CN105039343B - 一种抑制鸡细胞周期蛋白F基因表达的shRNA分子序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对鸡细胞周期蛋白F基因，构建抑制该基因表达效率最佳的shRNA慢病毒干扰载体。针对鸡细胞周期蛋白F基因设计的4个shRNA寡核苷酸序列，克隆到慢病毒干扰载体lentiviral vector中，构建出四个干扰载体，与包装质粒共转染293T细胞，上清培养液过滤后到病毒悬液，测定病毒滴度后以一定MOI病毒量感染鸡胚成纤维细胞系和鸡胚睾丸支持细胞，筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体。在分子生物学上通过实时荧光定量PCR证明它有效的降低了鸡细胞周期蛋白F基因的表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因技术领域的RNA干扰序列，具体涉及一种抑制鸡细胞周期蛋白F基因表达的shRNA分子序列。
背景技术
细胞周期通常可以分为四个阶段：G1、S、G2及M，其中G1和G2期是细胞生长期，S期是细胞将细胞核内的染色体复制的时期；M期是细胞进行有丝分裂或者减数分裂的时期。细胞周期蛋白，又名细胞周期素(Cyclin)，是一类与细胞周期功能状态密切相关的蛋白质家族，已知的细胞周期蛋白有十余种，目前功能研究较为透彻的主要有Cyclin A,Cyclin B,Cyclin C,Cyclin D及Cyclin E，他们在细胞周期的不同阶段通过cyclin box激活周期素依赖性蛋白激酶(CDK)分别发挥作用。1994年Elledge实验室发现一种新的人类细胞周期蛋白，并将其命名为细胞周期蛋白F(Cyclin F，CCNF)。CCNF是细胞周期蛋白中分子量最大的一个，在已检测的所有细胞中均有表达。与其他周期蛋白不同，CCNF拥有cyclin box，但没有可激活的CDK，因此其功能可能区别于其他细胞周期蛋白。近年来，随着CCNF在不同的物种中被相继报道，功能研究也逐渐开展。鸡的CCNF基因位于14号染色体，全长由12568个碱基编码。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是发生在真核生物细胞内，基因转录后的表达被特异性抑制的现象。其作用机制是，细胞内的长双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)与Dicer酶结合后，被切成长度为21-23bp的小干扰RNA分子(small interfering RNA，siRNA)。siRNA识别并结合靶基因mRNA上的互补序列，引导RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)将mRNA降解，从而导致靶基因转录后的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)。具有茎环结构的短发夹RNA(shorthairpin RNA，shRNA)在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，并诱导RNA干扰，而且作用时间更为持久。针对目的基因序列构建shRNA表达载体，并导入细胞内，可以长效、特异性的干扰靶基因的表达，实现类似于基因敲除的效果。RNAi技术被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一。该技术已被广泛用于探索基因功能等方面的研究。
经对现有技术的文献检索发现，尚无细胞周期蛋白F基因的RNA干扰序列的有关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种抑制鸡细胞周期蛋白F基因表达的shRNA分子序列。根据Genbank数据库中鸡细胞周期蛋白基因序列以及shRNA的分子序列设计原则，设计多个shRNA分子序列，根据设计经验和设计软件进行评估测定，选择4条最佳的动力学参数靶点进入后续试验流程。根据选择的4个干扰靶点序列设计并合成4个寡聚单链DNA序列。
本发明提供的作用于鸡细胞周期蛋白F基因mRNA的shRNA分子序列，为如下a)或b)或c)或d)：
a)由序列表的序列1所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸；
b)由序列表的序列2所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸；
c)由序列表的序列3所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸；
