CN102947444A - 用于治疗心血管疾病的非遗传修饰性重编程细胞的组合物和方法 - Google Patents
用于治疗心血管疾病的非遗传修饰性重编程细胞的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及重编程其他细胞（比如成纤维细胞）成为心肌细胞的组合物和方法，所述重编程不引入外源基因。本发明尤其涉及能够转导进入生物样品的转导物质，所述转导物质不是基因、也不会导致遗传修饰。本发明还涉及用本发明的转导组合物重编程生物样品的通路或治疗疾病的方法。
Description
优先权声明
本申请要求对以下美国临时专利申请的优先权：2010年6月23日提交的美国临时专利申请61/398,279、2010年7月1日提交的美国临时专利申请61/360,852，上述申请参考整体并入本文。
发明背景
胚胎干细胞能够分化为多种类型的人体细胞。大部分体细胞是终末分化细胞，并被认为缺乏转变成其它类型体细胞的能力。诱导型多能干细胞（iPSC）和转分化领域近来的进展已经改变了这一范式。体细胞可以被重编程为诱导型多能干细胞（iPSC），即，通过病毒转导使四种转录因子异位表达，即Oct4（例如SEQ ID NO:1）、Sox2（例如SEQ IDNO:2）、K1f4（SEQ ID NO:3）以及cMyc（例如SEQ ID NO:4）（Okita等，Nature 448,313-317(2007);Takahashi和Yamanaka，Cell 126,663-676(2006)）。进一步发展了一些改良的遗传方法来产生潜在风险更低的iPSC，包括采用非整合型腺病毒来传递重编程基因（Stadtfeld等，Science 322,945-949(2008)），瞬时转染重编程质粒（Okita等，Science 322、949-953(2008)），使用piggyBac转座子系统以及使用Cre-可切除的病毒等（Soldner等，Cell 136,964-977(2009)；Woltjen等，Nature 458,766-770(2009)）。此外，在某些细胞类型中利用内源性基因表达的策略也使得重编程更容易和/或需要的外源基因更少（Aasen等，Nat Biotechnol 26,1276-1284(2008)；Kim等，Nature 454,646-650(2008)；Shi等，Cell StemCell 2,525-528(2008b)）。而且，还发现了能够增强重编程效率和替代某些重编程因子的小分子（Huangfu等，Nat Biotechnol 26,795-797(2008a)；Huangfu等，Nat Biotechnol 26,1269-1275(2008b)；Li等，Cell Stem Cell 4,16-19(2009)；Shi等，Cell Stem Cell 3,568-574(2008a)；Shi等，Cell Stem Cell 2,525-528(2008b)）。然而，现有的所有这些方法仍然涉及使用遗传物质，其缺陷在于需要向目标细胞中通过外源序列引入未知的、不需要的，或者甚至有害的基因组修饰，而且对转基因的表达水平也没有足够的控制。为了解决这些缺点，本领域要重编程细胞的方法，其不依赖于或不引入外源遗传物质，如外源基因或DNA片段或包含外源DNA或基因的载体等。
尽管已开发了许多种治疗方法，但是心血管疾病，尤其是缺血性疾病仍然是全球发病率和死亡率的主要原因之一。这一问题由人类老龄化以及工业化引起。缺血性心肌缺血通常导致的一个主要形式为梗塞后心力衰竭，尤其是那些具有大量心肌梗塞的患者，而且这与高死亡率相关。
心肌梗死的开始通常会有一系列事件，这包括心肌细胞死亡、疤痕组织形成、动脉瘤变薄和左心室重构，从而降低了泵送能力、心脏功能障碍，甚至导致死亡。因此，急需非遗传修饰性重编程细胞，以为心血管疾病提供有效的治疗。
发明概述
本披露的一方面涉及包含效应结构域的转导物质。效应结构域一旦转导进入生物样品就能够使生物样品发生重编程改变。在某些实施方式中，效应结构域天然地能够转导进入生物样品中。
在某些实施方式中，转导物质还包含共价或非共价结合或连接于效应结构域的转导结构域。在某些实施方式中，转导结构域通过接头共价连接于效应结构域。
在某些实施方式中，转导物质能够选择性转导进入一种或多种特定生物样品中，或者在生物样品周围特定环境中变得可转导。
本披露的另一方面涉及包含生物样品和转导物质的组合物，其中转导物质已经转导进入生物材料。
本披露的另一方面涉及通过将生物样品暴露于包含转导物质的组合物中而重编程生物样品的方法。
本披露的另一方面涉及治疗生物体中疾病或状态的方法，包括将包含转导物质的药物组合物向生物体给药。
本披露的另一方面涉及开发基于细胞的疗法的方法，所述疗法针对各种疾病或状态，所述方法包括用转导物质将iPSC、胚胎干细胞或祖细胞重编程为可移植体细胞或可移植祖细胞的步骤。
本披露的另一方面涉及开发疾病模型的方法，包括用转导物质将iPSC、胚胎干细胞或祖细胞重编程为可移植体细胞或可移植祖细胞的步骤。
本披露的另一方面涉及识别效应结构域的方法，包括将测试效应结构域共价或非共价结合于转导结构域以形成测试转导分子，将测试分子暴露于生物样品以及测定生物样品的重编程水平。
附图简要说明
图1：转导物质的鉴定（I）。（A）转导物质Oct4-11R（SEQ ID NO:12）、Sox2-11R（SEQ ID NO:13）、K1f4-11R（SEQ ID NO:14）以及cMyc-11R（SEQ ID NO:15）、接头：SEQ ID NO:55；效应结构域：Oct4（SEQ ID NO:1）、Sox2（SEQ ID NO:2）、K1f4（SEQID NO:3）或cMyc（SEQ ID NO:4）的蛋白表达载体的示意图。（B）Western印迹分析测定的四种转导物质（Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R和cMyc-11R）在细胞培养条件下的稳定性。
图2：转导物质的鉴定（II）。通过免疫细胞化学检测11R标记的转导物质进入OG2-MEF细胞的蛋白转导。Oct4：Oct4-11R转导的MEF细胞（绿色），Sox2：Sox2-11R转导的MEF细胞（红色），K1f4：K1f4-11R转导的MEF细胞（红色）以及cMyc：cMyc-11R转导的MEF细胞（绿色）。DAPI：用DAPI对细胞染色以显示细胞核（蓝色），再将图像合并。
图3：转导物质的鉴定（III）。蛋白诱导的多能干细胞（piPS）在化学确定的培养基和无滋养条件下克隆增殖和自我更新。
图4：通过转导物质Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R和cMyc-11R产生piPS细胞。（A）piPS细胞产生的时间线。（B）第30-35天左右初始观察的Oct4-GFP+piPS细胞集落。相：代表性的相差图；GFP：荧光图。（C）Oct4-GFP+piPS细胞在常规mESC生长条件下维持长期自我更新。（D）长期扩增的piPS细胞以紧密且凸起的集落生长，强烈表达典型的多能标记ALP。（E）免疫荧光检测到piPS细胞表达其它典型的多能标记：SEA-1（红色）、Sox2（红色）、Oct4（红色）以及Nanog（红色）。DAPI：DAPI染色以显示细胞核（蓝色），将图合并。（F）RT-PCR分析piPS细胞中内源性多能基因表达。（G）用亚硫酸氢盐基因组测序法分析Oct4启动子的甲基化。空心圆和实心圆分别表示未甲基化和甲基化的CpG。
图5：piPS细胞在体外和体内的多能性（I）。piPS细胞在体外有效地分化为三胚层的细胞：Tuj1：特征性的TUJ1+神经元细胞-外胚层（红色）；Bryt：Brachyury+中胚层细胞（红色）；以及Sox17：Sox17+确定的内胚层细胞。将图与DAPI（蓝色）染色图合并。
图6：piPS细胞在体外和体内的多能性（II）。（A）RT-PCR分析piPS细胞的体外分化。（B）将piPS细胞聚集的胚胎转移至假孕小鼠（上图）后获得嵌合胚胎（13.5dpc，7只中有2只，左图）。在嵌合胚胎中分离的生殖嵴组织中，这种piPS细胞形成了生殖细胞（Oct4-GFP阳性）（下图）。
图7：转导物质的蛋白表达载体的示意图。His6：SEQ IDNO:59；效应结构域：Ngn3（SEQ ID NO:8）、PDX1（SEQ ID NO:9）；MafA（SEQ ID NO:10）或Foxp3（SEQ ID NO:11）；接头：SEQ ID NO:55。
图8：在小鼠中通过转导物质His6-Ngn3-11R（SEQ IDNO:30）、His6-PDX1-11R（SEQID NO:31）和His6-MafA-11R（SEQ ID NO:32）将肝脏和胰腺外分泌细胞重编程为产生胰岛素的β细胞（I）。小鼠-1、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白（BSA）处理（对照组）。小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6用His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R处理（处理组）。A）小鼠-1肝脏的免疫荧光分析（IFA）；B）小鼠-2肝脏的IFA分析；以及C）小鼠-3肝脏的IFA分析。
图9：在小鼠中通过转导物质His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R将肝脏和胰腺外分泌细胞重编程为产生胰岛素的β细胞（II）。小鼠-1、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白（BSA）处理（对照组）。小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6用His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R处理（处理组）。A）小鼠-4肝脏的IFA分析（1）；B）小鼠-4肝脏的IFA分析（2）；C）小鼠-5肝脏的IFA分析（1）；D）小鼠-5肝脏的IFA分析（2）；E）小鼠-6肝脏的IFA分析（1）；F）小鼠-6肝脏的IFA分析（2）。
