CN101591653A

CN101591653A - 低表达cyp7a1的肝细胞及其构建方法

Info

Publication number: CN101591653A
Application number: CNA2008100974728A
Authority: CN
Inventors: 裴雪涛; 郑吉春; 岳�文; 师伟
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2008-05-27
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2028-05-27
Also published as: CN101591653B

Abstract

本发明公开了低表达CYP7A1的肝细胞及其构建方法。该抑制肝细胞中CYP7A1表达水平的方法是将抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞，肝细胞中CYP7A1的表达水平得到抑制。可利用慢病毒载体系统将抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞。实验证明，用本发明的方法可显著下调肝细胞中CYP7A1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达水平，并可进一步有效降低总胆汁酸的分泌量。本发明低表达CYP7A1的肝细胞及其构建方法可用于生物人工肝支持疗法的基础研究及临床应用中，应用前景广阔。

Description

低表达CYP7A1的肝细胞及其构建方法

技术领域

本发明涉及小干扰RNA及其编码基因与应用，特别是涉及抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA及其编码基因与其在抑制肝细胞中CYP7A1基因表达水平中的应用。

背景技术

由多种原因(病毒、药物、肿瘤和遗传性疾病等)引发的终末期肝病严重威胁到人类的健康。肝移植是目前治疗终末期肝病最为有效的方法，但是受者对移植物的排斥是移植成功的主要障碍。近年来，国内外着重致力于生物人工肝(bioartificial liversystem，BAL)支持疗法的基础研究，以使其短期支持肝脏功能，维持并延长患者生命，帮助患者渡过危险期，提高患者的存活率，从而为肝脏移植赢得宝贵时间。

分泌胆汁酸是肝细胞特有的生理功能，对胆固醇的溶解和食物脂类的消化、吸收具有重要意义。胆汁酸主要在肝细胞内由胆固醇转化而来，具有经典途径和替代途径两种合成途径。大部分胆汁酸由经典途径合成，而胆固醇7α羟化酶(CYP7A1，cholesterol 7αhydroxylase，GenBank号：NM_000780)是肝细胞生物合成胆汁酸经典途径的起始酶，也是关键酶，其表达水平的高低反映了胆汁酸合成的快慢。

生物人工肝(BAL)是专指人工培养的肝细胞为基础构体的体外生物反应系统。生物人工肝在体外与患者循环通路相连，由人工部分(生物反应器)和生物部分(肝细胞)组成。其基本原理是将体外培养的肝细胞置于体外循环装置(生物反应器)中，患者血液(血浆)流过生物反应器时，通过容器内的纤维素半透膜或直接与肝细胞进行物质交换，从而达到人工肝支持肝功能的目的。

在BAL设计中常常忽略了胆汁酸的排除问题，因此胆汁酸只能靠残留的受损肝脏或直接经由血液循环排出。BAL内的肝细胞不断产生胆汁酸盐，它们多数具有与蛋白结合的毒性，从而进一步提高了血中的胆汁酸浓度。

慢病毒(Lentivirus)载体系统具有如下特点：(1)安全，病毒大部分基因被删除或替换，所以病毒不具备自身复制能力，而且因为删除了LTR 3’U3使病毒不能产生病毒RNA，病毒具有自身灭活作用；(2)宿主范围广，由于用VSV-G替代HIV的胞膜糖蛋白，人、鼠等多种属多类型细胞都能高效感染；(3)不仅保留了普通逆转录病毒稳定整合宿主基因组的特点，而且增加了高效感染静止期细胞以及高表达外源蛋白并且能逃避甲基化抑制的特点。慢病毒载体系统的这些特点使得其在分子生物学、细胞生物学等多学科和多领域中均得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种效果显著的抑制肝细胞中CYP7A1表达水平的方法。

本发明所提供的抑制肝细胞中CYP7A1表达水平的方法，是将抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因导入肝细胞，肝细胞中CYP7A1的转录水平得到抑制。