d)由序列表的序列4所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸。
本发明还保护以上任一所述shRNA序列在抑制鸡细胞的细胞周期蛋白F基因表达中的应用。
所述细胞周期蛋白F基因mRNA可为GenBank Accession Number:XM_415043.4自5’末端第1至3610位碱基序列。
所述细胞具体可为鸡胚睾丸支持细胞，鸡成纤维细胞系(DF-1)。
本发明还保护以上任一所述shRNA在抑制鸡的细胞周期蛋白F基因表达中的应用。
所述细胞周期蛋白F基因mRNA可为GenBank Accession Number:XM_415043.4自5’末端第1至3610位碱基序列。
本发明获得了有效抑制鸡细胞周期蛋白F基因表达的shRNA，在分子生物学上通过实时荧光定量PCR证明它有效的降低了细胞周期蛋白F基因的表达。
附图说明
图1为实施例2中shRNA干扰载体获得的病毒转染鸡胚睾丸支持细胞后细胞周期蛋白F基因荧光定量试验结果。
图2为实施例3中shRNA干扰载体获得的病毒转染鸡胚成纤维细胞后细胞周期蛋白F基因荧光定量试验结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。
实施例1、干扰鸡细胞周期蛋白F基因的shRNA序列的设计、合成、干扰载体构建及病毒收集。
根据NCBI公布的鸡细胞周期蛋白F基因mRNA核苷酸序列设计并化学合成五条shRNA分子，序列如下：
第一条(shRNA-462)：靶向基因462-482位碱基(GCAGAAGTGAATGGATTAAAG)5'-GCAGAAGTGAATGGATTAAAG-TTCAAGAGA-CTTTAATCCATTCACTTCTGCTT-3′(序列1)；
第二条(shRNA-623)：靶向基因623-643位碱基(GCTGGACAAAGCTCAGAAAGG)5'-GCTGGACAAAGCTCAGAAAGG-TTCAAGAGA-CCTTTCTGAGCTTTGTCCAGCTT-3'(序列2)；
第三条(shRNA-938)：靶向基因938-958位碱基(GGTGGCTCAGATGTTTCAAGC)5'-GGTGGCTCAGATGTTTCAAGC-TTCAAGAGAG-CTTGAAACATCTGAGCCACCTT-3'(序列3)；
第四条(shRNA-1817)：靶向基因1817-1837位碱基(GGAAGACAGCACTCAGGATGA)5'-GGAAGACAGCACTCAGGATGA-TTCAAGAGA-TCATCCTGAGTGCTGTCTTCCTT-3'(序列4)；
第五条(shRNA-NC)：不靶向该基因上的任何序列，作为阴性对照序列5'-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-TTCAAGAGA-GAAACGTGACACGTTCGGTGAA-3'(序列5)
其中每条序列中的TTCAAGAGA为loop区序列。
将以上单链寡核苷酸片段溶解后95℃加热5min，放置室温自然冷却20min，形成双链shRNA片段，用载体构建试剂盒将5个双链shRNA片段分别插入到shRNA表达载体pGLV3/H1/GFP+Puro中，室温连接30min，构建5个shRNA表达质粒(即编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒)。将表达质粒转化至感受态细胞DH5α。每个转化平板分别挑取4个克隆，摇菌抽提质粒后进行测序以验证重组克隆中插入片段序列与设计的该核苷酸单链序列一致。三种辅助包装原件载体质粒pGag/Po，pRev和pVSV-G分别进行高纯度无内毒素抽提，与shRNA表达质粒一起，用RNAi-Mate进行共转染人胚肾细胞(293T细胞)，转染后6h更换为完全培养基，培养72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。前四个序列构建的重组病毒质粒得到的病毒滴度分别为1×108TU/mL，第五个为5×108TU/mL，说明五种慢病毒颗粒可以满足后续实验需求。
实施例2、shRNA慢病毒干扰载体获得的病毒颗粒感染鸡胚睾丸支持细胞后，细胞周期蛋白F基因的表达量
分别用实施例1制备的五条shRNA慢病毒干扰载体获得的病毒颗粒对鸡胚睾丸支持细胞进行感染实验，具体步骤如下：
1、取孵化至18天的种蛋，依次用新洁尔灭、75％酒精清洗；
2、无菌获取睾丸，在PBS中漂洗3次，在体视显微镜下剥去血丝及睾丸白膜后PBS洗两次，移入西林瓶中剪碎；
3、加入1mg/mL胶原酶，放入37℃培养箱中消化10min，中间摇晃一次；
