CN111630154A

CN111630154A - 加强成纤维细胞再生活性

Info

Publication number: CN111630154A
Application number: CN201880086500.8A
Authority: CN
Inventors: P·奥希伦; T·伊奇姆
Original assignee: Figene LLC
Current assignee: Figene LLC
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2020-09-04
Also published as: JP2024020371A; EP4249586A3; US20210180020A1; US11959102B2; JP2021506303A; EP3727319A1; ES2965702T3; CA3085984A1; AU2018388979A1; EP3727319A4; EP3727319B1; JP7386162B2; WO2019125996A1; EP4249586A2

Abstract

本公开内容的实施方案包括使用制备的成纤维细胞和/或来自其的条件培养基的方法和组合物。在特定实施方案中，所制备的成纤维细胞具有增强的再生能力并且可以具有一种或多种细胞因子和/或生长因子的分泌增加；可以具有抗凋亡活性的增加；和/或可以具有调节的免疫原性。在具体的实施方案中，通过暴露于低氧和/或一氧化碳来制备成纤维细胞。

Description

加强成纤维细胞再生活性

技术领域

本公开内容的实施方案至少涉及细胞生物学、分子生物学、生物化学、细胞疗法和医学领域。

背景技术

成纤维细胞的主要功能之一是通过连续分泌细胞外基质的前体来维持结缔组织的结构完整性。成纤维细胞分泌细胞外基质所有组分的前体，主要是基质以及各种纤维或结构蛋白。它们还分泌影响和协调邻近细胞的功能和产物以增强组织应答的小分子量扩散因子。细胞外基质的组成显著地决定了结缔组织的物理特性。成纤维细胞参与体内的许多过程。伤口愈合是一个复杂的过程，其需要联合激活包括成纤维细胞活性调节在内的多个过程。在伤口愈合过程期间，真皮成纤维细胞迁移到伤口床，在那里伤口细胞分泌的转化生长因子-1基质分子(例如，纤连蛋白剪接变体)和机械提示(即，基质张力)起始它们分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞能与真皮成纤维细胞区分开，因为它们表达平滑肌α-肌动蛋白，包含成束的收缩性微丝，并且具有广泛的细胞与基质附着位点。肌成纤维细胞合成、沉积并重塑细胞外基质以形成肉芽组织，并从而使伤口收缩。在愈合过程期间形成的结缔组织通常在性质上是纤维性的，并且通常通过称为纤维化的过程形成结缔组织疤痕。本领域已知使用自体成纤维细胞(即从供体获得的成纤维细胞，供体也将是培养的成纤维细胞的受体)治疗的方法。这种成纤维细胞的已知用途中有通过施用培养的成纤维细胞来促进伤口(例如，上皮伤口或瘘管)愈合的方法，通过加强声带缺陷附近的组织进行矫正手术方法；以及治疗声带结疤和修复皮肤和软组织缺陷的方法。尽管在再生医学中利用成纤维细胞的可能性很多，但是目前限制成纤维细胞治疗应用的因素是缺乏优化成纤维细胞的再生活性的手段。本公开内容提供了针对该需求的解决方案。

发明内容

本公开内容的实施方案包括针对成纤维细胞的制备的方法和组合物，使得它们具有一种或多种在未如此制备的成纤维细胞中缺乏的属性。在特定实施方案中，将成纤维细胞制备为具有增强的再生特性。在具体的实施方案中，成纤维细胞具有一种或多种细胞因子和/或一种或多种生长因子的分泌增加，它们具有抗凋亡活性的增加，和/或成纤维细胞的免疫原性得到调节。在具体的实施方案中，将成纤维细胞暴露于足够水平的低氧和/或一氧化碳，使得成纤维细胞的再生能力与未相似地暴露于足够水平的低氧和/或一氧化碳的成纤维细胞相比得到增强。

在一些实施方案中，将成纤维细胞和/或从其条件化的培养基提供给有此需要的个体。在具体的实施方案中，所述个体患有医疗病况，需要在医疗病况之后补充细胞或组织，包括在某些情况下在局部位点。条件培养基可以包含一种或多种生长因子、一种或多种细胞因子、一种或多种肽、一种或多种蛋白质和/或其组合。

本公开内容的实施方案包括增强多个成纤维细胞的治疗活性的方法，其包括向成纤维细胞提供有效量的一种或多种试剂和/或一种或多种条件的步骤，所述试剂和/或条件包括刺激成纤维细胞中的天然血红素加氧酶(HO)-1表达，将成纤维细胞暴露于外源提供的HO-1，和/或由外源提供的载体在成纤维细胞中表达HO-1。在具体的实施方案中，治疗活性包括成纤维细胞的再生活性。成纤维细胞可以具有一种或多种细胞因子和/或一种或多种生长因子的分泌增加；成纤维细胞可以具有抗凋亡活性增加；和/或成纤维细胞的免疫原性得到调节，例如降低或增加。在特定实施方案中，一种或多种试剂和/或条件包括低氧、一氧化碳或其组合。可以在低氧后将一氧化碳提供给成纤维细胞。可以在低氧的同时将一氧化碳提供给成纤维细胞。

在特定实施方案中，将有效量的成纤维细胞和/或来自其的条件培养基提供给个体。所述个体可以患有医学病况，成纤维细胞和/或来自其的条件培养基对所述医学病况是治疗性的，例如，使得改善至少一种症状。在具体的实施方案中，所述医学病况是自身免疫性疾病、退行性疾病、炎性疾病和/或纤维化疾病。所述条件培养基可以包含一种或多种生长因子和/或一种或多种细胞因子。例如，低氧可以是0.1％-10％、0.1％-5％、0.1％-2.5％或0.1％-1％的氧气。在具体的实施方案中，低氧发生至少或不超过30分钟至3天的一段时间，尽管在某些情况下可以少于30分钟或大于3天。可以将成纤维细胞在暴露于低氧、一氧化碳或其组合之前和/或期间暴露于一种或多种生长因子。

在一个实施方案中是制备成纤维细胞的方法，其包括将成纤维细胞暴露于有效量的低氧、一氧化碳或两者的步骤。在一个具体的实施方案中，将成纤维细胞同时暴露于低氧和一氧化碳。在具体的实施方案中，将成纤维细胞在不同时间暴露于低氧和一氧化碳。在某些情况下，将成纤维细胞在暴露于一氧化碳之前暴露于低氧。在特定情况下，将有效量的成纤维细胞和/或来自其的条件培养基提供给需要其的个体。所述个体可以患有自身免疫性疾病、退行性疾病、炎性疾病和/或纤维化疾病。

前述内容已经相当广泛地概述了本公开内容的特征和技术优点，以便可以更好地理解下面的详细描述。在下文中将描述形成本文权利要求的主题的附加特征和优点。本领域技术人员应当理解，所公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修饰或设计用于进行本设计的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，这样的等效结构不脱离所附权利要求书中阐述的精神和范围。当结合附图考虑时，从以下描述中将更好地理解被认为是本文公开的设计的特征的新颖特征，关于组织和操作方法，以及另外的目的和优点。但是，应当明确地理解，提供每个附图仅出于示例说明和描述的目的并且不旨在作为对本公开内容的限制的定义。

附图说明

为了更全面地理解本公开内容，现在参考结合附图的以下描述，其中：

图1显示了通过用低氧、一氧化碳、或低氧后一氧化碳培养成纤维细胞来刺激VEGF产生。

图2显示了通过用低氧、一氧化碳、或低氧同时一氧化碳培养成纤维细胞来刺激VEGF产生。

发明详述

如本文的说明书中所使用的，“a”或“an”可表示一个或多个。如在本文的权利要求书中所使用的，当与单词“comprising”结合使用时，单词“a”或“an”可以表示一个或多于一个。如本文所使用的，“另一”可以表示至少第二或更多。在具体的实施方案中，例如，本公开内容的方面可以“基本上由本公开内容的一个或多个序列组成”或“由本公开内容的一个或多个序列组成”。本公开内容的一些实施方案可以由本公开内容的一个或多个元素、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成。预期能够相对于本文描述的任何其他方法或组合物实施本文描述的任何方法或组合物。可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物采用在本公开内容的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方案。因此，关于一种方法或组合物的实施方案也可以应用于本公开内容的其他方法和组合物。

