JP2021072818A - 終脳又はその前駆組織の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
に外転しながら両側に半球状の脳胞を形成する (図17A) (非特許文献2)。大脳皮質の後尾側は皮質ヘムが隣接し、一方吻腹側は古皮質を介して外側基底核原基(LGE, 線条体原基
)や隔膜が隣接している。成体の6層の中には、その大部分が皮質ヘムや隔膜などの隣接する組織に由来し(非特許文献3)、主にリーリン陽性のカハールレチウス細胞から形成さ
れる最表層のI層 (胎生時期の原基は辺縁帯と呼ばれる; 図17B)が存在する (ヒトの大脳
皮質の場合、リーリン陽性細胞の一部は大脳皮質神経上皮からも直接生み出される) (非
特許文献4)。残りの皮質板の層は、時間および空間的に規則正しく神経細胞が生み出され配置される特徴的なパターンを有していている。これはインサイド−アウトパターンと呼ばれ、より深い層の神経細胞がより早く神経前駆細胞から生みだされる(図17B) (非特許
文献5, 6)。
この凝集塊が大脳皮質の発生の初期過程を再現することを示した (非特許文献7-9)。この方法はヒトiPS細胞の適応も可能であることが報告されている (非特許文献10)。この自己組織化されたヒトES細胞由来の浮遊細胞塊の中には、大脳皮質神経上皮が自発的に形成され、培養40-45日後には脳室帯や皮質板および辺縁帯も自発的に形成される。この大脳皮
質神経上皮は、ヒト妊娠初期の大脳皮質形成を再現したが、多くの点で未成熟であった (図17C) (非特許文献7)。
即ち、本発明は下記の通りである:
[2]得られる細胞凝集塊が、大脳皮質、大脳基底核、海馬及び脈絡膜からなる群から選択されるいずれかの終脳部分組織、又はその前駆組織を含む、[1]記載の製造方法。
[3]高酸素分圧条件下での浮遊培養を、Wntシグナル増強剤の存在下で行う、[1]又
は[2]記載の製造方法。
[4]高酸素分圧条件下での浮遊培養を、Wntシグナル増強剤及び骨形成因子シグナル伝
達経路活性化物質の存在下で行う、[1]又は[2]記載の製造方法。
[5](I)多能性幹細胞の凝集塊を、Wntシグナル阻害剤及びTGFβシグナル阻害剤の存
在下で浮遊培養することにより、終脳マーカー陽性凝集塊を得ること、
(II)(I)で得られた該終脳マーカー陽性凝集塊を、Wntシグナル増強剤及び骨形成
因子シグナル伝達経路活性化物質の存在下で更に浮遊培養すること、及び
(III)(II)で得られた細胞凝集塊をWntシグナル増強剤及び骨形成因子シグナル
伝達経路活性化物質の不在下で更に浮遊培養すること
を含む、終脳若しくはその部分組織、或いはその前駆組織を含む細胞凝集塊の製造方法。[6]製造される細胞凝集塊が、連続した神経上皮中に、大脳皮質組織又はその前駆組織、脈絡膜組織又はその前駆組織、及び海馬組織又はその前駆組織を含む、[5]記載の製造方法。
[7]製造される細胞凝集塊が、連続した神経上皮中に、歯状回組織又はその前駆組織、及びアンモン角組織又はその前駆組織を含む、海馬組織またはその前駆組織を含む、[5]記載の製造方法。
[8]海馬組織または前駆組織が、連続した神経上皮中に、皮質ヘムを更に含む、[7]記載の製造方法。
[9]製造される細胞凝集塊が、アンモン角組織又はその前駆組織を含む、[5]記載の製造方法。
[10](II)及び(III)における浮遊培養を高酸素分圧条件下で行う、[5]記載の製造方法。
[11]細胞凝集塊を、shhシグナル作動薬で処理することを含む、[1]又は[2]記載の製造方法。
[12]細胞凝集塊を、FGF8で処理することを含む、[1]又は[2]記載の製造方法。[13]得られる細胞凝集塊が、表層から深部に向かって、辺縁帯、皮質板、サブプレート、中間帯、脳室下帯及び脳室帯を含む多層構造を有する、大脳皮質組織又はその前駆組織を含む、[2]記載の製造方法。
[14]得られる細胞凝集塊が、大脳基底核又はその前駆組織を含む、[11]記載の製造方法。
[15]得られる細胞凝集塊が、吻側化大脳皮質又はその前駆組織を含む、[12]記載の製造方法。
[16]多能性幹細胞が胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、[1]〜[15]のいずれかに記載の製造方法。
[17]多能性幹細胞がヒト由来である、[1]〜[16]のいずれかに記載の製造方法。
[18]浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、[1]〜[17]のいずれかに記載の製造方法。
[19][1]〜[18]のいずれかに記載の製造方法により得られる細胞凝集塊。
[20][1]〜[18]のいずれかに記載の製造方法により得られる、海馬又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を分散すること、及び分散した細胞を更に接着培養し、該細胞から成熟した海馬ニューロンを誘導することを含む、成熟した海馬ニューロンの製造方法。
ら脳室下帯外側に特異的に誘導することができる。
以下、本発明の詳細を説明する。
「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力(分化多能性)と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力(自己複製能)とを併せ持つ細胞をいう。
胞である限り、これに限定されない。本発明においては、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞が好適に用いられる。
Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1994);Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998))。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい(Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997))、Cibelli et al. (Science, 280, 1256 (1998))、入谷明ら
(蛋白質核酸酵素, 44, 892 (1999))、Baguisi et al. (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999))、Wakayama et al. (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999))、Rideout III et al. (Nature Genetics, 24, 109 (2000) 、Tachibana et al. (Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) in press)。初期胚として、単為発生
胚を用いてもよいKim et al. (Science, 315, 482-486 (2007))、Nakajima et al. (Stem Cells, 25, 983-985 (2007))、Kim et al. (Cell Stem Cell, 1, 346-352 (2007)
)、Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 9, 432-449 (2007))、Revazova et al.
(Cloning Stem Cells, 10, 11-24 (2008))。
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731 (1998)、Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003))。
等)へ核初期化因子を接触させることにより、人為的に分化多能性及び自己複製能を獲得した細胞をいう。iPS細胞は、体細胞(例えば線維芽細胞、皮膚細胞等)にOct3/4、Sox2
、Klf4およびc-Mycからなる核初期化因子を導入する方法で初めて見出された(Cell, 126: p. 663-676, 2006)。その後、多くの研究者により、リプログラム因子の組み合わせや因子の導入法について様々な改良が進められており、多様な誘導多能性幹細胞の製造法が報告されている。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), N-Myc, L-Mycで置換可能である。)
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
場合、Oct3/4, Sox2及びKlf4の3因子の組み合わせが好ましい。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合(例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4, Klf4, Sox2及びc-Mycの4因子か、それにLin28またはNanogを加えた5因子が好ましい。
遺伝子に標識遺伝子(例えばGFP等の蛍光タンパク質)をインフレームにノックインする
ことにより、標識遺伝子の発現を指標として対応する分化段階に達したことを識別可能とした細胞であってもよい。
無血清培養や、無フィーダー細胞培養により維持することが好ましい。
多能性幹細胞の凝集塊は、分散させた多能性幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養し(即ち、浮遊培養し)、複数の多能性幹細胞を集合させて凝集塊を形成させることにより、得ることができる。
胞を迅速に凝集させて、1つの培養コンパートメント中に1つの凝集塊を形成することが好ましい。このような分散した多能性幹細胞を迅速に凝集させる方法としては、例えば、以下の方法を挙げることができる:
