CN101418285A - 诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基。该培养基是在RPMI1640培养基的基础上添加了1－6％胎牛血清，1－3％B27和0.05－0.15％青－链霉素。该诱导分化方法包括以下步骤：1)将RhoA基因突变体导入卵圆细胞WB－F344，得到高表达RhoA基因活性突变体的WB－F344细胞；2)将高表达活性RhoA基因突变体的WB－F344细胞接种于上述体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的专用培养基中，在37℃、5％CO₂下培养，得到胆管细胞。本发明提供了一条获得胆管细胞的新途径，应用前景广阔。

Description

诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基

技术领域

本发明涉及诱导细胞分化的方法及其专用培养基，特别是涉及一种诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基。

背景技术

WB-F344细胞是一类从Fischer雄鼠肝脏分离出来的细胞，具有许多肝干/祖细胞的特性：1)它具有肝细胞和肝胆管细胞的表型特征；2)当它移植到大鼠的肝脏中后，它能够获得肝细胞的型态和功能特征；3)WB-F344细胞经过化学诱变后移植入大鼠肝脏后能够发展成为胆管癌，表明它具有向胆管细胞分化的潜能，这些特征都说明WB-F344细胞是肝干/祖细胞。有研究发现，丁酸钠处理后的WB-F344细胞具有了胆管细胞的一系列标志，说明WB-F344可在丁酸钠的诱导下向胆管细胞分化。此外，还有研究发现，把WB-F344细胞培养在Matrigel上时，细胞的生长开始停滞，细胞形成管腔样结构，细胞开始收缩并沿管腔结构方向拉伸，细胞的核质比变大。对诱导的细胞进行mRNA和蛋白水平检测发现，胆管细胞的标志如CK19、Yp、aquaporin以及BDS7等的表达量都不同程度的上调。

小G蛋白Rho家族主要的生物学效应是引起肌动蛋白细丝等细胞骨架蛋白重构，从而维持细胞的形态极性，促进细胞的变形、趋化运动和游走，此外，Rho家族成员也参与对细胞周期的调控、细胞应激反应的调节等。在生物发育的过程中，具有多向分化潜能干细胞的定向分化起着决定性作用，它们促成了胚胎发生、神经发生、造血生成、骨生成及肌肉生成等生物学过程，而在这些分化发育的过程中，小G蛋白家族尤其是RhoA蛋白起到至关重要的作用。研究发现，在传统生物学模型果蝇(Drosophila)的胚胎发育过程中，RhoA的缺乏会导致原肠胚形成的受阻，同时细胞失去运动能力；此外，在果蝇的神经发生过程中，神经母细胞的增殖和树突的形成也受到RhoA的调控，当RhoA失活时，果蝇的神经发生受到抑制。Li Wei等在小鼠胚胎的发育过程中，用RhoGDI表达来抑制RhoA的激活，发现RhoA的失活会导致发育7天的小鼠胚胎死亡(Wei L，Imanaka-Yoshida K，Wang L，et al.Inhibition of Rho family GTPases by Rho GDPdissociation inhibitor disrupts cardiac morphogenesis and inhibitscardiomyocyte proliferation.Development，2002，129(7)：1705～1714)；另一方面，在脊椎动物胚胎发育过程中，RhoA的过量表达也会导致胚胎体积的减小甚至胚胎的死亡。在早期胚胎发育的神经发生过程中，轴突的起始与生长、细胞的极化、神经元的再生都受到Cdc42和Rac的调控，此外，RhoA的抑制会阻碍神经系统形成，而RhoA活性的逐步下调引发皮层神经细胞的迁移。同样，在造血系统发育过程中，RhoA也参与了造血干细胞的细胞迁移和运动，抑制RhoA的活性会促进造血干细胞的迁移、粘附和重建研究还发现，在间充质干细胞的分化决定过程中，间充质干细胞与不同的分化细胞如平滑肌细胞和血管内皮细胞接触培养时，会呈现不同的细胞状态，此外，结合间充质干细胞本身的细胞形态、应力等，RhoA蛋白的失活突变会促进间充质干细胞向脂肪细胞分化，相反的大量活性RhoA蛋白则诱导间充质干细胞向肌肉或者成骨细胞分化。Sordella的研究发现小鼠的表皮成纤维细胞能够在p190GAP和RhoA的作用下调控着向成肌肉和脂肪细胞分化(Sordella R，Jiang W，Chen GC，et al.Modulation of RhoGTPase Signaling Regulates a Switch between Adipogenesis and Myogenesis.Cell，2003，113：147-158)。总而言之，在干细胞的分化发育过程中，RhoA在维持着细胞基本运动特性的同时，还对干细胞的自我更新、分化决定以及定向分化过程中起着调控作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便易行的用于体外诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的专用培养基。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：用于体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的专用培养基，是在RPMI1640培养基的基础上添加了1-6％(体积/体积百分比浓度，V/V)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，1-3％(体积/体积百分比浓度，V/V)B27和0.05-0.15％(体积/体积百分比浓度，V/V)青-链霉素。

