CN105814194A

CN105814194A - 产生视网膜色素上皮细胞的方法

Info

Publication number: CN105814194A
Application number: CN201480067617.3A
Authority: CN
Inventors: P·乔杜里; B·苏尔马齐-科德勒; H·D·E·布思; P·J·惠廷
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2016-07-27
Also published as: WO2015087231A1; KR20160095118A; EP3080248A1; BR112016012129A2; BR112016012129A8; KR101871084B1; TW201823451A; AU2014363032A1; MX2016007671A; IL245594A0; HK1221734A1; AR098693A1; CA2933083A1; TW201538726A; JP2017504311A

Abstract

本发明涉及一种产生视网膜色素上皮细胞的方法。

Description

产生视网膜色素上皮细胞的方法

【发明领域】

本发明涉及一种由多能性细胞产生视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法。本发明也涉及通过此方法获得或可获得的细胞及其用于治疗视网膜疾病的用途。本发明也涉及一种用于延展RPE细胞的方法。

【发明背景】

视网膜色素上皮是在感觉神经性视网膜外，底层的脉络膜(视网膜后的血管层)与上层的视网膜视细胞(如光感受器的视杆细胞及视锥细胞)之间的色素沉着细胞层。视网膜色素上皮对光感受器及视网膜的功能与健全非常重要。视网膜色素上皮通过回收光色素，传输、代谢、以及贮存维生素A，吞噬视杆细胞的外节，在视网膜与脉络膜之间传输铁及小分子，维持玻璃膜(Bruch’smembrane)与吸收漫射光使影像分辨率较好而维持光感受器的功能。视网膜色素上皮的退化可造成很多与视觉改变有关的疾病视网膜脱落、视网膜发育不全、或视网膜萎缩，导致光感受器的损坏与失明，如脉络膜缺失、糖尿病视网膜病变、黄斑变性(包括与年龄相关的黄斑变性)、色素性视网膜炎、以及Stargardt氏症(Stargardt'sDisease)。

对这些疾病的有效的治疗是将RPE细胞移植至患有该疾病的视网膜。据信，通过移植来补给视网膜色素上皮细胞可能延迟、中止或逆转变性，改善视网膜功能并预防由这些条件导致的失明。动物模型中已证明通过RPE细胞的次视网膜移植可实现光感受器救助与视觉功能保留(见例如Coffey,PJetal.Nat.Neurosci.2002:5,53-56；Sauve，Yetal.Neuroscience2002:114，389-401)。因此，有很大的兴趣寻找产生RPE细胞的方法，例如以多能性细胞作为用于治疗视网膜疾病的细胞移植的来源。

已证明小鼠与非人类的灵长目的胚胎干细胞分化成RPE细胞，以及在移植后存活并弱化视网膜病变的潜力。已显示人类胚胎干细胞自发性分化成RPE细胞(参见实施例WO2005/070011)。然而，这些方法的效率与再现性是低的。因此，需要能良好地被控制、可再现、有效率和/或适合大规模生产的产生RPE细胞的方法以及用于药物筛选、疾病模拟和/或治疗用途的产生RPE细胞的方法。

【发明内容】

本发明涉及一种产生RPE细胞的方法。证明此方法提供强健且可再现的多能性细胞如人类胚胎干细胞(hESCs)的分化，以生成RPE细胞。另外，本文提供的方法是容易量化生产而产生高产量的RPE细胞。本文公开的方法可例如而非限制地在不含异物的条件下用于可再现地及高效率地分化多能性细胞如hESC分化成RPE细胞。

本文提供产生RPE细胞的方法。在某些实施方式中，本方法包含步骤：

(a)在第一SMAD抑制剂与第二SMAD抑制剂的存在下培养多能性细胞；

(b)在骨形态生成蛋白质(BMP)通路活化剂的存在下且无第一与第二SMAD抑制剂的情况下培养步骤(a)的细胞；及

(c)再铺板步骤(b)的细胞。

在该方法的某些实施方式中，该方法进一步包含下列步骤：

(d)在活化素通路活化剂的存在下培养步骤(c)的经再铺板的细胞；

(e)再铺板步骤(d)的细胞；及

(f)培养步骤(e)的经再铺板的细胞。

在该方法的另一个实施方式中，

步骤(b)进一步包含，在BMP通路活化剂的存在下培养细胞之后，在无BMP通路活化剂的存在下培养细胞至少10天；

步骤(c)包含再铺板步骤(b)的具有卵石状形态的细胞；且该方法进一步包含步骤：

(d)培养步骤(c)的再铺板的细胞。

还提供延展RPE细胞的方法。在某些实施方式中，方法包含下列步骤：

(a)以密度介于1000至100000细胞/cm²接种RPE细胞，以及，

(b)在SMAD抑制剂、cAMP或增加胞内cAMP浓度的试剂的存在下培养该RPE细胞。

还提供纯化RPE细胞的方法，包含：

a)提供包含RPE细胞与非RPE细胞的细胞群；

b)通过就表达CD59的细胞而言富集该细胞群以增加细胞群中RPE细胞的百分比。

通过本文所公开的方法还提供或可获得的RPE细胞。

还提供药物组合物。药物组合物包含适合移植入患有视网膜疾病的受试者的眼睛的RPE细胞。在某些实施方式中，药物组合物包含一个适于支撑RPE细胞的结构。在某些实施方式中，药物组合物包含多孔的膜及RPE细胞。在某些实施方式中，膜的孔的直径介于约0.2μm至约0.5μm且孔的密度介于每cm²约1x10⁷至约3x10⁸个孔。在某些实施方式中，膜是被涂覆在有涂覆层的支撑RPE细胞的一侧上。在某些实施方式中，涂覆层包含醣蛋白，优选为选自层粘连蛋白或人类玻连蛋白(vitronectin)。在某些实施方式中，涂覆层包含人类玻连蛋白。在某些实施方式中，膜是由聚酯制成。

还提供受试者的视网膜疾病的治疗方法。在某些实施方式中，方法包含将本发明的RPE细胞利用于受视网膜疾病影响或有视网膜疾病风险的受试者，由此治疗视网膜疾病。

【图示简单说明】

图1A显示前期及后期的再铺板方法的特定实施例的示意图。

图1B与1C显示在用SMAD抑制剂处理期间的不同时间点通过免疫细胞化学法测量的指示表达PAX6与OCT4的细胞的百分比的图。图1B：用LDN/SB诱导的样品。

图1C：没有用LDN/SB诱导的样品。

图1D显示在用SMAD抑制剂处理2天(LDN/SB2D)后或5天(对照组+)后通过免疫细胞化学法测量的指示表达PAX6(上图)与OCT4(下图)的细胞的百分比的图。

图2A显示在不同条件下通过qPCR测量的指示Mitf(上图)及Silv(PMEL17)(下图)的相对表达的图。图2B显示通过免疫细胞化学法测量的指示表达MITF(上图)及PMEL17(下图)的细胞的百分比的图。图2A与2B显示在步骤(a)之后用BMP通路活化剂处理对于诱导MITF与PMEL17的表达是必要的。

图3显示用不同BMP通路活化剂处理之后通过免疫细胞化学法(上图)或qPCR(下图)测量的指示表达MITF的细胞的百分比的图。图3显示可用于本文公开的方法的步骤(b)的不同BMP通路活化剂。

图4A显示在不同条件下通过免疫细胞化学法测量的指示表达CRALBP的细胞的百分比的图。

图4B显示在不同条件下通过免疫细胞化学法测量的指示表达MERTK的细胞的百分比的图。

图4C显示在不同条件下通过qPCR测量的指示Rlbp1(CRALBP)(上图)与Mitf(下图)的相对表达的图。

图4D显示在不同条件下通过qPCR测量的指示Mertk(上图)与Best1(下图)的相对表达的图。

图4E显示在不同条件下通过qPCR测量的指示Silv(PMEL17)(上图)与Tyr(下图)的相对表达的图。

图5显示在不同条件下通过免疫细胞化学法测量的在D9-19指示表达CRALBP的细胞的百分比的图。图5显示活化素A是用于本文公开的方法的合适的活化素通路活化剂、且短暂暴露在活化素A下足以诱导RPE标志物的表达。

图6与图7显示当在不同板以不同的接种密度且在任选地包含cAMP的培养基中培养的细胞再铺板时(前期再铺板的实施方式的步骤(e))通过免疫细胞化学法测量在96孔板(图6)与384孔板(图7)在D9-19-20指示表达PMEL17(上图)与CRALBP(下图)的细胞的百分比的图。

图6与图7特别显示了可在步骤(e)中使用的不同的接种密度。

图8A显示在用SMAD抑制剂处理，BMP通路活化剂并在基础培养基中培养至第49天之后，后期再铺板实施方式的第49天(步骤(b))的细胞。图8B显示再铺板后培养(步骤(d))12天之后的细胞。图8C显示在再铺板后培养15天之后通过免疫细胞化学法测量的指示表达PMEL17(上图)与CRALBP(下图)的细胞的百分比的图。

图9A显示通过直接分化产生的7个RPE样品，与通过自发性分化产生的RPE细胞以及去分化对照组的主成分分析(PCA)的标绘图。图9B显示用于PCA的载数标绘图，其指示各个试验基因对样品簇集的贡献。图9C显示通过直接分化(如实施例1与实施例8公开的前期与后期再铺板)获得RPE细胞、通过自发性分化获得的RPE细胞以及hES细胞的全基因转录分析的比较。图10A显示在第10周在的底部室与顶部室的利用过的培养介质中指示VEGF的浓度对PEDF的浓度的比例的图。图10A与通过本发明的方法获得的细胞为RPE细胞的结论相符合。

图10B显示在再铺板的步骤(c)之后细胞培养的利用过的培养介质中描绘PEDF与VEGF的增加的图。图10B与通过本发明的方法获得的细胞为RPE细胞的结论相符合。

图11A为当RPE细胞延展时发生的上皮-间质转化与间质-上皮转化的示意图。

图11B显示在不同条件下RPE细胞延展之后获得的指示细胞(每张影像框的赫斯特染色阳性的细胞核)的数目图。图11B显示使用cAMP或增加胞内的cAMP浓度的试剂的增加了延展步骤的产量。

图11C显示在任选地存在cAMP的情况下RPE细胞延展之后通过免疫细胞化学法测量的指示表达PMEL17的细胞的百分比的图。

图11D显示在任选地存在增加胞内的cAMP浓度的试剂(如福司柯林(Forskolin))的情况下RPE细胞延展之后通过免疫细胞化学法测量的指示表达PMEL17的细胞的百分比的图。

图11E显示在cAMP的存在下指示EdU掺入经延展的RPE细胞的百分比的图。

图11F显示在cAMP的存在下RPE细胞延展之后所获得的指示每cm²的细胞数量的图。

图11G显示在任选地存在cAMP下RPE细胞延展之后通过免疫细胞化学法测量的指示在D14表达Ki67的细胞的百分比的图。

图11H显示在任选地存在cAMP下RPE细胞延展之后通过免疫细胞化学法测量的指示在D14表达PMEL17的细胞的百分比的图。

图11I显示在任选地存在cAMP下RPE细胞延展的后通过qPCR测量的指示在第5周Mitf的表达的图表。

图11J显示在任选地存在cAMP下RPE细胞延展的后通过qPCR测量的指示于第5周Silv的表达的图。

图11K显示在任选地存在cAMP下RPE细胞延展之后通过qPCR测量的指示在第5周Tyr的表达的图。

图12A显示在SMAD抑制剂的存在下指示经延展的RPE细胞掺入EdU的百分比的图。

图12B显示在任选地存在SMAD的抑制剂下RPE细胞延展之后通过qPCR测量的指示在第5周Best1的表达的图。

图12C显示在任选地存在SMAD抑制剂的下RPE细胞延展之后通过qPCR测量的指示在第5周Rlbp1的表达的图。

图12D显示在任选地存在SMAD抑制剂下RPE细胞延展之后通过qPCR测量的指示在第5周Grem1的表达的图。

图13A显示在抗TGFβ1与TGFβ2配体的抗体的存在下指示在第14天经延展的RPE细胞掺入EdU的百分比的图。

图13B显示在任选地存在抗TGFβ1与TGFβ2配体的抗体下RPE细胞延展之后通过免疫细胞化学法测量的指示在第14天表达PMEL17的细胞的百分比的图。

图13C、13D、13E、13F、13G及13H分别显示在任选地存在抗TGFβl与TGFβ2配体的抗体下RPE细胞延展之后通过qPCR测量的指示表达Best1、Merkt、Grem1、Silv、Lrat与Rpe65的细胞的百分比的图。

图14A显示以流式细胞仪筛分的经抗CD59抗体染色的细胞中通过qPCR测量的指示相对表达hESC标志物的图。

图14B显示以流式细胞仪筛分的经抗CD59抗体染色的细胞中通过qPCR测量的指示相对表达RPE标志物的图。

图15A、15B、15C及15D分别显示当RPE细胞中iPSC分化时通过免疫细胞化学法测量的指示在D2、D9(以及对于CRALBP在D9-19)表达OCT4、LHX2、PAX6与CRALBP的细胞的百分比的图。

图15E、15F与15G分别显示在直接分化规程中使用iPSC作为起始材料的第二次再铺板(D9-19-45)之后通过qPCR测量的指示表达Best1、Mertk与Silv的细胞的百分比的图。ESDD表示通过直接分化时使用hESC作为起始材料所获得的RPE细胞。IPSDD表示通过直接分化时使用iPSC作为起始材料所获得的RPE细胞。

【发明详述】

在某些实施方式中，术语“多能性细胞”指在适当的条件下能够分化成具有三层胚层(例如，能够分化成外胚层、中胚层及内胚层的细胞类型)的细胞类型的细胞。多能性细胞也能够通过体外培养以未分化的状态维持一段延长的时间。在一个优选的实施方式中，多能性细胞为脊椎动物的多能性细胞，特别是哺乳动物的多能性细胞，优选为源自人类、灵长类或啮齿类的多能性细胞。优选的多能性细胞为人类多能性细胞。多能性细胞的实施例为胚胎干细胞或诱导性多能性干细胞。在某些实施方式中，多能性干细胞通过不涉及损毁人类胚胎的方法获得的。