(1)比較的小さな体積(例えば、1ml以下、500μl以下、200μl以下、100μl以下)の培養コンパートメント中に、分散した多能性幹細胞を閉じ込め、該コンパートメント中に1個の凝集塊を形成する方法。好ましくは分散した多能性幹細胞を閉じ込めた後、培養コンパートメントを静置する。培養コンパートメントとしては、マルチウェルプレート(384ウェル、192ウェル、96ウェル、48ウェル、24ウェル等)、マイクロポア、チャンバースライド等におけるウェルや、チューブ、ハンギングドロップ法における培地の液滴等を挙げることができるが、これらに限定されない。該コンパートメントに閉じ込められた分散した多能性幹細胞が、重力にうながされて1箇所に沈殿し、或いは細胞同士が接着することにより、1つの培養コンパートメントにつき、1つの凝集塊が形成される。マルチウェルプレート、マイクロポア、チャンバースライド、チューブ等の底の形状は、分散した多能性幹細胞が1箇所へ沈殿するのが容易となるように、U底又はV底とすることが好ましい。
(2)遠心チューブに分散した多能性幹細胞を入れ、これを遠心し、1箇所に多能性幹細胞を沈殿させることにより、該チューブ中に1個の凝集塊を形成する方法。
凝集塊の集団における当該パラメーターの平均値±10%の範囲内、好ましくは、平均値±5%の範囲内であることを意味する。
本発明の製造方法は、多能性幹細胞の凝集塊を、Wntシグナル阻害剤及びTGFβシグナル阻害剤の存在下で浮遊培養することにより、終脳マーカー陽性凝集塊を得ること(第1の培養工程)、及び該終脳マーカー陽性凝集塊を、更に浮遊培養すること(第2の培養工程)を含む。第2の培養工程における浮遊培養は、好適には、高酸素分圧条件下で行われる。第1の培養工程により、多能性幹細胞から、終脳領域への分化方向をコミットすることにより、終脳マーカー遺伝子の発現が誘導され、得られた終脳マーカー陽性凝集塊を第2の培養工程に付すことにより、終脳若しくはその部分組織、又はその前駆組織への更なる分化が誘導される。
凝集塊である。終脳マーカー陽性凝集塊においては、例えば、該凝集塊に含まれる細胞の30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上が、終脳マーカー陽性である。
グナル阻害剤及びTGFβシグナル阻害剤の存在下で浮遊培養することにより、終脳マーカ
ー陽性凝集塊(例、Foxg1陽性凝集塊)を得て、該終脳マーカー陽性凝集塊(例、Foxg1陽性凝集塊)を、(好適には、高酸素分圧条件下で)更に浮遊培養することにより、該凝集塊中に、終脳マーカー陽性の神経上皮様構造が形成される。一態様において、神経上皮様構造を含む凝集塊に含まれる細胞の70%以上が終脳マーカー陽性(例、Foxg1陽性)で
ある。一態様において、凝集塊中に形成された、神経上皮様構造は、内部に脳室様の空洞を有した多列円柱上皮構造を呈する。一態様において、該神経上皮構造は、内腔側にPax6陽性およびSox2陽性の細胞層を有し、最も内腔の部分にリン酸化Histone H3陽性の有糸分裂細胞を含む。これらの構造は、ヒト妊娠初期の大脳皮質の脳室帯に類似する。一態様において、脳室帯に類似した神経上皮様の細胞層の外側には、有糸分裂後の神経細胞のマーカーであるTuj1を発現し、大脳皮質の初期皮質板マーカーであるCtip2とTbr1を発現する
細胞が含まれる。これらは、大脳皮質の第1層の神経細胞であるReelin陽性カハールレチウス細胞を含み、表層近くにはLamininを多く含んだ層を有し得る。つまり、好ましい態
様において、本発明の製造方法により得られる凝集塊には、大脳皮質前駆組織が含まれる。
る限り特に限定されない。Wntシグナル阻害剤としては、例えば、IWR-1-endo(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinyl-benzamide)、IWP-2、XAV939、Dkk1、Cerberus蛋白、Wnt受容体阻害剤、可溶型Wnt受容体、Wnt抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブWnt蛋白が挙げられるがこれらに限定されない。なかでも、IWR-1-endoが好ましい。
びSB431542である。
多能性幹細胞から終脳領域への分化誘導を可能な範囲で、適宜設定することができるが、Wntシグナル阻害剤としてIWR-1-endoを用いる場合、その濃度は、通常、0.1〜50 μM
、好ましくは0.3〜5 μMである。TGFβシグナル阻害剤としてSB431542を用いる場合、そ
の濃度は、通常、0.1〜100 μM、好ましくは1〜10 μMである。
1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。好ましくは、Glasgow MEM培地が用いられる。
、Glutamax(Gibco社製)が挙げられる。
ルビン酸、d−ビオチン等)、抗生物質(例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等)、緩衝剤(例えばHEPES等)等が挙げられるが、これらに限定されない。
SR等)を添加したものである。ここにいう「成長因子」には、Fgf、Wnt、Nodal、Notch、Shh等のパターン形成因子;インスリン及びLipid-rich albuminが包含される。
集塊は、例えば、RT-PCRや、終脳マーカー特異的抗体を用いた免疫組織化学により検出することができる。例えば、培養中の細胞凝集塊のうち50%以上、好ましくは70%以上の細胞凝集塊が終脳マーカー陽性となるまで実施される。培養期間は、多能性幹細胞の動物種や、Wntシグナル阻害剤及びTGFβシグナル阻害剤の種類に応じて変動し得るので
、一概に特定することは出来ないが、例えば、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第一の培養工程は、15〜20日(例、18日)である。
の分化誘導を促進するため、血清代替物としてN2サプリメントを含有することが好ましい。N2サプリメントは、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレスシン及び亜セレン酸ナトリウムを含む、公知の血清代替用組成物であり、Gibco/Invitrogen社等から購入可能である。N2サプリメントの添加量は、終脳若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化誘導が促進されるように、適宜設定することができる。
オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、及びステアリン酸を含む脂質混合物である。 Chemically Defined Lipid Concentrateは市販のものを使用することができ、例え
ば、Gibco/Invitrogen社等から購入可能である。
物(KSR等)を添加したものである。ここにいう「成長因子」には、Fgf、Wnt、Nodal、Notch、Shh等のパターン形成因子;インスリン及びLipid-rich albuminが包含される。
限定されない。血清は非動化されていることが好ましい。培地中の血清濃度は、脳室帯の長期間の維持培養に寄与しうる範囲で適宜調整することができるが、通常1〜20%(v/v)である。
l、好ましくは1〜10μg/ml(例、5μg/ml)である。
は、基底膜成分を用いることが好ましい。基底膜の主成分としては、例えばIV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンが挙げられる。培地に添加する細胞外マトリクス成分としては市販のものが利用でき、例えば、Matrigel(BD Bioscience)、ヒト型ラミニン(シグマ)などが挙げられる。Mat
rigelは、Engelbreth Holm Swarn(EHS)マウス肉腫由来の基底膜調製物である。Matrigelの主成分はIV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであるが、これらに加えてTGF−β、線維芽細胞増殖因子(FGF)、組織プラスミノゲン活性化因子、EHS腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。Matrigelのgrowth factor reduced製品は、通常のMatrigelよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はEGFが<0.5ng/ml、NGFが<0.2ng/ml、PDGFが<5pg/ml、IGF−1が5ng/ml、TGF−βが1.7ng/mlである。本発明の方法では、growth factor reduced製品の使用が好ましい。
形成された段階以降において)、N2サプリメント、Chemically Defined Lipid Concentrate、血清、ヘパリン、(任意で、細胞外マトリクス)を含有する培地へ切り替えてもよい。
の神経上皮様構造(多列円柱上皮)が形成されるのに十分な期間実施される。当該神経上皮様構造は、顕微鏡観察により確認することが可能である。培養期間は、多能性幹細胞の動物種や、Wntシグナル阻害剤及びTGFβシグナル阻害剤の種類等に応じて変動し得る
ので、一概に特定することは出来ないが、例えば、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第2の培養工程は、少なくとも15〜20日(例、17日)である。
ナル阻害剤の種類等に応じて変動し得るので、一概に特定することは出来ないが、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第2の培養工程を、例えば、52日以上実施する。辺縁帯には、一般的に、Reelin陽性のカハールレチウス細胞及びラミニンが含まれる。皮質板には、Tbr1陽性、Ctip2陽性の深部皮質板、及びSatb2を発現した神経細胞を含む浅部皮質板が包含され、浅部皮質板が辺縁帯と接する。大脳皮質前駆組織の分化が十分に進んでいない場合には、浅部皮質板が明確に形成されていない場合もあるが、分化が十分に進むと(例えば、第2の培養工程を73日以上実施すると)、深部皮質板及び浅部皮質板の双方が明確に形成される。サブプレートは、皮質板の直下に形成され、Calretinin陽性かつMAP2陽性の多くの神経突起を含んだ細胞を含む。中間帯は、脳室下帯と皮質板との間の、細胞がまばらな層である。脳室下帯はTbr2陽性で特徴付けられる。脳室帯は、Sox2陽性かつPax6陽性で特徴付けられる。一態様において、第2の培養工程は、細胞凝集塊中に、大脳皮質組織又はその前駆組織が、表層から深部に向かって、辺縁帯、浅部皮質板、深部皮質板、サブプレート、中間帯、外側脳室下帯、脳室下帯及び脳室帯を含む多層構造を呈するまで(例、73日以上)実施する。このような多層構造は、インビボにおいては、ヒト妊娠中期の大脳皮質に見られるものである。
