KR102317610B1 - 종뇌 또는 그 선구 조직의 제조 방법 - Google Patents

종뇌 또는 그 선구 조직의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다능성 간세포의 응집체를, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 존재하에서 부유 배양함으로써, 종뇌 마커 양성 응집체를 얻는 것, 및 그 종뇌 마커 양성 응집체를, 고산소 분압 조건하에서 추가로 부유 배양하는 것을 포함하는, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 혹은 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법에 관련된다. 한 구현에서, 고산소 분압 조건하에서 부유 배양하는 것은 Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 존재하에서 실시한다.

Description

종뇌 또는 그 선구 조직의 제조 방법{METHOD FOR MANUFACTURING TELENCEPHALON OR PROGENITOR TISSUE THEREOF}
본 발명은, 인비트로에 있어서, 다능성 간세포 (pluripotent stem cell)로부터 종뇌 또는 그 선구 조직에 대한 분화를 유도하는 기술에 관한 것이다.
포유류의 대뇌피질은 다층 구조 (I-VI층)를 가지고, 이것은 태아의 대뇌피질 형성기부터 서서히 형성된다 (비특허문헌 1). 대뇌피질은 등측 종뇌 (또는 팔리움)의 신경 표피로부터 만들어져 이어서 외반되면서 양측으로 반구상의 뇌포를 형성한다 (도 17 A) (비특허문헌 2). 대뇌피질의 후미측 (dorsocaudal side)에는 피질의 가장자리가 인접해있고, 한편 그 문복측 (ventrorostral side)은 고피질 (paleocortex)을 개재하여 외측 기저핵 원기 (lateral ganglionic eminence, LGE: 줄무늬체 원기 (striatum anlage)) 및 격막이 인접하고 있다. 성체의 6층에서, 그 대부분이 피질의 가장자리나 격막등의 인접하는 조직에 유래하고 (비특허문헌 3), 주로 Reelin 양성 Cajal-Retzius 세포로부터 형성되는 최표층의 I층 (태아 원기는 변연대 (MZ)로 불림; 도 17 B)이 존재한다 (인간의 대뇌피질의 경우, Reelin 양성 세포의 일부는 대뇌피질 신경 표피로부터도 직접 만들어진다) (비특허문헌 4). 나머지의 피질판의 층은, 시간 및 공간적으로 규칙적으로 신경세포가 만들어지고 배치되는 특징적인 패턴을 가지고 있으며, 이는 "인사이드-아웃" 패턴으로 불린다: 보다 깊은 층일수록, 신경세포가 보다 빨리 신경 선구 세포로부터 생성된다 (도 17 B) (비특허문헌 5, 6).
많은 정보를 얻을 수 있는 마우스의 대뇌피질의 발생과는 상이하게, 인간의 대뇌피질의 발생은 인간 태아의 뇌조직의 이용이 한정되기 때문에 상세하게는 이해되어 있지 않다. 앞선 연구에서, 본 발명자들은, 마우스 및 인간의 ES 세포를 사용한 3 차원 배양법 (SFEBq법)을 수립해, 이 응집체가 대뇌피질의 발생의 초기 과정을 재현하는 것을 나타냈다 (비특허문헌 7-9). 이 방법은 인간 iPS 세포에도 또한 성공적으로 응용가능한 것이 보고되고 있다 (비특허문헌 10). 이 자체 조직화된 hESC 유래의 부유 세포덩어리 안에는, 대뇌피질 신경 표피가 자발적으로 형성되어 배양 40-45일 후에는 뇌실대나 피질판 및 변연대도 자발적으로 형성된다. 이 대뇌피질 신경 표피는, 인간 임신 초기의 대뇌피질 형성을 모방했으나, 많은 점에서 미성숙이다 (도 17 C) (비특허문헌 7).
최근, 인간 다능성 간세포 유래의 다층 구조를 가진 대뇌피질 조직내에서, 외측 방사상 신경교 세포 (oRG)를 유도할 수 있었다는 결과가 보고되었다 (비특허문헌 11). 이 연구는 확률론적으로 뇌영역의 특정화를 수득할 수 있는 비선택적인 분화 방법을 사용한다. 이 분화 방법은, 응집체를 스피너 플라스크를 사용하여 선회 배양하는 것을 특징으로 한다.
선행 기술 문헌
비특허문헌
비특허문헌 1 : Molyneaux BJ, Arlotta P, Menezes JR, Macklis JD. (2007) Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 8:427-437.
비특허문헌 2 : Hebert JM, Fishell G. (2008) The genetics of early telencephalon patterning: some assembly required. Nat Rev Neurosci 9:678-685.
비특허문헌 3 : Bielle F, 등 (2005) Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nat Neurosci. 8:1002-1012.
비특허문헌 4 : Bystron I, Blakemore C, Rakic P. (2008) Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9:110-122.
비특허문헌 5 : Rakic P. (1974) Neurons in rhesus monkey visual cortex: systematic relation between time of origin and eventual disposition. Science. 183:425-427.
비특허문헌 6 : Shen Q. 등 (2006) The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci 9:743-751.
비특허문헌 7 : Eiraku M. 등 (2008) Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell 3: 519-532.
비특허문헌 8 : Watanabe K. 등 (2005) Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci 8:288-296.
비특허문헌 9 : Nasu M, 등 (2012) Robust formation and maintenance of continuous stratified cortical neuroepithelium by laminin-containing matrix in mouse ES cell culture. PLoS One 7:e53024.
비특허문헌 10 : Mariani J. 등 (2012) Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA.109:12770-12775.
비특허문헌 11 : Lancaster M. 등 (2013) Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Proc Natl Acad Sci USA. 109:12770-12775.
본 발명은, 포유 동물의 다능성 간세포로부터, 보다 성숙한 종뇌 또는 그 선구 조직을 인비트로로 유도하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 인간 입체 대뇌피질의 자체 조직화 유도 방법의 배양 조건을 최적화함으로써, 보다 선택적인, 장기간에 걸친 대뇌피질 조직의 입체 유도에 성공했다. 이 방법에 의해, 자체 조직화된 대뇌피질 안에서, 생체의 배 안에서 볼 수 있는 등배 (dorsal-ventral) 극성 및 전후 극성의 자발적 형성을 성공했다. 또, 외인성의 시그널 인자에 의해, 등배축 혹은 전후축에 따른 특정의 신경 영역을 선택적으로 분화 유도하는 것, 생체내와 동일한 위치 관계로 대뇌피질 조직을 인접하는 조직과 연속적으로 입체 형성시키는 것, 및 대뇌 피질의 주변 조직을 선택적으로 자체 조직화하는 것을 성공적으로 실시했다.
나아가, 대뇌피질 조직의 배양을 계속하는 것으로, 인간 임신 중기의 대뇌피질에서 보여지는 다층 구조(뇌실대, 뇌실하대, 외측 뇌실하대, 중간대, 서브플레이트, 심부 피질판, 천부 피질대, 변연대)를, 표층부에서 심층부로 축으로 따라 입체 형성하는 것에 성공했다.
나아가, 배양 조건을 변경함으로써, 대뇌피질 이외에, 대뇌 기저핵 (basal ganglion), 해마, 맥락막등의 조직의 입체 유도를 성공적으로 실시했다.
본 발명자들은, 상기 지견에 근거해 더욱 검토를 더해 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다:
[1] 다능성 간세포의 응집체를, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 존재하에서 부유 배양 (suspension culture)함으로써 종뇌 마커 양성 응집체를 얻는 것, 및 그 종뇌 마커 양성 응집체를, 고산소 분압 조건하에서 추가로 부유 배양하는 것을 포함하는, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 혹은 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법.
[2] 얻어진 세포 응집체가, 대뇌피질, 대뇌 기저핵, 해마 및 맥락막으로 이루어지는 군에서 선택되는 종뇌 부분 조직, 또는 그 선구 조직을 포함하는, [1]에 기재된 제조 방법.
[3] 고산소 분압 조건하에서의 부유 배양을, Wnt 시그널 증강제의 존재하에서 실시하는, [1] 또는 [2]에 기재된 제조 방법.
[4] 고산소 분압 조건하에서의 부유 배양을, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 존재하에서 실시하는, [1] 또는 [2]에 기재된 제조 방법.
[5] (I) 다능성 간세포의 응집체를, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 존재하에서 부유 배양함으로써, 종뇌 마커 양성 응집체를 얻는 것,
(II) (I)에서 얻어진 그 종뇌 마커 양성 응집체를, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 존재하에서 추가로 부유 배양하는 것, 및
(III) (II)에서 얻어진 세포 응집체를 Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 부재하에서 추가로 부유 배양하는 것
을 포함하는, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 혹은 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법.
[6] 제조된 세포 응집체가, 연속한 신경 표피 중에, 대뇌피질 조직 또는 그 선구 조직, 맥락막 조직 또는 그 선구 조직, 및 해마 조직 또는 그 선구 조직을 포함하는, [5]에 기재된 제조 방법.
[7] 제조된 세포 응집체가, 연속한 신경 표피 중에, 치상회 조직 또는 그 선구 조직, 및 Ammon 뿔 조직 또는 그 선구 조직을 포함하는, 해마 조직 또는 그 선구 조직을 포함하는, [5]에 기재된 제조 방법.
[8] 해마 조직 또는 선구 조직이, 연속한 신경 표피 중에, 피질의 가장자리를 더욱 포함하는, [7]에 기재된 제조 방법.
[9] 제조된 세포 응집체가, Ammon 뿔 조직 또는 그 선구 조직을 포함하는, [5]에 기재된 제조 방법.
[10] (II) 및 (III)에 있어서의 부유 배양을 고산소 분압 조건하에서 실시하는, [5]에 기재된 제조 방법.
[11] 세포 응집체를, shh 시그널 작동약 (agonist)으로 처리하는 것을 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 제조 방법.
[12] 세포 응집체를, FGF8로 처리하는 것을 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 제조 방법.
[13] 얻어진 세포 응집체가, 표층부에서 심부로 향해, 변연대, 피질판, 서브플레이트, 중간대, 뇌실하대 및 뇌실대를 포함하는 다층 구조를 갖는, 대뇌피질 조직 또는 그 선구 조직을 포함하는, [2]에 기재된 제조 방법.
[14] 얻어진 세포 응집체가, 대뇌 기저핵 또는 그 선구 조직을 포함하는, [11]에 기재된 제조 방법.
[15] 얻어진 세포 응집체가, 문측 (rostral) 대뇌피질 또는 그 선구 조직을 포함하는, [12]에 기재된 제조 방법.
[16] 다능성 간세포가 배성 간세포 또는 유도 다능성 간세포인, [1]-[15] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[17] 다능성 간세포가 인간 유래인, [1]-[16] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[18] 부유 배양을 피더 세포의 비존재하에서 실시하는, [1]-[17] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[19] [1]-[18] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 얻어진 세포 응집체.
[20] [1]-[18] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 얻어진 해마 또는 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체를 분산하는 것, 및 분산한 세포를 추가로 접착 배양해, 그 세포로부터 성숙한 해마 뉴런을 유도하는 것을 포함하는, 성숙한 해마 뉴런의 제조 방법.
본 발명에 의하면, 다능성 간세포로부터, 선택적으로 장기간 동안 종뇌 혹은 그 부분 조직 (대뇌피질, 대뇌 기저핵, 해마, 맥락막등), 혹은 그 선구 조직을 유도할 수 있다.
본 발명에 의하면, 다능성 간세포로부터, 선택적으로, 등배축 및 전후축의 극성을 갖는 대뇌피질 조직 또는 그 선구 조직을 유도할 수 있다.
본 발명에 의하면, 다능성 간세포로부터, 선택적으로 임신 중기의 다층 구조를 갖는 대뇌피질 조직 또는 그 선구 조직을 유도할 수 있다.
본 발명에 의하면, 다능성 간세포로부터, 연속한 신경 표피 중에, 대뇌피질 조직 또는 그 선구 조직, 맥락막 조직 또는 그 선구 조직, 및 해마 조직 또는 그 선구 조직을 인접하는 조직으로서 자체 조직화하는 것이 가능하다.
본 발명에 의하면, 다능성 간세포로부터, 연속한 신경 표피 중에, 치상회 조직 또는 그 선구 조직, 및 Ammon 뿔 조직 또는 그 선구 조직을 포함하는, 해마 조직 또는 그 선구 조직을 유도하는 것이 가능하다.
본 발명에 의하면, 인간 태아의 대뇌피질에 풍부하게 존재하나 마우스의 대뇌피질에서는 존재하지 않는, 외측 방사상 신경교 세포 (oRG)의 특징을 갖는 신경 선구 세포를, 인간 다능성 간세포로부터 뇌실하대 외측에 특이적으로 유도할 수 있다.
[도 1] 인간 다능성 간세포로부터 대뇌피질 선구 조직의 분화 유도. (A) Day 26의 세포 응집체에 있어서의 Foxg1::venus 발현. (B) Day 34의 응집체 중의 세포에 있어서의 Foxg1::venus 발현. (C) 세포 응집체 내부에 형성된, 뇌실-유사 (cerebral ventricle-like) 공동을 갖는, 반구상의 신경 표피-유사 구조. (D) 신경 표피 구조의 관강측 내 Pax6 발현. (E) 신경 표피 구조 관강측 내 Sox2 발현. (F) 신경 표피 구조의 가장 관강측의 인산화 히스톤 H3 (pH3) 발현. (G) 뇌실대와 유사한 세포층의 외측에 있어서의, Tuj1 발현. (H) 뇌실대와 유사한 세포층의 외측에 있어서의, Ctip2 발현. (I) 뇌실대와 유사한 세포층의 외측에 있어서의 Reelin 양성 Cajal-Retzius 세포의 출현. (J) 응집체의 표층 근처에 있어서의 Laminin 발현.
[도 2] 인간 다능성 간세포로부터 기저핵 선구 조직으로의 분화 유도. (A) 종뇌 신경 표피에 형성된 Gsh2를 발현하는 LGE. (B) LGE 신경 표피 아래에 존재하는 GAD65 양성의 GABA 작동성 신경세포. (C) 종뇌 신경 표피에 형성된 Nkx2.1을 발현하는 MGE. (D) MGE를 형성한 세포 응집체에 있어서의 Pax6 발현.
[도 3] 대뇌피질과 대뇌 기저핵의 연속적인 입체 형성. (A) 종뇌 신경 표피에 형성된 Gsh2를 발현하는 LGE. (B) 종뇌 신경 표피에 형성된 LGE에 있어서의 GAD65 발현. (C) LGE 신경 표피와 연속하여 형성된 Pax 양성 대뇌피질 신경 표피.
