CN108865968B - 一种调控外泌体释放的方法及其医药用途 - Google Patents

Abstract

提供一种调控外泌体释放的方法及其作为调控外泌体释放的医药用途，通过抑制雷帕霉素靶蛋白mTORC1活性促进外泌体的释放。通过雷帕霉素抑制mTORC1活化，增加外泌体的释放。通过剥夺营养素，生长因子和饮食限制抑制mTORC1的活性，促进外泌体的释放。mTORC1通过Rab27A依赖性机制调控外泌体的释放。mTOR与Rab27A有关，通过雷帕霉素处理增强Rab27A和mTOR之间相互作用。外泌体的释放，同时伴随自噬发生，受营养和生长因子条件变化的影响。外泌体的释放通过与质膜融合将细胞内容物释放到细胞外，导致细胞内容物的丢失。本发明能够调控外泌体的释放，为调控外泌体释放的医药用途提供了可行性方案。

Description

一种调控外泌体释放的方法及其医药用途

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种调控外泌体释放的方法及其作为调控外泌体释放的医药用途。

背景技术

外泌体是微小的膜结合囊泡(直径为40-200nm)，在生理和病理条件下，许多不同类型的细胞将其释放到细胞外。尽管外泌体最初被认为是细胞废物，但这些细胞外囊泡作为细胞间通讯的介质已经越来越受到重视。外泌体含有信号蛋白，miRNA，mRNA，DNA和脂质，在转运的时候能够调节受体细胞的各种生命活动。在许多类型的体液中都能发现外泌体，包括血浆和尿液。外泌体的分泌水平与许多生理和病理活动息息相关，常常指示健康，压力和疾病状况。最近，人们越来越有兴趣利用外泌体进行诊断和治疗。尽管如此，进行了多年的研究，我们对外泌体基本生物学的理解仍然有限。目前还不完全清楚调控外泌体形成和分泌的方法，限制了外泌体相关应用。

因此，针对现有技术不足，提供一种调控外泌体释放的方法甚为必要。

发明内容

本发明提供一种调控外泌体释放的方法及其医药用途。

本发明的上述目的通过如下技术手段实现：

提供一种调控外泌体释放的方法，通过抑制雷帕霉素靶蛋白mTORC1活性促进外泌体的释放。

具体的，通过雷帕霉素处理抑制mTORC1的活性，促进外泌体的释放。

优选的，通过剥夺营养素和生长因子抑制mTORC1的活性，促进外泌体的释放。

优选的，通过饮食限制抑制mTORC1的活性，促进外泌体的释放。

优选的，mTORC1通过Rab27A依赖性机制调控外泌体的释放。

进一步的，上述调控外泌体释放的方法，Rab27A与mTOR相关，通过雷帕霉素处理增强Rab27A和mTOR之间相互作用。

进一步的，上述调控外泌体释放的方法，外泌体的释放，同时伴随自噬发生。

进一步的，上述调控外泌体释放的方法，外泌体的释放，受营养和生长因子条件变化的影响。

进一步的，上述调控外泌体释放的方法，外泌体的释放通过与质膜融合将细胞内容物释放到细胞外，导致细胞内容物的丢失。

本发明同时提供通过抑制雷帕霉素靶蛋白mTORC1活性促进外泌体释放方法作为调控外泌体释放的医药用途。

本发明能够调控外泌体的释放，为调控外泌体释放的医药用途提供了可行性方案。

附图说明

结合附图对本发明进行说明，但附图中的内容不构成对本发明的限制。

图1是组成型活化mTORC1抑制细胞中的外泌体释放的结果图，其中(a，b)用抗CD63(红色)(a)或抗ALIX(红色)(b)和F-actin(绿色)染色的TSC2+/+和TSC2-/-MEF细胞的免疫荧光图像，DAPI核(蓝色)，比例尺，20微米。右图显示了TSC2+/+和TSC2-/-MEF细胞中CD63或ALIX阳性囊泡的定量分析。分析数据来自三次独立实验，总共60个随机选择的细胞。(c，d)通过NTA(c)和透射电子显微镜(d)检测来自TSC2+/+和TSC2-/-MEF细胞分离的外泌体。(e)通过Western印迹评估TSC2+/+和TSC2-/-MEF的细胞裂解物和在其培养基中分离的外泌体。**表示P<0.01。