本発明によれば、oRG様細胞の外側脳室下帯における出現という、ヒトに特異的な現象を
インビトロにおいて再現することができる。
はより強く、反対側では弱いという勾配を示し、吻腹側マーカー(例、Sp8)の発現が、
背尾側マーカーと逆の勾配を示す。或いは、一態様において、大脳皮質脳室帯における背尾側マーカー(例、CoupTF1、Lhx2)が強く発現する領域が皮質ヘムマーカー(例、Zic1
、Otx2)を発現する領域と隣接して形成される。
阻害剤及びTGFβシグナル阻害剤を含む培地中で浮遊培養する。質的に均一な、多能性幹
細胞の凝集塊の集団を用いることにより、終脳若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化の程度についての凝集塊間での差を最小限に抑制し、目的とする分化誘導の効率を向上することができる。質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団の浮遊培養には、以下の態様が包含される。
(1)複数の培養コンパートメントを用意し、1つの培養コンパートメントに1つの多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を播く。(例えば、96ウェルプレートの各ウェルに1つずつ、多能性幹細胞の凝集塊を入れる。)そして、各培養コンパートメントにおいて、1つの多能性幹細胞の凝集塊をWntシグ
ナル阻害剤及びTGFβシグナル阻害剤を含む培地中で浮遊培養する。
(2)1つの培養コンパートメントに複数の多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を1つの培養コンパートメントに播く。(例えば、10cmディッシュに、複数の多能性幹細胞の凝集塊を入れる。)そして、該コンパートメントにおいて、複数の多能性幹細胞の凝集塊をWntシグナル阻害剤及びTGFβシグナル阻害剤を含む培地中で浮遊培養する。
本発明の方法の第2の培養工程において、浮遊培養を、Wntシグナル増強剤及び骨形成
因子シグナル伝達経路活性化物質の存在下で行うことにより、細胞凝集塊中に脈絡膜又はその前駆組織を誘導することができる。
を誘導することが可能である限り、特に限定されず、例えば、GSK-3β阻害剤、組み換え
型Wnt3a、Wnt agonist (化合物)、Dkk (Wnt阻害タンパク質の阻害剤)、R-Spondin等が挙
げられる。GSK-3β阻害剤としては、例えば、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)、Kenpaullone、6-Bromoindirubin-3'-oxime(BIO)等を挙げることができる
。Wntシグナル増強剤は、好ましくはGSK-3β阻害剤であり、より好ましくはCHIR99021で
ある。
を誘導することが可能である限り、特に限定されない。CHIR99021を用いる場合、通常、
約0.1μM 〜30μM、好ましくは約1μM〜10μM(例、3μM)である。
中での培養は、必ずしも第2の培養工程において、脈絡膜又はその前駆組織が誘導されるまでの全ての期間に亘って行う必要はなく、その一部の期間において行えばよい。例えば、第2の培養工程の開始から、3日間以上、Wntシグナル増強剤及び骨形成因子シグナル
伝達経路活性化物質(BMP4等)を含む培地中で浮遊培養を行えば、脈絡膜又はその前駆組織を誘導するに十分であり、その後、Wntシグナル増強剤及び骨形成因子シグナル伝達経
路活性化物質(BMP4等)を含まない培地に切り替えた上で、浮遊培養を継続してもよい。
含む培地中での培養期間が長いほど、脈絡膜選択的な分化を誘導することができる(即ち、同一細胞凝集塊内に、脈絡膜以外の終脳組織(例、大脳皮質、海馬)への分化が生じにくい)。一態様において、細胞凝集塊の集団の8割以上において、脈絡膜又はその前駆組織を誘導することができる。一方、Wntシグナル増強剤及び骨形成因子シグナル伝達経路
活性化物質(BMP4等)を含む培地中での培養期間が短い場合、同一細胞凝集塊内に、脈絡膜以外の終脳組織(例、大脳皮質、海馬)への分化が生じやすくなり、脈絡膜又はその前駆組織に加え、大脳皮質又はその前駆組織及び/又は海馬又はその前駆組織を同一細胞凝集塊内に含む、細胞凝集塊を得ることができる(後述)。
る。脈絡膜組織の誘導に要する時間は、培養条件や、多能性幹細胞の由来する哺乳動物の種類によって変動するので、一概に特定することは出来ないが、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第2の培養工程の開始から、例えば24日後までには、凝集塊の内部に、脈絡膜組織が誘導される。得られた細胞凝集塊の集団の中から、脈絡膜又はその前駆組織が誘導された細胞凝集塊を選択することにより、脈絡膜又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を得ることができる。
本発明の方法の第2の培養工程において、浮遊培養を、Wntシグナル増強剤の存在下で
行うことにより、細胞凝集塊中に海馬又はその前駆組織(皮質ヘム等)を誘導することができる。
誘導することが可能である限り、特に限定されず、例えば、GSK-3β阻害剤、組み換え型Wnt3a、Wnt agonist (化合物)、Dkk (Wnt阻害タンパク質の阻害剤)、R-Spondin等が挙げられる。GSK-3β阻害剤としては、例えば、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)、Kenpaullone、6-Bromoindirubin-3'-oxime(BIO)等を挙げることができる。Wntシグナル増強剤は、好ましくはGSK-3β阻害剤であり、より好ましくはCHIR99021である。
誘導することが可能である限り、特に限定されない。CHIR99021を用いる場合、通常、約0.1μM 〜30μM、好ましくは約1μM〜10μM(例、3μM)である。
又はその前駆組織が誘導されるまでの全ての期間に亘って行う必要はなく、その一部の期間において行えばよい。例えば、第2の培養工程の開始から、3日間以上、Wntシグナル
増強剤を含む培地中で浮遊培養を行えば、海馬又はその前駆組織を誘導するに十分であり、その後、Wntシグナル増強剤を含まない培地に切り替えた上で、浮遊培養を継続しても
よい。
を誘導することができる(即ち、同一細胞凝集塊内に、海馬組織以外の終脳組織(例、大脳皮質、脈絡膜)への分化が生じにくい)。一態様において、細胞凝集塊の集団の8割以
上において、海馬又はその前駆組織を誘導することができる。一方、Wntシグナル増強剤
を含む培地中での培養期間が短い場合、同一細胞凝集塊内に、海馬以外の終脳組織(例、大脳皮質、脈絡膜)への分化が生じやすくなり、海馬組織又はその前駆組織に加え、大脳皮質又はその前駆組織及び/又は脈絡膜又はその前駆組織を同一細胞凝集塊内に含む、細胞凝集塊を得ることができる。
現、終脳マーカー(Foxg1等)の発現を指標に確認することができる。海馬又はその前駆
組織の誘導に要する時間は、培養条件や、多能性幹細胞の由来する哺乳動物の種類によって変動するので、一概に特定することは出来ないが、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第2の培養工程の開始から、例えば24日後までには、凝集塊の内部に、海馬又はその前駆組織が誘導される。得られた細胞凝集塊の集団の中から、海馬又はその前駆組織が誘導された細胞凝集塊を選択することにより、海馬又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を得ることができる。
本発明の方法の第2の培養工程において、浮遊培養を、一過性に、Wntシグナル増強剤
及び骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の存在下で行うことにより、1つの細胞凝集塊中に、脈絡膜(又はその前駆組織)と海馬(又は前駆組織)と大脳皮質(又はその前駆組織)を誘導することができる。
ナル伝達経路活性化物質の存在下で行い、得られた細胞凝集塊を、Wntシグナル増強剤及
び骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の不在下で更に培養する。その結果、得られた細胞凝集塊に含まれる連続した神経上皮中に、脈絡膜(又はその前駆組織)、海馬組織(又は前駆組織)及び大脳皮質組織(又はその前駆組織)が形成される。一態様において、細胞凝集塊の集団の8割以上において、連続した神経上皮中に、脈絡膜(又はその前駆組織)、海馬組織(又は前駆組織)及び大脳皮質組織(又はその前駆組織)を誘導することができる。
物質処理による、脈絡膜組織の形成、その後のこれらの因子の除去という一連の操作(添加による促進、及び除去による揺り戻し)(induction-reversal method)によってオー
ガナイザー活性と称するシグナルが流れて、脈絡膜組織、皮質ヘム、歯条回組織、アンモン角組織の適切な自己組織化が達成され得る。
脈絡膜(又はその前駆組織)、海馬(又は前駆組織)及び大脳皮質(又はその前駆組織)を誘導することができる限り、特に限定されず、例えば、GSK-3β阻害剤、組み換え型Wnt3a、Wnt agonist (化合物)、Dkk (Wnt阻害タンパク質の阻害剤)、R-Spondin等が挙げられ
る。GSK-3β阻害剤としては、例えば、CHIR99021、Kenpaullone、6-Bromoindirubin-3'-oxime(BIO)等を挙げることができる。Wntシグナル増強剤は好ましくは、GSK-3β阻害剤
であり、より好ましくはCHIR99021である。
脈絡膜(又はその前駆組織)、海馬(又は前駆組織)及び大脳皮質組織(又はその前駆組織)を誘導することができる限り、特に限定されない。CHIR99021を用いる場合、通常、
約0.1μM 〜100μM、好ましくは約1μM〜30μM(例、3μM)である。
nM、好ましくは0.1〜2.5 nM(例、0.5 nM)である。
中での培養の期間は、培養条件や、多能性幹細胞の由来する哺乳動物の種類によって変動するので、一概に特定することは出来ないが、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、通常、1〜7日、好ましくは2〜4日(例、3日)である。