[도 4] 인간 다능성 간세포로부터 맥락막 조직의 분화 유도. (A) 다능성 간세포로부터 유도된 맥락막 조직에 있어서의 TTR 및 Lmx1a 발현. (B) 다능성 간세포로부터 유도된 맥락막 조직에 있어서의 Otx2 발현. Foxg1::venus의 발현은 관측되지 않는다.
[도 5] 인간 다능성 간세포로부터의 피질의 가장자리로의 분화 유도. (A) 다능성 간세포로부터 유도된 피질의 가장자리에 있어서의 Lmx1a 발현. TTR의 발현은 관측되지 않는다. (B) 다능성 간세포로부터 유도된 피질의 가장자리에 있어서의 Otx2 발현. Foxg1::venus 약양성인 신경 표피로 대부분 이루어진 응집체가 형성된다.
[도 6] 맥락막, 해마 선구 조직 및 대뇌피질 선구 조직의 연속 형성. (A) Foxg1::venus 양성의 신경 표피와 Foxg1::venus 음성의 신경 표피의 양자를 포함하는 세포 응집체. (B) 맥락막, 해마 선구 조직 및 대뇌피질 선구 조직을 포함하는 세포 응집체에 있어서의 Bf1(Foxg1)::venus 발현. (C) 맥락막, 해마 선구 조직 및 대뇌피질 선구 조직을 포함하는 세포 응집체에 있어서의 Lmx1a 및 Lef1의 발현.
[도 7] 인간 다능성 간세포로부터 해마 선구 조직의 분화 유도. (A-D) Day 61의 세포 응집체에 있어서의 Bf1(Foxg1)::venus (A), Lmx1a (B), Prox1 Zbtb20 (C) 및 Nrp2 (D)의 발현을 나타낸다. (E-H) Day 75의 세포 응집체에 있어서의 Foxg1::venus, Lmx1a 및 Lef1 (E), Zbtb20 (F), Prox1 (G) 및 Prox1 및 Zbtb20 (H)의 발현을 나타낸다.
[도 8] 인간 ES 세포로부터 유도된 3 차원의 해마 조직의 평면 분산 배양. (A) 신경의 수상돌기와 MAP2 양성의 세포에 있어서의, 해마 마커인 Zbtb20의 발현. (B) Zbtb20 양성 세포에 있어서의 Bf1(Foxg1)::venus 발현. (C) 신경교 세포-유사의 형태를 한 Zbtb20 양성 세포에서의, 아스트로사이트 마커 GFAP의 발현. (D) 해마 영역 가운데, 치상회의 과립 세포 마커인 Prox1와 CA3의 피라미드 세포 마커인 KA1의 분산 배양에서의 발현 패턴. Prox1는 세포체의 직경 5-10μm 정도의 소형의 세포로, KA1는 세포체의 직경이 10-20μm의 대형의 피라미드 세포-유사의 형태를 한 세포로 발현이 관측된다. (E) 도 D의 세포에서의 Bf1(Foxg1)::venus의 발현을 나타낸다. Bar: 200μm (A, B), 100μm (C), 10μm (D, E).
[도 9] 해마 선구 조직을 분산 배양으로 장기 배양 이후 칼슘 이미징 및 전기 생리적 해석. (A-A') 칼슘 이미징 시의 시그널 발현상과 그 명시야상. (B) 각 세포에서의 칼슘 시그널의 각종 시간 경과 응답 패턴을 나타낸다. (C-C') 전기 생리 시험 시의 명시야상. (D) 나트륨-칼륨 전류 응답. (E) 유발성 활동 전위. (F) sEPSC와 DNQX에 의한 그 저해. Bar: 50μm (C, C').
[도 10] 인간 다능성 간세포로부터의, 임신 중기형의 다층 구조를 가지는 대뇌피질 선구 조직의 분화 유도. (A 및 A') Day 70의 인간 다능성 간세포 유래 대뇌피질 신경 표피의 절편. A'는 Ctip2 및 Pax6의 면역 염색을 나타낸다. 저확대 관찰에 있어서도, 뇌실대 (Pax6+), 뇌실하대, 중간대, 및 피질판 (Ctip2+)의 명확한 분리를 볼 수 있었다. (B-H") Day 70의 대뇌피질의 영역 특이적 마커에 의한 면역 염색. (I) Days 70 및 91에 있어서의 대뇌피질 신경 표피 (Cortical NE)의 전체 두께 및 뇌실대 (VZ) 및 피질판 (CP)의 두께. (J-P) Day 91 대뇌피질 신경 표피의 영역 특이적 마커에 의한 면역 염색. (Q) hESC 유래 대뇌피질 신경 표피의 장기 배양에 있어서 볼 수 있는 층 구조의 모식도.
[도 11] 대뇌피질의 자발적인 축형성과 외인성 인자에 의한 제어. (A-F) Day 42의 세포 응집체에 있어서의 Coup-TF1 (A), Lhx2 (B), Coup-TF1 및 Lhx2 (C), Coup-TF1 및 Zic1 (D), Coup-TF1 및 Otx2 (E), CoupTF1 및 인산화 Erk (F)의 발현. (G) FGF8b 처리에 의한 CoupTF1 발현의 희박화. (H) FGF8b 처리에 의한, Sp8 발현의 뇌실대 전체에 걸친 상승. (I) FGF8b 처리에 의한, Coup-TF1 및 Sp8 발현 패턴의 변화.
[도 12] hESC로부터 자체 조직화된 대뇌피질 신경 표피의 축 극성. (A) foxg1::Venus로 가시화한 대뇌피질 신경 표피를 포함하는 hESC 응집체 (Day 26). (B) foxg1::Venus 양성 세포의 대표적인 FACS 해석. (C-J) foxg1::venus hESC로부터 자기 형성된 반구상 대뇌피질 구조의 면역 염색. VZ, 뇌실대. (K-N) hESC 유래 대뇌피질 신경 표피에 있어서 관찰되는 축 극성의 자기 형성. 피질의 가장자리-유사 조직 (Otx2+; M)은, 대뇌피질 신경 표피의 후미측 마커 Coup-TF1 (K) 및 Lhx2의 발현이 강한 측에 인접하는 영역에 존재했다. Coup-TF1 발현과 반대측에서 보다 높은 레벨의 pErk 시그널이 관찰되었다 (N). 발현의 구배 및 극성을 삼각형으로 나타낸다. 화살표 머리, 뇌실대 (VZ) (마커 발현의 구배가 뇌실대 내에서 보여지는 것에 주목한다). (O 및 P) Fgf8 처리는, CoupTF1를 억제해, 문복측 (ventrorostral) 마커 Sp8의 발현을 확대시켰다(스케일 바, A에 있어서는 1 mm； C-P에 있어서는 200μm.) 핵대비 염색(파랑), DAPI.
[도 13] 자체 조직화된 신경 표피에 있어서의 비대칭적인 만곡 형태 형성 (rounding morphogenesis). (A-I) hESC 유래 피질 신경 표피의 비대칭적인 만곡 형태 형성 진행. A에 있어서, 화살표는, 피질 신경 표피 영역의 경계를 나타낸다. B-D에 있어서, 화살표는, 회전(rolling) 표피를 나타낸다. E에 있어서, 화살표 머리는 회전하는 표피를 나타낸다. F-I에 있어서, 화살표는, 신경 표피의 만곡 운동을 나타낸다. (J-L) 피질 신경 표피의 회전에 대한 ROCK 저해제 Y-27632의 효과. (L) ROCK 저해제에 의한, 회전 형태 형성의 감소. ***：Fisher 추출 검정에 있어서의 분할표 해석 (2 x 2)에 있어서 P < 0.001. 처치군, n = 187 신경 표피 영역；대조군；n = 130. (M 및 N) 회전 형태는, Otx2 및 Coup-TF1 (후미측 마커)의 강한 발현을 갖는 측에서 선택적으로 관찰되었다. (O-Q) Day 35의 신경 표피 구조에 있어서의, 대뇌피질 (Pax6+) 및 LGE (Gsh2+ ; GAD65+ GABA 작동성 신경세포를 아래에 수반한다)의 인접한 형성. LGE 영역에 접하는 대뇌피질측은, 강한 회전을 수반하는 측(화살표)과는 반대에 위치했다. (R) Day 24의 hESC 유래 대뇌피질 신경 표피에 있어서의 분열중의 핵의 상하 운동(2-광자 이미징). pax6::venus 리포터 hESC와 비표지 hESC를 일부 혼합해 가시화했다. 정단측 및 기저측의 양방의 돌기를 갖는 2개의 낭세포가 정단측의 분열 선구 세포로부터 발생했다. (스케일 바, A에 있어서는 200 μm, B-H 및 J-N에 있어서는 100μm, O-Q에 있어서는 200 μm.) 핵대비 염색(파랑), DAPI.
[도 14] hESC 유래 대뇌피질 신경 표피에 있어서의 다층 구조의 자기 형성. (A 및 A') Day70의 hESC 유래 대뇌피질 신경 표피의 절편. 저확대 관찰에 있어서도, 뇌실 대 (Pax6+), 뇌실하대, 중간대, 및 피질판 (Ctip2+)의 명확한 분리를 볼 수 있었다. (B-H") Day 70의 대뇌피질 신경 표피의 층 특이적 마커에 의한 면역 염색. (I) Days 70 및 91에 있어서의 대뇌피질 신경 표피의 두께 (Cortical NE) 및 뇌실대 (VZ) 및 피질판 (CP)의 두께. **P < 0.01; ***P < 0.001, Day 70 대뇌피질 신경 표피와 Day 91 대뇌피질 신경 표피(각각, n = 6) 샘플간의 Student t 검정. (J-O) Day 91 대뇌피질 신경 표피의 영역 특이적 마커에 의한 면역 염색. (P) hESC 유래 대뇌피질 신경 표피의 장기 배양에 있어서 볼 수 있는 층 구조의 모식도. (스케일 바, A에 있어서 400 μm；B-H"에 있어서 50 μm；J-O에 있어서 100 μm.) 그래프중의 바, SEM. 핵대비 염색(파랑), DAPI.
[도 15] 피질판에 있어서의 Satb2+및 Brn2+ 대뇌피질 신경세포의 기저측에 치우친 존재. (A-H) Satb2 및 Brn2 (표층 마커) 양성의 대뇌피질 신경세포는, Day 91 배양에 있어서, hESC 유래 대뇌피질판의 기저(표층) 부에 우선적으로 존재했다. 기저측에 존재한 Satb2+ 세포의 대부분은, 심부영역 마커 Tbr1 에 음성이었다. (H) 피질판내에 있어서의 마커 양성 신경세포의 분포. 상대적인 자리 매김을 위해, 피질판의 정단측 및 기저측의 경계를, 각각, 0 및 100으로 정의했다. ***P <0.001. Mann-Whitney 검정. 붉은선, 중앙치. 정량한 신경세포수：Tbr1+ (n =105), Satb2+ (n = 58), Ctip2+ (n = 87), 및 Brn2+ (n = 86). (I-L) EdU (Day 50；빨강；n = 36) 및 BrdU (Day 70; 흰색; n = 53)를 사용한 이중 펄스 표지 시험. Day 91에 면역 염색에 의해 해석했다. H 와 마찬가지로 통계학적 해석을 실시했다. (M-O) Day 112에 있어서, 성숙 대뇌피질 신경세포 마커 CaMKIIα는, 피질판의 깊은 부분에 존재하는 Tbr1+ 신경세포에 있어서 우선적으로 발현하고 있었다. 성숙한 신경세포의 생존을 유지하기 위해, 대뇌피질 신경세포를 78일째부터 112일째의 사이, 트랜스 웰 필터상에서 배양했다. (O) H 와 마찬가지로 플롯을 실시했다. ***P < 0.001, 사후 다중 비교 검사와 함께 Kruskal-Wallis 검정. 계수한 신경세포의 수：Tbr1+ (n = 293), Satb2+ (n = 177), 및 CaMKIIα+ (n = 132). (P) Day1 1 및 112의 hESC 유래 대뇌피질 신경 표피에 있어서의 신경세포 분포의 모식도. (스케일 바, A-C, E-G 및 I-K에 있어서 100 μm；D에 있어서 50 μm；M 및 N에 있어서 200 μm.) 핵대비 염색(파랑), DAPI.
[도 16] oRG-유사 선구세포의 출현. (A-F) Day 70 (C) 및 Day 91 (D-F)의 hESC 유래 대뇌피질 신경 표피에 있어서의, 수직 방향(60-90°의 분할 각도) 및 비수직 방향 (0-30° 및 30-60°)의 분할 (A 및 B)을 갖는 정단측 신경간 세포/선구/선구 세포의 백분율. p-Vimentin, M-기 마커. 화살표 머리, 페리센트린. 해석된 세포：n = 42 (Day 70) 및 n = 33 (Day 91). (G-I) Day 91 배양의 SVZ에 있어서의, 기저측 신경간 세포/선구 세포 (Pax6+, Sox2+) 및 중간 신경간 세포/선구 세포 (Tbr2+). (H) 피질판에 있어서의 모든 신경간 세포/선구 세포 (Sox2+ 및/또는 Tbr2+) 중의 Sox2+/Tbr2-및 Sox2-/Tbr2+ 신경간 세포/선구 세포의 백분율. Day 70으로부터 Day 91에 걸쳐, Sox2+/Tbr2-신경간 세포/선구 세포의 백분율이 증가했지만, Sox2-/Tbr2+ 신경간 세포/선구 세포는, 그에 비례해 감소했다. ***P < 0.001, Day 70 시료와 Day 91 시료 간의 Student t 검정. 각 일자에 있어서의 4개의 대뇌피질 신경 표피 영역으로부터의 뇌실대 외부의 신경간 세포/선구 세포를 계수하었다. (I) Day 91에 있어서, Sox2+/Tbr2-신경간 세포/선구 세포는, Sox2-/Tbr2+ 신경간 세포/선구 세포 (오른쪽)보다, 뇌실 표면으로부터 보다 멀리 존재하는 경향을 나타냈다. ***P < 0.001, Mann-Whitney 검정. 붉은 선, 중앙치. (J-M) Pax6+ p-Vimentin+ 신경간 세포/선구 세포는, 연막으로 성장하는 긴 기저막측의 돌기를 갖는 반면, 정단측의 돌기는 가지지 않고 (J 및 J'), 이들의 신경간 세포/선구 세포는 Tbr2 에 음성이었다 (K 및 K'). 기저막측의 돌기를 갖는 이들의 신경간 세포/선구 세포의 대부분 (>70%)은, 수평 방향의 분할 각도 (60-90°; L 및 M)를 나타냈다 (n = 37). (스케일 바, D에 있어서는 100 μm；E에 있어서는 25 μm；G, J, 및 K에 있어서는 50 μm；L에 있어서는 10 μm.) 그래프중의 바, SEM. 핵대비 염색(파랑), DAPI.