在上述抑制肝细胞中CYP7A1表达水平的方法中，可按照常规方法设计抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA，具体来讲，所述抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA，可为下述双链RNA序列之一：

1)正义链为序列表中的SEQ ID No：1，反义链为序列表中SEQ ID No：2的双链RNA序列；

2)正义链为序列表中的SEQ ID No：3，反义链为序列表中SEQ ID No：4的双链RNA序列

3)正义链为序列表中的SEQ ID No：5，反义链为序列表中SEQ ID No：6的双链RNA序列。

将具有1)的双链RNA序列命名为siRNA1，其反义链与CYP7A1 mRNA(GenBank号：NM_000780)的1083-1101位置序列5’-gaaugaccugccaguauuau-3’互补。序列表中的SEQ ID No：1由20个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中的SEQ ID No：2由20个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

将具有2)的双链RNA序列命名为siRNA2，其反义链与CYP7A1 mRNA的1047-1065位置序列5’-ggaaggcaauccuauuuguu-3’互补。序列表中的SEQ ID No：3由20个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中的SEQ ID No：4由20个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

将具有3)的双链RNA序列命名为siRNA3，其反义链与CYP7A1 mRNA的987-1005位置序列5’-gaaagcagcuacugaagaau-3’互补。序列表中的SEQ ID No：5由20个碱基组成，序列的方向从左至右为5端→3′端；序列表中的SEQ ID No：6由20个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

为获得更高的稳定性和更优越的抑制效果，可将所述抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的3′端双核苷酸悬垂(Bass BL.RNA interference.The short answer.Nature，2001，411：428～429)，以使其较难被核酶降解。

具体来讲，所述抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA分子的编码基因可具有下述1)、2)和3)中至少一个双链核苷酸序列(请确认下述序列)：

1)有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中SEQ ID No：7的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中SEQ ID No：8的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

2)有义链(正义链)具有序列表中SEQ ID No：9的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：9限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID No：10的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：10限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

3)有义链(正义链)具有序列表中SEQ ID No：11的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：11限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID No：12的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

将具有1)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA1，编码siRNA1。序列表中的SEQ ID No：7由55个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中的SEQ ID No：8由59个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

将具有2)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA2，编码siRNA2。序列表中的SEQ ID No：9由55个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中的SEQ ID No：10由59个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

将具有3)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA3，编码siRNA3。序列表中的SEQ ID No：11由55个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中的SEQ ID No：12由59个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

此外，可按照常规方法将抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞，如通过含有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组真核表达载体或利用慢病毒载体系统将抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞。

所述利用慢病毒载体系统将本发明抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞的方法，可包括以下步骤：

A)将抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入慢病毒载体系统中的目的基因转移载体中，得到携带有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒载体；

B)将携带有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒载体与慢病毒载体系统中的两种包装质粒和包膜质粒按4.5-5.5∶3.7-4.7∶1.5-2.5∶2.3-3.3的重量份数比混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒；

C)将携带有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒转染肝细胞，肝细胞中CYP7A1的表达水平得到抑制。

在上述利用慢病毒载体系统将本发明抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞的方法中，步骤A)中慢病毒载体系统中的目的基因转移载体为pSicoR(Andrea Ventura，Alexander Meissner，Tyler Jacks，al et.Cre-lox-regulated conditionalRNA interference from transgenes.PNAS，2004 vol.101 no.28，10380-10385)用限制性内切酶Pst I和Sal I进行双酶切(切除两个酶切位点之间的基因片段)后与正义链为：5’-ggctagcatgctctagagcgctg-3’，反义链为：3’-acgtccgatcgtacgagatctcgcgacagct-5’的多克隆位点序列连接得到。)，优选为慢病毒RNAi干涉载体pSicoR；携带有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒载体可为pSicoR-CYP7A1-1、pSicoR-CYP7A1-2或pSicoR-CYP7A1-3。