後の培養期間は、培養条件や、多能性幹細胞の由来する哺乳動物の種類によって変動するので、一概に特定することは出来ないが、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、通常、10日以上、好ましくは14日以上である。
陽性でFoxg1が陰性の脈絡膜領域、Lmx1a、Otx2を発現しFoxg1弱陽性である皮質ヘムの領
域、Lef1陽性でFoxg1が陽性の海馬前駆組織の領域、Lef1陰性かつFoxg1陽性の大脳皮質前駆組織が、同一神経上皮上に連続的に形成される。
(6)と同様に、本発明の方法の第2の培養工程において、浮遊培養を、一過性に、Wntシグナル増強剤及び骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の存在下で行うことにより
、1つの細胞凝集塊中に、歯状回組織(又はその前駆組織)及びアンモン角組織(又はその前駆組織)を連続的に含む、海馬組織又はその前駆組織を誘導することができる。これまでに、多能性幹細胞からアンモン角組織(又はその前駆組織)を分化させたという報告はない。
ナル伝達経路活性化物質の存在下で行い、得られた細胞凝集塊を、高酸素分圧条件下、Wntシグナル増強剤及び骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の不在下で更に培養する。
その結果、得られた細胞凝集塊における連続した神経上皮中に、歯状回組織(又はその前駆組織)及びアンモン角組織(又はその前駆組織)を含む海馬組織又はその前駆組織が形成される。また、この培養の結果、アンモン角組織(又はその前駆組織)を含む細胞凝集塊を得ることができる。
物質処理による、脈絡膜組織の形成、その後のこれらの因子の除去という一連の操作(添加による促進、及び除去による揺り戻し)(induction-reversal method)によってオー
ガナイザー活性と称するシグナルが流れて、脈絡膜組織、皮質ヘム、歯条回組織、アンモン角組織の適切な自己組織化が達成され得る。
歯状回組織(又はその前駆組織)及びアンモン角組織(又はその前駆組織)を誘導することができる限り、特に限定されず、例えば、GSK-3β阻害剤、組み換え型Wnt3a、Wnt agonist (化合物)、Dkk (Wnt阻害タンパク質の阻害剤)、R-Spondin等が挙げられる。GSK-3β
阻害剤としては、例えば、CHIR99021、Kenpaullone、6-Bromoindirubin-3'-oxime(BIO)等を挙げることができる。Wntシグナル増強剤は、好ましくはGSK-3β阻害剤であり、より好ましくはCHIR99021である。
歯状回組織(又はその前駆組織)及びアンモン角組織(又はその前駆組織)を誘導することができる限り、特に限定されない。CHIR99021を用いる場合、通常、約0.1μM 〜30μM、好ましくは約1μM〜10μM(例、3μM)である。
くは0.1〜2.5 nM(例、0.5 nM)である。
ント、Lグルタミン及び血清が含まれ得る。
中での培養の期間は、培養条件や、多能性幹細胞の由来する哺乳動物の種類によって変動するので、一概に特定することは出来ないが、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、通常、1〜7日、好ましくは2〜4日(例、3日)である。
後の培養期間は、培養条件や、多能性幹細胞の由来する哺乳動物の種類によって変動するので、一概に特定することは出来ないが、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、通常、40日
以上、好ましくは51日以上である。
、Lef1(海馬前駆組織マーカー)陽性、Zbtb20弱陽性等で特定され得る。
アンモン角組織又はその前駆組織(例、Zbtb20弱陽性)と、皮質ヘムおよび脈絡膜の間に形成される。即ち、生体と類似した互いに隣接した配置で、歯状回組織(又はその前駆組織)、アンモン角組織(又はその前駆組織)及び皮質ヘムが連続した神経上皮中に形成される。
本発明の方法において、細胞凝集塊を、ソニックヘッジホッグ(Shh)シグナル作動薬で処理することにより、細胞凝集塊中に大脳基底核又はその前駆組織を誘導することができる。
常、1nM 〜10μMである。
。一方、SAGを比較的高濃度(例えば100nM〜10μM、好ましくは250nM〜1μM)で用いる場合、大脳基底核のうち、内側基底核原基(MGE)が、終脳神経上皮上に優先的に誘導され
る。
上述の通り、本発明の方法においては、大脳皮質の背腹軸及び前後軸が自発的に形成される。一態様において、第2の培養工程において得られる、細胞凝集塊に含まれる、大脳皮質脳室帯において、背尾側マーカー(CoupTF1、Lhx2等)の発現が、片側ではより強く
、反対側では弱いという勾配を示し、吻腹側マーカー(例、Sp8)の発現が、背尾側マー
カーと逆の勾配を示す。ここに、大脳皮質の吻腹側の特異性の獲得に重要であることが知られるFGF8を作用させることにより、大脳皮質脳室帯全体を吻側化させることができる。
現の全体的減弱、及び吻腹側マーカー(例、Sp8)の脳室帯全体にわたる上昇等によって
確認することができる。これは、FGF8処理により、大脳皮質の背腹軸に沿った前頭葉と後
頭葉等の領域を選択的に制御して誘導できる可能性を示す。
上記(5)〜(7)のいずれかの方法により得られる海馬又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を分散し、分散した細胞を更にインビトロで接着培養することにより、成熟した海馬ニューロンを得ることが出来る。本発明は、このような海馬ニューロンの製造方法をも提供する。
を含むことが好ましい。B27サプリメントは、ビオチン、L−カルニチン、コルチコステ
ロン、エタノールアミン、D(+)ガラクトース、還元型グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレッシン、レチニル酢酸、セレン、トリオド−l−チロミン、ビタミンE、ビタミンE酢酸塩、ウシアルブミン、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシドジスムターゼ、トランスフェリン等を含む公知の組成物である。尚、海馬ニューロンの成熟を阻害しないため、該組成物からレチニル酢酸を除いた、ビタミンAフリーのB27サプリメントを用いることが好ましい。B27サプリメントの添加量は、海馬ニューロンの成熟が促進されるように、適宜設定することができる。
よい。BDNFを含む場合、培地中のBDNF濃度は、海馬ニューロンの成熟を促進する限り特に限定されないが、通常1ng/ml以上、好ましくは10ng/ml以上、より好ましくは20ng/ml以上である。BDNF濃度の上限値は、海馬ニューロンの成熟を促進する限り特に
限定されないが、過剰に添加しても活性が飽和するため、通常1000ng/ml以下、好ましく
は100ng/ml以下の濃度とすることが好ましい。BDNFは、好ましくは単離されている。
限定されないが、過剰に添加しても活性が飽和するため、通常1000ng/ml以下、好ましく
は100ng/ml以下の濃度とすることが好ましい。NT−3は、好ましくは単離されている。
化されていることが好ましい。培地中の血清濃度は、脳室帯の長期間の維持培養に寄与しうる範囲で適宜調整することができるが、通常1〜20%(v/v)である。
を含む。該B27サプリメントは、好ましくは、ビタミンAフリーである。該培地は、更に
、FBS及びL−グルタミンを含み得る。
ント、BDNF及びNT−3を含む。該B27サプリメントは、好ましくは、ビタミンAフ
リーである。該培地は、更に、FBS及びL−グルタミンを含み得る。
つMAP2陽性の樹状突起を有する細胞として特定できる。従って、一態様において、Zbtb20及びFoxg1陽性であり、かつMAP2陽性の樹状突起を有する細胞の出現が確認されるまで、
分散した細胞の接着培養が行われる。
小さな細胞)、及び海馬CA3領域の錐体細胞(KA1陽性、比較的大きい細胞)が包含される。
来る。
更なる局面において、上記により得られた細胞凝集塊から終脳若しくはその部分組織、又はその前駆組織を単離することができる。本発明は上記本発明の方法により得られる細胞凝集塊、終脳若しくはその部分組織、及びその前駆組織を提供する。更なる態様において、本発明は上記本発明の方法により得られる海馬ニューロンを提供する。
れら細胞の補充が所望される状態としては、脳外科手術後(例えば、脳腫瘍摘出後)が挙げられる。
ヒト多能性幹細胞からの選択的な大脳皮質前駆組織の立体形成
(方法)
ヒトES細胞(KhES-1;終脳特異的遺伝子Foxg1に蛍光タンパク遺伝子Venusをノックインしたもの)をトリプシン処理により単一細胞に分散し、SFEBq法(Nakano et al, Cell Stem Cell, 2012)に準じて凝集塊を形成し、分化誘導のための浮遊凝集塊培養を37℃、5% CO2存在下に行った。分散した9000個のヒトES細胞を、低細胞吸着性の表面コートをし
たV底型96ウェルプレートの各ウェルに播種し、分化誘導用の培養液は成長因子を含ま
ないG-MEM培地(Gibco/Invitrogen社)に20%KSR (Knockout Serum Replacement)、0.1mM
非必須アミノ酸溶液(Gibco/Invitrogen社)、1mM ピルビン酸ナトリウム溶液(Sigma社)、0.1 mM 2-メルカプトエタノールを添加したものを用いた。分化誘導の最初の3日間は分散惹起性細胞死を抑制するためにROCK阻害剤Y-27632を20 μM添加し、次の3日間はその濃
度を半減させて作用させた。分化誘導開始後0日目から18日目までWntシグナル阻害剤IWR-1-endを3 μM、TGFβシグナル阻害剤SB431542 を5 μM 添加して作用させた。分化誘
導開始後18日目に、これらの凝集塊を低細胞吸着性の表面コートをした9 cm ペトリ皿
に移し、浮遊培養を37℃、5% CO2、40% O2存在下に行った。18日目から35日目まではDMEM/F12培地(Gibco/Invitrogen社)に1%のN2サプリメント (Gibco/Invitrogen社)、1%
の脂質濃縮物(Chemically defined lipid concentrate、Gibco/Invitrogen社)を添加したものを用いた。35日目以降は、これらの培養液に、さらに10%FBS、5 μg/mlのヘパ