所述培养基中胎牛血清的含量优选为5％，B27的含量优选为2％，青-链霉素的浓度优选为0.1％。

本发明的第二个目的是提供一种体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的方法。

本发明所提供的体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的方法，包括以下步骤：

1)将RhoA基因活性突变体导入卵圆细胞WB-F344，得到高表达RhoA基因活性突变体的WB-F344细胞；

2)将高表达RhoA基因活性突变体的WB-F344细胞接种于上述体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的专用培养基中，在37℃、5％ CO₂下培养，促使WB-F344细胞向胆管细胞分化并形成管腔样结构，得到胆管细胞。

在上述诱导方法中，步骤1)中的RhoA基因活性突变体命名为RhoA V14，具有序列表中序列1的核苷酸序列，编码序列表中序列2的氨基酸残基序列。

可按照常规方法将RhoA基因活性突变体基因转染WB-F344细胞，如通过含有RhoA基因活性突变体基因的重组真核表达载体或利用慢病毒载体系统等将RhoA基因突变体基因导入WB-F344细胞。

所述利用慢病毒载体系统将RhoA基因活性突变体基因导入WB-F344细胞的方法，可包括以下步骤：

A)将RhoA基因活性突变体基因导入慢病毒载体系统中的目的基因转移载体中，得到携带有RhoA基因活性突变体基因的重组慢病毒载体；

B)将携带有RhoA基因活性突变体基因的重组慢病毒载体与慢病毒载体系统中的两种包装质粒和包膜质粒按4.5-5.5：3.7-4.7：1.5-2.5：2.3-3.3的重量份数比混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有RhoA基因活性突变体基因的重组慢病毒；

C)将携带有RhoA基因活性突变体基因的重组慢病毒转染WB-F344细胞，得到表达RhoA基因活性突变体的WB-F344细胞。

在上述表达RhoA基因活性突变体的WB-F344细胞的构建方法中，所述步骤A)中的慢病毒载体系统中的目的基因转移载体为pBPLV，是将pMA1载体(该载体参考文献(Amendola M，et al.Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectorscarrying synthetic bidirectional promoters.Nat Biotechnol，2005，23(1)：108-116)用限制性内切酶Pst I和Sal I进行双酶切(切除两个酶切位点之间的基因片段)后与正义链为：5’-ggctagcatgctctagagcgctg-3’，反义链为：3’-acgtccgatcgtacgagatctcgcgacagct-5’的多克隆位点序列连接得到。)。

步骤B)中的慢病毒载体系统中的两种包装质粒可为pLP1和pLP2(均可购自Invitrogen公司)，该包装质粒主要起到病毒包装作用，其转录表达后形成病毒衣壳结构蛋白及酶蛋白；包膜质粒可为pLP/VSVG(可购自Invitrogen公司)，该包膜质粒转录表达后形成病毒包膜蛋白；慢病毒包装细胞可为293-FT细胞(可购自Invitrogen公司)。

用上述方法诱导得到的胆管细胞也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基。该方法通过RhoA基因活性突变体及慢病毒载体系统包装形成慢病毒，将RhoA基因活性突变体导入WB-F344细胞，获得高表达活性RhoA基因突变体的WB-F344细胞，再在体外培养的条件下自主分化为胆管细胞并形成管腔样结构。形态学观察、基因和蛋白水平的验证结果表明用本发明的方法及培养基可获得表达有胆管系相关标志CK19、Yp、Aquaporin-1、GGTIV等的胆管细胞。本发明提供了一条获得胆管细胞的新途径，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为RT-PCR扩增的RhoA基因的1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为转染有RhoA V14基因的WB-F344细胞的形态图

