KR20220002565A - 이상헤모글로빈증 치료의 효과를 예측하는 방법 - Google Patents

이상헤모글로빈증 치료의 효과를 예측하는 방법 Download PDF

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리궈 팡
링링 유
후이후이 양
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에디진 인크.
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Abstract

본 발명은 (a) 평가 단계: 상기 평가 단계는 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는 평가 단계; 및
(b) 치료 단계: 상기 치료 단계는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 동시에, 본 발명은 또한 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법, 제 2 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC를 사용하여 치료하기 위해 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체를 선택하는 방법, 및 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체가 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 사용하여 치료하기에 적합한지 또는 부적합한지를 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

이상헤모글로빈증 치료의 효과를 예측하는 방법
(관련 출원에 대한 상호 참조)
본 출원은 2019년 4월 30일에 출원된 PCT 출원 PCT/CN2019/085116의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전체가 참조로 본원에 통합된다.
(ASCII 텍스트 파일에 서열 목록의 제출)
ASCII 텍스트 파일에 대한 하기 제출 내용은 그 전체가 참조로 여기에 통합된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형식(CRF)(파일 이름: FD00222PCT-PD01017-서열 목록_ST25, 기록일: 2020년 4월 22일, 크기: 11KB).
본 출원은 이상헤모글로빈증 치료에 있어서 유전자 편집 기술의 효과를 예측하기 위한 동반 예측 방법에 관한 것이다. 이 예측 방법에서는 질병을 치료하기 전에 환자의 CD34-양성 조혈줄기세포를 단리하고, 유전자 편집 기술을 사용하여 BCL11A 적혈구 인핸서 부위를 파괴하고, 유전자 편집된 BCL11A 적혈구 인핸서를 통한 이상헤모글로빈증 치료의 유효성이 γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 발현의 상향조절의 정도를 평가함으로써 미리 예측하여, 질병의 치료를 용이하게 한다.
이상헤모글로빈증은 비정상적인 헤모글로빈 분자 구조 또는 비정상적인 글로빈 펩티드쇄의 합성으로 인해 야기되는 유전성 혈액질환의 군이다. 이상헤모글로빈증의 두 가지 주요 질병 유형은 β-지중해 빈혈과 겸상적혈구 빈혈이다. β-지중해 빈혈의 병인은 β-글로빈 펩티드쇄의 유전자 돌연변이에 기인하고; 대부분의 환자는 점 돌연변이를 갖고, 일부는 큰 단편 유전자 결실을 갖는다. 유전자 결실 및 소정의 점 돌연변이로 인해 β-글로빈 펩티드쇄의 일부의 합성이 완전히 억제될 수 있으며, 이러한 유형을 β0 지중해 빈혈이라고 칭하고; 약간의 점 돌연변이는 부분적으로 β쇄의 합성을 억제하지만, 일부 펩티드쇄의 합성은 여전히 유지되며, 이러한 유형은 β+ 지중해 빈혈이라고 칭해지며, 상이한 조합은 상이한 임상 증상을 가질 수 있다. β-글로빈 발현의 부족 또는 감소로 인해서, 혈액 내의 과잉의 α 쇄가 적혈구에 침적되어 적혈구막의 표면에 부착되어 적혈구막의 특성을 변화시키는 봉입체를 형성하고, 또한 세포가 경직되어 변형성이 감소되게 되어, 만성 용혈성 빈혈의 징후를 나타냄으로써, 골수의 조성을 더욱 변화시킨다. β-지중해 빈혈과 유사한 겸상적혈구 빈혈은 상염색체 열성 유전 질환이고; 차이점은 이 빈혈은 단일 돌연변이 부위를 가지며, 또한 β-글로빈의 단일 염기 돌연변이에 의해 야기된다는 것이고, 즉 정상 β 유전자의 코돈 6이 GAG(글루탐산을 인코딩)에서 GTG(발린)로 돌연변이된다. 돌연변이 동형접합 상태에서, 정상 α-글로빈과 비정상 β-글로빈은 HbS라고 칭해지는 테트라머 복합체를 형성하고, 이 테트라머는 정상 헤모글로빈으로서 산소를 운반 능력의 절반을 갖고, 또한 탈산소화된 상태에서 폴리머 내로 응집되고; 형성된 폴리머는 세포막과 평행하게 세포막과 밀착되어 배열되어 있기 때문에, 폴리머의 수가 일정 수준에 도달하면, 세포막이 정상적인 오목한 모양으로부터 낫 모양으로 변형된다. 낫 모양의 적혈구는 변형능이 낮고, 쉽게 파괴되고, 용혈되어서, 혈관 막힘, 손상, 및 괴사 등을 유발한다(D. Rund, et al. New England Journal of Medicine. 2005, 718-739).
현재, β-지중해 빈혈 및 겸상적혈구 빈혈의 표준 치료법에는 탈철제(de-iron agent)를 이용한 철 제거 요법을 동반한 장기간의 고용량 수혈 및 동종이계 조혈줄기세포의 이식 치료 기술을 포함한다. 그러나, 탈철제를 이용한 철 제거 요법에 의해 동반되는 장기간의 고용량 수혈은 철 과부하로 이어져서, 지중해 빈혈을 가진 소아의 주요 사망 원인 중 하나가 비장, 간, 심장 및 신장과 같은 환자의 중요 기관에 대량의 철의 침적에 의해 야기되는 기관 손상이다. 동종이계 조혈줄기세포를 이식하면 β-지중해 빈혈 및 겸상적혈구 빈혈을 근절할 수 있지만, HLA 매칭과 GVHD(이식편대숙주질환)에 대한 완전히 호환 가능한 비율의 낮고 또한 이식 후 면역 거부반응에 의해 야기되는 사망으로 인해, 현재의 치료 기술은 치료해야 할 환자의 엄청난 요구를 충족시키기 어렵다. 동종이계 조혈줄기세포 치료 기술의 문제를 해결하기 위해, 유전자 변형된 자가 조혈줄기세포를 기반으로 한 전이유전자 요법 및 유전자 편집 요법이 등장했으며, 여기서 유전자 편집 요법의 치료 솔루션은: 환자의 자기유래 조혈줄기세포를 CRISPR/Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN, zinc finer nulease), 및 TALEN 등과 같은 유전자 편집 도구에 의해 편집하여, 태아 헤모글로빈(HbF)의 발현을 증가시킨 후, 전체 헤모글로빈을 정상 수준으로 회복시키도록 유전자 변형된 자기유래 조혈줄기세포를 환자에게 복귀시킴으로써, 질병 치료의 목적을 달성한다.
β-지중해 빈혈과 겸상적혈구 빈혈을 치료하기 위한 유전자 편집 요법의 주요 메커니즘은 인체에 자연적으로 존재하는 생물학적 현상, 즉 헤모글로빈 스위칭을 이용하는 것이다. 성인의 헤모글로빈(HbA)은 2개의 α-글로빈과 2개의 β-글로빈으로 구성된 테트라머 복합체이지만, 모체 내에 있는 태아와 출생 후 120일 이내의 아기의 경우, 인체 내의 헤모글로빈은 HbF, 즉 강한 산소 운반 능력과 약한 산소 방출 능력을 특징으로 하는, 2개의 α-글로빈과 2개의 γ-글로빈으로 이루어진 테트라머 복합체이므로, 태아가 모체로부터 영양분을 얻는데 유리하다. 그러나, 태아의 출생 120일 후, 인체의 적혈구는 HbF로부터 HbA로 스위칭되고, 정상 헤모글로빈 HbA를 발현하기 시작한다(Marina et al, Molecular Therapy. 2017; Megan D, et al. Blood. 2015). 클리닉에는 β-지중해 빈혈 또는 겸상적혈구 빈혈과 관련된 돌연변이를 보유하고 있지만, 임상 증상이 경미하거나 또는 전혀 없는 환자의 부류가 있다; 왜냐하면 HbF 발현 억제 유전자는 또한 이들 유전자의 발현을 감소시키는 돌연변이도 보유하여, 결과적으로 환자는 태아 헤모글로빈(HPFH)의 유전적 지속성을 갖게 되어, β-글로빈의 부족 또는 감소로 인한 적혈구에서의 전체 헤모글로빈 수준의 감소를 보상함으로써, 전체 헤모글로빈을 정상 수준에 가깝거나 정상 수준으로 되돌리기 때문이다(Vinjamur DS, et al. Br. J. Haematol. 2018). 따라서, 유전자 편집에 의해 적합한 유전자 표적 부위를 찾고 또한 적혈구 내 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 방법은 아주 새로운 치료 전략이 된다. 그러나, 인체에서 HbF 및 HbA의 발현은 비교적 안정한 동적 평형 상태에 있고, 조절 메커니즘은 매우 복잡하다. 연구에 따르면, β-글로빈의 40-60kb 상류에 약 16kb의 LCR(유전자좌 제어 영역)이 있으며, 이 영역은 HbF 및 HbA의 발현 조절에 참여하는 5개의 DNase 고감수성 부위를 포함한다. 또한, 조혈 시스템 발달 및 적혈구 분화 및 성숙과 관련된 일부 키 전사 인자가 GATA-1, BCL11A, FOG1, NuRD, LRF, MYB, KLF1, TAL1, E2A, LMO2 및 LDB1 등을 포함한 이 영역에서 단단히 결합되어 있고, 그들은 HbF 및 HbA의 발현을 협력하여 조절한다(G. Lettre, et al. PNAS. 2008, 11869-11874; Marina et al, Molecular Therapy. 2017; Megan D, et al. Blood. 2015). 현재, 발견된 적절한 표적은 BCL11A 적혈구 인핸서(+58)의 위치이며, 이 영역은 BCL11A 유전자의 발현을 하향 조절하도록 유전자 편집에 의해 변형됨으로써, 다른 계통의 분화 및 발달에 영향을 미치지 않고, BCL11A 유전자에 의한 γ-글로빈 및 HbF의 발현 억제가 완화되고 또한 γ-글로빈 및 HbF의 발현이 증가하고; 또한 일부 임상적으로 무증상 환자는 이 부위에서 HPFH를 유발하는 돌연변이를 보유한다(U. Manuela, et al. PNAS. 2008; P. Liu, et al. Nature Immunology. 2003; DE Bauer. Science. 2013; VG Sankaran, et al. Science. 2008, Matthew C., et al. Nature. 2015).
BCL11A 적혈구 인핸서 부위에 대한 임상 시험, 즉 유전자 편집 기술에 의해 개발된 자가 조혈줄기세포 이식을 통해 β-지중해 빈혈 및 겸상적혈구 빈혈을 치료하기 위한 임상 1/2상 시험이 수행되었지만(Clinicaltrials.govnombers: NCT03655678 , NCT03745287 및 NCT03432364), 그러나 환자 사이의 개체차로 인해, HbF에 대한 BCL11A 유전자의 조절 정도는 환자마다 다르다. 예를 들면, 소정 유형의 환자에게서 BCL11A 유전자가 이미 매우 낮은 발현 상태에 있는 바, BCL11A 유전자에 의한 HbF의 발현 억제가 완화된 것을 나타내는 경우, HbF가 증가하도록 BCL11A 적혈구 인핸서를 편집하여 환자를 치료하는 것은 실패할 수 있고; 또한 환자가 골수와 면역 체계를 정화하기 위해 화학 요법을 거치는 경우, 예측할 수 없는 잠재적인 손상이 야기될 수 있다. 또한, γ-글로빈 및 HbF 태아 헤모글로빈의 발현을 조절하는 메커니즘은 매우 복잡하고, 또한 소정 유전자 또는 여러 유전자의 발현을 검출함으로써 사전에 치료 방법의 유효성을 예측하기 어렵다. 따라서, BCL11A 유전자에 의한 γ-글로빈 및 HbF 발현의 상향 조절의 정도 및 가능성을 사전에 예측하는 방법은 유전자 편집된 자가 조혈줄기세포 치료에서 시급히 해결되어야 할 필요가 있는 주요 문제이다.
본 출원은 HbF에 대한 BCL11A 유전자의 조절 정도를 사전에 평가하는 전략을 활용하고, 또한 이상헤모글로빈증의 치료에 있어서 유전자 편집 기술의 유효성을 예측하고, BCL11A 적혈구 인핸서 부위의 유전자 편집에 의해 γ-글로빈 및 HbF의 발현 증가의 정도를 사전에 예측하고, 환자의 세포에서의 BCL11A의 낮은 발현 또는 낮은 기능으로 인한 치료의 실패 또는 유효성의 감소의 위험을 감소시킴으써, 임상 치료 프로세스 동안 진단 및 치료를 위해 환자를 선별하기 용이하게 하기 위한 동반 진단 방법을 개발한다. BCL11A의 발현이 높은 환자 및/또는 BCL11A가 γ-글로빈 및 HbF를 조절하는데 중요한 역할을 하는 환자가 치료를 수행하기 위해 우선적으로 선택되고, 또한 동반 진단뿐만 아니라 유전자 편집된 자가 조혈줄기세포의 새로운 치료 솔루션은 기존 기술의 공백을 메우기 위해 개발되어, 유전자 편집된 자가 조혈줄기세포를 이용하여 이상헤모글로빈증을 치료하는 새로운 치료 전략의 신속한 개발을 촉진함으로써, 임상 적용의 요구를 충족시킨다.
본 출원은 상이한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 유래된 조혈줄기세포에 관하여, BCL11A 적혈구 인핸서의 동일한 부위가 효율적으로 유전자 편집된 후, γ-글로빈 mRNA 수준 및 HbF 단백질 수준이 적혈구 분화 후 상이하게 증가하는 바, 개체차가 γ-글로빈 및 HbF 단백질의 발현에 대한 BCL11A의 억제 가능성 및 정도에 영향을 미친다는 것을 실험을 통해 처음으로 증명한다. 또한, 동일한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 유래된 조혈줄기세포에 관해서는, 상이한 배치식(batch)의 실험에 있어서 BCL11A 적혈구 인핸서의 동일한 부위가 효율적으로 유전자 편집된 후, γ-글로빈 mRNA 수준 및 HbF 단백질 수준이 적혈구 분화 후 안정적이고 유사하게 증가한다. 추가 실험 결과는, 동일한 배치에 있어서 γ-글로빈 및 HbF 단백질의 발현이 더욱 높은 공여자에 관해서는, 또 다른 배치식 실험에 있어서 γ-글로빈 및 HbF 단백질의 발현이 더 높고, 그 반대도 마찬가지이다. 마지막으로, 본 출원은 자가 조혈줄기세포의 BCL11A 적혈구 인핸서 부위의 진단 + 유전자 편집을 동반한 이상헤모글로빈증을 치료하기 위한 새로운 치료 솔루션 및 전략을 처음으로 제안한다.
일 양태에 있어서, 본 출원은:
a) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로서, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 EV(평가) 세포") 평가 단계; 및
b) 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계로서, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 TR(치료) 세포") 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법을 제공한다.
일 양태에 있어서, 본 출원은:
a) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로서, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 EV 세포") 평가 단계; 및
b) 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계로서, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 TR 세포") 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 태아 헤모글로빈의 발현을 증대시키는 방법을 제공한다.
일 양태에 있어서, 본 출원은:
a) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로서, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC가 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 EV 세포") 평가 단계; 및
b) 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계로서, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 TR 세포") 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 헤모글로빈의 기능을 평가하는 방법을 제공한다. 일 양태에 있어서, 본 출원은, 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계를 포함하는 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법으로서, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능("변형된 TR 세포")이 감소하도록 변형되고, 또한
여기서 개체는 치료를 위해, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로부터의 기능적 평가에 근거하여 선택되고, 여기서 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된다("변형된 EV 세포").
일 양태에 있어서, 본 출원은 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기 위한 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체를 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하고, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되고("변형된 EV 세포"), 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 경우, 상기 개체는 치료를 위해 선택된다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체가 상기 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기에 적합한지의 여부를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하고, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되고("변형된 EV 세포"), 또한 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 경우, 상기 개체는 치료에 적합하다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체가 상기 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된 변형 D34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기에 부적합한지의 여부를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하고, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되고("변형된 EV 세포"), 또한 여기서 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하지 않는 경우, 상기 개체는 치료에 적합하지 않다.
상기 실시형태에 있어서, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는, 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력의 평가는: 분화 후 BCL11A의 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준이 분화 후 비변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준보다 적어도 약 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 120% 증가되었는지의 여부를 평가하는 것을 지칭한다.