在某些实施方式中，多能性干细胞为胚胎干细胞(ESC)。

在某些实施方式中，ESC指衍生自胚胎的干细胞。在某些实施方式中，胚胎是取自体外受精的胚胎。

在某些实施方式中，ESC指衍生自囊胚泡的内细胞群或已连续继代的细胞系的桑葚胚的细胞。在某些实施方式中，该囊胚泡取自从体外受精的胚胎。在某些实施方式中，该囊胚泡是从单性生殖地活化以分裂及发展至囊胚泡阶段的未受精的卵母细胞获得。

ESC可通过本领域技术人员已知的方法(参见例如US5843780,其全文通过援引并入本文)获得的。

例如，为了将hESC自囊胚泡分离，除去透明带且通过免疫外科法分离内细胞群，其中滋养外胚层细胞被溶解且通过轻轻移液从完整的内细胞群除去。接着，铺板内细胞群至含有使内细胞群能够生长的合适培养基的组织培养烧瓶中。9至15天之后，通过机械性分离或通过酶消化将内细胞群衍生的产物分离成团块并接着再铺板细胞至新鲜组织培养基上。以微量吸管个别地选出证明未分化形态的细胞集落，机械性地分离成团块，并再铺板。接着将得到的ESC每1至2周常规地分开。

在某些实施方式中，术语ESC指从胚胎的一个或多个囊胚泡分离的细胞，优选地不损毁剩余的胚胎(参见例如US20060206953或US20080057041，其全文通过援引并入本文)。

在优选的实施方式中，多能性细胞为人类胚胎干细胞。在优选的实施方式中，多能性细胞为不损坏胚胎获得的人类胚胎干细胞。在优选的实施方式中，多能性细胞为源自已经确立的细胞系如MA01、MA09、ACT-4、H1、H7、H9、H14、WA25、WA26、WA27、Shef-1、Shef-2、Shef-3、Shef-4或ACT30的人类胚胎干细胞。

在某些实施方式中，不论ESC的来源或用于制造ESC的特定方法，可基于：(i)具有分化成所有三层胚层的细胞的能力，(ii)表达至少Oct-4及碱性磷酸酶，及(iii)具有当移植至免疫不全的动物时产生畸胎瘤的能力来鉴别ESC。

在某些实施方式中，多能性细胞为诱导性多能性干细胞(iPSC)。

在某些实施方式中，iPSC为衍生自非多能性细胞(如成年体细胞)的多能性细胞，通过重编程(如通过表达因子组合或诱导因子组合表达)该体细胞。IPSC可市售获得或可通过本领域技术人员已知的方法获得。IPSC可使用例如胎儿、产后、新生儿、幼年、或成年的体细胞来产生。在特定的实施方式中，可用于将体细胞重编程为多能性干细胞的因子包括，例如，Oct4(有时指Oct3/4)、Sox2、c-Myc、及Klf4的组合。在其他的实施方式中，可用于将体细胞重编程为多能性干细胞的因子包括，例如，Oct-4、Sox2、Nanog、及Lin28的组合(见例如EP2137296，通过援引全文并入本文)。在某些实施方式中，iPSC通过使用小分子化合物的组合重编程体细胞获得(参见例如Science,Vol.341no.6146，pp.651-654，其通过援引全文并入本文中)。

在优选的实施方式中，多能性细胞为人类诱导性多能性干细胞。在优选的实施方式中，多能性细胞为衍生自人类成年体细胞的诱导性多能性干细胞。

IPSC可使用通过例如援引全文并入本文的US20090068742、US20090047263、US20090227032、US20100062533、US20130059386、WO2008118820、或WO2009006930公开的方法获得。

在某些实施方式中，术语“SMAD抑制剂”指SmallMothersAgainstDecapentaplegic(SMAD)蛋白质信号的抑制剂。

在某些实施方式中，术语“第一SMAD抑制剂”指BMP1型受体ALK2的抑制剂。在某些实施方式中，第一SMAD抑制剂指BMP1型受体ALK2与ALK3的抑制剂。在某些实施方式中，第一SMAD抑制剂防止Smadl、Smad5和/或Smad8磷酸化。在某些实施方式中，第一SMAD抑制剂为dorsomorphin的衍生物。在某些实施方式中，第一SMAD抑制剂为dorsomorphin(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1，5-a]嘧啶)的衍生物。在某些实施方式中，第一SMAD抑制剂选自6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1，5-A]嘧啶(dorsomorphin)、头蛋白(noggin)、原肠胚双向形成相关蛋白(chordin)或4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉(LDN193189)。在优选的实施方式中，第一SMAD抑制剂为4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[l，5-a]嘧啶-3-基)喹啉(LDN193189)或其盐或水合物。

LDN193189为市售可得的下式化合物

在某些实施方式中，术语“第二SMAD抑制剂”指转化生长因子-β13超家族I型活化素受体样激酶(ALK)受体的抑制剂。在某些实施方式中，第二SMAD抑制剂为ALK5的抑制剂。在某些实施方式中，第二SMAD抑制剂为ALK5和ALK4的抑制剂。在某些实施方式中，第二SMAD抑制剂为ALK5和ALK4和ALK7的抑制剂。在某些实施方式中，第二SMAD抑制剂为4-(4-(苯并[d][l,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺(SB-431542)或其盐或水合物。

SB-431542为市售可得的下式化合物

在某些实施方式中，第二SMAD抑制剂是选自：

4-(4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺；

2-甲基-5-(6-(间甲苯基)-1H-咪唑[1,2-a]咪唑-5-基)-2H-苯并[d][l,2,3]三唑；

2-(6-甲基吡啶-2-基)-N-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-胺；

2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶；

4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)苯酚；

2-(4-甲基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)噻吩并[3,2-c]吡啶；

4-(5-(3,4-二羟基苯基)-1-(2-羟苯基)-1H-吡唑-3-基)苯甲酰胺；

2-(5-氯-2-氟苯基)-N-(吡啶-4-基)喋啶-4-胺；或

6-甲基-2-苯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮；

或其盐或水合物。

以上的化合物为市售可得或可由本领域技术人员已知的方法制备(参见例如SurmaczetAl，StemCells2012；30:1875-1884)。

在某些实施方式中，第二SMAD抑制剂是选自3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(A83-01)、2-(5-苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶(SB-505124)、7-(2-吗啉乙氧基)-4-(2-(吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉(LY2109761)或4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉(LY364947)。

在某些实施方式中，BMP通路活化剂包含BMP。在某些实施方式中，BMP通路活化剂包含选自BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP10、BMP11或BMP15的BMP。在某些实施方式中，BMP通路活化剂为BMP同二聚体，优选为BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP10、BMP11或BMP15同二聚体。在某些实施方式中，BMP通路活化剂为BMP同二聚体，优选为BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP7、或BMP8同二聚体。在某些实施方式中，BMP通路活化剂为BMP异二聚体，优选为包含选自BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP10、BMP11或BMP15的BMP。在某些实施方式中，BMP通路活化剂为BMP异二聚体，优选为包含选自BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP7或BMP8的BMP。在某些实施方式中，BMP通路活化剂为BMP2/6异二聚体、BMP4/7异二聚体或BMP3/8异二聚体。在某些实施方式中，BMP通路活化剂为BMP4/7异二聚体。

在某些实施方式中，BMP通路活化剂为BMP信号传导的小分子活化剂(参见通过援引全文并入本文的PLOSONE，March2013,Vol.8(3)，e59045)。

在某些实施方式中，术语“视网膜色素上皮细胞”或“RPE细胞”指具有成年RPE细胞形态上及功能上的属性的细胞，优选为成年人类RPE细胞。

在某些实施方式中，RPE细胞具有成年RPE细胞形态上的属性，优选为成年人类RPE细胞。在某些实施方式中，RPE细胞具有卵石状形态。在某些实施方式中，RPE细胞为具有色素沉着的。RPE细胞的形状、形态及色素沉着能以视觉观察。

在某些实施方式中，RPE细胞表达至少一个下列RPE标志物：MITF、PMEL17、CRALBP、MERTK、BEST1及ZO-1。在某些实施方式中，RPE细胞表达至少二、三、四或五个下列RPE标志物：MITF、PMEL17、CRALBP、MERTK、BEST1及ZO-1。在某些实施方式中，RPE标志物的表达是通过免疫细胞化学法测量。在某些实施方式中，RPE标志物的表达是如实施例部分详述通过免疫细胞化学法测量。在某些实施方式中，RPE标志物的表达是通过定量PCR测量。在某些实施方式中，RPE标志物的表达是如实施例部分详述通过定量PCR测量。

在某些实施方式中，RPE细胞不表达Oct4。

在某些实施方式中，RPE细胞具有成年RPE细胞功能上的属性，优选为成年人类RPE细胞。在某些实施方式中，RPE细胞分泌VEGF。在某些实施方式中，RPE细胞分泌PEDF。在某些实施方式中，RPE细胞分泌PEDF及VEGF。在某些实施方式中，由RPE细胞分泌的VEGF和/或PEDF是通过定量免疫测定法测量。在某些实施方式中，由RPE细胞分泌的VEGF和/或PEDF是如实施例公开那样地测量。

在优选的实施方式中，RPE细胞具有卵石状形态、为具有色素沉着且表达MITF、PMEL17、CRALBP、MERTK、BEST1及ZO-1的中至少一种。在优选的实施方式中，RPE细胞具有卵石状形态、为具有色素沉着且表达MITF、PMEL17、CRALBP、MERTK、BEST1及ZO-1的中至少二种。在优选的实施方式中，RPE细胞具有卵石状形态，具有色素且表达MITF、PMEL17、CRALBP、MERTK、BEST1及ZO-1的中至少二种且分泌VEGF及PEDF。

当一个参数定义为“介于低值与高值之间”，所述的低与高值应被作为定义范围的一部分。

前期再铺板

在一个实施方式中(前期再铺板实施方式)，本发明涉及一种产生RPE细胞的方法，包含以下步骤：

(b)在BMP通路活化剂存在且无第一与第二SMAD抑制剂的情况下培养步骤(a)的细胞；以及，

(c)再铺板步骤(b)的细胞。

在某些实施方式中，在步骤(a)中，多能性细胞被培养至少1天。在某些实施方式中，在步骤(a)中，多能性细胞被培养至少1天、至少2天、至少3天或至少4天。在某些实施方式中，在步骤(a)中，多能性细胞被培养2至10天之间。在某些实施方式中，在步骤(a)中，多能性细胞被培养2至6天之间。在某些实施方式中，在步骤(a)中，多能性细胞被培养3至5天之间。在某些实施方式中，在步骤(a)中，多能性细胞被培养约4天。

在某些实施方式中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓度介于0.5nM至10μM。在某些实施方式中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓度介于1nM至5μM。在某些实施方式中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓度介于1nM至2μM。在某些实施方式中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓度介于500nM至2μM。在某些实施方式中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓度为约1μM。在优选的实施方式中，第一SMAD抑制剂为LDN193189。

在某些实施方式中，在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度介于0.5nM至100μM。在某些实施方式中，在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度介于100nM至50μM。在某些实施方式中，在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度介于1μM至50μM。在某些实施方式中，在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度介于5μM至20μM。在某些实施方式中，在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度为至少5μM。在某些实施方式中，在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度为约10μM。在优选的实施方式中，第二SMAD抑制剂为SB-431542。

在某些实施方式中，在步骤(b)中，BMP通路活化剂的浓度介于1ng/mL至10μg/mL。在某些实施方式中，在步骤(b)中，BMP通路活化剂的浓度介于5ng/mL至1μg/mL。在某些实施方式中，在步骤(b)中，BMP通路活化剂的浓度介于50ng/mL至500ng/mL。在某些实施方式中，在步骤(b)中，BMP通路活化剂的浓度为约100ng/mL。在优选的实施方式中BMP通路活化剂为BMP4/7异二聚体。

在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞被培养至少1天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞被培养至少1天、至少2天、至少3天或至少4天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞被培养至少3天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞被培养2至20天之间。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞被培养2至10天之间。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞被培养2至6天之间。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞被培养2至4天之间。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞被培养约3天。

在某些实施方式中，在步骤(a)之前，细胞以至少20000细胞/cm²的起始密度被单层培养。在某些实施方式中，在步骤(a)之前，细胞以至少100000细胞/cm²的起始密度被单层培养。在某些实施方式中，在步骤(a)之前，细胞以介于20000至1000000细胞/cm²的起始密度被单层培养。在某些实施方式中，在步骤(a)之前，细胞以介于100000至500000细胞/cm²的起始密度被单层培养。在某些实施方式中，在步骤(a)之前，细胞以约240000细胞/cm²的起始密度被单层培养。

在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以至少1000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以至少10000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以至少20000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以至少100000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以介于20000至5000000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以介于100000至1000000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以约500000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞被再铺板于纤连蛋白、或上。

在某些实施方式中，本发明涉及一种产生RPE细胞的方法包含前文公开的步骤(a)、(b)及(c)并进一步包含以下步骤：

(d)在活化素通路活化剂的存在下培养步骤(c)的再铺板的细胞；

(e)再铺板步骤(d)的细胞；以及，

(f)培养步骤(e)的再铺板的细胞。

在某些实施方式中，活化素通路活化剂为活化素A通路活化剂。在某些实施方式中，活化素通路活化剂包含活化素A或活化素B。在优选的实施方式中，活化素通路活化剂为活化素A。

在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在活化素通路活化剂的存在下被培养至少1天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在活化素通路活化剂的存在下被培养至少3天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在活化素通路活化剂的存在下被培养1至50天、3至30天或3至20天。

在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在活化素通路活化剂的存在下被培养至少1天且细胞进一步在无活化素通路活化剂的存在下被培养至少3天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在活化素通路活化剂的存在下被培养至少3天且细胞进一步在无活化素通路活化剂的存在下被培养至少4天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在活化素通路活化剂的存在下被培养1至10天且细胞进一步在无活化素通路活化剂的存在下被培养5至30天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在活化素通路活化剂的存在下被培养约3天且细胞进一步在无活化素通路活化剂的存在下被培养5至30天。

在某些实施方式中，在步骤(d)中，活化素通路活化剂的浓度介于1ng/mL至10μg/mL。在某些实施方式中，在步骤(d)中，活化素通路活化剂的浓度介于1ng/mL至1μg/mL。在某些实施方式中，在步骤(d)中，活化素通路活化剂的浓度介于10ng/mL至500ng/mL。在某些实施方式中，在步骤(d)中，活化素通路活化剂为浓度约100ng/mL的活化素A。

在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以至少1000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以至少20000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以至少100000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以介于20000至5000000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以介于20000至1000000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以介于20000至500000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以约200000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞被再铺板于纤连蛋白、或上。

