattg tcagg 25
<210> 368
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-18G reverse
<400> 368
aaaccctgac aatcgatagg tcccc 25
<210> 369
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-18C forward
<400> 369
caccgggcac ctatcgattg tcagg 25
<210> 370
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-18C reverse
<400> 370
aaaccctgac aatcgatagg tgccc 25
<210> 371
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10C-18A forward
<400> 371
caccgggaac ctatccattg tcagg 25
<210> 372
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10C-18A reverse
<400> 372
aaaccctgac aatggatagg ttccc 25
<210> 373
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10C-18G forward
<400> 373
caccggggac ctatccattg tcagg 25
<210> 374
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10C-18G reverse
<400> 374
aaaccctgac aatggatagg tcccc 25
<210> 375
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10C-18C forward
<400> 375
caccgggcac ctatccattg tcagg 25
<210> 376
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG7-10C-18C reverse
<400> 376
aaaccctgac aatggatagg tgccc 25
<210> 377
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10T forward
<400> 377
caccgaacac cagtgtgtag agcgg 25
<210> 378
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10T reverse
<400> 378
aaacccgctc tacacactgg tgttc 25
<210> 379
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G forward
<400> 379
caccgaacac cagtgggtag agcgg 25
<210> 380
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G reverse
<400> 380
aaacccgctc tacccactgg tgttc 25
<210> 381
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C forward
<400> 381
caccgtgaca tctacctgct caacc 25
<210> 382
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C reverse
<400> 382
aaacggttga gcaggtagat gtcac 25
<210> 383
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-18A forward
<400> 383
caccgcctga caatcgatag gtacc 25
<210> 384
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-18A reverse
<400> 384
aaacggtacc tatcgattgt caggc 25
<210> 385
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-18T forward
<400> 385
caccgtggtg acaagtgtga tcact 25
<210> 386
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-18T reverse
<400> 386
aaacagtgat cacacttgtc accac 25
<210> 387
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-18G forward
<400> 387
caccggtcat ggtcatctgc tactc 25
<210> 388
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-18G reverse
<400> 388
aaacgagtag cagatgacca tgacc 25
<210> 389
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10T-18A forward
<400> 389
caccgaaaac cagtgtgtag agcgg 25
<210> 390
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10T-18A reverse
<400> 390
aaacccgctc tacacactgg ttttc 25
<210> 391
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10T-18T forward
<400> 391
caccgaatac cagtgtgtag agcgg 25
<210> 392
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10T-18T reverse
<400> 392
aaacccgctc tacacactgg tattc 25
<210> 393
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10T-18G forward
<400> 393
caccgaagac cagtgtgtag agcgg 25
<210> 394
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10T-18G reverse
<400> 394
aaacccgctc tacacactgg tcttc 25
<210> 395
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G-18A forward
<400> 395
caccgaaaac cagtgggtag agcgg 25
<210> 396
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G-18A reverse
<400> 396
aaacccgctc tacccactgg ttttc 25
<210> 397
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G-18T forward
<400> 397
caccgaatac cagtgggtag agcgg 25
<210> 398
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G-18T reverse
<400> 398
aaacccgctc tacccactgg tattc 25
<210> 399
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G-18G forward
<400> 399
caccgaagac cagtgggtag agcgg 25
<210> 400
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10G-18G reverse
<400> 400
aaacccgctc tacccactgg tcttc 25
<210> 401
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C-18A forward
<400> 401
caccgaaaac cagtgcgtag agcgg 25
<210> 402
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C-18A reverse
<400> 402
aaacccgctc tacgcactgg ttttc 25
<210> 403
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C-18T forward
<400> 403
caccgaatac cagtgcgtag agcgg 25
<210> 404
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C-18T reverse
<400> 404
aaacccgctc tacgcactgg tattc 25
<210> 405
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C-18G forward