图10：在小鼠中通过转导物质His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R将肝脏和胰腺外分泌细胞重编程为产生胰岛素的β细胞（III）。小鼠-1、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白（BSA）处理（对照组）。小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6用His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R处理（处理组）。A）小鼠-1胰腺的IFA分析；B）小鼠-2胰腺的IFA分析（1）；C）小鼠-2胰腺的IFA分析（2）；以及D）小鼠-3胰腺的IFA分析。
图11：在小鼠中通过转导物质His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R将肝脏和胰腺外分泌细胞重编程为产生胰岛素的β细胞（IV）。小鼠-1、小鼠-2和小鼠-3用牛血清白蛋白（BSA）处理（对照组）。小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6用His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R处理（处理组）。A）小鼠-4胰腺的IFA分析（1）；B）小鼠-4胰腺的IFA分析（2）；C）小鼠-5胰腺的IFA分析（1）；D）小鼠-5胰腺的IFA分析（2）；以及E）小鼠-6胰腺的IFA分析。
图12：通过转导物质His6-Foxp3-11R（SEQ IDNO:33）将T细胞重编程为Treg细胞（IA）。缺少CD14单核细胞的PBMC中CD4和CD25蛋白表达的流式细胞计数分析：同型对照、PBS对照、样品缓冲液对照以及蛋白（BSA100μg/ml）对照。
图13：通过转导物质His6-Foxp3-11R将T细胞重编程为Treg细胞（IB）。缺少CD14单核细胞的PBMC中CD4和CD25蛋白表达的流式细胞计数分析，所述PBMC用10μg/ml、20μg/ml或50μg/ml His16-Foxp3-11R处理。
图14：通过转导物质His6-Foxp3-11R将T细胞重编程为Treg细胞（IIA）。PBMC中CD4和CD25蛋白表达的流式细胞计数分析：同型对照和PBS对照。
图15：通过转导物质His6-Foxp3-11R将T细胞重编程为Treg细胞（IIB）。PBMC中CD4和CD25蛋白表达的流式细胞计数分析：样品缓冲液对照以及蛋白（BSA 100μg/ml）对照。
图16：通过转导物质His6-Foxp3-11R将T细胞重编程为Treg细胞（IIC）。PBMC中CD4和CD25蛋白表达的流式细胞计数分析，所述PBMC用10μg/ml或50μg/ml His16-Foxp3-11R处理。
图17：通过转导物质His6-Foxp3-11R将T细胞重编程为Treg细胞（IID）。以100μg/mlHis16-Foxp3-11R处理的PBMC中CD4和CD25蛋白表达的流式细胞计数分析，所述PBMC用100μg/ml His16-Foxp3-11R处理。
图18：通过转导物质将心肌成纤维细胞重编程为成熟的心肌细胞，所述转导物质为His6-Gata4-11R、His6-Mef2c-11R和His6-Tbx 5-11R(GMT)(b)、GMT和戊丙酸(c)、GMT和异羟肟酸(d)，以及作为对照的缓冲液(a)。荧光显微镜图片显示在启动子αMHC的控制下的GFP的表达。αMHC仅在成熟的心肌细胞中表达。
图19：通过转导物质将尾尖成纤维细胞重编程为成熟的心肌细胞，所述转导物质为His6-Gata4-11R、His6-Mef2c-11R和His6-Tbx 5-11R(GMT)(b)、GMT和戊丙酸(c)、GMT和异羟肟酸(d)，以及作为对照的缓冲液(a)。荧光显微镜图片显示在启动子αMHC的控制下的GFP的表达。αMHC仅在成熟的心肌细胞中表达。
图20：示例性效应结构域的序列。
图21：示例性转导物质：效应结构域-11R的序列。
图22：示例性转导物质：His6-效应结构域-11R的序列。
发明详述
本披露的一方面涉及包含效应结构域的转导物质。
在某些实施方式中，本披露所用的转导物质是指非DNA或非来源于DNA的物质或分子，其能够穿过或转导或被穿过生物样品的膜（例如，细胞膜），以至于转导物质可以从生物样品的外部进入或被带入生物样品的内部，并发挥重编程功能。例如，转导物质可以与细胞表面受体相互作用，通过受体介导的内吞作用促进物质进入细胞。
在某些实施方式中，转导物质是选择性转导物质，相比于其它生物样品，其更容易转导进入特定类型的生物样品（例如，癌或肿瘤细胞）或在生物样品中或周围的特定微环境（例如，癌或肿瘤周围的微环境）中变得可转导。例如，选择性转导物质包含将选择性转导物质优先递送进入特定类型生物样品的转导结构域，或在生物样品周围微环境中变得可转导的转导结构域（例如，细胞靶向性肽或激活的细胞穿膜肽）。
不限定于任何理论，预期转导物质可以穿过细胞膜，进入细胞质对诸如翻译、翻译后修饰、信号通路、凋亡通路等细胞质中的活动进行重编程。进一步预期，转导物质可以穿过核膜，对DNA或染色体复制、基因转录以及RNA剪接进行重编程或调节。
效应结构域是一旦在生物样品内部就能够使生物样品发生重编程改变的基序或分子。效应结构域可以与生物样品中（如在细胞质中或细胞核中）的分子（例如，蛋白、DNA、RNA、糖以及脂质）相互作用，导致如增殖、分化、去分化、转分化、反分化、转决定、凋亡以及形态发生等改变。效应结构域可以是：1）多肽，或其片段或模拟物；2）多核苷酸，它不是一旦转导或包含进生物样品的基因组就进行表达的基因，也不会导致遗传修饰，但是却能够与生物样品中的分子相互作用（例如，核酶、反义分子、siRNA或miRNA、寡核苷酸等等及诸如此类）；以及3）小分子或其它化学化合物（例如，化学治疗药物）。
在某些实施方式中，效应结构域是天然可转导的，例如PDX1（例如SEQ ID NO:9）以
及NeuroD（例如SEQ ID NO:7）。
效应结构域的一个例子是多肽，如转录因子、染色体重塑蛋白、抗体、或其片段或模拟物。效应结构域的另一个例子是小分子，它不是聚合物，且能够与如蛋白、核酸或多糖等生物聚合物结合，并且改变生物聚合物的活性或功能。小分子的例子包括，但不限于，乙酰化抑制剂、转录活化剂、信号通路活化剂、信号通路抑制剂以及甲基化抑制剂。
在另一个实施方式中，效应结构域可以是至少一种多肽，其将体细胞重编程为干细胞或将细胞状态由一种变为另一种。例如，效应结构域可以是：1）选自下组的多肽：K1f4（例如SEQ ID NO:3）、Sox2（例如SEQ ID NO:2）、Lin28（例如SEQ ID NO:5）、Oct4（例如SEQ ID NO:1）、cMyc（例如SEQ ID NO:4）、Nanog（例如SEQ ID NO:6）以及其任意组合；2）选自下组的多肽：K1f4、Sox2、Oct4、cMyc及其任意组合；3）选自下组的多肽：Sox2、Oct4、Lin28、Nanog及其任意组合；4）选自下组的多肽：Ngn3（例如SEQ IDNO:8）、PDX1（例如SEQ ID NO:9）、MafA（例如SEQ ID NO:10）、NeuroD（例如SEQID NO:7）及其任意组合；5）包含Foxp3（例如SEQ ID NO:11）的多肽；6）选自下组的多肽：Oct4、Sox2、K1f4、Lin28、Nanog、cMyc、Ngn3、PDX1、MafA、NeuroD、Foxp3及其任意组合；7）多肽Oct4、Sox2、K1f4以及cMyc的组合；8）多肽Ngn3、PDX1以及MafA的组合；9）选自下组的多肽：Nkx2.5、GATA4(例如SEQ ID NO:68)、Mef-2C(例如SEQID NO:69)、ISL1、Wt1、Tbx18、Tbx5(例如SEQ ID NO:70)、Ref-1、Baf60c、STAT3、STAT3-C（其为STAT3的突变版本），及其任意组合（示例性的序列如表1所示）；10）多肽Gata4、Mef2c和Tbx5的组合；以及11）选自下组的多肽：Oct4、Sox2、K1f4、Lin28、Nanog、cMyc、Ngn3、PDX1、MafA、NeuroD、Foxp3、Gata4、Mef2c和Tbx5，及其任意组合；以及11)选自下组的第一多肽：Nkx2.5、GATA4、Mef-2C、ISL1、Wt1、Tbx18、Tbx5、Ref-1、Baf60c、STAT3、STAT3-C，及其任意组合；以及选自下组的第二多肽：Oct4、Sox2、K1f4、Lin28、Nanog、cMyc、Ngn3、PDX1、MafA、NeuroD和Foxp3。
表1效应结构域的示例性序列
本披露提供的多肽包含其同源序列。本申请中使用的“同源序列”指的是一种多肽，其与同源的参比多肽相比，具有足够相当比例的相同氨基酸序列的多肽。在某些实施方式中，同源序列与本披露提供的用作效应结构域的多肽之一具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少93%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%相同的氨基酸序列。具有同源序列的多肽具有与本发明公开的效应结构域基本相同的活性。