在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养至少5天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养至少7天、至少14天或至少21天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养至少14天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养介于5至40天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养介于10至35天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养介于21至35天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养约28天。

在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在cAMP的存在下被培养，优选为浓度介于0.01mM至1M。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在0.1mM至5mM的cAMP的存在下被培养。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在0.5mM的cAMP的存在下被培养。

在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞在cAMP的存在下被培养，优选为浓度介于0.01mM至1M。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞在0.1mM至5mM的cAMP的存在下被培养。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞在0.5mM的cAMP的存在下被培养。

本发明的公开也包含组合了前文公开的步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和/或(f)的实施方式的方法。

在优选的实施方式中，本发明涉及一种产生视网膜色素上皮细胞的方法包含下列步骤：

(a)在500nM至2μM的LDN193189及5μM至20μM的SB-431542的存在下将人类ESC或人类iPSC培养3至5天。

(b)在50ng/mL至500ng/mL的BMP2/6异二聚体、BMP4/7异二聚体或BMP3/8异二聚体存在且无LDN193189及SB-431542的情况下培养步骤(a)的细胞2至6天；及，

(c)以介于100000至1000000细胞/cm²的密度再铺板步骤(b)的细胞。

(d)在约10ng/mL至500ng/mL的活化素A存在的存在下培养步骤(c)的经再铺板的细胞3至30天；

(e)以介于20000至500000细胞/cm²的密度再铺板步骤(d)的细胞；和

(f)培养步骤(e)的经再铺板的细胞10至35天。

后期再铺板

在替代的实施方式中(后期再铺板实施方式)，产生RPE细胞的方法包含以下步骤：

(b)在BMP通路活化剂存在且无第一与第二SMAD抑制剂的情况下培养步骤(a)的细胞；然后，

在无BMP通路活化剂的存在下培养该细胞至少10天；

(c)再铺板步骤(b)的具有卵石状形态的细胞；以及，

(d)培养步骤(c)的经再铺板的细胞。

前文公开的实施方式组合前期再铺板的实施方式的步骤(a)、(b)及(c)也是后期再铺板的实施方式的步骤(a)、(b)及(c)。

在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞在无BMP通路活化剂的存在下被培养至少20天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞在无BMP通路活化剂的存在下被培养至少30天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞在无BMP通路活化剂的存在下被培养至少40天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞在无BMP通路活化剂的存在下被培养10至60天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞在无BMP通路活化剂的存在下被培养30至50天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，细胞在无BMP通路活化剂的存在下被培养约40天。

在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以至少1000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以至少20000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以至少100000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以介于20000至5000000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以介于50000至1000000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以介于50000至500000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(c)中，细胞以约200000细胞/cm²的密度被再铺板。

在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞被培养至少3天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞被培养至少5天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞被培养至少10天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞被培养至少14天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞被培养介于10至40天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞被培养介于10至20天。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞被培养约14天。

在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在cAMP的存在下被培养，优选为浓度介于0.01mM至1M。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在0.1mM至5mM的cAMP的存在下被培养。在某些实施方式中，在步骤(d)中，细胞在0.5mM的cAMP的存在下被培养。在某些实施方式中，方法进一步包含以下额外步骤：

(e)再铺板步骤(d)的细胞；

(f)培养步骤(e)的再铺板的细胞。

在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以至少1000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以至少20000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以至少100000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以介于20000至5000000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以介于50000至1000000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以介于50000至500000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，在步骤(e)中，细胞以约200000细胞/cm²的密度被再铺板。

在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养至少10天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养至少14天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养至少20天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养至少25天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养至少40天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养介于10至60天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养介于15至40天。在某些实施方式中，在步骤(f)中，细胞被培养约28天。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及一种产生RPE细胞的方法包含以下步骤：

(a)在500nM至2μM的LDN193189及5μM至20μM的SB-431542的存在下将人类ESCs或人类iPSCs培养3至5天；

(b)在50ng/mL至500ng/mL的BMP2/6异二聚体、BMP4/7异二聚体或BMP3/8异二聚体存在且无LDN193189及SB-431542的情况下培养步骤(a)的细胞2至6天；然后，

在无BMP通路活化剂的存在下培养该细胞30至50天

(c)以介于50000至500000细胞/cm²的密度再铺板步骤(b)的具有卵石状形态的细胞；以及，

(d)培养步骤(c)的经再铺板的细胞介于10至20天；

(e)以介于50000至500000细胞/cm²的密度再铺板步骤(d)的细胞；以及，

(f)培养步骤(e)的经再铺板的细胞介于15至40天。

通过本文公开的方法而制备的RPE细胞(包括前期再铺板及后期再铺板)可通过本领域技术人员已知的多种方法收集。例如，RPE细胞可通过机械性切割或通过酶(如木瓜酶或胰蛋白酶)分离而收集。

通过本文公开的方法制备的RPE细胞可例如，不受限制地，通过技术比如荧光激活细胞分选术(FluorescenceActivatedCellSorting,FACS)或磁性活化细胞分类法(MagneticActivatedCellSorting,MACS)而进一步纯化。这些技术涉及抗RPE专一性细胞表面蛋白(正向选择)抗体的使用。在优选的实施方式中，该RPE专一性细胞表面蛋白为CD59。对于FACS，RPE细胞能以目标为特异性RPE细胞表面标记物的缀合荧光团的抗体标记。这些经标记的细胞可使用细胞计数器纯化以产生高同源性且经纯化的无任何污染细胞类型的RPE群。与MACS相似地，RPE细胞可被缀合磁性纳米粒子的抗体标记且进一步通过磁场的应用而纯化。负向选择可通过使用抗体目标潜在污染的细胞类型而应用，其导致这些潜在污染细胞类型被除去且也有助于生产纯RPE群。

在某些实施方式中，本文公开的产生RPE细胞的方法包含纯化步骤，用于就表达CD59的细胞而言富集该细胞群。就表达CD59的细胞而言富集该细胞群,是一种富集成熟RPE细胞并除去可能在最终RPE细胞群中出现的多余的污染细胞如多能性细胞和/或RPE前体的手段。

在某些实施方式中，本文公开的产生RPE细胞的方法包含纯化步骤，包含：

-将细胞与缀合荧光团的抗CD59抗体接触；以及，

-使用FACS选择与抗CD59抗体结合的细胞。

在优选的实施方式中，抗CD59抗体为抗体Cat#560747(BDBiosciences)。

在某些实施方式中，本文公开的产生RPE细胞的方法包含如实施例13b公开的纯化步骤。

-将细胞与缀合磁性粒子的抗CD59抗体接触；以及，

-使用MACS选择与抗CD59抗体结合的细胞。

市售可得的抗CD59抗体例如抗体Cat#560747(BDBiosciences)可使用于本发明。

在某些实施方式中，如前文公开的纯化步骤在前期再铺板方法的步骤(e)之后进行。在某些实施方式中，如前文公开的纯化步骤在前期再铺板方法的步骤(f)之后进行。在某些实施方式中，如前文公开的纯化步骤在后期再铺板方法的步骤(c)之后进行。在某些实施方式中，如前文公开的纯化步骤在后期再铺板方法的步骤(d)之后进行。

在某些实施方式中，本发明涉及产生RPE细胞的方法包含：

a)提供多能性细胞的群；

b)诱导多能性细胞分化成RPE细胞；以及，

c)就表达CD59的细胞而言使细胞群富集。

在某些实施方式中，本发明涉及产生RPE细胞的方法包含：

a)提供多能性细胞的群；

b)诱导多能性细胞分化成RPE细胞；以及，c)就表达CD59的细胞而言使细胞群富集，通过

-将细胞与缀合荧光团的抗CD59抗体接触；以及，

-使用FACS选择与抗CD59抗体结合的细胞。

在某些实施方式中，本发明涉及产生RPE细胞的方法包含：

a)提供多能性细胞的群；

b)诱导多能性细胞分化成RPE细胞；以及，

c)就表达CD59的细胞而言使细胞群富集，通过

-将细胞与缀合磁性粒子的抗CD59抗体接触；以及，

-使用MACS选择与抗CD59抗体结合的细胞。

在步骤b)中，多能性细胞分化成RPE细胞可通过本领域技术人员所知的任何方法如自发性分化或直接分化方法进行。特别地，在步骤b)中，多能性细胞分化成RPE细胞可通过WO08/129554、WO09/051671、WO2011/063005、US2011269173、US20130196369、WO2013/184809、WO08/087917、WO2011/028524或WO2014/121077(通过援引并入本文)所公开的任何方法进行。

在某些实施方式中，本发明涉及纯化RPE细胞的方法包含：

a)提供包含RPE细胞与非RPE细胞的细胞群；

b)通过就表达CD59的细胞而言使该细胞群富集,以增加细胞群中RPE细胞的百分比。

在某些实施方式中，本发明涉及纯化RPE细胞的方法包含：

a)提供包含RPE细胞及非RPE细胞的细胞群；

b)增加细胞群中RPE细胞的百分比，通过

-将细胞群与缀合荧光团的抗CD59抗体接触；以及

-使用FACS选择与抗CD59抗体结合的细胞。

在某些实施方式中，本发明涉及纯化RPE细胞的方法包含：

a)提供包含RPE细胞与非RPE细胞的细胞群；

b)增加细胞群中RPE细胞的百分比，通过

-将该细胞群与缀合磁性粒子的抗CD59抗体接触；以及

-使用MACS选择与抗CD59抗体结合的细胞。

在某些实施方式中，非RPE细胞为多能性细胞或RPE前体。

在某些实施方式中，术语“RPE前体”指衍生自多能性细胞比如经诱导的hESC分化成RPE细胞但其未完整地完成分化过程的细胞。在某些实施方式中，所述“RPE前体”包含具有一种或多种成年RPE细胞形态上及功能上的属性且缺乏至少一种成年RPE细胞形态上及功能上的属性。在某些实施方式中，RPE前体表达OCT4、NANOG或LIN28的一种或多种。

在本文公开方法的某些实施方式中，细胞在附着情况下以二维培养被培养，比如培养皿培养。在优选的实施方式中，细胞被单层培养。在某些实施方式中，细胞在细胞支撑物质，例如不受限的胶原蛋白、明胶、L-聚赖氨酸、D-聚赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、人类玻连蛋白、BME或(Becton，DickinsonandCompany)上被培养。在某些实施方式中，细胞被单层培养，例如，在胶原蛋白、明胶、L-聚赖氨酸、D-聚赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、人类玻连蛋白、BME或上培养。在优选的实施方式中，细胞在上被单层培养。在优选的实施方式中，细胞在纤连蛋白或人类玻连蛋白上被单层培养。

在某些实施方式中，本文公开的方法的某些步骤可在无附着的情况下以三维培养进行，如悬浮培养。在悬浮培养中，大部分的细胞为以单一细胞、丛聚细胞和/或细胞聚集在液状培养基内自由悬浮。细胞可通过本领域技术人员已知的方法(参见例如Kelleretal,CurrentOpinioninCellBiology，Vol7(6),862-869(1995)或Watanabeetal.,NatureNeuroscience8，288-296(2005))在三维系统中培养。

在某些实施方式中，本文公开的方法的某些步骤可在三维培养中进行，例如不受限制的，如悬浮培养及在二维培养中进行的某些步骤(例如单层培养细胞)。在某些实施方式中，步骤(a)和/或(b)在悬浮培养中进行且随后的步骤在二维培养中进行(例如单层培养细胞)。

在某些实施方式中，细胞在接种之前以Rho蛋白激酶(ROCK)抑制剂培养。在某些实施方式中，细胞在步骤(a)之前以ROCK抑制剂培养。ROCK抑制剂为允许分离的人类胚胎干细胞存活的物质(参见K.WatanabeetA1.，Nat.Biotech.,25:681-686(2007))。本发明的方法中可使用的ROCK抑制剂的实施例，不受限制地，为Y-27632、H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、GSK269962A及SB-772077-B。在某些实施方式中，ROCK抑制剂为Y-27632。在某些实施方式中，步骤(a)之前，在ROCK抑制剂的存在下铺板多能性细胞。在某些实施方式中，在铺板之后在ROCK抑制剂的存在下培养细胞1或2天。在某些实施方式中，本发明的方法的第一次再铺板在ROCK抑制剂的存在下进行。在某些实施方式中，在第一次再铺板之后在ROCK抑制剂的存在下培养细胞1或2天。

在本发明的方法中，细胞可在任何适合培养多能性细胞的基本培养基中培养，优选为人类多能性细胞。在某些实施方式中，细胞在适合培养人类胚胎干细胞的基本培养基中培养。

适合的基本培养基的实施例包括，不受限制，IMDM培养基、培养基199、EMEM培养基(Eagle'sMinimumEssentialMedium(EMEM))、AMEM培养基、DMEM培养基(Dulbecco’smodifiedEagle’sMedium(DMEM))、KO-DMEM、Ham’sF12培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、GlasgowMEM、TesRl、TesR2、Essential8及其混合物。在某些实施方式中培养基包含血清。在某些实施方式中，培养基为无血清的。在优选的实施方式中，基本培养基为TesRl或TesR2。

培养基可进一步包含，如果期望的话，一种或多种血清替代物，如白蛋白、运铁蛋白、Knockout血清替代品(KnockoutSerumReplacement(KSR))、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-巯基、甘油、B27补充剂及N2补充剂、以及一种或多种物质如脂肪、氨基酸、非必需氨基酸、维生素、生长因子、细胞激素、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸盐、缓冲剂及无机盐。

本发明的细胞培养方法使用的基本培养基可以用，例如不受限制地，SMAD抑制剂、BMP通路活化剂、活化素通路活化剂和/或cAMP被适当地补充。

在前文公开的方法的某些实施方式中，步骤(a)使用的细胞为hESC或人类IPSc，且此方法在不含异物的条件下进行，即不使用除了人类以外的任何动物的衍生材料。例如，当此方法在无异物的条件下进行时，培养基及细胞支撑物质不包含除了人类以外的任何动物的衍生材料。

在某些实施方式中，再铺板包含分离经铺板的细胞，优选为分离单层细胞，并铺板该经分离的细胞。优选的是，细胞使用酶比如例如胰蛋白酶、胶原蛋白酶IV、胶原蛋白酶I、中性蛋白酶或市售可得的细胞分离缓冲剂分离。优选的是，细胞使用TrypLE分离。

在某些实施方式中，通过本文公开的方法获得或可获得的RPE细胞被进一步延展。在某些实施方式中延展步骤是在附着的情况下以二维培养进行。在某些实施方式中，延展步骤包含：