图3A为转染有RhoA V14基因的WB-F344细胞中RhoA V14基因表达情况的RT-PCR检测结果

图3B为转染有RhoA V14基因的WB-F344细胞中RhoA V14表达情况的WesternBlotting检测结果

图4为RhoA V14WB-F344细胞分化形成的管腔样结构

图5为分化细胞胆管标志物的RT-PCR和免疫荧光检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别均为常规方法，所用引物均由上海英俊公司合成，所述百分比浓度均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例1、体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞

用本发明的方法体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞，包括以下步骤：

一、携带RhoA V14基因的重组慢病毒载体的构建

离心收集2-3×10⁶293FT细胞，抽提总RNA，用常规方法构建cDNA文库(J·萨姆布鲁克，E·F·弗里奇，T·曼尼阿第斯。分子克隆实验指南第二版，科学出版社，p396-p455)。以cDNA为模板，在PCR引物：F：5’ctgcagatggctgccatccggaagaa3’和R：5’gtcgactcacaagacaaggcaaggcaac3’的引导下，克隆RhoA基因的cDNA，以β-actin基因为对照，反应结束后，对RT-PCR扩增产物进行1％-2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，经扩增获得了594bp的DNA片段，与预期结果相符，然后将该目的片段连接到T-载体pGEM-T(购自Promega公司)上进行测序，测序结果表明获得了序列正确的RhoA基因的cDNA。将测序正确的重组质粒进行pfu点突变(Site-Directed Mutagenesis Kit)，点突变引物为F：5’CTG GTG ATTGTT GGT GAT GTT GCC TGT GGA AAG ACA TGC3’和R：5’GAC CAC TAA CAA CCA CTA CAACGG ACA CCT TTC TGT ACG3’，突变后再次进行测序，测序结果表明获得了序列正确的RhoA基因活性突变体，命名为RhoA V14，具有序列表中序列1的核苷酸序列，编码序列表中序列2的氨基酸残基序列。最后，对携带RhoA V14基因的重组T载体用Pst I和Sal I双酶切，回收并纯化获得的594bp的DNA片段，将其连入经同样酶双酶切的慢病毒载体系统中的目的基因转移载体pBPLV(pBPLV是通过将pMA1载体(该载体参考文献(Amendola M，et al.Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectorscarrying synthetic bidirectional promoters.Nat Biotechnol，2005，23(1)：108-116))用限制性内切酶Pst I和Sal I进行双酶切(切除两个酶切位点之间的基因片段)后与正义链为：5’-ggctagcatgctctagagcgctg-3’，反义链为：3’-acgtccgatcgtacgagatctcgcgacagct-5’的多克隆位点序列连接而得到的新的慢病毒载体)中，对得到的重组慢病毒载体用限制性内切酶Pst I和Sal I进行酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经酶切获得了约594bp的DNA片段，与预期结果相符，表明获得了携带有RhoA V14基因的重组慢病毒载体，将其命名为pBPLV-RhoAV14。

二、通过慢病毒感染转导RhoA V14基因

1、慢病毒的包装

①培养293FT细胞(购自Invitrogen公司)，从不使其生长过度，长至90％汇合即传代，传代超过20代后不应使用。

②制备DNA-Lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)复合物，方法为：在一个无菌的5mL管中，加入1.5mL无血清

 I培养基(购自Gibco公司)，依次加入包装质粒4.2μg pLP1(购自Invitrogen公司)、2μg pLP2(购自Invitrogen公司)、2.8μgpLP/VSVG(购自Invitrogen公司)包膜蛋白质粒和5μg步骤一构建的携带RhoA V14基因慢病毒表达质粒pBPLV-RhoAV14，轻轻混匀。在另一个无菌的5mL管中，将42μl Lipofectamine 2000稀释于1.5mL无血清 I培养基中，轻轻混匀，室温放置5分钟。注意，吸取Lipofectamine 2000前要轻轻混匀。混合以上2管液体，轻轻混匀。室温孵育20分钟以形成DNA-Lipofectamine 2000复合物。