<400> 405
caccgaagac cagtgcgtag agcgg 25
<210> 406
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-RG2-10C-18G reverse
<400> 406
aaacccgctc tacgcactgg tcttc 25
<210> 407
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-F1 primer
<400> 407
gacagggaag ctagcagcaa 20
<210> 408
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR5-R1 primer
<400> 408
ttcctgggag agacgcaaac 20
<210> 409
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-F1 primer
<400> 409
ttcagggaga tggctgcaag 20
<210> 410
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CCR2-R1 primer
<400> 410
cagaagcaaa cacagccacc 20
<210> 411
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BXPC3-KRAS-RG1 (Spacer + PAM)
<400> 411
cttgtggtag ttggagctgg tgg 23
<210> 412
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BXPC3-KRAS-RG2 (Spacer + PAM)
<400> 412
gtagttggag ctggtggcgt agg 23
<210> 413
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HPAFII-KRAS-G12D-RG1 (Spacer + PAM)
<400> 413
cttgtggtag ttggagctga tgg 23
<210> 414
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HPAFII-KRAS-G12D-RG2 (Spacer + PAM)
<400> 414
gtagttggag ctgatggcgt agg 23
<210> 415
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CFPAC-KRAS-G12V-RG1 (Spacer + PAM)
<400> 415
cttgtggtag ttggagctgt tgg 23
<210> 416
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CFPAC-KRAS-G12V-RG2 (Spacer + PAM)
<400> 416
gtagttggag ctgttggcgt agg 23
<210> 417
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1 forward
<400> 417
caccgcttgt ggtagttgga gctga 25
<210> 418
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1 reverse
<400> 418
aaactcagct ccaactacca caagc 25
<210> 419
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2 forward
<400> 419
caccggtagt tggagctgat ggcgt 25
<210> 420
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2 reverse
<400> 420
aaacacgcca tcagctccaa ctacc 25
<210> 421
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12V-RG1 forward
<400> 421
caccgcttgt ggtagttgga gctgt 25
<210> 422
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12V-RG1 reverse
<400> 422
aaacacagct ccaactacca caagc 25
<210> 423
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12V-RG2 forward
<400> 423
caccggtagt tggagctgtt ggcgt 25
<210> 424
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12V-RG2 reverse
<400> 424
aaacacgcca acagctccaa ctacc 25
<210> 425
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KrasG12 forward primer
<400> 425
ttttcttaag cgtcgatgga gga 23
<210> 426
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KrasG12 reverse primer
<400> 426
tctaccctct cacgaaactc tga 23
<210> 427
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-10A
<400> 427
cttgtggtag atggagctga 20
<210> 428
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-10C
<400> 428
cttgtggtag ctggagctga 20
<210> 429
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-10G
<400> 429
cttgtggtag gtggagctga 20
<210> 430
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-18A
<400> 430
ctagtggtag ttggagctga 20
<210> 431
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-18C
<400> 431
ctcgtggtag ttggagctga 20
<210> 432
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-18G
<400> 432
ctggtggtag ttggagctga 20
<210> 433
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-10A
<400> 433
gtagttggag atgatggcgt 20
<210> 434
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-10T
<400> 434
gtagttggag ttgatggcgt 20
<210> 435
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-10G
<400> 435
gtagttggag gtgatggcgt 20
<210> 436
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-18T
<400> 436
gttgttggag ctgatggcgt 20
<210> 437
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-18G
<400> 437
gtggttggag ctgatggcgt 20
<210> 438
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-18C
<400> 438
gtcgttggag ctgatggcgt 20
<210> 439
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-10A forward
<400> 439
caccgcttgt ggtagatgga gctga 25
<210> 440
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-10A reverse
<400> 440
aaactcagct ccatctacca caagc 25
<210> 441
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-10C forward
<400> 441
caccgcttgt ggtagctgga gctga 25
<210> 442
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-10C reverse
<400> 442
aaactcagct ccagctacca caagc 25
<210> 443
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-10G forward
<400> 443
caccgcttgt ggtaggtgga gctga 25