图2是mTORC1的激活阻止HEK293和Hela细胞中的外泌体释放的结果图。其中，(a，b)将转染了TSC1特异性siRNA或无有效序列siRNA的HEK293(a)和Hela(b)细胞固定后，用抗CD63(红色)，F-actin(绿色)和DAPI(蓝色)染色，通过共聚焦显微镜成像。比例尺，20微米。定量TSC1敲低细胞和对照细胞中CD63阳性小泡数目，并表示为mean±s.d.(右图)。分析数据，来自三次独立实验的总共60个随机选择的细胞。**表示P<0.01。(c，d)Western免疫印迹分析，从TSC1敲低HEK293(c)，Hela(d)和它们各自对照细胞的细胞裂解液，以及培养基提取外泌体标志物蛋白的表达水平。

图3是抑制mTORC1促进外泌体释放的结果图，采用将TSC2+/+和TSC2-/-MEF细胞用100nM雷帕霉素或空白对照处理24小时。其中，(a)通过NTA评估在雷帕霉素处理结束时从培养基中分离的外泌体数量。(b)通过Western印迹检查细胞裂解物(细胞组)和分离的外泌体(外泌体组)中的外来体标志物蛋白的水平。基于P-S6的水平测定细胞提取物中的mTORC1活性。(c，d)将细胞固定后用抗CD63(红色)(c)或抗ALIX(红色)(d)，连同鬼笔环肽对F-actin(绿色)和DAPI对核(蓝色)进行染色。通过共焦显微镜观察染色的细胞。比例尺，20微米。右图是雷帕霉素处理组和空白对照组细胞中CD63或ALIX阳性囊泡数量的定量。分析数据来自三次独立实验，总共60个随机选择的细胞。(e)用100nM雷帕霉素处理或PBS处理24小时的Hela细胞，进行透射电子显微镜分析。红色箭头标记细胞外释放的外泌体。右图是细胞外外泌体数量的定量表分析。(f)NTA检测100nM雷帕霉素处理或PBS处理的Hela细胞培养基分离的外泌体在指定时间的数目。**表示P<0.01。

图4是雷帕霉素处理促进HEK293细胞外泌体释放的结果，用雷帕霉素处理或PBS处理HEK293细胞20小时。固定细胞后用抗CD63(红色)，鬼笔环肽(绿色)和DAPI(蓝色)染色，并通过共聚焦显微镜成像。比例尺，20微米。其中，(a)定量细胞中CD63阳性小泡的数量，并显示为mean±s.d.(右图)。分析数据来自三次独立实验的总共60个随机选择的细胞。(b)通过Western免疫印迹评估从细胞裂解物和培养基分离外泌体标志物蛋白水平。(c)通过NTA测定从培养基分离外泌体的量，并以mean±s.d表示。数据来自三个独立实验。**表示P<0.01。

图5是血清或氨基酸缺乏促进外泌体释放的结果，其中(a，b)将TSC2+/+MEF细胞在含血清培养基中培养16小时，然后转移至去除血清培养基。培养16小时后，将细胞再移回含血清的培养基培养16小时。通过NTA(a)测定每次转移前后从培养基中分离的外泌体的数量。通过Western印迹确定每次转移前后细胞提取物(细胞组)和培养基释放的外泌体(外泌体组)中的标记蛋白的水平。通过P-S6(b)的水平监测细胞中的mTORC1活性。(c，d)将TSC2+/+MEF细胞在含氨基酸的培养基中培养2小时，然后转移至无氨基酸培养基。培养2小时后，将细胞移回含氨基酸的培养基培养另外2小时。通过NTA(c)，蛋白质印迹(d)来测定细胞裂解物(细胞组)和释放的外泌体(外泌体组)中外泌体标记蛋白的水平，确定每次转移细胞之前后释放的外泌体的数量。(e，f)将每次转移前后的细胞固定并用抗-CD63(红色)，F-actin(绿色)，DAPI(蓝色)进行染色。比例尺，20微米。右图是细胞中CD63阳性囊泡数量的定量。对于每个转换点，分析数据来自三个独立实验的总共60个随机选择的细胞。(g，h)TSC2-/-MEFs，同前面实验描述一样，进行剥夺血清和回复血清培养。处理的细胞被固定后染色，比例尺，20微米。右图显示了细胞中CD63阳性囊泡数量的定量分析。对于每个转换点，分析数据来自三个独立实验的总共60个随机选择的细胞(g)。通过Western印迹(h)确定细胞裂解物中外泌体标志物蛋白和mTORC1活性的水平。**表示P<0.01。