本公开内容至少涉及细胞疗法领域，更具体地，本公开内容涉及通过在特定培养条件下进行培养以增强成纤维细胞自身的再生活性来加强成纤维细胞再生活性。本公开内容进一步涉及修饰一种或多种细胞培养条件以诱导能够增加成纤维细胞的治疗活性的细胞程序。在一些实施方案中，如本文使用的术语“再生活性”定义为从头生成细胞和组织的能力。

在某些实施方案中是通过向成纤维细胞提供有效量的增强一种或多种活性(例如对于成纤维细胞的再生活性)的一种或多种试剂或条件来增强多个成纤维细胞的一种或多种治疗活性的方法。与没有被修饰的情况下的活性相比具有更高的再生活性的经修饰的成纤维细胞然后可以用于多种目的，例如细胞的治疗用途，包括在哺乳动物中，例如人、狗、猫、马、奶牛等等。

I.成纤维细胞、其修饰和生产方法

公开了与增强成纤维细胞的治疗活性在于再生能力有关的方法和组合物。在具体的实施方案中，通过一种或多种试剂和/或条件刺激血红素加氧酶(HO)-1表达来增强成纤维细胞，并且刺激可以是直接的或可以不是直接的。这种增强可以通过以下发生：(1)将成纤维细胞暴露于增加HO-1的内源表达的一种或多种试剂和/或条件；(2)将成纤维细胞暴露于外源提供的HO-1；和/或(3)将成纤维细胞暴露于外源提供的HO-1，例如，当来自外源提供的表达HO-1的载体在成纤维细胞中表达HO-1时。在具体的实施方案中，所述一种或多种试剂包括一氧化碳(CO)、低氧或其组合。在某些实施方案中，当将CO和低氧两者提供给成纤维细胞时，它们暴露的顺序是特定的。在某些情况下，将它们同时提供给成纤维细胞，而在其他情况下，将它们在不同时间提供给成纤维细胞，并且在某些情况下，将它们两者在分开的时间和同时提供给细胞。在某些情况下，在低氧之前将CO提供给成纤维细胞，而在其他情况下，在低氧之后将CO提供给成纤维细胞。

在一些实施方案中是处理成纤维细胞以增强它们的再生活性的方法，其包括以下步骤：a)任选地获得成纤维细胞群体(例如，成纤维细胞可以由另一方获得或从储藏获得或商购获得)；b)通过暴露于低氧足够长的时间来引发成纤维细胞群体，例如以诱导低氧诱导因子(HIF)-1α的上调；和c)任选地在暴露于低氧之后，以足够的浓度和一段时间用CO处理成纤维细胞以诱导HO-1的上调。

在特定实施方案中，通过本文涵盖的方法增强成纤维细胞在于其以下活性：细胞因子分泌、抗凋亡特性的上调和/或免疫原性的调节。在具体的实施方案中，再生活性包括一种或多种细胞因子的产生增强，例如选自以下的细胞因子：a)成纤维细胞生长因子(FGF)-1；b)FGF-2；c)FGF-5；d)FGF-12；e)IL-10；f)白血病抑制因子；f)胰岛素生长因子；g)表皮生长因子；h)血管内皮生长因子(VEGF)；和i)其组合。

尽管所述再生活性可以是任何种类，但是在具体的实施方案中再生活性包括成纤维细胞分化成任何其他类型的细胞，包括至少分化成软骨细胞；脂肪细胞和/或骨细胞的能力。

在一些实施方案中，再生活性包括成纤维细胞产生对任何类型的细胞(包括至少成纤维细胞；间充质干细胞；脊索细胞和/或软骨祖细胞)是促有丝分裂的条件培养基的能力。

在特定实施方案中，成纤维细胞在暴露于一种或多种特定条件之后具有增强的再生活性，包括一定的一段时间的条件或其他参数形式的条件的暴露。在具体的实施方案中，成纤维细胞暴露于低氧环境。例如，在低氧环境中的成纤维细胞的孵育可以在至少或不超过0.1％-10％的氧气的条件下进行；例如，0.1％-9％；0.1％-8％；0.1％-7％；0.1％-6％；0.1％-5％；0.1％-4％；0.1％-3％；0.1％-2％；0.1％-1％；0.1％-0.75％；0.1％-0.5％；0.25％-10％；0.25％-9％；0.25％-8％；0.25％-7％；0.25％-6％；0.25％-5％；0.25％-4％；0.25％-3％；0.25％-2％；0.25％-1％；0.25％-0.75％；0.25％-0.5％；0.5％-10％；0.5％-9％；0.5％-8％；0.5％-7％；0.5％-6％；0.5％-5％；0.5％-4％；0.5％-3％；0.5％-2％；0.5％-1％；0.5％-0.75％；0.75％-10％；0.75％-9％；0.75％-8％；0.75％-7％；0.75％-6％；0.75％-5％；0.75％-4％；0.75％-3％；0.75％-2％；0.75％-1％；1％-9％；1％-8％；1％-7％；1％-6％；1％-5％；1％-4％；1％-3％；1％-2％；2％-9％；2％-8％；2％-7％；2％-6％；2％-5％；2％-4％；2％-3％；3％-9％；3％-8％；3％-7％；3％-6％；3％-5％；3％-4％；4％-9％；4％-8％；4％-7％；4％-6％；4％-5％；5％-9％；5％-8％；5％-7％；5％-6％；6％-9％；6％-8％；6％-7％；7％-9％；7％-8％；或8％-9％，0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1.0％，1.25％，1.5％，1.75％，2.0％，2.25％，2.5％，2.75％，3％，3.25％，3.5％，3.75％，4.0％，4.25％，4.5％，4.75％，5％，5.25％，5.5％，5.75％，6％，6.25％，6.5％，6.75％，7.25％，7.5％，7.75％，8％，8.25％，8.5％，8.75％，9％或10％。

在某些情况下，将成纤维细胞暴露于低氧环境发生一定的一段时间，并且该时间可以是连续的或也可以是不连续的。在具体的实施方案中，在低氧环境中成纤维细胞的孵育发生一定的一段时间，例如，至少或不超过30分钟(min)-3天；例如，30min-2天；30min-1天；30min-18小时(hrs)；30min-12hrs；30min-8hrs；30min-6hrs；30min-4hrs；30min-2hrs；30min-1hr；45min-3天；45min-2天；45min-1天；45min-18hrs；45min-12hrs；45min-8hrs；45min-6hrs；45min-4hrs；45min-2hrs；45min-1hr；60min-3天；60min-2天；60min-1天；60分-18hrs；60min-12hrs；60min-8hrs；60min-6hrs；60min-4hrs；60min-2hrs；60min-1hr；2hrs-3天；2hrs-2天；2hrs-1天；2hrs-18hrs；2hrs-12hrs；2hrs-8hrs；2hrs-6hrs；2hrs-4hrs；2hrs-3hrs；6hrs-3天；6hrs-2天；6hrs-1天；6hrs-18hrs；6hrs-12hrs；6hrs-8hrs；8hrs-3天；8hrs-2天；8hrs-1天；8hrs-18hrs；8hrs-12hrs；8hrs-10hrs；12hrs-3天；12hrs-2天；12hrs-1天；12hrs-18hrs；18hrs-3天；18hrs-2天；18hrs-1天；1天-3天；或2天-3天。在特定实施方案中，这样的孵育发生例如1-8；1-7；1-6；1-5；1-4；1-3；1-2；2-8；2-7；2-6；2-5；2-4；2-3；3-8；3-7；3-6；3-5；3-4；4-8；4-7；4-6；4-5；5-8；5-7；5-6；6-8；6-7；或7-8小时。

