TW201837176A - 大量表現目標蛋白系統及其方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種大量表現目標蛋白系統，包含二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞、葉酸拮抗劑、目標蛋白表現載體和CRISPRi表現載體，其中目標蛋白表現載體包含目標蛋白表現卡匣和DHFR表現卡匣，CRISPRi表現載體包含gRNA卡匣和dCas9表現卡匣。所述大量表現目標蛋白系統可以大量提高目標蛋白的產量，並縮短進行基因擴增的時間。

Description

大量表現目標蛋白系統及其方法
本發明是有關於一種DNA重組技術，特別是一種使用載體引入外來遺傳材料的DNA重組技術。
由於生物體內各種蛋白質控制了生理狀態，因此許多疾病與缺乏某些蛋白質有關。蛋白質藥物屬於大分子藥物，可定義為治療人類疾病而由體外給予的配製蛋白質。蛋白質藥物原料以天然的生物材料為主，包括人體、動物、植物和微生物等，因低毒性及與人體相容之優點，為目前新藥發展趨勢及為我國生物製劑產業發展重要項目之一。
過去蛋白質藥物主要來源為從人(血液或尿液)或動物器官(如胰臟)中萃取。這種方法產率和產量都很低，來源不易取得，因此成本非常高。同時由於各種傳染病如愛滋病與狂牛病盛行，很難保證這些藥物不被病原體污染。
以基因工程生產的藥物，利用生物細胞為工廠製造，可在實驗室中篩檢確保不受病原體污染，同時在轉殖蛋白質基因時，可利用強啟動子(strong promoter)使蛋白質表現量增強以提昇產量。早期的宿主細胞常選用大腸桿菌 或酵母菌，因為此類細胞較易培養，容易利用生化反應器放大生產規模，產量較大且培養基較便宜。但大腸桿菌或酵母菌為較簡單的生物，有些蛋白質生產出來會無法適當地摺疊成正確的三維形狀，或因無法進行適當轉譯後處理，而使蛋白質缺乏其應有功能或影響到蛋白質的形狀、功能、穩定性及免疫性質等，因此以細菌生產出的蛋白質可能無法達到所要求的藥效。
面對此狀況，可選用較高等的生物細胞如中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細胞、人類胚胎腎臟(Human embryonic kidney,HEK)細胞、非洲綠猴腎臟(Vero)細胞等哺乳動物細胞作為生產工具，用以表現需要較精密修飾的蛋白質分子。其中CHO細胞具有不死性，可以傳代百代以上，且對於蛋白進行糖基化之糖型與人類基本一致，此外CHO細胞屬於成纖維細胞(fibroblast)，為一種非分泌型細胞，且本身很少分泌CHO內源蛋白，對目標蛋白分離純化工作十分有利，因此CHO細胞為表達複雜生物大分子的理想宿主。目前CHO細胞基因増幅表現系統常用於生產目標蛋白，先前文獻報導中指出，利用CHO細胞基因増幅表現系統進行基因擴增時，若是逐步增加藥物篩選的壓力能促使標的基因擴增套數增加，但因須逐步增加藥物濃度，非常耗時費力，往往需數個月以上才能篩選出高產量細胞株。因此如何有效提高目標蛋白產量並縮短篩選出高產量細胞株始終是相當重要的課題。
本發明之一態樣是在提供一種大量表現目標蛋白系統，其包含二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)缺陷型CHO細胞、葉酸拮抗劑、目標蛋白表現載體和CRISPRi表現載體。目標蛋白表現載體包含目標蛋白表現卡匣和DHFR表現卡匣，其中目標蛋白表現卡匣包含第一啟動子和目標蛋白之基因，DHFR表現卡匣包含第二啟動子和DHRF基因。CRISPRi表現載體包含gRNA卡匣和dCas9表現卡匣，其中gRNA卡匣包含第三啟動子、gRNA序列和終止子，dCas9表現卡匣包含第四啟動子、dCas9-KRAB基因及抵抗抗生素基因。
依據前述之大量表現目標蛋白系統，其中所述二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞可為DUXB11細胞株或DG44細胞株。
依據前述之大量表現目標蛋白系統，其中所述葉酸拮抗劑可為甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺醯亞胺(Methionine sulfoximine,MSX)。
依據前述之大量表現目標蛋白系統，其中所述第一啟動子可為CMV啟動子或SV40啟動子，所述第二啟動子可為CMV啟動子或SV40啟動子，且第二啟動子和第一啟動子不相同。
依據前述之大量表現目標蛋白系統，其中所述第三啟動子可為U6啟動子，第四啟動子可為CMV啟動子或SV40啟動子。
依據前述之大量表現目標蛋白系統，其中所述dCas9表現卡匣可更包含一2A胜肽序列，所述2A胜肽序列串接KRAB區域及抵抗抗生素基因。
依據前述之大量表現目標蛋白系統，其中所述抵抗抗生素基因可為抵抗吉歐黴素(Zeocin resistance,ZeoR)基因。