[도 17] 태아 대뇌피질 신경 표피의 발생. (A) 발생중의 태아종뇌의 모식도. (B) 인간 임신 제 2기 초기 (약 13배주령)의 태아 대뇌피질 신경 표피의 다층화한 구조의 모식도. (C) 이전의 hESC의 자체 조직화 배양에 있어서 유도된 층상 대뇌피질 신경 표피 구조의 모식도. 그 구조는, 임신 초기 동안의 인간 대뇌피질 조직과 닮았다.
[도 18] hESC 유래 대뇌피질 신경 표피에 있어서의 축 극성. (A) 개선된 배양 방법의 모식도. (A') Day 7에 있어서의 hESC의 응집체 형성의 비교. (위) 본 발명자들의 이전의 배양；(하) 개선된 배양, 이는 분리된 hESC로부터, 분할하고 있지 않는 매끄러운 응집체의 형성을 촉진했다. (B) foxg1::Venus 시그널을 갖는 신경 표피를 포함하는 hESC 응집체 (Day 26)의 백분율. ***P < 0.001, Student t 검정. (C) foxg1::Venus+ 집단에 대한 대표적인 FACS 해석. 회색, 컨트롤 (배양 1일째)；빨강, 이전의 조건하에서의 배양 34일째. (D) Day 42 대뇌피질 신경 표피의 피질판에 있어서의 Tbr1의 면역 염색 시그널. (E 및 F) 마우스 태아종뇌 (Foxg1+; E)에 있어서의 영역 마커의 지역화. 대뇌피질 신경 표피에 있어서의 Coup-TF1 발현은, 후미측 영역에 있어서 강하지만, 문복측 영역에 있어서 약했다 (F). (G) CoupTF1와 Lhx2의 이중 면역 염색의 결과, 이들의 발현 패턴은 동일한 경향이 있는 것이 나타났다. (H-J) E12.5의 마우스 종뇌의 방시장 절편. Gsh2, LGE (외측 기저핵 원기) 마커 (H)；Lmx1a, 피질의 가장자리 및 맥락막 마커 (H)；Otx2 및 Zic1, 피질의 가장자리 마커 (I 및 J). (K) Coup-TF1와 Zic1의 이중 면역 염색의 결과, 피질의 가장자리 마커 Zic1는, 대뇌피질 신경 표피에 인접한 조직의 Coup-TF1 발현이 강한 측에 발현하는 것이 나타났다. (L) Fgf8 처리 (Days 24-42)의 CoupTF1 및 Sp8 발현에 대한 효과. 대뇌피질 신경 표피의 횡단면 (최장축부분의 것)에 있어서, 분극화한 발현 (흑), 브로드한 발현 (회색) 및 검출할 수 없는 시그널 (흰색)의 백분율을 카운트했다. 이와 같은 방법으로 카운트를 실시했기 때문에, 분극화한 발현 패턴의 백분율은, 조금 과소평가일 수도 있다. (스케일 바, A' 및 B에 있어서 1 mm)；D, G, 및 I-K에 있어서 200 μm；E, F, 및 H에 있어서 500 μm) 그래프중의 바, SEM.
[도 19] 대뇌피질 신경 표피에 있어서의, 만곡 형태 형성 및 정단측 분할. (A) hESC 응집체에 있어서의 대뇌피질 신경 표피 영역의 자발적인 만곡 형태 형성：(상) Day 24；(하) Day 27. aPKC, 정단측 마커. (B) hESC에 유래하는, Foxg1+ 종뇌 신경 표피에 있어서의 Pax6+ (대뇌피질) 및 Gsh2+ (외측 기저핵 원기) 신경 표피의 백분율. 저농도의 SAG (30 nM; Days 15-21; 회색 칼럼)는, Pax6+ 신경 표피의 비율을 부분적으로 억제해 Gsh2+ 신경 표피의 비율을 상승시켰다. 이 조건하에, Pax6+ NE 및 Gsh2+ NE의 비교적 큰 영역이 자주 서로 인접하여 발견되었다. 500 nM에서는, SAG 처리는 효율적으로 Pax6 및 Gsh2 모두의 발현을 억제했다. **P < 0.01 및 ***P < 0.001, Dunnett의 검정. (C) 500 nM SAG로 처리한 신경 표피에 있어서의 내측 기저핵 원기 마커 Nkx2.1의 발현. Nkx2.1+ 신경 표피는, Foxg1+ 종뇌 NE의 40-50%를 차지했다. (D) 태아 대뇌피질과 비교한, hESC 배양에 있어서의 대뇌피질 형태 형성의 모식도. (E) Days 28-29에 있어서의 관강측 (정단측) 표면 가까이의 정단측 선구 세포의 대칭 분열, 이들의 세포는, 수직적인 분열 각도(정의에 관해서는 도 14를 참조)의 세포 분열 이전에 관강측 표면으로 가까워져, 함께 기저측으로 이동했다. pax6::venus hESC에 의해 가시화(부분적으로 WT hESC와 혼합). (스케일 바, A 및 C에 있어서 200 μm.) 그래프중의 바：SEM.
[도 20] hESC 유래 대뇌피질 신경 표피에 있어서의 서브플레이트 형성. (A-E) Day 70 hESC 유래 대뇌피질 신경 표피의 면역 염색. (A 및 B) 아세틸화 튜불린(AcTubulin；안정화 미소관), DAPI(핵염색), 및 네스틴(신경선구세포의 중간형 필라멘트)에 의한 단순 염색에 의해서도, 대뇌피질 신경 표피에 있어서 명확한 형태학적인 층의 분리가 관찰되었다. (C-E) 대뇌피질 신경 표피의 중간대 (E)에 있어서의 calretinin+ 신경세포 (C), MAP2+ 초기 신경돌기(D), 및 CSPG 축적의, 고확대 관찰. (F) E14.5 마우스 태아 대뇌피질의 영역 마커의 면역 염색. (G) Day 70 hESC 유래 대뇌피질 신경 표피의 면역 염색. 피질판에 있어서의 GAD65+ 인터뉴런의 축적 또는 TAG1+ 대뇌피질 하행성의 축색은, 거의 관찰되지 않았다. (H-J) Day 91 hESC 유래 대뇌피질 신경 표피의 면역 염색. 대뇌피질 신경 표피는 잘 발달해, 다층화한 구조는 보다 두꺼워졌다 (비타민 A-프리의 2% B27 서플리먼트 I). 피질판에는, 다수의 Brn2+ 표층성 신경세포가 포함되어 있었다 (J). (K) Day 112 hESC 유래 대뇌피질 신경 표피의 Tbr1의 면역 염색 시그널. (L 및 M) Day 112 hESC 유래 대뇌피질 신경 표피의 피질판에 있어서의 성숙화한 대뇌피질 신경세포 마커 CaMKIIα의 발현. 이들 CaMKII 신경세포의 대부분이 Tbr1 (L)를 공발현했지만, Satb2 (M)는 공발현하지 않았다. (스케일 바, A, B, G, L, 및 M에 있어서 50 μm；C-E에 있어서 20 μm；F 및 H-J에 있어서 100 μm；K에 있어서 200 μm.)
[도 21] oSVZ에 있어서의 oRG-유사 신경간 세포/선구 세포. (A-C) Day 91의 hESC 유래 대뇌피질 신경 표피 중의 정단측 및 기저측 (SVZ) 신경간 세포/선구 세포에 있어서의 Pax6 및 Sox2의 면역 염색. Sox2 양성 세포의 대부분은 Pax6를 발현했다 (C). (D-F) Notch 시그널 저해에 의한, 대뇌피질 신경 표피에 있어서의 신경간 세포/선구 세포 및 신경세포 마커의 발현에 대한 효과. Notch 저해제 처리(10 μm DAPT, Days 70-77)에 의해, Sox2- Tbr2+ 중간 신경간 세포/선구 세포가 증가했지만, Sox2+ Tbr2-세포는 처리후에 거의 남아있지 않았다 (D 및 E). Satb2+ 신경세포도, DAPT 처리에 의해 증가했다(D 및 E). 처리 후에 있어서, 대뇌피질 신경 표피의 두께의 증가도 관찰되었다 (F). ***P < 0.001, DAPT 처리(n = 6)와 DAPT 비처리(n = 5) 간의 Student t 검정. (G) 인간 태아 외부 SVZ에 있어서의 oRG 신경간 세포/선구 세포의 모식도. (H 및 H') SVZ에 있어서의 인산화 vimentin+ 신경간 세포/선구 세포는 Sox2를 발현했다. (I) SVZ에 있어서의 연막표면으로 신장된 긴 정단측 돌기를 갖는 인산화 vimentin+ 신경간 세포/선구 세포. (J) 기저측에 대한 돌기를 갖는 인산화 vimentin+ 신경간 세포/선구 세포는, pericentin+ 중심체 (centrosome)를 신경세포 체내에 가지고 있었다. 마이토시스 동안, 2개의 pericentin+ 중심체가, 분열 세포에 있어 발견되었다. (K-K") oRG-유사 신경간 세포/선구 세포와는 상이하게, hESC 유래 대뇌피질 신경 표피 중의 Tbr2+, 인산화 vimentin+ 신경간 세포/선구 세포는, 기저막 측에 돌기를 가지지 않았다 (정단측의 돌기도 없음). (스케일 바, A-E에 있어서 100 μm; H-K에 있어서 25 μm.)
본 발명은, 다능성 간세포의 응집체를, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 존재하에서 부유 배양함으로써, 종뇌 마커 양성 응집체를 얻는 것, 및 그 종뇌 마커 양성 응집체를, 추가로 부유 배양하는 것을 포함하는, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 혹은 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법을 제공하는 것이다. 추가적인 부유 배양은, 바람직하게는, 고산소 분압 조건하에서 행해진다.
이하, 본 발명의 상세를 설명한다.
(1) 다능성 간세포
「다능성 간세포」란, 생체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 능력(분화 다능성 (pluripotency))과 세포 분열을 거쳐 자기와 동일한 분화능을 갖는 낭세포를 낳는 능력(자기 복제능)을 겸비하는 세포를 말한다.
분화 다능성은, 평가 대상의 세포를, 누드 마우스에 이식해, 3 배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽)의 각각의 세포를 포함하는 테라토마 형성의 유무를 시험함으로써, 평가할 수 있다.
다능성 간세포로서는, 배성 간세포 (ES 세포), 배성 생식 세포 (EG세포), 유도 다능성 간세포 (iPS 세포) 등을 들 수가 있지만, 분화 다능성 및 자기 복제능을 겸비하는 세포인한, 이것으로 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서는, 배성 간세포 또는 유도 다능성 간세포가 바람직하게 사용된다.
배성 간세포 (ES 세포)는, 예를 들어, 착상 이전의 초기배, 당해 초기배를 구성하는 내부 세포덩어리, 단일 할구 등을 배양함으로써 수립할 수 있다 (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)；Thomson, J.A. 등, Science, 282, 1145-1147 (1998)). 초기배로서, 체세포의 핵을 핵이식함으로써 제작된 초기배를 사용해도 된다 (Wilmut 등 (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli 등 (Science, 280, 1256 (1998)), Akira Iritani 등 (단백질 핵산 효소, 44, 892 (1999)), Baguisi 등 (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999)), Wakayama 등 (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999)), Rideout III 등 (Nature Genetics, 24, 109 (2000), Tachibana 등 (Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) in press). 초기배로서, 단위생식발생 배를 사용해도 된다 (Kim 등 (Science, 315, 482-486 (2007)), Nakajima 등 (Stem Cells, 25, 983-985 (2007)), Kim 등 (Cell Stem Cell, 1, 346-352 (2007)), Revazova 등 (Cloning Stem Cells, 9, 432-449 (2007)), Revazova 등 (Cloning Stem Cells, 10, 11-24 (2008)).
ES 세포와 체세포의 세포 융합에 의해 얻어지는 융합 ES 세포도, 본 발명 방법으로 사용되는 배성 간세포에 포함된다.
배성 간세포는, 소정의 기관으로부터 입수할 수 있고 또, 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배성 간세포인 KhES-1, KhES-2및 KhES-3은, 쿄토 대학 Institute for Frontier Medical Sciences로부터 입수 가능하다.
배성 생식 세포 (EG세포)는, 시원 생식 세포를, LIF, bFGF, SCF의 존재하에서 배양하는 것 등에 의해 수립할 수 있다 (Matsui 등, Cell, 70, 841-847 (1992), Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731 (1998), Turnpenny 등, Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)).
유도 다능성 간세포 (iPS 세포)란, 체세포 (예를 들어 섬유아세포, 피부 세포, 임파구등)에 핵 리프로그래밍 인자를 접촉시킴으로써, 인위적으로 분화 다능성 및 자기 복제능을 획득한 세포를 말한다. iPS 세포는, 체세포 (예를 들어 섬유아세포, 피부 세포 등)에 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 로 이루어지는 핵 리프로그래밍 인자를 도입하는 방법에 의해 처음으로 발견되었다 (Cell, 126: p. 663-676, 2006). 그 후, 많은 연구자에 의해, 리프로그래밍 인자의 조합이나 인자의 도입법에 대해 여러가지 개선이 진행되고 있어 다양한 유도 다능성 간세포의 제조법이 보고되고 있다.
핵 리프로그래밍 인자는, 섬유아세포 등의 체세포로부터 분화 다능성 및 자기 복제능을 갖는 세포를 유도할 수 있는 물질 (물질들)이면, 단백질성 인자 또는 그것을 코드하는 핵산 (벡터에 혼입된 형태를 포함하는), 혹은 저분자 화합물 등의 어떠한 물질로 구성되어도 된다. 핵 리프로그래밍 인자가 단백질성 인자 또는 그것을 코드하는 핵산인 경우, 바람직하게는 이하의 조합이 예시된다 (이하에 있어서는, 단백질성 인자의 명칭만을 기재한다).
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (여기서, Sox2는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18로 치환가능하다. 또, Klf4는 Klf1, Klf2 또는 Klf5로 치환가능하다. 나아가 c-Myc는 T58A(활성 형태 변이체), N-Myc, L-Myc로 치환가능하다.)
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
이들의 조합 중, 얻어지는 iPS 세포를 치료 용도에 사용하는 것을 염두에 두었을 경우, Oct3/4, Sox2 및 Klf4의 3 인자의 조합이 바람직하다. 한편, iPS 세포를 치료 용도에 사용하는 것을 염두에 두지 않는 경우 (예를 들어, 창약 스크리닝 등의 연구 툴로서 사용하는 경우 등)는, Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc로 이루어지는 4가지 인자 또는 거기에 Lin28 또는 Nanog를 더한 5가지 인자가 바람직하다.