在某些实施方案中，将成纤维细胞暴露于一定水平的CO。在特定实施方案中，成纤维细胞与CO的孵育在至少或不超过百万分之(parts per million,ppm)1-500的浓度进行；例如，1-400ppm；1-300ppm；1-250ppm；1-200ppm；1-175ppm；1-150ppm；1-125ppm；1-100ppm；1-75ppm；1-50ppm；1-25ppm；1-10ppm；10-500ppm；10-400ppm；10-300ppm；10-250ppm；10-200ppm；10-150ppm；10-125ppm；10-100ppm；10-75ppm；10-50ppm；10-25ppm；25-500ppm；25-400ppm；25-300ppm；25-250ppm；25-200ppm；25-175ppm；25-150ppm；25-125ppm；25-100ppm；25-75ppm；25-50ppm；50-500ppm；50-400ppm；50-300ppm；50-200ppm；50-175ppm；50-150ppm；50-125ppm；50-100ppm；50-75ppm；75-500ppm；75-400ppm；75-300ppm；75-250ppm；75-225ppm；75-200ppm；75-175ppm；75-150ppm；75-125ppm；75-100ppm；100-500ppm；100-400ppm；100-300ppm；100-200ppm；100-150ppm；100-125pm；125-500ppm；125-400ppm；125-300ppm；125-275ppm；125-200ppm；125-175ppm；125-150ppm；150-500ppm；150-400ppm；150-300ppm；150-200ppm；150-175ppm；175-500ppm；175-400ppm；175-300ppm；175-275ppm；175-250ppm；175-225ppm；175-200ppm；200-500ppm；200-400ppm；200-300ppm；200-250ppm；250-500ppm；250-400ppm；250-300ppm；250-275ppm；300-500ppm；300-400ppm；或400-500ppm。在特定情况下，成纤维细胞与CO的孵育在百万分之(ppm)75、100、125、150、175、200、225、250、275、300或325或者更多的浓度进行1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或者更多小时。

在特定实施方案中，将成纤维细胞暴露于如上所述特定水平的CO特定的一段时间，例如至少或不超过30分钟(min)-3天；例如30min-2天；30min-1天；30分-18小时(hrs)；30min-12hrs；30min-8hrs；30min-6hrs；30min-4hrs；30min-2hrs；30min-1hr；45min-3天；45min-2天；45min-1天；45min-18hrs；45min-12hrs；45min-8hrs；45min-6hrs；45min-4hrs；45min-2hrs；45min-1hr；60min-3天；60min-2天；60min-1天；60min-18hrs；60min-12hrs；60min-8hrs；60min-6hrs；60min-4hrs；60min-2hrs；60min-1hr；2hrs-3天；2hrs-2天；2hrs-1天；2hrs-18hrs；2hrs-12hrs；2hrs-8hrs；2hrs-6hrs；2hrs-4hrs；2hrs-3hrs；6hrs-3天；6hrs-2天；6hrs-1天；6hrs-18hrs；6hrs-12hrs；6hrs-8hrs；8hrs-3天；8hrs-2天；8hrs-1天；8hrs-18hrs；8hrs-12hrs；8hrs-10hrs；12hrs-3天；12hrs-2天；12hrs-1天；12hrs-18hrs；18hrs-3天；18hrs-2天；18hrs-1天；1天-3天；或2天-3天。在特定实施方案中，这样的孵育发生例如1-8；1-7；1-6；1-5；1-4；1-3；1-2；2-8；2-7；2-6；2-5；2-4；2-3；3-8；3-7；3-6；3-5；3-4；4-8；4-7；4-6；4-5；5-8；5-7；5-6；6-8；6-7；或7-8小时。

在特定实施方案中，在用CO处理之前用低氧处理细胞，尽管在其他实施方案中在用CO处理期间和/或之后用低氧处理细胞。在某些实施方案中，在将细胞顺序暴露于低氧和随后的CO处理后，对成纤维细胞有协同作用(例如，成纤维细胞协同产生生长因子)。

在特定实施方案中，本公开内容提供了通过修饰成纤维细胞的培养条件来加强成纤维细胞的治疗活性的方法。在特定实施方案中，在通过在低氧和低浓度的一氧化碳中培养成纤维细胞刺激再生活性方面，先前没有公开协同作用。在一个实施方案中，将成纤维细胞暴露于一种或多种试剂和/或一种或多种培养条件，目的是成纤维细胞产生包含一种或多种因子和/或一种或多种其他试剂的条件培养基用于治疗应用。

在特定情况下，将成纤维细胞(在暴露于一种或多种特定试剂和/或培养条件之后)用作条件培养基的来源；在某些情况下，条件培养基包含一种或多种特定的生长因子或其他试剂。在具体的实施方案中，将由成纤维细胞产生的条件培养基储存起来以备将来使用或者可以在不首先储存的情况下使用培养基。在某些情况下，成纤维细胞产生条件培养基并且将培养基提供给获得成纤维细胞的个体。在其他情况下，成纤维细胞产生条件培养基并且将培养基提供给除获得成纤维细胞的个体之外的个体。所述条件培养基可以在患者特异性情况下(使用自体成纤维细胞)或通用供体情况下(使用同种异体成纤维细胞)生成。

在具体的实施方案中，例如，成纤维细胞条件培养基可用于任何应用，包括加速伤口愈合、诱导血管生成和/或用于美容手段。在特定实施方案中，将成纤维细胞暴露于加强再生特性的条件并且作为包括间充质干细胞在内的干细胞的补充或替代施用给个体。在一个实施方案中，将成纤维细胞注射到个体的特定部位，包括盘内注射用于刺激椎间盘再生。如本文所公开的，成纤维细胞再生活性的加强可以通过两步过程实现，该过程包括在某些情况下首先暴露于低氧，然后暴露于刺激HO-1的条件，例如CO。

在本公开内容的一方面，可以分析来自成纤维细胞的条件培养基产物的效力。在具体的实施方案中，例如，可以分析条件培养基以评估蛋白质产生。此类测定法是本领域技术人员众所周知的。

可以分析条件培养基的抗炎活性，例如条件培养基可以具有抗炎活性使得其能够用作抗炎剂或与一种或多种其他抗炎剂一起使用。为了量化抗炎活性，本领域技术人员将理解术语“炎症”包括以局部或全身保护性应答为特征的任何病况，其可以是由物理创伤、感染、慢性疾病和/或对外部刺激的化学和/或生理反应(例如，作为过敏应答的一部分)引发的。可以破坏、稀释或隔离伤害性试剂和受伤组织的任何此类应答可以表现为例如发热、肿胀、疼痛、发红、血管扩张和/或血流量增加、白细胞对受影响区域的侵袭、功能的丧失和/或已知与炎性病况有关的任何其他症状。因此，术语“炎症”还将被理解为包括任何炎性疾病、病症或病况本身，具有与之相关的炎性组分的任何病况，和/或特征在于以炎症为症状的任何病况，尤其包括：急性、慢性、溃疡性、特异性、过敏性和坏死性炎症，以及本领域技术人员已知的其他形式的炎症。因此，出于本公开内容的目的，该术语还包括由炎症引起的炎性疼痛和/或发烧。

在一个实施方案中，在离体体外环境中生成条件培养基。具体而言，目标成纤维细胞在体外生长，例如在一种或多种底物之上和/或之中生长。在一个具体的实施方案中，细胞在中空纤维过滤器的外部上生长，例如连接到连续体外系统的中空纤维过滤器。中空纤维系统在中空纤维中包含足够尺寸的孔，以便允许循环血细胞与在中空纤维外部上的培养细胞之间的蛋白质交换，而不会使宿主细胞与成纤维细胞互换。在一个实施方案中，将成纤维细胞-条件培养基与一种或多种免疫抑制剂组合使用以加强其活性。