リン、1%のマトリゲル グロースファクター リデュースト(BD Bioscience社)を添加した
ものを用いた。これらの凝集塊は、分化誘導開始後1日目および34日目にFACSで解析を行い、42日目に免疫組織染色で解析した。
分化誘導開始18日後より、凝集塊にFoxg1::venusの蛍光が強く観察された。分化誘導開始26日後には、9割以上の凝集塊で再現性良くFoxg1::venusの蛍光が強く観察された(図
1A)。分化誘導開始34日後には、全細胞の7.5割以上の細胞でFoxg1::venusの蛍光が観察
された。またすべての凝集塊はFoxg1::venus 陽性であった(図1B)。Foxg1:venus陽性凝
集塊は、内部に脳室様の空洞を有した半球上の神経上皮様構造(多列円柱上皮)を示した。これらの神経上皮構造は、内腔側にPax6陽性およびSox2陽性の細胞密度が高い細胞層を有し(図1D、E)、最も内腔の部分にリン酸化Histone H3陽性の有糸分裂細胞を認めた(図1F)。これらの構造はヒト妊娠初期の大脳皮質の脳室帯に類似していた。脳室帯に類似
した細胞層の外側には、有糸分裂後の神経細胞のマーカーであるTuj1を発現し、大脳皮質の初期皮質板マーカーであるCtip2とTbr1を発現していた。またこれらは、大脳皮質の第
1層の神経細胞であるReelin陽性カハールレチウス細胞を含み、表層近くにはLamininを
多く含んだ層を有していた。つまり、このように培養した凝集塊の中に大脳皮質前駆組織が形成されていることが判った。このようにヒト妊娠初期の大脳皮質前駆組織を自己形成することが再現性良く認められた。
ヒト多能性幹細胞からの大脳基底核前駆組織の立体形成
(方法)
分化誘導35日目まで実施例1の培養条件と同様に培養した。即ち、ヒトES細胞凝集塊を分化誘導18日後までV底96穴プレートにて培養したのち、浮遊凝集塊を細胞非吸着性の
ペトリ皿(直径9 cm)に移し、分化誘導18日から35日目までの浮遊培養を37℃、5%
CO2、40% O2存在下で行った。ただし、実施例1の培養液に15日目から21日目の期間のみ、Sonic hedgehog (Shh)シグナル作動薬SAGを30 nMまたは500 nMの最終濃度で添加して作用させた。これらの凝集塊は、35日目に免疫組織染色で解析した。
Shhシグナル作動薬SAGを30 nMを作用させた場合、Foxg1::venus陽性の終脳神経上皮に
は、Gsh2を発現する外側基底核原基(LGE)が形成された(図2A,Bの矢頭)。Gsh2陽性のLGE神経上皮はこの条件下において7割以上の凝集塊で再現性良く認められた。胎児のLGEはGABA作動性神経細胞である線条体神経細胞を生み出す。同様に、ヒトES細胞由来のLGE神経上皮の直下には、GAD65陽性のGABA作動性神経細胞が認められた(図2B)。
のように、本培養法により大脳基底核前駆組織であるLGEやMGEを高効率に誘導できることが示された。
大脳皮質と大脳基底核の連続的な立体形成
(方法)
分化誘導35日目まで実施例2の培養条件と同様に培養した。即ち、ヒトES細胞凝集塊を
分化誘導18日後までV底96穴プレートにて培養したのち、浮遊凝集塊を細胞非吸着性の
ペトリ皿(直径9 cm)に移し、分化誘導18日から35日目までの浮遊培養を37℃、5%
CO2、40% O2存在下で行った。分化培養15日目から21日目の期間のみ、Shhシグナル作動
薬SAGを30 nMの濃度で培養液に添加した。これらの凝集塊は、35日目に免疫組織染色で解析した。
実施例2で示したように、Shhシグナル作動薬SAGを30 nMを作用させた場合、終脳神経上皮はFoxg1::venus陽性かつ、外側基底核原基(LGE)のマーカーであるGsh2,GAD65を発現し
た(図3A,B)。これらのLGE 神経上皮は、Gsh2陰性かつ大脳皮質のマーカーであるPax6陽性
の大脳皮質神経上皮と連続して形成されていた(図3C)。つまりこれらの結果は、大脳皮質と大脳基底核が一つの凝集塊の中に連続して形成されていることを示している。このように、大脳皮質と大脳基底核が一つの凝集塊の中に連続して自己形成することは、5割以上の凝集塊で再現性良く認められた。
ヒト多能性幹細胞からの選択的な脈絡膜組織の立体形成
(方法)
分化誘導18日後まで実施例1の培養条件でV底96穴プレートにて培養したのち、浮遊
凝集塊を細胞非吸着性のペトリ皿(直径9 cm)に移し、浮遊培養を37℃、5% CO2,40% O2存在下で行った。培養液は、18日目から42日目までは、DMEM/F12培地(Gibco/Invitrogen社)に1% N2サプリメント(Gibco/Invitrogen社)、1% 脂質濃縮物(Chemically defined lipid concentrate、Gibco/Invitrogen社)、10%FBS、5 μg/ml ヘパリン、3 μM GSK-3β阻害剤CHIR99021、0.5 nM BMP4を加えたものを用いて培養し、42日目に免疫組織染色で解析した。
上記の条件で培養した場合、分化誘導開始18日目以降も凝集塊にBf1(Foxg1)::venusの
強い蛍光は観察されなかった。これらの凝集塊はひだ状の単層上皮となり、脈絡膜のマーカーであるTTR、Lmx1a、Otx2を発現している(図4A,B)ことから、脈絡膜組織を誘導できたと考えられた。この条件下で脈絡膜組織を自己形成することは、8割以上の凝集塊で再現性良く認められた。
ヒト多能性幹細胞からの選択的な皮質ヘム(海馬采の前駆組織)の形成
(方法)
分化誘導18日後まで実施例1の培養条件でV底96穴プレートにて培養したのち、浮遊
凝集塊を細胞非吸着性のペトリ皿(直径9 cm)に移し、浮遊培養を37℃、5% CO2、40% O2存在下で行った。培養液は、18日目から42日目までは、DMEM/F12培地(Gibco/Invitrogen社)に1% N2サプリメント (Gibco/Invitrogen社)、1% 脂質濃縮物(Chemically defined lipid concentrate、Gibco/Invitrogen社)、10%FBS、5 μg/ml ヘパリン、3 μM GSK-3β阻害剤CHIR99021(Wntシグナル増強剤)を加えたものを用いて培養し、42日目に免疫組織染色で解析した。
上記のように18日目以降Wntシグナルを増強した条件で培養した場合、皮質ヘムのマ
ーカーのLmx1a、Otx2を発現し、Foxg1::venus弱陽性である神経上皮が主体である凝集塊
が形成された(図5A,B)。この神経上皮は脈絡膜マーカーのTTRを発現しなかった(図5A)。
これらのマーカー発現プロフィールから、この条件では海馬采の前駆組織である皮質ヘムが選択的に誘導されたと考えられる。この条件下で、皮質ヘムの選択的な形成することは、8割以上の凝集塊で再現性良く認められた。
脈絡膜と海馬前駆組織と大脳皮質前駆組織の連続的な立体形成
(方法)
分化誘導18日後まで実施例1の培養条件でV底96穴プレートにて培養したのち、浮遊
凝集塊を細胞非吸着性のペトリ皿(直径9 cm)に移し、浮遊培養を37℃、5% CO2、40% O2存在下で行った。培養液は、18日目から35日目までは、DMEM/F12培地(Gibco/Invitrogen社)に1% N2サプリメント(Gibco/Invitrogen社)、1% 脂質濃縮物(Chemically defined
lipid concentrate、Gibco/Invitrogen社)、10%FBS、5 μg/ml ヘパリンを加えたもの
を用いて培養した。ただし、18日目から21日目の期間のみ、これらの培養液に3 μM GSK-3β阻害剤CHIR99021、0.5 nM BMP4を添加し作用させた。これらの物質は、実施例4と5
にあるように、脈絡膜や皮質へムへの分化を促進するが、実施例6の培養では、これらの作用を3日間に限定し、21日目以降の培養からはこれらを除いた。これらの凝集塊は35日目に免疫組織染色で解析した。
上記のように、一過性にのみWntシグナルとBMPシグナルを増強して、その後にそれらを除去した条件で培養した場合、培養21-27日目の凝集塊には、Foxg1::venus陽性の神
経上皮とFoxg1::venus陰性の神経上皮の両者が形成され(図6A)、それらは連続した神経上皮を構成していた。このようなFoxg1::venus陽性と陰性の神経上皮の両者を隣接して含む状態は、8割以上の凝集塊で再現性良く認められた。Foxg1::venus陰性の神経上皮は、凝
集塊から外へ突出する構造を取り、その先端は半球様の構造を有していた。分化誘導開始35日目において、これらの凝集塊では、Lmx1aが陽性でFoxg1::venusが陰性の脈絡膜領域
、Lmx1a、Otx2を発現しFoxg1::venus弱陽性である皮質ヘムの領域、Lef1陽性でFoxg1::venusが陽性の海馬前駆組織の領域、Lef1陰性かつFoxg1::venus陽性の大脳皮質前駆組織が
連続的に形成されていた(図6B,C)。このように、脈絡膜と海馬前駆組織と大脳皮質前駆組織が一つの凝集塊の中に連続して自己形成することは、8割以上の凝集塊で再現性良く認められた。
海馬組織内の各領域の連続的な立体形成
(方法)
分化誘導18日後まで実施例1の培養条件でV底96穴プレートにて培養したのち、浮遊
凝集塊を細胞非吸着性のペトリ皿(直径9 cm)に移し、浮遊培養を37℃、5% CO2、40% O2存在下で行った。培養液は、18日目以降は、下記の2つの培地のいずれかを用いて培養を行った。
1) DMEM/F12培地(Gibco/Invitrogen社)に1% N2サプリメント (Gibco/Invitrogen社)、1% 脂質濃縮物(Chemically defined lipid concentrate、Gibco/Invitrogen社)、10%FBS
及び5 μg/ml ヘパリンを加えたもの
2) Neurobasal培地(Gibco/Invitrogen社)に2% B27サプリメント ビタミンA無し(Gibco/Invitrogen社)、2mM L-グルタミン及び10% FBSを加えたもの
ただし、実施例6と同様に、18日目から21日目の期間のみ、これらの培養液に3 μM GSK-3β阻害剤CHIR99021、0.5 nM BMP4を添加し作用させた。これらの凝集塊は61日目及び75日目に免疫組織染色で解析した。
上記の1)および2)のいずれの培養液を用いた培養でも、61日目まで継続して培養した場合、凝集塊には海馬前駆組織マーカーであるLef1陽性かつFoxg1::venus陽性の神経上皮が形成された(図7A, B)。これらの神経上皮は海馬前駆組織マーカーであるNrp2陽性の