자가 이식 용도에는 iPS 세포가 바람직하게 사용된다.
염색체상의 유전자를 공지된 유전자 공학의 기법을 사용하여 개변한 다능성 간세포도, 본 발명에 있어서 사용할 수 있다. 다능성 간세포는, 공지된 방법을 사용하여, 분화 마커를 코드하는 유전자에 표지 유전자(예를 들어 GFP등의 형광 단백질)를 in-frame 방식으로 노크 인함으로써, 표지 유전자의 발현을 지표로서 대응하는 분화 단계에 이른 것을 식별 가능하게 한 세포여도 된다.
다능성 간세포로서는, 예를 들어 온혈동물, 바람직하게는 포유 동물의 다능성 간세포를 사용할 수 있다. 포유 동물로서는, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등 설치류나 토끼등의 실험동물, 돼지, 소, 염소, 말, 양등의 가축, 개, 고양이 등의 애완동물, 인간, 원숭이, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류를 들 수가 있다. 다능성 간세포는, 바람직하게는, 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등)의 다능성 간세포이며, 가장 바람직하게는 인간 다능성 간세포이다.
다능성 간세포는, 자체 공지된 방법에 의해 유지 배양할 수 있다. 예를 들어, 임상 응용의 관점에서는, 다능성 간세포는, KnockoutTM Serum Replacement (KSR) 등의 혈청 대체물을 사용한 무혈청배양이나, 무피더 세포 배양에 의해 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 다능성 간세포는, 바람직하게는 단리된다. 「단리」란, 목적으로하는 세포나 성분 이외의 인자를 제거하는 조작이 이루어져 세포나 성분이 더 이상 자연 상태에 있지 않는 것을 의미한다. 「단리된 인간 다능성 간세포」의 순도 (총세포수에 차지하는 인간 다능성 간세포수의 백분율)는, 통상 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%이다.
(2) 다능성 간세포의 응집체의 형성
다능성 간세포의 응집체는, 분산시킨 다능성 간세포를, 배양 용기에 비접착성의 조건하에서 배양하고 (즉, 부유 배양해), 복수의 다능성 간세포를 집합시켜 응집체를 형성시킴으로써 얻을 수 있다.
이 응집체 형성에 사용하는 배양 용기로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 마이크로포아, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀을 들 수 있다. 비접착성의 조건하에서의 배양을 가능하게하기 위해, 배양 용기는, 세포비접착성인 것이 바람직하다. 유용한 세포비접착성의 배양 용기로서는, 배양 용기의 표면이, 세포비접착성이 되도록 인공적으로 처리된 것이나, 세포와의 접착성을 향상시키는 목적으로 인공적으로 처리(예를 들어, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 것 등을 포함한다.
응집체의 형성시에 사용되는 배지는, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, Ham F-12배지, RPMI 1640 배지, Fischer 배지, 및 이들의 혼합 배지 등, 동물세포의 배양에 사용할 수 있는 배지이면 특별히 한정되지 않는다.
다능성 간세포로부터, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도에, 악영향을 주지 않는 관점에서, 응집체의 형성시에 사용되는 배지는, 바람직하게는, 무혈청 배지이다. 무혈청 배지란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 사이토카인)을 함유하는 배지는 무혈청 배지에 해당하는 것으로 한다.
응집체의 형성시에 사용되는 배지는, 혈청 대체물을 함유하고 있어도 된다. 혈청 대체물은, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'-티올 글리세롤, 혹은 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어, WO98/30679에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 또, 본 발명 방법을 보다 간편하게 실시하기 위해서, 혈청 대체물은 시판되는 것을 이용할 수 있다. 이러한 시판되는 혈청 대체물로서는, 예를 들어, KSR (녹아웃 혈청 대체물) (Invitrogen 사제), Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco 사제), Glutamax (Gibco 사제)를 들 수 있다.
응집체의 형성에 사용되는 배지는, 다능성 간세포로부터, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도에, 악영향을 주지 않는 범위에서, 다른 첨가물을 포함할 수 있다. 첨가물로서는, 예를 들어, 인슐린, 철 공급원 (예를 들어 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어 셀렌산 나트륨 등), 당류 (예를 들어 글루코오스 등), 유기산 (예를 들어 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어 알부민 등), 아미노산 (예를 들어 L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어 2-메르캅토에탄올 등), 비타민류 (예를 들어 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생 물질 (예를 들어 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어 HEPES 등) 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
또, 응집체의 형성에 사용되는 배지는, 다능성 간세포로부터, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도에 있어서 사용되는 후술하는 배지일 수 있다.
다능성 간세포의 응집체의 형성을 위해서는, 먼저, 다능성 간세포를 계대 배양으로부터 회수해, 이것을, 단일 세포, 또는 이것에 가까운 상태에까지 분산한다. 다능성 간세포의 분산은, 적절한 세포 해리액을 사용하여 행해진다. 세포 해리액으로서는, 예를 들어, EDTA；트립신, 콜라게나제 IV, 메타로프로테아제등의 단백 분해 효소등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다. 그 중에서도 세포 독성이 적은 것이 바람직하고, 이와 같은 세포 해리액으로서 예를 들어, DISPASE (EIDIA), TrypLE (Invitrogen) 또는 Accutase (MILLIPORE) 등의 시판품이 입수 가능하다. 분산된 다능성 간세포는 상기 배지 안에 부유 된다.
분산에 의해 유도되는 다능성 간세포 (특히, 인간 다능성 간세포)의 세포사를 억제하기 위해서, Rho-회합 코일드-코일 키나아제 (ROCK)의 저해제를 배양 개시시부터 첨가하는 것이 바람직하다 (JP-A-2008-99662). ROCK 저해제를 배양 개시부터 예를 들어 15일 이내, 바람직하게는 10일 이내, 보다 바람직하게는 6일 이내 첨가한다. ROCK 저해제로서는, Y-27632 ((＋)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카복사미드 2염산) 등을 들 수가 있다. 부유 배양에 사용되는 ROCK 저해제의 농도는, 분산에 의해 유도되는 다능성 간세포의 세포사를 억제할 수 있는 농도이다. 예를 들어, Y-27632에 대해, 이와 같은 농도는, 통상 약 0.1-200μm, 바람직하게는 약 2-50μm이다. ROCK 저해제의 농도를 첨가하는 기간내에 변동시켜도 되고, 예를 들어 기간의 후반에 농도를 반감시킬 수 있다.
분산된 다능성 간세포의 부유액을, 상기 배양 용기중에 파종하여, 분산시킨 다능성 간세포를, 배양 용기에 비접착성의 조건하에서 배양함으로써, 복수의 다능성 간세포를 집합시켜 응집체를 형성한다. 이 때, 분산된 다능성 간세포를, 10 cm 디쉬와 같은, 비교적 큰 배양 용기에 파종함으로써, 1개의 배양 컴파트먼트중에 복수의 다능성 간세포의 응집체를 동시에 형성시켜도 되는데, 이렇게 하면 응집체의 크기나, 그 안에 포함되는 다능성 간세포의 수에 큰 편차가 생겨 이 편차가 원인으로, 다능성 간세포로부터, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화의 정도에 있어 응집체간 차이가 생겨 결과적으로 분화 유도의 효율이 저하해 버린다. 따라서, 분산한 다능성 간세포를 신속히 응집시켜, 1개의 배양 컴파트먼트중에 1개의 응집체를 형성하는 것이 바람직하다. 이와 같은 분산한 다능성 간세포를 신속히 응집시키는 방법으로서는, 예를 들어, 이하의 방법을 들 수가 있다：
(1) 비교적 작은 체적 (예를 들어, 1 ml 이하, 500μl 이하, 200μl 이하, 100μl 이하)의 배양 컴파트먼트중에, 분산한 다능성 간세포를 가두어 그 컴파트먼트중에 1개의 응집체를 형성하는 방법. 바람직하게는 분산한 다능성 간세포를 가둔 후, 배양 컴파트먼트를 정치한다. 배양 컴파트먼트로서는, 멀티 웰 플레이트 (384 웰, 192 웰, 96 웰, 48 웰, 24 웰 등), 마이크로포아, 챔버 슬라이드 등의 웰이나, 튜브, 행잉 드롭 (hanging drop) 법에 있어서의 배지의 액체방울 등을 들 수가 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 그 컴파트먼트에 갇힌 분산된 다능성 간세포가, 중력에 따라 1개 장소 (spot)에 침전, 혹은 세포끼리 접착함으로써, 1개의 배양 컴파트먼트에 대해, 1개의 응집체가 형성된다. 멀티 웰 플레이트, 마이크로포아, 챔버 슬라이드, 튜브 등의 바닥의 형상은, 분산한 다능성 간세포가 1개 장소에 침전하는 것이 용이해지도록, U 바닥 또는 V 바닥으로하는 것이 바람직하다.
(2) 원심 튜브에 분산한 다능성 간세포를 넣어 이것을 원심분리하여, 1개 장소에 다능성 간세포를 침전시킴으로써, 그 튜브 중에 1개의 응집체를 형성하는 방법.
1개의 배양 컴파트먼트 중에 파종하는 다능성 간세포의 수는, 1개의 배양 컴파트먼트에 대해 1개의 응집체가 형성되고 또한 본 발명 방법에 의해 그 응집체에 있어서, 다능성 간세포로부터, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도가 가능하면, 특별히 한정되지 않지만, 1개의 배양 컴파트먼트에 대해, 통상 약 1x103- 약 5x104개, 바람직하게는 약 1x103- 약 2x104개, 보다 바람직하게는 약 2x103- 약 1.2x104개의 다능성 간세포를 파종한다. 그리고, 다능성 간세포를 신속히 응집시킴으로써, 1개의 배양 컴파트먼트에 대해, 통상 약 1x103- 약 5x104개, 바람직하게는 약 1x103- 약 2x104개, 보다 바람직하게는 약 2x103- 약 1.2x104개의 다능성 간세포로 이루어지는 세포 응집체가 1개 형성된다.
응집체 형성까지의 시간은, 1개의 컴파트먼트에 대해 1개의 응집체가 형성되고 또한 본 발명 방법에 의해, 그 응집체에 있어서, 다능성 간세포로부터, 대뇌피질 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도가 가능한 범위에서 적절히 결정 가능하지만, 이 시간을 짧게 함으로써, 목적으로하는 대뇌피질 조직 또는 그 선구 조직에 대한 효율적인 분화 유도를 기대할 수 있기 때문에, 이 시간은 짧은 편이 바람직하다. 바람직하게는, 24시간 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내, 더욱 바람직하게는 6시간 이내, 가장 바람직하게는, 2-3시간으로, 다능성 간세포의 응집체를 형성한다. 이 응집체 형성까지의 시간은, 세포를 응집시키는 도구나, 원심 조건 등을 조정하는 것으로 당업자이면 적절히 조절하는 것이 가능하다.
또 응집체 형성시의 배양 온도, CO2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 약 30-40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또, CO2 농도는, 예를 들어 약 1-10%, 바람직하게는 약 5%이다.
나아가, 동일 배양 조건의 배양 컴파트먼트를 복수 준비해, 각 배양 컴파트먼트에 있어서, 1개의 다능성 간세포의 응집체를 형성시킴으로써, 질적으로 균일한, 다능성 간세포의 응집체의 집단을 얻을 수 있다. 다능성 간세포의 응집체가 질적으로 균일하다는것은, 응집체의 사이즈 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 해석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 분화 효율의 응집체간의 재현성 등에 기초하여 평가하는 것이 가능하다. 한 구현에 있어서, 본 발명 방법에 사용하는, 다능성 간세포의 응집체의 집단은, 응집체 중에 포함되는 다능성 간세포의 수가 균일하다. 특정의 파라미터에 대해, 다능성 간세포의 응집체의 집단이 「균일」하다는 것은, 응집체의 집단 전체 중 90% 이상의 응집체가, 당해 응집체의 집단에 있어서의 당해 파라미터의 평균치±10%의 범위내, 바람직하게는, 평균치±5%의 범위내인 것을 의미한다.
(3) 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직의 유도
본 발명의 제조 방법은, 다능성 간세포의 응집체를, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 존재하에서 부유 배양함으로써, 종뇌 마커 양성 응집체를 얻는 것 (제 1의 배양 공정), 및 그 종뇌 마커 양성 응집체를, 추가로 부유 배양하는 것 (제 2의 배양 공정)를 포함한다. 제 2의 배양 공정에 있어서의 부유 배양은, 바람직하게는, 고산소 분압 조건하에서 행해진다. 제 1의 배양 공정에 의해, 다능성 간세포로부터 종뇌영역에 대한 분화 방향이 위탁됨 (committed)으로써, 종뇌 마커 유전자의 발현이 유도된다. 수득한 종뇌 마커 양성 응집체를 제 2의 배양 공정에 제공함에 따라, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 추가적인 분화가 유도된다.
종뇌 마커로서는, Foxg1 (Bf1라고도 불린다), Six3등을 들 수가 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 종뇌 마커 양성 응집체는, 적어도 1개의 종뇌 마커를 발현하는 세포를 함유한다. 바람직한 양태에 있어서, 종뇌 마커 양성 응집체는, Foxg1 양성 응집체이다. 종뇌 마커 양성 응집체에 있어서는, 예를 들어, 그 응집체에 포함되는 세포의 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상이, 종뇌 마커 양성이다.
종뇌의 부분 조직으로서는, 대뇌피질, 대뇌 기저핵, 해마, 맥락막 등을 들 수가 있다.
본 발명에 의하면, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직이, 다능성 간세포의 응집체 내에서 자체 조직화된다. 본 발명의 한 구현에 의하면, 다능성 간세포의 응집체를, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 존재하에서 부유 배양함으로써, 종뇌 마커 양성 응집체 (예, Foxg1 양성 응집체)를 수득하여, 그 종뇌 마커 양성 응집체 (예, Foxg1 양성 응집체)를, (바람직하게는, 고산소 분압 조건하에서) 추가로 부유 배양함으로써, 그 응집체 중에, 종뇌 마커 양성의 신경 표피-유사 구조가 형성된다. 한 구현에 있어서, 신경 표피-유사 구조를 포함하는 응집체에 포함되는 세포의 70% 이상이 종뇌 마커 양성 (예, Foxg1 양성)이다. 한 구현에 있어서, 응집체 중에 형성된, 신경 표피-유사 구조는, 내부에 뇌실-유사의 공동을 가진 가성중층 원기둥 표피 구조를 나타낸다. 한 구현에 있어서, 그 신경 표피 구조는, 관강측에 Pax6 양성 및 Sox2 양성의 세포층을 가지고, 가장 안쪽의 부분에 인산화 Histone H3 양성의 유사분열 세포를 포함한다. 이들의 구조는, 인간 임신 초기의 대뇌피질의 뇌실대와 유사하다. 한 구현에 있어서, 뇌실대에 유사한 신경 표피-유사의 세포층의 외측에는, 유사분열 후의 신경세포의 마커인 Tuj1가 발현하고, 대뇌피질의 초기 피질판 마커인 Ctip2와 Tbr1를 발현하는 세포가 포함된다. 이들은, 대뇌피질의 제 1층의 신경세포인 Reelin 양성 Cajal-Retzius 세포를 포함하고, 표층 가까운 곳에는 Laminin를 많이 포함한 층이 있을 수 있다. 요컨대, 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 응집체에는, 대뇌피질 선구 조직이 포함된다.