4、l000g离心7min，弃上清，加入0.25％胰酶-EDTA消化，至液体浑浊，将上清吸出移入有FBS的培养基中终止消化。
5、用400目滤布过滤入离心管中，l000g离心8min，因子培养基悬浮，计数，以106个/mL细胞密度将细胞接种到75cm2培养瓶中，贴壁40min，弃上清。再次用因子培养基悬浮细胞，贴壁40min，弃上清后加入因子培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
6、转染前一天将鸡胚睾丸支持细胞按1×104个/mL接种于48孔板，培养到良好状态，细胞融合率达到40％-60％时进行慢病毒感染。
7、取出慢病毒，放置冰上至全溶，小离心机瞬离。取五个无菌EP管，分别吸取五种1×108TU/mL的慢病毒与含10％FBS的DMEM培养基以1:19(复感染指数MOI值为5)混合，再以5ug/mL的浓度加入Polybrene，混匀，加入细胞孔。
8、细胞板放回培养箱孵育12-24小时后，移去病毒液，加入新鲜的含10％FBS的DMEM培养基，继续培养。
9、在慢病毒感染后72小时，在荧光显微镜下观察细胞中荧光表达情况，并收集细胞。
10、提取细胞RNA，实时荧光定量PCR进行细胞周期蛋白F基因表达干扰效果检测(不加病毒的细胞作为空白对照)。
结果见图1。结果显示：转染了慢病毒的鸡胚睾丸支持细胞的细胞周期蛋白F基因表达量显著低于对照组；其中shRNA-462，siRNA-938的抑制效果达到了60％以上，shRNA-462的抑制效果最好。在分子水平上证明了本发明的shRNA分子序列可以有效抑制细胞周期蛋白F基因的表达。
实施例3、shRNA慢病毒干扰载体获得的病毒颗粒感染鸡胚成纤维细胞系(DF-1)后，细胞周期蛋白F基因的表达量
用实施例2鉴定出来的高效干扰载体(shRNA-462)的慢病毒对鸡成纤维细胞系(DF-1)进行感染实验，具体步骤如下：
1、取出在液氮中冻存的DF-1细胞，37℃水浴锅速溶，3000g离心3min，加5mL的DMEM培养基吹匀细胞，1000g离心，加含10％FBS的DMEM反复吹匀制成单细胞悬液，以5×105细胞/mL接细胞培养瓶培养，放37℃，CO2培养箱中培养。
2、转染前一天将DF-1按1×104个/mL接种于48孔板，培养到良好状态，细胞融合率达到40％-60％时进行慢病毒感染。
3、取出慢病毒，放置冰上至全溶，小离心机瞬离。取EP管，吸取1×108TU/ml的慢病毒与含10％FBS的DMEM培养基以1:19(MOI值为5)混合，再以5ug/mL的浓度加入Polybrene，混匀，加入细胞孔。
4、细胞板放回培养箱孵育12-24h后，移去病毒液，加入新鲜的10％FBS的DMEM培养基，继续培养。
5、分别在慢病毒感染后24h,48h,72h和96h，在荧光显微镜下观察细胞中荧光表达情况，并收集细胞。
6、提取细胞RNA，实时荧光定量PCR进行细胞周期蛋白F基因表达干扰效果检测(不加病毒的细胞作为空白对照)。
结果见图2。结果显示：在转染后24h,48h,72h和96h，转染了shRNA-462慢病毒干扰载体的DF-1中细胞周期蛋白F基因表达量低于对照组，72h后差异达到显著；shRNA-462的抑制效果在72h后达到了60％以上。在分子水平上证明了本发明的shRNA分子序列可以有效抑制细胞周期蛋白F基因的表达。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种作用于鸡细胞周期蛋白F基因的shRNA分子序列，所述shRNA分子序列的单链寡核苷酸序列为GCAGAAGTGAATGGATTAAAGTTCAAGAGACTTTAATCCATTCACTTCTGCTT。
2.一种如权利要求1所述作用于鸡细胞周期蛋白F基因的shRNA分子序列在抑制鸡细胞的细胞周期蛋白F基因表达中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述细胞周期蛋白F基因为GenBankAccession Number:XM_415043.4自5’末端第1至3610位核苷酸。
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| Cyclin D1 与细胞周期调控;卢梦玲 等;《生物技术通报》;20111231(第10期);55-59 * |
| 公鸡弱精症相关候选基因的表达分析;富丽 等;《畜牧兽医学报》;20150630;第46卷(第6期);摘要，表1 * |
| 靶向细胞周期蛋白E 的shRNA 真核表达载体的构建和鉴定;卓建新,等;《中国肿瘤》;20071231;第16卷(第3期);190-192 * |
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