图6是氨基酸或血清剥夺促进Hela细胞中的外泌体释放的结果。Hela细胞在无血清培养基中培养16小时，然后再转移到含血清培养基中16小时。转移前后收集细胞和培养基。其中，(a)通过NTA评估从培养基中分离的外泌体的数目。(b)通过Western印迹确定细胞裂解物中外泌体标志物蛋白的水平。(c)细胞用抗CD63(红色)，F-actin(绿色)和DAPI(蓝色)染色，通过共聚焦显微镜成像。比例尺，20微米。测定细胞中CD63阳性小泡的数目，表示为mean±s.d.分析数据，来自三次独立实验的总共60个随机选择的细胞。**表示P<0.01。

图7是mTORC1在体内调节外泌体释放的结果，其中(a，b)用2.5mg/kg/d雷帕霉素或PBS给3个月大的具有肝细胞特异性TSC1基因表达缺失(TSC1KO)的小鼠(n＝5)灌胃2个月。(a)收集肝脏组织并用抗CD63(红色)，ALIX(红色)或p-S6(S235/236)(绿色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺，20微米。(b)将肝组织裂解并通过p-S6水平确定mTORC1活性。(c，d)指定时间对C57BL/6小鼠用2.5mg/kg/d雷帕霉素或生理盐水灌胃。从处理的动物中分离血浆外泌体并进行NTA(c)或Western印迹(d)分析(d)。(e，f)C57BL/6小鼠饮食限制48小时，通过NTA(e)或Western印迹(f)分析从处理组和对照组动物分离的血浆外泌体。**表示P<0.01。

图8是mTORC1抑制小鼠肝脏中的外泌体释放的结果。用2.5mg/kg/d雷帕霉素或PBS给3个月具有肝细胞特异性TSC1基因表达缺失(TSC1KO)的小鼠(n＝5)灌胃2个月。处死动物并收集组织，固定后，用抗CD63或ALIX抗体染色，进行免疫组织化学分析。其中，图(a)肝脏，(b)肾脏，(c)脾脏。比例尺，20微米。

图9是抑制mTORC1诱导外泌体释放而不改变其内溶物的结果图，Hela细胞用100nM雷帕霉素或PBS处理24小时。对从培养基分离的外泌体进行MircoRNA序列分析。其中，(a)(左图)显示了雷帕霉素处理组(Rapa)或空白对照组(Ctrl)细胞之间MircoRNA表达的相关性。a(右图)MircoRNA表达的分布(Rapa vsCtrl)。(b)通过iTRAQ偶联的2-D LC-MS/MS分析分离的外泌体的蛋白质谱。扇形图(左图)显示，上调(>2倍)或下调(>2倍)蛋白质(Rapa Vs对照)的百分比。右图显示了基于ExoCarta的统计数据的前20个最常鉴定的外泌体蛋白(Rapa VS对照)的变化倍数。绿色代表，空白对照组；红色代表，雷帕霉素处理组。

图10.是mTORC1通过Rab27A依赖性机制调节外来体释放的结果，其中(a，b)Hela细胞转染Rab27B特异序列-siRNA后，用100nM雷帕霉素或空白对照处理24小时。通过NTA(a)测定在处理结束时，培养基中分离出外泌体的数量，并通过Western印迹(b)评估细胞裂解物中的外泌体标志物蛋白的水平。(c，d)Rab27A特异序列siRNA转染的Hela细胞用100nM雷帕霉素或空白对照处理24小时。通过NTA(c)测定从培养基中分离的外泌体的数目，并通过Western印迹(b)评估细胞裂解物中的外泌体标志物蛋白的水平。(e)Hela细胞用100nM雷帕霉素或空白处理24小时。处理细胞的细胞裂解物用抗mTOR抗体进行免疫共沉淀，并通过Western印迹确定mTOR与Rab27A之间的相互作用。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明作进一步说明，但实施例中的内容不构成对本发明的限制。