다능성 간세포의 응집체를 「부유 배양한다」란, 다능성 간세포의 응집체를, 배지내에 있어서, 배양 용기에 대해 비접착성의 조건하에서 배양하는 것을 말한다. 이로써, 종래의 접착 배양에서는 곤란한 입체 형성이 가능하게 된다.
부유 배양에 사용되는 배지는, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제를 포함한다. Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 작용에 의해, 다능성 간세포로부터 종뇌영역에 대한 분화 유도를 효율적으로 실시할 수가 있다.
Wnt 시그널 저해제는, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 것인한 특별히 한정되지 않는다. Wnt 시그널 저해제로서는, 예를 들어, IWR-1-엔도(4-[(3 aR, 4 S, 7 R, 7 aS)-1, 3,3 a, 4,7,7 a-헥사하이드로-1, 3-디옥소-4, 7-메타노-2 H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드), IWP-2, XAV939, Dkk1, Cerberus 단백, Wnt 수용체 저해제, 가용형 Wnt 수용체, Wnt 항체, 카세인 키나아제 저해제, 도미넌트 네거티브 Wnt 단백을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 그 중에서도, IWR-1-엔도가 바람직하다.
TGFβ 시그널 저해제는, TGFβ 에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 것인한 특별히 한정되지 않는다. TGFβ 시그널 저해제로서는, SB431542 (4-(5-벤졸[1,3]디옥소-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드), LY-364947, SB-505, A-83-01등을 들 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 그 중에서도, SB431542가 바람직하다.
바람직한 Wnt 시그널 저해제와 TGFβ 시그널 저해제의 조합은, IWR-1-엔도 및 SB431542이다.
배지 안의 Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 농도는, 응집체에 있어서, 다능성 간세포로부터 종뇌영역에 대한 분화 유도를 가능한 범위에서, 적절히 설정할 수 있다. Wnt 시그널 저해제로서 IWR-1-엔도를 사용하는 경우, 그 농도는, 통상, 0.1-50 μm, 바람직하게는 0.3-5 μm이다. TGFβ 시그널 저해제로서 SB431542를 사용하는 경우, 그 농도는, 통상, 0.1-100 μm, 바람직하게는 1-10 μm이다.
응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지,αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, Ham F-12배지, RPMI 1640 배지, Fischer 배지, Neurobasal 배지, 및 이들의 혼합 배지 등, 동물세포의 배양에 사용할 수 있는 배지이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, Glasgow MEM 배지가 사용된다.
다능성 간세포로부터, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도에, 악영향을 주지 않는 관점에서, 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 바람직하게는, 무혈청 배지이다.
응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 혈청 대체물을 함유하고 있어도 된다. 혈청 대체물은, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'-티올 글리세롤, 혹은 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어, WO98/30679에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 또, 본 발명 방법을 보다 간편하게 실시하기 위해서, 혈청 대체물은 시판되는 것을 이용할 수 있다. 이러한 시판되는 혈청 대체물로서는, 예를 들어, KSR (녹아웃 혈청 대체물) (Invitrogen 사제), Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco 사제), Glutamax (Gibco 사제)를 들 수 있다.
응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 다능성 간세포로부터, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도에, 악영향을 주지 않는 범위에서, 다른 첨가물을 포함할 수 있다. 첨가물로서는, 예를 들어, 인슐린, 철 공급원 (예를 들어 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어 셀렌산 나트륨 등), 당류 (예를 들어 글루코오스 등), 유기산 (예를 들어 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어 알부민 등), 아미노산 (예를 들어 L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어 2-메르캅토에탄올 등), 비타민류 (예를 들어 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생 물질 (예를 들어 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어 HEPES 등) 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
한 구현에 있어서, 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도에 악영향을 주지 않는 관점에서, 성장 인자를 포함하지 않는 화학 합성 배지 (growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM)에, 혈청 대체물 (KSR 등)을 첨가한 것이다. 여기에 말하는 「성장 인자」에는, Fgf, Wnt, Nodal, Notch, Shh등의 패턴 형성 인자；인슐린 및 지방-풍부 알부민이 포함된다.
응집체의 부유 배양에 있어서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30-40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1-10%, 바람직하게는 약 5%이다. O2농도는, 예를 들어 약 20%이다.
제 1의 배양 공정은, 종뇌영역에 대한 분화 방향이 위탁되어, 종뇌 마커 양성 응집체 (예, Foxg1 양성 응집체)가 유도되는데 충분한 기간 실시된다. 종뇌 마커 양성 응집체는, 예를 들어, RT-PCR나, 종뇌 마커 특이적 항체를 사용한 면역 조직화학에 의해 검출할 수 있다. 예를 들어, 배양중의 세포 응집체 중 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상의 세포 응집체가 종뇌 마커 양성이 될 때까지 실시된다. 배양 기간은, 다능성 간세포의 동물종이나, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 종류에 따라 변동일 수 있으므로, 한 마디로 특정할 수 없지만, 예를 들어, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 제 1의 배양 공정은, 15-20일 (예, 18일)이다.
제 2의 배양 공정에 있어서는, 제 1의 배양 공정으로 얻어진 종뇌 마커 양성 응집체를, 추가로 부유 배양함으로써, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 혹은 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체를 얻는다. 제 2의 배양 공정에 있어서의 부유 배양은, 바람직하게는 고산소 분압 조건하에서 행해진다. 고산소 분압 조건하에서 종뇌 마커 양성 응집체를 추가로 부유 배양함으로써, 응집체에 포함되는 뇌실대의 장기간의 유지 배양이 달성되어 종뇌 혹은 그 부분 조직, 혹은 그 선구 조직에 대한 효율적인 분화 유도가 가능해진다.
고산소 분압 조건이란, 공기중의 산소 분압 (20%)을 상회하는 산소 분압 조건을 의미한다. 제 2의 배양 공정에 있어서의 산소 분압은, 예를 들어, 30-60%, 바람직하게는 35-60%, 보다 바람직하게는 38-60%이다.
제 2의 배양 공정에 사용되는 배지는, 제 1의 배양 공정에 사용되는 배지와 마찬가지로, 동물세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지,αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, Ham F-12배지, RPMI 1640 배지, Fischer 배지, 및 이들의 혼합 배지 등, 동물세포의 배양에 사용할 수 있는 배지이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, DMEM 배지가 사용된다.
제 2의 배양 공정에 있어서는, 제 1의 배양 공정에 이용된, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제는 불필요하다. 한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정에 사용되는 배지에는, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제가 포함되지 않는다.
제 2의 배양 공정에 사용되는 배지는, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도를 촉진하기 위해, 혈청 대체물로서 N2 서플리먼트를 함유하는 것이 바람직하다. N2 서플리먼트는, 인슐린, 트랜스페린, 프로게스테론, 프트레스신 및 아셀렌산 나트륨을 포함하는, 공지된 혈청 대체용 조성물이며, Gibco/Invitrogen 사 등으로부터 구입 가능하다. N2 서플리먼트의 첨가량은, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도가 촉진되도록, 적절히 설정할 수 있다.
또, 제 2의 배양 공정에 사용되는 배지는, 뇌실대의 장기간의 유지 배양을 위해, 화학적으로 결정된 지방질 농축물 (Chemically Defined Lipid Concentrate)을 함유하는 것이 바람직하다. 화학적으로 결정된 지방질 농축물은, 각각 정제된, 콜레스테롤, DL-α-토코페롤, 아라키돈산, 리놀렌산, 리놀레산, 미리스트산, 올레산, 팔미트산, 풀미톨레산, 및 스테아르산을 포함하는 지방질 혼합물이다. 화학적으로 결정된 지방질 농축물은 시판되는 것을 사용할 수 있고, 예를 들어, Gibco/Invitrogen 사 등으로부터 구입 가능하다.
응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 다능성 간세포로부터, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도에, 악영향을 주지 않는 범위에서, 다른 첨가물을 포함할 수 있다. 첨가물로서는, 예를 들어, 인슐린, 철 공급원 (예를 들어 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어 셀렌산 나트륨 등), 당류 (예를 들어 글루코오스 등), 유기산 (예를 들어 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어 알부민 등), 아미노산 (예를 들어 L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어 2-메르캅토에탄올 등), 비타민류 (예를 들어 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생 물질 (예를 들어 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어 HEPES 등) 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정에 있어서 사용되는 배지는, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도에, 악영향을 주지 않는 관점에서, 성장 인자를 포함하지 않는 화학 합성 배지 (growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM)에, 혈청 대체물 (KSR 등)을 첨가한 것이다. 여기에 말하는 「성장 인자」에는, Fgf, Wnt, Nodal, Notch, Shh 등의 패턴 형성 인자；인슐린 및 지방-풍부 알부민이 포함된다.
바람직한 양태에 있어서, 제 2의 배양 공정에 있어서의 배지는, N2 서플리먼트 및 화학적으로 결정된 지방질 농축물을 함유한다.
한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정에 있어서의 배지는, 무혈청 배지이다.
한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정에 있어서의 배지는, 혈청을 포함하고 있어도 된다. 혈청은, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있다. 혈청으로서는, FBS 등을 들 수 있으나, 이것으로 한정되지 않는다. 혈청은 불활성화되어 있는 것이 바람직하다. 배지 안의 혈청 농도는, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있는 범위에서 적절히 조정할 수 있고, 통상 1-20% (ｖ/ｖ)이다.
한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정에 있어서의 배지는, 헤파린을 포함하고 있어도 된다. 헤파린은, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있다. 배지 안의 헤파린 농도는, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있는 범위에서 적절히 조정할 수 있고, 통상 0.5-50μg/ml, 바람직하게는 1-10μg/ml (예, 5μg/ml)이다.
한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정에 있어서의 배지는, 세포외 매트릭스 성분을 포함하고 있어도 된다. 세포외 매트릭스는, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있다. 「세포외 매트릭스 성분」이란, 세포외 매트릭스 안에 통상 발견되는 각종 성분을 말한다. 본 발명 방법에서는, 기저막 성분을 사용하는 것이 바람직하다. 기저막의 주성분으로서는, 예를 들어 IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 엔타크틴을 들 수 있다. 배지에 첨가하는 세포외 매트릭스 성분으로서는 시판되는 것을 이용할 수 있고 예를 들어, Matrigel (BD Bioscience), 인간형 라미닌 (시그마) 등을 들 수 있다. Matrigel는, Engelbreth Holm Swarn (EHS) 마우스 육종 유래의 기저막 조제물이다. Matrigel의 주성분은 IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 엔타크틴이지만, 이들에 추가해 TGF-α, 섬유아세포 증식 인자(FGF), 조직 프라스미노겐 활성화 인자, EHS 종양이 자연에 산생하는 증식 인자가 포함된다. Matrigel의 성장인자 감소된 제품은, 통상적인 Matrigel보다 증식 인자의 농도가 낮고, 그 표준적인 농도는 EGF가＜0.5 ng/ml, NGF가＜0.2 ng/ml, PDGF가＜5 pg/ml, IGF-1이 5 ng/ml, TGF-α가 1.7 ng/ml이다. 본 발명 방법에서는, 성장인자 감소된 제품의 사용이 바람직하다.
배지 안의 세포외 매트릭스 성분의 농도는, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있는 범위에서 적절히 조정할 수 있고, Martigel를 사용하는 경우에는 배양액의 1/500-1/20의 용량, 더욱 바람직하게는 1/100의 용적으로 첨가하는 것이 바람직하다.
한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정에 있어서의 배지는, N2 서플리먼트 및 화학적으로 결정된 지방질 농축물에 추가해, 혈청 및 헤파린을 함유한다. 그 양태에 있어서는, 그 배지에 세포외 매트릭스를 추가로 포함하고 있어도 된다. 본 태양의 배지는, 장기간에 걸치는 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직의 분화 유도를 관찰하는데 적합하다. 이 경우, 제 2의 배양 공정의 전 범위에 걸쳐, N2 서플리먼트, 화학적으로 결정된 지방질 농축물, 혈청 및 헤파린 (임의로 더욱 세포외 매트릭스)을 함유하는 배지를 사용해도 되고, 일부의 기간만, 당해 양태의 배지를 사용해도 된다. 한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정에 있어서, 먼저, N2 서플리먼트 및 화학적으로 결정된 지방질 농축물을 포함하고, 혈청, 헤파린 및 세포외 매트릭스를 함유하지 않는 배지를 이용하고 도중에 (예를 들어, 뇌실-유사의 공동을 가진 반구상의 신경 표피-유사 구조 (가성중층 원기둥 표피; pseudostratified columnar epithelium)가 형성된 단계 이후), N2 서플리먼트, 화학적으로 결정된 지방질 농축물, 혈청, 헤파린, (임의로, 세포외 매트릭스)를 함유하는 배지로 전환 가능하다.
제 2의 배양 공정에 있어서의 배양 온도, CO2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30-40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1-10%, 바람직하게는 약 5%이다.
제 2의 배양 공정은, 적어도, Foxg1 양성 응집체 중에, 뇌실-유사의 공동을 가진 반구상의 신경 표피-유사 구조 (가성중층 원기둥 표피)가 형성되는데 충분한 기간 실시된다. 당해 신경 표피-유사 구조는, 현미경 관찰에 의해 확인하는 것이 가능하다. 배양 기간은, 다능성 간세포의 동물종이나, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 종류 등에 따라 변동할 수 있으므로, 한 마디로 특정할 수 없지만, 예를 들어, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 제 2의 배양 공정은, 적어도 15-20일 (예, 17일)이다.
본 발명 방법에 있어서는, 제 2의 배양 공정을 장기간 (예, 20일 이상, 바람직하게는 50일 이상, 보다 바람직하게는 70일 이상)에 실시함으로써, 세포 응집체 내에 있어서, 안정적인 종뇌의 자체 조직화를 유발하는 것이 가능하고, 제 2의 배양 공정을 계속하여 실시하면, 시간의 경과에 따라, 세포 응집체 내에 포함되는 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직의 분화 단계가 진행된다. 그 때문에, 원하는 분화 단계에 도달할 때까지, 제 2의 배양 공정을 계속하여 실시하는 것이 바람직하다.