本發明之另一態樣是在提供一種大量表現目標蛋白方法，包含下述步驟：構築目標蛋白表現載體、構築CRISPRi表現載體、建立第一穩定表現細胞株、建立第二穩定表現細胞株和進行基因擴增。所述目標蛋白表現載體包含目標蛋白表現卡匣和DHFR表現卡匣，其中目標蛋白表現卡匣包含第一啟動子和目標蛋白之基因，DHFR表現卡匣包含第二啟動子和DHRF基因。所述CRISPRi表現載體包含gRNA卡匣和dCas9表現卡匣，其中gRNA卡匣包含第三啟動子、gRNA序列和終止子，dCas9表現卡匣包含第四啟動子、dCas9-KRAB基因及抵抗抗生素基因。而建立第一穩定表現細胞株時，係將所述目標蛋白表現載體轉染至二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞中，並以篩選培養基進行篩選，以得到第一穩定表現細胞株。建立第二穩定表現細胞株時，係將CRISPRi表現載體轉染至所述第一穩定表現細胞株中，並以抗生素進行篩選，以得到第二穩定表現細胞株。進行基因擴增時，係以含有葉酸拮抗劑之培養基培養所述第二穩定表現細胞株，以大量表現目標蛋白。
依據前述之大量表現目標蛋白方法，其中所述 二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞可為DUXB11細胞株或DG44細胞株。
依據前述之大量表現目標蛋白方法，其中所述篩選培養基可為缺乏核酸之α-MEM。
依據前述之大量表現目標蛋白方法，其中所述抗生素可為吉歐黴素(Zeocin)。
依據前述之大量表現目標蛋白方法，其中所述葉酸拮抗劑可為甲氨蝶呤或甲硫胺酸磺醯亞胺。
藉此，本發明之大量表現目標蛋白系統和大量表現目標蛋白方法，能有效地抑制CHO細胞的DHFR基因表現，進而增加基因擴增後的目標蛋白產量。此外，本發明之大量表現目標蛋白系統和大量表現目標蛋白方法不會影響CHO細胞的生長速度，且與傳統方法相比，在進行基因擴增時僅需添加較低劑量的葉酸拮抗劑，而達到傳統方法中以高劑量葉酸拮抗劑處理的基因擴增效果，因此可以大量提高目標蛋白的產量，並縮短進行基因擴增的時間。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
100‧‧‧大量表現目標蛋白方法
110、120、130、140、150‧‧‧步驟
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1A圖繪示pDHFR-2A-EGFP載體之構築示意圖；第1B圖繪示CRISPRi表現載體之構築示意圖；第2圖為CRISPRi表現載體以及綠螢光測試模型對CHO細胞之DHFR mRNA表現量影響之分析結果圖；第3A圖和第3B圖為CRISPRi表現載體以及綠螢光測試模型對CHO細胞之綠螢光表現之分析結果圖；第4圖繪示目標蛋白表現載體之構築示意圖；第5圖為第二穩定表現細胞株之dCas9 mRNA表現量之分析結果圖；第6A圖和第6B圖為第二穩定表現細胞株生長速度影響之分析結果圖；第7圖繪示本發明之大量表現目標蛋白方法之步驟流程圖；第8A圖至第8D圖為本發明之大量表現目標蛋白方法提高目標蛋白產量之分析結果圖；第9A圖至第9D圖為本發明之大量表現目標蛋白方法提高目標蛋白基因表現量之分析結果圖；以及第10A圖至第10D圖為本發明之大量表現目標蛋白方法提高目標蛋白之基因套數之分析結果圖。
本說明書中所述之「CRISPRi」係指CRISPR interference(CRISPRi)系統則是將修改源自於化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的第二型CRISPR/Cas9 系統一改質Cas9蛋白使其失去核酸內切酶活性(RuvC1 and HNH)，被稱為dCas9(Cas9 D10A and H841A)，其作用原理一樣藉由gRNA或crRNA-trancrRNA複合物的誘導結合至指定基因序列，但卻不會對目標基因造成切割，因此可用來阻擋RNA聚合酶進行基因轉錄，進而抑制基因表現。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
<試驗例> 一、本發明之大量表現目標蛋白系統
本發明之大量表現目標蛋白系統包含二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)缺陷型CHO細胞、葉酸拮抗劑、目標蛋白表現載體以及CRISPRi表現載體。
二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞可為CHO DUXB11細胞株或CHO DG44細胞株。
葉酸拮抗劑可為甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺醯亞胺(Methionine sulfoximine,MSX)。