神経細胞を多く含んでいた(図7D)。また神経上皮は海馬神経細胞および前駆細胞のマーカーであるZbtb20陽性の細胞も多く含んでいた(図7C)。胎児の海馬前駆組織では、神経上皮の脳室帯および脳室下帯のZbtb20の発現は歯状回(脈絡膜や皮質ヘムに隣接する部分)の前駆組織に強く、アンモン角(脈絡膜や皮質ヘムから遠い部分)の前駆組織に弱いという発現強度の勾配が見られる。同様に、ヒトES細胞から形成したLef1陽性神経上皮でもZbtb20の発現は脈絡膜(Lmx1a陽性、Foxg1::venusは陰性)や皮質ヘム(Lmx1a陽性、Foxg1::venusは弱陽性)の領域と隣接する部分で強く、これらから離れるに従って弱くなるという発現強度の勾配が見られた(図7A, B, C)。さらに培養を同条件で75日目まで継続すると、歯状回神経細胞に特徴的なZbtb20とProx1をともに発現する領域(図7E, DG)が、Zbtb20
が弱陽性のアンモン角領域(図7E, CA)と、皮質ヘム(図7E, hem)および脈絡膜(図7E, C
P)の間に形成が確認された。これらは海馬組織内において歯状回組織、アンモン角組織
になり得る領域が連続的に形成されていることを示している。
海馬組織内の各領域の連続的な立体形成を分散培養し得られる成熟した海馬ニューロン
(方法)
実施例7−1の方法により連続した海馬組織を誘導し、Day60-90の間で得られた細胞凝集塊をパパイン酵素液(SUMITOMO BAKELITE, MB-X9901)などの細胞解離液にて単一細胞に
分散させ、その細胞をガラス製のdishやslideなどに播種して平面培養を行った。培養を
行う前にガラスの表面をpoly-D-Lysine 200μg/mlで4℃にて一晩、Laminin 20μg/ml/Fibronectin 8μg/mlで37℃にて一晩コーティングした。
培養液はNeurobasal培地(Gibco/Invitrogen社)に2% B27サプリメント ビタミンA無し(Gibco/Invitrogen社)、2mM L-グルタミン及び10% FBSを加えたものを用いた。これらの
平面条件で培養した細胞は、分散後2-3日以内にガラスの表面に張り付き、神経突起を延
ばし始めた。d140からd197の間に免疫組織染色で解析した。
単一に分散した細胞は小さな凝集塊を形成しやすく、そのニューロン間で神経突起が伸長されていた(図8A)。ほとんどの細胞で海馬マーカーであるZbtb20は陽性であり(図8B)、Foxg1::venusもDay197時点で陽性であった(図8B)。MAP2陽性の樹状突起を認めるニューロン以外に散在する細胞がみられたが、これらの細胞もZbtb20(+)で、細胞の形はグリア細
胞様で、GFAP陽性であることより、アストロサイトであると示唆された(図8C)。Zbtb20陽性細胞の中には、海馬の歯状回マーカーであるProx1陽性細胞と海馬のCA3領域マーカーであるKA1が陽性の細胞が見られ、Prox1陽性細胞は顆粒細胞を示唆する円形で比較的小さな細胞である一方、KA1陽性細胞は比較的大きめの錐体細胞様の形をしていた(図8D-E)。こ
れは生体内で見られる歯状回では顆粒細胞が、CA領域では錐体細胞が形成される事と矛盾していないと考えられた。Zbtb20陽性の細胞割合は8割前後で、この発現率は再現良く認められた。
これらの結果から、マーカーの発現と細胞形態上、海馬歯状回の顆粒細胞及び海馬CA3
領域の錐体細胞が誘導できたことが示唆された。
3次元で誘導した海馬組織を分散培養し得られる成熟した海馬ニューロンの機能解析
(方法)
実施例7−1と同様の方法により、連続した海馬組織を分散培養した。本試験においてはガラス製もしくはプラスチック製のdishやslideなどに播種して平面培養を行った。培
養にはガラスもしくはプラスチックの表面をpoly-D-Lysine 100μg/mlで37℃にて3時間
、Laminin 20μg/ml/Fibronectin 8μg/mlで37℃にて一晩コーティングした。
培養液は分散1〜2日目はNeurobasal培地(Gibco/Invitrogen社)に2% B27サプリメント
ビタミンA無し(Gibco/Invitrogen社)、2mM L-グルタミン、1% FBS、20ng/ml BDNF、20ng/ml NT-3、及び10μM Y-27632を加えたものを用いた。培養3日目以降は、Neurobasal
培地(Gibco/Invitrogen社)に2% B27サプリメント ビタミンA無し(Gibco/Invitrogen社)、2mM L-グルタミン、10% FBS、BDNF 20ng/ml、及びNT-3 20ng/mlを加えた培地を用いて
、半量培地交換を3日に1回行った。分散後30-60日の間に、細胞をfluo4-AM(life technologies、F-14201) 5μM中で37℃にて45分インキュベートし、培地で洗浄後にLCMを用い
たカルシウムイメージングによる機能解析を行った。また、同じ方法で分散培養した細胞でパッチクランプ法による電気生理的解析を行った。測定はwhole cell patch clampにておこない、ガラス電極(電極抵抗値3-6MΩ)内を内液用バッファー(120mM K-Gluconate
、10mM KCl、10mM EGTA、及び10mM Hepes含有バッファーをKOHにてpH7.2に調整)で、チ
ャンバー内を外液用バッファー(140mM NaCl、2.5mM CaCl2、2mM MgCl2、10mM Glucose、
1mM NaH2PO4、及び10mM Hepes含有バッファーをNaOHにてpH7.4に調整)で満たして使用した。測定はEPC10(HEKA)にて行った。全ての試験は室温で実施した。膜容量成分補正を
行い、直列抵抗値は電極抵抗値の3倍以内となる条件下で試験を実施した。電位依存性の
ナトリウム、カリウム電流は、-60mVで電位を保持し、-80mVから+60mVまで-10mV刻みでの刺激時の測定を行った。sEPSCは-60mVにて電圧を保持した際の経時的な電流を測定し、薬剤はDNQX(sigma, D0540)を終濃度10μMで使用した。活動電位は過分極刺激を行った際
の膜電位を測定した。
分散後30-31日経過後のカルシウムイメージングでは、多くの神経がカルシウム流入に
伴う発火活動を示しており(図9A, A’)、各細胞の多様な経時的活動パターンが確認でき
た(図9B)。分散後53日目に施行したパッチクランプでは、電位刺激によるナトリウム・カリウム電流応答、誘発性活動電位、及び自発性興奮性シナプス後電流(spontaneous excitatory postsynaptic current; sEPSC)が認められた(図9C-E)。このsEPSCはAMPA型グル
タミン酸受容体アンタゴニストであるDNQXによる阻害が確認された(図9F)。
これらの実験により、実施例7で得られた神経細胞では自発的な神経活動が見られ、かつその細胞では刺激に応じた活動を示しており、シナプスネットワークも有する機能的な神経が得られていることが示唆された。
ヒト多能性幹細胞からの妊娠中期型の多層構造を持つ大脳皮質の立体形成
(方法)
分化誘導35日目まで実施例1の培養条件と同様に培養した。即ち、ヒトES細胞凝集塊を分化誘導18日後までV底96穴プレートにて培養したのち、浮遊凝集塊を細胞非吸着性の
ペトリ皿(直径9 cm)に移し、分化誘導18日目以降の浮遊培養を37℃、5% CO2、40% O2存在下で行った。長期間において凝集塊を健康に維持するために35日目以降は、2週間
に1度凝集塊を半分割し、実施例1で記載した培養液で培養を継続した。分化誘導56日目
以降は、酸素透過性の高い細胞非吸着性培養皿(直径6cm, SARSTEDT社)に細胞塊を移し
培養を継続した。分化誘導70日目以降は、マトリゲル グロースファクター リデュースト(BD Bioscience社)の濃度を2%に変更して培養を継続した。これらの凝集塊は、70日目お
よび91日目に免疫組織染色で解析した。
上記の条件で培養した場合、分化誘導開始70日目で凝集塊は形態的に明らかな層構造を示した(図10A-B’)。この層構造の最も表層にはLamininが蓄積し、Reelin陽性のカハールレチウス細胞を含んだ辺縁帯が形成されていた(図10C,C’)。辺縁帯の直下にはTbr1陽性
、Ctip2陽性の深部皮質板の神経細胞を含む皮質板が観察された(図10D,D’)。この時点では浅部皮質板のマーカーであるSatb2を発現した神経細胞は少なかった(図10E)。内腔側には細胞密度が高くPax6陽性およびSox2陽性の神経前駆細胞を含んだ細脳室帯(図10F,F’)
と、その上部にTbr2陽性の細胞を含んだ脳室下帯が形成されていた(図10G)。皮質板と脳
室下帯の間は細胞がまばらな、妊娠中期の中間帯と良く似た領域が発達していた。皮質板の直下にはCalretinin陽性かつMAP2陽性の多くの神経突起を含んだ細胞層が形成されていた(図10H,H’)。この細胞層はコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の蓄積が観
察される(図10H”)ことからもサブプレートが形成されていることが示唆された。分化誘
導開始91日目には、この多層構造を持った大脳皮質組織はさらに分厚くなり(図10I)、こ
の時期においても発達したSox2陽性かつPax6陽性の脳室帯およびTbr2陽性の脳室下帯を有していた(図10J,K,M)。皮質板も同様に分厚くなり(図10I)、Tbr1陽性、Ctip2陽性の深部
皮質板の神経細胞だけでなく、Satb2陽性、Brn2陽性の浅部皮質板の神経細胞も多く含ま
れていることが明らかになった(図10L-O)。この時点においてもCalretinin陽性のサブプ
レートは皮質板の直下に観察された(図10P)。このように、本培養法によって、図10Qに示
すような表層-深部軸に沿ってヒト妊娠中期の大脳皮質に見られる多層構造を有する組織
を立体形成することが可能となった。
大脳皮質の自発軸形成とその外因性の制御
(方法)
分化誘導42日目まで実施例1の培養条件と同様に培養した。即ち、ヒトES細胞凝集塊を分化誘導18日後までV底96穴プレートにて培養したのち、浮遊凝集塊を細胞非吸着性の
ペトリ皿(直径9 cm)に移し、分化誘導18日から42日目までの浮遊培養を37℃、5% CO2、40% O2存在下で行った。培養液は実施例1と同じものを用いた。外因性因子の影響を検