尽管成纤维细胞-条件培养基可以单独或可以不单独用于疾病缓解的治疗和/或维持，但是在某些实施方案中，可以在某些方法中使用一种或多种免疫抑制剂的施用。另外，免疫抑制剂可用于“诱导疗法”。取决于疾病和所希望的应答，本领域技术人员将知道从各种免疫抑制剂中选择。例如，当需要全身性消耗T细胞和B细胞时，可以使用某些免疫抑制剂，例如抗CD52抗体，而在其他情况下，可能需要同时刺激T调节细胞活性的试剂，例如雷帕霉素。指导熟练的从业人员至本领域已知的引起免疫抑制的几种试剂的实例，其包括环孢素、雷帕霉素、campath-1H、ATG、Prograf、抗IL-2r、MMF、FTY、LEA、环孢素A、diftitox、地尼白介素(denileukin)、左旋咪唑(levamisole)、硫唑嘌呤、布喹那(brequinar)、胍立莫司(gusperimus)、6-巯基嘌呤、咪唑立宾(mizoribine)、雷帕霉素、他克莫司(FK-506)、叶酸类似物(例如，二甲叶酸、依达曲沙(edatrexate)、甲氨蝶呤、piretrexim、蝶罗呤(pteropterin)、Toretdex.RTM.和三甲曲沙(trimetrexate))、嘌呤类似物(例如，克拉屈滨、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤(thiaguanine))、嘧啶类似物(例如，安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、多西氟啶(doxifluridine)、乙嘧替氟(emitefur)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)和替加氟(tegafur))氟轻松、三氨酮(triaminolone)、醋酸阿奈可他(anecortave acetate)、氟米龙(fluorometholone)、甲羟松(medrysone)、泼尼松龙(prednislone)等。在另一个实施方案中，干细胞条件培养基的使用可以用于强化现有的抗炎剂。抗炎剂可以包括一种或多种试剂，包括NSAID、白介素-1拮抗剂、二氢乳清酸合酶抑制剂、p38 MAP激酶抑制剂、TNF-α抑制剂、TNF-α螯合剂和甲氨蝶呤。更具体地，抗炎剂可以包含一种或多种，例如抗TNF-α、溶血茶碱(lysophylline)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、白介素-10(IL-10)、己酮可可碱(pentoxyfilline)、COX-2抑制剂、21-乙酰氧基孕烯醇酮、阿氯米松(alclometasone)、阿尔孕酮(algestone)、安西奈德(amcinonide)、倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、氯泼尼松(chloroprednisone)、氯倍他索(clobetasol)、氯倍他松(clobetasone)、氯可托龙(clocortolone)、氯泼尼醇(cloprednol)、皮质酮、可的松、可的伐唑(cortivazol)、地富可特(deflazacort)、地奈德(desonide)、去氢米松(desoximetasone)、地塞米松、二氟拉松(diflorasone)、二氟可龙(diflucortolone)、二氟泼尼酯(difluprednate)、甘草次酸(enoxolone)、氟扎可特(fluazacort)、氟氯奈德(flucloronide)、氟米松(flumethasone)、氟尼缩松(flunisolide)、氟轻松(fluocinolone acetonide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟考丁酯(fluocortin butyl)、氟可龙(fluocortolone)、氟米龙(fluorometholone)、醋酸氟培龙(fluperolone acetate)、醋酸氟泼尼定(fluprednideneacetate)、氟泼尼松龙(fluprednisolone)、氟氢缩松(flurandrenolide)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、氟甲酰龙(formocortal)、哈西奈德(halcinonide)、丙酸卤倍他索(halobetasol propionate)、卤米松(halometasone)、醋酸卤泼尼松(halopredoneacetate)、氢可他酯(hydrocortamate)、氢化可的松(hydrocortisone)、氯替泼诺碳酸乙酯(loteprednol etabonate)、马泼尼酮(mazipredone)、甲羟松(medrysone)、甲泼尼松(meprednisone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、糠酸莫米他松(mometasonefuroate)、帕拉米松(paramethasone)、泼尼卡酯(prednicarbate)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松龙25-二乙基胺基醋酸酯、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松(prednisone)、强的松龙戊酸酯(prednival)、泼尼立定(prednylidene)、利美索龙(rimexolone)、替可的松(tixocortol)、曲安奈德(triamcinolone)、丙酮曲安奈德、苯曲安奈德、己曲安奈德、氨基芳基羧酸衍生物(例如，苯乙氨茴酸(enfenamic acid)、依托芬那酯(etofenamate)、氟灭酸(flufenamic acid)、异尼克辛(isonixin)、甲氯灭酸(meclofenamic acid)、甲灭酸(mefenamic acid)、尼氟灭酸(niflumic acid)、他尼氟酯(talniflumate)、特罗氨酯(terofenamate)、托芬那酸(tolfenamic acid))、芳基乙酸衍生物(例如，醋氯芬酸(aceclofenac)、阿西美辛(acemetacin)、阿氯芬酸(alclofenac)、氨芬酸(amfenac)、呱氨托美丁(amtolmetin guacil)、溴芬酸(bromfenac)、丁苯羟酸(bufexamac)、桂美辛(cinmetacin)、氯吡酸(clopirac)、双氯芬酸钠、依托度酸(etodolac)、联苯乙酸(felbinac)、芬克洛酸(fenclozic acid)、芬替酸(fentiazac)、葡美辛(glucametacin)、异丁芬酸(ibufenac)、吲哚美辛(indomethacin)、三苯唑酸(isofezolac)、伊索克酸(isoxepac)、氯那唑酸(lonazolac)、甲嗪酸(metiazinic acid)、莫苯唑酸(mofezolac)、奥沙美辛(oxametacine)、吡拉唑酸(pirazolac)、丙谷美辛(proglumetacin)、舒林酸(sulindac)、噻拉米特(tiaramide)、托美汀(tolmetin)、tropesin、佐美酸(zomepirac))、芳基丁酸衍生物(例如，布马地宗(bumadizon)、布替布芬(butibufen)、芬布芬(fenbufen)、联苯丁酸(xenbucin))、芳基羧酸(例如，克力丹酸(clidanac)、酮咯酸(ketorolac)、替诺立定(tinoridine))、芳基丙酸衍生物(例如，阿明洛芬(alminoprofen)、苯噁洛芬(benoxaprofen)、柏莫洛芬(bermoprofen)、布氯酸(bucloxic acid)、卡洛芬(carprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟诺洛芬(flunoxaprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、异丁普生(ibuproxam)、吲哚洛芬(indoprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、氯索洛芬(loxoprofen)、萘普生(naproxen)、噁丙嗪(oxaprozin)、吡酮洛芬(piketoprolen)、吡洛芬(pirprofen)、普拉洛芬(pranoprofen)、丙替嗪酸(protizinic acid)、舒洛芬(suprofen)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)、希莫洛芬(ximoprofen)、扎托洛芬(zaltoprofen))、吡唑类(例如，二苯酰胺吡唑(difenamizole)、依匹唑(epirizole))、吡唑啉酮类(例如，阿扎丙宗(apazone)、苄哌吡酮(benzpiperylon)、非普拉宗(feprazone)、莫非保松(mofebutazone)、吗拉宗(morazone)、羟基保泰松(oxyphenbutazone)、保泰松(phenylbutazone)、哌保松(pipebuzone)、异丙安替比林(propyphenazone)、雷米那酮(ramifenazone)、琥布宗(suxibuzone)、噻唑丁炎酮(thiazolinobutazone))、水杨酸衍生物(例如，醋氨沙洛(acetaminosalol)、阿司匹林、贝诺酯(benorylate)、溴水杨醇(bromosaligenin)、乙酰水杨酸钙(calcium acetylsalicylate)、二氟尼柳(diflunisal)、依特柳酯(etersalate)、芬度柳(fendosal)、龙胆酸、水杨酸乙二醇酯、咪唑水杨酸、赖氨酸乙酰水杨酸、美沙拉嗪(mesalamine)、水杨酸吗啉、水杨酸1-萘酯、奥沙拉嗪(olsalazine)、帕沙米特(parsalmide)、乙酰水杨酸苯酯、水杨酸苯酯、醋水杨胺(salacetamide)、柳胺乙酸(salicylamide o-acetic acid)、水杨基硫酸(salicylsulfuric acid)、双水杨酯(salsalate)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine))、噻嗪羧酰胺类(例如，安吡昔康(ampiroxicam)、屈噁昔康(droxicam)、伊索昔康(isoxicam)、氯诺昔康(lornoxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、替诺昔康(tenoxicam))、ε-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群(amixetrine)、苄达酸(bendazac)、苄达明(benzydamine)、α-没药醇(alpha.-bisabolol)、布可隆(bucolome)、联苯吡胺(difenpiramide)、地他唑(ditazol)、依莫法宗(emorfazone)、非普地醇(fepradinol)、愈创蓝油烃(guaiazulene)、萘丁美酮(nabumetone)、尼美舒利(nimesulide)、奥沙西罗(oxaceprol)、瑞尼托林(paranyline)、哌立索唑(perisoxal)、普罗喹宗(proquazone)、超氧化物歧化酶、替尼达普(tenidap)、齐留通(zileuton)、小烛树蜡(candelilla wax)、α-没药醇(alpha bisabolol)、芦荟、Manjistha、Guggal、Kola提取物、洋甘菊(chamomile)、柳珊瑚提取物(sea whip extract)、甘草次酸(glycyrrhetic acid)、甘草酸、油溶性甘草提取物、甘草酸单铵、甘草酸单钾、甘草酸二钾、1-β-甘草次酸、硬脂酰甘草次酸、和3-硬脂酰氧基甘草次酸、3-琥珀酰氧基-β-甘草次酸二钠或其组合。