步骤B)中的慢病毒载体系统中的两种包装质粒可为pLP1和pLP2(均可购自Invitrogen公司)，该包装质粒主要起到病毒包装作用，其转录表达后形成病毒衣壳结构蛋白及酶蛋白；包膜质粒可为pLP/VSVG(可购自Invitrogen公司)，该包膜质粒转录表达后形成病毒包膜蛋白；慢病毒包装细胞可为293-FT细胞(可购自Invitrogen公司)。

步骤C)中还包括对经携带有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒转染的肝细胞进行流式细胞术分选的步骤，从而得到低表达CYP7A1的肝细胞。

用上述方法得到的低表达CYP7A1的肝细胞也属于本发明的保护范围。

本发明提供了低表达CYP7A1的肝细胞及其构建方法。所述低表达CYP7A1的肝细胞是通过将抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞后得到的。可利用慢病毒载体细胞将所述抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞。实验证明，用本发明的方法可显著下调(knock down)肝细胞中CYP7A1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达水平，并可进一步有效降低总胆汁酸的分泌量，从而改善了肝细胞培养的微环境，提高了肝细胞的生存质量，同时还能较好地维持其生物学功能。此外，用本发明方法获得的低表达CYP7A1的肝细胞进行肝移植，避免了植入患者体内的生物人工肝中肝细胞分泌的胆汁酸对肝细胞本身的毒害作用以及可能造成的其它不良影响。本发明低表达CYP7A1的肝细胞及其构建方法可用于生物人工肝支持疗法的基础研究及临床应用中，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

说明书附图

图1为携带有siDNA1、siDNA2或siDNA3的重组慢病毒RNAi干涉载体的双酶切鉴定结果

图2为慢病毒包装前、后293-FT细胞的荧光显微镜观察结果

图3为经慢病毒感染前、后的L-02细胞的荧光显微镜观察结果

图4为经由携带pSicoR-CYP7A1的慢病毒转染的L-02细胞的流式细胞术分选结果

图5为慢病毒感染前、后的肝细胞的生物学特性基因ALB、AFP、CK18、CK19和CYP1b1 mRNA水平的表达情况的半定量RT-PCR法检测结果

图6为转pSicoR-CYP7A1的L-02与转染空载体pSicoR的L-02肝细胞中CYP7A1基因表达情况的半定量RT-PCR检测结果以及CYP7A1 siRNA干涉效果的实时荧光定量RT-PCR检测结果

图7为转pSicoR-CYP7A1的L-02与转染空载体pSicoR的L-02肝细胞中CYP7A1蛋白表达情况的Western blot检测结果

图8为转pSicoR-CYP7A1的L-02与转染空载体pSicoR的L-02肝细胞的生长曲线

图9为转pSicoR-CYP7A1的L-02与转染空载体pSicoR的L-02肝细胞的总胆汁酸分泌量测定

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

所用引物及DNA序列均由北京奥科生物公司合成。

所述百分比浓度均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

所述各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，而不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的同类生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用；在产业实施中，来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的各种细胞均为离体的，并包括从细胞库中取得、从商业途径购买获得，还包括按照已有文献的介绍制备获得，以及经可以商业获取的多种干细胞用已知方法诱导而来的。

实施例1、低表达CYP7A1的L-02肝细胞的获得

应用RNAi技术及慢病毒载体系统获得低表达CYP7A1的肝细胞(以人肝细胞L-02细胞株为例)，具体方法包括以下步骤：

一、L-02肝细胞的传代扩增

将L-02肝细胞(由军事医学科学院实验血液学实验室惠赠)接种于25cm²培养瓶中，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(购自Sigma公司)在37℃、5％CO₂细胞培养箱内进行平面常规培养，隔天更换培养液，用0.25％(V/V)胰酶消化传代，在相同条件下进行培养。