材料与方法

细胞培养。

在含有10％FBS(Gibco)的DMEM培养基(Corning)中培养TSC2+/+和TSC2-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，Hela和HEK293细胞。pCMV6-GFP-CD63购自Obio Technologies(上海)，感染Hela细胞至其稳定表达GFP-CD63。研究中使用的一抗是来自Abcam的抗CD63(#ab193349)，TSG101(#ab83)和ALIX(#ab117600)，抗P-S6(#4858)，来自Cell Signaling的LC3II(#3868)和mTOR(#2972)，来自Santa Cruz Biotech的抗S6(sc-74459)，来自ProteinTech的抗Rab27A(#17817-1-AP)和Rab27B(#13412-1-AP)。用于核染色的DAPI来自Fisher Scientific(#D1306)。

动物。

动物实验得到南方医科大学动物研究伦理委员会的批准，并按照中国科学技术部的国家指导原则进行。TSC1flox/flox(StockNo：005680)和Alb-Cre(StockNo：003574)小鼠品系购自Jackson Laboratory。为了产生肝特异性TSC1缺失小鼠，将TSC1flox/flox小鼠与Alb-cre小鼠杂交。C57BL/6小鼠(新生或4-5周龄)购自南方医科大学实验动物中心。雄性和雌性小鼠都被使用。在22±1℃的受控温度下，06:00至18:00点开灯，在12小时光照/12小时黑暗循环中将小鼠放置在塑料笼中养殖。整个研究期间充足供应标准啮齿动物食物和水。对于雷帕霉素处理实验，小鼠用雷帕霉素灌胃2.5mg/kg/天，6天。对于饮食限制性实验，小鼠禁食48小时，在此期间正常提供水。

外泌体分离。

细胞在含有10％FBS的无外泌体培养基中培养。无外泌体血清通过100,000g过夜离心来制备。细胞培养20小时或指定时间后收集培养基，在320g下离心10分钟，然后2,000g离心15分钟以除去碎片和死亡细胞，之后培养基在4℃，10000g下离心30分钟(离心机型号：Beckman Coulter Optima L-100XP，BeckmanCoulter)。之后继续收取上清，上清液在4℃，100,000g离心70分钟。所得沉淀用PBS洗涤一次，并再次离心，100,000g，70分钟后收集沉淀。

iTRAQ，2D LC-MS/MS和数据分析。

根据制造商的说明书(Applied Biosystems，Foster city，CA，USA)进行iTRAQ标记。简而言之，收集来自对照或雷帕霉素处理的Hela细胞的外泌体蛋白质，还原，烷基化并在37℃下用胰蛋白酶消化过夜，然后用iTRAQ标记。对照组用报告tag 116标记，雷帕霉素处理组用带有报道tag 118标记。将标记的肽汇集并用Sep-Pak Vac C18柱(Waters，Milford，MA，USA)脱盐，然后用纳米超高效液相色谱系统(100μm×100mm C18BEH柱)(Waters，Milford，MA)偶联Q-Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)进行分离和分析。使用Thermo Proteome Discoverer(1.3.0.339)软件分析所有原始文件。倍数变化阈值设定为2.0。使用P值(P>0.05)标准(在未处理/对照比率和样品/对照比率之间)来确定差异表达的蛋白质。

从动物血浆中分离外泌体。

从动物心脏取血并在室温下静置3小时，然后在4℃静置2小时。4℃，400g离心10分钟得到血浆。在4℃，3,000g离心15分钟从血浆中除去细胞碎片。之后血浆在4℃，100,000g离心70分钟。用PBS洗涤外泌体沉淀，并100,000g离心70分钟再次沉淀，然后重悬于RIPA缓冲液中。

纳米粒子追踪分析。

使用Nanosight N3000系统检查分离的外泌体的数量和粒径分布，并且通过NTA3.2Dev Build 3.2.16分析数据。

基因沉默。

使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将基因特异性siRNA和无有效序列对照siRNAs转染到HEK293和Hela细胞中。转染48小时后，将细胞转移至无外泌体血清培养基中，培养20小时，然后分析。使用的siRNA的序列是：TSC1,5-GCACUCUUUCAUCGCCUUUTT-3和5-CCAAAUCUCAGCCCGCUUUTT-3，RAB27A，5-CAAGAGAGGUUUCGUAGCUUGACAA-3和5-CCAACUACAAAUGCAUGCAUAUUGU-3，RAB27B，5-GGGACCAAAUGGAUCAUCAGGGAAA -3,5-GAGCCAACUGCAAGCAAACGCUUAU-3。