目標蛋白表現載體包含目標蛋白表現卡匣和DHFR表現卡匣，目標蛋白表現卡匣包含第一啟動子和目標 蛋白之基因，DHFR表現卡匣包含第二啟動子和DHRF基因。其中第一啟動子可為CMV啟動子或SV40啟動子，第二啟動子可為CMV啟動子或SV40啟動子，但第一啟動子和第二啟動子不相同。
CRISPRi表現載體包含gRNA卡匣和dCas9表現卡匣，gRNA卡匣包含第三啟動子、gRNA序列和終止子，dCas9表現卡匣包含第四啟動子、dCas9-KRAB基因、及抵抗抗生素基因。dCas9表現卡匣更可包含2A胜肽序列，所述2A胜肽序列串接dCas9-KRAB基因及抵抗抗生素基因。前述第三啟動子可為U6啟動子，第四啟動子可為CMV啟動子或SV40啟動子，抵抗抗生素基因可為抵抗吉歐黴素(Zeocin resistance,ZeoR)基因。
1.1. 建立CRISPRi表現載體以及綠螢光測試模型
目前在尚無文獻報導指出CRISPRi在CHO細胞內對DHFR的抑制效率。因此於本試驗例中先測試CRISPRi能否在CHO細胞內有效抑制DHFR基因的表現。為達此目標，本試驗例首先以綠螢光蛋白(egfp)基因作為報導基因，構築共同表現DHFR與綠螢光蛋白的pDHFR-2A-EGFP載體，並構築本發明之大量表現目標蛋白系統中的CRISPRi表現載體，以建立CRISPRi表現載體以及綠螢光測試模型。
請參照第1A圖，繪示pDHFR-2A-EGFP載體之構築示意圖，pDHFR-2A-EGFP載體中具有1個表現卡匣，其中包含CMV啟動子、DHFR基因和綠螢光蛋白基因， DHFR基因和綠螢光蛋白基因以P2A胜肽串接，在mRNA轉譯時核醣體會在DHFR蛋白與綠螢光蛋白中切斷，因此可利用綠螢光蛋白表現量判斷DHFR蛋白的表現量。CMV啟動子之序列如序列辨識編號1所示，DHFR基因之序列如序列辨識編號2所示，綠螢光蛋白基因之序列如序列辨識編號3所示，P2A胜肽之序列如序列辨識編號4所示。
請再參照第1B圖，繪示CRISPRi表現載體之構築示意圖。於本試驗例中所示之一實施例，CRISPRi表現載體係以pUseAmp(+)(由Merck Millipore購入)為骨架，插入gRNA卡匣和表現卡匣而得。gRNA卡匣包含U6啟動子、gRNA序列和終止子，gRNA卡匣由U6啟動子負責轉錄gRNA，而U6啟動子之序列如序列辨識編號5所示，終止子之序列如序列辨識編號6所示。dCas9表現卡匣包含CMV啟動子、dCas9-KRAB基因、抵抗吉歐黴素抗生素基因以及BGH多聚腺苷酸。dCas9表現卡匣由CMV啟動子轉錄dCas9-KRAB蛋白並以P2A胜肽串接吉歐黴素抗生素。其中KRAB(Krüppel associated box)能抑制基因轉錄，與dCas9串接能增加抑制效果。而CMV啟動子之序列如序列辨識編號1所示，dCas9-KRAB基因之序列如序列辨識編號7所示，其中dCas9-KRAB基因之序列依序包含dCas9基因序列、SV40核定位序列(負責將在細胞質表現的dCas9蛋白帶入細胞核內)、3倍HA flag序列(可用於後續測定的標籤)和KRAB基因。抵抗吉歐黴素抗生素基因之序列如序列辨識編號8所示，BGH多聚腺苷酸之序列如序列辨識編號9 所示。於本試驗例中同時構築3組CRISPRi表現載體-pCRISPRi-、pCRISPRi-T和pCRISPRi-NT，分別為空集合組()、模板股組(template strand,T)和非模板股組(non-template strand,NT)，3組CRISPRi表現載體之差異在於gRNA之序列不同，其餘部分相同。組的gRNA之序列如序列辨識編號10所示，T組的gRNA之序列如序列辨識編號11所示，NT組的gRNA之序列如序列辨識編號12所示，其中T組與NT組的標的位置(Target site)設計在DHFR的基因內。
試驗上將pDHFR-2A-eGFP載體與CRISPRi表現載體共轉染進入CHO DUXB11細胞株(購自食品工業發展研究所)內，在轉染後48小時後，分別以qRT-PCR分析細胞中DHFR mRNA表現量的改變程度，以及利用螢光顯微鏡和流式細胞儀分析綠螢光蛋白的表現量，進而推算CRSIPRi抑制DHFR蛋白的效率。qRT-PCR所使用之順向引子(Q mDHFR F)和反向引子(Q mDHFR R)之序列分別如序列辨識編號13和序列辨識編號14所示。
請參照第2圖至第3B圖，第2圖為CRISPRi表現載體以及綠螢光測試模型對CHO細胞之DHFR mRNA表現量影響之分析結果圖，其係以組的DHFR mRNA表現量為基準計算T組和NT組的DHFR mRNA表現量。第3A圖和第3B圖為CRISPRi表現載體以及綠螢光測試模型對CHO細胞之綠螢光表現之分析結果圖，其中第3A圖為螢光顯微鏡觀察之結果，第3B圖為流式細胞儀分析螢光強度之結 果，第3B圖的螢光強度係以組的螢光強度為基準計算T組和NT組的螢光強度。