분화 후 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준이 분화 후 비변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준과 비교하여 적어도 약 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 120% 증가된 경우, 개체는 변형 TR 세포를 사용한 치료에 적합하다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 분화 후 변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈의 수준은 분화 후 비변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈 수준의 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600% 이상이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 분화 후 변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 태아 헤모글로빈은 6.5g/dL, 7.0g/dL, 7.5g/dL, 8.0g/dL, 8.5g/dL, 9.0g/dL, 9.5g/dL, 10g/dL, 10.5g/dL 또는 11.0g/dL 말초혈액 초과 또는 그 이상의 레벨이다. 일부 실시형태에 있어서, 분화 후 변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 태아 헤모글로빈은 약 9.0-18g/dL, 예를 들면 10-17g/dL, 11-15g/dL, 또는 12-16g/dL 말초혈액이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 원하는 수준의 γ-글로빈에 대해, 비변형된 CD34-양성 HSPC와 비교하여 변형된 CD34-양성 HSPC는 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600% 초과 또는 그 이상의 수준의 γ-글로불린 mRNA를 생성한다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 평가 단계는:
a) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 EV 세포")을 얻기 위해 개체의 골수 또는 말초혈액 샘플로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
b) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC 세포("변형된 EV 세포")의 제 1 집단을 얻기 위해 상기 단리된 EV 세포를 변형하는 단계; 및
c) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력을 평가하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 치료 단계는:
a) 말초혈액 중의 CD34-양성 HSPC의 양을 증가시키기 위해 개체의 골수 중의 CD34-양성 HSPC를 말초혈액으로 동원하는 단계;
b) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 TR 세포")을 얻기 위해 개체의 말초혈액으로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계,
c) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단을 얻기 위해 단리된 TR 세포를 변형하는 단계; 및
d) 변형된 TR 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에 있어서, 본 출원은:
1) a) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 EV 세포")을 얻기 위해 개체의 골수 또는 말초혈액 샘플로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
b) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC 세포("변형된 EV 세포")의 제 1 집단을 얻기 위해 상기 단리된 EV 세포를 변형하는 단계; 및
c) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계; 및
2) a) 개체에 있어서의 CD34-양성 HSPC를 말초혈액으로 동원하는 단계;
b) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 TR 세포")을 얻기 위해 개체의 말초혈액으로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계,
c) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단을 얻기 위해 단리된 TR 세포를 변형하는 단계; 및
d) 변형된 TR 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법을 제공한다.
일 양태에 있어서, 본 출원은:
1) a) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 EV 세포")을 얻기 위해 개체의 골수 또는 말초혈액 샘플로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
b) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC 세포("변형된 EV 세포")의 제 1 집단을 얻기 위해 단리된 EV 세포를 유전자 변형(예를 들면, CRISPR 방법에 의한 유전자 변형)하는 단계; 및
c) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계; 및
2) a) 개체에 있어서의 CD34-양성 HSPC를 말초혈액으로 동원하는 단계;
b) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 TR 세포")을 얻기 위해 개체의 말초혈액으로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계,
c) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단을 얻기 위해 단리된 TR 세포를 유전자 변형(예를 들면, CRISPR 방법에 의한 유전자 변형)하는 단계; 및
d) 변형된 TR 세포의 유효량을 개체에 투여(예를 들면, 단일 정맥주사를 포함한 정맥주사에 의해)하는 단계를 포함하는 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 단리된 EV 세포를 생성하기 위해 CD34-양성 HSPC를 단리하는데 사용되는 골수 또는 말초혈액 샘플은 소량이며, 예를 들면 골수의 샘플링 부피는 20ml 이하, 예를 들면 5-20ml, 5-10ml이고; 말초혈액의 샘플링 부피는 30ml 이하, 예를 들면 10-30ml, 15-20ml이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 단리된 TR 세포를 생성하기 위해 CD34-양성 HSPC를 단리하는데 사용되는 골수 또는 말초혈액 샘플은 대량, 예를 들면 50ml 이상, 예를 들면 50-300ml, 100-200ml이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, CD34-양성 HSPC 세포는 개체의 골수 또는 말초혈액으로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 분리 방법은 자기 비드 분리를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단리된 EV 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 유전자 변형은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR), RNA 편집 및 RNA 간섭 기술 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법에 의해 단리된 EV 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능은 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서 BCL11A 유전자를 변형함으로써 감소된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능은 CRISPR/Cas 기술에 의한 CD34-양성 HSPC 세포의 유전자 변형을 통해 감소된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능은 BCL11A 기능 억제제에 의한 CD34-양성 HSPC 세포의 변형을 통해 감소된다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 BCL11A 유전자, 예를 들면 뉴클레아제(예를 들면 ZFN 및 TALEN), 펩티드 핵산, 안티센스 RNA, siRNA, miRNA 및 shRNA의 전사 및/또는 발현을 억제하는 단백질 또는 핵산 분자이다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 억제하는 단백질 또는 핵산 분자이다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 간섭, 억제 또는 파괴하는 단백질 또는 핵산 분자이다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 방해, 억제 또는 파괴하는 뉴클레아제(예를 들면 ZFN 및 TALEN), 펩티드 핵산, 안티센스 RNA, siRNA, miRNA이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은 1) 적혈구 집단이 얻어지도록 분화를 허용하는 조건 하에서 변형된 EV 세포를 배향하는 단계; 및 2) 적혈구에 의해 생성되는 γ-글로불린 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가된다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은 γ-글로불린의 mRNA 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은 태아 헤모글로빈(HbF)의 단백질 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 평가 단계 전에 개체가 CD34-양성 HSPC 세포 동원 또는 전처치를 받지 않았고, 예를 들면 평가 단계 전에 개체에게 골수 및 림프를 정화하기 위한 제제(예를 들면 부설판 및 플루다라빈)가 주입되지 않았다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 평가 단계는 치료 단계 전에 적어도 1회 반복된다.
단리된 TR 세포를 변형하는 방법은 단리된 EV 세포를 변형하는 방법과 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 단리된 TR 세포를 변형하는 방법은 단리된 EV 세포를 변형하는 방법과 동일할 수 있다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 단리된 TR 세포는 유전자 변형된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 유전자 변형은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR), RNA 편집, RNA 간섭(RNAi), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법에 의해 단리된 TR 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능은 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서 BCL11A 유전자를 변형함으로써 감소된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능은 CRISPR/Cas 기술에 의한 CD34-양성 HSPC 세포를 유전자 변형함으로써 감소된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능은 BCL11A 기능 억제제에 의한 CD34-양성 HSPC 세포의 변형을 통해 감소된다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 BCL11A 유전자의 전사 및/또는 발현을 억제하는 단백질 또는 핵산 분자, 예를 들면 뉴클레아제(예를 들면 ZFN 및 TALEN), 펩티드 핵산, 안티센스 RNA, siRNA, miRNA 및 shRNA이다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 억제하는 단백질 또는 핵산 분자이다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 간섭, 억제 또는 파괴하는 단백질 또는 핵산 분자이다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 방해, 억제 또는 파괴하는 뉴클레아제(예를 들면 ZFN 및 TALEN), 펩티드 핵산, 안티센스 RNA, siRNA, miRNA이다.
일부 실시형태에 있어서, 치료 단계는 대량의 조혈줄기세포가 골수에 의해 생성되고 말초혈액 순환계로 방출되도록, 개체의 골수를 동원하는 단계를 포함한다. CD34-양성 HSPC를 동원하는 단계는 CD34-양성 HSPC 세포를 수집하기 전(예를 들면, 4-10일, 5-8일, 또는 6-7일)에 개체에게 과립구 집락 자극 인자(GCSF) 및/또는 플레릭사포를 투여하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 치료 단계는 변형된 TR 세포를 투여하기 전에 개체를 전처치하는 단계를 추가로 포함한다. 전처치는 골수 정화 및/또는 림프 정화의 요법을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 전처치는 화학요법, 모노클로날 항체 요법, 또는 전신 방사선을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 화학요법은 부설판, 시클로포스파미드 및 플루다라빈으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화학요법제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 치료 단계는 변형된 TR 세포의 ≥2x106, ≥5x106, ≥1x107, 또는 ≥2x107세포/kg 체중을 개체에 투여(예를 들면, 단일 정맥 주사를 포함한 정맥 주사에 의해)하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 단리된 TR 세포는 변형 전에 1일 이상 동안 배양된 후, 단리된 TR 세포가 변형된다. 일부 실시형태에 있어서, 변형된 TR 세포는 개체에 투여되기 전에 1일 이상(예를 들면, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일) 동안 배양된다. 일부 실시형태에 있어서, 변형된 TR 세포는 변형된 TR 세포를 개체에 투여하기 전에 적어도 24시간 동안 동결 조건 하에 보관된다. 일부 실시형태에 있어서, 변형된 TR 세포는 동결 조건 하에 보관되기 전에 1일 이상(예를 들면, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일) 동안 배양된다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 이상헤모글로빈증은 겸상적혈구증, 겸상적혈구 소질, 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 C 소질, 헤모글로빈 S/C 질환, 헤모글로빈 D 질환, 헤모글로빈 E 질환, 지중해 빈혈, 산소 친화성이 증가된 헤모글로빈 관련 장애, 산소 친화성이 감소된 헤모글로빈 관련 장애, 불안정한 헤모글로빈 질환 및 메트헤모글로빈혈증으로 이루어진 군에선 선택된다. 일부 실시형태에 있어서, 이상헤모글로빈증은 β-지중해 빈혈 및 겸상적혈구 빈혈로 이루어진 군에서 선택되는다. 일부 실시형태에 있어서, 이상헤모글로빈증은 β0 또는 β+ 지중해 빈혈이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 개체는 인간이다. 일부 실시형태에 있어서, 개체는 35세 미만의 인간이다. 일부 실시형태에 있어서, 개체는 남성이다. 일부 실시형태에 있어서, 개체는 여성이다. 일부 실시형태에 있어서, 개체는 심장, 간, 폐 또는 비장의 합병증이 없는 인간이다. 일부 실시형태에 있어서, 치료 전 개체의 헤모글로빈 수준은 5.0g/dL, 6.0g/dL, 7.0g/dL, 8.0g/dL, 또는 9.0g/dL 말초혈액 이하이다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 치료 단계는 평가 단계 직후에 수행된다.
도 1: Cas9 mRNA 코딩 유전자의 2개 sgRNA(서열 번호 1) 및 파괴된 BCL11A 적혈구 인핸서(각각 sgRNA-1 및 sgRNA-2)를 전기천공법에 의해 5개의 다른 지중해 빈혈 환자 및 2명의 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 각각 유래된 조혈줄기세포에 도입하고, 4일 후, "Synthego ICE Analysis" 온라인 소프트웨어에 의해 인델(Indel)을 생성하는 효율에 대한 통계적 분석을 수행한다.
도 2: Cas9 mRNA의 2개의 sgRNA 및 파괴된 BCL11A 적혈구 인핸서(각각 sgRNA-1 및 sgRNA-2)를 전기천공법에 의해 5명의 다른 지중해 빈혈 환자 및 2명의 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 각각 유래된 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입하고, 적혈구 분화를 수행하고, 18일 후 검출하여, 적혈구 분화의 효율을 나타내는 인간 CD71 및 인간 CD235a의 2개의 막 단백질의 발현 비율을 알아낸다. 대조군: 유전자 편집을 거치지 않는 세포를 나타낸다. sgRNA-1 및 sgRNA-2: 유전자 편집을 거치는 2종류의 sgRNA를 각각 갖는 2종류의 세포를 나타낸다.
도 3: Cas9 mRNA의 2개의 sgRNA 및 파괴된 BCL11A 적혈구 인핸서(각각 sgRNA-1 및 sgRNA-2)를 전기천공법에 의해 5명의 다른 지중해 빈혈 환자와 2명의 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 각각 유래된 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입하고, 적혈구 분화를 수행하고, 18일 후 형광 정량적 PCR에 의해 HBG(γ-글로빈) 유전자 mRNA의 발현을 검출한다. 대조군: 유전자 편집을 거치지 않는 세포를 나타낸다. 실험군: 2종류의 sgRNA의 유전자 편집을 각각 거치는 2종류의 세포를 나타낸다. N=3 실험 반복수. HBG 유전자 및 GAPDH 유전자가 정규화된다.
도 4a: 파괴된 BCL11A 적혈구 인핸서의 Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 2명의 다른 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 각각 유도된 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입하고, 3회의 배치식(batch) 실험을 수행하고, 4일 후 인델 생성 효율에 대한 통계적 분석을 "Synthego ICE Analysis" 온라인 소프트웨어에 의해 수행한다. 도 4b: 파괴된 BCL11A 적혈구 인핸서의 Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 10명의 지중해 빈혈 환자의 동원된 말초혈액으로부터 각각 유도된 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입하고, 다수의 배치식 실험(환자 공여자 1, 3회의 배치; 환자 공여자 6, 환자 공여자 9 및 환자 공여자 10, 각각 2회의 독립적인 배치)을 행하고, 2일 후 "Synthego ICE Analysis" 온라인 소프트웨어에 의해 인델 생성 효율에 대한 통계적 분석을 수행한다.
도 5: 파괴된 BCL11A 적혈구 인핸서의 Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 2명의 다른 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 각각 유도된 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입하고, 3회의 배치식 실험을 수행하고; 적혈구 분화를 수행하고, 18일 후에 적혈구 분화의 효율을 나타내도록 인간 CD71 및 인간 CD235a의 2개의 막 단백질의 발현을 검출한다. 대조군: 유전자 편집을 거치지 않는 세포를 나타낸다. 실험군: sgRNA-2의 유전자 편집을 거치는 세포를 나타낸다.
도 6: 파괴된 BCL11A 적혈구 인핸서의 Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 10명의 지중해 빈혈 환자의 동원된 말초혈액으로부터 각각 유도된 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입하고, 다수의 배치식 실험을 수행하고; 적혈구 분화를 수행하고, 18일 후에 적혈구 분화의 효율을 나타내도록 인간 CD71 및 인간 CD235a의 2개의 막 단백질의 발현을 검출한다. 대조군: 유전자 편집을 거치지 않는 세포를 나타낸다. 실험군: sgRNA-2의 유전자 편집을 거치는 세포를 나타낸다.
도 7: 파괴된 BCL11A 적혈구 인핸서의 Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 제 1 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 각각 유도된 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입하고, 3회의 배치식의 적혈구 분화 실험을 수행하고; 분화 18일 후, 형광 정량적 PCR에 의해 BCL11A 및 HBG(γ-글로빈)를 포함하는 유전자의 mRNA 발현을 검출한다. 대조군: 유전자 편집을 거치지 않는 세포를 나타낸다. 실험군: sgRNA-2의 유전자 편집을 거치는 세포를 나타낸다. N=3 실험 반복수. HBG 유전자 및 BCL11A 유전자는 각각 GAPDH 유전자로 정규화된다.
도 8: 파괴된 BCL11A 적혈구 인핸서의 Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 제 2 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 각각 유도된 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입하고, 3회의 배치식 적혈구 분화 실험을 수행하고; 분화 18일 후, 형광 정량적 PCR에 의해 BCL11A 및 HBG(γ-글로빈)를 포함하는 유전자의 mRNA 발현을 검출한다. 대조군: 유전자 편집을 거치지 않는 세포를 나타낸다. 실험군: sgRNA-2의 유전자 편집을 거치는 세포를 나타낸다. N=3 실험 반복수. HBG 유전자 및 BCL11A 유전자는 각각 GAPDH 유전자로 정규화된다.
도 9a: 파괴된 BCL11A 적혈구 인핸서의 Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 10명의 지중해 빈혈 환자의 동원된 말초혈액으로부터 각각 유도된 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입에 도입하고, 다수의 배치식 실험을 수행하고; 적혈구 분화를 수행하고, 18일 후 유세포 분석에 의해 분화 후 적혈구에서의 HbF 발현의 비율을 검출한다. 대조군: 유전자 편집을 거치지 않는 세포를 나타낸다. 실험군: sgRNA-2의 유전자 편집을 거치는 세포를 나타낸다. 도 9b: 상이한 지중해 빈혈 환자로부터 실험군에서의 HbF+% 및 대조군에서의 HbF+%의 배수의 통계적 분석을 도시한다.
도 10: 지중해 빈혈 환자 1로부터 실험군에서의 HbF+% 및 대조군에서의 HbF+%의 배수의 통계적 분석을 도시한다. n=3 실험 반복수.
도 11: 이상헤모글로빈증을 치료하기 위한 BCL11A 적혈구 인핸서 부위를 유전자 편집하는 신규 치료 솔류션의 개략도이다.
본 출원은 BCL11A 기능을 감소시킴으로써, 예를 들면 유전자 편집 기술을 통한 조혈줄기세포에 있어서의 BCL11A 적혈구 인핸서 부위를 파괴하고, 유전자 편집을 거치는 조혈줄기세포에 대한 적혈구 분화를 수행하고, 또한 γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈의 발현의 상향조절의 정도를 평가함으로써, 이상헤모글로빈증(예를 들면 β-지중해 빈혈 및 겸상적혈구 빈혈) 치료에 있어서 유전자 편집 기술이 유효한지 또는 유전자 편집의 유효성 수준을 예측하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 출원은:
a) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로서, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 EV 세포") 평가 단계; 및
b) 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계로서, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 TR 세포") 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 실시형태에 있어서, 제 1 집단 및/또는 제 2 집단은 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서 BCL11A 유전자를 변형함으로써 BCL11A 기능이 감소하도록 변형(예를 들면, 서열 번호: 3-25 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 sgRNA를 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포 내에 도입하여 BCL11A 유전자를 편집하는 단계를 포함하는 CRISPR/Cas 기술에 의한 유전자 변형)된다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 개체에게 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형("변형된 TR 세포")되고,
여기서 개체는 치료를 위해, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로부터의 기능적 평가에 근거하여 선택되고, 여기서 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형("변형된 EV 세포")된다. 상기 방법의 실시형태에 있어서, 제 1 집단 및/또는 제 2 집단은 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서 BCL11A 유전자를 변형함으로써 BCL11A 기능이 감소하도록 변형(예를 들면, 서열 번호: 3-25 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 sgRNA를 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포 내에 도입하여 BCL11A 유전자를 편집하는 단계를 포함하는 CRISPR/Cas 기술에 의한 유전자 변형)된다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기 위한 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체를 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하고, 여기서 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되고("변형된 EV 세포"), 여기서 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성할 경우, 개체는 치료를 위해 선택된다. 상기 방법의 실시형태에 있어서, 제 1 집단 및/또는 제 2 집단은 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서 BCL11A 유전자를 변형함으로써 BCL11A 기능이 감소하도록 변형(예를 들면, 서열 번호: 3-25 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 sgRNA를 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포 내에 도입하여 BCL11A 유전자를 편집하는 단계를 포함하는 CRISPR/Cas 기술에 의한 유전자 변형)된다.