-再铺板RPE细胞；以及，

-培养再铺板的RPE细胞。

在某些实施方式中，RPE细胞被再铺板于细胞支撑物质上。适合的细胞支撑物质包括，例如不受限制，胶原蛋白、明胶、L-聚赖氨酸、D-聚赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、人类玻连蛋白、或BME(BME是从EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)肿瘤纯化的基底膜的可溶性形式。它主要包含层粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白(entactin)、及肝素硫酸盐蛋白多醣)。在优选的实施方式中，细胞支撑物质是选自Fibronectin或优选为

在某些实施方式中，RPE细胞以介于1000至100000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，RPE细胞以介于5000至100000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，RPE细胞以介于10000至40000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，RPE细胞以介于10000至30000细胞/cm²的密度被再铺板。在某些实施方式中，RPE细胞以约20000细胞/cm²的密度被再铺板。

在某些实施方式中，再铺板的细胞被培养至少7天。在某些实施方式中，再铺板的细胞被培养至少14天。在某些实施方式中，再铺板的细胞被培养至少28天。在某些实施方式中，再铺板的细胞被培养至少42天。在某些实施方式中，再铺板的细胞被培养21至70天。在某些实施方式中，再铺板的细胞被培养30至60天。在某些实施方式中，再铺板的细胞被培养约49天。

在某些实施方式中，RPE细胞在cAMP的存在下被培养，优选为浓度介于0.01mM至1M。在某些实施方式中，RPE细胞在0.1mM至5mM的cAMP的存在下被培养。在某些实施方式中，RPE细胞在约0.5mM的cAMP的存在下被培养。

在某些实施方式中，RPE细胞在增加胞内的cAMP浓度的试剂的存在下被培养。在某些实施方式中，该试剂为腺苷环化酶活化剂，优选为福司柯林。在某些实施方式中，该试剂为磷酸二脂酶(PDE)抑制剂，优选为PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、PDE7、PDE8、PDE10和/或PDE11抑制剂。在某些实施方式中，该试剂为PDE4、PDE7和/或PDE8抑制剂。

在某些实施方式中，RPE细胞在SMAD抑制剂的存在下被培养，优选为浓度介于1nM至100μM。在某些实施方式中，RPE细胞在10nM至10μM的SMAD抑制剂的存在下被培养。在某些实施方式中，RPE细胞在10nM至1μM的SMAD抑制剂的存在下被培养。在某些实施方式中，该SMAD抑制剂为TGFβI型受体(ALK5)和/或TGFβ第II型受体的抑制剂。在优选的实施方式中，该SMAD抑制剂为ALK5抑制剂。在某些实施方式中，该SMAD抑制剂为2-(6-甲基吡啶-2-基)-N-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-胺、6-(1-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)喹唑啉-4(3H)-酮、或4-甲氧基-6-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)喹啉。可用于本发明SMAD抑制剂的实施例也可在例如EP2409708A1或YinglingJMetal.NatureReviews/DrugDiscoveryVol.3:1011-1022(2004)中找到。

在某些实施方式中，RPE细胞在cAMP或增加胞内的cAMP浓度的试剂(优选为cAMP)的存在下被培养，相比于在无所述试剂或cAMP的相似条件下，延展步骤的产量会增加。

本发明也涉及延展RPE细胞的方法包含在SMAD抑制剂、cAMP或增加胞内的cAMP浓度的试剂的存在下培养该RPE细胞的步骤。在某些实施方式中，本发明涉及一种延展RPE细胞的方法包含下列步骤：

(a)以至少1000细胞/cm²的密度铺板RPE细胞；以及，

(b)在SMAD抑制剂、cAMP或增加胞内的cAMP浓度的试剂的存在下培养所述RPE细胞。

在某些实施方式中，在步骤(a)中，RPE细胞铺板于细胞支持物质例如选自胶原蛋白、明胶、L-聚赖氨酸、D-聚赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、人类玻连蛋白、或BME在优选的实施方式中，在步骤(a)中，细胞支持物质是选自纤连蛋白或优选为

在某些实施方式中，在步骤(a)中，RPE细胞以介于1000至100000细胞/cm²的密度铺板。在某些实施方式中，在步骤(a)中，RPE细胞以介于5000至100000细胞/cm²的密度铺板。在某些实施方式中，在步骤(a)中，RPE细胞以介于10000至40000细胞/cm²的密度铺板。在某些实施方式中，在步骤(a)中，RPE细胞以介于10000至30000细胞/cm²的密度铺板。在某些实施方式中，在步骤(a)中，RPE细胞以约20000细胞/cm²的密度铺板。

在某些实施方式中，在步骤(b)中，RPE细胞被培养至少7天。在某些实施方式中，经再铺板的细胞被培养至少14天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，经再铺板的细胞被培养至少28天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，经再铺板的细胞被培养至少42天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，经再铺板的细胞被培养介于21至70天。在某些实施方式中，在步骤(b)中，经再铺板的细胞被培养介于30至60天。在某些实施方式中，经再铺板的细胞被培养约49天。

在某些实施方式中，在步骤(b)中，RPE细胞在增加胞内的cAMP浓度的试剂的存在下被培养。在某些实施方式中，该试剂为腺苷环化酶活化剂，优选为福司柯林。在某些实施方式中，该试剂为磷酸二脂酶(PDE)抑制剂，优选为PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、PDE7、PDE8、PDE10和/或PDE11抑制剂。在某些实施方式中，该试剂为PDE4、PDE7和/或PDE8抑制剂。

在某些实施方式中，在步骤(b)中，RPE细胞在cAMP的存在下被培养，优选为浓度介于0.01mM至1M。在某些实施方式中，在步骤(b)中，RPE细胞在0.1mM至5mM的cAMP的存在下被培养。在某些实施方式中，在步骤(b)中，RPE细胞在约0.5mM的cAMP的存在下被培养。

在某些实施方式中，在步骤(b)中，RPE细胞在cAMP或增加胞内的cAMP浓度的试剂(优选为cAMP)的存在下被培养，相比于在无所述试剂或cAMP的相同方法下，延展的RPE细胞的方法的产量会增加。

在某些实施方式中，在步骤(b)中，RPE细胞在SMAD抑制剂的存在下被培养，优选为浓度介于1nM至100μM。在某些实施方式中，RPE细胞在10nM至10μM的SMAD抑制剂的存在下被培养。在某些实施方式中，RPE细胞在约10nM至1μM的SMAD抑制剂的存在下被培养。在某些实施方式中，所述SMAD抑制剂为TGFβI型受体(ALK5)和/或TGFβ第II型受体抑制剂。在一个优选实施方式中，所述SMAD抑制剂为ALK5抑制剂。在一些实施方式中，所述SMAD抑制剂为2-(6-甲基吡啶-2-基)-N-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-胺、6-(1-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)喹唑啉-4(3H)-酮、或4-甲氧基-6-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)喹啉。可用于本发明的SMAD抑制剂的实施例也可在例如EP2409708A1或YinglingJMetal.NatureReviews/DrugDiscoveryVol.3:1011-1022(2004)中找到。

在某些实施方式中，本发明涉及通过本文公开的方法获得的RPE细胞。在某些实施方式中，本发明涉及通过本文公开的方法可获得的RPE细胞。

通过本文公开的方法获得或可获得的RPE细胞可作为研究工具使用。例如，RPE细胞可用于新药开发的体外模型以提升其存活、再生和/或功能或对RPE细胞具有毒性或再生效应的化合物的高通量筛选。

通过本文公开的方法获得或可获得的RPE细胞可用于疗法中。在某些实施方式中，RPE细胞可用于视网膜疾病的治疗。

在某些实施方式中，RPE细胞被配制成药物组合物，其适于移植进入患有视网膜疾病的受试者的眼中。

在某些实施方式中，适于移植入眼中的药物组合物包含适于支撑RPE细胞及适于RPE细胞的结构。这样的药物组合物的不受限制的实施例公开于WO2009/127809、WO2004/033635或WO2012/009377或WO2012177968，其通过援引全文并入本文。

在优选的实施方式中药物组合物包含多孔的膜及RPE细胞。在某些实施方式中，膜的孔的直径介于0.2μm至0.5μm且孔的密度介于每cm²为1x10⁷至3x10⁸孔。在某些实施方式中膜的一侧被支持RPE细胞的涂覆层涂覆。在某些实施方式中，涂覆层包含醣蛋白，优选为选自层粘连蛋白或人类玻连蛋白。在优选的实施方式中，涂覆层包含人类玻连蛋白。在某些实施方式中，涂覆层是由聚酯制成。

在替代性的实施方式中，药物组合物包含RPE细胞，其悬浮于适于移植入受试者眼睛的培养基中。这样的药物组合物的实施例公开于WO2013/074681，其通过援引全文并入本文。

通过本文公开的方法获得的RPE细胞可被移植至受试者眼中的多种目标位置。根据一个实施方式，RPE细胞是移植至眼中的次视网膜空间(光感受器外节与脉络膜之间)。除此之外，可考虑植入另外的眼睛腔室包括玻璃体空间、内及外视网膜、视网膜边缘及脉络丛内。

可通过现有技术中已知的多种技术进行RPE细胞移植入眼睛(参见例如美国专利No5962027、6045791及5,941,250,其通过援引全文并入本文)。

在某些实施方式中，移植是透过平坦部玻璃体切割术后接着将细胞送经视网膜小开口至次视网膜空间进行。在某些实施方式中，使用适合的装置RPE细胞移植入眼睛(见如WO2012/099873或WO2012/004592，其通过援引全文并入本文)。

在某些实施方式中，移植是通过直接注射至受试者眼中进行。

在某些实施方式中，通过本文公开的方法获得的RPE细胞可用于视网膜疾病的治疗。在某些实施方式中，本发明涉及通过本文公开的方法获得的或可获得的RPE细胞，或包含所述细胞的药物组合物，用于治疗受试者的视网膜疾病。在某些实施方式中，本发明涉及通过本文公开的方法获得的或可获得的RPE细胞的用途，或包含这样的细胞的药物组合物，用于制备治疗受试者的视网膜疾病的药物。在某些实施方式中，本发明涉及在受试者中治疗视网膜疾病的方法，通过对所述的患者给药通过本文公开的方法获得或可获得的RPE细胞或者包含至这样的细胞的药物组合物。

在某些实施方式中，受试者为哺乳动物，优选为人类。

在某些实施方式中，视网膜疾病是与视网膜功能不全、视网膜受损、和/或视网膜色素上皮的丧失或病变有关的疾病。在某些实施方式中，视网膜疾病是选自色素性视网膜炎、莱贝尔先天性黑矇(Leber’sCongenitalamaurosis)、遗传或后天的黄斑变性、老年性黄斑退化症(AMD)、卵黄状黄斑变性(Bestdisease)、视网膜脱落、环状萎缩(gyrateatrophy)、无脉络膜、型营养不良(patterndystrophy)及其他RPE细胞的营养不良、糖尿病视网膜病变或Stargardt氏症。在优选的实施方式中，视网膜疾病是色素性视网膜炎或老年性黄斑变性(AMD)。在优选的实施方式中，视网膜疾病是老年性黄斑变性。

实施例

实施例1-前期再铺板的直接分化

所有作业在灭菌组织培养橱中进行。在TeSRl培养基(StemCellTechnologies)中Matrigel(BD)上常规地培养Shef-1hESC。在Essential8培养基(LifeTechnologies)中人类玻连蛋白(LifeTechnologies)上例行性地培养WA26hESC(Wicell)。培养物使用0.5mM的EDTA溶液(Sigma)一周传代两次以将细胞集落分割成较小的聚集块，其接着在含有10μM的Y-27632(Rho相关激酶抑制剂)(Sigma)的培养基内再铺板。每日替换培养基。

Shefl或WA26hESC(Wicell)在37℃以10μM的Y276352(ROCK抑制剂)培养35分钟。除去培养基且细胞用5ml的PBS(-MgCl₂，-CaCl₂)(以下称为PBS(-/-))洗涤。加入2mL的TrypLE并在潮湿的恒温培养箱中以37℃/5％C0₂培养细胞6-8分钟。DMEMKSRXF培养基如下表制备：

TesR2completemedia(TesR2)如下表制备：

成分	产品目录编号	体积(mL)
			TesR2基底培养基	05860(Stem cell technologies)	78
TesR2 5x补充物	05860(Stem cell technologies)	20
			TesR2 250x补充物	05860(Stem cell.technologies)	0.4

加入5mL的DMEMKSRXF培养基并上下吸量以获得单细胞悬浮液。将悬浮液移至15mL的离心管(falcontube)并以300xg离心4分钟。吸取上清液并在5mL的TesR2complete中重新悬浮颗粒。细胞悬浮液经过40μM的细胞滤器进入50mL的离心管，且细胞滤器接着以lmL的TesR2complete洗涤。细胞以1300rpm离心4分钟。吸取上清液并以5μM的Y276352补充的3mL的TesR2complete中重新悬浮颗粒。用需要的基质(如Matrigel或纤连蛋白)涂覆T25烧瓶。在冰箱内隔夜解冻Matrigel并在使用前与KnockoutDMEM以1：15稀释。纤连蛋白在PBS(-/-)中以1：10稀释。使用经稀释的2.5ml基质涂覆T25烧瓶并在37℃培养3小时。计数细胞并以适当的密度在经涂覆的培养容器中铺板以获得单层细胞。在T25烧瓶中，在总体积10mL且包含5μMY276352的TesR2中以240000细胞/cm²的密度接种细胞。这个时间点被设定成第0天。铺板24小时之后(第1天)，吸取培养基并以10mL/烧杯的TesR2completemedia(不含Rock抑制剂)取代。铺板48小时之后(第2天)，吸取培养基并以含有1μMLDN193189及10μMSB-431542的10mL/烧杯DMEMKSRXF培养基取代。每日添补包含两种抑制剂的培养基。在第6天，吸取培养基并用含有100ng/mL的BMP4/7异二聚体的10mL/烧杯DMEMKSRXF培养基替代。每日添补含有BMP4/7的新鲜培养基。