二、抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的设计

根据GenBank公布的CYP7A1 mRNA序列(NM_000780)以及慢病毒RNAi干涉载体pSicoR的使用要求，用Gene specific siRNA selector软件(http://bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm)设计三对以CYP7A1编码区为靶点的特异性CYP7A1 siRNA序列，分别命名为siRNA1(序列表中序列1和序列2)、siRNA2(序列表中序列3和序列4)和siRNA3(序列表中序列5和序列6)，siRNA1作用于CYP7A1 mRNA的1083-1101位置序列5’-gaaugaccugccaguauuau-3’，siRNA2作用于CYP7A1 mRNA的1047-1065位置序列5’-ggaaggcaauccuauuuguu-3’，siRNA3作用于CYP7A1 mRNA的987-1005位置序列5’-gaaagcagcuacugaagaau-3’。

三、抑制CYP7A1基因表达的慢病毒RNAi干涉载体的构建

1、根据siRNA1、siRNA2和siRNA3所作用的靶序列以及慢病毒RNAi干涉载体pSicoR的使用要求，设计能够产生siRNA1、siRNA2和siRNA3的siDNA序列，分别命名为siDNA1、siDNA2和siDNA3，具体序列如下(下划线碱基序列为针对CYP7A1mRNA的靶序列)：

siDNA1正义链：

5’-tgaatgacctgccagtattattcaagagataatactggcaggtcattcttttttc-3’(序列表中序列7)

siDNA1反义链：

3’-acttactggacggtcataataagttctctattatgaccgtccagtaagaaaaaagagct-5’(序列表中序列8)；

siDNA2正义链：

5’-tggaaggcaatcctatttgtttcaagagaacaaataggattgccttccttttttc-3’(序列表中序列9)

siDNA2反义链：

3’-accttccgttaggataaacaaagttctcttgtttatcctaacggaaggaaaaaagagct-5’(序列表中序列10)；

siDNA3正义链：

5’-tgaaagcagctactgaagaattcaagagattcttcagtagctgctttcttttttc-3’(序列表中序列11)

siDNA3反义链：

3’-actttcgtcgatgacttcttaagttctctaagaactcatcgacgaaagaaaaaagagct-5’(序列表中序列12)。

2、合成步骤1中的三对siDNA序列，然后取正向、反向siDNA寡核苷酸片段(siDNA1、siDNA2或siDNA3)各1μl与48μl退火缓冲液混合，在95℃下温育4min后，再在70℃下温育10min，然后缓慢冷却至室温进行退火；取5μl退火后的siDNA双链寡核苷酸片段加到2μl T4 DNA连接酶缓冲液中，加入1U PNK激酶，在37℃下温育30min后，再在70℃下温育10min进行磷酸化反应；同时用限制性内切酶Hpa I和Xhol I将慢病毒RNAi干涉载体pSicoR(Pro.Tyler Jacks惠赠)线性化；再将线性化的慢病毒RNAi干涉载体pSicoR与磷酸化后的siDNA双链寡核苷酸片段进行连接，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，摇菌扩增并提取质粒，对质粒用限制性内切酶Xhol I和Xbal I进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图1所示(泳道M：DL2000 Marker，泳道1：pSicoR-CYP7A1-1双酶切产物，泳道2：pSicoR-CYP7A1-2双酶切产物，泳道3：pSicoR-CYP7A1-3双酶切产物，泳道4：pSicoR空载体双酶切产物)，经酶切获得400bp和350bp DNA片段的为阳性质粒，然后对经初筛获得的阳性质粒用测序的方法做进一步鉴定，结果获得了插入序列及位置均正确的携带有siDNA1、siDNA2或siDNA3的重组慢病毒RNAi干涉载体，分别命名为pSicoR-CYP7A1-1、pSicoR-CYP7A1-2和pSicoR-CYP7A1-3(统称为pSicoR-CYP7A1)。

四、慢病毒的包装

培养293-FT(购自Invitrogen公司)慢病毒包装细胞，培养基为添加10％FBS，0.1mmol/L NEAA，2mmol/L L-谷氨酰胺，1％青-链霉素，500μg/mL G418的高糖DMEM培养基(Sigma公司产品，Cat#D5648)。用步骤三构建的携带有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒RNAi干涉载体pSicoR-CYP7A1-1、pSicoR-CYP7A1-2或pSicoR-CYP7A1-3以及空载体pSicoR(对照)分别和包装质粒pLP1(购自Invitrogen公司)、pLP2(购自Invitrogen公司)及包膜蛋白质粒pLP/VSVG(购自Invitrogen公司)按5ug∶4.2ug∶2ug∶2.8ug的比例混合后加入1.5mL无血清Opti-