일 양태에 있어서, 본 출원은:
1) a) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 EV 세포")을 얻기 위해 개체의 골수 또는 말초혈액 샘플로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
b) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC 세포("변형된 EV 세포")의 제 1 집단을 얻기 위해 단리된 EV 세포를 유전자 변형(예를 들면 CRISPR 방법에 의한 유전 변형)하는 단계; 및
c) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계; 및
2) a) 개체에 있어서의 CD34-양성 HSPC를 말초혈액으로 동원하는 단계;
b) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 TR 세포")을 얻기 위해 개체의 말초혈액으로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
c) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단을 얻기 위해 단리된 TR 세포를 유전자 변형(예를 들면 CRISPR 방법에 의한 유전자 변형)하는 단계; 및
d) 유효량의 변형된 TR 세포를 개체에게 투여하는(예를 들면, 단일 정맥주사를 포함하는 정맥주사에 의해) 단계를 포함하는 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 실시형태에 있어서, 제 1 집단 및/또는 제 2 집단은 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서 BCL11A 유전자를 변형함으로써 BCL11A 기능이 감소하도록 변형(예를 들면, 서열 번호: 3-25 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 sgRNA를 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포 내에 도입하여 BCL11A 유전자를 편집하는 단계를 포함하는 CRISPR/Cas 기술에 의한 유전자 변형)된다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 단리된 EV 세포를 생성하기 위해 CD34-양성 HSPC를 단리하는데 사용되는 골수 또는 말초혈액 샘플은 소량이며, 예를 들면 골수의 샘플링 부피는 20ml 이하, 예를 들면 5-20ml, 5-10ml이고; 말초혈액의 샘플링 부피는 30ml 이하, 예를 들면 10-30ml, 15-20ml이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 단리된 TR 세포를 생성하기 위해 CD34-양성 HSPC를 단리하는데 사용되는 골수 또는 말초혈액 샘플은 대량이며, 예를 들면 50ml 이상, 예를 들면 50-300ml, 100- 200ml이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, CD34-양성 HSPC 세포는 개체의 골수 또는 말초혈액으로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 분리 방법은 자성 비드 분리를 포함한다. 예를 들면, 골수 또는 말초혈액 내의 세포는 초상자성 MACS MicroBeads로 특별히 표지된다. 자기 표지 후, 이들 세포는 강력하고 안정적인 자기장에 배치된 분류 컬럼을 통과한다(분류 컬럼에 있어서의 매트릭스는 고구배 자기장을 생성한다). 자기 표지된 세포는 컬럼에 유지되는 반면, 비표지된 세포는 유출된다. 분류 컬럼이 자기장에서 제거하면, 컬럼 내의 자기 표지된 세포가 용출될 수 있어서, 표지된 세포와 비표지된 세포의 2개의 세포 집단을 얻을 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 피콜 액체 밀도 구배 원심분리는 상이한 성분의 비중 차이를 이용하는 저속 밀도 구배 원심분리에 의해 혈액에서 상이한 세포층을 분리하는데 사용될 수 있다. 적혈구 및 과립구의 밀도는 층상 액체의 밀도보다 크며, 적혈구는 피콜 액체와 접한 후 스트링으로 빠르게 응집되어 튜브 바닥에 축적될 것이다. 혈장층과 층상액, 즉 버피 코트(buffy coat) 사이에는 층상액과 동일한 밀도의 단핵세포만이 농축되고, 이 층에는 조혈줄기세포가 존재한다. CD34-양성 HSPC 세포가 후속하는 자기 비드 분류에 의해 얻어질 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체가 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기에 적합한지의 여부를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하며, 여기서 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되고("변형된 EV 세포"), 여기서 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성할 경우, 개체는 치료에 적합하다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체가 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기에 부적합한지의 여부를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하고, 여기서 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 파생되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형("변형된 EV 세포")되고, 여기서 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하지 않을 경우, 개체는 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기에 적합하지 않다.
"조혈줄기세포"는 활발한 증식 잠재력, 다분화 능력 및 자기 재생 능력을 갖는 세포 집단을 지칭한다. 조혈줄기세포는 다양한 혈액세포로 분화하여 보완할 뿐만 아니라, 자기 재생을 통해 줄기세포의 특성 및 양을 유지할 수 있다. 조혈줄기세포의 분화 정도 및 증식 능력은 상이하고 이질적이다. 다능성 조혈줄기세포는 가장 원시적이며, 이들은 우선 유도된 다능성 조혈줄기세포, 예를 들면 과립구, 적혈구, 단핵구 및 거핵구-혈소판 세포를 생성할 수 있는 골수 조혈줄기세포, 및 B 림프구 및 T 림프구를 생성할 수 있는 림프구 줄기세포로 분화한다. 이들 두 가지 유형의 줄기세포는 조혈줄기세포의 기본 특성을 유지하며, 또한 약간 분화되고; 또한 그들은 각각 "골수 성분" 및 림프구의 발생에 책임이 있으므로, 유도된 다능성 조혈줄기세포라고 칭해진다. 또한, 그들은 원시 혈액세포이지만, 조혈줄기세포의 다수의 기본 특성을 상실한, 예를 들면 다중 분화 능력을 상실하고, 또한 하나의 세포주 또는 밀접하게 관련된 2개의 세포주로만 분화하고; 그 자체가 반복적으로 재생하는 능력을 상실하여, 조혈줄기세포의 증식과 분화에 의존하여 그 수를 보충하고; 제한된 증식 잠재력을 가져서 몇 번으로 나누어서만 조혈 전구세포로 더 분화한다. 조혈전구세포로부터 분화되는 혈액세포주의 수에 따라, 이들은 단능성 조혈전구세포(하나의 혈액세포주로만 분화) 및 협능성(oligopotent) 조혈전구세포(2~3개의 혈액세포주로 분화)로 구분된다. 본 출원에 있어서, "조혈줄기세포/전구세포" 및 "조혈줄기세포"라는 용어는 서로 교환가능하게 사용되며, 다능성 조혈줄기세포, 유도된 다능성 조혈줄기세포 및 조혈전구세포를 커버하고, 또한 이들은 상이한 이질성을 가진 조혈줄기세포의 일반적인 용어이다.
본 출원에서 언급된 CD34-양성 HSPC로 약칭되는 "CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포"는 표면에 CD34 마커를 발현하고 또한 조혈 기능을 갖는 줄기세포와 전구세포의 집단을 지칭한다. 예를 들면, CD34-양성 조혈 줄기/전구세포는, 예를 들면 유세포 분석 및 형광 표지된 항CD34 항체에 의해 검출 및 카운팅될 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포는 조혈계 기원의 세포를 포함하는 유기체(개체)로부터 단리되거나 또는 얻어진다. "단리"는 원래의 환경으로부터 제거하는 것을 의미한다. 예를 들면, 세포가 그 자연 상태에서 일반적으로 수반하는 구성요소의 일부 또는 전부로부터 분리되는 경우에, 세포는 단리된다.
조혈줄기세포/전구세포는 성인의 미분획 또는 분획 골수로부터 얻거나 또는 단리될 수 있으며, 공급원은 대퇴골, 고관절, 갈비뼈, 흉골 및 기타 골을 포함한다. 조혈줄기세포 및 전구세포는 고관절로부터 니들 및 시린지로 직접 얻거나 또는 분리될 수 있고, 또는 혈액으로부터 얻어질 수 있고, 일반적으로 GCSF(과립구 집락 자극 인자)와 같은 조혈줄기세포 동원기로 전처리한 후 혈액으로부터 얻어질 수 있다. 조혈줄기세포 및 전구세포의 다른 공급원은 제대혈, 태반 혈액 및 개체의 동원된 말초혈액을 포함한다.
세포 집단이 개체(예를 들면 골수 또는 말초혈액)로부터 단리되어 얻어진 후, CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포를 얻기 위해 추가로 정제될 수 있으며, 예를 들면 면역화에 의해 단리된 세포 집단에서 성숙 계열지향 세포를 제거하고, 예를 들면 일련의 "계열(lineage)" 항원(예를 들면, CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123, 및 CD235a)에 결합하여 있는 항체에 의해 고체 매트릭스를 표지하고, 이어서 CD34-양성 항원에 결합하여 있는 항체를 가진 원래의 조혈줄기세포 및 전구세포를 분리한다. 다양한 세포 공급원으로부터 조혈줄기세포 및 전구세포를 정제하기 위한 키트는 상업적으로 입수가능하고, 또한 특정 실시형태에 있어서, 이들 키트는 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다.
"CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포"는 CD34-양성 세포에서 풍부한 세포 집단에 있어서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포 집단을 나타낼 수 있다.
"변형된" 세포는 생물학적 또는 화학적 방법을 통해 분자 또는 세포 수준에서 변화를 겪는 세포를 지칭한다. 예를 들면, 단리된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")는, 유전자 편집 방법에 의해, 예를 들면 ZFN, TALEN, CHRISPR, RNA 편집 또는 RNAi 기술로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법에 의해 BCL11A 기능이 감소된 변형된 EV 세포 또는 변형된 TR 세포를 생성하도록 BCL11A 유전자 또는 그 코딩 RNA를 파괴한다. 또한, 뉴클레아제(예를 들면 ZFN 및 TALEN), 펩티드 핵산, 안티센스 RNA, siRNA, miRNA 및 shRNA를 포함하는 BCL11A 기능 억제제는 단리된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")를 변형시키기 위해 BCL11A 유전자의 기능을 억제하는데 사용됨으로써, 변형된 EV 세포 또는 변형된 TR 세포를 생성한다. 본원에서 사용된 CD34-양성 "EV 세포"는 평가(EV)에 사용되는 세포를 나타내고; 본원에서 사용된 "TR 세포"는 치료(TR)에 사용되는 세포를 나타낸다.
조혈줄기세포의 "동원"은 조혈 미세환경 내의 조혈줄기세포가 동원제의 영향을 받은 후 특정 골수미세환경으로부터 말초 순환으로 이동하는 프로세스를 지칭한다.
이상헤모글로빈증은 비정상적인 헤모글로빈 분자 구조 또는 글로빈 펩티드쇄의 비정상적인 합성으로 인해 야기된 유전성 혈액 질환의 군이다. 임상증상으로는 용혈성 빈혈, 메트헤모글로빈혈증, 헤모글로빈의 산소 친화성 증가 또는 감소로 인한 조직 저산소증, 또는 보상적 적혈구증가증으로 인한 청색증 등을 들 수 있다.
"헤모글로빈"은 글로빈과 헴으로 구성된 결합 단백질이다. 글로빈 분자는 2쌍의 펩티드쇄를 갖고, 한 쌍은 α쇄이고, 다른 한 쌍은 5종류의 쇄, 즉 β, γ, δ 및 ξ쇄(α쇄와 유사한 구조를 가짐) 및 ε쇄를 포함한 비α쇄이다. 인간 헤모글로빈은 소정의 공간적 관계에 따라 결합된 2쌍(4개)의 헤모글로빈 모노머(각각의 펩티드쇄가 헴에 연결되어 헤모글로빈 모노머를 형성함)으로 이루어진 테트라머, 예를 들면 HbA(또는 HbA1, α2β2), HbA2(α2δ2) 및 HbF(α2γ2)이고, 여기서 HbF(α2γ2)는 태아 헤모글로빈의 테트라머이다.
본원에 사용된 "BCL11A"는 전사 인자이다. 레트로바이러스의 결합 부위로서 마우스에서 처음 발견되었으며, Evi9로 명명되었다. 나중에, 이 유전자는 인간 게놈에서도 발견되었으며, 2번 염색체의 단완의 2p13 부위에 위치되었다.
변형 후 감소된 BCL11A 기능이란, BCL11A 유전자가 파괴되거나 또는 그 발현 및/또는 전사가 변형에 의해, 예를 들면 유전자 변형(예를 들면 DNA 수준 및/또는 RNA 수준에서의 유전자 편집)에 의해 또는 BCL11A 기능 억제제(예를 들면, BCL11A 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제(예를 들면 ZFN 및 TALEN), 펩티드 핵산, 안티센스 RNA, siRNA, miRNA 또는 shRNA)의 추가에 의해, 억제, 약화, 차단 및 방해되는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "CRISPR/Cas"는 CRISPR/Cas9 시스템과 같은 다양한 자연적으로 발생하는 또는 인공적으로 설계된 CRISPR/Cas 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 유전자 편집 기술이다. 자연적으로 발생하는 CRISPR/Cas 시스템은 침입하는 바이러스 및 외래 DNA와 싸우는데 사용될 수 있는, 박테리아 및 고세균의 장기간의 진화 동안에 형성된 적응 면역 방어이다. 예를 들면, CRISPR/Cas9의 작동 원리는, crRNA와 쌍을 이루는 서열의 표적 부위의 이중가닥 DNA를 절단하도록 뉴클레아제 Cas9 단백질을 가이딩하는 tracrRNA/crRNA 복합체를 형성하도록, crRNA(CRISPR 유래 RNA)가 염기쌍을 통해 tracrRNA(트랜스 활성화 RNA)와 결합하는 것이다. 가이드용 sgRNA(단일 가이드 RNA)는 tracrRNA 및 crRNA를 인공적으로 설계함으로써 형성될 수 있으며, 또한 DNA의 부위 특이적 절단을 수행하도록 Cas9를 가이딩하기에 충분하다. RNA 가이딩된 dsDNA 결합 단백질로서, Cas9 이펙터 뉴클레아제는 RNA, DNA 및 단백질을 공국소화(colocalize)할 수 있으며, 또한 형질전환될 가능성이 크다. CRISPR/Cas 시스템은 유형 1, 유형 2 또는 유형 3 Cas 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 Cas9를 사용한다. 다른 적용 가능한 CRISPR/Cas 시스템은 WO2013176772, WO2014065596, WO2014018423, US8,697,359, PCT/CN2018/112068, 및 PCT/CN2027/112에 기재된 시스템 및 방법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단리된 EV 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 유전자 변형은:
징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR), RNA 편집, RNA 간섭 기술, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법에 의해 단리된 EV 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에 있어서, BCL11a 인핸서(예를 들면, BCL11a의 발현 또는 기능에 영향을 미치는, 예를 들면 향상시키는 핵산 서열)는 유전자 변형(예를 들면, ZFN, TALEN, CRISPR, RNA 편집 또는 RNAi로 이루어진 군에서 선택되는 방법)에 의해 파괴된다. BCL11a 인핸서에 대해서는, 예를 들면 Bauer et al., Science, Vol. 342, 2013, pp. 253-257을 참조한다. BCL11a 인핸서의 예는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열이다(예를 들면 hg38: +55:Chr2:60497676-60498941; +58:Chr2:60494251-60495546, +62:Chr2:60490409-60491734에 기록된 바와 같은 위치에 위치된 또는 대응하는 핵산). BCL11a 인핸서의 예는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +62 영역이다. BCL11a 인핸서의 예는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +58 영역이다(BCL11A 유전자의 58K 부위의 150bp 서열: ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaaagcaactgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc (서열 번호: 2). 일부 실시형태에 있어서, BCL11a 인핸서는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +55 영역이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능은 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서 BCL11A 유전자를 변형함으로써 감소된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능은 CRISPR/Cas 기술에 의해 CD34-양성 HSPC 세포를 변형함으로써 감소된다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 억제하는 단백질 또는 핵산 분자이다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 방해, 억제 또는 파괴하는 단백질 또는 핵산 분자이다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 방해, 억제 또는 파괴하는 뉴클레아제(예를 들면 ZFN 및 TALEN), 펩티드 핵산, 안티센스 RNA, siRNA, miRNA이다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 유전자 편집 기술은 BCL11A 기능을 감소시키기 위해 조혈줄기세포에 있어서의 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 BCL11A 게놈 영역을 파괴하기 위해 사용된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 유전자 편집 기술은 징크 핑거 뉴클레아제 기반 유전자 편집 기술, TALEN 유전자 편집 기술 또는 CRISPR/Cas 유전자 편집 기술, RNA 편집 기술, 또는 RNAi 기술이다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 유전자 편집 기술은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술이다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 게놈의 표적 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3-25로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 서열에 상보적이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 서열 번호 3-25 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 sgRNA를 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포 내에 도입하여 BCL11A 유전자를 편집함으로써 BCL11A 기능을 감소시킨다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, sgRNA는 2'-O-메틸 유사체 및/또는 인터뉴클레오티드 3'-티오에 의해 변형된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 화학적 변형은 sgRNA의 5'-말단 및/또는 3'-말단의 마지막 염기 앞의 1개, 2개 및/또는 3개의 염기의 2'-O-메틸 유사체 변형이다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, sgRNA 및 Cas9-인코딩 뉴클레오티드는 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포 내로 공도입(co-introduced)된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, sgRNA 및 Cas9-인코딩 뉴클레오티드는 전기천공법에 의해 조혈줄기세포 내로 공도입된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 전기천공 조건은 200-600V, 0.5ms-2ms이다.