<210> 444
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-10G reverse
<400> 444
aaactcagct ccacctacca caagc 25
<210> 445
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-18A forward
<400> 445
caccgctagt ggtagttgga gctga 25
<210> 446
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-18A reverse
<400> 446
aaactcagct ccaactacca ctagc 25
<210> 447
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-18C forward
<400> 447
caccgctcgt ggtagttgga gctga 25
<210> 448
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-18C reverse
<400> 448
aaactcagct ccaactacca cgagc 25
<210> 449
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-18G forward
<400> 449
caccgctggt ggtagttgga gctga 25
<210> 450
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG1-18G reverse
<400> 450
aaactcagct ccaactacca ccagc 25
<210> 451
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-10A forward
<400> 451
caccggtagt tggagatgat ggcgt 25
<210> 452
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-10A reverse
<400> 452
aaacacgcca tcatctccaa ctacc 25
<210> 453
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-10T forward
<400> 453
caccggtagt tggagttgat ggcgt 25
<210> 454
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-10T reverse
<400> 454
aaacacgcca tcaactccaa ctacc 25
<210> 455
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-10G forward
<400> 455
caccggtagt tggaggtgat ggcgt 25
<210> 456
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-10G reverse
<400> 456
aaacacgcca tcacctccaa ctacc 25
<210> 457
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-18T forward
<400> 457
caccggttgt tggagctgat ggcgt 25
<210> 458
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-18T reverse
<400> 458
aaacacgcca tcagctccaa caacc 25
<210> 459
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-18G forward
<400> 459
caccggtggt tggagctgat ggcgt 25
<210> 460
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-18G reverse
<400> 460
aaacacgcca tcagctccaa ccacc 25
<210> 461
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-18C forward
<400> 461
caccggtcgt tggagctgat ggcgt 25
<210> 462
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS-G12D-RG2-18C reverse
<400> 462
aaacacgcca tcagctccaa cgacc 25
<210> 463
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BxPC3 (normal)
<400> 463
cttgtggtag ttggagctgg tggcgtaggc aagagtgcct tgacg 45
<210> 464
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> BxPC3 (normal)
<400> 464
Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
<210> 465
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HPAFII (G12D)
<400> 465
cttgtggtag ttggagctga tggcgtaggc aagagtgcct tgacg 45
<210> 466
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HPAFII (G12D)
<400> 466
Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
<210> 467
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CFPAC-3 (G12V)
<400> 467
cttgtggtag ttggagctgt tggcgtaggc aagagtgcct tgacg 45
<210> 468
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CFPAC-3 (G12V)
<400> 468
Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
<210> 469
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS wild type
<400> 469
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgatggcg taggcaagag tgccttgacg 60
<210> 470
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> KRAS wild type
<400> 470
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr
20
Claims (25)
- 타겟 유전자 영역에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA로서, 상기 뉴클레오타이드 서열은
i) 오프-타겟 유전자 영역에 대해 원래 (original) 하나의 미스매치를 포함하고;
ii) 타겟 유전자 영역 및 오프-타겟 유전자 영역에 대해 의도적인 (intentional) 하나 또는 두 개의 미스매치를 포함하며;
상기 원래 하나의 미스매치와 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 서로 상이한 위치에 도입되는, 가이드 RNA. - 제1항에 있어서, 상기 원래 하나의 미스매치와 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 각각 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 프로토스페이서-인접 모티프 (protospacer-adjacent motif)로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 서로 상이한 위치에 도입되는, 가이드 RNA.
- 제2항에 있어서, 상기 의도적인 하나 또는 두 개의 미스매치는 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 프로토스페이서-인접 모티프 (protospacer-adjacent motif)로부터 +1 위치 및 +18 위치 중 하나 또는 두 개에 도입되는, 가이드 RNA.
- 제1항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 CCR5이고, 상기 오프-타겟 유전자는 CCR2인, 가이드 RNA.
- 제4항에 있어서, 서열번호 1 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 의도적인 미스매치가 도입되고, 상기 서열번호 1 내지 19의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외되는, 가이드 RNA.