在一个实施方案中，本公开内容中使用的成纤维细胞可以通过从受体自身皮肤的活检(在自体制备物的情况下)或一种或多种健康供体的皮肤(对于同种异体制备物)中长出。在一些实施方案中，使用来自年轻供体的成纤维细胞，尽管供体可以是任何年龄，包括新生儿、婴儿、儿童、青少年、成人或老年人。在另一个实施方案中，用一种或多种基因转染成纤维细胞。在具体的实例中，用一种或多种基因转染成纤维细胞以允许增强的生长和克服Hayflick极限。这样的基因的实例包括端粒酶、hTERT和/或一种或多种癌基因，例如，RAS、c-myc、RAF或bcr-able。细胞衍生后，可以使用标准细胞培养技术在培养中扩增成纤维细胞。在某些情况下，可以从受试者的耳后区域对皮肤组织(真皮层和表皮层)进行活检。在一个实施方案中，起始材料由使用标准无菌操作收集的多个3-mm穿孔皮肤活检组成。活检可以由执业医师收集并放入包含合适缓冲液的容器(例如，包含无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)的小瓶)中。活检可以在使用之前运输，例如，在合适的温度(例如，2-8℃)运输。活检可以适当地运输到制造设施。在一个实施方案中，到达制造设施之后，可以检查活检，并且在接受后将其直接转移到制造区域。

起始制备细胞的过程后，可以洗涤活检组织，例如在酶消化之前洗涤。洗涤后，可以将酶暴露于组织，例如胶原酶和/或中性蛋白酶的混合物(例如，Liberase^TM消化酶溶液(Lonza Walkersville,Inc.(Walkersville,Md.)或Roche Diagnostics Corp.(Indianapolis,Ind.))，在切碎或不切碎的情况下添加到组织中，并且然后将活检组织在合适的温度和持续时间孵育，例如37.0±2℃孵育一小时。活检组织消化的时间是能够影响培养中的细胞的活性和生长速度的过程参数。除了Liberase^TM，还可以使用其他商购可得的胶原酶，例如Serva胶原酶NB6(Helidelburg，Germany)。消化后，可以为经消化的材料提供合适的培养基，例如可以添加起始生长培养基(IMDM，GA，10％胎牛血清(FBS))以中和酶。可以将细胞沉淀，例如通过离心，并重悬浮于5.0mL起始生长培养基中。备选地，不进行离心，仅通过添加培养基(例如，起始生长培养基)使酶完全失活。可以在将细胞悬浮液接种到合适的容器(例如，T-175细胞培养瓶)之前添加起始生长培养基用于起始细胞生长和扩增。在某些情况下，能够使用T-75、T-150、T-185或T-225烧瓶代替T-75烧瓶。将细胞在37±2.0℃与5.0±1.0％的CO₂孵育并以合适的间隔(例如，每三至五天)饲喂新鲜培养基，例如完全生长培养基。可以通过去除部分(例如，大约一半)培养基(例如，完全生长培养基)并用新鲜培养基替换相同体积来进行方法中的饲喂。备选地，能够进行完全饲喂。在一个实施方案中，细胞在传代前不留在烧瓶中的天数超过特定天数，例如，大约30天，并且可以在传代前留在烧瓶中至少24小时。在整个过程中监测汇合以确保培养物分裂期间有足够的接种密度。当容器中的细胞汇合度大于或等于某个百分比(例如，大约40％-大约70％)时，可以通过去除用过的培养基，洗涤细胞并用胰蛋白酶-EDTA处理以释放烧瓶中的粘附细胞到溶液中来对细胞进行传代。然后可以用胰蛋白酶消化细胞并接种到合适的容器(例如，T-500烧瓶)中以继续扩增细胞。备选地，能够使用一个或两个T-300烧瓶、一层细胞堆叠(1CS)、一层细胞工厂(1CF)或两层细胞堆叠(2CS)代替T-500烧瓶。可以在每次传代和收获前评估形态以监测整个过程中的培养物纯度。例如，可以通过将观察到的样品与用于细胞培养物形态检查的视觉标准进行比较来评估形态。当在培养的单层中生长时，细胞表现出典型的成纤维细胞形态。细胞可以表现出细长的梭形或纺锤形外观，具有细长的延伸，或出现较大的扁平星状细胞，其可能具有细胞质前缘。也可以观察到这些形态的混合。汇合程度较小的区域中的成纤维细胞在形状上类似，但随机取向。还可以评估细胞培养物中角质形成细胞的存在。角质形成细胞呈现圆形和不规则形状，并且在较高汇合度，它们看起来以鹅卵石形式进行组织。在较低汇合度，在小菌落中可观察到角质形成细胞。将细胞在37±2.0℃和5.0±1.0％CO₂下孵育并且在T-500烧瓶中每三至五天和在十层细胞堆叠(10CS)中每五至七天进行传代。在一些实施方案中，在传代之前，细胞不应在T-500烧瓶中保留超过10天。用于散装药物物质安全性的质量控制(QC)释放测试包括无菌和内毒素测试。当T-500烧瓶中的细胞汇合度是约95％时，将细胞传代至10CS培养容器。备选地，能够使用两个五层细胞堆叠(5CS)或十层细胞工厂(10CF)代替10CS。10CS。通过去除用过的培养基，洗涤细胞，并用胰蛋白酶-EDTA处理以释放烧瓶中的粘附细胞到溶液中来传代至10CS。然后将细胞转移至10CS。添加额外的完全生长培养基以中和胰蛋白酶并将来自T-500烧瓶的细胞吸移到包含新鲜的完全生长培养基的2L瓶中。将2L瓶中的内容物转移到10CS中并在所有层中接种。然后将细胞在37±2.0℃和5.0±1.0％CO₂下孵育并每五至七天用新鲜的完全生长培养基进行饲喂。在特定实施方案中，细胞在传代之前不应在10CS中停留超过20天。在一个实施方案中，通过将扩增的成纤维细胞在无蛋白培养基中孵育一段时间，使传代的真皮成纤维细胞基本上不含培养基中存在的免疫原性蛋白质，初次收获当10CS中的细胞汇合度是95％或更高时，收获细胞。可以通过以下进行收获：去除用过的培养基，洗涤细胞，用胰蛋白酶-EDTA处理以释放粘附细胞到溶液中，并添加额外的完全生长培养基以中和胰蛋白酶。可以通过离心收集细胞，重新悬浮，并进行过程中QC测试以确定总的活细胞计数和细胞活性。

在一些实施方案中，当在接收来自初次10CS收获的细胞计数结果之后需要大量细胞时，可以进行向多个细胞堆叠(最多四个10CS)的额外传代。对于额外的传代，将来自初次收获的细胞添加到包含新鲜的完全生长培养基的2L培养基瓶中。将重悬浮的细胞添加到多细胞堆叠中并在37±2.0℃和5.0±1.0％CO₂下孵育。在某些实施方案中，如上所述饲喂和收获细胞堆叠，除了在细胞收获之前细胞汇合是80％或更高。收获程序可以与以上对初次收获所描述的相同。收集来自细胞和用过的培养基的支原体样品，并按照以上对初次收获所描述的进行细胞计数和活性。该方法通过避免从动物来源的反应剂中引入免疫原性蛋白质来减少或消除免疫原性蛋白质。为了减少过程残留，将细胞冷冻保存在无蛋白质的冷冻培养基中，然后解冻并洗涤，之后准备最终注射以进一步减少残留。如果收获后需要额外的药物物质并且完成来自额外传代的细胞的冷冻保存，则将等份的冷冻药物物质-冷冻管解冻并用于接种5CS或10CS培养容器。备选地，能够使用四层细胞工厂(4CF)、两个4CF或两个5CS代替5CS或10CS。将冷冻的一个或多个细胞的冷冻管解冻，洗涤，添加至包含新鲜的完全生长培养基的2L培养基瓶中并按如上所述进行培养、收获和冷冻保存。添加细胞悬浮液，在细胞收获前细胞汇合度必须为80％或更高。