세포 "분화"는 동일한 공급원으로부터의 세포가 형태학적 구조와 기능적 특성이 상이한 세포 집단을 점진적으로 생성하는 프로세스를 지칭한다.
조혈줄기세포로부터 적혈구로의 "분화"는 조혈줄기세포 단계, 적혈구 전구세포 단계, 적혈구 전구세포의 증식 및 분화 단계(최초 적혈구로부터 말기 적혈구), 망상적혈구의 증식 및 성숙 프로세스, 적혈구로 성숙하도록 말초혈액으로부터 망상적혈구를 방출하는 단계를 포함한다. 조혈줄기세포 단계: 현재 조혈줄기세포는 골수, 비장, 간 및 기타 조혈조직에 주로 존재하고, 그 중 소량은 말초혈액에서도 순환하다는 것은 알려져 있다. 적혈구 전구세포 단계: 이 단계에서 세포는 조혈줄기세포와 적혈구 전구세포 사이의 세포 집단이다. 조혈줄기세포는 골수의 조혈 미세환경의 영향 하에서 적혈구 전구세포로 분화한다. 조혈 미세환경은 미세혈관계, 신경계, 및 조혈 스트로마 등을 포함한다. 조혈줄기세포의 분화는 특히 체액성 인자와 사이토카인의 영향이 미쳐치고 그 영향을 받는다. 적혈구 전구세포 단계: 원시 적혈구, 초기 신생 적혈구, 중간 신생 적혈구, 말기 신생 적혈구 및 망상적혈구를 포함하고, 성숙 적혈구에 도달한다.
세포 성숙의 프로세스는 헤모글로빈이 증가하고, 핵 활성이 감소하는 프로세스이다. 세포가 성숙함에 따라, 유핵 적혈구의 헤모글로빈의 함량은 계속해서 증가하고, RNA 함량은 계속해서 감소한다. 적혈구에서 헤모글로빈이 증가하면, 핵이 활성을 잃게 되고, 또한 DNA 또는 RNA를 더 이상 합성하지 않는다. 실험을 통해, 헤모글로빈이 핵막의 기공을 통해 핵으로 진입해서 뉴클레오히스톤에 작용하기 때문에, 염색체가 불활성화로 되고, 핵응축이 촉진되게 된다고 확인했다. 말기 신생 적혈구는 분열을 계속하는 능력을 상실하고, 나중에 그 핵이 농축되어 탈출하여 단핵 대식세포에 의해 삼켜지거나, 또는 비장에서 단편화되어 용해되고, 이것에 의해 핵이 없는 망상적혈구가 된다. 헤모글로빈은 성숙 적혈구 단계에서는 더 이상 합성되지 않는다. 세포내 헤모글로빈 농도의 증가는 세포핵의 활성을 상실하게 한다는 이론에 따르면, 성숙 동안에 적혈구의 분열 횟수와 세포의 최종 크기는 헤모글로빈 합성의 속도와 관련된다. 세포가 성숙함에 따라, 적혈구의 직경이 점차 감소하고, 세포 부피가 점차 감소한다. 이것은 세포 내 헤모글로빈, 매트릭스 단백질 및 각종 효소를 합성하는 일부 소기관(예를 들면 미토콘드리아, 골지체, 폴리리보솜 등)이 점차 감소하고, 또한 소기관도 점차 퇴화되어 소실되기 때문이다. 유전자 활성은 적혈구 성숙 프로세스 동안에 글로빈의 발현에 의해 지배된다. 글로빈은 원시 적혈구에 있어서 단백질의 0.1%만을 차지하며, 망상적혈구 단계까지 95%에 도달한다. 성인형 글로빈의 합성은 주로 HbA(α2β2), 소량의 HbA2(α2δ2) 및 HbF(α2γ2)이라는 것은 공지되어 있다. 적혈구 세포의 증식 시간은 방사성 핵종으로 표지된 세포 증식 주기의 DNA 합성 능력에 의해 추정될 수 있고; 원시 적혈구의 증식시간은 약 20시간, 초기의 신생 적혈구의 증식시간은 약 16시간이고, 중기의 신생 적혈구의 증식시간은 25-30시간이고, 말기의 신생 적혈구의 증식시간은 DNA 합성 능력을 갖고 있지 않고 비증식 세포이다. 따라서, 정상적인 적혈구 전구세포는 골수로부터 생성되며, 새로운 망상적혈구가 골수로부터 빠져나올 때까지 증식 및 분화하는데 약 3~5일이 소요된다. 그 다음, 망상적혈구는 1-2일 동안 비장에 체류하면서, 계속해서 성숙되어 막의 지질 조성을 변화시킨 다음, 혈액 순환으로 진입한다.
"원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 능력"이란 분화 후 비변형된 EV 세포에 의해 생성되는 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈의 수준과 비교하여, 분화 후 변형된 EV 세포에 의해 생성되는 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈의 수준이, 예를 들면 적어도 0.2배, 0.3배, 0.4배, 0.5배, 1.0배, 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6.0배 이상 증가했다는 것을 의미한다. 예를 들면, 본 출원의 일부 실시형태에 있어서, 비변형된 CD34-양성 HSPC와 비교하여, 변형된 CD34-양성 HSPC는 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 또는 그 이상의 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈을 생성한다.
상기 실시형태에 있어서, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는, 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 것은: 분화 후 감소된 BCL11A 기능을 갖는 변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준이 분화 후 비변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성되는 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준보다 적어도 약 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 120% 증가되는지의 여부를 평가하는 것을 나타낸다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 태아 헤모글로빈의 원하는 수준은 6.5g/dL, 7.0g/dL, 7.5g/dL, 8.0g/dL, 8.5g/dL, 9.0g/dL, 9.5g/dL, 10g/dL, 10.5g/dL, 또는 11.0g/dL 말초혈액 또는 그 이상의 수준이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 원하는 수준의 γ-글로빈에 관해서는, 비변형된 CD34-양성 HSPC와 비교하여, 변형된 CD34-양성 HSPC가 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 또는 그 이상의 수준의 γ-글로불린 mRNA를 생성한다.
상기 γ-글로불린 또는 태아 헤모글로빈(HbF) 수준은, 예를 들면 유핵 적혈구가 분화된 세포 집단의 총수의 10%를 초과(예를 들면, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)하여 차지하는 단계까지 CD34-양성 HSPC의 분화 후, γ-글로불린 mRNA 또는 헤모글로빈(HbF)을 검출하고, 이것에 의해 분화 후 BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준이 분화 후 비변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준보다 적어도 약 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 120% 증가되었는지의 여부를 비교함으로써 검출될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC는, 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서 BCL11A 유전자를 변형(예를 들면, CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포로 서열 번호: 3-25 중 어느 하나에서 선택되는 서열을 포함하는 sgRNA를 도입하여 BCL11A 유전자를 편집하는 단계를 포함하는 CRISPR/Cas 기술에 의한 유전자 변형)함으로써 BCL11A 기능이 감소한다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은: 1) 적혈구 집단을 얻기 위해 분화를 허용하는 조건하에서 변형된 EV 세포를 배양하는 단계; 및 2) 적혈구에 의해 생성되는 γ-글로불린 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가된다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은 γ-글로불린의 mRNA 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은 태아 헤모글로빈(HbF)의 단백질 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 개체는 평가 단계 전에 CD34-양성 HSPC 세포 동원 또는 전처치를 거치지 않았다.
일부 실시형태에 있어서, CD34-양성 HSPC 세포 동원은 GCSF 및/또는 Mozobil™(Genzyme) 또는 기타 조혈줄기세포 동원제를 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 평가 단계는 치료 단계 전에 적어도 1회(예를 들면, 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상) 반복된다.
단리된 TR 세포는 변형된 단리된 EV 세포의 변형 방법과 동일하거나 또는 상이한 방법으로 변형될 수 있다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 단리된 TR 세포는 유전자 변형된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단리된 TR 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 유전자 변형은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법에 의해 단리된 TR 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 단리된 EV 세포 또는 TR 세포에 있어서의 BCL11a 인핸서(BCL11a의 발현 또는 기능에 영향을 미치는, 예를 들면 증대시키는 핵산 서열)는 유전자 변형(예를 들면 ZFN, TALEN, CRISPR, RNA 편집 및 RNAi로 이루어진 군에선 선택된 방법)에 의해 파괴된다. BCL11a 인핸서에 대해서는, 예를 들면 Bauer et al., Science, Vol. 342, 2013, pp. 253-257을 참조한다. BCL11a 인핸서의 예는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열이다(예를 들면 hg38:+55:Chr2:60497676-60498941; +58:Chr2:60494251-60495546; +62:Chr2:60490409-60491734에 기록된 바와 같은 위치에 위치된 또는 대응하는 핵산). BCL11a 인핸서의 예는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +62 영역이다. BCL11a 인핸서의 예는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +58 영역이다. 일부 실시형태에서, BCL11a 인핸서는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +55 영역이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능은 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서 BCL11A 유전자를 변형함으로써 감소된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능은 CRISPR/Cas 기술에 의해 CD34-양성 HSPC 세포를 변형함으로써 감소된다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 억제하는 단백질 또는 핵산 분자이다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 방해, 억제 또는 파괴하는 단백질 또는 핵산 분자이다. 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 기능 억제제는 인간의 2번 염색체상의 위치 60495197-60495346의 영역에서의 유전자의 전사 및/또는 발현을 방해, 억제 또는 파괴하는 뉴클레아제(예를 들면 ZFN 및 TALEN), 펩티드 핵산, 안티센스 RNA, siRNA, miRNA이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 유전자 편집 기술은 BCL11A 기능을 감소시키기 위해 조혈줄기세포에 있어서 인간의 2번 염색체 상의 위치 60495197-60495346의 BCL11A 게놈 영역을 파괴하는데 사용된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 유전자 편집 기술은 징크 핑거 뉴클레아제 기반 유전자 편집 기술, TALEN 유전자 편집 기술 또는 CRISPR/Cas 유전자 편집 기술, RNA 편집 기술, 또는 RNAi 기술이다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 유전자 편집 기술은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술이다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, BCL11A 게놈의 표적 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3-25로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 서열에 상보적이다.
하기 표는 서열 번호 3-25로 표시되는 sgRNA가 표적으로 하는 인간의 2번 염색체 상의 게놈 서열 위치, 및 각 sgRNA에 의해 촉발되는 Cas9 절단에 대한 절단 부위를 열거한다.
Figure pct00001
서열 번호 3: BCL11A의 인핸서-1로 명명된 sgRNA(인핸서-1로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
cacaggctccaggaagggtt
서열 번호 4: BCL11A의 인핸서-2로 명명된 sgRNA(인핸서-2로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
atcagaggccaaacccttcc
서열 번호 5: BCL11A의 인핸서-3으로 명명된 sgRNA(인핸서-3으로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
Ctaacagttgcttttatcac
서열 번호 6: BCL11A의 인핸서-4로 명명된 sgRNA(인핸서-4로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
ttgcttttatcacaggctcc
서열 번호 7: BCL11A의 인핸서-5로 명명된 sgRNA(인핸서-5로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
ttttatcacaggctccagga
서열 번호 8: BCL11A의 인핸서-6으로 명명된 sgRNA(인핸서-6으로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
tttatcacaggctccaggaa
서열 번호 9: BCL11A의 인핸서-7로 명명된 sgRNA(인핸서-7로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
tgggtggggtagaagaggac
서열 번호 10: BCL11A의 인핸서-8로 명명된 sgRNA(인핸서-8로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
gggcgtgggtggggtagaag
서열 번호 11: BCL11A의 인핸서-9로 명명된 sgRNA(인핸서-9로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
ttagggtgggggcgtgggtg
서열 번호 12: BCL11A의 인핸서-10으로 명명된 sgRNA(인핸서-10으로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
attagggtgggggcgtgggt
서열 번호 13: BCL11A의 인핸서-11로 명명된 sgRNA(인핸서-11로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
gattagggtgggggcgtggg
서열 번호 14: BCL11A의 인핸서-12로 명명된 sgRNA(인핸서-12로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
tctgattagggtgggggcgt
서열 번호 15: BCL11A의 인핸서-13으로 명명된 sgRNA(인핸서-13으로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
ctctgattagggtgggggcg
서열 번호 16: BCL11A의 인핸서-14로 명명된 sgRNA(인핸서-14로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
cacgcccccaccctaatcag
서열 번호 17: BCL11A의 인핸서-15로 명명된 sgRNA(인핸서-15로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
ttggcctctgattagggtgg
서열 번호 18: BCL11A의 인핸서-16으로 명명된 sgRNA(인핸서-16으로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
tttggcctctgattagggtg
서열 번호 19: BCL11A의 인핸서-17로 명명된 sgRNA(인핸서-17로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
gtttggcctctgattagggt
서열 번호 20: BCL11A의 인핸서-18로 명명된 sgRNA(인핸서-18로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
ggtttggcctctgattaggg
서열 번호 21: BCL11A의 인핸서-19로 명명된 sgRNA(인핸서-19로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
aagggtttggcctctgatta
서열 번호 22: BCL11A의 인핸서-20으로 명명된 sgRNA(인핸서-20으로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
gaagggtttggcctctgatt
서열 번호 23: BCL11A의 인핸서-21로 명명된 sgRNA(인핸서-21로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
actcttagacataacacacc
서열 번호 24: BCL11A의 인핸서-22로 명명된 sgRNA(인핸서-22로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
cttcaaagttgtattgaccc
서열 번호 25: BCL11A의 인핸서-23으로 명명된 sgRNA(인핸서-23으로 약칭되는 경우도 있음); sgRNA 코딩 서열:
ctcttagacataacacacca
상기 23개의 sgRNA의 절단 부위를 분석한 결과, 이들 sgRNA에 의해 촉발된 Cas9 절단의 절단 부위는 BCL11A 유전자의 위치 60495219-60495336의 게놈 영역에 집중되어 있다는 것을 확인했다.
일반적으로 말해서, sgRNA에서의 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하도록 표적 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, 최적의 정렬을 위해 적절한 정렬 알고리즘이 사용되는 경우, 가이드 서열과 그 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이거나 또는 이를 초과한다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적절한 알고리즘에 의해 결정될 수 있으며, 비제한적인 예로는: 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만 브니쉬(Needleman-Wunch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 변환(Burrows-Wheeler Transform) 기반 알고리즘(예를 들면 버로우즈 휠러 얼라이너), ClustalW, Clustai X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies, ELAND(Illumina, 미국 캘리포니아주 샌디에고), SOAP(soap. genomics.org.cn에서 입수 가능함), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 입수 가능함)를 들 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 가이드 서열의 길이는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75개 이상 뉴클레오티드이거나 또는 이를 초과할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 가이드 서열의 길이는 약 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 미만의 뉴클레오티드 또는 그 이하의 뉴클레오티드이다. 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 안내하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분(테스트할 가이드 서열을 포함함)이 대응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공될 수 있고, 예를 들면 CRISPR 서열 성분을 인코딩하는 벡터로 트랜스펙팅하고, 그 다음 표적 서열 내에서의 우선적인 절단(본원에 기재된 서베이어(Surveyor)에 의해 결정됨)을 평가함으로써 행해질 수 있다. 마찬가지로, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열의 성분, CRISPR 복합체(시험할 가이드 서열 및 이 가이드 서열과는 상이한 대조 가이드 서열을 포함함)를 제공함으로써 시험관 내에서 수행될 수 있고, 그 다음 시험한 서열과 대조 가이드 서열의 표적 서열에 대한 결합 또는 절단의 비율을 비교함으로써, 평가가 행해질 수 있다. 상기 검출 및 평가를 행하기 위해 당업자에게 공지된 다른 어세이 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 유전자 편집 프로세스에 사용된 sgRNA는 화학적으로 변형된다. "화학적으로 변형된 sgRNA"는 5'-말단 및 3'-말단의 3개의 염기에서 2'-O-메틸 유사체 변형 및/또는 인터뉴클레오티드 3'-티오 변형과 같은 sgRNA의 특수한 화학적 변형을 지칭한다.
화학적으로 변형된 sgRNA는 적어도 다음과 같은 두 가지 이점이 있다. 첫째로, sgRNA는 반감기가 매우 짧은 단일가닥 형태의 RNA이기 때문에, 세포에 진입한 후 신속하게(최대 12시간) 분해되는 반면, Cas9 단백질은 유전자 편집을 수행하기 위해 sgRNA에 결합하는데 적어도 48시간이 걸린다. 따라서, 화학적으로 변형된 sgRNA를 채택하고, 세포에 진입된 후 안정적으로 발현되고, 또한 Cas9 단백질과 결합된 후, 게놈에 대한 유전자 편집이 효율적으로 수행되어 인델이 생성될 수 있다. 둘째로, 비변형된 sgRNA는 세포막을 투과하는 능력이 부족하여, 대응하는 기능을 수행하기 위해 세포 또는 조직에 효과적으로 진입할 수 없다. 화학적으로 변형된 sgRNA의 세포막 침투 능력은 일반적으로 향상된다. 본 발명에 있어서, sgRNA의 안정성(반감기 연장)을 향상시키고 또한 세포막으로의 진입능을 향상시킬 수 있는 것이면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 화학적 변형 방법이 사용될 수 있다. 실시예에서 사용된 특정 화학적 변형에 추가하여, 다른 변형 방법, 예를 들면 이하의 문헌에 보고된 화학적 변형 방법도 사용할 수 있다: Deleavey GF1, Damha MJ. 표적으로 하는 유전자 침묵을 위해 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 설계. Chem Biol. 2012년 8월 24일; 19(8):937-54; 및 Hendel et al., 인간 1차 세포에서 CRISPR-Cas 게놈 편집을 향상시키는 화학적으로 변형된 가이드 RNA. Nat Biotechnol. 2015년 9월; 33(9):985-989.