③在DNA-Lipofectamine 2000复合物形成过程中，用胰蛋白酶消化293FT细胞，计数，将细胞重悬于含血清的生长培养基中，使其密度为1.2×10⁶个/mL。注意：培养基中不能含有抗生素。

④将DNA-Lipofectamine 2000复合物加入到含有5mL生长培养基(购自Gibco公司)的10cm细胞培养皿中。注意：培养基中不能含有抗生素。

⑤将5mL293FT细胞悬液(共6×10⁶个细胞)加入到含有DNA-Lipofectamine 2000复合物和生长培养基的10cm细胞培养皿中，轻轻地前后移动培养皿混匀。将细胞置于37℃ CO₂孵箱中过夜培养(10-12小时)。

⑥次日，用10mL包含丙酮酸钠的完全培养基(高糖DMEM，10％胎牛血清，0.1mmol/L非必需氨基酸，2mmol/L L-谷氨酰胺，1％青-链霉素，1mmol/L丙酮酸钠)更换含有DNA-Lipofectamine复合物的培养基。VSVG糖蛋白会使293FT融合形成多核合胞体，这种形态上的改变是正常的，不影响慢病毒的产生。

⑦转染48-72小时后收集上清于15mL无菌离心管中。转染后48小时或72小时收集病毒上清，产量并没有太大差别。注意：此时操作的是有感染性的病毒，请带口罩和手套。

⑧4℃、3,000rpm离心15分钟去除细胞碎片。如果要体内应用，则采用0.45μm滤膜过滤。

⑨如果需要浓缩，可用0.45μm滤膜过滤后，用水平转头如Beckman SW41t转头于4℃、26,000rpm超速离心90分钟收集沉淀；或用Amicon的Centricon-100分子质量截留滤膜4℃、5,000g离心进行浓缩，离心时间越长，病毒原液越浓。

⑩最后，将病毒液分装，冻存于-80℃备用。

2、慢病毒感染WB-F344细胞

将常规培养的WB-F344细胞接种于24孔板中，15,000个细胞/孔，待细胞长至70％丰度时，弃去培养液，加入步骤1获得的病毒毒液，同时每孔补加1-2μl Polybrene(购自Sigma公司)促进病毒的入侵。24小时后弃去毒液，加入RPMI1640完全培养基(购自Gibco公司)进行继续培养，48小时后观察有无绿色荧光的产生(注意：Polybrene在-20℃可储存达1年，在4℃可放置2周，反复冻融不宜超过3次。)。

如图2所示(对照为未转染WB-F344细胞)(比例尺100um)，细胞在转染后48小时发出绿色荧光，细胞收缩呈圆形，核质比升高，证明携带有RhoA V14基因的慢病毒成功将该基因转进WB-F344细胞中。然后，提取转染细胞的mRNA和蛋白，分别进行RT-PCR(引物1为5’CTGCAGATGGCTGCCATCCGGAAGAA3’，引物2为5’GTCGACTCACAAGACAAGGCAAGGCAAC3’)和Western Blotting(一抗为兔源RhoA(119)，购自SANTA CRUZ公司；二抗为TRITC标记的山羊抗兔Ig，购自北京中杉公司)检测，检测结果如图3A和图3B(active RhoA为活性RhoA蛋白量，total RhoA为RhoA全蛋白量)所示，经验证RhoA V14基因在基因和蛋白水平上均高度表达，说明RhoA V14基因细胞已成功地转进WB-F344细胞中，得到高表达活性RhoA基因突变体的WB-F344细胞，命名为RhoA V14WB-F344细胞。

三、将RhoA V14WB-F344细胞分化为胆管细胞并形成管腔样结构

1、诱导分化

分化培养基：在RPMI1640培养基的基础上添加了5％(4-6％均可)胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)，2％(1-3％均可)B27和0.1％(0.05-0.15％均可)青-链霉素。

将高表达活性RhoA基因突变体的WB-F344细胞接种于上述体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的专用培养基中，在37℃、5％ CO₂下培养，促使WB-F344细胞向胆管细胞分化并形成管腔样结构。培养4-7天后，在荧光显微镜下观察细胞形态，结果如图4所示(比例尺100um)，RhoA V14 WB-F344细胞在接种培养后逐渐形成管腔样结构。