在培养物扩增完成时，收获细胞并洗涤，然后配制为含有1.0-2.7x10⁷个细胞/mL，目标为2.2x10⁷个细胞/mL。备选地，能够在制剂范围内调节目标以适应不同的适应症剂量。药物物质包括悬浮在合适的培养基中的活的、自体人类成纤维细胞的群体，所述合适的培养基例如是由Iscove的改良的Dulbecco培养基(IMDM)和Profreeze-CDM.TM.(Lonza,Walkerville,Md.)加7.5％二甲基亚砜(DMSO)组成的冷冻保存培养基。备选地，可以使用更低的DMSO浓度代替7.5％，或者可以使用CryoStor^TM CS5或CryoStor^TM CS10(BioLifeSolutions,Bothell,Wash.)代替IMDM/Profreeze/DMSO。除细胞计数和活性之外，还要进行药物物质的纯度/鉴定并且必须确认悬浮液包含98％或更多的成纤维细胞。常见的细胞污染物包括角质形成细胞。纯度/鉴定测定法采用针对CD90和CD 104(分别是成纤维细胞和角质形成细胞的细胞表面标志物)的荧光标记抗体来定量成纤维细胞群体的纯度百分比。CD90(Thy-1)是35kDa的细胞表面糖蛋白。已显示针对CD90蛋白的抗体对人成纤维细胞表现出高特异性。CD104，整联蛋白β4链，是205kDa的跨膜糖蛋白，其与整联蛋白α6链(CD49f)结合形成α6/β4复合物。已显示该复合物可作为角质形成细胞的分子标志物(Adams和Watt1991)。

CD 104蛋白的抗体结合100％的人类成纤维细胞。通过将样品与Viacount DyeReagent孵育并使用Guava PCA系统分析样品来确定细胞计数和活性。反应剂由两种染料组成，一种是对所有有核细胞染色的膜渗透性染料，另一种是仅对损伤或死亡细胞染色的膜不渗透性染料。这种染料组合的使用使得Guava PCA系统能够估计样品中存在的细胞总数，并确定哪些细胞是活的、凋亡的或死亡的。该方法是专门定制开发用于确定自体培养的成纤维细胞的纯度/鉴定。备选地，可以将细胞从T-175烧瓶(或替代品)或T-500烧瓶(或替代品)传代到含有微运载体作为细胞生长表面的旋转瓶中。微运载体是小的珠状结构，其用作悬浮培养中锚定依赖性细胞的生长表面。将它们设计为以小批量生产大量细胞。在该设备中，将体积为50mL-300mL的完全生长培养基添加到500mL、IL或2L无菌一次性旋转瓶中。将无菌的微运载体添加到旋转瓶中。使培养物保持静态或放置在以低RPM(15-30RRM)的搅拌板上短时间(1-24小时)，在37±2.0℃与5.0±1.0％CO₂的培养箱中以使细胞粘附到运载体上。附着期过后，旋转板的速度增加(30-120RPM)。每一到五天或当通过颜色改变培养基出现失效时，就用新鲜的完全生长培养基饲喂细胞。通过对微运载体进行取样，分离细胞并进行细胞计数和活性分析，以规律间隔收集细胞。每个运载体的细胞浓度用于确定何时扩大培养规模。当产生足够的细胞时，将细胞用PBS洗涤并使用胰蛋白酶-EDTA从微运载体中收获，并以较大数量的微运载体和较高体积的完全生长培养基(300mL-2L)接种回旋转瓶中。备选地，可以将额外的微运载体和完全生长培养基直接添加到含有现有微运载体培养物的旋转瓶中，使得无需使用胰蛋白酶消化和再接种而直接将细胞从珠子转移到珠子。备选地，如果从最初的T-175或T-500烧瓶中产生了足够的细胞，则可以将细胞直接接种到按比例放大量的微运载体中。附着期过后，旋转板的速度增加(30-120RPM)。每一到五天或当通过颜色改变培养基出现失效时，就用新鲜的完全生长培养基饲喂细胞。当浓度达到预期适应症的所需细胞计数时，将细胞用PBS洗涤并使用胰蛋白酶-EDTA收获。一次性旋转瓶中使用的微运载体可以由如下的共混物制成：例如BioNOC

(Cesco Bioengineering,由BellcoBiotechnology,Vineland,N.J.分销)和

(New Brunswick Scientific,Edison,N.J.)，明胶，例如Cultispher-G(Percell Biolytica,Astrop,Sweden),纤维素，例如Cytopore^TM.(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)或涂层/未涂层的聚苯乙烯，例如2DMicroHex^TM.(Nunc,Weisbaden,Germany)，

(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)或Hy-Q Sphere^TM(Thermo Scientific Hyclone,Logan,Utah)。

在另一个实施方案中，可以使用自动波纹管系统，例如FibraStage^TM(NewBrunswick Scientific，Edison，N.J.)或

(Cesco Bioengineering，由BellcoBiotechnology，Vineland，N.J.分销)代替旋转瓶设备，在例如

和

的多共混2D微运载体上处理细胞。可将来自T-175(或替代品)或T-500烧瓶(或替代品)的细胞传代到含有微运载体的波纹管瓶中，所述微运载体带有合适量的完全生长培养基，并且放入系统中。系统泵送培养基在微运载体上以饲喂细胞，并抽出培养基以允许在重复的固定循环中进行充氧。以与上述相同的顺序监测、饲喂、洗涤和收获细胞。备选地，可以使用自动化系统处理细胞。消化活检组织后或完成第一次传代后(T-175烧瓶或替代品)，可将细胞接种到自动化装置中。一种方法是自动细胞扩增(ACE)系统，该系统是一系列商购可得的或定制制造的组件，连接在一起以形成细胞生长平台，在其中无需人工干预即可扩增细胞。细胞在细胞塔中扩展，该细胞塔由一堆能够支持锚固依赖性细胞附着的圆盘组成。系统自动循环培养基并在细胞扩增阶段完成后进行胰蛋白酶消化用于收获。

备选地，ACE系统可以是按比例缩小的、单批单位版本，其包括由细胞生长表面、输送管、培养基和反应剂组成的一次性组件，以及容纳用于加热/冷却、培养基转移和自动编程周期的进行的机械和计算机处理能力的永久基座。收到后，将从其包装中取出每个经过无菌的经辐照ACE一次性单元并通过悬挂预先装填的袋子并通过无菌连接器将袋子连接到现有管道的方式装入培养基和反应剂。该过程按以下继续：a)在生物安全柜(BSC)内，将经过酶消化的来自活检的细胞悬浮液引入“预生长室”(细胞塔顶部的小单元)，该预生长室已经装填了含有抗生素的起始生长培养基。一次性物品将从BSC转移到已经在位置上的永久性ACE单元；b)大约三天后，将预生长室内的细胞进行胰蛋白酶消化并引入预先装填完全生长培养基的细胞塔本身。在此，由CO₂注射引起的“起泡作用”迫使培养基以一定速度循环，使得细胞向下盘旋并以均匀分布方式沉降在盘表面上；c)在大约七天的时间内，允许细胞繁殖。此时，将检查汇合度(撰写时方法未知)以验证培养物在增长。同样在此时，完全成长培养基将被新的完全成长培养基更换。CGM可以适当的间隔更换，例如每7天进行三到四周。在培养期结束时，再次检查汇合度以验证有足够的生长以产生所需数量的细胞用于预期的处理；d)如果培养物充分汇合，则将其收获。失效的培养基(上清液)从容器中排出。然后将PBS泵入容器(以洗涤培养基，来自细胞的FBS)并几乎立即排出。将胰蛋白酶-EDTA泵入容器以使细胞与生长表面分离。胰蛋白酶/细胞混合物从容器中排出并进入旋转分离器。将低温防腐剂泵入容器中以冲洗掉圆盘表面上的任何残留细胞，并将其也送至旋转分离器。旋转分离器收集细胞并然后将细胞均匀地重悬在运输/注射培养基中。从旋转分离器中，细胞将通过串联自动细胞计数装置发送或收集的样品用于通过实验室分析进行细胞计数和活性测试。一旦已经计数了特定数量的细胞并且达到了适当的细胞浓度，就将收获的细胞递送到收集瓶中，可以将其取出以等分样品用于低温冷冻。