일부 실시형태에 있어서, sgRNA 및/또는 Cas9-인코딩 뉴클레오티드(예를 들면 mRNA)는 전기적 형질도입(electrotransduction)에 의해 조혈줄기세포에 도입되고, 예를 들면 250-360V, 0.5-1ms; 250-300V, 0.5-1ms; 250V-1ms; 250V 2ms; 300V 0.5ms; 300V 1ms; 360V 0.5ms; 또는 360V1ms의 전기천공 조건 하에서 조혈줄기세포 내에 도입된다. 일부 실시형태에 있어서, sgRNA 및 Cas9-인코딩 뉴클레오티드는 전기천공법에 의해 조혈줄기세포 내로 공도입된다. 일부 실시형태에 있어서, sgRNA는 전기적 형질도입에 의해 Cas9를 발현하는 조혈줄기세포 내에 도입된다.
일부 실시형태에 있어서, Cas9-인코딩 뉴클레오티드는 ARCA 캡을 포함하는 mRNA와 같은 mRNA이다. 일부 실시형태에 있어서, Cas9-인코딩 뉴클레오티드는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 내에 있다. 일부 실시형태에 있어서, Cas9-인코딩 뉴클레오티드는 서열 번호 26으로 표시되는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, sgRNA 및 Cas9-인코딩 뉴클레오티드는 동일한 벡터 내에 있다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 서열 번호 3-25로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 서열을 포함하는 sgRNA를 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포 내에 도입하여 BCL11A 유전자를 편집함으로써 BCL11A 기능을 감소시킨다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, sgRNA는 2'-O-메틸 유사체 및/또는 인터뉴클레오티드 3'-티오에 의해 변형된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 화학적 변형은 sgRNA의 5'-말단의 처음 1개, 처음 2개 및/또는 처음 3개의 염기 및/또는 sgRNA의 3'-말단의 마지막 염기에서의 2'-O-메틸 유사체 변형이다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, sgRNA 및 Cas9-인코딩 뉴클레오티드는 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포 내로 공도입된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, sgRNA 및 Cas9-인코딩 뉴클레오티드는 전기천공법에 의해 조혈줄기세포 내로 공도입된다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 전기천공 조건은 200-600V, 0.5-2ms이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 치료 단계에서 CD34-양성 HSPC를 동원하는 단계는 과립구 집락 자극 인자(GCSF) 및/또는 플레릭사포를 이용하여 개체를 치료하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 치료 단계는 변형된 TR 세포를 투여하기 전에 개체를 전처치하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 전처치는 화학요법, 모노클로날 항체 요법, 또는 전신 방사선을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 화학요법은 부설판, 시클로포스파미드 및 플루다라빈으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화학요법제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 변형된 EV 세포 집단은 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈을 발현하는 적혈구 또는 성숙 적혈구의 전구체 세포로 추가 분화하기 위해 시험관내에서 배양된다.
일부 실시형태에 있어서, 적혈구의 전구체 세포는 성숙 적혈구가 되기 전에 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈을 발현할 수 있는 전구체 세포이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 조혈줄기세포의 적혈구계의 확장 및 분화용 배지는 변형된 EV 세포 집단에 대한 조혈줄기세포의 적혈구계의 확장 및 분화를 수행하는데 사용되고, 여기서 조혈줄기세포의 적혈구계의 확장 및 분화용 배지는 기본 배지 및 성장 인자의 조성물을 포함하고, 또한 여기서 성장 인자의 조성물은 줄기세포 성장 인자(SCF); 인터루킨-3(IL-3) 및 에리스로포이에틴(EPO)을 포함한다. 또한, 일부 실시형태에 있어서, 적혈구 분화 및 제핵용 배지를 사용하여 조혈줄기세포의 적혈구 분화 및 제핵을 수행하는 단계도 포함되며, 여기서 적혈구 분화 및 제핵용 배지는 기본 배지, 성장 인자, 및 프로게스테론 수용체 및 글루코코르티코이드 수용체의 길항제 및/또는 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 적혈구 분화 및 제핵용 배지 내의 성장 인자는 에리스로포이에틴(EPO)을 포함하고, 또한 프로게스테론 수용체 및 글루코코르티코이드 수용체의 길항제 및/또는 억제제는 하기 화합물(I)-(IV)로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 1종 또는 2종 이상이다:
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일부 실시형태에 있어서, 조혈줄기세포의 적혈구 확장 및 분화용 배지는 기본 배지 및 성장 인자 첨가제를 포함하며, 여기서 기본 배지는 STEMSPAN™ SFEM II(STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.), 또는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)와 같은 임의의 무혈청 기본 배지에서 선택되고, 선택적으로 ITS(Thermofisher), L-굴루타민(Thermofisher), 비타민 C 및/또는 소 혈청 알부민이 보충되고; 여기서 성장 인자 첨가제는 IL-3, SCF 및 EPO, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 적혈구의 전구체 세포, 예를 들면 적혈모구, 유핵 적혈구, 신생 적혈구 및 망상적혈구는 5-10일, 예를 들면 6-10일, 또는 7-10일의 변형된 EV 세포 집단의 확장 및 분화 후에 얻어진다. 그 다음, 적혈구의 전구체 세포는 약 4-14일, 예를 들면 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일의 분화(또는 분화 및 제핵) 처리되어 성숙 적혈구가 얻어진다.
일부 실시형태에 있어서, 변형된 EV 세포 집단을 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 성숙 적혈구로 분화시키는 단계는:
a) 인간 말초혈액(골수에서 조혈줄기세포의 동원이 있거나 없는) 또는 골수로부터 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포(단리된 CD34-양성 HSPC)를 얻는 단계,
b) BCL11A 기능을 감소시키기 위해 상기 CD34-양성 HSPC를 유전자 변형하는 단계;
c) 5-10일, 예를 들면 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 및 10일의 확장 및 분화를 수행하기 위해 무혈청 배지(SFME)에 추가 성장 인자를 첨가함으로써, 적혈구의 전구체 세포로의 HSPC를 분화시키는 단계;
d) 약 4-14일(예를 들면 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상)의 분화를 수행하기 위해 무혈청 배지(SFME)에 추가 성장 인자를 첨가함으로써, 성숙 적혈구를 얻는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 조혈줄기세포의 적혈구 분화 및 제핵용 배지는 기본 배지, 성장 인자, 및 화학적 소분자 첨가제를 포함하며, 여기서 기본 배지는 필요에 따라 ITS(Thermofisher), L-굴루타민(Thermofisher), 비타민 C 및/또는 소 혈청 알부민, 성장 인자, 및 EPO, 인간 트랜스페린 및/또는 화학적 소분자 미페프리스톤을 포함하는 화학적 소분자 첨가제가 첨가된, STEMSPAN™ SFEM II(STEM CELLS Technology Inc.), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)와 같은 무혈청 기본 배지이다.
변형된 CD34-양성 HSPC(EV 세포 집단)는 분화되어 당업계의 통상적인 방법에 의해 검출될 수 있는 γ-글로빈 mRNA 또는 헤모글로빈(HbF)을 생성한다. 예를 들면, 변형된 CD34-양성 HSPC(EV 세포 집단)가 유핵 적혈구가 분화된 세포 집단의 총 수의 10% 초과(예를 들면 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%)하여 차지하는 단계로 분화하면, 얻어진 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준은 당업계의 통상적인 방법에 의해 검출될 수 있고; 분화 후 BCL11A 기능이 감소한 변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준이 분화 후 비변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준보다 더 높은지를 비교하고, 적어도 약 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 120% 증가한 경우, 본 발명의 방법이 치료에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 임의의 일반적으로 사용되는 기본 배지가 상기 조혈줄기세포의 적혈구계의 확장 및 분화용 배지, 및 조혈줄기세포의 적혈구계 분화 및 제핵용 배지, 예를 들면 STEMSPAN™ SFEM II(STEM CELL TECHONOLOGIES에서 구입); 예를 들면 Thermo Fisher에서 구입한 IMDM, DF12, Knockout DMEM, RPMI 1640, Alpha MEM, DMEM 등에 사용될 수 있다. 또한, 필요에 따라 이들 기본 배지에 다른 성분이 추가로 첨가될 수 있으며, 예를 들면 ITS(즉, 주로 인슐린, 인간 트랜스페린 및 셀레늄을 포함함), L-글루타민, 비타민 C 및 소혈청 알부민이 첨가될 수 있다. 예를 들면, ITS, 2mM L-글루타민, 10-50㎍/ml 비타민 C 및 0.5-5질량% BSA(소 혈청 알부민)이 IMDM 배지에 첨가될 수 있다. 또한, 상기 DF12는 동일한 농도의 ITS, L-글루타민, 비타민 C 및 소혈청 알부민과 함께 첨가될 수 있다. Knockout DMEM은 동일한 농도의 ITS, L-글루타민, 비타민 C 및 소 혈청 알부민과 함께 첨가될 수 있고; RPMI 1640은 동일한 농도의 ITS, L-글루타민, 비타민 C 및 소혈청 알부민과 함께 첨가될 수 있고; Alpha MEM은 동일한 농도의 ITS, L-글루타민, 비타민 C 및 소 혈청 알부민과 함께 첨가될 수 있고; 또한 DMEM은 동일한 농도의 ITS, L-글루타민, 비타민 C 및 소 혈청 알부민과 함께 첨가될 수 있다. 여기서, 다양한 기본 배지에서의 추가 ITS의 농도는 0.1mg/ml의 인슐린 농도, 0.0055mg/ml의 인간 트랜스페린, 및 6.7 x 10-6mg/ml의 셀레늄일 수 있다. 또한, 추가 ITS의 각 성분의 농도도 실제 필요에 따라 조정될 수 있다. ITS는 Thermofisher에서 구입될 수 있고, 필요에 따라 적절한 최종 작업 농도로 조정될 수 있다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 변형된 TR 세포 집단은 개체에 투여되기 전에 생체외 또는 시험관내에서 증식되지 않는다. 특정 실시형태에 있어서, 변형된 TR 세포를 처리 시약을 제거하기 위해 세척될 수 있고, 또한 생체외에서 증식시키지 않고 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 변형된 TR 세포는 임의의 유의한 생체외 세포 분열이 발생하기 전에, 또는 임의의 유의한 생체외 세포 분열에 필요한 시간 전에 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, 변형 후 변형된 TR 세포는 개체에 투여되기 전에 1일 이상 동안 배양된다. 일부 실시형태에 있어서, 변형 후 변형된 TR 세포는 2, 4, 6, 12, 24, 또는 48시간 이내에 환자에게 투여된다.
일부 실시형태에 있어서, 변형된 TR 세포는 개체에 투여되기 전에 적어도 24시간 동안 동결 조건 하에 보관된다. 일부 실시형태에 있어서, 변형된 TR 세포는 동결 조건 하에 보관되기 전에 1일 이상 동안 배양된다. 변형된 TR 세포는 1일 이상(예를 들면, 1-3일) 동안 세포 생존력을 유지하는 사이토카인이 보충된 무혈청 기본 배지에서 배양될 수 있으며, 사이토카인은, 예를 들면 SCF(줄기세포 인자), TPO(트롬보포이에틴), FLT-3L(FMS-유사 티로신 키나아제-3 리간드), 또는 IL-6(인터루킨-6)이다. 예를 들면, 세포는 1일 이상(예를 들면, 1-3일) 동안 줄기세포 성장 배지(CellGenix)에서 배양될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 단리된 TR 세포는 변형 전에 1일 이상 동안 배양된 후, 단리된 TR 세포가 변형된다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 이상헤모글로빈증은 겸상적혈구증, 겸상적혈구 소질, 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 C 소질, 헤모글로빈 S/C 질환, 헤모글로빈 D 질환, 헤모글로빈 E 질환, 지중해 빈혈, 산소 친화성이 증가된 헤모글로빈 관련 장애, 산소 친화성이 감소한 헤모글로빈 관련 장애, 불안정한 헤모글로빈 질환 및 메트헤모글로빈혈증으로 이루어진 군에서 선택되는다. 일부 실시형태에 있어서, 이상헤모글로빈증은 β-지중해 빈혈 및 겸상적혈구 빈혈로 이루어진 군에서 선택되는다. 일부 실시형태에 있어서, 이상헤모글로빈증은 β0 또는 β+ 지중해 빈혈이다.
상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 개체는 인간이다. 상기 방법의 일부 실시형태에 있어서, 치료 단계는 평가 단계 직후에 수행된다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 병증의 개선 또는 제거를 달성하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 그 효과는 질환 또는 그 증상의 완전한 또는 부분적인 예방으로 나타나는 예방적일 수 있고; 및/또는 그 효과는 증상의 개선 또는 제거로 나타나거나, 또는 질환 또는 그 질환으로 인한 부작용의 부분적 또는 완전한 치유를 제공하는 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 (a) 개체에 있어서 질환의 발병을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 그 진전을 예방하는 것; (c) 질환의 완화, 예를 들면 질환의 경감, 예를 들면 병증의 완전한 또는 부분적 제거를 유발하는 것; 및 (d) 개체를 질환 전의 상태로 되돌리는 것, 예를 들면 혈액계를 재건하는 것을 포하는, 포유류, 특히 인간에 있어서 임의의 질환의 치료를 포함한다. 본 출원에 있어서, "치료"는 반드시 질환 또는 질환 상태, 또는 그와 관련된 증상의 완전한 근절 또는 치유를 의미하는 것은 아니며, 질환 또는 질환 상태의 임의의 하나 이상의 측정가능한 징후의 임의의 최소한의 개선 또는 완화를 포함한다. 상기 기재된 특정 방법에 있어서, 치료는 개체의 조혈 재구성 또는 생존의 개선을 포함한다.
예시적인 실시형태:
1. a) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로서, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 EV 세포") 치료 단계; 및
b) 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계로서, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 TR 세포") 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법.
2. 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계를 포함하는 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법으로서, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되고("변형된 TR 세포"),
상기 개체는 치료를 위해, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로부터의 기능적 평가에 근거하여 선택되고, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 EV 세포"), 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법.
3. 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기 위한 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체를 선택하는 방법으로서, 상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하고, 여기서 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소되도록 변형되고("변형된 EV 세포"), 여기서 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 경우에, 상기 개체는 치료를 위해 선택되는 방법.
4. 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체가 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소되도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기에 적합한지의 여부를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하고, 여기서 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되고("변형된 EV 세포"), 또한 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 경우에, 개체는 치료에 적합한 방법.
5. 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체가 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소되도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기에 부적합한지의 여부를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하고, 여기서 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되고("변형된 EV 세포"), 또한 여기서 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하지 않는 경우, 개체는 변형된 TR 세포로 치료하기에 부적합한 방법.
6. 실시형태 1-5 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 평가 단계는:
a) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 EV 세포")을 얻기 위해 개체의 골수 또는 말초혈액 샘플로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
b) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC 세포("변형된 EV 세포")의 제 1 집단을 얻기 위해 단리된 EV 세포를 변형하는 단계; 및
c) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
7. 실시형태 1-6 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 치료 단계는:
a) 말초혈액 중의 CD34-양성 HSPC의 양을 증가시키기 위해 개체의 골수 중의 CD34-양성 HSPC를 동원하는 단계;
b) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 TR 세포")을 얻기 위해 개체의 말초혈액으로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계,
c) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단을 얻기 위해 단리된 TR 세포를 변형하는 단계, 및
d) 변형된 TR 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
8. 1) a) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 EV 세포")을 얻기 위해 개체의 골수 또는 말초혈액 샘플로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
b) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC 세포("변형된 EV 세포")의 제 1 집단을 얻기 위해 상기 단리된 EV 세포를 변형하는 단계; 및
c) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계, 및/또는
2) a) 개체의 CD34-양성 HSPC를 말초혈액으로 동원하는 단계;
b) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 TR 세포")을 얻기 위해 개체의 말초혈액으로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계,
c) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단을 얻기 위해 단리된 TR 세포를 변형하는 단계; 및
d) 변형된 TR 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계를 포함하는, 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법.
9. 실시형태 1-8 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 변형된 EV 세포는 유전자 변형에 의해 변형되는 방법.
10. 실시형태 6-8 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단리된 EV 세포를 변형하는 단계는 상기 단리된 EV 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함하는 방법.
11. 실시형태 9 또는 10에 있어서, 상기 단리된 EV 세포는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 및 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR), RNA 편집 및 RNA 간섭으로 이루어진 군에서 선택되는 기술에 의해 유전자 변형되는 방법.
12. 실시형태 1-11 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은, 1) 적혈구 집단을 얻기 위해 분화를 허용하는 조건하에서 변형된 EV 세포를 배양하는 단계; 및 2) 적혈구에 의해 생성되는 γ-글로불린 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가되는 방법.
13. 실시형태 1-12 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은 γ-글로불린의 mRNA 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가되는 방법.