在进行序列对比后，并在必要时引入间隔使相同氨基酸数目达到最多后，相同氨基酸序列的百分比定义为在候选氨基酸序列中与对比氨基酸序列的氨基酸残基相同的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。本申请中使用的“保守替代”指的是将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质（例如，疏水性和侧链分子体积）的氨基酸残基替代。
可以通过本领域不同的方式来对比以确定相同氨基酸的百分比。例如，可以用公开可用的以下工具进行序列对比，所述工具如BLASTp（美国国家生物技术信息中心网站（NCBI）：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，也可参见，Altschul S.F.等、J.Mol.Biol.，215:403–410(1990);Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997)）、ClustalW2（欧洲生物信息研究所网站：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，可参见，Higgins D.G.等，Methods in Enzymology，266:383-402(1996);Larkin M.A.等，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21):2947-8(2007)）和TCoffee（瑞士生物信息学研究所网站，可参见，PoirotO.等，Nucleic Acids Res.，31(13):3503-6(2003);Notredame C.等，J.Mol.Boil.，302(1):205-17(2000)）。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据对比的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的运算法则。
本披露提供的多肽进一步包含其功能等同体。本申请中使用的“功能等同体”指的是具有与母体多肽全部或部分基本相似的功能或结构特征的多肽一种多肽，其具有的功能或结构特征与母本母体多肽的全部或部分基本相似。本披露提供的多肽包含其功能等同体，所述功能等同体可以发挥基本相似的功能，即重编程体细胞成为干细胞或使细胞状态发生改变。本披露提供的多肽（即母本母体多肽）的功能等同体可以是母本母体多肽的片段、突变体、衍生物、变体或类似物，并可以包含化学或生物的修饰。所述功能等同体可以具有母本母体多肽一个或多个氨基酸的替代、增加、删除、插入、截断、修饰（例如，磷酸化、糖基化、标记等）或其任意组合。功能等同体可以包括母本母体多肽天然存在的变体和人工多肽的序列，如通过重组方法或化学合成获得的人工多肽序列。功能等同体可以包含非天然存在的氨基酸残基。
在某些实施方式中，转导物质进一步包括转导结构域。转导结构域是能够促进转导物质进入生物样品（例如细胞）的基序。转导结构域与效应结构域共价、非共价或通过接头相连接。在某些实施方式中，转导结构域通过接头共价连接于效应结构域。在某些实施方式中，接头是包含一个或多个甘氨酸残基的富含甘氨酸的接头（例如esggggspg（SEQ IDNO:55））。
转导结构域的例子包括，但不限于，聚合物如阳离子脂类聚合物和纳米颗粒等、蛋白转导结构域（PTD）、细胞穿膜肽（CPP1）、细胞渗透肽（CPP2）、激活的细胞穿膜肽或结合物（ACPP）、细胞靶向性肽（CTP）以及超荷电蛋白质（supercharged protein）。
CPP1、CPP2、PTD和超荷电蛋白质是已知能促进与之连接的分子载物递送进入细胞的肽。CPP1、CPP2、PTD或超荷电蛋白质与分子载物间的结合可以通过共价键或非共价的相互作用。分子载物可以是化学小分子、肽、蛋白、DNA片段、RNA如siRNA和miRNA等或者纳米大小的颗粒。例如，CPP1和PTD包括5到20种氨基酸肽基序，其能够不依赖于表面转运蛋白和细胞周期时相而穿透细胞。CPP1和PTD也能够穿透血脑屏障。CPP1和PTD可以在体外递送蛋白和肽，也可以在肠胃外给药后，在体内递送蛋白和肽并使之在生物体内均匀分布。阳离子PTD可以作为核定位信号，将结合的分子载物运送至细胞核。蛋白转导结构域的示例包括，但不限于TAT（例如，YGRKKRRQRRR，SEQ ID NO:34）、聚精氨酸（例如，具有7-11个精氨酸残基的聚精氨酸，如RRRRRRR、RRRRRRRR、RRRRRRRRR、RRRRRRRRRR(SEQ ID NO:35）以及RRRRRRRRRRR(SEQ ID NO:36)等）、穿膜肽（突触足穿膜肽，例如，RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:38)）、VP22（例如，DAATATRGRSAASRPTQRPRAPARSASRPRRPVQ(SEQ ID NO:39)）、转运肽（例如，GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:40））、MAP（例如，KLALKLALKALKAALKLA(SEQ ID NO:41)）、MTS（例如，AAVALLPAVLLALLP(SEQID NO:42)）、PEP-1（例如，KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:43））、精氨酸/色氨酸类似物（例如，RRWRRWWRRWWRRW (SEQ ID NO:44））、聚胍类肽（例如，在骨架和胍基之间有6-亚甲基间隔的聚胍类肽，如N-arg 5、7或9类肽）、固有蛋白转导域（例如，RHIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:56)、KPKRRGPKKKKMTKARLERFKLRRMKANARERNR(SEQ ID NO:57)、HIV-I Rev（例如，TRQARRNRRRRWRERQR(SEQ ID NO:60)）、兽棚病毒衣壳肽（例如，RRRRNRTRRNRRRVR(SEQ ID NO:61)）以及DNA结合肽，如c-Fos（例如，KRRIRRERNKMAAAKSRNRRRELTDT(SEQ ID NO:62)）、c-Jun（例如，RIKAERKRMRNRIAASKSRKRKLERIAR(SEQ ID NO:63)）、酵母GCN4（例如，KRARNTEAARRSRARKLQRMKQ(SEQ ID NO:64)）、融合HA2肽（例如，GLFGAIAGFIENGWEGMIDG(SEQ ID NO:65)、GDIMGEWGNEIFGAIAGFLG(SEQ IDNO:66)）。
超荷电蛋白质可以是修饰的多肽或蛋白，其与未修饰的蛋白形式相比具有增加或减少的总体净电荷（正净电荷或负净电荷）。在某些实施方式中，超荷电蛋白质具有总体净正电荷，可以用作转导结构域。超荷电蛋白质的例子包括，不限于，超荷电GFP（例如，ASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(SEQ ID NO:67)），和其他在美国专利申请US20110112040中所公开的其他超荷电蛋白质，该美国专利申请通过引用整体并入本文。也可以使用天然存在的超荷电蛋白质，例如，HBEGF（登记号：Q99075）、N-DEK（登记号：P35659）、C-jun（登记号：P05412），和HGF（登记号：P14210），以及其他如美国专利申请号US20110112040中所公开的其他天然超荷电蛋白质，该美国专利申请通过引用整体并入本文。
细胞靶向性肽是能与细胞表面受体结合并通过内吞作用进入细胞的蛋白或肽。在某些实施方式中，细胞靶向性肽针对特定的组织或细胞类型，例如，GnRH肽（例如SEQ IDNO:58）针对表达GnRH受体的生物样品（例如，实体瘤和激素应答的癌细胞系）。细胞靶向性肽及其针对的特定生物样品的更多示例列于表2中。
表2.细胞靶向性肽及其针对的特定生物样品的示例
激活的细胞穿膜肽或结合物（ACPP）包括阳离子的CPP1、CPP2、PTD或超荷电蛋白质以及中和性阴离子对应物。在某些实施方式中，阳离子的CPP1、CPP2、PTD或超荷电蛋白质和阴离子对应物的结合通过非共价相互作用（例如电荷-电荷相互作用）和/或共价可剪切的接头（例如基质金属蛋白酶（MMP）可剪切的序列）。在非共价相互作用被破坏和/或可剪切的接头被剪切之前，ACPP转导进入细胞被抑制。例如，不限定于任何理论，阴离子对应物包括一种或多种pH敏感基团，如磺胺类基团，其在pH 7.4（血流中的pH值）时被质子化，在弱酸性pH（例如pH6.8）时变为中性。因此，在弱酸性微环境中（例如在肿瘤或癌中或周围），阳离子的CPP1、CPP2、PTD或超荷电蛋白质和阴离子对应物间的电荷-电荷相互作用可以被破坏。血流中的MMP浓度比肿瘤或癌周围微环境中要低。因此，MMP可剪切的序列在血流中不会被剪切，但在肿瘤或癌周围的环境中被剪切。阳离子的CPP1、CPP2、PTD或超荷电蛋白质不再被阴离子对应物所中和，因此被暴露以促进向细胞（例如肿瘤或癌细胞）内转位。在某些实施方式中，CPP1、CPP2或PTD是TAT。在某些实施方式中，阴离子对应物包括pH敏感性聚合物（例如两嵌段聚合物），其包含pH-敏感性基团（例如磺胺类基团）。
在另一个例子中，激活的细胞穿透性结合物包括由聚合物形成的常规的疏水核心，其中包含一个效应结构域，由聚乙二醇和一个或多个阳离子CPP1、CPP2、PTD或超荷电蛋白质组成的外周亲水层，以及一个或多个阴离子对应物，其能够通过电荷-电荷相互作用中和阳离子CPP12、CPP2s、PTD或超荷电蛋白质。预期这种电荷-电荷相互作用在递送过程中保护阳离子电荷，直到转导物质到达弱酸性微环境（例如肿瘤或癌），阴离子对应物的质子化被触发，并破坏电荷-电荷的结合作用。随后，之前被阴离子对应物淬灭的阳离子CPP1、CPP2、PTD或超荷电蛋白质现在则能够促进效应结构域向周围细胞（例如肿瘤或癌细胞）的递送。