荧光显微镜。

用4％多聚甲醛固定细胞，并用前面所示的一抗进行染色，然后用荧光染料缀合的第二抗体(Molecular Probes)染色。使用共焦激光扫描显微镜(OlympusFV1200，日本东京)拍照。

Western印迹。

将细胞或外泌体在含有50mM Tris-HCl pH 8，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS和1x蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液中裂解。将裂解物在1×SDS样品缓冲液中煮沸。蛋白质在SDS PAGE上分离并转移到硝酸纤维素膜上，通过抗原抗体结合来进行印记。

电子显微镜。

将悬浮于PBS中的外体装载到辉光放电碳涂覆的铜网格上并用1％(w/v)乙酸铀酰染色1分钟。使用H-7600TEM(Hitachi，Japan)在80kV的加速电压下检查染色的外泌体样品。将细胞样品沉淀并在室温下在0.1M磷酸盐缓冲液中的2.5％戊二醛中固定1小时。将固定样品包埋在树脂中，薄切片并用乙酸铀酰染色。

免疫共沉淀。

细胞用含有20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.5％Nonidet P-40,2mM EDTA，0.5mMDTT，1mM NaF，1mM PMSF和1x蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液裂解。通过在4℃以10,000g离心10分钟使裂解物澄清。然后将上清液与抗mTOR抗体或对照IgG温育，随后用蛋白G偶联的琼脂糖珠沉淀。用裂解缓冲液将珠子洗涤4次，并用1×SDS样品煮沸5分钟。通过Western印迹分析沉淀的蛋白质。

统计分析。

使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。P值由学生t检验，单向ANOVA检验确定。P值<0.05被认为是显著的。所有实验重复至少三次。定量数据表示为mean±sd。

实验结果。

激活mTORC1抑制外泌体的分泌

实验在研究老年小鼠中外泌体分泌水平时，偶然发现来自TSC2敲除小鼠的胚胎成纤维细胞与其同源野生型对照相比，具有CD63的囊泡结构的强染色。由于CD63通常集中在内体上，这一观察结果表明TSC2敲除细胞中有腔内囊泡的异常聚集，如图1a所示。为了证实CD63阳性泡状结构是ILV，采用另一种ILV标记ALIX染色了TSC2-/-MEFs及其野生型对照。发现TSC2缺陷型MEFs含有比对照组多得多的ALIX阳性囊泡结构，如图1b所示。

ILV在TSC2缺陷细胞中的异常积累可能是由于ILV过量产生或其释放在细胞内阻塞所致。为了区分这两种可能性，实验比较了总的细胞裂解液和从TSC2-/-和TSC2+/+MEFs释放到培养基中的外泌体的几种常用的ILV/外泌体标志物含量。如前所述，通过差速离心分离一定时间后培养基中释放的外泌体。使用纳米颗粒追踪分析仪(NTA)检查分离的外泌体，来自TSC2-/-和野生型MEFs的外泌体具有相似的大小分布，如图1c所示。电镜观察，它们也具有相似的形态和大小，如图1d所示。然而，从TSC2-/-MEFs培养基中得到的外泌体数量明显少于野生型MEFs，如图1c所示。蛋白质印迹分析显示，从TSC2-/-MEFs培养基中分离的外来体中外泌体标记蛋白(包括CD63，ALIX和TSG101)的数量显著降低，而在总细胞提取物中的数量远高于其野生型对照组，如图1e所示。这些发现表明，TSC2-/-MEFs中ILV的细胞内积累是由其释放中的阻塞引起的。

TSC2通常与TSC1一起负向调控mTORC1。为了确定TSC1是否也参与外泌体释放，我们调查了TSC1下调对该过程的影响。发现在HEK293和Hela细胞中用siRNA敲低TSC1，导致细胞内CD63阳性囊泡结构的积累增加，如图2a，b所示。当TSC1基因的表达被siRNA下调时，外泌体标志物蛋白CD63，ALIX和TSG101的量在细胞裂解物中显著增加，但从培养基中分离的总的外泌体的量减少，如图2c，d所示。这些发现表明TSC1同TSC2一样是外泌体释放所必需的调控因子。