14. 실시형태 1-12 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은 태아 헤모글로빈(HbF)의 단백질 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가되는 방법.
15. 실시형태 1-14 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 개체는 상기 평가 단계 전에 동원 또는 전처치를 거치지 않는 방법.
16. 실시형태 1-15 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 평가 단계는 상기 치료 단계 전에 적어도 1회 반복되는 방법.
17. 실시형태 1-16 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 변형된 TR 세포는 유전자 변형에 의해 변형되는 방법.
18. 실시형태 7-16 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단리된 TR 세포를 변형하는 단계는 상기 단리된 TR 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함하는 방법.
19. 실시형태 17 또는 18에 있어서, 상기 단리된 TR 세포는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR), RNA 편집, RNA 간섭으로 이루어진 군에서 선택되는 기술에 의해 유전자 변형되는 방법.
20. 실시형태 7-19 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 치료 단계에서의 CD34-양성 HSPC를 동원하는 단계는 과립구 집락 자극 인자(GCSF) 및/또는 플레릭사포로 개체를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
21. 실시형태 1-20 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 치료 단계는 상기 변형된 TR 세포를 투여하기 전에 개체를 전처치하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
22. 실시형태 21에 있어서, 상기 전처치는 화학요법, 모노클로날 항체 요법, 또는 전신 방사선을 포함하는 방법.
23. 실시형태 22에 있어서, 상기 전처치는 화학요법을 포함하는 방법.
24. 실시형태 23에 있어서, 상기 화학요법은 부설판, 시클로포스파미드 및 플루다라빈으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화학요법제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
25. 실시형태 7-24 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단리된 TR 세포는 변형 전에 1일 이상 동안 배양되는 방법.
26. 실시형태 7-25 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 변형된 TR 세포는 개체에 투여되기 전에 1일 이상 동안 배양되는 방법.
27. 실시형태 1-26 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 변형된 TR 세포는 개체에게 변형된 TR 세포를 투여하기 전에 적어도 24시간 동안 동결 조건 하에 보관되는 방법.
28. 실시형태 27에 있어서, 상기 변형된 TR 세포는 동결 조건 하에 보관되기 전에 1일 이상 동안 배양되는 방법.
29. 실시형태 1-28 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 이상헤모글로빈증은 겸상적혈구증, 겸상적혈구 소질, 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 C 소질, 헤모글로빈 S/C 질환, 헤모글로빈 D 질환, 헤모글로빈 E 질환, 지중해 빈혈, 산소 친화성이 증가된 헤모글로빈 관련 장애, 산소 친화성이 감소된 헤모글로빈 관련 장애, 불안정 헤모글로빈 질환 및 메트헤모글로빈혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 방법.
30. 실시형태 29에 있어서, 상기 이상헤모글로빈증은 β-지중해 빈혈 및 겸상적혈구 빈혈로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
31. 실시형태 30에 있어서, 상기 이상헤모글로빈증은 β0 또는 β+ 지중해 빈혈인 방법.
32. 실시형태 1-31 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 개체는 인간인 방법.
33. 실시형태 1-32 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 치료 단계는 상기 평가 단계 직후에 수행되는 방법.
상기 모든 실시형태의 일부 특정 실시형태에 있어서, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 것은: 분화 후 BCL11A의 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준이 분화 후 비변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성되는 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준보다 적어도 약 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 120%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 또는 600% 증가하는지의 여부를 평가하는 것을 지칭한다.
또한, 본 출원은 하기 실시형태를 포함한다.
1. 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법에 사용되는 약제의 제조에 있어서의 변형된 TR 세포의 용도로서, 상기 방법은:
a) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로서, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 EV 세포") 평가 단계; 및
b) 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계로서, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 TR 세포") 치료 단계를 포함하는 용도.
2. 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법에 사용되는 약제의 제조에 있어서의 변형된 TR 세포의 용도로서, 상기 방법은 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계로서, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 TR 세포") 치료 단계를 포함하고, 또한
상기 개체는 치료를 위해, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로부터의 기능적 평가에 근거하여 선택되고, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 EV 세포") 용도.
3. 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체가 개체로부터 유도되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기에 적합 또는 부적합한지를 결정하는 방법에 사용되는 제품의 제조에 있어서 변형된 EV 세포의 용도로서, 상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하고, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되고("변형된 EV 세포"), 또한 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 경우에, 개체는 치료에 적합하고; 여기서 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하지 않는 경우에, 개체는 변형된 TR 세포로 치료하기에 적합하지 않는 용도.
4. 실시형태 1-3 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 평가 단계는:
a) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 EV 세포")을 얻기 위해 개체의 골수 또는 말초혈액 샘플로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
b) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC 세포("변형된 EV 세포")의 제 1 집단을 얻기 위해 단리된 EV 세포를 변형하는 단계; 및
c) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 용도.
5. 실시형태 1-4 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 치료 단계는:
a) 말초혈액 중의 CD34-양성 HSPC의 양을 증가시키기 위해 개체의 골수 중의 CD34-양성 HSPC를 동원하는 단계;
b) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 TR 세포")을 얻기 위해 개체의 말초혈액으로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
c) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단을 얻기 위해 단리된 TR 세포를 변형하는 단계; 및
d) 변형된 TR 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 용도.
6. 실시형태 1-5 중 어느 한 실시형태에 있어서,
1) 상기 평가 단계는:
a) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 EV 세포")을 얻기 위해 개체의 골수 또는 말초혈액 샘플로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
b) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC 세포("변형된 EV 세포")의 제 1 집단을 얻기 위해 상기 단리된 EV 세포를 변형하는 단계; 및
c) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력을 평가하는 단계를 포함하고; 또한
2) 상기 치료 단계는:
a) 상기 개체의 CD34-양성 HSPC를 상기 말초혈액으로 동원하는 단계;
b) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 TR 세포")을 얻기 위해 개체의 말초혈액으로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
c) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단을 얻기 위해 단리된 TR 세포를 변형하는 단계; 및
d) 변형된 TR 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 용도.
7. 실시형태 1-6 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 변형된 EV 세포는 유전자 변형에 의해 변형되는 용도.
8. 실시형태 4-6 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단리된 EV 세포를 변형하는 단계는 상기 단리된 EV 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함하는 용도.
9. 실시형태 7 또는 8에 있어서, 상기 단리된 EV 세포는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 및 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR), RNA 편집, RNA 간섭으로 이루어진 군에서 선택되는 기술에 의해 유전자 변형되는 용도.
10. 실시형태 1-9 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은: 1) 적혈구 집단을 얻기 위해 분화를 허용하는 조건하에서 변형된 EV 세포를 배양하는 단계; 및 2) 적혈구에 의해 생성되는 γ-글로불린 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가되는 용도.
11. 실시형태 1-10 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은 γ-글로불린의 mRNA 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가되는 용도.
12. 실시형태 1-10 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 EV 세포의 능력은 태아 헤모글로빈(HbF)의 단백질 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가되는 용도.
13. 실시형태 1-12 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 개체는 상기 평가 단계 전에 동원 또는 전처치를 거치지 않는 용도.
14. 실시형태 1-13 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 평가 단계는 상기 치료 단계 전에 적어도 1회 반복되는 용도.
15. 실시형태 1-14 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 변형된 TR 세포는 유전자 변형에 의해 변형되는 용도.
16. 실시형태 5-14 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단리된 TR 세포를 변형하는 단계는 상기 단리된 TR 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함하는 용도.
17. 실시형태 15 또는 16에 있어서, 상기 단리된 TR 세포는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR), RNA 편집, RNA 간섭으로 이루어진 군에서 선택되는 기술에 의해 유전자 변형되는 용도.
18. 실시형태 5-17 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 치료 단계에서의 CD34-양성 HSPC를 동원하는 단계는 과립구 집락 자극 인자(GCSF) 및/또는 플레릭사포로 개체를 치료하는 단계를 포함하는 용도.
19. 실시형태 1-18 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 치료 단계는 상기 변형된 TR 세포를 투여하기 전에 개체를 전처치하는 단계를 추가로 포함하는 용도.
20. 실시형태 19에 있어서, 상기 전처치는 화학요법, 모노클로날 항체 요법, 또는 전신 방사선을 포함하는 용도.
21. 실시형태 20에 있어서, 상기 전처치는 화학요법을 포함하는 용도.
22. 실시형태 21에 있어서, 상기 화학요법은 부설판, 시클로포스파미드 및 플루다라빈으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화학요법제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 용도.
23. 실시형태 5-22 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단리된 TR 세포는 변형 전에 1일 이상 동안 배양되는 용도.
24. 실시형태 5-23 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 변형된 TR 세포는 개체에 투여되기 전에 1일 이상 동안 배양되는 용도.
25. 실시형태 1-24 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 변형된 TR 세포는 개체에게 변형된 TR 세포를 투여하기 전에 적어도 24시간 동안 동결 조건 하에 보관되는 용도.
26. 실시형태 25에 있어서, 상기 변형된 TR 세포가 동결 조건 하에 보관되기 전에 1일 이상 동안 배양되는 용도.
27. 실시형태 1-26 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 이상헤모글로빈증은 겸상적혈구증, 겸상적혈구 소질, 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 C 소질, 헤모글로빈 S/C 질환, 헤모글로빈 D 질환, 헤모글로빈 E 질환, 지중해 빈혈, 산소 친화성이 증가된 헤모글로빈 관련 장애, 산소 친화성이 감소된 헤모글로빈 관련 장애, 불안정 헤모글로빈 질환 및 메트헤모글로빈혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 용도.
28. 실시형태 27에 있어서, 상기 이상헤모글로빈증은 β-지중해 빈혈 및 겸상적혈구 빈혈로 이루어진 군에서 선택되는 용도.
29. 실시형태 28에 있어서, 상기 이상헤모글로빈증은 β0 또는 β+ 지중해 빈혈인 용도.
30. 실시형태 1-29 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 개체는 인간인 용도.
31. 실시형태 1-30 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 치료 단계는 상기 평가 단계 직후에 수행되는 용도.
상기 모든 실시형태의 일부 특정 실시형태에 있어서, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 것은: 분화 후 BCL11A의 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성된 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준이 분화 후 비변형된 CD34-양성 HSPC에 의해 생성되는 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준보다 적어도 약 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 120%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 또는 600% 증가하는지의 여부를 평가하는 것을 지칭한다.
실시예
실시예 1: 조혈줄기세포의 BCL11A 인핸서의 유전자 편집
이 실시예는 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 지중해 빈혈 환자 및 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 유래된 CD34-양성 조혈줄기세포의 BCL11A 적혈구 인핸서 부위의 유전자 편집을 포함한다.
"CRISPR RGEN TOOLS" 소프트웨어를 사용하여 BCL11A(+58) 부위를 표적으로 하는 sgRNA를 설계하고, 2개의 화학적으로 변형된 sgRNA를 합성한다. 서열 정보는 다음과 같다: sgRNA-1: ctaacagttgcttttatcac(서열 번호 5); sgRNA-2: atcagaggccaaacccttcc(서열 번호 4). Cas9 mRNA의 코딩 서열 정보는 다음과 같다:
gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgac. (서열 번호 1)
sgRNA의 화학적 합성은, sgRNA의 5'-말단의 처음 3개의 염기와 3'-말단의 마지막 3개의 염기가 2'-O-메틸 유사체 변형 및 인터뉴클레오티드 3'-티오 변형으로 변형되는 것을 의미한다. 하기 화학식에 나타낸 바와 같이, 좌측이 화학적으로 변형된 sgRNA이고, 우측이 비변형된 sgRNA이다. Cas9 mRNA와 sgRNA는 모두 미국 Trilink Biotechnologies로부터 구입했다.
Figure pct00003
우리는 지중해 빈혈 환자 5명과 건강한 공여자 2명의 동원된 말초혈액(동원된 말초혈액의 샘플은 Nanfang-Chunfu Children's Institute of Hematology and Oncology 유래)으로부터 CD34-양성 조혈줄기세포를 단리했다. BTX ECM830 전기천공기에서 "300V 1ms"의 전기천공 조건을 선택하여, 합성된 Cas9 mRNA와 화학적 변형에 의해 합성된 sgRNA-1 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 각각 5명의 환자와 2명의 건강한 공여자 유래의 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입하고; 전기천공 4일 후, CD34-양성 조혈줄기세포의 게놈을 추출하고, 총 길이 903bp(sgRNA 절단 부위의 좌측에 대해서는 453bp이고 우측에 대해서는 450bp)의 단편을 증폭 및 생어 시퀀싱(Sanger Sequencing)을 위해 선택한다.
정방향 프라이머: cacctcagcagaaacaaagttatc(서열 번호 26)
역방향 프라이머: gggaagctccaaactctcaa(서열 번호 27)
인델 생성의 효율에 대한 통계 분석은 "Synthego ICE Analysis" 온라인 소프트웨어에 의한 시퀀싱 결과를 기반으로 수행되며, "Synthego ICE Analysis" 온라인 소프트웨어는 인델의 효율을 분석하기 위한 온라인 소프트웨어이다. 인델로 인한 이중 피크 돌연변이의 효율은 하기 웹사이트를 참조하여 1세대 시퀀싱 결과를 기반으로 하여 분석된다.
https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis.
도 1을 참조하면, 이 결과는 이 실시예에서 합성된 2개의 sgRNA가 상이한 지중해 빈혈 환자 및 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 유래된 CD34-양성 조혈줄기세포의 유전자-편집을 성공적으로 수행한다는 것을 나타내고; 여기서 sgRNA-1의 유전자 편집 효율은 30-70%이고, 인델의 효율은 상이한 공여자 간에서 현저하게 다르다. 대조적으로, sgRNA-2가 세포를 보다 효율적이고 안정적으로 편집하여 인델을 생성함으로써, BCL11A 적혈구 인핸서를 파괴할 수 있다는 점은 상당히 다르고; 5명의 환자 공여자와 2명의 건강한 공여자의 경우, 유전자 편집 효율이 60-80%에 이른다.
실시예 2: γ-글로빈 mRNA 및 적혈구 분화 관련 단백질의 발현
본 실험은 분화 후 유전자 편집된 조혈줄기세포의 γ-글로빈(HBG 유전자) mRNA의 발현을 검증하고, 여기서 조혈줄기세포는 지중해 빈혈 환자 및 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 유래한다.
2.1 적혈구 분화
"300v 1ms"의 전기천공 조건을 선택하여, Cas9 mRNA 및 sgRNA-1, Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 각각 5명의 지중해 빈혈 환자 및 2명의 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 조혈줄기세포에 도입했다. 대조군의 세포는 전기천공 단계를 거치지 않는다. 그 후, 하기 "2단계 방법"의 분화 프로토콜을 통해 적혈구 분화 실험을 수행한다.
"2단계 방법" 분화에 있어서, 먼저 적혈구 확장 및 조혈줄기세포의 분화용 배지를 사용하여, CD34+ HSPC가 분화를 위한 적혈구 전구세포로 분화하도록 유도한 다음, 적혈구 분화 및 조혈줄기세포의 제핵용 배지를 사용하여, 적혈구 전구세포가 성숙 적혈구로 분화하도록 유도한다.
적혈구 확장 및 조혈줄기세포의 분화용 배지에 있어서의 기본 배지는 StemSpan™ SFEM II이고; 성장 인자는 50-200ng/ml SCF, 10-100ng/ml IL-3, 및 1-10U EPO/ml이고; 배양 조건: CD34+ HSPC를 1.0×105세포/ml의 세포 밀도로 적혈구 확장 및 조혈줄기세포의 분화용 배지에서 배양하고, 분화 7일 후, CD34+ HSPC는 적혈구 전구세포로 분화한다.
적혈구 분화 및 조혈줄기세포의 제핵용 배지에 있어서의 기본 배지는 StemSpan™ SFEM II이고; 성장 인자는 1-10U EPO, 100-1000㎍/ml 인간 트랜스페린이며, 화학적 소분자는 0.5-10㎛ 미페프리스톤이다. 전 단계에서 배양된 적혈구 전구세포를 사용하여 적혈구 분화 및 조혈줄기세포의 제핵용 배지에서 1.0×106세포/ml의 세포밀도로 분화하고, 11일 후에 적혈구 전구세포가 분화되고 성숙 적혈구로 성숙된다.
우리는 적혈구에 의해 발현되는 세포 표면 막 단백질 CD71 및 CD235a의 발현을 검출하고, CD71와 CD235a 이중 양성의 비율을 사용하여 도 2에서 나타낸 바와 같이 CD34+ HSPC가 적혈구로 분화하는 효율을 나타낸다. 실험군은 sgRNA-1 및 sgRNA-2 모두를 포함하고, 대조군은 적혈구로 효율적으로 분화하고, CD71 및 CD235a의 발현율은 모두 약 80% 이상이며, 분화 효율이 높은 바, sgRNA-1 및 sgRNA-2의 유전자 편집 효과는 둘 다 비교적 양호한 것을 나타낸다.
2.2 조혈줄기세포로부터 분화된 적혈구에서의 γ-글로빈(HBG) 유전자의 mRNA 발현의 검출
세포의 mRNA를 실시예 2.1에 있어서의 조혈줄기세포로부터 분화된 성숙 적혈구로부터 추출하고, cDNA로 역전사하고, 도 3에 도시된 바와 같이 형광 정량 PCR에 의해 HBG 유전자의 mRNA 발현을 검출한다.