第2圖的結果顯示，T組和NT組的DHFR mRNA表現量與組相較，分別為34.6±4.3%和15.2±0.4%，其DHFR抑制率分別是66±4.3%及85±0.4%，具有顯著差異(p<0.05)。第3A圖的結果顯示，T組和NT組的綠螢光蛋白表現量明顯地低於組，而由第3B圖的結果顯示，T組和NT組的綠螢光蛋白的螢光強度與組相較，分別為50.0±1.6%和21.6±2.8%，顯示其DHFR抑制率分別是50.0±1.6%及79±2.8%，並有顯著差異(p<0.05)。
由本試驗例證實本發明所建立的CRISPRi表現載體在CHO細胞能有效的抑制DHFR基因的表現，且基因轉錄抑制效率可達85±0.4%，蛋白表現抑制效率可達79%。傳統方式以RNAi抑制DHFR表現的效率約為72%，相較之下，本發明之CRISPRi系統的抑制效率較高。
1.2. 建立大量表現目標蛋白系統
由試驗例1.1確認了本發明之CIRSPRi表現載體在CHO細胞內能有效抑制DHFR基因表現，預期在CRISPRi抑制DHFR基因表現之下，可以進而增加基因擴增的幅度。於本試驗例中進一步構築本發明之目標蛋白表現載體，以建立能夠藉由基因擴增放大的大量表現目標蛋白系統。
請參照第4圖，繪示目標蛋白表現載體之構築示 意圖。於本試驗例中所示之一實施例，目標蛋白表現載體為pCMV-EGFP-SD載體，係利用綠螢光蛋白為目標蛋白來當作測試模型，然需說明的是，綠螢光蛋白僅為本發明之一實施例，目標蛋白之基因可依據所欲生產之目標蛋白而進行更改。pCMV-EGFP-SD載體係以pUseAmp(+)(由Merck Millipore購入)為骨架，並插入目標蛋白表現卡匣和DHFR表現卡匣。其中目標蛋白表現卡匣包含CMV啟動子、綠螢光蛋白之基因和BGH多聚腺苷酸，DHFR表現卡匣包含SV40啟動子、DHRF基因和BGH多聚腺苷酸。綠螢光蛋白之基因與DHFR基因分別由CMV啟動子與SV40啟動子進行轉錄，而CMV啟動子之序列如序列辨識編號1所示，綠螢光蛋白基因之序列如序列辨識編號3所示，BGH多聚腺苷酸之序列如序列辨識編號9所示，DHFR基因之序列如序列辨識編號2所示，SV40啟動子之序列如序列辨識編號15所示。
試驗上先將pCMV-eGFP-SD載體轉染進入CHO DUXB11細胞株後，利用缺乏核酸的α-MEM培養篩選出穩定表現的細胞群，並以螢光顯微鏡挑選出表現綠螢光的第一穩定表現細胞株，再轉染pCRSIRPi表現載體至第一穩定表現細胞株中，並且外加吉歐黴素(Zeocin)進行篩選，篩選出同時穩定表現兩種載體的第二穩定表現細胞株。試驗分成三組，第一組為無轉染CRISPRi表現載體的對照組，第二組為轉染pCRISPRi-的組，第三組為轉染pCRISPRi-NT的NT組。在此對照組代表傳統方法，組為比較額外表現dCas9蛋白及gRNA是否會影響標的目標蛋 白產量的組別，NT組則是測試CRISPRi專一抑制DHFR是否能增加目標蛋白產量的組別。篩選出對照組、組及NT組的第二穩定表現細胞株後，以qRT-PCR相對定量法分析細胞內是否表現dCas9，qRT-PCR所使用之順向引子(Q dCas9 F)和反向引子(Q dCas9 R)之序列分別如序列辨識編號16和序列辨識編號17所示。
請參照第5圖，為第二穩定表現細胞株之dCas9 mRNA表現量之分析結果圖，其中以第二穩定表現細胞株2-1的dCas9 mRNA表現量為基準值，來計算其他第二穩定表現細胞株的dCas9 mRNA表現量。結果顯示，有轉染CRISPRi表現載體組別(組及NT組)的單株細胞皆有穩定表現dCas9基因。
1.3 本發明之大量表現目標蛋白系統對細胞生長速度的影響
為驗證CRSIPRi是否會造成細胞生長速度的影響，本試驗進一步將試驗例1-2中的對照組、組及NT組分別以1x105的細胞密度接種於6孔盤，每隔一日計算貼附在表面的細胞數量，並取其對數生長期(48-120小時)之細胞密度，計算細胞的複製時間(Doubling time)。
請參照第6A圖和第6B圖，為第二穩定表現細胞株生長速度影響之分析結果圖，其中第6A圖為第二穩定表現細胞株之生長曲線圖，第6B圖為第二穩定表現細胞株之複製時間統計圖。第6A圖的結果顯示，三組第二穩定表現細胞株的生長速度並無顯著差異。此外第6B圖的結果顯 示，對照組的第二穩定表現細胞株平均分裂時間約22.5±0.8小時，組的第二穩定表現細胞株平均分裂時間約26.7±1.9小時，NT組的第二穩定表現細胞株平均分裂時間約23.8±0.6小時，雖NT組的第二穩定表現細胞株平均分裂時間較對照組較久，但無統計意義(p>0.05)。由本試驗例之結果顯示，本發明之大量表現目標蛋白系統不會影響CHO細胞的生長速度。
二、本發明之大量表現目標蛋白方法
請參照第7圖為本發明之大量表現目標蛋白方法100之步驟流程圖。第7圖中，大量表現目標蛋白方法100包含步驟110、步驟120、步驟130、步驟140和步驟150。