在第9天，细胞如下文再铺板(前期再铺板1)。第一，培养容器如T12.5烧瓶、96孔CellBind板或384孔CellBind板以需要的基质(如Matrigel、Fibronectin或Cellstart)涂覆。在冰箱内隔夜解冻Matrigel并在使用前与DMEM以1:15稀释。纤连蛋白在PBS(-/-)中以1:10稀释。Cellstart在PBS(+MgCl₂,+CaCl₂)中以1:50稀释(以下称为PBS(+/+))。使用1.5ml稀释的基质涂覆T12.5烧瓶并在37℃培养3小时。接着，加入10μM的Y276352至各个T25烧瓶的细胞(分化规程的第9天)并在37℃培养35分钟。吸取培养基且细胞以5mL的PBS(-/-)洗涤两次。加入2.5mL的TrypLE至各个烧瓶并将烧杯移至37℃下15-25分钟，直到细胞从烧瓶脱离。向各个烧瓶中加入5mL的DMEMKSRXF培养基并用以洗涤烧瓶表面。细胞悬浮液经过40μm的细胞滤器。细胞在室温下以400xg离心5分钟。吸取上清液并在10mL的DMEMKSRXF培养基(+5μMY276352)中重新悬浮颗粒。吸取上清液并在10mL的DMEMKSRXF培养基(5μMY276352)中重新悬浮颗粒。计数细胞并在经涂覆的培养容器中以500000细胞/cm²的密度铺板。再铺板24小时之后(即D10,其也可指示为分化规程的D9-1)，将培养基换成DMEMKSRXF+100ng/mL的活化素A。用新鲜的活化素A每周添补培养基三次。

在第9-19天(即第28天)之后，再铺板细胞得到RPE细胞的同源性群(前期再铺板2)。吸取培养基并用5mL的PBS(-/-)洗涤细胞两次。向各个烧瓶中加入2.5mL的Accutase并在37℃培养细胞约35分钟，直到细胞自烧瓶脱离。在经70μm的滤器将内容物移至50mL的离心管之前，向各个烧瓶中加入5mL的DMEMKSRXF培养基并用以洗涤烧瓶的表面。细胞在室温下以400xg离心5分钟。吸取上清液并在10mL的DMEMKSRXF培养基中重新悬浮颗粒。使用血球计计数细胞，并在经涂覆的培养容器中的DMEMKSRXF培养基(例如Cellstart在PBS(+/+)中以1:50稀释)中以多种密度(如120000细胞/cm²)铺板细胞。新鲜培养基每周添补两次。

细胞维持培养14天。通过免疫细胞化学法及qPCR检测RPE标志物(PMEL17,ZO1，BEST1，CRALBP)的表达，特别表征得到的RPE细胞。超过90％的细胞表达了RPE标志物PMEL17。

本规程结果产生表达RPE标志物PMEL17及其他成熟RPE细胞标记物比如CRALBP及MERTK的RPE细胞。

本规程包括用SMAD抑制剂处理单层多能性细胞，优选为LDN193189及SB-431542，之后接着活化BMP通路，例如使用重组BMP4/7异二聚体蛋白。接着LDN193189/SB-431542及BMP4/7的处理之后，再铺板细胞(前期再铺板1)并能用活化素A处理。用活化素A处理之后，第二次再铺板细胞(前期再铺板2)至基底培养基并维持培养以获得纯RPE细胞培养物。这导致同源性RPE细胞培养的产生。

不受限于任何理论，据信使用SMAD抑制剂抑制TGFβ信号导致hESC向前神经外胚层(Anteriorneuroectoderm,ANE)分化。随后用BMP通路活化剂(如BMP4/7)处理诱导ANE向眼动区分化。随后的再铺板及任选地用活化素A处理使得向RPE结果分化。

本发明公开因此提供稳健且可再现的hESC的分化以产生纯RPE细胞的方法。另外，本规程易于量化以得到高产量。该方法可用于可再现地且有效地在不含异物的条件下将hESC分化成RPE细胞。

实施例2-用SMAD抑制剂处理

本实施例阐明SMAD抑制剂对hESC的效果。

2.1.用SMAD抑制剂处理导致ANE形成

在以Matrigel涂覆的96孔板上以125000细胞/cm²的密度接种Shef-1hESC。在接种之后的第2天，用1μM的LDN193189及10μM的SB-431542处理细胞且于第2天、第6天、第8天及第10天固定样品。对于PAX6(ANE标志物)的表达及OCT4(多能性hESC标志物)的下调进行细胞免疫化学法。在用LDN193189及SB-431542诱导的样品中发现，随着分化的时间推移，均匀诱导的PAX6蛋白和均匀减少的OCT4(图1B)。这不只在96孔板的其中一个孔的整个表面观察到，而且类似地在板中的所有孔中都观察得到，其指示了以较低的板中/板内变异性进行强健的诱导。相比之下，未用LDN193189及SB-431542处理且保持在培养基中的样品在时程结束时仅仅表达低水平的PAX6及高水平的OCT4，这显示在不存在LDN193189及SB-431542时未发生ANE的有效诱导(图1C)。

2.2用SMAD抑制剂处理两天

在以Matrigel涂覆的96孔板上以125000细胞/cm²的密度接种Shef-1hESC。在接种之后的第2天，如表1中描述的不同时间长度用1μM的LDN193189及10μM的SB-431542处理细胞。

表1

对于PAX6及OCT4将细胞免疫染色。在所有试验的条件中PAX6的上调及OCT4下调的程度是相似的(图1C)。这表示至少2天的LDN193189/SB-431542导致ANE诱导。

实施例3-RPE标志物的诱导

实施例3.1-通过BMP通路的活化诱导MITF

本实施例阐明BMP通路活化剂对RPE标志物表达的效应。在以Matrigel涂覆的96孔板上以125000细胞/cm²的密度接种Shef-1hESC。在接种之后的第2天将1μM的LDN193189及10μM的SB-431542应用4天。不处理未诱导对照组的细胞。在第6天，加入100ng/ml的BMP4/7或100ng/ml的活化素A+10mM的烟碱酰胺或不加入任何物质至培养基3天。在第9天，撤掉BMP4/7或活化素A及烟碱酰胺并只用DMEMKSRXF处理细胞4天。为RNA萃取及qPCR分析制备样品。结果总结于图2A。

与未诱导的或只用LDN193189/SB-431542处理的对照组比较，BMP4/7诱导RPE基因(例如MITF及PMEL17)的表达。更进一步地，活化素A+烟酰胺不能替代BMP4/7(图2A)。免疫细胞化学法也可在随后LDN193189/SB-431542用BMP4/7处理的样品上进行以确认RPE标志物如MITF及PMEL17的表达(图2B)。这些结果证明BMP通路活化剂强烈地诱导MITF表达及PMEL17表达。

实施例3.2

从第2天至第6天用1μM的LDN193189及10μM的SB-431542处理Shef-1hESC接着从第6天至第9天用100ng/ml的BMP4/7处理(经诱导的细胞)。维持未诱导的细胞不暴露于LDN/SB及BMP4/7两者。对标志物PAX6、LHX2、OTX2、SOX11及SOX2进行细胞免疫化学法，已知当细胞被付诸于向眼动区域的结局发展时，标志物PAX6、LHX2、OTX2、SOX11及SOX2被表达。OCT4，多能性的标志物，从第2天至第9天在经诱导的细胞中下调。从第2天至第9天PAX6，LHX2，OTX2，SOX11及SOX2上调且在未诱导的样品中没有实现此上调。这表示直接分化规程诱导细胞趋向眼动区状态，该状态然后付诸于RPE结局。

实施例4-替代的BMP通路活化剂的使用

本实施例阐明数种BMP通路活化剂对RPE标志物的表达的效应。

在涂覆有Matrigel的96孔板上以125000细胞/cm²的密度接种Shef-1HESC。在接种后的第2天，用1μM的LDN193189及10μM的SB-4315424处理4天。在第6天，加入50-200ng/ml的BMP4/7异二聚体或200ng/ml的BMP4，300ng/ml的BMP7，100ng/ml的BMP2/6为期3天。在第9天，撤掉BMP且将细胞单独维持在DMEMKSRXF中4天。在第13天，通过免疫染色法及qPCR分析以测试MITF的表达。用BMP4/7异二聚体或其他的BMP处理将MITF的表达诱导至相似的程度(图3)。这显示BMP4/7能用其他BMP替代。

这些结果证明可使用不同的BMP通路活化剂以诱导MITF的表达。

实施例5-第一次再铺板步骤

在涂覆有Matrigel的T25烧瓶上以240000细胞/cm²的密度接种Shef-1hESC。在接种后的第2天，应用1μM的LDN193189及10μM的SB-431542保持4天。在第6天，加入100ng/ml的BMP4/7至培养基保持3天。在分化规程的第6天、第9天或第12天，再铺板细胞至只有DMEMKSRXF，或在不同密度下用100ng/ml的活化素A、0.5mMcAMP或100ng/ml的BMP4/7补充的DMEMKSRXF中。将在第6天再铺板的细胞，在换成用活化素A、cAMP或BMP4/7补充的DMEMKSRXF之前，在用100ng/ml的BMP4/7补充的DMEMKSRXF再铺板之后，维持3天。将在第12天再铺板的细胞，在再铺板之前，从第9天至第12天维持在仅单独的DMEMKSRXF中。再铺板的细胞在BMP4/7的存在下不存活且在随后的分析中排除此条件。使用如实施例10(a)公开的通过自发性分化获得的成熟RPE细胞样品作为对照组，以比较直接分化及成熟RPE细胞的第一次再铺板步骤中所获得的群体之间的相似性。再铺板之后19天，固定细胞用于免疫细胞化学法，而且收集样品用于qPCR。采用成熟RPE标志物如CRALBP及MERTK的免疫细胞化学法，显示在活化素A的存在下在D9再铺板是最佳的，并且得到高水平的RPE标志物表达(图4A及4B)。用一组标志物的qPCR分析也显示出第9天是再铺板的最佳时间(图4C、4D及4E)。当在不同的基质如Matrigel、Cellstart或Fibronectin上培养细胞时，再铺板前与再铺板后获得相似的结果。

实施例6-暴露于活化素A的期间

本实施例阐明在RPE分化中暴露于活化素A的期间的效应。

在涂覆有Matrigel的T25烧瓶中以240000细胞/cm²的密度接种WA26hESCs(Wicell)。在接种后的第2天，应用1μM的LDN193189及10μM的SB-431542保持4天。在第6天，加入100ng/ml的BMP4/7至培养基保持3天。在第9天，以500000细胞/cm²的密度再铺板细胞至有Matrigel或Cellstart涂覆的96孔CellBind板。将细胞在只有DMEMKSRXF中或在用100ng/ml的活化素A补充的DMEMKSRXF中维持不同长度的时间如3天、5天、10天或18天。在D9-18，固定细胞用于免疫染色，并将细胞染色用于CRALBP(一种RPE细胞的标志物)。所有用活化素A处理的测试的CRALBP表达的水平相似(图5)。这些结果证明活化素A的短暂暴露足以诱导RPE细胞分化。

实施例7-在不同密度下第二次再铺板步骤

在涂覆有Matrigel的T25烧瓶中以240000细胞/cm²的密度接种WA26hESCs(Wicell)。在接种之后的第2天，用1μM的LDN193189及10μM的SB-431542保持4天。在第6天，加入100ng/ml的BMP4/7至培养基保持3天。在第9天，以500000细胞/cm²的密度再铺板细胞至有Matrigel或Cellstart涂覆的T12.5烧瓶。将细胞在用100ng/ml的活化素A补充的DMEMKSRXF维持19天。在D9-19，以多种密度再铺板细胞至有Cellstart涂覆的96孔或384孔板(前期再铺板2)。将细胞在只有培养基或用0.5mM的cAMP补充的培养基中维持20天。在D9-19-20，固定细胞用于RPE标志物的免疫染色。96及384孔格式均得到PMEL17表达>95％及CRALBP表达约60％的相似结果(图6及7)。更进一步地，通过免疫染色确认成熟RPE细胞的另一个标志物ZO1的表达。

实施例8-后期再铺板的直接分化

直至第9天的规程与前文实施例1公开的规程相同。

在第9天，培养基以每个烧瓶10ml的DMEMKSRXF取代。维持细胞在培养基内至第50天并每周换3次新鲜培养基。在第50天左右，在烧瓶中可见卵石状的细胞点缀于不同形态的其他细胞之间。另外，烧瓶的中央区域具有高密度的几个区域具有神经元突起物的明显的形态。

为了进行再铺板，从烧瓶内除去培养基并以5mL的PBS(-/-)洗涤细胞一次。加入5ml的PBS至烧瓶并以细胞刮具将中央密集区域刮除并丢弃。以5ml的PBS(-/-)再一次洗涤烧瓶。加入5mL的Accutase至烧瓶并在37℃培养约50分钟，直到细胞自烧瓶脱离。在经由70μm的滤器将内容物转移至50mL的离心管之前，向各烧瓶加入5mL的DMEMKSRXF用以洗涤烧瓶的表面。细胞在室温下以400xg离心5分钟。抽取上清液且颗粒在10mL的DMEMKSRXF培养基中重新悬浮。使用血球计以计数细胞并将细胞以多种密度如200000/cm²接种于有DMEMKSRXF培养基涂覆的培养容器(如Cellstart以1:50稀释于PBS(+/+))中。每周重新补给新鲜培养基两次。

维持细胞培养14天。通过免疫细胞化学法及qPCR以测试RPE标志物(PMEL17,ZO1,BEST1，CRALBP)的表达，来表征得到的RPE细胞。通过分析VEGF及PEDF蛋白质的分泌(其为RPE细胞成熟度的指标)而测试RPE细胞的功能性。

本发明因此提供一种强健且可再现的hESC分化以生成RPE细胞的方法。此外本规程为容易量产以供给高产量。前文所述方法可使用于在无异物的条件下可再现且有效率地将hESC分化成RPE细胞。

实施例9-在不同涂覆层上的后期再铺板

将Shef-1hESC以240000细胞/cm²的密度接种在涂覆有Matrigel的T25烧瓶上。在接种之后的第2天，应用1μM的LDN193189及10μM的SB-431542保持4天。在第6天，将BMP4/7加入培养基保持3天。细胞接着维持在仅单独的培养基内至第50天。在第50天，收集烧瓶的外缘处，其中可见卵石状细胞(图8)，并以200000细胞/cm²的密度接种至有Matrigel、Cellstart或Fibronectin涂覆的96孔或48孔格式的板上。收集烧瓶的内部密集区域，其中卵石状细胞不可见，并分开接种(图8A)。再铺板的细胞维持在仅单独的培养基内或维持在用0.5mM的cAMP补充的培养基内。从内部密集区域再铺板的细胞产生出高比例的神经元并被丢弃。在cAMP的存在下从外缘培养的细胞产生有更多具有色素沉着卵石状细胞(图8B)。更进一步地，如通过免疫染色而观察到细胞表达RPE标志物如PMEL17、ZO-1、CRALBP、Bestrophin及MERTK。在再铺板后15天免疫染色，定量PMEL17及CRALBP显示出两个标志物都有多于70％的表达量(图8C)。在所有测试的涂覆层上获得相似的表型。