I培养基(购自Invitrogen公司)中，轻轻混匀，在另一个无菌的5mL管中将42uL lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)稀释于1.5mL的无血清Opti-

I培养基中，室温静置5分钟，混合以上两种液体，室温孵育20分钟以形成DNA-lipofectamine 2000复合物。用0.25％胰酶(Gibco公司产品，Cat#25200-056)消化收集培养的293-FT细胞，计数约6×10⁶个细胞，将其重悬到5mL不含抗生素的生长培养基(在高糖DMEM培养基(Sigma公司产品，Cat#D5648)的基础上添加10％胎牛血清(FBS)(Biochrom公司产品，cat#S0115)，0.1mmol/L非必需氨基酸(Non-Essential Amino Acids，NEAA)(购自HyClone公司)和2mmol/L L-谷氨酰胺)中，再将293-FT包装细胞悬液与3mL含有DNA-lipofectamine 2000复合物的培养基混匀后加入到含有5mL不含抗生素的生长培养基的10cm细胞培养皿中，混匀，放于37℃、5％CO₂孵箱中培养，次日用含有1mmol/L丙酮酸钠的完全培养基(在高糖DMEM培养基的基础上添加10％胎牛血清，0.1mmol/L非必需氨基酸，2mmol/L L-谷氨酰胺，1％青-链霉素和1mmol/L丙酮酸钠)更换含有DNA-lipofectamine 2000复合物的培养基进行包装，并分别在包装24、48、36、72小时后取样，对经包装的293-FT细胞在荧光显微镜下进行观察，结果如图2所示((a)为包装前的293-FT细胞，(b)为经慢病毒包装后48-72小时的293-FT细胞(200×))，包装24小时后即可见到293-FT细胞内有绿色荧光蛋白GFP表达(GFP基因为慢病毒RNAi干涉载体pSicoR携带)，表达绿色荧光蛋白GFP的细胞超过95％，表明包装效率很高，且伴随着包膜质粒pLP/VSVG中VSVG基因的表达，逐渐出现293-FT细胞的多细胞合胞体，包装72小时后培养上清为淡黄色，此时收集病毒液上清于15mL的无菌离心管中，4℃、3000rpm离心15min去除细胞碎片，将四种病毒上清冻存于-70℃备用。

五、慢病毒感染人肝细胞(L-02)和感染后肝细胞(L-02)的流式细胞术分选

病毒感染前一天，于六孔板中接种L-02细胞至细胞密度为3×10⁵细胞/孔，感染时，每孔加入1mL步骤四获得的病毒上清和终浓度为8μg/mL的聚凝胺(polybrene，购自Sigma公司，可促进病毒的转染效率)，晃动培养瓶使病毒液能接触到所有细胞，3小时后加入3mL L-02细胞培养基(RPMI1640培养基(Sigma公司产品，Cat#D0547)按1∶1体积比混合后加入体积百分浓度为10％的胎牛血清(Biochrom公司产品，cat#S0115)，再过3小时，更换新的培养基。在荧光显微镜下观测慢病毒感染前、后的L-02细胞，结果如图3所示((a)为未转染的L-02细胞，(b)为由携带pSicoR空载体的慢病毒转染的L-02细胞，(c)为由携带pSicoR-CYP7A1的慢病毒转染的L-02细胞(100×))，显微镜观察结果表明本发明的慢病毒可高效率地转染L-02细胞，再将转染后的细胞通过流式细胞术(FACS)进行分选，结果如图4所示((a)为光学显微镜下由携带pSicoR-CYP7A1的慢病毒转染的L-02细胞中GFP的表达情况，(b)为荧光显微镜下由携带pSicoR-CYP7A1的慢病毒转染的L-02细胞中GFP的表达情况，(c)为a和b的叠加(100×)，(d)为流式细胞术分选结果)，将感染有携带siDNA1、siDNA2或siDNA3的重组慢病毒RNAi干涉载体pSicoR-CYP7A1和慢病毒RNAi干涉载体pSicoR空载体的L-02细胞分别命名为L-02/CYP7A1(将感染有携带siDNA1的重组慢病毒RNAi干涉载体pSicoR-CYP7A1-1的L-02细胞命名为L-02/CYP7A1-1，将感染有携带siDNA2的重组慢病毒RNAi干涉载体pSicoR-CYP7A1-2的L-02细胞命名为L-02/CYP7A1-2，将感染有携带siDNA3的重组慢病毒RNAi干涉载体pSicoR-CYP7A1-3的L-02细胞命名为L-02/CYP7A1-3)和L-02/pSicoR。