한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정을, 세포 응집체 중에, 대뇌피질 조직 또는 그 선구 조직이, 표층부에서 심부로 향해, 변연대, 피질판, 서브플레이트, 중간대, 뇌실하대 및 뇌실대를 포함하는 다층 구조를 나타낼 때까지 실시한다. 중요하게, 본 발명 방법에 있어서는, 그 다층 구조를 나타내는 대뇌피질 또는 그 선구 조직이 자체 조직화된다. 그 다층 구조를 나타내기까지 필요로하는 배양 기간은, 다능성 간세포의 동물종이나, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 종류등에 따라 변동될 수 있으므로, 한 마디로 특정할 수 없지만, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 제 2의 배양 공정을, 예를 들어, 52일 이상 실시한다. 변연대에는, 일반적으로, Reelin 양성의 Cajal-Retzius 세포 및 라미닌이 포함된다. 피질판에는, Tbr1 양성, Ctip2 양성의 심부 피질판, 및 Satb2를 발현한 신경세포를 포함하는 천부 피질판을 포함하고 천부 피질판이 변연대와 접한다. 대뇌피질 선구 조직의 분화가 충분히 진행되지 않은 경우에는, 천부 피질판이 명확하게 형성되어 있지 않은 경우도 있지만, 분화가 충분히 진행되면 (예를 들어, 제 2의 배양 공정을 73일 이상 실시하면), 심부 피질판 및 천부 피질판의 쌍방이 명확하게 형성된다. 서브플레이트는, 피질판의 바로 아래에 형성되어 Calretinin 양성 또한 MAP2 양성의 많은 신경돌기를 포함한 세포를 포함한다. 중간대는, 뇌실하대와 피질판과의 사이의, 세포가 드문 층이다. 뇌실하대는 Tbr2 양성으로 특징될 수 있다. 뇌실대는, Sox2 양성 또한 Pax6 양성으로 특징될 수 있다. 한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정은, 세포 응집체 중에, 대뇌피질 조직 또는 그 선구 조직이, 표층부에서 심부로 향해, 변연대, 천부 피질판, 심부 피질판, 서브플레이트, 중간대, 외측 뇌실하대, 뇌실하대 및 뇌실대를 포함하는 다층 구조를 나타낼 때까지 (예, 73일 이상) 실시한다. 이와 같은 다층 구조는, in vivo에 있어서는, 인간 임신 중기의 대뇌피질로 보여지는 것이다.
흥미롭게, 본 발명 방법에 있어서, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 외측 뇌실하대 (oSVZ)에, 인산화 Vimentin 양성, Tbr2 음성, Sox2 양성, Pax6 양성의 신경간 세포/선구 세포가 포함된다. 그 신경간 세포/선구 세포는, 인간 태아의 대뇌피질에 풍부하게 존재하지만, 마우스 대뇌피질에서는 거의 존재하지 않는 외측 방사상 신경교 세포 (oRG)와 같은 특징을 갖는다. 즉, 본 발명에 의하면, oRG-유사 세포의 외측 뇌실하대에 있어서의 출현이라고하는, 인간에 특이적 현상을 인비트로에 있어서 재현할 수 있다.
중요하게, 본 발명 방법에 있어서는, 대뇌피질의 등배축 및 전후축이 자발적으로 형성된다. 예를 들어, 한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정에 있어서 얻어지는, 세포 응집체에 포함되는, 대뇌피질 뇌실대에 있어서, 후미측 마커(CoupTF1, Lhx2 등)의 발현이, 한쪽 편에서는 보다 강하고, 반대측에서는 약한 구배를 나타내고, 문복측 마커(예, Sp8)의 발현은 후미측 마커와 역의 구배를 나타낸다. 혹은, 한 구현에 있어서, 대뇌피질 뇌실대에 있어서의 후미측 마커 (예, CoupTF1, Lhx2)가 강하게 발현하는 영역이 피질의 가장자리 마커 (예, Zic1, Otx2)를 발현하는 영역과 인접해 형성된다.
본 발명 방법을 통해, 다능성 간세포로부터 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화 유도가 가능한 한, 피더 세포의 존재하/비존재하 어느 조건으로 응집체의 부유 배양을 실시해도 되는데, 미정의 (undefined) 인자의 혼입을 회피하는 관점에서, 피더 세포의 비존재하에서 응집체의 부유 배양을 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명 방법에 있어서, 응집체의 부유 배양에 사용하는 배양 용기로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 플라스크, 조직배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 마이크로포아, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀을 들 수 있다. 비접착성의 조건하에서의 배양을 가능하게하기 위해서, 배양 용기는 세포비접착성인 것이 바람직하다. 세포비접착성의 배양 용기로서는, 배양 용기의 표면이, 세포비접착성이 되도록 인공적으로 처리된 것이나, 세포와의 접착성을 향상시키는 목적으로 인공적으로 처리 (예를 들어, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리) 되어 있지 않은 것 등을 사용할 수 있다.
응집체의 부유 배양에 사용하는 배양 용기로서 산소 투과성의 것을 사용하여도 좋다. 산소 투과성의 배양 용기를 사용하는 것에 따라, 응집체에 대한 산소의 공급이 향상해, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있다. 특히, 제 2의 배양 공정에 있어서는, 세포 응집체가 크게 성장해, 응집체 안의 세포 (예를 들어 뇌실대의 세포)에까지, 충분한 산소가 공급되지 않게 되는 리스크가 있기 때문에, 산소 투과성의 배양 용기의 사용이 바람직하다.
응집체의 부유 배양을 위해서는, 응집체의 배양 용기에 대한 비접착 상태를 유지할 수 있는 한, 응집체를 정치 배양해도 되고, 선회 배양이나 진탕 배양에 의해 응집체를 의식적으로 움직여도 되는데, 본 발명에 있어서는, 선회 배양이나 진탕 배양에 의해 응집체를 의식적으로 움직일 필요는 없다. 즉, 한 구현에 있어서, 본 발명의 제조 방법에 있어서의 부유 배양은, 정치 배양에 의해 행해진다. 정치 배양이란, 응집체를 의식적으로 이동시키지 않는 상태로 배양하는 배양법을 말한다. 즉, 예를 들어, 국소적인 배지 온도의 변화에 수반해, 배지가 대류해, 그 흐름에 의해, 응집체가 이동할 수 있다. 그러나, 의식적으로 응집체를 이동시키지 않았으므로, 그러한 경우도 포함해, 본 발명에서는 정치 배양으로 한다. 부유 배양의 전 기간을 통해서 정치 배양을 실시해도 되고, 일부의 기간만 정치 배양을 실시해도 된다. 예를 들어, 상기의 제 1의 배양 공정 및 제 2의 배양 공정의 어느 하나 일방만을 정치 배양할 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 부유 배양의 전 기간을 통해서, 정치 배양을 실시한다. 정치 배양은 장치가 불필요하고, 세포덩어리의 데미지도 적은 것이 기대되어 배양액의 양도 줄일 수 있는 점에서 유리하다.
바람직한 양태에 있어서, 질적으로 균일한, 다능성 간세포의 응집체의 집단을, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제를 포함하는 배지 안에서 부유 배양한다. 질적으로 균일한, 다능성 간세포의 응집체의 집단을 사용하는 것에 의해, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 대한 분화의 정도에 대한 응집체간에서의 차이를 최소한으로 억제해, 목적으로하는 분화 유도의 효율을 향상시킬 수 있다. 질적으로 균일한, 다능성 간세포의 응집체의 집단의 부유 배양에는, 이하의 양태가 포함된다.
(1) 복수의 배양 컴파트먼트를 준비해, 1개의 배양 컴파트먼트에 1개의 다능성 간세포의 응집체가 포함되도록, 질적으로 균일한, 다능성 간세포의 응집체의 집단을 파종한다 (예를 들어, 96 웰 플레이트의 각 웰에 1개씩, 다능성 간세포의 응집체를 넣는다). 그리고, 각 배양 컴파트먼트에 있어서, 1개의 다능성 간세포의 응집체를 Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제를 포함하는 배지 내에서 부유 배양한다.
(2) 1개의 배양 컴파트먼트에 복수의 다능성 간세포의 응집체가 포함되도록, 질적으로 균일한, 다능성 간세포의 응집체의 집단을 1개의 배양 컴파트먼트에 파종한다 (예를 들어, 10 cm디쉬에, 복수의 다능성 간세포의 응집체를 넣는다). 그리고, 그 컴파트먼트에 있어서, 복수의 다능성 간세포의 응집체를 Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제를 포함하는 배지 내에서 부유 배양한다.
본 발명 방법을 통해서, (1) 및 (2)의 어느 양태를 채용해도 되고, 또, 배양의 도중에 양태를 변경해도 된다 ((1)의 양태로부터 (2)의 양태, 혹은 (2)의 양태로부터 (1)의 양태). 한 구현에 있어서, 제 1의 배양 공정에 있어서는 (1)의 양태를 채용하고, 제 2의 배양 공정에 있어서는 (2)의 양태를 채용한다.
상기 서술한 바와 같이, 본 발명 방법에 있어서는, 세포 응집체 내에 있어서, 종뇌의 자체 조직화가 유발되므로, 시간의 경과에 따라, 세포 응집체 내에 포함되는 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직의 분화 단계가 진행된다. 따라서, 목적으로하는 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직에 따라, 배양 기간이나 배양 조건을 적절히 조절하는 것이 바람직하다. 이하 (4)-(11)에 있어서, 본 발명의 한 구현을 설명하지만, 이들은 본 발명의 예시로서, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
(4) 맥락막의 유도
본 발명 방법의 제 2의 배양 공정에 있어서, 부유 배양을, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 존재하에서 실시하는 것으로, 세포 응집체 중에 맥락막 또는 그 선구 조직을 유도할 수 있다.
Wnt 시그널 증강제로서는, 상기 방법에 있어 사용한 경우, 맥락막 또는 그 선구 조직을 유도하는 것이 가능하면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, GSK-3β 저해제, 재조합 Wnt3a, Wnt 작동약 (화합물), Dkk (Wnt 저해 단백질의 저해제), R-Spondin 등을 들 수 있다. GSK-3β 저해제로서는, 예를 들어, CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴), Kenpaullone, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO) 등을 들 수가 있다. Wnt 시그널 증강제는, 바람직하게는 GSK-3β 저해제이며, 보다 바람직하게는 CHIR99021이다.
Wnt 시그널 증강제의 농도는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 맥락막 또는 그 선구 조직을 유도하는 것이 가능하면, 특별히 한정되지 않는다. CHIR99021를 사용하는 경우, 통상, 약 0.1μm -3 0μm, 바람직하게는 약 1μm-10μm (예, 3μm)이다.
본 명세서에 있어서, 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질은, 골형성 인자와 수용체와의 결합에 의해 시그널이 전달되는 경로를 활성화하는 임의의 물질을 의미한다. 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 예로서는 BMP2, BMP4, BMP7, GDF5 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질은 BMP4이다. 이하, 주로 BMP4에 대해 기재하지만, 본 발명에 있어서 사용되는 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질은 BMP4로 한정되지 않는다. BMP4는, 공지된 사이토카인으로, 그 아미노산 배열도 공지이다. 본 발명에 사용하는 BMP4는, 포유 동물의 BMP4이다. 포유 동물로서는, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등 설치류나 토끼 등의 실험동물, 돼지, 소, 염소, 말, 양등의 가축, 개, 고양이 등의 애완동물, 인간, 원숭이, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류를 들 수가 있다. BMP4는, 바람직하게는, 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등)의 BMP4이며, 가장 바람직하게는 인간 BMP4이다. 인간 BMP4란, BMP4가, 인간이 생체내에서 천연에 발현하는 BMP4의 아미노산 배열을 갖는 일을 의미한다. 인간 BMP4의 대표적인 아미노산 배열로서는, NCBI의 기탁 번호로, NP_001193.2 (2013년 6월 15일 갱신), NP_570911.2 (2013년 6월 15일 갱신), NP_570912.2 (2013년 6월 15일 갱신), 이들의 아미노산 배열의 각각으로부터 N 말단 시그널 배열 (1-24)을 제외하여 수득한 아미노산 배열 (성숙형 인간 BMP4 아미노산 배열) 등을 예시할 수 있다.
배지 안의 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도는, 응집체에 있어서, 다능성 간세포로부터 맥락막 또는 그 선구 조직에 대한 분화를 유도 가능한 범위에서, 적절히 설정할 수 있다. 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4를 사용하는 경우, 그 농도는, 통상, 0.05-10 nM, 바람직하게는 0.1-2.5 nm (예, 0.5 nM)이다.
바람직한 양태에 있어서, 맥락막 또는 그 선구 조직의 유도에 사용하는 배지에는, N2 서플리먼트, 화학적으로 결정된 지방질 농축물, 혈청 및 헤파린이 포함될 수 있다.
Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)을 포함하는 배지 안에서의 배양은, 반드시 제 2의 배양 공정에 있어서, 맥락막 또는 그 선구 조직이 유도될 때까지의 모든 기간에 실시할 필요는 없고, 그 일부의 기간에 있어서 실시하면 된다. 예를 들어, 제 2의 배양 공정의 개시부터, 3일간 이상, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)을 포함하는 배지 내에서 부유 배양을 실시하면, 맥락막 또는 그 선구 조직을 유도하기에 충분하고, 그 후, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)을 포함하지 않는 배지로 전환한 다음, 부유 배양을 계속해도 된다.
여기서, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)을 포함하는 배지 안에서의 배양 기간이 길수록, 맥락막 선택적인 분화를 유도할 수 있다 (즉, 동일 세포 응집체 내에, 맥락막 이외의 종뇌조직 (예, 대뇌피질, 해마)으로의 분화가 발생하기 어렵다). 한 구현에 있어서, 세포 응집체의 집단의 80% 이상에 있어서, 맥락막 또는 그 선구 조직을 유도할 수 있다. 한편, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)을 포함하는 배지 안에서의 배양 기간이 짧은 경우, 동일 세포 응집체 내에, 맥락막 이외의 종뇌조직 (예, 대뇌피질, 해마)에 대한 분화가 발생하기 쉬워져, 맥락막 또는 그 선구 조직에 추가해 대뇌피질 또는 그 선구 조직 및/또는 해마 또는 그 선구 조직을 동일 세포 응집체 내에 포함하는, 세포 응집체를 얻을 수 있다 (후술).