实施例10-通过直接分化获得的RPE细胞极相似于自发性分化RPE细胞

a)自发性分化的RPE细胞的制备

在有20％的KSR(GIBCO)、1％的非必需氨基酸溶液(GIBCO)、1mML-谷氨酰胺、0.1mM的β-巯基乙醇、30μg/ml的庆大霉素(GIBCO)及4ng/ml的人类重组bFGF补充的KnockoutDMEM(GIBCO)内非活化小鼠胚胎成纤维细胞(inactivatedmouseembryonicfibroblast,iMEF)、或非活化人类真皮成纤维细胞(inactivatedhumandermalfibroblasts,iHDFs)、或在mTesR1培养基(StemCellTechnologies)内无喂养物质的Matrigel(BD)上，作为集落培养Shef-1Hesc。如前文，在换至KnockoutDMEM培养基(但无bFGF)之前，每日喂食所有培养物直到超汇合(接种之后约2周)。每周三次供给烧瓶食料，直到RPE集落出现且大到足够切出。接着以刮刀切除集落，以PBS(-/-)洗涤并在震荡水浴中以Accutase(GIBCO)培养1-1.5小时。分离的RPE细胞经由70μm细胞滤器过滤，以700xg离心5分钟并如前文重新悬浮在无bFGF的温热KnockoutDMEM培养基中。计数RPE细胞并接种(典型地，以38000-50000细胞/cm²的密度)于有胞外基质涂覆的48孔板(典型地，在细胞培养恒温培养箱中以1:50CellStart(LifeTechnologies)在PBS(+/+)中涂覆2小时)。这些典型地培养7或16周(在第0天接种细胞)，在进行RNA萃取之前以0.5ml/孔一周喂食2次。

如前文通过相同规程产生去分化的RPE细胞样品，但细胞以2500细胞/cm²接种用于去分化，并培养4或5周。

b)从通过直接分化及自发性分化获得的RPE细胞样品的比较

如实施例8公开的从直接分化获得的样品与通过自发性分化获得的样品作比较，用于由PCR定量的一组RPE细胞和其他标志物。自发性分化的RPE细胞培养7或16周。去分化的样品作为对照组使用，因为这些细胞没有达到上皮表型反而保持在纺锤状和去分化的。包括这些样品以查看通过qPCR测试的基因是否能够在上皮RPE细胞和非RPE类的细胞之间分化。

图9A显示通过直接分化生产的7个RPE细胞样品与通过自发性分化而生产的RPE细胞以及去分化对照组的主成分分析(PCA)的标绘图。PCA模型的载数标绘图也表示出平均值、单位方差度量的mRNA转录数据，其显示测试的每个基因对样品簇集的贡献(图9B)。使用PCA可视化样品的整体变异。前2个组分的值标绘图揭示,去分化的样品簇集在Hotelling’sT2椭圆外,且其特征在于,与RPE表型成正相关的低水平的标志物：MERTK、PMEL17、Tyrosinase、Bestrophin、RPE65及CRALBP,指示出它们不相似于分化的RPE细胞,且测试的基因能够区别RPE与非RPE表型。更进一步地，通过直接分化而产生的RPE细胞与通过自发性分化而产生的RPE细胞样品簇集,且因此拥有与经分化的RPE细胞相关的适当特征。

下一步，通过直接分化(如实施例1及8公开的前期及后期的再铺板)获得的RPE细胞进行全基因组转录分析,并与通过自发性分化获得的RPE细胞的转录分析比较。在图9C显示的主成分分析明显可见的样品的簇集证明,如实施例1及8公开的来自前期及后期再铺板规程的细胞具有与自发性分化衍生的RPE细胞相似的全基因组基因表达分析，但与hESC的不同。

在相关的研究中，通过自发性分化获得的RPE细胞被证实就基因表达印迹而言与天然RPE细胞相似。

实施例11-通过直接分化获得的RPE细胞分泌VEGF及PEDF蛋白质

a)通过前期再铺板方法获得的RPE

将在实施例1公开的前期再铺板规程的再铺板2(D9-19-50)之后获得的细胞,以116000细胞/的密度接种至并培养10周的时间段。的两个小室保持分开,且不允许培养基混合。从底部及顶部的小室收集培养基并分析VEGF及PEDF的分泌。如图10A显示，从底部小室收集的培养基的[VEGF]:[PEDF]比例较高,从顶部小室收集的培养基的[VEGF]:[PEDF]比例较低，指示VEGF在底侧分泌较高,而PEDF在顶端分泌较高。这显示出本文公开的通过直接分化法获得的RPE是极化的且具有功能性。

b)通过后期再铺板方法获得的RPE

对于后期再铺板，在涂覆有Matrigel的T25烧瓶中以240000细胞/cm²的密度接种Shef-1hESC。在接种后的第2天，应用1μM的LDN193189及10μM的SB-431542保持4天。在第6天，加入100ng/ml的BMP4/7至培养基保持3天。从第9天开始，细胞接着维持在仅单独的培养基内,直到第64天时收集烧瓶的外缘,并以400000细胞/cm²的密度再铺板至涂覆有Matrigel的上。每周两次通过溢流喂食从接种至之后的第12天开始,为了定量VEGF及PEDF，以规律时间间隔收集利用过的培养基。根据制造商的规程，使用“MesoScaleDiscovery”(MSD)为基础的多分析途径，进行VEGF及PEDF的测量。如图10B显示，在培养中VEGF及PEDF水平随时间增加，指示由RPE细胞活跃的分泌，其为成熟的指标。这些结果证明通过本文所述的方法获得的细胞为RPE。

实施例12-RPE细胞的延展

RPE细胞的增生与分化的上皮形态的损失相关，而非细胞外观上变得增长和纤维化。这明显的“去分化”之后跟随的是“重新分化”时期，其中，细胞的融合单层开始具有立方状、具有色素沉着的RPE细胞的特征化表型(VugleretAl.，ExpNeurol.2008Dec；214(2):347-61)。该去分化、重新分化的示例，其在延展中发生，被描述为上皮-间质转换(Epithelial-MesenchymalTransition,EMT)之后是间质-上皮转换(Mesenchymal-EpithelialTransition,MET)(TamiyaetAl.,IOVS,May2010,Vol.51,No.5)(图11A)。

a)在cAMP或增加胞内cAMP浓度的试剂的存在下延展以增加RPE细胞的产量及成熟性

将通过自发性分化而产生的RPE细胞以40000细胞/cm²接种在只有培养基中或以20000细胞/cm²接种于加0.5mM的cAMP的培养基中。每周置换培养基三次。在第15天通过免疫细胞化学法测量增生标志物Ki67的表达量，并且观察到在cAMP的存在下接种的细胞的Ki67的表达量增加。在第35天，固定细胞并使用赫斯特染色将细胞核染色。经染色的细胞核的数目相等于细胞数目。当cAMP补充于以20000细胞/cm²的密度接种的细胞时，观察到细胞数目的增加，且增加量相等于以40000细胞/cm²的密度接种于只有培养基所获得的细胞的数量(图11B)。这指示通过将cAMP掺入培养物中会使产量变成两倍。细胞也以PMEL17(一种RPE标志物)免疫染色。当细胞以cAMP补充且以20000细胞/cm²接种时，PMEL17的表达量增加，且此增加量相似于当细胞以40000细胞/cm²的较高的密度接种时的量(图11C)。这显示在延展步骤时cAMP的存在会增加RPE标志物的表达量，由此指示成熟性增加。

更进一步地，增加胞内cAMP浓度的其他化学试剂如福司柯林，一种腺苷环化酶活化剂，在增加细胞产量及PMEL17表达量方面也与cAMP有相似的效果。将通过自发性分化而产生的RPE细胞以40000细胞/cm²接种到仅有培养基中或以20000细胞/cm²接种到包含10μM的福司柯林的培养基中。每周置换三次培养基且在第14天将细胞免疫染色。在福司柯林的存在下增加PMEL17表达量相似于在cAMP的存在下看见的效果(图11D)。

b)全基因组转录分析

为了获得cAMP对RPE细胞延展的效果的进一步了解，设定时程表，其中细胞以10000细胞/cm²及20000细胞/cm²接种至只有培养基或有0.5mM的cAMP补充的培养基。将这些与以40000细胞/cm²接种在只有培养基的RPE细胞比较。每周置换三次培养基。在接种之后的D3、D15及D35收集样品且全基因组转录分析分三组进行。在所有测试的时间点，发现在以较低密度接种但有cAMP补充的细胞与以较高密度接种在只有培养基中的细胞之间相比较，RPE标志物TYR、TYRP1、MITF、RPE65、BEST1及MERTK的表达量相似。

c)EdU掺入用cAMP处理的RPE

除了进行Ki67的免疫细胞化学法之外，EdU掺入细胞用作为测量在cAMP的存在下RPE细胞的增生的另一种测定法。Ki67表达于细胞周期(Gl、S、G2、以及有丝分裂)的所有活跃期中，但不见于静息的细胞(G0)中。然而，Ki67生物上的功能仍大多未知且尚不清楚所有表达Ki67的细胞是否完成有丝分裂。一种测量增生的补充技术为测量掺入DNA的胸腺嘧啶同类物(如EdU)，其在EdU标记期间促进进展至细胞周期的S期的细胞的辨识。

通过hESC细胞自发性分化获得的RPE以38000细胞/cm²的密度接种，并在有或无0.5mM的cAMP的情况下，维持8周的期间。在以下时间点测量EdU掺入：在接种之后的第2天、第3天、第5天、第7天、第14天、第21天、第56天。以细胞染色为EdU阳性的百分比表示结果。第7天、第14天及第21天的时间点，在用cAMP处理的细胞中见到％EdU增加，其指示在这些RPE延展的阶段cAMP会使增生增加(图11E)。细胞数目的定量从每个图框的赫斯特阳性细胞核影像推断。捕捉的每个图框影像具有0.0645x0.0645mm的尺寸，且孔的总表面积为6mm²。因此，孔内的总细胞数目约等于每个影像的赫斯特阳性细胞核的数目乘以6/(0.0645x0.0645)的系数(其等于1442.2)。当加入cAMP时观察到总细胞数目的增加，其指示因加入cAMP而增加的增生导致了RPE数目的增加(图11F)。

d)cAMP的剂量

RPE以20000细胞/cm²的密度接种，并以范围为：500μM、50μM、5μM、0.5μM及0.05μM的cAMP浓度处理14天的期间。对照组设为包括以40000细胞/cm²及20000细胞/cm²接种在只有培养基中的细胞。在14天结束时，固定细胞并进行免疫细胞化学法以测量Ki67(一种增生的标志物)以及PMEL17(一种辨识RPE及其纯度的标志物)的表达。以赫斯特核染色复染(conterstained)细胞核。

500μM的cAMP的剂量在以20000细胞/cm²接种的细胞中诱导Ki67的表达的量，与以双倍密度的40000细胞/cm²接种至只有培养基的RPE细胞的量相似(图11G)。更进一步地，当用500μM的cAMP剂量处理后PMEL17表达量增加。不用cAMP处理，以20000细胞/cm²接种的细胞具有PMEL17的低表达量(图11H)。

这些数据显示高于50μM的剂量足以诱导cAMP对RPE表型的增生以及发展效果。优选为500μM或更高的剂量可用于诱导RPE细胞的增生。

e)在cAMP存在下以20000细胞/cm²或以40000细胞/cm²在只有培养基内延展RPE之后获得的等值的RPE斑块

通过自发性分化获得的RPE悬浮液在48孔格式内以20000细胞/cm²或40000细胞/cm²的密度接种。用500μM的cAMP处理以20000细胞/cm²接种的细胞，而将以40000细胞/cm²接种的细胞维持在只有培养基内10周的期间。在延展的期间结束时，使用Accutase将两种条件的细胞脱离并使用细胞以116000细胞/的密度接种于将在只有培养基中维持培养5周的期间。每周收集利用过的培养基以定量两种条件下的VEGF及PEDF水平。在培养期间结束时，切下斑块免疫染色RPE标志物ZO1。使用的外部区域以qPCR为基础分析一组RPE标志物的基因表达。

在延展结束时，我们观察到两种延展条件的细胞具有相似的形态，且显示了特征性的具有色素沉着、卵石状细胞的存在。在培养时定量VEGF及PEDF分泌的量，且从两组获得可比较的VEGF:PEDF比例，不论它们是否是从cAMP的存在下以20000细胞/cm²的密度延展的培养物中获得的，或是在培养基内以40000细胞/cm²延展的培养物中获得的。就基因表达而言，我们从两种延展条件之下设定的组观察到可比较的RPE基因(Mitf,Silv，Tyr)表达量(图11I、11J及11K)。更进一步地，RPE标志物ZO-1的蛋白表达量在两种条件之间是可比较的。

总而言之，数据显示在培养基上以40000细胞/cm²或在cAMP的存在下以减半的接种密度例如20000细胞/cm²延展的在上培养的RPE之间是没有差别的。

f)在SMAD抑制剂的存在下延展增加RPE细胞的增生

1.TGFβ受体(TGFBR)的小分子抑制剂增加RPE增生及RPE标志物的表达

表2列出的TGFBR抑制剂对于RPE增生及RPE标志物的表达的效果。

表2

向从如实施例10a公开的以2500细胞/cm²的密度接种于浓度为10μM、1μM及0.1μM的Shef-1hESC细胞获得的RPE中加入化合物。化合物维持在培养基内10天的期间。通过在细胞固定之后将该细胞于10μM的EdU暴露4小时的期间以评估增生，以及使用EdU(Invitrogen，Catalogue#C10337)试剂盒依照制造商的建议检测EdU的掺入。与用媒介物处理比较，观察当用所有3种化合物处理时增生增加(参见图12A)。为了试验由TGFBR抑制剂造成的增生增加是否影响RPE表型的实现，进行qPCR以测量RPE标志物Best1及Rlbp1转录的量。当用化合物处理时观察RPE标志物表达量的增加(参见图12B及12C)。我们也检测一种去分化RPE的标志物Grem1水平，发现Grem1其再用化合物处理的样品中的量较低(参见图12D)。