在另一个实施例中，自动化机器人系统可以用于在方法的整个长度或一部分中进行细胞饲喂、传代和收获。消化后可以将细胞直接引入机器人装置并接种到T-175烧瓶中(或替代品)。该装置可以具有孵育细胞、进行细胞计数和活性分析以及进行饲喂和转移至更大的培养容器的能力。该系统还可以具有计算机化的分类功能以跟踪单个批次。现有技术或定制系统可以用于机器人选择。

在一个实施方案中，在暴露于低氧/一氧化碳之前通过与一种或多种生长因子例如在混合物中(包含生长因子的混合物)接触而预激活成纤维细胞。混合物可包含选自以下的生长因子：转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生的内皮生长因子(PDEGF)、血小板衍生的血管生成因子(PDAF)、血小板因子4(PF-4)、肝细胞生长因子(HGF)及其混合物。在特定实施方案中，生长因子是转化生长因子(TGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)或其混合物。在特定实施方案中，一种或多种生长因子选自转化生长因子β(TGF-β)、血小板衍生的生长因子BB(PDGF-BB)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其混合物。在本公开内容的另一个实施方案中，在递送成纤维细胞的同时或之后提供包含生长因子的组合物，可以注射其中之一或两者。成纤维细胞可以是自体的、同种异体的或异种的。在一些实施方案中，血小板血浆组合物与成纤维细胞一起施用或与成纤维细胞分开施用，例如在施用成纤维细胞之后。血小板血浆组合物可以包含血小板和血浆，基本上由其组成或由其组成，并且例如可以衍生自骨髓或外周血。本公开内容可以使用来自这些来源中的任何一个或两个的血小板血浆组合物，并且可以使用血小板血浆组合物的两者之一来再生有此需要的核或环。此外，可以将血小板血浆组合物与或不与浓缩的骨髓(BMAC)一起使用。举例来说，当插入环时，可以使用0.05-2.0cc的血小板血浆组合物，而当插入核时，可以使用0.05-3.0cc的血小板血浆组合物。血小板是如上所述在骨髓和外周血中发现的无核血细胞。它们具有一些重要功能，例如控制出血和组织愈合。如本领域普通技术人员所知，促进组织愈合的能力是由于它们产生的许多生长因子，包括血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、结缔组织生长因子(CTGF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)。

II.成纤维细胞的使用方法

本公开内容的实施方案包括用于个体的治疗目的的制备的成纤维细胞，并且在某些情况下，除了制备的成纤维细胞或作为替代，将来自成纤维细胞的条件培养基提供给个体。

在制备本文所涵盖的成纤维细胞以使其再生活性得到增强之后，向一个或多个有此需要的个体提供合适数量的成纤维细胞，必要时包括多次递送。本公开内容包括通过在液体培养基中成纤维细胞群体的生长生成治疗产物并将其提供给有此需要的一个或多个个体的方法。在一个实施方案中是生成包含制备的成纤维细胞和/或条件培养基的药物的方法，所述药物可用于治疗至少一种医学病况，包括至少炎性、自身免疫性和/或退化性病况。在特定实施方案中，通过培养成纤维细胞以使它们暴露于合适水平和合适暴露的低氧和/或CO来制备成纤维细胞。在某些情况下，低氧条件可以首先提供给成纤维细胞，然后提供一氧化碳，例如两者的浓度和暴露时间在特定情况下足以分别刺激HIF-1α和血红素加氧酶。

本领域技术人员可以使用许多类型的培养基来制备条件培养基。在一个实施方案中，培养基选自αMEM、DMEM、RPMI、Opti-MEM、IMEM和AIM-V。可以在多种培养基中培养细胞进行扩增，这些培养基可以含有或不含胎牛血清或其他生长因子；然而，为了收集治疗上清液，在一个特定实施方案中，将细胞转移到基本上缺乏血清的培养基中。在一些实施方案中，条件培养基可以直接提供给需要治疗的个体。在本领域中众所周知，在施用之前可以通过多种方式进行条件培养基的制备；例如，可将条件培养基过滤灭菌，或在某些条件下浓缩。在一个具体的实施方案中，单独或与具有再生特性的细胞组合施用条件培养基以诱导再生活性。

在一些实施方案中，将制备的细胞和/或条件培养基用于通过施用培养的成纤维细胞和/或来自其的条件培养基来促进伤口愈合的方法。伤口的实例包括上皮伤口和/或瘘管。在某些实施方案中是通过施用培养的成纤维细胞和/或来自其的条件培养基来加强个体的声带缺陷附近的组织的方法。在某些实施方案中，将制备的细胞和/或条件培养基用于治疗声带结疤和/或修复皮肤和软组织缺陷(例如纤维化损伤、炎症损伤、萎缩和/或烧伤)的方法。

制备的成纤维细胞在特定实施方案中是HO-1加强的，可用于多种治疗性适应症，在相似的许多情况下用于干细胞包括间充质干细胞。可以提供给个体的细胞数量的实例包括10,000/kg至3亿/kg的范围。

在一些实施方案中，条件培养基单独或与成纤维细胞一起用作药物制剂的活性成分。这可以包括单独施用低氧/一氧化碳成纤维细胞条件培养基治疗剂，但在某些情况下，包括通过已知药物制剂的方式进行施用，包括用于口服施用的片剂、胶囊或酏剂，用于直肠施用的栓剂，用于肠胃外或肌内施用的无菌溶液或悬浮液，脂质体或胶囊化制剂，其中治疗剂单独或与递送剂或媒介物缀合的制剂等。应当理解，本公开内容的治疗实体(包括制备的成纤维细胞)可以与合适的运载体、赋形剂和/或掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的其他试剂一起施用。可以在所有药物化学家已知的配方中找到许多合适的制剂：Remington's Pharmaceutical Sciences(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1975))，其中尤其是Blaug,Seymour的第87章。这些制剂包括，例如粉剂、糊剂、软膏、胶冻剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如Lipofectin^TM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂carbowax(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含carbowax的半固体混合物。只要制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂在生理上相容且对施用途径是可耐受的，则前述混合物中的任何一种都可以适用于根据本公开内容的治疗和疗法。另请参见Powell等"Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA J Pharm Sci Technol 52：238-311(1998)及其中引文列出了与药物化学家众所周知的赋形剂和运载体有关的其他信息。在本公开内容的一个实施方案中，将本公开内容的一种或多种试剂纳米胶囊化到纳米颗粒中以进行递送。纳米胶囊化材料可以是生物可降解的或不可降解的。纳米胶囊化材料可以由合成聚合物、天然聚合物、低聚物或单体制成。合成聚合物、低聚物和单体包括衍生自聚环氧烷前体分子的那些，例如聚环氧乙烷(PEO)、聚乙二醇(PEG)和与聚环氧丙烷的共聚物(PEG-co-PPO)，聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙基噁唑啉)(PEOX)、聚氨基酸和假聚氨基酸，以及这些聚合物的共聚物。Sawhney等，Macromolecules 26：581-587(1993)。共聚物也可以与其他水溶性聚合物或水不溶性聚合物形成，只要缀合物是水溶性的。水溶性缀合物的一个实例是聚乙二醇和聚环氧丙烷的嵌段共聚物，作为Pluronic^TM表面活性剂(BASF)商购可得。天然聚合物、低聚物和单体包括由天然或重组来源产生的蛋白质，例如纤维蛋白原、纤维蛋白、明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、玉米蛋白和白蛋白，以及多糖，例如琼脂糖、藻酸盐、透明质酸、硫酸软骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、壳聚糖、结冷胶、黄原胶、瓜尔豆胶、水溶性纤维素衍生物和角叉菜胶。这些聚合物仅是可以使用的纳米胶囊化材料类型的示例并且并不意图代表其中可能存在包封的所有纳米胶囊化材料。在一个实施方案中，以局部制剂施用治疗剂。局部制剂可用于治疗与皮肤疾病有关的病况。例如，可以进行成纤维细胞条件培养基和/或制备的成纤维细胞的局部施用于治疗牛皮癣、硬皮病或痤疮。施用的局部形式可以由例如水性和非水性凝胶、乳膏、多种乳剂、微乳剂、脂质体、软膏、水性和非水性溶液、洗剂、气雾剂、皮肤贴剂、碳氢化合物基质(base)和粉剂组成，并且可以包含赋形剂，例如增溶剂、渗透促进剂(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)和亲水性聚合物(例如聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药学上可接受的运载体是脂质体或透皮增强剂。本发明的局部制剂可以包括皮肤病学上可接受的运载体，例如能够将制剂的其他组分递送至皮肤的物质，皮肤具有对这些组分的可接受的应用或吸收。运载体通常将包含溶剂以溶解或分散治疗剂，以及任选地一种或多种赋形剂或其他媒介物成分。作为非限制性实例，根据本发明的局部制剂有用的载体可包括水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁烷-1,3-二醇、丙烯酸酯共聚物、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、黄油、芦荟、滑石粉、植物油、植物汁、植物提取物、植物粉、其他植物衍生物、羊毛脂、尿素、石油制备物、焦油制备物、植物或动物脂肪、植物或动物油、肥皂、甘油三酸酯和角蛋白。根据本领域众所周知的方法，例如通过标准参考文献提供的方法，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，1577-1591，1672-1673，866-885(Alfonso R.Gennaro编辑，第19版，1995)；和Ghosh等，Transdermal and Topical Drug Delivery Systems(1997)，通过将本发明的化合物与局部运载体混合来制备本发明的局部制剂。在其他实施方案中，保湿剂或湿润剂、防晒剂、香料、染料和/或增稠剂例如石蜡、荷荷巴油、PABA和蜡、表面活性剂、闭塞剂、吸湿剂、乳化剂、润肤剂、无脂质清洁剂、抗氧化剂和亲脂剂，如果需要的话可以添加到本发明的局部制剂中。可以将本公开内容的培养基和/或细胞的局部制剂设计为在施用后留在皮肤上并且不短时间洗涤。备选地，可以将局部制剂设计为在施用后的给定时间内冲洗掉。