雷帕霉素抑制mTOC1活性促进外泌体的释放

TSC1和TSC2是mTORC1的负向调控因子，其下调导致mTORC1激活。为了确定TSC2-/-MEFs中过度活跃的mTORC1是否是阻断外泌体释放的原因，实验调查了雷帕霉素对外泌体释放的影响。用雷帕霉素或PBS对照处理TSC2-/-和TSC2+/+MEF，收集处理结束时释放到培养基中的外泌体。与PBS处理的细胞相比，NTA显示来自雷帕霉素处理细胞的培养基的外泌体量的大量增加，如图3a所示。CD63，ALIX和TSG101含量在细胞培养基分离的总外泌体中增加，同时在细胞提取物中的表达量降低，可证实雷帕霉素促进外泌体释放，如图3b所示。自噬标记物LC3II增加表明药物诱导的外泌体释放伴随着自噬的激活，如图3b所示。雷帕霉素还导致细胞内CD63和ALIX阳性小泡结构的量急剧减少，如图3c，d所示。电子显微镜显示用雷帕霉素处理的细胞的胞外空间中，外泌体积聚显著增加，如图3e所示。如图4a-c所示，在HEK293和Hela细胞中也观察到雷帕霉素促进外泌体释放。如图3f所示，活细胞成像和NTA检测显示了雷帕霉素诱导表达GFP-CD63的Hela细胞外泌体时间依赖性释放。总之，这些研究结果表明持续激活mTORC1抑制外泌体释放，抑制mTORC1促进外泌体的释放，揭示了mTORC1在该过程中的负向调控作用。

氨基酸或血清饥饿促进培养细胞中的外泌体释放

外泌体的释放受mTORC1调控，这一发现，暗示外泌体释放过程可能对营养和生长因子条件的变化有感应。为了证实这个想法，我们将TSC2+/+MEFs剥夺血清培养16小时或氨基酸限制培养2小时。如图5a所示，NTA分析显示血清饥饿降低了mTORC1的活性，极大地促进了细胞外泌体的释放。如图5b所示，Western表明从培养基中分离的外泌体，CD63，ALIX和TSG101含量增加，而细胞内裂解物中的CD63，ALIX和TSG101含量减少。如图5c，d所示，在发生氨基酸限制培养的细胞中发现了类似的结果。血清剥夺或氨基酸限制培养的胞内CD63和ALIX阳性小泡结构也相应减少，与外泌体标志物蛋白胞内含量降低一致，如图5e，f所示。当应激细胞移回正常培养基时，由血清剥夺或氨基酸限制性诱导的外泌体释放增加被逆转。相反，血清剥夺未能在TSC2-/-MEFs中诱导外泌体释放，mTORC1活性对血清剥夺基本不敏感，如图5g，h所示。在Hela细胞中营养素和生长因子敏感性调节外泌体的释放进一步得到证实，如图6a-c所示。这些发现表明，外泌体释放，如自噬一样，对营养和生长因子条件的变化有感应。

mTORC1在体内控制外泌体释放。

实验接下来评估了mTORC1是否在体内调节外泌体释放。已经有研究表明，肝细胞释放大量的外泌体到细胞外和血液循环。外泌体的释放受疾病状况影响，包括酒精性肝病，病毒性肝炎和肝细胞癌。为了确定mTORC1活性是否调节肝外泌体释放，将TSC1flox/flox与在白蛋白启动子(ALB-CRE)表达CRE的转基因系杂交产生具有肝细胞特异性mTORC1活化的小鼠。发现TSC1在肝脏特异性缺失导致肝细胞中mTORC1特异性激活，并且在肝脏组织的细胞外间隙中发现CD63和ALIX阳性染色囊泡大量减少，如图7a，b所示。这种表型是肝脏特异的，其他器官如肾和心脏不受影响，如图8a-c所示。用雷帕霉素处理敲除动物可降低mTORC1活性，并增加肝组织细胞外间隙中的CD63和ALIX阳性染色囊泡，如图7a所示。通过分析从雷帕霉素处理过的动物的血浆中分离出的外泌体的数量和蛋白质水平可以确定，雷帕霉素在野生型C57BL/6小鼠中引起血浆外泌体含量的显著和时间依赖性分泌增加，如图7c，d所示。由于细胞mTORC1活性受到动物营养摄入的调控，接下来检查了饮食限制对野生型C57BL/6小鼠血浆外泌体水平的影响。在禁食小鼠48小时后，从处理组和对照组动物收集血浆并分离外泌体。NTA分析显示饮食限制引起血浆外泌体含量的剧烈增加，如图7e所示。蛋白质印迹分析还表明与未处理的动物相比，从饮食限制小鼠的血浆分离的外泌体中外泌体标记蛋白的含量增加，如图7f所示。这些观察结果表明，体内外泌体的释放受mTORC1和食物摄取的调节。