在某些实施方式中，选择性转导物质包括选自下组的转导结构域：细胞靶向性肽、激活的细胞穿膜肽以及激活的细胞穿透性结合物。
转导结构域与效应结构域的结合通过共价键、非共价作用或通过接头结合。因此，可以通过分别获得转导结构域和效应结构域，再通过共价键或非共价相互作用（例如，排斥作用、偶极作用、氢键作用、色散作用、电荷-电荷相互作用、溶剂、反离子和熵效应以及水和疏水效应）将其结合在一起而得到转导物质。在某些实施方式中，通过将效应结构域与转导结构域混合而制备转导物质。另外，也可以通过从天然资源中分离或者重组制备而得到转导物质。当两个结构域都是肽或多肽时，效应结构域可以连接于转导结构域的N-末端或C-末端，可以通过化学合成或通过重组技术重组而制备转导多肽。
在某些实施方式中，转导物质包含天然可转导的效应结构域，以及通过共价或非共价作用结合于效应结构域的转导结构域。
在某些实施方式中，转导物质还包含一个或多个不妨碍效应结构域或转导结构域的功能的基序。在某些实施方式中，这些基序与效应结构域和/或转导结构域通过共价、非共价或通过接头连接。在某些实施方式中，这些基序有助于转导物质的制备和/或纯化。这种基序的一个示例是多组氨酸标签，其有助于转导物质的制备中的蛋白纯化。在某些实施方式中，聚组氨酸标签包含至少6个组氨酸残基（例如MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH（″His6″，SEQ ID NO:59））。
在某些实施方式中，转导物质包括，例如，Oct4-11R（SEQ ID NO:12）、Sox2-11R（SEQID NO:13）、K1f4-11R（SEQ ID NO:14）、Lin28-11R（SEQ ID NO:16）、Nanog-11R（SEQID NO:17）、cMyc-11R（SEQ ID NO:15）、Ngn3-11R（SEQ ID NO:19）、PDX1-11R（SEQID NO:20）、MafA-11R（SEQ ID NO:21）、NeuroD-11R（SEQ ID NO:18）以及Foxp3-11R（SEQ ID NO:22）、Nkx2.5-11R、GATA4-11R(例如，SEQ ID NO:71)、Mef-2C-11R(例如，SEQ ID NO:72)、Isl1-11R、Wt1-11R、Tbx18-11R、Tbx5-11R(例如，SEQ ID NO:73)、Ref-1-11R、Baf60c-11R、STAT3-11R、STAT3-C-11R，其中11R（SEQ ID NO:37）代表包括11个精氨酸残基的聚精氨酸序列，其与接头连接，通过该接头将聚精氨酸序列共价连接至效应结构域。在某些实施方式中，“11R”共价连接于效应结构域的C端。在某些实施方式中，转导物质包括，例如，His6-Oct4-11R（SEQ IDNO:23）、His6-Sox2-11R（SEQ IDNO:24）、His6-K1f4-11R（SEQ ID NO:25）、His6-Lin28-11R（SEQ ID NO:27）、His6-Nanog-11R（SEQ ID NO:28）、His6-cMyc-11R（SEQ ID NO:26）、His6-Ngn3-11R（SEQ ID NO:30）、His6-PDX1-11R（SEQ ID NO:31）、His6-MafA-1IR（SEQ ID NO:32）、His6-NeuroD-11R（SEQ ID NO:29）、His6-Foxp3-11R（SEQ ID NO:33）、His6-Nkx2.5-11R、His6-GATA4-11R(例如，SEQ ID NO:74)、His6-Mef-2C-11R(例如，SEQ ID NO:75)、His6-Isl1-11R、His6-Wt1-11R、His6-Tbx18-11R、His6-Tbx5-11R(例如，SEQ ID NO:76)、His6-Ref-1-11R、His6-Baf60c-11R、His6-STAT3-11R和His6-STAT3-C-11R。在某些实施方式中，“His6”与效应结构域的N端共价连接。示例性的转导物质如表3所示。
表3示例性的转导物质
在某些实施方式中，转导物质可以与一种或多种佐剂联合使用，如小分子表观遗传试剂。合适的表观遗传试剂包括，但不限于，组蛋白组胺去乙酰酶抑制剂和DNA甲基化抑制剂。合适的佐剂的例子包括，但不限于，曲古抑菌素A，其为组胺组蛋白去乙酰酶抑制剂和DNA甲基化抑制剂；丙戊酸，其为组胺组蛋白去乙酰酶抑制剂和DNA甲基化抑制剂、氮杂-2’-脱氧胞苷，其为DNA甲基化抑制剂，以及异羟肟酸，其为组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
本披露的另一方面涉及包含生物样品和至少一种转导物质的组合物，其中转导物质已经转导进入生物样品。例如，组合物包括转导物质以及T细胞，所述转导物质含有Foxp3（例如转导物质为Foxp3、Foxp3-11R或His6-Foxp3-11R），其中转导物质已经转导进入T细胞；组合物包括piPS细胞以及一种或多种转导物质，该转导物质含有选自下组的多肽：Oct4、K1f4、Sox2、cMyc及其任意组合（例如转导物质为Oct4、K1f4、Sox2、cMyc、Oct4-11R、K1f4-11R、Sox2-11R、cMyc-11R、His6-Oct4-11R、His6-K1f4-11R、His6-Sox2-11R或His6-cMyc-11R）；组合物包括肝脏或胰腺外分泌细胞以及一种或多种转导物质，该转导物质含有选自下组的多肽Ngn3、PDX1、MafA、NeuroD及其任意组合（例如转导物质为Ngn3、PDX1、MafA、NeuroD、Ngn3-11R、PDX1-11R、MafA-11R、NeuroD-11R、His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R或His6-MafA-11R、His6-NeuroD-11R），其中转导物质已经转导进入肝脏或胰腺外分泌细胞；以及包括成纤维细胞和一种或多种转导物质的组合物，所述转导物质包含选自下组的多肽：Nkx2.5、GATA4、Mef-2C、ISL1、Wt1、Tbx18、Tbx5、Ref-1、Baf60c、STAT3、STAT3-C及其任意组合(例如，转导物质为Nkx2.5、GATA4、Mef-2C、Isl1、Wt1、Tbx18、Tbx5、Ref-1、Baf60c、STAT3、STAT3-C、Nkx2.5-11R、GATA4-11R、Mef-2C-11R、Isl1-11R、Wt1-11R、Tbx18-11R、Tbx5-11R、Ref-1-11R、Baf60c-11R、STAT3-11R、STAT3-C-11R、His6-Nkx2.5-11R、His6-GATA4-11R、His6-Mef-2C-11R、His6-Isl1-11R、His6-Wt1-11R、His6-Tbx18-11R、His6-Tbx5-11R、His6-Ref-1-11R、His6-Baf60c-11R、His6-STAT3-11R、His6-STAT3-C-11R，或其任意组合)其中转导物质已经转导入成纤维细胞。
本披露的另一方面涉及通过将生物样品暴露于包含转导物质的组合物中而重编程生物样品的方法。在某些实施方式中，该方法通过将生物样品暴露于包含选择性转导物质的组合物中，使得相比于其它生物样品来说，该方法优先重编程特定类型的生物样品（例如癌症或肿瘤细胞）或优先重编程生物体特定微环境中或周围的生物样品（例如，癌或肿瘤周围的微环境）。
在一种实施方式中，生物样品包括来自生物体的细胞、细胞簇、组织、器官、生物体。生物样品可以是正常、健康的样品或是异常、病变的样品（例如，癌或肿瘤）。
生物体包括，例如，微生物（例如细菌）、真菌、植物以及动物（例如人体）。
来源于动物生物体（例如人）的器官包括，例如，循环器官（例如心脏、血液和血管）、消化器官（例如唾液腺、食管、胃、肝脏、胆囊、胰腺、肠、直肠和肛门）、内分泌器官（例如，内分泌腺体如下丘脑、脑垂体或脑垂体腺、松果体或松果腺、甲状腺、副甲状腺、以及肾上腺即肾上腺体等）、外皮器官（例如皮肤、毛发和指甲）、淋巴器官（例如，淋巴结和淋巴管、扁桃体、类腺体、胸腺和脾脏）、肌肉器官（例如肌肉）、神经器官（例如脑、脊髓、外周神经和神经）、生殖器官（例如，卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺以及阴茎）、呼吸器官（例如，咽、喉、气管、支气管、肺以及隔膜）、骨骼器官（例如，骨骼、软骨、韧带以及肌腱）、泌尿系统（例如，肾脏、输尿管、膀胱以及尿道）。器官可以是正常或健康的，或者，异常或非健康的（例如，癌化的）。
来源于植物生物体的器官包括，例如，根、茎、叶、花、种子以及果实。
来源于生物样品（例如动物）的组织包括结缔组织、肌肉组织、神经组织和上皮组织。组织可以是正常或健康的，或者，异常或非健康的（例如，癌化的）。来源于生物样品（例如植物）的组织包括皮层、维管组织以及基本组织。