实施例2、半定量RT-PCR法检测慢病毒感染前、后的肝细胞的生物学特性基因mRNA水平的表达情况

用半定量RT-PCR法检测实施例1获得的慢病毒感染前、后的L-02肝细胞的生物学特性基因ALB、AFP、ck18、ck19和CYP1b1 mRNA水平的表达情况，具体方法为：提取正常L-02肝细胞和转染慢病毒干涉载体pSicoR-CYP7A1的肝细胞(包括L-02/CYP7A1-1、L-02/CYP7A1-2和L-02/CYP7A1-3)的总RNA并以此为模板，在表1所示的各引物对的引导下进行RT-PCR检测(退火温度见表1)，同时用β-actin基因作为内参(所用正向引物序列为：5’-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3’，反向引物序列为：5’-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3’)。检测结果如图5所示((a)为pSicoR-CYP7A1转染组，(b)为未转染组)，慢病毒干涉载体pSicoR-CYP7A1转染前、后的肝细胞中ALB、ck18和CYP1b1基因均获得表达，而AFP和ck19基因均不表达，表明慢病毒感染前、后的人肝细胞的生物学性状没有改变，本发明携带pSicoR-CYP7A1的慢病毒具有较高的安全性和稳定性。

表1 半定量RT-PCR法检测ALB、AFP、ck18、ck19和CYP1b1 mRNA水平表达情况的引物序列及最佳退火温度

实施例3、半定量RT-PCR法和实时荧光定量RT-PCR法检测慢病毒感染前、后肝细胞中CYP7A1基因的表达情况

分别取实施例1中经分选获得的1×10⁶个L-02/CYP7A1(L-02/CYP7A1-1、L-02/CYP7A1-2和L-02/CYP7A1-3各1×10⁶个)和L-02/pSicoR，提取细胞总RNA后，用RT-PCR法检测CYP7A1基因在mRNA水平的表达情况(所用引物为P1：