这些数据显示通过TGFBR抑制剂抑制SMAD信号传导会增加增生以及RPE表型的实现。

2.SMAD信号传导的以抗体为基础的抑制增加RPE增生及RPE标志物表达量

作为抑制SMAD信号传导的替代方法，使用已知作为1D11的抗TGFβ1及TGFβ2配体的中和抗体(TheJournalofImmunology,Vol.142，1536-1541,No.5.March1989)。如实施例10a公开从Shef-1hESC细胞获得的RPE以5000细胞/cm2的密度接种且以1μg/ml及10μg/ml的浓度向培养基中加入抗体1D11。维持抗体在培养基内14天的期间。通过将细胞于10μM的EdU暴露4小时的期间然后固定细胞来评估增生，以及使用Click化学依照制造商的建议检测EdU掺入。与用媒介物处理比较，观察到当以剂量依赖的方式用中和抗体处理时增生增加(图13A)。这显示通过抑制TGFβ1及TGFβ2的抗体抑制RPE中SMAD信号传导会增加RPE增生。

为了试验由TGFβ抑制造成的增生增加是否影响RPE表型的实现，以免疫染色及qPCR检测RPE标志物水平。在两种蛋白质上均观察到PMEL17表达量的增加(参见图13B)，以及转录的量伴随着其他一组RPE标志物的转录的量的增加以及去分化RPE标志物GREM1的量减少(参见图13C至13H)。

这些数据显示通过抑制TGFβ1及TGFβ2通路的抗体而抑制SMAD信号传导会增加增生及RPE表型的实现。

实施例13-RPE细胞的纯化

a)筛选以辨别细胞表面标志物表达

依照直接分化规程的前期再铺板，从Shefl.3hESC获得细胞。在Matrigel上培养细胞至第9天并再铺板至Cellstart上(再铺板1)并在Cellstart上培养细胞19天，接着再铺板至Cellstart(再铺板2)并在使用于本实验之前在Cellstart上培养15天。细胞以100000细胞/cm²的密度接种至涂覆有Matrigel的384孔板上。在使用BDLyoplate人类细胞表面标志物筛选板(BDBiosciences，Cat#560747)对于细胞表面蛋白质表达而进行筛选之前，培养细胞7天。依照制造商的建议以生物成像筛选细胞。分析细胞染色的影像，用于标志物的阳性表达。细胞也染上RPE标志物的PMEL17、CRALBP及ZO1以确认RPE身分。CD59被鉴定为在RPE细胞中以超过同型的背景值被表达。

b)来自直接分化方法的前期再铺板的样品上CD59的流式细胞术

使用流式细胞术定量CD59的表达。为分析准备以下来自直接分化规程的细胞样品：

1/SheflhESC(第0天)，

2/第6天(从第2天至第6天1μM的LDN193189及10μM的SB-431542)，

3/第9天(LDN/SB减去BMP4/7):从第2天至第6天1μM的LDN193189及10μM的SB-431542以及从第6天至第9天无BMP4/7的培养基，

4/第9天(LDNSB加上BMP4/7):从第2天至第6天1μM的LDN193189及10μM的SB-431542以及从第6天至第9天100ng/ml的BMP4/7，

5/在再铺板2之后获得两重复的RPE样品：从第2天至第6天LDN/SB，从第6天至第9天BMP4/7，在D9于活化素A的存在下再铺板2周的期间，然后在只有培养基上再铺板3个月的期间。

使用Accutase收集所有样品。使用在绿色(FL2)的频率发荧光的Live/Dead可固定的死细胞染色试剂盒(Invitrogen,Cat#L23101)，以Live/Dead染色剂将细胞染色。以1％的PFA固定细胞并以PBS(-/-)洗涤三次。以300xg进行离心5分钟。在PBS(-/-)加2％的BSA中重新悬浮细胞至约为1x10⁶细胞/100μL。使用PE小鼠抗人类CD59抗体(BDPharmingen，Cat#560953)将细胞的CD59染色。在100μL的实验样品中每个试验使用20μL的抗体。室温下避光培养细胞30分钟。在以150μLPBS(-/-)加2％的BSA重新悬浮以供AccuriC6流式细胞仪分析之前洗涤样品2次。阴性对照组由未染色细胞组成并且也进行以同型对照组(PEMouseIgG2a，eBioscienceCat#12-4724-41)染色的细胞。通过排除废渣及双联体并只选取活细胞染色呈染色阳性的群而进行流式细胞仪分析。本分析的结果显示于表3内。

表3:取自直接分化时程的样品以流式细胞仪呈CD59染色阳性的百分比

这显示CD59在再铺板之前的直接分化规程的前期时间点不表达，且只在第二次再铺板之后获得的成熟RPE上表达。因此，分类表达CD59的细胞可为富集成熟RPE及除去可能在最终RPE培养中作为多余的污染细胞而呈现的任何RPE前体或其他CD-59-阴性细胞的手段。

c)直接分化规程的再铺板2之后获得的SheflhESC及RPE的加标试验(Spikingexperiment)

为了显示RPE上CD59表达的特异性，进行加标实验。使用Accutase收集在前期再铺板的直接分化规程的再铺板2之后获得的SheflhESC及RPE。以1％的PFA固定细胞并在PBS(-/-)+2％的BSA中重新悬浮至相同浓度之前，使用在远红外(FL4)的频率发荧光Live/Dead可固定的死细胞染色试剂盒(Invitrogen,Cat#L10120)以Live/Dead染剂将细胞染色。混合以下hESC与RPE的比例以得出100μL的最终体积：100％的RPE加0％的hESC；75％的RPE加25％的hESC；50％的RPE加50％的hESC；25％的RPE加75％的hESC；0％的RPE加100％的hESC。针对CD59及TRA-1-60(一种多能性ES细胞的标志物)而对所有样品进行流式细胞术。阴性对照组由未染色细胞组成，并且也进行以适当的同型对照组所染色的细胞。在AccuriC6流式细胞仪上分析样品。通过排除废渣及双联体并只选取活细胞染色呈染色阳性的群而进行流式细胞仪分析。本分析的结果显示于表4及5内。

表4:以流式细胞仪染色呈CD59阳性％

表5:以流式细胞仪染色呈TRA-1-60阳性％

这些结果显示检测到的CD59的量与样品中呈现RPE的比例相关且抗体能够区分在样品中呈现的其他非RPE细胞。更进一步地，加标至样品中的非RPE的hESC细胞的比例与检测到的TRA-1-60的百分比例相关。因此，分类表达CD59的细胞可以是富集成熟RPE及除去可能在最终RPE培养中作为多余的污染细胞存在的任何hESC或RPE前体的手段。

d)使用流式细胞仪从ESC及RPE细胞的混合群中选出CD59阳性的RPE

为了证明使用CD59分类从混合的群中富集RPE是可能的，将相等数量的hESC及RPE细胞(在前期再铺板2之后获得)混合在一起。来自此混合物的样品如预分类的群一样保持分开。剩下的混合物以PE小鼠抗人类CD59抗体(BDPharmingen,Cat#560953)染色。在含有1x10⁶个细胞的100μL的实验样品中每个试验使用20μL的抗体。在室温下避光培养样品30分钟。在以每毫升的PBS(-/-)加2％的BSA中有1x10⁶个细胞的密度重新悬浮之前，洗涤样品2次。在inFluxv7细胞仪分类CD59阳性细胞且与CD59阴性群分开收集。从预分类、CD59阳性及CD59阴性部分萃取RNA。使用qPCR以检测一组ES及RPE标志物的表达。这显示CD59阳性的部分富集RPE标志物Best1、Silv、Rlbp1(见图14B)且CD59阴性的部分富集ES标志物Nanog、Pou5fl及Lin28(见图14A)。这显示CD59的流式分类可从混合的群富集RPE细胞并除去非RPE细胞类型。

实施例14

直接分化规程是在诱导性多能性细胞上进行的(iPSC)。IPSC是由取自健康志愿者的成红血细胞产生并使用CytoTune-iPS重新编程试剂盒(LifeTechnologies,A13780-01/02)重新编程。在E8培养基内以240000细胞/cm²的密度接种IPSC并分化至直接分化规程的前期再铺板的第9-19天。诱导的细胞指从第2天至第6天用LDN193189/SB-431542处理接着从第6天至第9天用BMP4/7处理的细胞。未诱导的细胞保持在不暴露于LDN193189/SB-431542及BMP4/7中。为感兴趣的标志物进行免疫染色。如图15A至15D所见，诱导的iPSC在第9天下调OCT4并相似于诱导性hESC上调PAX6及LHX2。随后在第9天于活化素A的存在下再铺板，iPSC上调RPE标志物CRALBP。随后是在第9-19天的第二次再铺板步骤并培养45天的期间，iPSC衍生的RPE表达了一组RPE标志物，其与由实施例8的规程所获得的ES细胞的直接分化所衍生的RPE所见相似水平(参见图15E、15F及15G)。因此，这些结果证明对于RPE的产生直接分化规程是可转换至IPSC的。

以下方法用于上述实施例：

免疫细胞化学法：

在96孔或384孔格式中进行免疫细胞化学法。吸取培养基以及将50μL的4％聚甲醛(PFA)加入各孔并在室温下培养35分钟。吸取PFA并以3x100uL的PBS(+/+)洗涤细胞。于暗室中室温下在阻断缓冲剂(blockingbuffer)(PBS(+/+)/5％正常驴血清(NDS)，0.3％Triton*100)中培养细胞1小时。在PBS(+/+)，1％正常驴血清(NDS)/0.3％Triton*100中制作一级抗体。将60μL的一级抗体溶液加入各孔并于暗室中室温下培养1小时。吸取溶液并以3x100uL的PBS(+/+)洗涤细胞。在PBS(+/+)/1％正常驴血清(NDS)/0.3％Triton*100中制作二级抗体。将60uL的二级抗体溶液加入各孔并于暗室中室温下培养1小时。吸取溶液并以3x100uL的PBS(+/+)洗涤细胞。将赫斯特33342溶液在PBS(+/+)中以1:5000稀释(最终浓度为2μg/ml)并将50μL加入各孔并于暗室中室温下培养至少6分钟。吸取溶液且细胞以1xPBS(+/+)洗涤，接着将100μL的PBS(+/+)加入各孔并将板密封并在冰箱中贮存直到成像。以10x、20x放大倍率在IXMMetaExpressPlatform上捕捉影像。

分子生物技术：

RNA萃取

吸取培养基且细胞以100μL的PBS(-/-)洗涤。在将溶解产物移转至含有额外250μL的BufferRLT(1％的2-巯基乙醇)的2mL的试管之前，将100μL的BufferRLT(1％的2-巯基乙醇)加入各孔并上下量吸。将样品贮存于-80℃直至样品被处理。使用RNeasymicro试剂盒(Qiagen)萃取RNA，如制造商的规程包括在Qiacube上的柱上Dnase(脱氧核糖核酸水解酶)消化。RNA用14μL的无RNase(核糖核酸水解酶)的水清洗。

cDNA合成

使用AppliedBiosystemsHighCapacityRNA-to-cDNA试剂盒合成cDNA

	1x反应混合物
		2x RT缓冲剂	10
20x RT酶	1
		RNA	4
无核酸酶的H₂O	5
		总计	20

将Mastermix(16μL)等分至96孔板的孔内且将4μL的RNA加至各孔。将无核酸酶的水加至一个孔以作为无模板对照组。以1000rpm将板离心1分钟以收集，并将板移转至热循环器以及使用以下规程合成cDNA:

步骤	温度	时间
			1	37℃	60分钟
2	95℃	5分钟
			3	4℃	维持

以80uL的无核酸酶的水稀释cDNA样品并贮存于-20℃直至cDNA样品被进一步使用。

定量PCR

使用AppliedBiosystemsTaqmanGeneExpressionMastermix如下文对于各试验制作qPCRmastermix:

	1x反应Mix
		2x Taqman Gene Expression Mastermix	10
引子/探针mix	1
		无核酸酶的水	7
cDNA/模板	2
		总量	20

将Mastermix(18uL)等份至96孔板的孔中且将2uL的cDNA(或对照组)加至各孔。对照组为来自cDNA合成的无模板对照组、水、及自发性分化RPEcDNA。每个样品一式两份进行。接着以1000rpm将板离心1分钟以收集，且板转移至热循环器以及使用以下规程进行qPCR测定：

步骤	温度	时间
			1	50℃	2分钟
2	95℃	10分钟
			3	95℃	15秒
4	60℃(数据收集)	1分钟
			5	至步骤3 49x
6	40℃	2分钟

数据输出至MicrosoftExcel并使用2^-DCT法分析。

在实施例10中以qPCR测试的基因列表：

Claims

1.一种产生视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，其包含步骤：

(b)在BMP通路活化剂的存在下且无该第一与第二SMAD抑制剂的情况下培养步骤(a)的细胞；及

(c)再铺板步骤(b)的细胞。

2.根据权利要求1的方法，其中，在步骤(a)中，单层培养细胞。

3.根据权利要求1或2的方法，其中，在步骤(b)中，单层培养细胞。

4.根据权利要求1的方法，其中，在步骤(a)中，细胞在悬浮培养中培养。

5.根据权利要求1,2或4中任一项的方法，在步骤(b)中,其中细胞在悬浮培养中培养。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中该多能性细胞是胚胎干细胞或诱导性多能性干细胞。

7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中该多能性细胞是人类细胞。

8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中该多能性细胞是人类胚胎干细胞。

9.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中该多能性细胞是人类诱导性多能性干细胞。

10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中该多能性细胞是通过不需破坏人类胚胎的手段获得。

11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂为BMP1型受体ALK2的抑制剂。

12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂为BMP1型受体ALK2和ALK3的抑制剂。

13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂防止Smadl、Smad5和/或Smad8磷酸化。

14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂为dorsomorphin衍生物。

15.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂选自dorsomorphin、头蛋白(noggin)或原肠胚双向形成相关蛋白(chordin)。

16.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂选自4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉(LDN193189)或其盐或水合物。

17.根据权利要求第1至16中任一项的方法，其中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓度介于0.5nM至10μM。

18.根据权利要求第1至17中任一项的方法，其中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓度介于500nM至2μM。

19.根据权利要求第1至18中任一项的方法，其中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓度为约1μM。