실험 결과는 다음을 나타낸다:
1) 지중해 빈혈 환자 및 건강한 공여자의 동원된 샘플로부터의 CD34-양성 조혈줄기세포에 있어서, BCL11A의 적혈구 인핸서 부위의 유전자 편집이 수행되어 γ-글로빈(HBG) 및 태아 헤모글로빈 HbF에 대한 BCL11A의 억제가 완화되고; sgRNA-1 및 sgRNA-2의 2개의 실험군의 세포에 있어서, γ-글로빈(HBG)의 mRNA 발현 수준이 증가된다.
2) 특히:
a. 환자 1의 경우, sgRNA-1은 약 4.2배 증가하고, sgRNA-2는 약 3.8배 증가한다.
b. 환자 2의 경우, sgRNA-1은 약 1.8배 증가하고, sgRNA-2는 약 2배 증가한다.
c. 환자 3의 경우, sgRNA-1은 약 2.1배 증가하고, sgRNA-2는 약 3.1배 증가한다.
d. 환자 4의 경우, sgRNA-1은 약 4배 증가하고, sgRNA-2는 약 5.8배 증가한다.
e. 환자 5의 경우, sgRNA-1은 약 1.6배 증가하고, sgRNA-2는 약 2.2배 증가한다.
f. 건강한 공여자 1의 경우, sgRNA-1은 약 3.0배 증가하고, sgRNA-2는 약 6.1배 증가한다.
g. 건강한 공여자 2의 경우, sgRNA-1은 약 1.7배 증가하고, sgRNA-2는 약 1.7배 증가한다.
상기 데이터를 종합하면, 상이한 공여자(환자 및 건강한 공여자)에 있어서 sgRNA-1이든지 또는 sgRNA-2이든지 간에, BCL11A의 적혈구 인핸서 부위의 유전자 편집이 γ-글로빈(HBG) 및 태아 헤모글로빈 HbF에 대한 BCL11A의 억제를 완화하기 위해 수행되지만, γ-글로빈(HBG)의 증가 수준은 공여자마다 다르다는 것을 알 수 있다.
또한, sgRNA-1과 sgRNA-2에 의한 γ-글로빈(HBG)의 증가 수준은 다르지만, γ-글로빈(HBG)의 증가 수준이 낮은 공여자와 비교하여, γ-글로빈(HBG)의 수준이 더 높게 증가된 공여자에 있어서, sgRNA-1 및 sgRNA-2는 일관성 및 안정성의 정도가 높은 동일한 경향을 갖는다. 예를 들면, 환자 공여자 1의 경우, sgRNA-1과 sgRNA-2가 모두 약 4배 증가하는 반면, 환자 공여자 2의 경우, sgRNA-1과 sgRNA-2가 모두 약 2배만 증가하고; 건강한 공여자 1의 경우, sgRNA-1과 sgRNA-2가 모두 3.0~6.0배 증가하는 반면, 건강한 공여자 2의 경우, sgRNA-1과 sgRNA-2가 모두 2배 미만으로 증가한다.
실시예 3: 유전자 편집 효율의 검출을 위한 다중 배치식 검증 실험
3.1 건강한 공여자로부터의 동원된 말초혈액
본 실험은 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 2명의 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터의 CD34-양성 조혈줄기세포의 BCL11A 적혈구 인핸서 부위의 효율적인 유전자 편집을 위한 다중 배치식 검증 실험을 포함한다.
실시예 1 및 실시예 2의 결과로부터, BCL11A 적혈구 인핸서 부위의 효율적이고 안정적인 유전자 편집을 위해 Cas9 mRNA 및 sgRNA-2가 사용될 수 있으며, 또한 유전자 편집 효율이 sgRNA-1보다 더 높은 60-80%이고; 더욱이 γ-글로빈(HBG) 및 태아 헤모글로빈 HbF에 대한 BCL11A의 억제를 해제한 후, sgRNA-2에 의해 야기된 γ-글로빈(HBG)의 증가된 mRNA 수준은 sgRNA-1보다 높을 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이 실시예에 있어서, sgRNA-2는 후속 실험을 위한 바람직한 표적으로서 선택된다.
BTX ECM830 전기천공기에서 "300V 1ms"의 전기천공 조건을 선택하여, 화학적 변형에 의해 합성된 합성 Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 2명의 건강한 공여자로부터 유래한 CD34-양성 조혈줄기세포에 각각 도입하고; 전기천공 4일 후, CD34-양성 조혈줄기세포의 게놈을 추출하고, 전체 길이가 903bp(sgRNA 분할 부위의 좌측 및 우측에 대해 약 450bp)인 단편을 증폭 및 생어 시퀀싱을 위해 선택한다. 시퀀싱 프라이머 및 유전자 편집 효율의 분석 방법에 대해서는 실시예 1을 참조한다. 실험 결과를 도 4a에 도시한다.
실험 결과는, 전기천공 조건 하에서, 본 실시예에서 합성된 sgRNA-2가 상이한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 CD34-양성 조혈줄기세포의 유전자 편집을 성공적이고 효율적으로 수행하고, 또한 효율적으로 인델을 생성하고; 2명의 건강한 공여자에 대한 3회의 배치식 실험에서 유전자 편집 효율이 70-80%에 이르는 것을 나타낸다. 여기서, "3회의 배치식 실험"이란, 1개의 동원된 말초혈액의 샘플을 각각의 건강한 공여자로부터 얻고, CD34-양성 조혈줄기세포를 단리하지만, 이들 세포에 대해 3회의 독립적인 유전자 편집 실험을 수행하는 것을 의미한다.
3.2 지중해 빈혈 환자는 말초혈액원을 동원함
BTX ECM830 전기천공기에서 "300V 1ms"의 전기천공 조건을 선택하여, 화학적 변형에 의해 합성된 Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 각각 전기천공법에 의해 지중해 빈혈 환자 10명으로부터 유래하는 CD34-양성 조혈줄기세포에 도입한다. 대조군 세포는 전기천공 단계를 거치지 않는다. 2일 후, 게놈을 추출하고, 총 길이 903bp(sgRNA 절단 부위의 좌측 및 우측에 대해 약 450bp)의 단편을 PCR 증폭을 위해 선택하고, PCR 생성물을 생어 시퀀싱에 사용한다. 시퀀싱 프라이머 및 유전자 편집 효율의 분석 방법에 대해서는 실시예 1을 참조한다. 실험 결과는 도 4b에 도시된다.
실험 결과는, 전기천공 조건 하에서, 본 실시예에서 합성된 sgRNA-2는 상이한 지중해 빈혈 환자의 동원된 말초혈액으로부터의 CD34-양성 조혈줄기세포의 유전자 편집을 성공적이고 효율적으로 수행하고, 또한 효율적으로 인델을 생성하고; 지중해 빈혈 환자 10명에 대한 다수의 배치식 실험에서 유전자 편집 효율이 60-80% 이상에 이르는 것을 나타내고; 여기서 1개의 동원된 말초혈액 샘플은 각각의 지중해 빈혈 환자 10명으로부터 얻고, 유전자 편집 실험을 위해 CD34-양성 조혈줄기세포를 단리한다. 이들 세포의 경우, 환자 공여자 1에 대해 3개의 독립적인 유전자 편집 실험을 수행하고; 3명의 환자 공여자인 공여자 6, 공여자 9, 공여자 10에 대해서는 2회의 독립적인 유전자 편집 실험을 각각 수행하는 한편, 나머지 환자 공여자에 대해서는 단일 유전자 편집 실험을 수행한다.
실시예 4: 분화 후 조혈줄기세포의 γ-글로빈 mRNA 및 태아 헤모글로빈 HbF의 발현
본 실험은 분화 후 유전자 편집된 조혈줄기세포의 BCL11A 유전자 및 γ-글로빈 mRNA의 발현을 검출하는 것에 관한 것으로, 여기서 조혈줄기세포는 건강한 공여자의 동원된 말초혈액으로부터 유래한다.
4.1 적혈구 분화
4.1.1 건강한 공여자
"300v 1ms"의 전기천공 조건을 선택하여, Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 2명의 건강한 공여자의 동원된 말초혈액 유래의 조혈줄기세포에 각각 도입한다. 대조군의 세포는 전기천공 단계를 거치지 않는다. 3회의 배치식의 적혈구 분화 실험을 하기의 "2단계 방법"의 분화 프로토콜을 통해 수행한다.
"2단계 방법" 분화는: 먼저 적혈구 확장 및 조혈줄기세포의 분화용 배지에서 분화를 수행한 다음, 적혈구 분화 및 조혈줄기세포의 제핵용 배지에서 분화를 수행하는 단계를 포함한다.
적혈구 확장 및 조혈줄기세포의 분화용 배지에 있어서의 기본 배지에는 StemSpan™ SFEM II이고; 성장 인자 50-200ng/ml SCF, 10-100ng/ml IL-3, 및 1-10U EPO/ml이고; 배양 조건: 조혈줄기세포를 적혈구 확장 및 조혈줄기세포 분화용 배지에서 1.0×105 세포/ml로 배양하고, 7일 동안 세포 확장을 수행한다.
적혈구 분화 및 조혈줄기세포의 제핵용 배지에 있어서의 기본 배지는 StemSpan™ SFEM II이고; 성장 인자는 1-10U EPO, 100-1000㎍/ml 인간 트랜스페린이며, 화학적 소분자는 0.5-10㎛ 미페프리스톤이다. 이전 단계에서 배양된 세포를 사용하여 적혈구 분화 및 조혈줄기세포의 제핵용 배지에서 1.0×106세포/ml로 11일 동안 분화한다.
우리는 CD71과 CD235a의 발현을 도 5에 나타낸 바와 같이 FACS 방법으로 검출한다. 실험군과 대조군 모두에 있어서 세포는 높은 효율로 적혈구로 분화하고, CD71과 CD235a의 발현율은 모두 약 85% 이상이고, 분화 효율이 높고, 또한 효과가 양호하다. 여기서, "3회의 배치식의 적혈구 분화 실험"이란, 건강한 공여자 각각으로부터 1개의 동원된 말초혈액의 샘플을 얻고, CD34-양성 조혈줄기세포를 단리하는 반면; 이들 세포에 대해 3회의 독립적인 유전자 편집 실험을 수행하고 3회의 적혈구 분화 실험을 각각 수행하는 것을 의미한다.
4.1.2 지중해 빈혈 환자
"300V 1ms"의 전기천공 조건을 선택하여, Cas9 mRNA 및 sgRNA-2를 전기천공법에 의해 10명의 지중해 빈혈 환자의 동원된 말초혈액 유래의 조혈줄기세포에 각각 도입한다. 대조군 세포는 전기천공 단계를 거치지 않는다. 다중 배치식의 적혈구 분화 실험은 4.1.1에서의 "2단계 방법"의 분화 프로토콜에 의해 수행된다.
분화 18일 후, CD71과 CD235a의 발현이 도 6에 나타낸 바와 같이 검출된다. 실험군과 대조군의 세포 모두에서 세포는 높은 효율로 적혈구로 분화한다. 상이한 지중해 빈혈 환자의 적혈구 분화 효율은 개체 간 다르고; CD71과 CD235a의 이중 양성 발현 비율은 약 60-95%인 바, 분화 효율이 높고 효과가 양호한 것을 나타낸다.
여기서, 1개의 동원된 말초혈액의 샘플을 10명의 지중해 빈혈 환자 각각으로부터 얻고, CD34-양성 조혈줄기세포를 단리하고; 여기서 환자 공여자 1로부터의 CD34-양성 조혈줄기세포를 사용하여 3회의 독립적인 유전자 편집 실험 및 3회의 독립적인 적혈구 분화 실험을 수행하고; 3명의 환자 공여자인 공여자 6, 공여자 9 및 공여자 10 유래의 CD34-양성 조혈줄기세포를 사용하여 2회의 독립적인 유전자 편집 실험 및 2회의 적혈구 분화 실험을 각각 수행하는 한편; 나머지 6명의 환자 공여자에 대해서는 단일 유전자 편집 실험 및 단일 적혈구 분화 실험을 수행한다.
4.2 건강한 공여자의 조혈줄기세포로부터 분화된 적혈구에서의 γ-글로빈 및 BCL11A 유전자의 mRNA 발현의 검출
실시예 4.1.1에서 조혈줄기세포로부터 분화된 성숙 적혈구로부터 추출된 세포의 mRNA를 cDNA로 역전사하고, 도 7-8에 나타낸 바와 같이, 형광 정량적 PCR에 의해 BCL11A 및 HBG와 같은 유전자의 mRNA 발현을 검출한다.
실험 결과는:
1) 건강한 공여자 1의 경우, 3회의 배치식 실험의 결과는, 조혈줄기세포의 BCL11A 적혈구 인핸서의 유전자 편집 후, 실험군에서의 BCL11A 유전자의 발현이 하향 조절되어, 대조군에서의 발현의 약 40-80%인 한편, γ-글로빈(HBG 유전자)의 유전자 발현이 현저하게 증가되고, 또한 3회의 배치식 실험에서 증가된 수준은 대조군의 약 6~10배인 것을 나타내고, 이 결과는 매우 일관되고 안정적이다.
2) 건강한 공여자 2의 경우, 3회의 배치식 실험의 결과는, 조혈줄기세포의 BCL11A 적혈구 인핸서의 유전자 편집 후, 실험군에서의 BCL11A 유전자의 발현이 하향 조절되어, 대조군에서의 발현의 약 40-80%인 한편, γ-글로빈(HBG 유전자)의 유전자 발현이 현저하게 증가하고, 또한 3회의 배치식 반복 실험에서 증가된 수준은 대조군의 약 1.5-3.5배인 것을 나타내고, 이 결과는 매우 일관되고 안정적이다.
이 실험의 결과는 다른 공여자에 대해서는, BCL11A의 적혈구 인핸서를 표적으로 하는 sgRNA 및 Cas9 mRNA의 전기천공 후, BCL11A 유전자 발현의 하향 조절 비율이 20-60%인 반면; γ-글로빈 발현의 증가된 수준은 상당히 상이하다. 건강한 공여자 1의 경우, γ-글로빈의 발현이 6-10배 증가하고; 건강한 공여자 2의 경우, γ-글로빈의 발현이 1.5-3.5배 증가한다. 여기서, "3회의 배치식 적혈구 분화 실험"이란, 각각의 건강한 공여자로부터 1개의 동원된 말초혈액의 샘플을 얻고, CD34-양성 조혈줄기세포를 단리하는 한편; 이들 세포에 대해 3회의 독립적인 유전자 편집 실험을 수행하고, 또한 3회의 적혈구 분화 실험을 각각 수행하고, BCL11A 유전자 및 γ-글로빈(HBG 유전자)의 mRNA 발현 수준을 검출한다.
4.3 지중해 빈혈 환자의 조혈줄기세포로부터 유래된 적혈구에서의 태아 헤모글로빈 HbF 발현의 검출
실시예 4.1.2에서 조혈줄기세포로부터 분화된 성숙 적혈구에서의 태아 헤모글로빈 HbF의 양성 발현율을 도 9a, 9b 및 도 10에 나타낸 바와 같이 유세포 분석법으로 검출한다.
실험 결과는:
1) 유전자 편집을 거치지 않는 대조군에 비해, 유전자 편집을 거치는 CD34-양성 조혈줄기세포로부터 분화된 적혈구에서의 HbF의 발현이 증가한다.
2) 증가된 HbF 발현의 수준은 지중해 빈혈 환자 사이에서 현저하게 상이하며, 3회의 배치식 실험에 있어서, 환자 공여자 1과 환자 공여자 7에 대한 HbF의 발현 수준은 대조군의 약 1.3배이며, 환자 공여자 2에 대한 HbF의 발현 수준은 대조군의 약 2.3배이다. 그러나, 상이한 배치식 실험에서 동일한 지중해 빈혈 환자에 대한 HbF의 발현 수준은 매우 유사하며, 여기서 2회의 배치식 실험에서, 환자 공여자 1에 대한 HbF의 발현 수준은 대조군의 약 1.3배이고, 환자 공여자 9에 대한 HbF의 발현 수준은 대조군의 약 1.4배이고, 환자 공여자 10에 대한 HbF의 발현 수준은 대조군의 약 1.5-1.6배이다.
3) 실험군에 있어서의 환자 공여자 1에 대한 HbF의 발현 수준은 대조군의 1.29±0.12배이다. 따라서, 우리는 유전자 편집 후 HbF의 발현 수준이 대조군보다 적어도 약 12%, 즉 1 표준편차의 값이 증가하면, 이 지중해 빈혈 환자에 대해 효과적이라고 생각한다.
실시예 5: BCL11A 적혈구 인핸서의 유전자 편집에 의한 이상헤모글로빈증의 치료
실시예 2.2, 실시예 4.2 및 실시예 4.3의 결과로부터, BCL11A 적혈구 인핸서에 대해 Cas9 mRNA 및 동일한 sgRNA의 전기천공 후, γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF의 증가된 발현 수준이 상이한 공여자에 대해서 현저하게 다르다는 것을 발견하는 것은 어렵지 않다. 주요 이유는 본 출원의 배경기술에 기재된 바와 같이, 성숙 적혈구에서 γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbFb의 발현을 조절 및 억제하는 메커니즘이 복잡하고, 원거리 조절 영역에서 LCR을 포함하고, 또한 γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF를 조절하기 위한 스위치로서 복합체를 형성하도록 결합하는 BCL11A, MYB, KLF1 및 그 외의 것과 같은 다중 전사 인자가 있다(G. Lettre, et al. PNAS. 2008, 11869-11874; Marina et al, Molecular Therapy. 2017, Megan D, et al. Blood. 2015). 이것은 γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF에 대한 BCL11A의 억제 효과가 개체 사이에서 현저하게 다르다는 것을 의미한다.