细胞可以是原核的或真核的。原核细胞包括，例如，细菌。真核细胞包括，例如，真菌、植物细胞以及动物细胞。动物细胞（例如，哺乳动物细胞或人的细胞）的类型包括，例如，来源于循环/免疫系统或器官的细胞（例如，B细胞、T细胞（细胞杀伤性T细胞、自然杀伤性T细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞）、自然杀伤性细胞、粒细胞（例如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞以及多叶核中性粒细胞）、单核细胞或巨噬细胞、红细胞（例如网织红细胞）、肥大细胞、血小板或巨核细胞以及树突状细胞）；来源于内分泌系统或器官的细胞（例如，甲状腺细胞（例如甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞）、甲状腺旁细胞（例如甲状腺旁主细胞、嗜酸性细胞）、肾上腺细胞（例如嗜铬细胞）以及松果体细胞（例如松果体细胞））；来源于神经系统或器官的细胞（例如，成神经胶质细胞（例如，星形胶质细胞和少突细胞）、小神经胶质细胞、大细胞型神经分泌细胞、星形细胞、卜歇细胞以及脑垂体细胞（例如，促性腺细胞、促皮质激素分泌细胞、促甲状腺细胞、生长激素细胞以及催乳激素分泌细胞））；来源于呼吸系统或器官的细胞（例如，肺细胞（I型肺细胞和II型肺细胞）、克拉拉细胞、杯状细胞、肺泡巨噬细胞）；来源于循环系统或器官的细胞（例如，心肌细胞和周细胞）；来源于消化系统或器官的细胞（例如，胃粘膜主细胞、壁细胞、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝细胞（例如肝细胞和库普弗细胞））；来源于外皮系统或器官的细胞（例如，骨骼细胞（例如，成骨细胞、骨细胞和破骨细胞），牙齿细胞（例如，成牙骨质细胞和成釉细胞）、软骨细胞（例如，成软骨细胞和软骨细胞）、皮肤/毛发细胞（例如，丝胞、角化细胞和黑色素细胞（痣细胞））、肌肉细胞（例如，肌细胞）、脂肪细胞、成纤维细胞和腱细胞）；来源于泌尿系统或器官的细胞（例如，足状突细胞、近肾小球细胞、球内系膜细胞、球外系膜细胞、肾近曲小管刷状缘细胞和致密斑细胞）以及来源于生殖系统或器官的细胞（例如，精子、塞尔托利氏细胞、莱氏细胞、卵细胞、卵母细胞）。细胞可以是正常、健康的细胞；或者疾病或非健康的（例如，癌细胞）。
细胞还包括哺乳动物干细胞，其包括胚胎干细胞、胎干细胞、诱导型多能干细胞以及成人干细胞。干细胞是能够经历细胞分裂周期并同时维持未分化状态，且能够分化为专门细胞类型的细胞。干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞（multipotent stemcell）、寡潜能干细胞以及单能干细胞（参见Hans R.Schóler（2007）.″The Potential of StemCells:An Inventory″in Nikolaus Knoepffler，Dagmar Schipanski，and Stefan Lorenz Sorgner.Humanbiotechnology as Social Challenge.Ashgate Publishing，Ltd.pp.28），其中任何一种都可能从体细胞诱导得到。干细胞也可能包括癌干细胞。
在某些实施方式中，细胞是成纤维细胞。成纤维细胞是分泌包含胶原蛋白的细胞外基质的细胞。成纤维细胞在全身都有分布并且是结缔组织中最常见的细胞。示例性的成纤维细胞包括，心肌成纤维细胞和真皮成纤维细胞。
在另一种实施方式中，本申请所用的“重编程生物样品”可替换为或指的是调节、更改或改变生物样品（例如细胞）的生物学活性，或者将生物样品从一种状态或一种状况调节、变更或改变为另一种。例如，通过将生物样品（例如细胞）暴露于转导物质，细胞的生物学活性（例如，细胞生长、细胞分裂、细胞代谢、细胞周期、细胞信号传导、DNA复制、转录、RNA剪接、蛋白质合成、翻译后修饰）被调节或改变，以至于导致细胞增殖、分化（例如，从祖细胞到终末分化细胞）、去分化（例如，从终末分化细胞到多能干细胞）、转分化（例如，从一种类型的终末分化细胞到另一种类型的终末分化细胞）、反分化（例如，从终末分化细胞到祖细胞）、转决定（例如，从一种类型的祖细胞到在天然状态下通常来源于另一种类型的祖细胞的终末分化细胞）、凋亡（例如，细胞或癌细胞的死亡）、形态发生以及细胞命运的改变。在另一个例子中，生物样品的状态可以变更或改变：从异常或疾病状态变成正常或健康状态（例如，从癌细胞到非癌细胞），从一种细胞类型变成另一种细胞类型（例如，从未分化的干细胞变成分化的干细胞或专门细胞），从分化的或专门细胞变成未分化细胞或干细胞（例如，全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、寡潜能干细胞以及单能干细胞）（例如，从成纤维细胞变成诱导型多能干细胞（iPSCs）），从体细胞变成干细胞或诱导型干细胞，从干细胞的一种状态变成干细胞的另一种状态（例如，从全能干细胞到多能干细胞），从一种类型的分化细胞变成另一种类型的分化细胞（例如，T细胞到调节性T细胞，胰腺外分泌细胞到产生胰岛素的β细胞、成纤维细胞到心肌细胞、心脏干细胞或心脏祖细胞）。
在另一项实施方式中，生物样品暴露于转导物质并被重编程。生物样品可以在体外、体内或离体暴露。例如，通过将样品与转导物质在活的生物体以外的环境（例如，在细胞培养系统或试管中）中接触而使生物样品在体外暴露。通过将物质与包含样品的生物体接触或者将物质给入（例如，通过给药）生物体而使生物样品在体内暴露。转导物质可以通过任何已知的给药途径来给药，例如肠胃外（例如，皮下、腹膜内、静脉，包括静脉输注、肌肉内或皮内注射）或非肠胃外（例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部）的途径。当生物样品（例如，细胞、组织或器官）从生物体取出，与转导物质接触并放回同样或不同的生物体时，生物样品被离体暴露。离体暴露的例子包括将生物样品移出生物体，将生物样品暴露于转导物质，将转导物质转导的生物样品移植回生物体。
在某些实施方式中，OG2-MEF细胞暴露于包含蛋白Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R以及cMyc-11R的组合物中，并重编程为诱导型多能干细胞（iPSCs）。
在某些实施方式中，T细胞暴露于包含蛋白Foxp3-11R或His6-Foxp3-11R的组合物中，并重编程为调节性T细胞（Treg细胞）。
在某些实施方式中，肝脏和/或胰腺外分泌细胞暴露于组合物中，并重编程为产生胰岛素的细胞（例如β细胞），所述组合物包含选自下组的多肽：Ngn3-11R、PDX1-11R、MafA-11R、NeuroD-11R、His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R、His6-MafA-11R以及His6-NeuroD-11R。在某些实施方式中，组合物进一步包含一种或多种佐剂，如胰岛细胞生长因子（例如乙胞素）。在某些实施方式中，组合物包含His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R以及His6-MafA-11R。在某些实施方式中，组合物包含His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R、His6-MafA-11R以及乙胞素。不局限于特定的机理，我们预期这种重编程是通过转决定和/或转分化进行的。
在某些实施方式中，成纤维细胞暴露于包含一种或多种蛋白的组合物，所述蛋白选自：Nkx2.5-11R、GATA4-11R、Mef-2C-11R、Isl1-11R、Wt1-11R、Tbx18-11R、Tbx5-11R、Ref-1-11R、Baf60c-11R、STAT3-11R、STAT3-C-11R、His6-Nkx2.5-11R、His6-GATA4-11R、His6-Mef-2C-11R、His6-Isl1-11R、His6-Wt1-11R、His6-Tbx18-11R、His6-Tbx5-11R、His6-Ref-1-11R、His6-Baf60c-11R、His6-STAT3-11R、His6-STAT3-C-11R并重编程为心肌细胞、心脏干细胞或心脏祖细胞。在某些实施方式中，所述组合物进一步包含一种或多种佐剂，例如表观遗传试剂（例如，曲古抑菌素A、丙戊酸、氮杂-2’-脱氧胞苷、异羟肟酸）。在某些实施方式中，所述组合物包含GATA4-11R、Mef-2C-11R、Tbx5-11R、His6-GATA4-11R、His6-Mef-2C-11R、His6-Tbx5-11R或其任意组合。不局限于特定的机理，所述重编程是通过转决定、转分化和/或反分化。
本披露的另一方面涉及通过将包含转导物质的组合物给药于生物体而治疗、预防或减轻生物体中疾病或状态的方法。在某些实施方式中，组合物是包含转导物质的药物组合物。在某些实施方式中，组合物包含选择性转导物质。疾病或状态的治疗、预防或减轻与生物体中生物样品（例如，细胞、组织或器官）的改变或重编程相关联。
本披露还提供了转导物质在制备药物中的用途，所述药物用于在生物体内治疗、预防或减缓疾病或状态。在某些实施方式中，转导物质是选择性转导物质。疾病或状态的治疗、预防或减缓与生物体内生物样品（例如，细胞、组织或器官）的改变或重编程相关。
在某些实施方式中，本方法或药物可以治疗的疾病或状态包括，但不限于，肿瘤、癌症、代谢疾病或状态（例如I型和II型糖尿病和肥胖症）、炎症状态、心脏病、神经生成疾病（例如，贫血症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓损伤、烧伤或关节炎）、自身免疫性疾病或状态（例如急性播散性脑脊髓炎（ADEM）、爱迪生氏病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合症（APS）、贫血症（例如，自身免疫性溶血性贫血症以及恶性贫血症）、关节炎、牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎、1型糖尿病、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、类天疱疮、乳糜泻、查加斯病、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、皮肌炎、子宫内膜异位症、古德帕斯彻氏综合症、格雷夫斯氏病、吉巴氏综合症（GBS）、桥本氏病、化脓性汗腺炎、川崎病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、红斑狼疮、混合性结缔组织病、硬斑病、多发性硬化症（MS）、重症肌无力、嗜睡症、神经性肌强直、寻常天疱疹、牛皮癣、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、精神分裂症、硬皮病、干燥综合征、僵人综合症、颞动脉炎（“巨细胞性动脉症”）、溃疡性结肠炎、血管炎、白癜风、以及韦格纳肉芽肿病）。