- 제5항에 있어서,
서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +15 위치 및 +17 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +11 위치 및 +13 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +8 위치 및 +10 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 및 +3 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +14 위치 및 +16 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +13 위치 및 +15 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +15 위치 및 +17 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +12 위치 및 +14 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +4 위치 및 +6 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +2 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +19 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +9 위치 및 +11 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +13 위치 및 +15 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +9 위치 및 +11 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +13 위치 및 +15 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +18 위치 및 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +18 위치 및 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나; 또는
서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +19 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되고;
상기 서열번호 1 내지 19의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외되는, 가이드 RNA. - 제4항에 있어서, 서열번호 1 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되고, 상기 서열번호 1 내지 19의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외되는, 가이드 RNA.
- 제6항에 있어서, 서열번호 20 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 가이드 RNA.
- 제7항에 있어서, 서열번호 96 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 가이드 RNA.
- 제1항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 점 돌연변이 (point mutation)를 포함하는 유전자이고, 상기 오프-타겟 유전자는 야생형 유전자인, 가이드 RNA.
- 제10항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 KRAS G12D, G12C 또는 G12V 점 돌연변이를 포함하는 유전자이고, 상기 오프-타겟 유전자는 야생형 KRAS 유전자인, 가이드 RNA.
- 제11항에 있어서, 서열번호 413 내지 416로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 의도적인 미스매치가 도입되고, 상기 서열번호 413 내지 416의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외되는, 가이드 RNA.
- 제12항에 있어서,
서열번호 413의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +2 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 414의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +6 위치 및 +8 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나;
서열번호 415의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +2 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되거나; 또는
서열번호 416의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +6 위치 및 +8 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되고;
상기 서열번호 413 내지 416의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외되는, 가이드 RNA. - 제13항에 있어서, 서열번호 413 내지 416로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 각 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +10 위치 및 +18 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 전이 또는 전좌 돌연변이를 유발하여 의도적인 미스매치가 도입되고, 상기 서열번호 413 내지 416의 뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 제외되는, 가이드 RNA.
- 제14항에 있어서, 서열번호 427 내지 438로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 가이드 RNA.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 야생형 가이드 RNA의 온-타겟 활성의 50% 이상을 유지하고, 야생형 가이드 RNA에 비해 감소된 오프-타겟 활성을 나타내거나 오프-타겟 활성이 없는, 가이드 RNA.
- (a) 타겟 유전자 영역에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 오프-타겟 유전자 영역에 대해서는 원래 (original) 하나의 미스매치를 포함하는 가이드 RNA를 선별하는 단계; 및
(b) 선별된 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +1 위치 내지 +20 위치 중 어느 하나 또는 두 개에 의도적인 미스매치를 도입하는 단계를 포함하며,
이때, 상기 원래 하나의 미스매치와 상기 하나 또는 두 개의 의도적인 미스매치는 서로 상이한 위치에 도입되는, 가이드 RNA의 제조방법. - 제17항에 있어서, 상기 단계 (b)의 의도적 미스매치는 선별된 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 프로토스페이서-인접 모티프로부터 +10 위치 내지 +18 위치 중 하나 또는 두 개에 도입되는, 가이드 RNA의 제조방법.
- 제17항에 있어서, 상기 방법으로부터 제조된 RNA는 야생형 가이드 RNA의 온-타겟 활성의 50% 이상을 유지하고, 야생형 가이드 RNA에 비해 감소된 오프-타겟 활성을 나타내거나, 오프-타겟 활성이 없는, 가이드 RNA의 제조방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 가이드 RNA를 이용한 CRISPR 시스템의 정확도를 향상시키는 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 가이드 RNA를 포함하는, 유전자 교정용 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 가이드 RNA를 포함하는, 점 돌연변이 (point mutation)로 야기되는 질환 또는 후천성면역결핍증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 가이드 RNA를 포함하는, 점 돌연변이 (point mutation)로 야기되는 질환의 진단용 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 가이드 RNA를 이용한 유전자 표적 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 가이드 RNA를 이용한 유전자 교정 방법.
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