또한, γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF에 대한 조절 메커니즘은 복잡하지만, 동일한 개체에 대해서는 태아기부터 출생 및 성인기까지 γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF의 조절 메커니즘은 비교적 일정하므로, γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF에 대한 BCL11A 유전자의 억제 정도 및 효과는 기본적으로 변하지 않는다는 것을 의미하고(Paikari A, et al. Br J Haematol. 2018; Lettre G, et al. Lancet. 2016; G. Lettre, et al. PNAS .2008, 11869-11874; Marina et al, Molecular Therapy. 2017; Megan D, et al. Blood. 2015), 또한 이는 실시예 4.2 및 4.3의 결과로부터 추가로 확인된다. 동일한 공여자의 경우, BCL11A 적혈구 인핸서 부위 및 적혈구 분화의 유전자 편집 후, γ-글로빈(HBG 유전자) mRNA 발현 및 태아 헤모글로빈 HbF의 검출 및 분석을 위한 다수의 배치식 실험에서, 그 증가된 수준이 일관되고 안정적이다.
따라서, 본 출원의 실험 결과와 현상을 조합하면, 이상헤모글로빈증을 치료하기 위한 BCL11A 적혈구 인핸서의 유전자 편집의 현재의 치료 전략은 명백한 잠재적 결함을 갖고, 즉 종래기술은 γ-글로빈 및 태아 헬로글로빈 HbF에 대한 BCL11A의 조절 수준 및 효과를 미리 예측하지 못해서, 환자가 고용량의 골수 청정제 및 자가 조혈줄기세포 이식을 이용하여 치료된 후, 치료 프로토콜이 효과가 없거나 또는 효과가 크지 않을 가능성이 매우 높고, 이것은 환자에게 잠재적으로 큰 피해를 줄 수 있다. 본 출원은 효과적인 예측 방법을 제공하며, 즉 상이한 개체에서의 γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF의 증가된 수준 및 효과가 상이하고, 또한 그 결과는 일관되고 안정적인 반면; 동일한 개체의 조혈줄기세포에 대한 상이한 배치식 실험에서는, BCL11A의 발현을 하향 조절하기 위해 유전자 편집을 수행한 후, γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF의 증가된 수준 및 효과는 일관되고 안정적이며; 유전자 편집 후 태아 헤모글로빈 HbF가 적어도 약 12% 증가될 수 있는 경우, 치료 프로토콜은 지중해 빈혈 환자에게 효과적인 것으로 간주된다.
실험 결과를 기반으로, 본 출원은, 도 11에 도시된 바와 같이, BCL11A 적혈구 인핸서의 유전자 편집, 즉 동반 진단 + 자가 조혈줄기세포의 유전자 편집 요법에 의한 이상헤모글로빈증의 새로운 치료 방법을 제안한다.
동반 진단: BCL11A 적혈구 인핸서의 유전자 편집에 의해 이상헤모글로빈증 환자를 치료하기 전에, 우리는 미리; 즉 환자로부터 소량의 골수 또는 말초혈액을 미리 추출하고, CD34-양성 조혈줄기세포를 단리한 다음, BCL11A 적혈구 인핸서 부위의 유전자 편집을 수행하고, 유전자 편집된 세포를 성숙 적혈구로 분화시켜서, 치료 프로토콜의 효과를 미리 예측할 수 있고, 여기서 γ-글로빈(HBG 유전자) 및 태아 헤모글로빈 HbF의 발현 수준은 일련의 지표에 의해 평가되고, γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF 발현의 수준이 더욱 높게 증가된 환자를 우선 치료 대상으로 선택하므로, 치료 프로토콜이 효과적일 확률이 더 높다. 여기서, 유전자 편집을 거치지 않는 대조군과 비교하여, 실험군에서의 태아 헤모글로빈 HbF의 발현이 적어도 약 12% 증가하면, 치료를 받은 환자가 임상 치료로부터 이익을 얻을 수 있다. 한편으로는 헤모글로빈 함유율이 90g/L인 환자가 수혈 의존성을 제거할 수 있다고 임상적으로 생각되기 때문에; γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF 발현의 수준이 더욱 높게 증가된 환자를 치료를 위해 선택하면, 수혈 의존성이 제거될 가능성이 높아진다. 한편, 90g/L 환자에게서는 수혈을 제거할 수 있지만, 경미한 빈혈 증상은 여전히 존재하며(90-110g/L), 또한 골 발달에도 영향을 미칠 수도 있고(일반적으로, 남성의 헤모글로빈 함유율 범위는 120-160g/L이고, 여성의 경우 110-150g/L임); γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF 발현의 수준이 더욱 높게 증가된 환자가 치료에 선택되는 경우, 환자의 완전한 회복 가능성이 더 크다. 따라서, BCL11A 적혈구 인핸서의 유전자 편집에 의해 이상헤모글로빈증을 치료하는 치료 전략의 목표는 환자의 총 헤모글로빈 발현을 가능한 한 높게 하는 것이며, 정상인의 기준에 도달하면, 치료 효과가 더욱 현저하고, 또한 환자에게 더욱 유익하다. 또한, 본 출원에서 개발한 예측 방법에서는 소량의 골수 또는 말초혈액만을 추출할 필요가 있고, 또한 프로세스가 간단하다. 환자는 골수가 대량의 조혈줄기세포를 생성하도록 동원제를 투여하는 복잡한 프로세스를 거칠 필요가 없고, 또한 스크리닝 기간 동안, 환자에게 부설판 및 플루다라빈과 같은 골수 및 림프를 정화시키기 위한 제제를 대량으로 투여하지 않을 수 있어, 환자의 건강이 보장된다.
자가 조혈줄기세포의 유전자 편집 치료: 최종적으로 치료에 등록된 이상헤모글로빈증 환자를 본 출원에서 개발한 동반 진단법에 의해 결정하고, 그 다음 자가 조혈줄기세포의 유전자 편집의 치료 프로세스에 들어간다: 1. 피험체에게 골수를 동원하기 위해 과립구 집락 자극 인자(G-CSF) 또는/및 플레릭사포(케모카인 수용체 CXCR4 제거용 길항제)를 투여하여, 다수의 조혈줄기세포가 골수에 의해 생성되고 말초혈액 순환 시스템으로 방출된다. 2. 동원이 완료된 후, 유전자를 편집하는 치료 세포 제품의 제조 프로세스가 시작되고; 첫째로, CD34 자기 비드의 표지 및 분류를 통해 CD34-양성 조혈줄기세포를 얻고 배양하고; 둘째로 BCL11A 적혈구 인핸서 부위를 전기천공법에 의해 Cas9 및 sgRNA를 도입함으로써 유전자 편집하고; 마지막으로 세포를 저온 보관하여, 품질 관리 및 안전성 평가 단계에 진입하고, 발송 기준에 도달한 후, 세포를 환자에게 복귀시킬 준비를 한다. 3. 제품이 성공적으로 준비되고, 발송 기준이 충족된 후, 임상의는 피험체에게 입원하여 전처치 화학요법을 받도록(골수 정화제(예를 들면 부설판) 및 림프 정화제(예를 들면 시클로포스파미드 및 플루다라빈)를 투여) 통지한다. 다른 임상 기관이 다른 전처치 프로토콜을 채택할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 일부 임상 기관에서는 부설판과 같은 골수 정화제만 사용할 수 있지만, 다른 임상 기관에서는 골수 절화제, 및 시클로포스파미드 및 플루다라빈과 같은 림프 정화제를 사용할 수 있다. 전처치가 완료된 후, 유전자 편집된 자가 조혈줄기세포를 ≥2×106 활성 CD34-양성 세포/kg의 용량으로 단일 정맥주사를 통해 환자에게 투여하여 복귀시킨다. 4. 주사 완료 후, 피험체를 안전성, 내약성 및 유효성 등을 포함하는 지표를 평가하기 위해 적어도 2년 동안 추적 관찰한다.
(산업적 이용 가능성)
본 출원에 따르면, 본 출원의 방법은 다음과 같은 이점을 갖는다. 첫째로, 하기 현상은 본 출원에서 처음으로 발견되었으며: 상이한 개체에서, BCL11A의 발현을 하향 조절하기 위해 조혈줄기세포의 유전자 편집 후, γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF의 증가된 수준 및 효과는 상이한 한편; 동일한 개체에서, BCL11A의 발현을 하향 조절하기 위해 조혈줄기세포의 유전자 편집 후, γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF의 증가된 수준 및 효과는 일관되고 안정적이며; 또한 이것은 종래기술의 결함을 보완한다. 둘째로, BCL11A 적혈구 인핸서의 유전자 편집 후 태아 헤모글로빈 HbF의 증가된 수준의 유효성 임계값(즉, HbF 수준이 유전자 편집 후 적어도 약 12% 증가됨)은 본 출원에서 처음으로 설정하였고, 이에 따라 환자가 치료를 받은 후, 질환이 현저하게 개선될 수 있으며, 또한 수혈 빈도를 줄이거나 또는 수혈을 제거할 수 있다. 셋째로, 본 출원에서 개발된 동반 진단법은 조작이 간단하고, 또한 스크리닝 기간(환자 스크리닝 기간은 보통 2~3개월 지속됨) 동안에 등록할 환자로부터 소량의 골수 또는 말초혈액만을 추출하고, 그 후 CD34-양성 조혈줄기세포를 단리하고, BCL11A 적혈구 인핸서의 유전자 편집 및 적혈구 분화를 수행하고, 또한 γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF의 증가된 수준을 검출할 필요가 있고; 전체 평가 프로세스를 완료하는데 3-4주만 필요하므로, γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF에 대한 BCL11A 유전자의 조절의 개체차로 인해 환자에 대해 치료 방법이 비효과적이거나 또는 효과가 미미할 위험을 피할 수 있다. 넷째로, 본 출원에서 개발된 방법은 유전자 편집 기술에 의해 이상헤모글로빈증을 치료하기 위한 치료 프로토콜에서 환자를 계층화하고 등급화하는데 유리할 것이고, 즉 γ-글로빈 및 태아 헤모글로빈 HbF의 수준이 더욱 높게 증가된 환자는 치료의 우선 순위수준에 있다. 다섯째로, 본 출원은 자가 조혈줄기세포의 유전자 편집 치료와 동반 진단을 결합한 새로운 치료 프로토콜을 제안함으로써, 유전자 편집에 의한 이상헤모글로빈증 치료의 안전성과 유효성을 향상시킨다.
SEQUENCE LISTING <110> Edigene Inc. <120> Method for Predicting Effectiveness of Treatment of Hemoglobinopathy <130> FD00222PCT-PD01017 <150> PCT/CN2019/085116 <151> 2019-04-30 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 mRNA coding gene <400> 1 gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60 accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180 acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240 ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300 gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420 ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga 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encoding sequence <400> 23 actcttagac ataacacacc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA encoding sequence <400> 24 cttcaaagtt gtattgaccc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA encoding sequence <400> 25 ctcttagaca taacacacca 20 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward sequencing primer <400> 26 cacctcagca gaaacaaagt tatc 24 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse sequencing primer <400> 27 gggaagctcc aaactctcaa 20

Claims (31)

  1. a) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로서, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 EV 세포") 평가 단계; 및
    b) 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계로서, 상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 TR 세포") 치료 단계를 포함하는 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법.
  2. 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 2 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 단계를 포함하는 개체에 있어서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법으로서,
    상기 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형("변형된 TR 세포")되고, 또한
    상기 개체는 치료를 위해, 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 조혈줄기세포/전구세포("CD34-양성 HSPC")의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계로부터 기능적 평가에 근거하여 선택되고, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되는("변형된 EV 세포") 방법.
  3. 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 개체가 상기 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단으로 치료하기에 적합한지 또는 부적합한지를 결정하는 방법으로서,
    상기 방법은 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 평가 단계를 포함하고, 상기 제 1 집단의 변형된 CD34-양성 HSPC는 개체로부터 유래되고 또한 BCL11A 기능이 감소하도록 변형되고("변형된 EV 세포"), 또한 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 경우, 상기 개체는 치료에 적합하고; 상기 변형된 CD34-양성 HSPC의 제 1 집단이 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하지 않는 경우, 상기 개체는 변형된 TR 세포로 치료하기에 적합하지 않은 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 평가 단계는:
    a) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 EV 세포")을 얻기 위해 개체의 골수 또는 말초혈액 샘플로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
    b) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC 세포("변형된 EV 세포")의 제 1 집단을 얻기 위해 상기 단리된 EV 세포를 변형하는 단계; 및
    c) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 상기 변형된 EV 세포의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료 단계는:
    a) 상기 말초혈액 중의 CD34-양성 HSPC의 양을 증가시키기 위해 개체의 골수 중의 CD34-양성 HSPC를 동원하는 단계;
    b) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 TR 세포")을 얻기 위해 개체의 말초혈액으로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계,
    c) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단을 얻기 위해 상기 단리된 TR 세포를 변형하는 단계; 및
    d) 상기 변형된 TR 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1) 평가 단계는:
    a) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 EV 세포")을 얻기 위해 개체의 골수 또는 말초혈액 샘플로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계;
    b) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC 세포("변형된 EV 세포")의 제 1 집단을 얻기 위해 상기 단리된 EV 세포를 변형하는 단계; 및
    c) 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 상기 변형된 EV 세포의 능력을 평가하는 단계를 포함하고; 또한
    2) 상기 치료 단계는:
    a) 개체의 CD34-양성 HSPC를 상기 말초혈액으로 동원하는 단계;
    b) 단리된 CD34-양성 HSPC 집단("단리된 TR 세포")을 얻기 위해 개체의 말초혈액으로부터 CD34-양성 HSPC를 단리하는 단계,
    c) BCL11A 기능이 감소된 변형된 CD34-양성 HSPC("변형된 TR 세포")의 제 2 집단을 얻기 위해 상기 단리된 TR 세포를 변형하는 단계; 및
    d) 상기 변형된 TR 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 EV 세포는 유전자 변형에 의해 변형되는 방법.
  8. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된 EV 세포를 변형하는 단계는 상기 단리된 EV 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 단리된 EV 세포는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 및 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR), RNA 편집, RNA 간섭으로 이루어진 군에서 선택되는 기술에 의해 유전자 변형되는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 상기 변형된 EV 세포의 능력은: 1) 적혈구 집단을 얻기 위해 분화를 허용하는 조건하에서 상기 변형된 EV 세포를 배양하는 단계; 및 2) 적혈구에 의해 생성되는 γ-글로불린 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가되는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 상기 변형된 EV 세포의 능력은 γ-글로불린의 mRNA 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가되는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분화 후 원하는 수준의 γ-글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)을 생성하는 상기 변형된 EV 세포의 능력은 태아 헤모글로빈(HbF)의 단백질 수준을 결정하는 단계를 포함하는 평가 단계에서 평가되는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 상기 평가 단계 전에 동원 또는 전처치를 거치지 않는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 평가 단계는 상기 치료 단계 전에 적어도 1회 반복되는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 TR 세포는 유전자 변형에 의해 변형되는 방법.
  16. 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된 TR 세포를 변형하는 단계는 상기 단리된 TR 세포를 유전자 변형하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    상기 단리된 TR 세포는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR), RNA 편집 및 RNA 간섭으로 이루어진 군에서 선택되는 기술에 의해 유전자 변형되는 방법.
  18. 제 5 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료 단계에서 CD34-양성 HSPC를 동원하는 단계는 과립구 집락자극인자(GCSF) 및/또는 플레릭사포로 개체를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료 단계는 상기 변형된 TR 세포를 투여하기 전에 개체를 전처치하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 전처치는 화학요법, 모노클로날 항체 요법, 또는 전신 방사선을 포함하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 전처치는 화학요법을 포함하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 화학요법은 부설판, 시클로포스파미드 및 플루다라빈으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화학요법제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제 5 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단리된 TR 세포는 변형 전 1일 이상 동안 배양되는 방법.
  24. 제 5 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 TR 세포는 개체에 투여되기 전에 1일 이상 동안 배양되는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 TR 세포는 개체에 상기 변형된 TR 세포를 투여하기 전에 적어도 24시간 동안 동결 조건 하에 보관되는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 변형된 TR 세포는 동결 조건 하에 보관되기 전에 1일 이상 동안 배양되는 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이상헤모글로빈증은 겸상적혈구증, 겸상적혈구 소질, 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 C 소질, 헤모글로빈 S/C 질환, 헤모글로빈 D 질환, 헤모글로빈 E 질환, 지중해 빈혈, 증가된 산소 친화성을 갖는 헤모글로빈 관련 장애, 감소된 산소 친화성을 갖는 헤모글로빈 관련 장애, 불안정 헤모글로빈 질환 및 메트헤모글로빈혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 이상헤모글로빈증은 β-지중해 빈혈 및 겸상적혈구 빈혈로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 이상헤모글로빈증은 β0 또는 β+ 지중해 빈혈인 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 인간인 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료 단계는 상기 평가 단계 직후에 수행되는 방법.
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