2、标志物检测

提取分化细胞(以未诱导分化的WB-F344细胞为对照)的mRNA和蛋白，对胆管系相关标志CK19、Yp、Aquaporin-1、GGT IV分别进行RT-PCR(检测CK19基因的引物为5’-TTGCGCGACAAGATTCTTGG-3’(正向)和5’-CATCTCACTCAGGATCTTGG-3’(反向)，检测Yp基因的引物为5’-TGGAAGGAGGAGGTGGTTAC-3’(正向)和5’-TGTCCCTTCGTCCACTACTG-3’(反向)，检测Aquaporin-1基因的引物为5’-CAGCAGCGACTTTACAGACC-3’(正向)和5’-GGGGACTTTCTAGCACACTC-3’(反向)，检测GGT基因的引物为5’-GGCTTGTTGACCTTGGGCATCTG-3’(正向)和5’-CCAGCACCAGAAACCGATTCTTCAT-3’(反向))和免疫荧光(检测CK19的抗体为鼠源CK19，购自SANTA CRUZ公司和TRITC标记的山羊抗小鼠Ig，购自北京中杉公司)检测，结果如图5所示(图A为RT-PCR检测结果，图B为免疫荧光检测结果，比例尺100um，图a为CK19基因表达分析图，b为Yp基因表达分析图，c为Aquaporin-1基因表达分析图，d为RhoA V14WB-F344细胞形成的管腔样结构，e为该结构上CK19蛋白表达情况的免疫荧光图，f为d图和e图的合并，g为对照细胞形态结构图，h为对照细胞CK19蛋白表达情况，i为g图和h图的合并。)，与阴性对照细胞相比，胆管系相关标志CK19、Yp、Aquaporin-1、GGT IV等在基因和蛋白水平表达量均上调，表明RhoA V14 WB-F344细胞经诱导分化成为胆管细胞。

序列表

<160>2

<210>1

<211>582

<212>DNA

<213>人属人(HomoSapiens)

<400>1

<210>2

<211>193

<212>PRT

<213>人属人(HomoSapiens)

<400>2

Claims (9)

1、用于体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的培养基，是在RPMI1640培养基的基础上添加了1-6％胎牛血清，1-3％B27和0.05-0.15％青-链霉素。

2、根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基中胎牛血清的含量为5％，B27的含量为2％，青-链霉素的浓度为0.1％。

3、一种体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的方法，包括以下步骤：

1)将RhoA基因活性突变体导入卵圆细胞WB-F344，得到高表达RhoA基因活性突变体的WB-F344细胞；

2)将高表达RhoA基因活性突变体的WB-F344细胞接种于权利要求1或2所述体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的专用培养基中，在37℃、5％ CO₂下培养，得到胆管细胞。

4、根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于：所述步骤1)中的RhoA基因活性突变体具有序列表中序列1的核苷酸序列。

5、根据权利要求3或4所述的诱导方法，其特征在于：通过含有RhoA基因活性突变体的重组真核表达载体或利用慢病毒载体系统将RhoA基因活性突变体导入WB-F344细胞。

6、根据权利要求5所述的诱导方法，其特征在于：所述利用慢病毒载体系统将RhoA基因突变体基因导入WB-F344细胞的方法，包括以下步骤：

A)将RhoA基因突变体基因导入慢病毒载体系统中的目的基因转移载体中，得到携带有RhoA基因突变体基因的重组慢病毒载体；

B)将携带有RhoA基因突变体基因的重组慢病毒载体与慢病毒载体系统中的两种包装质粒和包膜质粒按4.5-5.5：3.7-4.7：1.5-2.5：2.3-3.3的重量份数比混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有RhoA基因突变体基因的重组慢病毒；

C)将携带有RhoA基因突变体基因的重组慢病毒转染WB-F344细胞，得到表达RhoA基因突变体的WB-F344细胞。

7、根据权利要求6所述的诱导方法，其特征在于：所述步骤A)中的慢病毒载体系统中的目的基因转移载体为pBPLV。

8、根据权利要求6所述的诱导方法，其特征在于：所述步骤B)中的慢病毒载体系统中的两种包装质粒为pLP1和pLP2；包膜质粒为pLP/VSVG；慢病毒包装细胞为293-FT细胞。

9、用权利要求3-8任一项所述方法诱导得到的胆管细胞。

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