在一个实施方案中，一种或多种免疫疾病的治疗是通过将经低氧/一氧化碳成纤维细胞处理的条件培养基和/或制备的成纤维细胞直接施用于其治疗活性的位点来进行的，在许多免疫疾病的情况是在淋巴结中。例如，可以将治疗剂直接注射到淋巴结中。淋巴结内注射T细胞依赖性激活抑制剂的优选淋巴结是位于腹股沟、腋下和颈部区域中的主要淋巴结。在另一个实施方案中，将治疗剂施用到其治疗活性的位点的远端。

在特定实施方案中，用制备的成纤维细胞和/或来自其的条件培养基治疗的医学病况包括自身免疫性疾病、退行性疾病、炎性疾病和纤维化疾病。自身免疫性疾病的实例包括Graves病、狼疮、I型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎等。退行性疾病的实例包括退行性椎间盘疾病、阿尔茨海默病、癌症、Charcot-Marie-Tooth疾病、II型糖尿病、心脏病、肌肉营养不良、帕金森病、亨廷顿病、黄斑变性、脊髓性肌萎缩、炎性肠病、骨质疏松症、骨关节炎、Tay-Sachs病、原发性肺动脉高压等。炎性疾病(可以是慢性或急性)的实例包括哮喘、肺结核、溃疡性结肠炎、慢性消化性溃疡、牙周炎、克罗恩病、鼻窦炎等。纤维化疾病的实例包括肺纤维化、放射性肺损伤、肝硬化、心房纤维化、心肌内膜纤维化、胶质瘢痕、瘢痕疙瘩、骨髓纤维化、硬皮病等。

实施例

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并因此可以认为构成其实施的优选方式。但是，鉴于本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍可获得类似或相似的结果。

实施例1

通过在低氧、一氧化碳、或低氧之后一氧化碳培养成纤维细胞的协同刺激VEGF产生

购自ATCC的包皮成纤维细胞，使用来自ATCC的成纤维细胞基础培养基在T-75烧瓶中培养。当细胞达到75％汇合时，暴露于：a)常氧；b)低氧(2％氧气4小时)；c)一氧化碳(250ppm)4小时；或d)低氧之后一氧化碳。通过胰蛋白酶消化将细胞重新铺在平底的96孔板上。重新铺板的细胞的浓度为0、10000、20000和40000个细胞每孔。培养24小时后提取培养基并使用ELISA(R&D Systems)分析VEGF产生。如图1所示，通过组合的处理观察到VEGF产生的协同增加。从常氧对照成纤维细胞中未观察到VEGF产生。

实施例2

通过在低氧、一氧化碳、或低氧同时一氧化碳培养成纤维细胞的刺激VEGF产生

购自ATCC的包皮成纤维细胞，使用来自ATCC的成纤维细胞基础培养基在T-75烧瓶中培养。当细胞达到75％汇合时，暴露于：a)常氧；b)低氧(2％氧气4小时)；c)一氧化碳(250ppm)4小时；或d)低氧同时一氧化碳。通过胰蛋白酶消化将细胞重新铺在平底的96孔板上。重新铺板的细胞的浓度为0、10000、20000和40000个细胞每孔。培养24小时后提取培养基并使用ELISA(R&D Systems)分析VEGF产生。如图2所示，通过组合的处理观察到VEGF产生的协同增加。从常氧对照成纤维细胞中未观察到VEGF产生。这些数据表明一氧化碳暴露与低氧协同作用以加强VEGF产生。

尽管已经详细描述了本公开内容及其优点，但是应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的设计的精神和范围的情况下，可以在本文中进行多种改变、替换和变更。而且，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施方案。如本领域的普通技术人员将从本公开内容中容易地理解的是，目前存在或将要开发的与本文描述的对应实施方案执行基本相同的功能或基本实现相同结果的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤可以根据本发明公开内容使用。因此，所附权利要求旨在将这样的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤包括在它们的范围内。

Claims

1.一种增强多个成纤维细胞的治疗活性的方法，其包括以下步骤：向成纤维细胞提供有效量的一种或多种试剂和/或条件，所述试剂和/或条件包括刺激成纤维细胞中的天然血红素加氧酶(HO)-1表达，将成纤维细胞暴露于外源提供的HO-1，和/或由外源提供的载体在成纤维细胞中表达HO-1。

2.权利要求1所述的方法，其中所述治疗活性包括成纤维细胞的再生活性。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述成纤维细胞具有一种或多种细胞因子和/或生长因子的分泌增加。

4.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述成纤维细胞具有抗凋亡活性的增加。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述成纤维细胞的免疫原性得到调节。

6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂和/或条件包括低氧、一氧化碳或其组合。

7.权利要求6所述的方法，其中在低氧后将一氧化碳提供给所述成纤维细胞。

8.权利要求6所述的方法，其中在低氧的同时将一氧化碳提供给所述成纤维细胞。

9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中将有效量的成纤维细胞和/或来自其的条件培养基提供给个体。

10.权利要求9所述的方法，其中所述个体患有自身免疫性疾病、退行性疾病、炎性疾病和/或纤维化疾病。

11.权利要求9或10所述的方法，其中所述条件培养基包含一种或多种生长因子和/或一种或多种细胞因子。

12.权利要求6-11中任一项所述的方法，其中所述低氧是0.1％-10％、0.1％-5％、0.1％-2.5％或0.1％-1％的氧。

13.权利要求6-12中任一项所述的方法，其中所述低氧发生例如至少或不超过30分钟至3天的一段时间。

14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中将所述成纤维细胞在暴露于低氧、一氧化碳或其组合之前暴露于一种或多种生长因子。

15.一种制备成纤维细胞的方法，其包括将成纤维细胞暴露于有效量的低氧、一氧化碳或两者的步骤。

16.权利要求15所述的方法，其中将所述成纤维细胞同时暴露于低氧和一氧化碳。

17.权利要求15所述的方法，其中将所述成纤维细胞在不同时间暴露于低氧和一氧化碳。

18.权利要求17所述的方法，其中将所述成纤维细胞在暴露于一氧化碳之前暴露于低氧。

19.权利要求15-18中任一项所述的方法，其中将有效量的成纤维细胞和/或来自其的条件培养基提供给有此需要的个体。

20.权利要求19所述的方法，其中所述个体患有自身免疫性疾病、退行性疾病、炎性疾病和/或纤维化疾病。