例如，预期可以将转导物质或由转导物质制备的药物给药于患有肿瘤的生物体以激活肿瘤细胞的凋亡或使肿瘤细胞对化学疗法、放射疗法或癌症药物更加敏感。
在某些实施方式中，可以将转导物质或由转导物质制备的药物给药于生物体以增强或减弱免疫系统，并因此治疗或预防免疫相关疾病或炎症疾病。例如，将蛋白Foxp3-11R或His6-Foxp3-11R转导进T细胞并使之编程为Treg细胞，后者抑制过度活跃的免疫系统并因此治疗自身免疫性疾病。
在某些实施方式中，可以将转导物质或由转导物质制备的药物给药于生物体以治疗心血管疾病，所述心血管疾病如心肌梗塞、局部缺血、心脏梗塞、梗塞后过程（post-infarctionprocess）、心脏损伤、酒精性心肌病、冠状动脉疾病、先天性心脏病、心脏受影响的营养病、缺血性（或缺血性）心肌病、高血压性心肌病、瓣膜心肌病、炎性心肌病、系统代谢性疾病继发性心肌病、心肌营养不良（myocardiodystrophy）、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制性心肌病和内心肌病。
例如，为了治疗心血管疾病或状况治疗受损的心脏部分，将多肽或包含所述多肽的组合物转导进入适合的细胞（例如，成纤维细胞、心肌成纤维、真皮成纤维细胞、内皮细胞或平滑肌细胞）并将其重编程为心肌细胞、心脏干细胞或心脏祖细胞，所述多肽选自：Nkx2.5-11R、GATA4-11R、Mef-2C-11R、Isl1-11R、Wt1-11R、Tbx18-11R、Tbx5-11R、Ref-1-11R、Baf60c-11R、STAT3-11R、STAT3-C-11R、His6-Nkx2.5-11R、His6-GATA4-11R、His6-Mef-2C-11R、His6-Isl1-11R、His6-Wt1-11R、His6-Tbx18-11R、His6-Tbx5-11R、His6-Ref-1-11R、His6-Baf60c-11R、His6-STAT3-11R、His6-STAT3-C-11R及其任意组合。不局限于特定的机理，进一步预期所述重编程通过转决定和/或转分化。在某些实施方式中，包含多肽的组合物转导进入成纤维细胞并重编程其成为心肌细胞，所述多肽选自：GATA4-11R、Mef-2C-11R、Tbx5-11R、His6-GATA4-11R、His6-Mef-2C-11R、His6-Tbx5-11R或其任意组合。
再例如，通过转分化、转决定或反分化将心肌成纤维细胞重编程为心脏干细胞或心脏祖细胞。在心脏生态位，这些新生成的心脏干细胞或心脏祖细胞可以分化成为肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，这些细胞随后重新组成心脏的受损部分。
在某些实施方式中，将一种或多种佐剂向生物体给药，所述佐剂如表观遗传试剂（例如曲古抑菌素A、丙戊酸、氮杂-2’-脱氧胞苷和/或异羟肟酸）。
本发明的另一方面涉及将iPSC、胚胎干细胞或其它类型的干细胞或祖细胞重编程为某种类型的体细胞或祖细胞的方法，这可以发展为基于细胞的疗法而用于各种疾病或状态，包括神经障碍、贫血症、神经退行性疾病、癌症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓损伤、烧伤、心脏病、糖尿病以及关节炎。干细胞或祖细胞可以是病人特异的或非病人特异的，可以在被暴露于转导物质以进行受控的分化或重编程之前，被修复以去除分子缺陷，或者不修复。已重编程的细胞在移植回病人之前可能被富集、纯化或操作。在某些实施方式中，重编程细胞是心血管系统中的细胞，例如，心肌细胞、心肌成纤维细胞、心脏干细胞或心脏祖细胞。
本发明的另一方面涉及将iPSC、胚胎干细胞或其它类型的干细胞或祖细胞重编程为某种类型的体细胞或祖细胞的方法，这可以作为疾病模型，用于药物筛选、机制研究、毒性分析、或者用作其它研究和药物开发的工具。例如，该方法包括将iPSC、胚胎干细胞或祖细胞暴露于包含转导物质的组合物中，而使iPSC、胚胎干细胞或祖细胞重编程为可移植的体细胞或可移植的祖细胞；将可移植的体细胞或可移植的祖细胞移植进生物样品或生物体中；将生物样品或生物体开发变为疾病模型。在另一个例子中，本方法包括用转导物质将病人特异性细胞重编程为iPSC；进一步用或不用转导物质从病人特异性iPSC产生不同类型的细胞；用病人特异性iPSC或iPSC衍生细胞开发疾病模型。在另一例子中，开发药物筛选或毒性模型的方法包括用转导物质将体细胞、祖细胞或多潜能细胞重编程为iPSC；进一步通过或不通过暴露于转导物质而从iPSC产生不同类型的细胞；用iPSC和/或iPSC衍生细胞来筛选不同化合物的效果和/或毒性。
本披露的另一方面涉及开发基于细胞的疗法的方法，所述疗法针对各种疾病或状态，所述方法包括步骤：用转导物质将iPSC、胚胎干细胞或祖细胞重编程为可移植的体细胞或祖细胞；将可移植的体细胞或祖细胞移植进生物样品或生物体；评估可移植的体细胞或祖细胞的治疗效果。
在某些实施方式中，上述可移植的细胞是心血管系统中的细胞，例如，心肌细胞、心肌成纤维细胞、心肌细胞、心脏干细胞或心脏祖细胞。这些可移植的细胞可以移植入所需对象，这些可移植的心脏干细胞或心脏祖细胞一旦在心脏生态位中，便可分化为肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，这些细胞随后重新组成已受损的心脏部分。
例如，用蛋白药物、小分子药物或其组合，通过注入患者的受损部位来治疗梗塞后患者，上述药物的注入在受损或受影响的部位产生新的心肌细胞和/或其他心脏细胞类型。这些新细胞重建心脏组织的正常结构和功能，并能帮助心肌梗塞患者很快恢复。
本披露的另一方面涉及效应结构域的识别方法，其中该方法包括步骤：将测试效应结构域共价连接于已知转导结构域以形成测试转导分子；将测试分子暴露于生物样品以及测定生物样品的重编程以表明测试效应结构域是否可以引起生物样品的改变。本披露的另一方面还涉及转导结构域的识别方法，其中该方法包括步骤：将已知效应结构域共价连接于测试转导结构域以形成测试转导分子；将测试分子暴露于生物样品以及测定测试分子在生物样品中的定位或生物样品的重编程效果以表明测试转导结构域是否可以将效应结构域转导进生物样品。
实施例
提供下列实施例是为了更好地举例说明所要求保护的发明，而不是以任何方式解释以限制本发明的范围。下面描述的所有特定组合物、物质和方法，其全部或部分地落在本发明的范围之内。这些特定的组合物、物质和方法并非意在限制发明，而仅仅是举例说明落在本发明范围之内的特定实施方式。本领域普通技术人员可以在不需要发挥创造性劳动以及不脱离本发明范围的前提下开发等同的组合物、材料和方法。可以理解，对本发明描述的方案可以进行多种改变，但仍然在本发明的范围之内。发明人认为，这样的变化包括在本发明的范围之内。
实施例1将体细胞重编程为诱导型多能干细胞（iPSCs）
1.a.制备转导物质Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R和cMyc-11R。
将聚精氨酸蛋白转导结构域通过接头SEQ ID NO.55融合到每个重编程蛋白Oct4、Sox2、K1f4和cMyc A的C-末端以分别形成融合蛋白Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R和cMyc-11R（图1A）。这些聚精氨酸融合蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中表达，随后溶解、再折叠并进一步纯化以获得转导物质Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R和cMyc-11R。通过质谱分析法和Western印迹分析法确认蛋白身份（图1B）。
1.b.转导物质Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R和cMyc-11R的细胞渗透性和稳定性
将转导物质（Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R或cMyc-11R）以不同浓度加入小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养6-72小时。免疫细胞化学方法检查细胞形态和蛋白存在。发现在0.5-8μg/ml浓度下的转导物质在6小时内进入细胞并转位入核（图2）。另外，转导的蛋白在细胞内48小时以内都相当稳定（图3）。
1.c.对报告OG2/Oct4-GFP报告基因的MEF细胞进行重编程。
用第0047段描述的蛋白转导条件来重编程报告OG2/Oct4-GFP报告基因的MEF细胞。细胞进行4轮处理。在每轮处理中，成纤维细胞（初始以5×104个细胞/孔的密度接种于6孔板中）首先在加入或不加入1mM丙戊酸（VPA，酶组蛋白去乙酰化酶1（HDACl）的抑制剂）的mESC生长培养基中用8μg/ml转导物质Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R和cMyc-11R处理过夜，随后更换为不含转导物质和VPA的相同培养基，在下一轮处理前再培养36小时。完成转导物质的重复蛋白转导后，将已处理的细胞转移至已辐射过的MEF滋养细胞上并在mESC生长培养基中培养，直到第30-35天左右出现集落（图4A）。当细胞用Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R和cMyc-11R转导并以VPA处理后，每5×104个细胞得到3个GFP+的集落，当细胞用Oct4-11R、Sox2-11R或K1f4-11R分别转导并以VPA处理后，每5×104个细胞得到1个GFP+的集落。随后将那些最初的GFP+的集落在常规mESC生长条件下传代产生piPS细胞，并进一步鉴定。