20.根据权利要求第1至19中任一项的方法，其中该第二SMAD抑制剂为ALK5抑制剂。

21.根据权利要求第1至20中任一项的方法，其中该第二SMAD抑制剂为ALK5和ALK4的抑制剂。

22.根据权利要求第1至21中任一项的方法，其中该第二SMAD抑制剂为ALK5和ALK4和ALK7抑制剂。

23.根据权利要求第1至20中任一项的方法，其中该第二SMAD抑制剂是选自：

4-(4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)_1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺；

2-甲基-5-(6-(间甲苯基)-1H-咪唑并[1,2-a]咪唑-5-基)-2H-苯并[d][l,2,3]三唑；

2-(6-甲基吡啶-2-基)-N-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-胺；

2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶；

2-(4-甲基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)噻吩并[3,2-c]吡啶；

4-(5-(3,4-二羟基苯基)-1-(2-羟基苯基)-1H-吡唑-3-基)苯甲酰胺；

2-(5-氯-2-氟苯基)-N-(吡啶-4-基)喋啶-4-胺；

6-甲基-2-苯基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮；

3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(A83-01)；

2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶(SB-505124)；

7-(2-吗啉乙氧基)-4-(2-(吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉(LY2109761)；

4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉(LY364947)；或

4-(4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺(SB-431542)；或其盐或水合物。

24.根据权利要求1至20中任一项的方法，其中该第二SMAD抑制剂是4-(4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺(SB-431542)。

25.根据权利要求1至24中任一项的方法，其中在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度介于0.5nM至100μM。

26.根据权利要求1至25中任一项的方法，其中在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度介于1μM至50μM。

27.根据权利要求第1至26中任一项的方法，其中在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度为约10μM。

28.根据权利要求第1至27中任一项的方法，其中在步骤(a)中，该多能性细胞被培养至少1天。

29.根据权利要求第1至28中任一项的方法，其中在步骤(a)中，该多能性细胞被培养至少2天。

30.根据权利要求第1至29中任一项的方法，其中在步骤(a)中，该多能性细胞被培养2至10天。

31.根据权利要求第1至30中任一项的方法，其中在步骤(a)中，该多能性细胞被培养3至5天。

32.根据权利要求第1至31中任一项的方法，其中在步骤(a)中，该多能性细胞被培养约4天。

33.根据权利要求第1至32中任一项的方法，其中在步骤(a)之前，该细胞在起始密度至少1000细胞/cm²被单层培养。

34.根据权利要求1至33中任一项的方法，其中在步骤(a)之前，该细胞在起始密度100000至500000细胞/cm²被单层培养。

35.根据权利要求1至34中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂包含BMP。

36.根据权利要求1至35中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂包含选自BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP10、BMP11或BMP15的BMP。

37.根据权利要求1至36中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂为BMP同二聚体。

38.根据权利要求1至36中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂为BMP异二聚体。

39.根据权利要求1至36中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂为BMP2/6异二聚体、BMP4/7异二聚体或BMP3/8异二聚体。

40.根据权利要求1至36中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂为BMP4/7异二聚体。

41.根据权利要求1至40中任一项的方法，其中在步骤(b)中，该BMP通路活化剂的浓度介于1ng/mL至10μg/mL。

42.根据权利要求1至41中任一项的方法，其中在步骤(b)中，该BMP通路活化剂的浓度介于50ng/mL至500ng/mL。

43.根据权利要求1至42中任一项的方法，其中在步骤(b)中，该BMP通路活化剂的浓度为约100ng/mL。

44.根据权利要求1至43中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述细胞被培养至少1天。

45.根据权利要求1至44中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述细胞被培养2至20天。

46.根据权利要求1至45中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述细胞被培养约3天。

47.根据权利要求1至46中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞以密度至少1000细胞/cm²被再铺板。

48.根据权利要求1至47项中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞以密度100000至1000000细胞/cm²被再铺板。

49.根据权利要求1至48中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞以密度约500000细胞/cm²被再铺板。

50.根据权利要求1至49中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞被再铺板在纤连蛋白或上。

51.根据权利要求1至50中任一项的方法，其中该方法进一步包含下列步骤：

(e)再铺板步骤(d)的细胞；及

(f)培养步骤(e)的经再铺板的细胞。

52.根据权利要求51的方法，其中在步骤(d)中，该细胞被培养至少1天。

53.根据权利要求51或52的方法，其中在步骤(d)中，该细胞被培养至少3天。

54.根据权利要求51至53中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该细胞被培养3至20天。

55.根据权利要求51至54中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该活化素通路活化剂的浓度介于1ng/mL至10μg/mL。

56.根据权利要求51至55中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该活化素通路活化剂的浓度为约100ng/mL。

57.根据权利要求51至56中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该活化素通路活化剂为活化素A。

58.根据权利要求51至57中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该细胞在cAMP的存在下被培养。

59.根据权利要求58的方法，其中在步骤(d)中，cAMP的浓度为约0.5mM。

60.根据权利要求51至59中任一项的方法，其中在步骤(e)中，所述细胞以密度至少1000细胞/cm²被再铺板。

61.根据权利要求51至60中任一项的方法，其中在步骤(e)中，该细胞以密度20000至500000细胞/cm²被再铺板。

62.根据权利要求51至61中任一项的方法，其中在步骤(e)中，所述细胞以密度约200000细胞/cm²被再铺板。

63.根据权利要求51至62中任一项的方法，其中在步骤(e)中，所述细胞被再铺板在纤连蛋白或上。

64.根据权利要求51至63中任一项的方法，其中在步骤(f)中，该细胞被培养至少5天。

65.根据权利要求51至64中任一项的方法，其中在步骤(f)中，该细胞被培养至少14天。

66.根据权利要求51至65中任一项的方法，其中在步骤(f)中，该细胞被培养10至35天。

67.根据权利要求51至66中任一项的方法，其中在步骤(f)中，该细胞被培养约28天。

68.根据权利要求51至67中任一项的方法，其中在步骤(f)中，该细胞在cAMP的存在下被培养。

69.根据权利要求68的方法，其中在步骤(f)中，cAMP的浓度为约0.5mM。

70.根据权利要求1至50中任一项的方法，其中

步骤(b)进一步包含，在BMP通路活化剂的存在下培养该细胞后，在无BMP通路活化剂的存在下培养该细胞至少10天；

(d)培养步骤(c)的经再铺板的细胞。

71.根据权利要求70的方法，其中在步骤(b)中，该细胞在无BMP通路活化剂的存在下被培养至少20天。

72.根据权利要求70或71的方法，其中在步骤(b)中，该细胞在无BMP通路活化剂的存在下被培养30至50天。

73.根据权利要求70至72的方法，其中在步骤(b)中，该细胞在无BMP通路活化剂的存在下被培养约40天。

74.根据权利要求70至73中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞以密度至少1000细胞/cm²被再铺板。

75.根据权利要求70至74中任一项的方法，其中在步骤(c)中，该细胞以密度50000至500000细胞/cm²被再铺板。

76.根据权利要求70至75中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞以密度约200000细胞/cm²被再铺板。

77.根据权利要求70至76中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞被再铺板在纤连蛋白或上。

78.根据权利要求70至77中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该细胞被培养至少5天。

79.根据权利要求70至78中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该细胞被培养10至40天。

80.根据权利要求70至79中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该细胞被培养约14天。

81.根据权利要求70至80中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该细胞在cAMP的存在下被培养。

82.根据权利要求81的方法，其中在步骤(d)中，cAMP的浓度为约0.5mM。

83.根据权利要求70至82中任一项的方法，其包含下列额外步骤：

(e)再铺板步骤(d)的细胞；

(f)培养步骤(e)的经再铺板的细胞。

84.根据权利要求83中的方法，其中在步骤(e)中，细胞以密度至少1000细胞/cm²被再铺板。

85.根据权利要求83或84的方法，其中在步骤(e)中，该细胞以密度50000至500000细胞/cm²被再铺板。

86.根据权利要求83至85中任一项的方法，其中在步骤(e)中，所述细胞以密度约200000细胞/cm²被再铺板。

87.根据权利要求70至86中任一项的方法，其中在步骤(e)中，所述细胞被再铺板在纤连蛋白或上。

88.根据权利要求70至87中任一项的方法，其中在步骤(f)中，该细胞被培养至少10天。

89.根据权利要求70至88中任一项的方法，其中在步骤(f)中，该细胞被培养15至40天。

90.根据权利要求70至89中任一项的方法，其中在步骤(f)中，该细胞被培养约28天。

91.根据权利要求1至90中任一项的方法，其中该方法进一步包含收集该RPE细胞的步骤。

92.根据权利要求1至91中任一项的方法，其中该方法进一步包含纯化该RPE细胞的步骤。

93.根据权利要求1至91中任一项的方法，其中该方法进一步包含通过荧光激活细胞分选术(FACS)或磁性活化细胞分类法(MACS)纯化该RPE细胞的步骤。

94.根据权利要求92的方法，其中所述纯化RPE细胞的步骤包含步骤：

-将该细胞与缀合荧光团的抗CD59抗体接触；及

-使用FACS选择与该抗CD59抗体结合的细胞。

95.根据权利要求92的方法，其中该纯化RPE细胞的步骤包含步骤：

-将该细胞与缀合磁性粒子的抗CD59抗体接触；及

-使用MACS选择与该抗CD59抗体结合的细胞。

96.根据权利要求1至90中任一项的方法，其中在所有步骤中，该细胞被单层培养。

97.根据权利要求1至96中任一项的方法，其中该RPE细胞通过一种方法被延展，该方法包含

-再铺板RPE细胞；及

-培养经再铺板的RPE细胞。

98.根据权利要求97的方法，其中该细胞以密度1000至100000细胞/cm²被再铺板。

99.根据权利要求97或98的方法，其中该细胞以密度10000至30000细胞/cm²被再铺板。

100.根据权利要求97至99中任一项的方法，细胞以密度约20000细胞/cm²被再铺板。

101.根据权利要求97至100中任一项的方法，其中所述细胞被再铺板在纤连蛋白或上。

102.根据权利要求97至101中任一项的方法，其中该细胞被培养至少7天、至少14天、至少28天或至少42天。

103.根据权利要求97至102中任一项的方法，其中该细胞被培养约49天。

104.根据权利要求97至103中任一项的方法，其中该细胞在SMAD抑制剂、cAMP或增加胞内cAMP浓度的试剂存在下被培养。

105.根据权利要求104的方法，其中所述试剂选自腺苷环化酶活化剂，优选为福司柯林(forskolin)或磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，优选为PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、PDE7、PDE8、PDE10和/或PDE11抑制剂。

106.根据权利要求104或105的方法，其中所述细胞在cAMP存在下被培养。

107.根据权利要求106的方法，cAMP的浓度介于0.01mM至1M。

108.根据权利要求106或107的方法，其中cAMP的浓度为约0.5mM。

109.一种延展RPE细胞的方法，其包含下列步骤：

(a)以密度至少1000细胞/cm²铺板RPE细胞；及

110.根据权利要求109的方法，其中在步骤(a)中，该细胞以密度5000至100000细胞/cm²铺板。

111.根据权利要求109或110的方法，其中在步骤(a)中，该细胞以密度约20000细胞/cm²铺板。

112.根据权利要求109至111中任一项的方法，其中在步骤(a)中，所述细胞被再铺板在纤连蛋白或上。

113.根据权利要求109至112中任一项的方法，其中在步骤(b)中，该细胞被培养至少7天、至少14天、至少28天或至少42天。

114.根据权利要求109至113中任一项的方法，其中在步骤(b)中，该细胞被培养约49天。

115.根据权利要求109至114中任一项的方法，其中所述试剂选自腺苷环化酶活化剂，优选为福司柯林或磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，优选为PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、PDE7、PDE8、PDE10和/或PDE11抑制剂。

116.根据权利要求109至114中任一项的方法，其中在步骤(b)中，该细胞在cAMP的存在下被培养。

117.根据权利要求116的方法，cAMP的浓度介于0.01mM至1M。

118.根据权利要求116或117的方法，其中cAMP的浓度为约0.5mM。

119.根据权利要求109至114的方法，其中在步骤(b)中，在SMAD抑制剂的存在下培养该细胞。

120.根据权利要求119的方法，其中该SMAD抑制剂为2-(6-甲基吡啶-2-基)-N-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-胺；6-(1-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)喹唑啉-4(3H)-酮；或4-甲氧基-6-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)喹啉。

121.根据权利要求1至120中任一项的方法，其中产生的RPE细胞具有卵石状形态，具有色素沉着且表达至少一个下列RPE标志物：MITF、PMEL17、CRALBP、MERTK、BEST1及ZO-1。

122.根据权利要求1至121中任一项的方法，其中产生的RPE细胞分泌VEGF及PEDF。

123.根据权利要求1至122中任一项的方法，其中所有步骤均在无异物的条件下进行。

124.RPE细胞，其是通过根据权利要求第1至123中任一项的方法获得。

125.RPE细胞，其可通过权利要求第1至123中任一项的方法获得。

126.药物组合物，其包含根据权利要求124或125的RPE细胞。

127.在受试者中治疗视网膜疾病的方法，所述方法包含向所述受试者给药权利要求124或125的RPE细胞或权利要求126的药物组合物。

128.产生RPE细胞的方法，其包含：

a)提供多能性细胞群；

b)诱导多能性细胞分化成RPE细胞；和

c)就表达CD59的细胞而言富集该细胞群。

129.根据权利要求128的方法，其中步骤c)包含

-将该细胞与缀合荧光团的抗CD59抗体接触；和

-使用FACS选择与该抗CD59抗体结合的细胞。

130.根据权利要求128的方法，其中步骤c)包含

-将该细胞与缀合磁性粒子的抗CD59抗体接触；和

-使用MACS选择与该抗CD59抗体结合的细胞。

131.纯化RPE细胞的方法，其包含：

a)提供包含RPE细胞与非RPE细胞的细胞群；

b)通过就表达CD59的细胞而言富集该细胞群以增加该细胞群中RPE细胞的百分比。

132.根据权利要求131的方法，其中步骤b)包含

-将该细胞群与缀合荧光团的抗CD59抗体接触；和

-使用FACS选择与该抗CD59抗体结合的细胞。

133.根据权利要求131的方法，其中步骤b)包含

-将该细胞群与缀合磁性粒子的抗CD59抗体接触；及

-使用MACS选择与该抗CD59抗体结合的细胞。

134.根据权利要求131至133的方法，其中该非RPE细胞为多能性细胞或RPE前体。