5’-CCGATGGATGGAAATACCAC-3’，P2：5’-TTTCATTGCTTCTGGGTTCC-3’，扩增片段长度为391bp)，同时用β-actin基因作为内参(所用正向引物序列为：5’-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3’，反向引物序列为：5’-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3’)，退火温度均为57℃。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图6中的图(a)和(b)所示((a)CYP7A1基因的表达情况，(b)β-actin基因的表达情况；图(a)和(b)中，1：未转染组；2：pSicoR空载体转染组；3：pSicoR-CYP7A1转染组)，L-02/CYP7A1与L-02/pSicoR中的β-actin基因均可在mRNA水平上获得表达，而L-02/CYP7A1的CYP7A1基因在mRNA水平上比阴性对照L-02/pSicoR的表达水平低，表明CYP7A1基因在L-02/CYP7A1中获得低表达。为进一步验证pSicoR-CYP7A1质粒的RNAi干涉效果，以上述获得的不同组细胞的RNA经反转录得到的cDNA作为模板，进行以β-actin为内参照的CYP7A1基因相对表达量的实时荧光定量PCR检测，反应在Bio-Rad荧光定量PCR仪上运行，用SYBR Green染料分析，表达量最高的细胞样品设为100％，比较Ct值计算相对含量。实时荧光定量PCR检测结果如图6中的图(c)所示(纵坐标为CYP7A1基因的相对表达量；normal：未转染组，pSicoR：pSicoR空载体转染组，siRNA1：pSicoR-CYP7A1-1转染组；^*P＞0.05，^**P＜0.05)，转染慢病毒干涉载体pSicoR-CYP7A1-1的L-02细胞中CYP7A1基因的相对表达量受到明显抑制，与对照组相比，转染慢病毒干涉载体pSicoR-CYP7A1-1的肝细胞中CYP7A1基因的相对表达量仅为正常肝细胞相对表达量的38.08％，即干涉效率为61.92％，为转染pSicoR空载体的肝细胞相对表达量的44.81％，干涉效率为55.19％，均具有显著差异(P＜0.05)，此外，pSicoR-CYP7A1-2转染组干涉效率，干涉效率仅为20.16％(相对于正常肝细胞)，pSicoR-CYP7A1-3转染组(因测序不正确，放弃了)。

上述检测结果证明利用本发明的小干扰RNA及慢病毒载体系统可有效地抑制肝细胞中CYP7A1基因的表达水平。

实施例4、Western blot法检测慢病毒感染前、后肝细胞中CYP7A1蛋白的表达情况

分别取实施例1中经分选获得的1×10⁶个L-02/CYP7A1-1和L-02/pSicoR，L-02细胞，用放射性免疫沉淀裂解缓冲液RIPA(50mmol/L Tris·HCl(pH8.0)，150mmol/LNaCl，1mmol/L DTT，0.5mmol/L EDTA，1.0％NP40，0.5％去氧胆酸钠，0.1％SDS，100μg/mL PMSF，1μg/mL胰蛋白酶肽，2μg/mL亮抑制肽，100μmol/L正钒酸钠。)裂解细胞，然后对裂解细胞进行不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再用半干式电转的方法将蛋白质转移至PVDF膜，接着用5％脱脂奶粉封闭2小时，再与相应的一抗(一抗为山羊抗人CYP7A1多克隆抗体，购自Santa Cruz公司，Cat#：sc-14426)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗山羊二抗(购自中杉金桥公司)孵育后，用化学发光试剂(购自Santa Cruz公司，Cat#：SC-2048)于暗室自显影，同样用β-actin蛋白作为内参(β-actin，购自Santa Cruz公司产品，Cat#：sc-1616-R；辣根过氧化酶标记的兔抗山羊二抗IgG抗体购自中杉金桥公司)。Western blot检测结果如图7所示(1：未转染组；2：pSicoR空载体转染组；3：pSicoR-CYP7A1-1转染组)，作为对照组的未转染的L-02细胞与转染pSicoR空载体的L-02细胞中的CYP7A1基因均在蛋白水平上获得表达，而转染慢病毒干涉载体pSicoR-CYP7A1-1的L-02细胞(L-02/CYP7A1-1)中的CYP7A1基因在蛋白水平上的表达量受到明显抑制。上述检测结果进一步证明利用本发明的小干扰RNA及慢病毒载体系统可有效地抑制肝细胞中CYP7A1基因的表达水平。