生成的小鼠piPS细胞稳定扩增20代以上，形态上与经典mES细胞难以辨别，形成了紧密凸起的集落（图4B和4C）。以免疫细胞化学和染色法检查，它们表达典型的多能标记，包括ALP（图4D）、Oct4、Nanog、Sox2以及SSEA1（图4E）。RT-PCR分析确认了这些多能标记和其它多能基因的内源基因表达（图4F）。单细胞存活分析也表明，piPS在无滋养细胞和N2/B27化学确定条件下，以Oct4阳性集落的形式有效地进行克隆扩增。而且，Oct4启动子的亚硫酸氢盐基因组测序分析表明，它在piPS细胞中被去甲基化，这与mES细胞相似，然而MEF的Oct4启动子却是被超甲基化的（图4G）。该结果进一步提示了在这些piPS细胞中多能转录程序的重新活化。
为了检查piPS细胞的发育潜能，进行了用类胚胎体（EB）的标准体外分化或化学确定的单层阶梯分化以及体内嵌合体分析。piPS细胞有效地形成了悬浮的EB，分化为三层初始胚层的细胞，包括原始内胚层（AFP、Sox17）、前肠内胚层（FoxA2）、胰腺细胞内胚层（PDX1、Pax6）、中胚层（Brachyury）以及神经（Sox1）和神经元细胞（βIII-微管蛋白）外胚层（图5和6A）。这些piPS细胞与8-细胞胚胎聚集后，被有效地包含进囊胚的内细胞团中，聚集后的胚胎被移植入小鼠后，在体内形成具有生殖系转化能力的嵌合体（图6B），如图6B底所示，7个胚胎中的2个中的生殖腺组织中都观察到Oct4-GFP+细胞。这些体外和体内的鉴定共同确认了，纯化的转导物质Oct4-11R、Sox2-11R、K1f4-11R和cMyc-11R能够将MEF重编程为在形态和功能上都与常规mES细胞相似的piPS细胞。
实施例2在小鼠中通过转导物质His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R将肝脏和胰腺外分泌细胞重编程为产生胰岛素的β细胞。
将聚精氨酸蛋白转导结构域通过接头（SEQ ID NO:55）分别融合于每个重编程蛋白（Ngn3、PDX1和MafA）的C-末端以分别形成His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R（图7）。His6（SEQ ID NO:59）的加入有助于蛋白纯化。这些聚精氨酸融合蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中表达，随后溶解、再折叠并进一步纯化以制备转导物质His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R。以质谱分析法和Western印迹分析法确认蛋白身份。
6只CD-1小鼠（Charles River Laboratory）分成两组：处理组和对照组。对处理组中的每只小鼠（小鼠-4、小鼠-5和小鼠-6）通过腹腔注射（IP）转导物质His6-Ngn3-11R（1mg/kg）、His6-PDX1-11R（1mg/kg）和His6-MafA-11R（1mg/kg），对照组中的每只小鼠（小鼠-1、小鼠-2和小鼠-3）注射BSA（1mg/kg）。当针头穿透每只小鼠的腹膜时，没有青褐色或黄色的穿刺物。7天内每天重复注射。在完成所有注射后的第3天，处死处理组和对照组的小鼠。小鼠肝脏和胰腺以1×PBS清洗并用4%多聚甲醛固定过夜。然后按照石蜡包埋标准操作规程处理肝脏和胰腺组织。用组织显微切片机按常规制备5微米厚的组织切片，铺在标准组织玻片上。处理组织片期间以二甲苯溶解组织中的石蜡。用常规方法进行组织切片，组织和免疫组织化学染色。对于间接荧光-抗体（IFA）分析，切片用0.05%Tween-20（TBST）和3%BSA在室温封闭1小时，与小鼠抗胰岛素抗体（Invitrogen）4°C孵育过夜。切片以PBS在室温洗涤三次洗15分钟，与异硫氰酸荧光素（FITC）结合的猪抗小鼠抗体（KPL）在室温孵育2小时。同样浓度的小鼠IgG用作同型对照。将抗DAPI抗体加入切片作为核标记。如前述清洗切片，用水相封片剂（Biomeda，Foster City，CA）封片。在显微镜（Olympus BX51，San Diego，CA）下鉴定内皮标记，用Microsuite BiologicalSuite程序（Olympus BX51，San Diego，CA）分析合并后的细胞（图8-11）。结果表明，相比于对照组（图8），处理组在肝脏中具有更多的产生胰岛素的细胞（图9）。对照组的胰腺显示出一簇产生胰岛素的细胞（图10），而处理组的胰腺在更大的区域显示出产生胰岛素的细胞（图11）。因此，结果显示转导物质His6-Ngn3-11R、His6-PDX1-11R和His6-MafA-11R的处理将肝脏和/或胰腺细胞转变为产生胰岛素的细胞。
实施例3用转导物质Foxp3重编程T细胞并将它们编程为Treg细胞。
将聚精氨酸蛋白转导结构域通过接头（SEQ ID NO:55）融合于每个重编程蛋白Foxp3的C-末端以形成His6-Foxp3-11R（图7）。His6（SEQ ID NO:59）的加入有助于蛋白纯化。聚精氨酸融合蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中表达，随后溶解、再折叠并进一步纯化以制备转导物质His6-Foxp3-11R。以Western印迹分析法确认蛋白身份。
从供体处收集100ml健康人血液，用Histopaque-1077（Sigma-Aldrich，St Louis，MO）通过密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMCs）。用磁珠选择法（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）去除CD14+单核细胞。简而言之，108PBMC与200μL抗CD14微珠（Miltenyi Biotec）在冰上孵育30分钟。用含有2%FCS的冷1×PBS清洗细胞，300g离心10分钟，然后用含2%FCS的1×PBS重悬。将细胞悬液加入磁柱，用含2%FCS的1×PBS清洗3次，使未结合的细胞流出。300g离心10分钟收获PBMC/单核细胞-。
在37°C和5%CO2条件下，在6孔板（Becton Dickinson、Gaithersburg、MD）中培养PBMC/单核细胞-，供以10%FBS、非必须氨基酸、2mM谷氨酸盐、1mM丙酮酸盐、25mMHEPES、200单位/ml青霉素和链霉素。培养1小时后，将His6-Foxp3-11R（10μg/ml，20μg/ml或50μg/ml）加入细胞。将BSA（100μg/ml）加入另一孔中作为对照。培养两天后加入同样浓度的His6-Foxp3-11R或BSA。培养5天后，细胞以PBS清洗两次。细胞重悬于100μL稀释液并加入兔抗人CD25培养90分钟。以含2%FCS的冷1×PBS清洗3次，然后将结合PE的小鼠抗人CD4以及结合FITC的山羊抗兔IgG在冰上加入细胞，放置60分钟。将结合PE的小鼠IgG和兔IgG与另一组细胞孵育作为同型对照。PBS清洗细胞，以Beckman Coulter FC500细胞计数仪和Cytomics CXP软件（Beckman Coulter、Fullerton、CA）进行流式细胞计数分析（图12和13）。结果表明，转导物质His6-Foxp3-11R的处理使得CD4+CD25+T细胞（Treg细胞）显著增加，而且这种增加是蛋白剂量依赖的。
从供体处收集100ml健康人血液，用Histopaque-1077（Sigma-Aldrich，St Louis，MO）通过密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMCs）。在37°C和5%CO2条件下在6孔板（Becton Dickinson，Gaithersburg，MD）中培养PBMC/单核细胞-，供以10%FBS、非必须氨基酸、2mM谷氨酸盐、1mM丙酮酸盐、25mM HEPES、200单位/ml青霉素和链霉素。培养1小时后，将Foxp3（10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）加入细胞。将BSA（100μg/ml）加入另一孔中作为对照。培养两天后加入同样浓度的Foxp3或BSA。培养5天后，细胞以PBS清洗两次。细胞重悬于100μL稀释液并加入兔抗人CD25培养90分钟。以含2%FBS的冷1×PBS将细胞清洗3次，然后将结合PE的小鼠抗人CD4以及结合FITC的山羊抗兔IgG在冰上加入细胞，放置60分钟。将结合PE的小鼠IgG和兔IgG与另一组细胞孵育作为同型对照。PBS清洗细胞，以Beckman Coulter FC500细胞计数仪和Cytomics CXP软件（Beckman Coulter、Fullerton、CA）进行流式细胞计数分析（图14-17）。结果表明，转导物质His6-Foxp3-11R的处理使得CD4+CD25+T细胞（Treg细胞）显著增加，而且这种增加是蛋白剂量依赖的。
实施例4.成纤维细胞的重编程以及用转导物质重编程成纤维细胞成为心肌细胞。
聚精氨酸蛋白转导结构域通过接头（SEQ ID NO:55）融合到重编程蛋白(Gata4、Mef2c和Tbx5)的C端，分别形成His6-Gata4-11R(SEQ ID NO:74)、His6-Mef2c-11R(SEQ ID NO:75)和His6-Tbx5-11R(SEQ ID NO:76)(图7)。包含的His6（SEQ ID NO:59）能有助于蛋白纯化。所述聚精氨酸融合蛋白以包涵体形式表达于E.Coli中，所述包涵体随后溶解、重折叠并进一步纯化以制备转导物质His6-Gata4-11R、His6-Mef2c-11R和His6-Tbx5-11R。通过质谱和Western印迹分析来确认蛋白的身份。