步驟110為構築目標蛋白表現載體，目標蛋白表現載體包含目標蛋白表現卡匣和DHFR表現卡匣，其中目標蛋白表現卡匣包含第一啟動子和目標蛋白之基因，DHFR表現卡匣包含第二啟動子和DHRF基因。其中第一啟動子可為CMV啟動子或SV40啟動子，第二啟動子可為CMV啟動子或SV40啟動子，但第一啟動子和第二啟動子不相同。
步驟120為構築CRISPRi表現載體，所述CRISPRi表現載體包含gRNA卡匣和dCas9表現卡匣，其中gRNA卡匣包含第三啟動子、gRNA序列和終止子，dCas9表現卡匣包含第四啟動子、dCas9-KRAB基因及抵抗抗生素基因。dCas9表現卡匣更可包含2A胜肽序列，所述2A胜肽序列串接dCas9-KRAB基因及抵抗抗生素基因。前述第三啟動子可為U6啟動子，第四啟動子可為CMV啟動子或 SV40啟動子，抵抗抗生素基因可為抵抗吉歐黴素(Zeocin resistance,ZeoR)基因。
步驟130為建立第一穩定表現細胞株，係將所述目標蛋白表現載體轉染至二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞中，並以篩選培養基進行篩選，以得到第一穩定表現細胞株。所述二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞可為CHO DUXB11細胞株或CHO DG44細胞株。而轉染的方式可利用磷酸鈣轉染法、電穿孔轉染法或脂質體轉染法。所述篩選培養基可為缺乏核酸之α-MEM。
步驟140為建立第二穩定表現細胞株，係將CRISPRi表現載體轉染至所述第一穩定表現細胞株中，並以抗生素進行篩選，以得到第二穩定表現細胞株。所述抗生素可為吉歐黴素。
步驟150為進行基因擴增，進行基因擴增時，係以含有葉酸拮抗劑之培養基培養所述第二穩定表現細胞株，以大量表現目標蛋白。所述葉酸拮抗劑可為甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺醯亞胺(Methionine sulfoximine,MSX)。
2.1. 本發明之大量表現目標蛋白方法能提高目標蛋白產量
為測試本發明之大量表現目標蛋白方法是否能提高目標蛋白產量，於本試驗例中先將pCMV-eGFP-SD載體轉染進入CHO DUXB11細胞株後，利用缺乏核酸的α-MEM培養篩選出穩定表現的第一穩定表現細胞株，再轉染pCRSIRPi表現載體至第一穩定表現細胞株中，並且外加 吉歐黴素篩選，篩選出同時穩定表現兩種載體的第二穩定表現細胞株。再利用添加MTX的培養基進行基因擴增。試驗分成三組，第一組為無轉染CRISPRi表現載體的對照組，第二組為轉染pCRISPRi-的組，第三組為轉染pCRISPRi-NT的NT組，每組各挑6個第二穩定表現細胞株進行基因擴增，利用逐步提升MTX藥劑濃度達到基因擴增的效果。先以濃度為50nM的MTX篩選四周後，再將MTX濃度提高到250nM持續篩選四周。
在完成基因擴增後，每組挑選出4株第二穩定表現細胞株，分別以螢光顯微鏡和流式細胞儀進行分析綠螢光蛋白是否成功擴增。其中對照組所挑選的第二穩定表現細胞株分別為1-1、1-2、1-4、1-5，組所挑選的第二穩定表現細胞株分別為2-1、2-2、2-4、2-5，NT組所挑選的第二穩定表現細胞株分別為3-1、3-3、3-4、3-6。
請參照第8A圖至第8D圖，為本發明之大量表現目標蛋白方法提高目標蛋白產量之分析結果圖，其中第8A圖為進行基因擴增前CHO細胞之綠螢光蛋白表現之顯微照片圖，第8B圖為進行基因擴增後CHO細胞之綠螢光蛋白表現之顯微照片圖，第8C圖為進行基因擴增前CHO細胞之綠螢光蛋白表現強度統計圖，第8D圖為進行基因擴增後CHO細胞之綠螢光蛋白表現強度統計圖。
第8A圖和第8B圖的結果顯示，在尚未進行基因擴增前(0nM MTX)，對照組、組及NT組的綠螢光蛋白表現量較低，在進行基因擴增後(250nM MTX)後，三 組的綠螢光蛋白表現量皆有上升。且與對照組及組相比，NT組的4個第二穩定表現細胞株的綠螢光蛋白表現量有明顯提高。
而第8C圖和第8D圖的結果顯示，在進行基因擴增前，對照組的螢光強度平均為85±9 a.u.，組平均螢光強度為121±14 a.u.，NT組平均螢光強度為161±23 a.u.，三組之間無統計差異(p>0.05)。在進行基因擴增後，對照組螢光強度平均為712±86 a.u.，組平均螢光強度為670±41 a.u.，NT組平均螢光強度為2722±632 a.u.，其中NT組螢光強度明顯上升且具有統計意義(p<0.05)，而組與對照組之間並無顯著差異(p>0.05)，代表額外表現dCas9蛋白及gRNA並不影響第二穩定表現細胞株對於目標蛋白的產量。
本試驗例的結果可知，利用本發明之大量表現目標蛋白方法抑制DHFR基因，能夠增加基因擴增後的目標蛋白產量，且與傳統方式相比能夠增加綠螢光蛋白3.8倍表現量。
2.2. 本發明之大量表現目標蛋白方法能提高目標蛋白基因表現量