实施例5、L-02/CYP7A1-1、L-02/pSicoR和L-02生长曲线的绘制与总胆汁酸分泌量测定

取实施例1中经分选获得的L-02/CYP7A1-1和L-02/pSicoR和L-02细胞，以每孔10⁴个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μl，每块板接种两列，每列6孔(第一列用作生长曲线，第二列用作胆汁酸测定)共8块板。接种后，将培养板放入37℃、5％CO₂孵箱中进行培养，待细胞贴壁后取一个培养板，每孔加入cck-8溶液(购自Dojindo laboratories)，10μl，继续在孵箱中孵育1小时，然后选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值，共测3次，记录结果，作为第0天数据；同时，第二列每孔每天定点收集细胞上清200μ检测总胆汁酸分泌情况。以后每隔24小时取出一个培养板，用相同方法进行比色，最后以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制生长曲线，如图8所示(normal：未转染组，pSicoR：pSicoR空载体转染组，siRNA1：pSicoR-CYP7A1-1转染组)，L-02和L-02/pSicoR两组的细胞数量逐渐增长，由图8可以看出，作为对照组的转染前的肝细胞和转染pSicoR空载体的肝细胞数量随着时间的推移，第0-4天呈对数期生长，4-5天进入平台期，5-7天细胞数量急剧下降；与此对应的总胆汁酸分泌量(TBA)也是先增加，后逐渐下降，如图9所示(normal：未转染组，pSicoR：pSicoR空载体转染组，siRNA1：pSicoR-CYP7A1-1转染组)，随着细胞数量的增加，总胆汁酸分泌量也增加，而总胆汁酸分泌量增加到一定程度后，可能是由于胆汁酸对肝细胞的损害而致，细胞数量迅速下降，因而又引起总胆汁酸分泌量的减少。相对于前两者，转染pSicoR-CYP7A1-1第0-4天先增殖，4-7天缓慢下降，与之对应的总胆汁酸分泌量较未转染组和pSicoR空载体转染组明显减少。上述检测结果表明利用本发明的小干扰RNA及慢病毒载体系统可有效地抑制肝细胞中CYP7A1的表达水平，从而可有效降低肝细胞的胆汁酸分泌量。

序列表

<160>12

<210>1

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gaaugaccug ccaguauuau 20

<210>2

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

auaauacugg caggucauuc 20

<210>3

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ggaaggcaau ccuauuuguu 20

<210>4

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

aacaaauagg auugccuucc 20

<210>5

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gaaagcagcu acugaagaau 20

<210>6

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

auucuucagu agcugcuuuc 20

<210>7

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

tgaatgacct gccagtatta ttcaagagat aatactggca ggtcattctt ttttc 55

<210>8

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

acttactgga cggtcataat aagttctcta ttatgaccgt ccagtaagaa aaaagagct 59

<210>9

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

tggaaggcaa tcctatttgt ttcaagagaa caaataggat tgccttcctt ttttc 55

<210>10

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

accttccgtt aggataaaca aagttctctt gtttatccta acggaaggaa aaaagagct 59

<210>11

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

tgaaagcagc tactgaagaa ttcaagagat tcttcagtag ctgctttctt ttttc 55

<210>12

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

actttcgtcg atgacttctt aagttctcta agaactcatc gacgaaagaa aaaagagct 59

Claims

1、一种抑制肝细胞中CYP7A1表达水平的方法，是将抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞，肝细胞中CYP7A1的表达水平得到抑制。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA，是下述双链RNA序列之一：

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的3′端双核苷酸是悬垂的。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因具有下述1)、2)和3)中至少一个双链核苷酸序列：

1)有义链具有序列表中SEQ ID No：7的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ IDNo：8的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

2)有义链具有序列表中SEQ ID No：9的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：9限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ IDNo：10的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：10限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

3)有义链具有序列表中SEQ ID No：11的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：11限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQID No：12的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：通过含有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组真核表达载体或利用慢病毒载体系统将抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述利用慢病毒载体系统将抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA的编码基因导入肝细胞的方法，包括以下步骤：

7、根据为要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤A)中慢病毒载体系统中的目的基因转移载体为慢病毒RNAi干涉载体pSicoR；步骤B)中的慢病毒载体系统中的两种包装质粒为pLP1和pLP2，包膜质粒为pLP/VSVG，慢病毒包装细胞为293-FT细胞。

8、根据为要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤A)中携带有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒载体为pSicoR-CYP7A1-1。

9、根据为要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤C)中还包括对经携带有抑制CYP7A1基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒转染的肝细胞进行流式分选的步骤。

10、用权利要求1-9任一项所述方法得到的低表达CYP7A1的肝细胞。