맥락막 조직의 유도는, 맥락막 마커 (TTR, Lmx1a, Otx2 등)의 발현이나, 종뇌 마커 (Foxg1 등)의 비발현, 러플링된 (ruffled) 단층 표피의 형태를 지표로 하여 확인할 수 있다. 맥락막 조직의 유도에 필요로하는 시간은, 배양 조건이나, 다능성 간세포의 유래하는 포유 동물의 종류에 따라 변동하므로, 한 마디로 특정할 수 없지만, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 제 2의 배양 공정의 개시부터, 예를 들어 24일 후까지에는, 응집체의 내부에 맥락막 조직이 유도된다. 얻어진 세포 응집체의 집단중에서, 맥락막 또는 그 선구 조직이 유도된 세포 응집체를 선택함으로써, 맥락막 또는 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체를 얻을 수 있다.
(5) 해마의 유도
본 발명 방법의 제 2의 배양 공정에 있어서, 부유 배양을, Wnt 시그널 증강제의 존재하에서 실시하는 것으로, 세포 응집체 중에 해마 또는 그 선구 조직 (피질의 가장자리 등)을 유도할 수 있다.
Wnt 시그널 증강제로서는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 해마 또는 그 선구 조직을 유도하는 것이 가능하면, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, GSK-3β 저해제, 재조합 Wnt3a, Wnt 작동약 (화합물), Dkk (Wnt 저해 단백질의 저해제), R-Spondin 등을 들 수 있다. GSK-3β 저해제로서는, 예를 들어, CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴), Kenpaullone, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO) 등을 들 수가 있다. Wnt 시그널 증강제는, 바람직하게는 GSK-3β 저해제이며, 보다 바람직하게는 CHIR99021이다.
Wnt 시그널 증강제의 농도는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 해마 또는 그 선구 조직을 유도하는 것이 가능하면, 특별히 한정되지 않는다. CHIR99021를 사용하는 경우, 통상, 약 0.1μm -3 0μm, 바람직하게는 약 1μm-10μm (예, 3μm)이다.
바람직한 양태에 있어서, 해마 또는 그 선구 조직의 유도에 사용하는 배지에는, N2 서플리먼트, 화학적으로 결정된 지방질 농축물, 혈청 및 헤파린이 포함될 수 있다.
Wnt 시그널 증강제를 포함하는 배지 안에서의 배양은, 반드시 제 2의 배양 공정에 있어서, 해마 또는 그 선구 조직이 유도될 때까지의 모든 기간에 실시할 필요는 없고, 그 일부의 기간에 있어서 실시하면 된다. 예를 들어, 제 2의 배양 공정의 개시부터, 3일간 이상, Wnt 시그널 증강제를 포함하는 배지 내에서 부유 배양을 실시하면, 해마 또는 그 선구 조직을 유도하기에 충분하고, 그 후, Wnt 시그널 증강제를 포함하지 않는 배지로 전환한 다음, 부유 배양을 계속해도 된다.
여기서, Wnt 시그널 증강제를 포함하는 배지 안에서의 배양 기간이 길수록, 해마 선택적인 분화를 유도할 수 있다(즉, 동일 세포 응집체 내에, 해마 조직 이외의 종뇌조직 (예, 대뇌피질, 맥락막)에 대한 분화가 생기기 어렵다). 한 구현에 있어서, 세포 응집체의 집단의 80% 이상에 있어서, 해마 또는 그 선구 조직을 유도할 수 있다. 한편, Wnt 시그널 증강제를 포함하는 배지 안에서의 배양 기간이 짧은 경우, 동일 세포 응집체 내에, 해마 이외의 종뇌조직 (예, 대뇌피질, 맥락막)에 대한 분화가 발생하기 쉬워져, 해마 조직 또는 그 선구 조직에 추가해 대뇌피질 또는 그 선구 조직 및/또는 맥락막 또는 그 선구 조직을 동일 세포 응집체 내에 포함하는, 세포 응집체를 얻을 수 있다.
한 구현에 있어서, 해마 또는 그 선구 조직의 유도에 사용하는 배지에는, 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)이 포함되지 않는다. 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)을 포함하지 않는 배지를 사용함에 따라, 맥락막에 대한 분화 유도를 억제해, 해마 조직 또는 그 선구 조직의 선택적인 유도가 가능해진다.
다른 양태에 있어서, 해마 또는 그 선구 조직의 유도에 사용하는 배지에는, 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)이 포함되어 있어도 된다. 이 경우, 분화의 해마 선택성이 저하하는 한편, 동일 세포 응집체 내에, 해마 이외의 종뇌조직 (예, 맥락막)에 대한 분화가 발생하기 쉬워진다.
해마 또는 그 선구 조직의 유도는, 피질의 가장자리 마커 (Lmx1a, Otx2 등)의 발현, 종뇌 마커 (Foxg1 등)의 발현을 지표로하여 확인할 수 있다. 해마 또는 그 선구 조직의 유도에 필요로하는 시간은, 배양 조건이나, 다능성 간세포의 유래하는 포유 동물의 종류에 따라 변동하므로, 한 마디로 특정할 수 없지만, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 제 2의 배양 공정의 개시부터, 예를 들어 24일 후까지에는, 응집체의 내부에, 해마 또는 그 선구 조직이 유도된다. 얻어진 세포 응집체의 집단 중에서, 해마 또는 그 선구 조직이 유도된 세포 응집체를 선택함으로써, 해마 또는 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체를 얻을 수 있다.
(6) 맥락막, 해마 선구 조직 및 대뇌피질 선구 조직의 유도
본 발명 방법의 제 2의 배양 공정에 있어서, 부유 배양을, 일과성으로 (transiently) Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 존재하에서 실시하는 것으로, 1개의 세포 응집체 중에, 맥락막 (또는 그 선구 조직)과 해마 (또는 선구 조직)와 대뇌피질 (또는 그 선구 조직)을 유도할 수 있다.
즉, 제 2의 배양 공정에 있어서, 부유 배양을, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 존재하에서 실시하고, 얻어진 세포 응집체를, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 부재하에서 더욱 배양한다. 그 결과, 얻어진 세포 응집체에 포함되는 연속한 신경 표피 중에, 맥락막 (또는 그 선구 조직), 해마 조직 (또는 선구 조직) 및 대뇌피질 조직 (또는 그 선구 조직)이 형성된다. 한 구현에 있어서, 세포 응집체의 집단의 80% 이상에 있어서, 연속한 신경 표피 중에, 맥락막 (또는 그 선구 조직), 해마 조직 (또는 선구 조직) 및 대뇌피질 조직 (또는 그 선구 조직)을 유도할 수 있다.
이론에 구속되지 않지만, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 처리에 의해 맥락막 조직의 형성 및 이들 인자의 제거라고하는 일련의 조작 (첨가에 의한 촉진, 및 제거에 의한 반동) (induction-reversal method)에 의해 조직화 (organizer) 활성으로 칭하는 시그널이 흘러, 맥락막 조직, 피질의 가장자리, 치조회 조직, Ammon 뿔 조직의 적절한 자체 조직화가 달성될 수 있다.
Wnt 시그널 증강제로서는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 1개의 세포 응집체 중에, 맥락막 (또는 그 선구 조직), 해마 (또는 선구 조직) 및 대뇌피질 (또는 그 선구 조직)을 유도할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, GSK-3β 저해제, 재조합 Wnt3a, Wnt 작동약 (화합물), Dkk (Wnt 저해 단백질의 저해제), R-Spondin 등을 들 수 있다. GSK-3β 저해제로서는, 예를 들어, CHIR99021, Kenpaullone, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO) 등을 들 수가 있다. Wnt 시그널 증강제는 바람직하게는, GSK-3β 저해제이며, 보다 바람직하게는 CHIR99021이다.
Wnt 시그널 증강제의 농도는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 1개의 세포 응집체 중에, 맥락막 (또는 그 선구 조직), 해마 (또는 선구 조직) 및 대뇌피질 조직 (또는 그 선구 조직)을 유도할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. CHIR99021를 사용하는 경우, 통상, 약 0.1μm -100μm, 바람직하게는 약 1μm-30μm (예, 3μm)이다.
골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 예로서는 BMP2, BMP4, BMP7, GDF5 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질은 BMP4이다.
배지 안의 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 1개의 세포 응집체 중에, 맥락막 (또는 그 선구 조직), 해마 (또는 선구 조직) 및 대뇌피질 (또는 그 선구 조직)을 유도할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않지만, 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4를 사용하는 경우, 그 농도는, 통상, 0.05-10 nM, 바람직하게는 0.1-2.5 nm (예, 0.5 nM)이다.
바람직한 양태에 있어서, 본 방법에 있어서의 제 2의 배양 공정에 사용하는 배지에는, N2 서플리먼트, 화학적으로 결정된 지방질 농축물, 혈청 및 헤파린이 포함될 수 있다.
Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)을 포함하는 배지 안에서의 배양의 기간은, 배양 조건이나, 다능성 간세포의 유래하는 포유 동물의 종류에 따라 변동하므로, 한 마디로 특정할 수 없지만, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 통상, 1-7일, 바람직하게는 2-4일 (예, 3일)이다.
Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)을 제거한 후의 배양 기간은, 배양 조건이나, 다능성 간세포의 유래하는 포유 동물의 종류에 따라 변동하므로, 한 마디로 특정할 수 없지만, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 통상, 10일 이상, 바람직하게는 14일 이상이다.
1개의 세포 응집체 중에, 맥락막 (또는 그 선구 조직), 해마 (또는 선구 조직) 및 대뇌피질 조직 (또는 그 선구 조직)이 연속적으로 형성된 것은, 각 조직의 마커의 발현을 지표로하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 생체와 유사한 서로 인접한 배치로, Lmx1a 양성이고 Foxg1가 음성의 맥락막 영역, Lmx1a, Otx2를 발현하고 Foxg1 약양성인 피질의 가장자리의 영역, Lef1 양성이고 Foxg1가 양성의 해마 선구 조직의 영역, Lef1 음성이고 Foxg1 양성의 대뇌피질 선구 조직이, 동일 신경 표피상에 연속적으로 형성된다.
얻어진 세포 응집체의 집단중에서, 연속한 신경 표피 중에, 맥락막 (또는 그 선구 조직), 해마 (또는 선구 조직) 및 대뇌피질 (또는 그 선구 조직)이 형성된 세포 응집체를 선택함으로써, 목적으로하는 세포 응집체를 얻을 수 있다.
(7) 해마 조직내의 각 영역의 연속적인 입체 형성
(6)과 마찬가지로, 본 발명 방법의 제 2의 배양 공정에 있어서, 부유 배양을, 일과성으로 Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 존재하에서 실시하는 것으로, 1개의 세포 응집체 중에, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직) 및 Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)을 연속적으로 포함하는, 해마 조직 또는 그 선구 조직을 유도할 수 있다. 지금까지, 다능성 간세포로부터 Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)을 분화시켰다고하는 보고는 없다.
즉, 제 2의 배양 공정에 있어서, 부유 배양을, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 존재하에서 실시하고, 얻어진 세포 응집체를 고산소 분압 조건하에, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 부재하에서 더욱 배양한다. 그 결과, 얻어진 세포 응집체에 있어서의 연속한 신경 표피 중에, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직) 및 Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)을 포함하는 해마 조직 또는 그 선구 조직이 형성된다. 또, 이 배양의 결과, Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)을 포함하는 세포 응집체를 얻을 수 있다.
이론에 구속되지 않지만, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 처리에 의해 맥락막 조직의 형성 및 이들 인자의 제거라고하는 일련의 조작 (첨가에 의한 촉진, 및 제거에 의한 반동) (induction-reversal method)에 의해 조직화 (organizer) 활성으로 칭하는 시그널이 흘러, 맥락막 조직, 피질의 가장자리, 치조회 조직, Ammon 뿔 조직의 적절한 자체 조직화가 달성될 수 있다.
Wnt 시그널 증강제로서는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 1개의 세포 응집체 중에, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직) 및 Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)을 유도할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, GSK-3β 저해제, 재조합 Wnt3a, Wnt 작동약 (화합물), Dkk (Wnt 저해 단백질의 저해제), R-Spondin 등을 들 수 있다. GSK-3β 저해제로서는, 예를 들어, CHIR99021, Kenpaullone, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO) 등을 들 수가 있다. Wnt 시그널 증강제는, 바람직하게는 GSK-3β 저해제이며, 보다 바람직하게는 CHIR99021이다.
Wnt 시그널 증강제의 농도는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 1개의 세포 응집체 중에, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직) 및 Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)을 유도할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. CHIR99021를 사용하는 경우, 통상, 약 0.1μm -3 0μm, 바람직하게는 약 1μm-10μm (예, 3μm)이다.
골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 예로서는 BMP2, BMP4, BMP7, GDF5 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질은 BMP4이다.
배지 안의 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 1개의 세포 응집체 중에, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직) 및 Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)을 유도할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않지만, 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4를 사용하는 경우, 그 농도는, 통상, 0.05-10 nM, 바람직하게는 0.1-2.5 nm (예, 0.5 nM)이다.
바람직한 양태에 있어서, 본 방법론에 있어서의 제 2의 배양 공정에 사용하는 배지에는, N2 서플리먼트, 화학적으로 결정된 지방질 농축물, 혈청 및 헤파린이 포함될 수 있다.
다른 양태에 있어서, 본 방법에 있어서의 제 2의 배양 공정에 사용하는 배지에는, B27 서플리먼트, L-글루타민 및 혈청이 포함될 수 있다.
Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)을 포함하는 배지 안에서의 배양의 기간은, 배양 조건이나, 다능성 간세포의 유래하는 포유 동물의 종류에 따라 변동하므로, 한 마디로 특정할 수 없지만, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 통상, 1-7일, 바람직하게는 2-4일 (예, 3일)이다.
Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등)을 제거한 후의 배양 기간은, 배양 조건이나, 다능성 간세포의 유래하는 포유 동물의 종류에 따라 변동하므로, 한 마디로 특정할 수 없지만, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 통상, 40일 이상, 바람직하게는 51일 이상이다.
1개의 세포 응집체 중에, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직) 및 Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)이 연속적으로 형성된 것은, 각 조직의 마커의 발현을 지표로하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직)은, Lef1 (해마 선구 조직 마커) 양성, Zbtb20 양성, Prox1 양성 등으로 특정될 수 있다. Ammon 뿔 (또는 그 선구 조직)은, Lef1 (해마 선구 조직 마커) 양성, Zbtb20 약양성등으로 특정될 수 있다.
한 구현에 있어서, 본 발명에 의해 얻어진 세포 응집체에 있어서는, 세포 응집체에 있어서의 연속한 신경 표피 중에, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직) 및 Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)에 추가해, 피질의 가장자리가 더욱 포함된다. 즉, 연속한 신경 표피 중에, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직), Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직) 및 피질의 가장자리를 포함하는, 해마 조직 또는 그 선구 조직을 유도할 수 있다.