為測試本發明之大量表現目標蛋白方法是否能提高目標蛋白基因表現量，於本試驗例中進一步利用qRT-PCR進行綠螢光蛋白基因和DHFR基因的相對定量，並以未進行基因放大的組2-1單株細胞作為基準值進行比較。其中qRT-PCR所使用之引子為Q EGFP F、Q EGFP R、 Q mDHFR F和Q mDHFR R，Q EGFP F之序列如序列辨識編號18所示，Q EGFP R之序列如序列辨識編號19所示，Q mDHFR F之序列分別如序列辨識編號13，Q mDHFR R之序列如序列辨識編號14所示。
請參照第9A圖至第9D圖，為本發明之大量表現目標蛋白方法提高目標蛋白基因表現量之分析結果圖，其中第9A圖為進行基因擴增前CHO細胞之綠螢光蛋白基因表現量之分析圖，第9B圖為進行基因擴增後CHO細胞之綠螢光蛋白基因表現量之分析圖，第9C圖為進行基因擴增前CHO細胞之DHFR基因表現量之分析圖，第9D圖為進行基因擴增後CHO細胞之DHFR基因表現量之分析圖。
第9A圖和第9B圖為綠螢光蛋白基因於基因擴增前後的改變程度，結果顯示，在進行基因擴增前，對照組平均綠螢光蛋白基因表現量為1.05±0.02倍，組平均綠螢光蛋白基因表現量為1.06±0.03倍，NT組平均綠螢光蛋白基因表現量為1.06±0.05倍，三組之間並無統計上的差異(p>0.05)。在進行基因擴增後，對照組平均綠螢光蛋白基因表現量為4.6±0.2倍，組平均綠螢光蛋白基因表現量為2.6±0.1倍，NT組平均綠螢光蛋白基因表現量為8.8±0.3倍，其中NT組比對照組高1.94倍，且具有統計意義(p<0.05)。
第9C圖和第9D圖為DHFR基因於基因擴增前後的改變程度，結果顯示，在進行基因擴增前，對照組平均DHFR基因表現量為4.07±1.3倍，組平均DHFR基因表現 量為3.73±1.0倍，NT組平均DHFR基因表現量為1.58±0.3倍，三組之間並無統計上的差異(p>0.05)。在進行基因擴增後，對照組平均DHFR基因表現量為39.02±1.4倍，組平均DHFR基因表現量為33.51±4.2倍，NT組平均DHFR基因表現量為67.1±10.6倍，其中NT組比對照組高1.7倍，且具有統計意義(p<0.05)。
由本試驗例的結果可知，利用本發明之大量表現目標蛋白方法抑制DHFR基因，能增加篩選壓力進而增加目標蛋白基因的表現量，且在有CRISPRi-NT的表現下，綠螢光蛋白基因表現量增加1.94倍，DHFR基因表現量增加1.7倍。
2.3. 本發明之大量表現目標蛋白方法能提高目標蛋白基因表現量
於前述試驗例證實本發明之大量表現目標蛋白方法能有效增加目標蛋白表現量以及目標蛋白的基因表現量，於本試驗例中進一步利用絕對定量的方式測定綠螢光蛋白基因套數以及DHFR基因套數的變化。
試驗上先使用Genomic DNA mini試劑盒(Geneaid)自第二穩定表現細胞株中抽取總基因組DNA。再取6ng總基因組DNA，使用對DHFR基因或綠螢光蛋白基因特異性的引子組(Q mDHFR F、Q mDHFR R、Q EGFP F和Q EGFP R)進行Q-PCR。為了定量絕對基因套數，序列稀釋p-CMV-EGFP-2A-DHFR載體(4、0.4、0.04、0.004和0.0004μg)，並利用Q-PCR定量以產生標準曲線。再假 設6ng總基因組DNA為1820個基因組DNA分子，對每個細胞的DHFR基因和綠螢光蛋白基因的基因套數進行絕對定量。
請參照第10A圖至第10D圖，為本發明之大量表現目標蛋白方法提高目標蛋白之基因套數之分析結果圖，其中第10A圖為進行基因擴增前CHO細胞之綠螢光蛋白基因套數之分析圖，第10B圖為進行基因擴增後CHO細胞之綠螢光蛋白基因套數之分析圖，第10C圖為進行基因擴增前CHO細胞之DHFR基因套數之分析圖，第10D圖為進行基因擴增後CHO細胞之DHFR基因套數之分析圖。
第10A圖和第10B圖為綠螢光蛋白基因套數在基因擴增前後之改變，結果顯示，在進行基因擴增前，對照組平均綠螢光蛋白基因套數為每個細胞0.73±0.04套，組平均綠螢光蛋白基因套數為每個細胞0.76±0.07套，NT組平均綠螢光蛋白基因套數為每個細胞0.46±0.05套，三組之間並無統計上的差異(p>0.05)。在進行基因擴增後，對照組平均綠螢光蛋白基因套數為每個細胞12.1±3.6套，組平均綠螢光蛋白基因套數為每個細胞8.9±1.07套，NT組平均綠螢光蛋白基因套數為每個細胞56.3±0.5套，NT組比對照組高3.5倍，且具有統計意義(p<0.05)。
第10C圖和第10D圖為DHFR基因套數在基因擴增前後之改變，結果顯示，在進行基因擴增前，對照組平均DHFR基因套數為每個細胞2.0±0.3套，組平均基因套數為每個細胞1.9±0.3套，NT組平均基因套數為每個細胞 1.6±0.2套，三組之間並無統計上的差異(p>0.05)。在進行基因擴增後，對照組平均基因套數為每個細胞21.3±3.0套，組平均基因套數為每個細胞11.3±1.5套，NT組平均基因套數為每個細胞65.2±10.2套，NT組比對照組高3倍，且具有統計意義(p<0.05)。