α-肌球蛋白重链（α-MHC）仅在成熟的心肌细胞中表达。用αMHC启动子驱动的EGFP-IRES-嘌呤霉素产生转基因小鼠（αMHC-GFP），其中只有成熟的心肌细胞才表达绿荧光蛋白（GFP）。
从αMHC-GFP小鼠中提取心脏成纤维和尾尖成纤维细胞，并培养于8腔室载玻片上。在蛋白转导中，向培养基中以16μg/ml的浓度加入His6-Gata4-11R、His6-Mef2c-11R和His6-Tbx 5-11R(GMT)，同时加入或不加入表观遗传试剂丙戊酸（VPA，1mM）或异羟肟酸（SAHA，1μM）。24小时后，将细胞转至常规培养基中并使其恢复24小时。总共进行6轮转导（24小时的蛋白处理、24小时的恢复，重复六次）。
如图18和19所示，在存在或不存在表观遗传试剂的情况下，用三种蛋白的组合物处理心肌成纤维细胞或尾尖成纤维细胞都能引起αMHC表达，正如GFP表达所提示。对于尾尖成纤维细胞，有一些背景值：少数细胞表达αMHC，但经蛋白处理后可显著增加GFP+细胞的百分比。
Claims (39)
1.一种包含效应结构域的转导物质，其中所述效应结构域为多肽、小分子或多核苷酸，并且其中所述多肽选自：Nkx2.5、GATA4、Mef-2C、Isl1、Wt1、Tbx18、Tbx5、Ref-1、Baf60c、STAT3、STAT3-C、其同源序列和其任意组合。
2.如权利要求1所述的转导物质进一步包含蛋白，所述蛋白选自：Oct4、K1f4、Lin28、Nanog、cMyc、Ngn3、PDX1、MafA、NeuroD、Foxp3、其同源序列和其任意组合。
3.如权利要求1所述的转导物质，其中所述同源序列指的是与所述蛋白中至少一个的序列至少70%相同的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的转导物质，其中所述同源序列与所述蛋白中至少一个具有基本相同的活性。
5.如权利要求1所述的转导物质进一步包含转导结构域。
6.如权利要求5所述的转导物质，其中所述转导结构域与效应结构域共价、非共价或通过接头相连接。
7.如权利要求1所述的转导物质，其中所述效应结构域是天然可转导的。
8.如权利要求1所述的转导物质，其中所述效应结构域选自GATA4、Mef-2C、Tbx5、其同源序列和其任意组合。
9.如权利要求8所述的转导物质，其中所述效应结构域具有氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、其同源序列和其组合。
10.如权利要求5所述的转导物质，其中所述转导结构域选自：蛋白转导结构域、细胞穿膜肽、细胞渗透肽、激活的细胞穿膜肽、细胞靶向性肽、聚合物及超荷电蛋白质（supercharged protein）。
11.如权利要求10所述的转导物质，其中所述蛋白转导结构域选自：TAT、聚精氨酸、穿膜肽、突触足穿膜肽、VP22、转运肽、MAP、MTS、PEP-1、精氨酸/色氨酸类似物、RRWRRWWRRWWRRW、聚胍类肽、聚胍类肽、天然蛋白转导结构域、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、HIV-1Rev、兽棚病毒衣壳肽、DNA结合肽、c-Fos、c-Jun、酵母GCN4、融合HA2肽以及超荷电GFP(supercharged GFP)。
12.如权利要求10所述的转导物质，其中所述细胞靶向性肽是具有选自下列氨基酸序列的多肽：NGR、RGD、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54和SEQ ID NO:58。
13.如权利要求10所述的转导物质，其中所述聚合物选自：阳离子脂类聚合物和纳米粒。
14.如权利要求1所述的转导物质，其中所述转导物质能够选择性地转导进入一种或多种特定生物样品中，或者能够在所述生物样品周围特定环境中变得可转导。
15.如权利要求6所述的转导物质，其中所述接头具有SEQ ID:55所示的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的转导物质，其中所述蛋白转导结构域是聚精氨酸。
17.如权利要求16所述的转导物质，其中所述转导物质包含多肽，所述多肽含有选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、其同源序列和其任意组合多肽的氨基酸序列。
18.如权利要求5所述的转导物质进一步包含一个或多个基序，所述基序不妨碍所述效应结构域或所述转导结构域的功能。
19.如权利要求18所述的转导物质，其中所述基序共价连接于所述效应结构域或所述转导结构域。
20.如权利要求19所述的转导物质，其中所述基序具有SEQ ID:59所示的氨基酸序列。
21.如权利要求20所述的转导物质，其中所述转导物质包含多肽，所述多肽含有选自SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、其同源序列及其组合的氨基酸序列。
22.一种重编程生物样品的方法，包括：将所述生物样品暴露于至少一种如权利要求1所述的转导物质中。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述生物材料来源于生物体的细胞、组织或器官。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述生物体是微生物、植物或动物。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述生物样品被重编程，以引起增殖、分化、转分化、反分化、转决定、去分化、凋亡或形态发生。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述细胞被重编程，从第一种类型的细胞改变为第二种类型的细胞。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述第一种类型的细胞是成纤维细胞，所述第二种类型的细胞是心肌细胞、心脏干细胞或心脏祖细胞。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述第一种类型的细胞是心肌成纤维细胞或真皮成纤维细胞，并且所述第二种类型的细胞是心肌细胞、心脏干细胞或心脏祖细胞。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述转导物质包含多肽，所述多肽选自：Nkx2.5、GATA4、Mef-2C、ISL1、Wt1、Tbx18、Tbx5、Ref-1、Baf60c、STAT3、STAT3-C、Nkx2.5-11R、GATA4-11R、Mef-2C-11R、Isl1-11R、Wt1-11R、Tbx18-11R、Tbx5-11R、Ref-1-11R、Baf60c-11R、STAT3-11R、STAT3-C-11R、His6-Nkx2.5-11R、His6-GATA4-11R、His6-Mef-2C-11R、His6-Isl1-11R、His6-Wt1-11R、His6-Tbx18-11R、His6-Tbx5-11R、His6-Ref-1-11R、His6-Baf60c-11R、His6-STAT3-11R和His6-STAT3-C-11R。
30.一种包含权利要求1所述的转导物质的药物组合物。
31.如权利要求30所述的药物组合物进一步包含表观遗传试剂。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述表观遗传试剂包括曲古抑菌素A、丙戊酸、氮杂-2’-脱氧胞苷或异羟肟酸。
33.一种包含生物样品和权利要求1所述转导物质的组合物，其中所述转导物质已经转导进入所述生物样品。
34.一种将权利要求1所述的转导物质用于制备药物的用途，所述药物用于治疗生物体的心血管疾病或状况。
35.如权利要求34所述的用途，其中所述心血管疾病或状况选自心肌梗塞、局部缺血、心脏梗塞、梗塞后过程（post-infarction process）、心脏损伤、酒精性心肌病、冠状动脉疾病、先天性心脏病、心脏受影响的营养病、缺血性（或缺血性）心肌病、高血压性心肌病、瓣膜心肌病、炎性心肌病、系统代谢性疾病继发性心肌病、心肌营养不良（myocardiodystrophy）、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制性心肌病和内心肌病。
36.一种治疗生物体的疾病或状态的方法，包括：从所述生物体中取出生物样品；将所述生物样品暴露于如权利要求1所述的转导物质；并将所述转导物质转导过的所述生物样品移植回所述生物体。
37.一种开发基于细胞的疗法的方法，所述疗法针对各种疾病或状态，所述方法包括：
通过将iPSC、胚胎干细胞或祖细胞暴露于至少一种如权利要求1所述的转导物质中而使所述iPSC、所述胚胎干细胞或所述祖细胞重编程为可移植的体细胞或可移植的祖细胞；
将所述可移植的体细胞或祖细胞移植进生物样品或生物体中；以及
评估所述可移植的体细胞或祖细胞的治疗效果。
38.一种开发疾病模型的方法，包括：
将iPSC、胚胎干细胞或祖细胞暴露于至少一种如权利要求1所述的转导物质中而使之重编程为可移植的体细胞或可移植的祖细胞；
将所述可移植的体细胞或祖细胞移植进生物样品或生物体中；开发具有所述可移植的体细胞或祖细胞的疾病模型。
39.一种开发药物筛选或毒性模型的方法，包括：
通过暴露于至少一种权利要求1所述的转导物质而使体细胞、祖细胞或多潜能细胞重编程为iPSC；
通过或不通过暴露于所述转导物质而从iPSC产生衍生细胞；并且
用所述iPSC和/或所述iPSC衍生的细胞来筛选不同化合物的效果和/或毒性。
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