抑制mTORC1诱导外泌体释放而不改变其内溶物含量。

外泌体含有细胞特异性蛋白质，mRNA和miRNA，它们可以作为细胞间通讯的信号分子。为了确定mTORC1是否调节外泌体内溶物，对从用雷帕霉素处理或载体对照处理的Hela细胞释放的外泌体进行了miRNA测序和蛋白质组学分析。发现尽管雷帕霉素处理明显增加了外泌体释放，但经过雷帕霉素处理过的实验组的和模拟处理的对照组细胞的miRNA和蛋白质含量在很大程度上是难以区分的。仅确认了配对样品之间有差异表达的少数miRNA和蛋白质，如图9a，b所示。这一发现表明mTORC1控制外泌体释放而非内容物装载。

mTORC1通过Rab27A依赖性机制调节外泌体释放。

Rab27A和Rab27B是两种密切相关的Rab小GTP酶，已被证明在多种类型的细胞外泌体分泌中起关键作用。为了确定mTORC1如何控制外泌体释放，调查了两种Rab蛋白在该过程中的作用。发现通过siRNA敲低Hela细胞中的Rab27B，培养基中的外泌体含量降低，增加了细胞内外泌体标记物CD63，ALIX和TSG101的水平，如图10a，b所示。这一观察结果与小GTP酶在外泌体释放中的促进作用是一致的。然而，siRNA介导的Rab27B下调未能阻断雷帕霉素促进的外泌体释放，如图10a，b所示，表明Rab27B不是mTORC1控制外泌体释放的效应因子。通过siRNA敲低Rab27A也能减少了外泌体释放，Hela细胞培养基中外泌体水平减少和细胞提取物中外泌体标志蛋白增多，如图10c，d所示，证实了小GTP酶在该过程中的正向调控作用。然而，与Rab27B下调不同，敲低Rab27A可抑制雷帕霉素诱导的外泌体释放并增加外泌体标记蛋白的细胞内积累，如图10c，d所示。这些发现表明mTORC1通过Rab27A依赖性机制调控外泌体的释放。为了支持这一观点，发现Rab27A与mTOR有关，并且通过雷帕霉素处理促进Rab27A和mTOR之间相互作用，如图10e所示。

医药用途

基于以上抑制雷帕霉素靶蛋白mTORC1活性，促进外泌体释放方法的原理，可依此作为调控外泌体释放的医药用途。本发明能够调控外泌体的释放，为调控外泌体释放的医药用途提供了可行性方案。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种体外调控外泌体释放的方法，其特征在于：

通过抑制雷帕霉素靶蛋白mTORC1活性促进外泌体的释放，且外泌体的释放，同时伴随自噬发生；

mTORC1通过Rab27A依赖性机制调控外泌体的释放，通过雷帕霉素处理增强Rab27A和mTOR之间相互作用。

2.根据权利要求1所述的体外调控外泌体释放的方法，其特征在于：通过雷帕霉素抑制mTORC1活化，增加外泌体的释放。

3.根据权利要求1所述的体外调控外泌体释放的方法，其特征在于：通过剥夺营养素和生长因子抑制mTORC1的活性，促进外泌体的释放。

4.根据权利要求3所述的体外调控外泌体释放的方法，其特征在于：外泌体的释放通过与质膜融合将细胞内容物释放到细胞外，导致细胞内容物的丢失。

5.如权利要求1至4任意一项所述的体外调控外泌体释放的方法在制备体外调控外泌体释放的药物中的用途。

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