由本試驗例的結果可知，本發明之大量表現目標蛋白方法在基因擴增時，利用CRISPRi抑制DHFR基因能提高基因擴增的效率，且在有CRISPRi-NT的表現下，綠螢光蛋白基因擴增量為對照組的3.5倍，DHFR基因擴增量為對照組的3倍。
藉此，本發明之大量表現目標蛋白系統和大量表現目標蛋白方法，能有效地抑制CHO細胞的DHFR基因表現，其抑制效率達85±0.4%。而後續進行基因擴增時因可有效抑制DHFR基因表現，以增加基因擴增時的篩選壓力，進而大幅增加目標蛋白的產量。與傳統方法相比，本發明之大量表現目標蛋白系統和大量表現目標蛋白方法可增加綠螢光蛋白3.8倍表現量，而綠螢光蛋白的基因表現量亦提升3.5倍，且綠螢光蛋白的基因套數亦擴增3.5倍。此外，本發明之大量表現目標蛋白系統和大量表現目標蛋白方法不會影響CHO細胞的生長速度，且與傳統方法相比，在進行基因擴增時僅需以250nM的MTX處理，就能達到傳統方法利用1000nM的MTX處理下的基因擴增效果，大幅縮減進行基因擴增的時間，因此可以大量提高目標蛋白的產量，並縮短進行基因擴增的時間。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
<110> 國立清華大學
<120> 大量表現目標蛋白系統及其方法
<160> 19
<210> 1
<211> 584
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> CMV啟動子
<400> 1
<210> 2
<211> 561
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<223> DHFR基因
<400> 2
<210> 3
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> 綠螢光蛋白基因
<400> 3
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> P2A胜肽
<400> 4
<210> 5
<211> 233
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> U6啟動子
<400> 5
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> 終止子
<400> 6
<210> 7
<211> 4452
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> dCas9-KRAB基因
<400> 7
<210> 8
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> 抵抗吉歐黴素抗生素基因
<400> 8
<210> 9
<211> 225
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> BGH多聚腺苷酸
<400> 9
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> pCRISPRi-之gRNA
<400> 10
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> pCRISPRi-T之gRNA
<400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> pCRISPRi-NT之gRNA
<400> 12
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Q mDHFR F
<400> 13
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Q mDHFR R
<400> 14
<210> 15
<211> 358
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> SV40啟動子
<400> 15
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Q dCas9 F
<400> 16
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Q dCas9 R
<400> 17
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Q EGFP F
<400> 18
<210> 19
<211>
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Q EGFP R