討する際には24日目から42日目にこの培養液に200 ng/mLのFGF8bを添加し作用させた。いずれの条件においても、凝集塊は42日目に免疫組織染色で解析した。
妊娠初期の大脳皮質脳室帯において発現が背尾側から吻腹側にかけて勾配を形成する背尾側マーカーとしてCoupTF1やLhx2が知られている。一方で逆の勾配を示す吻腹側マーカ
ーとしてSp8が知られている。外因性因子を作用させない場合には、ヒト多能性幹細胞か
ら誘導した大脳皮質脳室帯でも背尾側マーカーのCoupTF1が、片側ではより強く、反対側
では弱く発現していた(図11A)。吻腹側マーカーであるSp8の発現はCoupTF1と逆の勾配を
示し(図11A)、他の背尾側マーカーであるLhx2の発現はCoupTF1と同じ勾配を示した(図11B,C)。生体内の終脳組織では大脳皮質の背尾側は皮質ヘムに隣接するが、ヒト多能性幹細
胞から誘導した大脳皮質脳室帯も、背尾側マーカーのCoupTF1やLhx2が強く発現する領域
が皮質ヘムマーカーであるZic1やOtx2を発現する領域と隣接して形成されていた(図11D,E)。これらは、この条件下においてヒト多能性幹細胞から誘導した大脳皮質は自発的に背
尾側から吻腹側への極性を自己組織化的に獲得したことを示唆している。
の弱い吻腹側でFGFシグナルにより生じるリン酸化Erkが強く蓄積した(図11F)。一方、外
因性のFGF8bを作用させた場合には、CoupTF1の発現が全体に減弱し、逆にSp8の発現が脳
室帯全体に渡って上昇した(図11G-I)。これらは、外因性にシグナルを与えることで、大
脳皮質の背腹軸あるいは前後軸に沿った前頭葉と後頭葉などの領域性を選択的に制御して、誘導できることを示唆する。
(方法)
ヒトES細胞の維持培養と分化
ヒトES細胞(KhES-1)は日本政府のヒトES細胞研究指針に従って使用した。ヒトES細胞はマイトマイシンCによって不活性化されたMEF細胞をフィーダーとして、DMEM/F12 (Sigma)に 20% (vol/vol) Knockout Serum Replacement (KSR, Gibco/Invitrogen社), 2 mM グルタミン, 0.1 mM非必須アミノ酸溶液 (Gibco/Invitrogen社), 5 ng/ml ヒト組換えbFGF (Wako), 0.1 mM 2-メルカプトエタノール (2-ME), 50 U/ml ペニシリン、 50 μg/ml スト
レプトマイシンを加えたものを培地として用いて、37℃, 2% CO2 存在下で培養を行った
。細胞の継代は、ヒトES細胞を0.25%トリプシン、0.1 mg/ml コラゲナーゼIV、20% KSR、1 mM CaCl2を含むPBSで37℃で7分間反応させて、塊のままフィーダー細胞から剥がした。剥がしたヒトES細胞の塊は、緩やかにピペッティングして小さな細胞の塊 (数十個の細胞)にした。細胞の継代は3〜4分の1で行った。
脳皮質分化用培地を用いて低細胞吸着性の表面コートをしたV底型96ウェルプレートの
各ウェルに播種し凝集塊を形成した。大脳皮質分化用培地は、G-MEM培地(Gibco/Invitrogen社)に20%KSR (Knockout Serum Replacement)、0.1mM 非必須アミノ酸溶液(Gibco/Invitrogen社)、1mM ピルビン酸ナトリウム溶液(Sigma社)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール
、100 U/ml ペニシリン、 100 μg/ml ストレプトマイシンを添加したものを用いた。SFEBq培養を開始した日を0日目とし、IWR1e (Wnt阻害剤) 及び SB431542 (TGFβ 阻害剤)を
それぞれ3 μM 及び 5 μMになるように培養0日目から18日目に添加した。
、100 U/ml ペニシリン、 100 μg/ml ストレプトマイシンを添加したものを用いて37
℃、5% CO2、40% O2存在下で培養した。培養35日目からは、10%FBS、5 μg/mlのヘパリ
ン、1%のマトリゲル グロースファクター リデュースト(BD Bioscience社)を培地に加え
た。細胞凝集塊の中心部分の細胞死を抑制するために、培養35日目以降は2週間毎に実体
顕微鏡下で鋭利なピンセットを用いて半割し、培養56日目以降はlumox培養皿(SARSTEDT; O2透過性)を用いた。培養70日目以降は、マトリゲルの濃度を増加させ(最終2%)、B27添加物(Gibco/Invitrogen社)を培地に加えた。
自己組織化した大脳皮質神経上皮の極性
SFEBq培養法を改良するために (図18 A 及び A′)、分散した9000個のヒトES細胞を、
低細胞吸着性のV底型96ウェルプレート (文献15) の各ウェルに播種し、Rho-キナーゼ
阻害剤(Y-27632)(文献16) を含んだGMEM-KSR培地で培養を行った (図18A)。その後、細胞塊を低細胞吸着性9cm培養皿に移し、40% O2存在下で培養した。脂質濃縮物(18日目)、10%FBS、ヘパリン、低濃度のマトリゲル(1%)(35日目)の添加は脳室帯の長期間の維持
培養のために、最初の18日間のTGFβ阻害剤(SB43152)とWnt阻害剤(IWR1e)の添加は終脳領域の効率的な誘導のために添加した。
脳室帯に類似していた。この脳室帯に類似した細胞層の外側には、有糸分裂後の神経細胞のマーカーであるTuj1を発現し (CP; 図12G)、大脳皮質の初期皮質板マーカーであるCtip2とTbr1を発現していた (文献1, 2) (図12H 及び 図18D)。またこれらの神経細胞層はReelin陽性カハールレチウス細胞を含み (図12I)、表層近くにはLamininを多く含んだ層を有していた (図12J)。つまりヒトES細胞由来の大脳皮質神経上皮内に、自己組織化した層構造が形成されていた。
現勾配は培養35日目には既に観察されていた。マウス胎児では、大脳皮質の後尾側は、将来海馬領域の海馬采を生み出す皮質ヘムに隣接している (図18 H-J)。この現象と一致す
るように、皮質マーカーであるOtx2とZic1は大脳皮質神経上皮のCoupTF1が強く発現する
側に隣接する領域で発現していた (図12M 及び 図18K)。
文献17)。興味深いことに、リン酸化Erk(FGFシグナルの下流で機能する)の強いシグナ
ルが、ヒトES細胞由来の大脳皮質神経上皮ではCoupTF1の発現と逆側で観察された (図12N)。また、ヒトES細胞由来の大脳皮質に外因性のFGF8を作用させると、CoupTF1の発現が失われ、Sp8の発現が広範囲に誘導された (図12 O 及び P 及び 図18L)。これらの結果はFGF−MAPKシグナルがこの自己組織化に関与していることを示している。
ヒトES細胞由来の神経上皮(N-cadherin陽性かつSox2陽性)において、終脳マーカーFoxg1の発現は培養18-20日くらいに観察され始める。神経上皮の頂端側(aPKC陽性)は細胞塊の外周に位置した (図13A, 下)。培養21日目にはこの神経上皮は部分的に非連続的にいくつかの大きな神経上皮に分かれた (図13A)。その後、これらの分割された大脳皮質神経上皮は頂端側がくぼんだ湾曲を示した (図13 B-D 及び 図19A, 上)。
ミオシン(リン酸化MLC2で示される)は大脳皮質領域の頂端側の表層に丸い側も含めて一様に蓄積した (図13C)。ライブイメージングでは、大脳皮質領域の回転端が反対側に近づき、最終的に接着した(図13 E 及び F)。この過程において大脳皮質領域神経上皮の本体
は回転端と同じ方向に動いていた (図13 E-H)。この回転を伴った形態変化は最終的に培
養27日目に内腔が内側に位置する半球状の大脳皮質構造を形成した(図13I 及び 図19A,
下)。
阻害剤であるRock阻害剤の添加により抑制された (図13 J-L)。回転端の神経上皮では後
尾側マーカー(Otx2およびCoupTF1; 図13 M 及び N)が発現していることから、回転端は大脳皮質神経上皮の後尾側と考えられた。
、多量のGAD65陽性GABA作動性神経細胞がLGE神経上皮の直下に誘導された (文献19) (図11P, 赤)。一方で終脳神経上皮の残りの領域の多くは大脳皮質のマーカーであるPax6陽性
であった (図13 Q)。高濃度のSAG添加によって、Pax6やGsh2の発現が抑制され、MGEマー
カーであるNkx2.1が誘導された (図19 B 及び C)。重要なことに、弱いSAGを作用させた
神経上皮は、生体内で見られるように、大脳皮質(Pax6陽性)とLGE(Gsh2陽性)の領域
が連続的に形成され、このことは改良した培養条件下では、自己組織化によって、ひとつ
の凝集塊の中で外套と外套下部が連続的に形成されていることを示している。この連続した神経上皮の中で、大脳皮質神経上皮の回転端 (図13 O-Q, 矢印)は大脳皮質―LGE連結部とは反対側に位置し、これは回転端および非回転端がそれぞれ大脳皮質神経上皮の背側と腹側に相当することと一致している。
本立体培養系では、ヒトES細胞由来の大脳皮質神経上皮の後尾側の端が固定されずに動くことができるので回転を伴う形態変化を起こす。これは胎児の大脳皮質背側の強い湾曲作用を反映していると推察することが出来る (図19 D)。
。
改良した培養条件下では、ヒトES細胞由来の大脳皮質神経上皮は培養42日以降も成長を続けた。培養70日ではヒトES細胞由来の大脳皮質神経上皮の厚さは200μm以上になった (図14 A 及び A′)。この時期になると、神経上皮は形態的に脳室帯、脳室下帯、中間帯、皮質板、辺縁帯の多層構造を示した (図14 B-G 及び 図20 A 及び B)。辺縁帯の最表層にはLamininが蓄積し、リーリン陽性の細胞(CR細胞)を含んでいた (図14 C 及び C′)。
辺縁帯の直下には皮質板が形成され、Tbr1陽性、Ctip2陽性の深部皮質板の神経細胞を含
んでいた (図14 D 及び D′)。この時期には浅部皮質板のマーカーであるSatb2 (文献21)を発現した神経細胞は少なかった (図14 E)。内腔側の脳室帯は、培養70日目には約100μmの厚さで、Pax6陽性およびSox2陽性の神経幹/前駆細胞 (図14 F 及び F′)、または放射状グリア (文献22)と呼ばれる細胞を含んでいた。その上部にTbr2陽性の細胞から成る脳
室下帯が形成されていた (図14 G)。