<400> 19

Claims (14)

  1. 一種大量表現目標蛋白系統，包含：一二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)缺陷型CHO細胞；一葉酸拮抗劑；一目標蛋白表現載體，包含：一目標蛋白表現卡匣，其包含一第一啟動子和一目標蛋白之基因；及一DHFR表現卡匣，其包含一第二啟動子和一 DHRF基因；以及一CRISPRi表現載體，包含：一gRNA卡匣，其包含一第三啟動子、一gRNA序列和一終止子；及一dCas9表現卡匣，其包含一第四啟動子、一 dCas9-KRAB基因及一抵抗抗生素基因。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之大量表現目標蛋白系統，其中該二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞為DUXB11細胞株或DG44細胞株。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之大量表現目標蛋白系統，其中該葉酸拮抗劑為甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺醯亞胺(Methionine sulfoximine,MSX)。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之大量表現目標蛋白系統，其中該第一啟動子為CMV啟動子或SV40啟動子。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之大量表現目標蛋白系統，其中該第二啟動子為CMV啟動子或SV40啟動子，且該第二啟動子和該第一啟動子不相同。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之大量表現目標蛋白系統，其中該第三啟動子為U6啟動子。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之大量表現目標蛋白系統，其中該第四啟動子為CMV啟動子或SV40啟動子。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之大量表現目標蛋白系統，其中該dCas9表現卡匣更包含一2A胜肽序列，該2A胜肽序列串接該 dCas9-KRAB基因及該抵抗抗生素基因。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之大量表現目標蛋白系統，其中該抵抗抗生素基因為抵抗吉歐黴素(Zeocin resistance,Zeo R)基因。
  10. 一種大量表現目標蛋白方法，包含： 構築一目標蛋白表現載體，其包含：一目標蛋白表現卡匣，其包含一第一啟動子和一目標蛋白之基因；及一DHFR表現卡匣，其包含一第二啟動子和一 DHRF基因；構築一CRISPRi表現載體，其包含：一gRNA卡匣，其包含一第三啟動子、一gRNA序列和一終止子；及一dCas9表現卡匣，其包含一第四啟動子、一 dCas9-KRAB基因、及一抵抗抗生素基因；建立一第一穩定表現細胞株，係將該目標蛋白表現載體轉染至一二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)缺陷型CHO細胞中，並以一篩選培養基進行篩選，以得到該第一穩定表現細胞株；建立一第二穩定表現細胞株，係將該CRISPRi表現載體轉染至該第一穩定表現細胞株中，並以一抗生素進行篩選，以得到該第二穩定表現細胞株；以及進行一基因擴增，係以含有一葉酸拮抗劑之一培養基培養該第二穩定表現細胞株，以大量表現該目標蛋白。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之大量表現目標蛋白方法，其中該二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞為DUXB11細胞株或DG44細胞株。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之大量表現 目標蛋白方法，其中該篩選培養基為一缺乏核酸之α-MEM。
  13. 如申請專利範圍第10項所述之大量表現目標蛋白方法，其中該抗生素為吉歐黴素(Zeocin)。
  14. 如申請專利範圍第10項所述之大量表現目標蛋白方法，其中該葉酸拮抗劑為甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺醯亞胺(Methionine sulfoximine,MSX)。
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