経細胞(視床と大脳皮質を連結する初期パイオニア神経細胞)と類似している (文献23-25)。胎児のサブプレートとその直下の中間帯にはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の蓄積が観察される (図20 F, 右下, 括弧) (文献26)。同様に、ヒトES細胞由来大脳皮質神経上皮の同じ領域にも強いCSPGの蓄積が観察された (図14 H″及び 図20 E)。これらの結果はヒトES細胞由来の大脳皮質神経上皮が、皮質板や辺縁帯だけでなくサブプレートや中間帯も、内腔から頂端に向かって胎児と同じ並びで自己組織化し得ることを示している。この時期には、大脳皮質で明らかなGAD65陽性の介在神経細胞やTAG1陽性の皮質
下行性の神経軸索の蓄積は観察されなかった (図20 G)。
程度;図14 I)、Tbr1陽性、Ctip2陽性の深部皮質板の神経細胞だけでなく、浅部皮質板
の神経細胞 (Satb2陽性、Brn2陽性)も多く含んでいた(図14 L-N 及び 図20 J)。サブプレ
ートの神経細胞(Calretinin陽性) はこの時期にも皮質板の直下に観察された(図14 O)。
胎児大脳皮質の妊娠中期の始めに見られる組織に類似している (文献25, 27)。さらに、
ヒトES細胞由来の皮質板の中で、表層神経細胞 (Satb2陽性、Brn2陽性)が深層神経細胞 (Tbr1陽性、Ctip2陽性)よりも優先的に表層側に位置していた (図15 A-H)。さらに、培養50日目にEdUおよび70日目にBrdUを用いて細胞を1日ラベルすると、培養91日目にはEdUとBrdUでラベルされた細胞が優先的にそれぞれ深層と表層側に位置していた(図15 I-L)。これらの結果は胎児の大脳皮質発生時のインサイド−アウトパターン(文献5, 6)、つまり遅生まれの大脳皮質神経細胞は外側に、早生まれの大脳皮質神経細胞は内側に位置するというパターンに類似して神経細胞が位置する傾向を持っていることを示している。この考えに一致するように、培養112日では、成熟した神経細胞のマーカーであるCaMKIIαがより優
先的に、ヒトES細胞由来の大脳皮質の内腔側の2/3の部分に観察され、その領域はSatb2ではなくTbr1を主に発現していた (図15 M-O 及び 図20 K)。実際、細胞レベルでも、CaMKIIα陽性の神経細胞の大部分はSatb2ではなくTbr1を共発現していた(図20 L 及び M; 図15
Pに要約)。
最後に、長期間培養したヒトES細胞由来大脳皮質における大脳皮質神経幹/前駆細胞の
動態を検討した。過去のin vivo研究によって、発生がより進んだ時期では内腔側の神経
幹細胞の非垂直の分裂が増加し、この非対称的な分裂によって頂端側の神経前駆細胞が生み出されることが明らかになっている (文献28, 29)。本培養において、培養70日での内
腔側神経幹細胞は垂直の分裂面(60-90度)を優位に示した (図16 A-C)。この分裂では内腔表面に対して平行に娘細胞の分裂が起こる。一方、培養91日では分裂中の神経幹細胞(リン酸化Vimentin陽性)は非垂直の分裂をより高頻度に示した (図16 D-F)。
右)。興味深いことに、これらの神経幹/前駆細胞は、早期の神経分化を誘導することに
より内腔側の神経幹/前駆細胞を強力に減少させるNotchシグナル阻害剤に対して異なる反応性を示した。Notchシグナル阻害剤はTbr2陽性かつSox2陰性のIntermediate progenitorsを増加させたが、Tbr2陰性かつSox2陽性の細胞はその処理後にはほとんど残っていなか
った (図21 D-F)。
積していることが報告されている (図21 G) (文献11, 12)。oRG(またはOSVZ幹細胞)と呼
ばれるこれらの神経幹/前駆細胞 (文献11, 12) は、ヒト大脳皮質に特徴的な表層神経細
胞の膨大な数の産生に寄与していると考えられている。このoRG細胞は頂端側表層に向け
た突起を有するが、内腔の神経幹細胞とは異なり内腔側への突起は持っていない。同様に培養91日目のヒトES細胞由来の大脳皮質神経上皮のTbr2陰性、Sox2陽性、Pax6陽性の神経幹/前駆細胞は頂端側の突起を持つが、内腔側への突起は持っていない (図16 J-K′ 及び
図21 H, H′, 及び I)。これらの細胞はSVZでもpericentrin陽性の基底小体を細胞体の
中に持っている (図21 J)。これは内腔近傍に基底小体を有する内腔側の神経幹細胞とは
異なる。生体内のoRGと同様に、ヒトES細胞由来のoRG様の細胞は水平に分裂する傾向を示
した(図16 L 及び M)。Tbr2陽性の細胞(リン酸化Vimentin陽性)は、生体内のIntermediate progenitorsと同様に頂端側への突起は持っていなかった(図21 K-K″)。
の結果は、従前の3次元培養の限界、つまりヒト妊娠初期に相当する成熟さの組織までし
か大脳皮質神経上皮を維持できなかったことと明らかに異なる。本発明の培養法は、さらにヒト妊娠中期の大脳皮質発生に特徴的な現象、つまり培養91日(13週)でのoRG様の神
経幹/前駆細胞の出現までも再現することが出来た。これらの結果は、本発明の方法にお
ける自己組織化した組織の発生スピードは、胎児の脳の発生とほぼ同等であることも示唆している。
期神経細胞 (pioneer neuron)で形成されると考えられている (文献24, 25)。しかしながらサブプレートは胎児脳では一時的にのみ出現する構造で、サブプレートに派生した一部が成体脳の白質の介在神経細胞に存在する (文献33)。サブプレートは生後には無くなっ
てしまうため、その研究は特にヒトにおいては容易ではなく、それ故に我々の系はこの理解が進んでいない神経細胞層の研究では重要であろう。さらに、我々の培養系は、滑脳症の原因を含めて、ヒト胎児大脳皮質のインサイド−アウトの層形成の研究にも応用できるであろう。
く大きな利点だと考えられる。これまでに、oRGと定義付けるための特異的なマーカーは
報告されていないし、oRGと内腔側の神経幹細胞 (どちらもSox2陽性、Pax6陽性、Tbr2陰
性)を区別するには、細胞形態と、その動きと場所に主に依存している。それ故に、位置
関係が失われてしまう分散培養を用いたoRGの研究は極めて限定的になってしまっている
。一方で、本発明の培養系は、発生中のヒトの大脳皮質の3次元の位置関係を有するので
、この点で大きな利点を持っている。ごく最近、ヒト多能性幹細胞由来の多層構造を有した大脳皮質組織の中で、oRGが誘導できたという同様の結果が報告された (文献34)。この研究は確率論的に脳領域の特異性が得られる非選択的な分化方法を用いている(我々は再
現性の高い大脳皮質特異的な分化法である)。
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Claims (20)
- 多能性幹細胞の凝集塊を、Wntシグナル阻害剤及びTGFβシグナル阻害剤の存在下で浮遊培養することにより、終脳マーカー陽性凝集塊を得ること、及び該終脳マーカー陽性凝集塊を、高酸素分圧条件下で更に浮遊培養することを含む、終脳若しくはその部分組織、或いはその前駆組織を含む細胞凝集塊の製造方法。
- 得られる細胞凝集塊が、大脳皮質、大脳基底核、海馬及び脈絡膜からなる群から選択されるいずれかの終脳部分組織、又はその前駆組織を含む、請求項1記載の製造方法。
- 高酸素分圧条件下での浮遊培養を、Wntシグナル増強剤の存在下で行う、請求項1又は
2記載の製造方法。 - 高酸素分圧条件下での浮遊培養を、Wntシグナル増強剤及び骨形成因子シグナル伝達経
路活性化物質の存在下で行う、請求項1又は2記載の製造方法。 - (I)多能性幹細胞の凝集塊を、Wntシグナル阻害剤及びTGFβシグナル阻害剤の存在下で浮遊培養することにより、終脳マーカー陽性凝集塊を得ること、
(II)(I)で得られた該終脳マーカー陽性凝集塊を、Wntシグナル増強剤及び骨形成
因子シグナル伝達経路活性化物質の存在下で更に浮遊培養すること、及び
(III)(II)で得られた細胞凝集塊をWntシグナル増強剤及び骨形成因子シグナル
伝達経路活性化物質の不在下で更に浮遊培養すること
を含む、終脳若しくはその部分組織、或いはその前駆組織を含む細胞凝集塊の製造方法。 - 製造される細胞凝集塊が、連続した神経上皮中に、大脳皮質組織又はその前駆組織、脈絡膜組織又はその前駆組織、及び海馬組織又はその前駆組織を含む、請求項5記載の製造方法。
- 製造される細胞凝集塊が、連続した神経上皮中に、歯状回組織又はその前駆組織、及びアンモン角組織又はその前駆組織を含む、海馬組織またはその前駆組織を含む、請求項5記載の製造方法。
- 海馬組織または前駆組織が、連続した神経上皮中に、皮質ヘムを更に含む、請求項7記載の製造方法。
- 製造される細胞凝集塊が、アンモン角組織又はその前駆組織を含む、請求項5記載の製造方法。
- (II)及び(III)における浮遊培養を高酸素分圧条件下で行う、請求項5記載の製造方法。
- 細胞凝集塊を、shhシグナル作動薬で処理することを含む、請求項1又は2記載の製造方法。
- 細胞凝集塊を、FGF8で処理することを含む、請求項1又は2記載の製造方法。
- 得られる細胞凝集塊が、表層から深部に向かって、辺縁帯、皮質板、サブプレート、中間帯、脳室下帯及び脳室帯を含む多層構造を有する、大脳皮質組織又はその前駆組織を含む、請求項2記載の製造方法。
- 得られる細胞凝集塊が、大脳基底核又はその前駆組織を含む、請求項11記載の製造方法。
- 得られる細胞凝集塊が、吻側化大脳皮質又はその前駆組織を含む、請求項12記載の製造方法。
- 多能性幹細胞が胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、請求項1〜15のいずれか1項記載の製造方法。
- 多能性幹細胞がヒト由来である、請求項1〜16のいずれか1項記載の製造方法。
- 浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、請求項1〜17のいずれか1項記載の製造方法。
- 請求項1〜18のいずれか1項記載の製造方法により得られる細胞凝集塊。
- 請求項1〜18のいずれか1項記載の製造方法により得られる、海馬又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を分散すること、及び分散した細胞を更に接着培養し、該細胞から成熟した海馬ニューロンを誘導することを含む、成熟した海馬ニューロンの製造方法。
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