한 구현에 있어서, 본 방법에 의해 얻어진 세포 응집체에 있어서는, Lef1 양성 신경 표피에서도 Zbtb20의 발현은 맥락막 (Lmx1a 양성, Foxg1 음성)이나 피질의 가장자리 (Lmx1a 양성, Foxg1 약양성)의 영역과 인접하는 부분(치상회 조직 또는 그 선구 조직)에서 강하고, 이들로부터 멀어짐에 따라 약해진다고하는 발현 강도의 구배를 볼 수 있다.
다른 양태에 있어서, 치상회 조직 또는 그 선구 조직 (예, Zbtb20 양성, Prox1 양성)이, Ammon 뿔 조직 또는 그 선구 조직 (예, Zbtb20 약양성)과 피질의 가장자리 및 맥락막의 사이에 형성된다. 즉, 생체와 유사한 서로 인접한 배치로, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직), Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직) 및 피질의 가장자리가 연속하여 신경 표피 중에 형성된다.
얻어진 세포 응집체의 집단 중에서, 연속한 신경 표피 중에, 치상회 조직 (또는 그 선구 조직) 및 Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)이 형성된 세포 응집체를 선택함으로써, 목적으로하는 세포 응집체를 얻을 수 있다.
(8) 대뇌 기저핵조직의 유도
본 발명 방법에 있어서, 세포 응집체를, 소닉 헤지혹 (Shh) 시그널 작동약으로 처리함으로써, 세포 응집체 중에 대뇌 기저핵 또는 그 선구 조직을 유도할 수 있다.
Shh 시그널 작동약으로서는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 대뇌 기저핵조직 또는 그 선구 조직을 유도하는 것이 가능하면, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, Hedgehog 패밀리에 속하는 단백(예를 들어, Shh), Shh 수용체 작동약Purmorphamine, SAG (N-메틸-N'-(3-피리디닐벤질)-N'-(3-클로로벤조[b]티오펜-2-카보닐)-1, 4-디아미노시클로헥산) 등을 들 수가 있다. Shh 시그널 작동약은, 바람직하게는 SAG이다.
Shh 시그널 작동약의 농도는, 상기 방법에 있어서 사용한 경우, 대뇌 기저핵조직 또는 그 선구 조직을 유도하는 것이 가능하면, 특별히 한정되지 않는다. SAG를 사용하는 경우, 통상, 1 nM -10μm이다.
여기서, SAG를 비교적 저농도 (예를 들어 1 nM-75 nM, 바람직하게는 25 nM-50 nM)로 사용하는 경우, 대뇌 기저핵의, 외측 기저핵 원기 (LGE)가, 종뇌 신경 표피상에 우선적으로 유도된다. 한편, SAG를 비교적 고농도 (예를 들어 100 nM-10μm, 바람직하게는 250 nM-1μm)로 사용하는 경우, 대뇌 기저핵의, 내측 기저핵 원기 (MGE)가, 종뇌 신경 표피상에 우선적으로 유도된다.
Shh 시그널 작동약 처리에 제공하는 세포 응집체는, 바람직하게는, 종뇌 마커 양성 세포 응집체이다. Shh 시그널 작동약 처리 (Shh 시그널 작동약을 포함하는 배지 안에서의 배양)는, 제 1의 배양 공정, 제 2의 배양 공정의 어느 하나 일방에 있어서 실행해도 되고, 그 양방에 있어서 실행해도 된다. Shh 시그널 작동약을 포함하는 배지 안에서의 배양은, 대뇌 기저핵 조직이 유도될 때까지의 모든 기간에 실행해도되고, 그 일부의 기간에만 실행해도 된다.
한 구현에 있어서, Shh 시그널 작동약처리는, 세포 응집체 중에 종뇌 마커가 발현하는, 제 1의 배양 공정의 후반부터, 제 2의 배양 공정의 전반에 걸친 3-10일간 (예, 7일간)에 일과성으로 행해진다.
대뇌 기저핵 또는 그 선구 조직의 유도는, 대뇌 기저핵조직 마커의 발현을 지표로하여 확인할 수 있다. 외측 기저핵 원기 (LGE) 마커로서는, Gsh2, GAD65를 들 수가 있다. 내측 기저핵 원기 (MGE) 마커로서는, Nkx2.1을 들 수가 있다.
대뇌 기저핵 또는 그 선구 조직의 유도에 필요로하는 시간은, 배양 조건이나, 다능성 간세포의 유래하는 포유 동물의 종류에 따라 변동하므로, 한 마디로 특정할 수 없지만, 인간 다능성 간세포를 사용한 경우, 제 2의 배양 공정의 개시부터, 예를 들어 24일 이후까지는, 응집체의 내부에, 대뇌 기저핵 또는 그 선구 조직이 유도된다. 한 구현에 있어서, 세포 응집체의 집단의 70% 이상에 있어서, 대뇌 기저핵 또는 그 선구 조직을 유도할 수 있다. 얻어진 세포 응집체의 집단중에서, 대뇌 기저핵 또는 그 선구 조직이 유도된 세포 응집체를 선택함으로써, 대뇌 기저핵 또는 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체를 얻을 수 있다.
바람직한 양태에 있어서, 본 방법에 의해 유도되는 대뇌 기저핵(또는 그 선구 조직) (예, LGE, MGE)는, 대뇌피질 (또는 그 선구 조직)과 1개의 세포 응집체 중에, 연속하여 형성된다. 즉, 얻어진 세포 응집체에 있어서의 연속한 신경 표피 중에, 대뇌 기저핵(또는 그 선구 조직) (예, LGE, MGE) 및 대뇌피질 (또는 그 선구 조직)이 형성된다. 한 구현에 있어서, 세포 응집체의 집단의 50% 이상에 있어서, 연속한 신경 표피 중에, 대뇌 기저핵(또는 그 선구 조직) (예, LGE, MGE) 및 대뇌피질 (또는 그 선구 조직)을 유도할 수 있다.
(9) 대뇌피질에 있어서의 축형성의 외인성 제어
상기 서술한 바와 같이, 본 발명 방법에 있어서는, 대뇌피질의 등배축 및 전후축이 자발적으로 형성된다. 한 구현에 있어서, 제 2의 배양 공정에 있어서 얻어지는, 세포 응집체에 포함되는 대뇌피질 뇌실대에 있어서, 후미측 마커 (CoupTF1, Lhx2 등)의 발현이, 한쪽 편에서는 보다 강하고, 반대측에서는 약한 구배를 나타내, 문측 마커 (예, Sp8)의 발현이, 후미측 마커와 역의 구배를 나타낸다. 대뇌피질의 문측의 특이성 획득에 중요하다는 것이 알려진 FGF8를 작용시킴으로써, 대뇌피질 뇌실대 전체를 문측화시킬 수 있다.
FGF8 처리는, 제 2의 배양 공정에 있어서 FGF8를 포함하는 배지를 사용하는 것에 따라 실시할 수가 있다. 배지 안의 FGF 농도는, 문측화의 달성에 충분한 농도이며, 통상, 10-1000 ng/ml, 바람직하게는 50-300 ng/ml이다.
FGF8 처리는, 제 2의 배양 공정의 전부 또는 일부에 있어서 실시된다.
대뇌피질 뇌실대 전체가 문측화된 것은, 후미측 마커 (CoupTF1, Lhx2 등)의 발현의 전체적 희박화, 및 문측 마커 (예, Sp8)의 뇌실대 전체에 걸치는 상승 등에 의해 확인할 수 있다. 이것은, FGF8 처리에 의해, 대뇌피질의 등배축으로 따른 전두엽과 후두엽등의 영역을 선택적으로 제어되고 유도될 수 있는 가능성을 나타낸다.
(10) 해마 뉴런의 유도
상기 (5) 내지 (7)의 어느 하나 방법에 의해 얻어지는 해마 또는 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체를 분산해, 분산한 세포를 더욱 인비트로로 접착 배양함으로써, 성숙한 해마 뉴런을 얻을 수 있다. 본 발명은, 이와 같은 해마 뉴런의 제조 방법도 제공한다.
당해 제조 방법에 있어서는, 바람직하게는, 상기 (7) 방법에 의해 얻어지는 해마 또는 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체 (치상회 조직 (또는 그 선구 조직) 및 Ammon 뿔 조직 (또는 그 선구 조직)을 연속적으로 포함하는, 해마 조직 또는 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체)가 사용된다.
해마 또는 그 선구 조직을 포함하는 세포 응집체를, 적절한 세포 해리액으로 처리해, 단일 세포, 또는 이것에 가까운 상태까지 분산한다. 세포 해리액으로서는, 예를 들어, EDTA 등의 킬레이트；파파인, 트립신, 콜라게나제 IV, 메탈로프로테아제등의 단백 분해 효소등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 포함하는 생리적 수용액을 사용할 수 있다.
분산된 세포를, 그 세포를 배양하기 위한 적절한 배지 안에 부유해, 배양 용기중에 파종한다. 배양 용기로서는, 세포의 접착 배양에 일반적으로 사용되는 접착성의 배양 기재를 사용할 수 있다. 배양 기재로서는, 예를 들어, 샬레, 페트리 디쉬, 플라스크, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드등을 들 수가 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
세포와의 접착성을 향상시키기 위해, 배양 용기의 표면을, 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐, 기저막 표품등의 세포외 매트릭스；폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 폴리-L-오르니틴등의 폴리머에 의한 코팅해도 된다. 한 구현에 있어서, 배양 용기의 표면을 직접 또는 간접적으로 라미닌 및 피브로넥틴에 의해 코팅한다. 간접적인 코팅은, 예를 들어, 배양 용기의 표면을 먼저, 폴리-L-리신으로 코팅함으로써, 폴리-L-리신의 하층 코팅을 형성하고, 그 하층 코팅 위에, 라미닌 및 피브로넥틴을 코팅함으로써 실시할 수가 있다.
분산된 세포의 접착 배양에 사용하는 배지는, 동물세포 (바람직하게는 신경세포)의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어 DMEM, Ham F-12, Neurobasal, IMDM, M199, EMEM,αMEM, Fischer Medium 및 이들의 혼합 배지 등, 동물세포 (바람직하게는 신경세포)의 배양에 사용할 수 있는 배지이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, Neurobasal이 사용된다.
그 배지는, 해마 뉴런의 성숙을 촉진하기 위해, 혈청 대체물로서 B27 서플리먼트를 포함하는 것이 바람직하다. B27 서플리먼트는, 비오틴, L-카르니틴, 코르티코스테론, 에탄올아민, D(＋) 갈락토오스, 환원형 글루타티온, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신, 레티닐 아세트산, 셀레늄, 트리요도-l-티로닌, 비타민 E, 비타민 E 아세트산염, 소 알부민, 카탈라제, 인슐린, 수퍼옥시드 디스뮤타제, 트랜스페린등을 포함하는 공지된 조성물이다. 또한, 해마 뉴런의 성숙을 저해하지 않기 위해, 그 조성물로부터 레티닐 아세트산을 제외한, 비타민 A가 없는 B27 서플리먼트를 사용하는 것이 바람직하다. B27 서플리먼트의 첨가량은, 해마 뉴런의 성숙이 촉진되도록, 적절히 설정할 수 있다.
한 구현에 있어서, 해마 뉴런의 성숙을 촉진하기 위해, 그 배지는 BDNF를 포함해도 된다. BDNF를 포함하는 경우, 배지 안의 BDNF 농도는, 해마 뉴런의 성숙을 촉진하는 한 특별히 한정되지 않지만, 통상 1 ng/ml이상, 바람직하게는 10 ng/ml이상, 보다 바람직하게는 20 ng/ml이상이다. BDNF 농도의 상한치는, 해마 뉴런의 성숙을 촉진하는 한 특별히 한정되지 않지만, 과잉으로 첨가해도 활성이 포화되기 때문에, 통상 1000 ng/ml 이하, 바람직하게는 100 ng/ml 이하의 농도로 하는 것이 바람직하다. BDNF는, 바람직하게는 단리되고 있다.
한 구현에 있어서, 해마 뉴런의 성숙을 촉진하기 위해, 그 배지는 NT-3을 포함해도 된다. NT-3을 포함하는 경우, 배지 안의 NT-3 농도는, 해마 뉴런의 성숙을 촉진하는 한 특별히 한정되지 않지만, 통상 1 ng/ml이상, 바람직하게는 10 ng/ml이상, 보다 바람직하게는 20 ng/ml이상이다. NT-3 농도의 상한치는, 해마 뉴런의 성숙을 촉진하는 한 특별히 한정되지 않지만, 과잉으로 첨가해도 활성이 포화되기 때문에, 통상 1000 ng/ml 이하, 바람직하게는 100 ng/ml 이하의 농도로 하는 것이 바람직하다. NT-3은, 바람직하게는 단리되고 있다.
한 구현에 있어서, 그 배지는, 혈청을 포함하고 있어도 된다. 혈청은, 해마 뉴런의 성숙에 기여할 수 있다. 혈청으로서는, FBS 등을 들 수 있으나, 이것으로 한정되지 않는다. 혈청은 비활성화된 것이 바람직하다. 배지 안의 혈청 농도는, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있는 범위에서 적절히 조정할 수 있으나, 통상 1-20% (ｖ/ｖ)이다.
한 구현에 있어서, 그 배지는, 해마 뉴런의 성숙에 악영향을 주지 않는 범위에서, 다른 첨가물을 포함할 수 있다. 첨가물로서는, 예를 들어, 인슐린, 철 공급원 (예를 들어 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어 셀렌산 나트륨 등), 당류 (예를 들어 글루코오스 등), 유기산 (예를 들어 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어 알부민 등), 아미노산 (예를 들어 L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어 2-메르캅토에탄올 등), 비타민류 (예를 들어 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생 물질 (예를 들어 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어 HEPES 등) 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
바람직한 양태에 있어서, 분산된 세포의 접착 배양에 사용하는 배지는, B27 서플리먼트를 포함한다. 그 B27 서플리먼트는, 바람직하게는, 비타민 A-프리 (free)이다. 그 배지는, 더욱, FBS 및 L-글루타민을 포함할 수 있다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 분산된 세포의 접착 배양에 사용하는 배지는, B27 서플리먼트, BDNF 및 NT-3을 포함한다. 그 B27 서플리먼트는, 바람직하게는, 비타민 A-프리이다. 그 배지는, 더욱, FBS 및 L-글루타민을 포함할 수 있다.
분산한 세포의 세포사를 억제하기 위해서, Rho-회합 코일드-코일 키나아제 (ROCK)의 저해제를 접착 배양 개시시부터 첨가해도 된다. ROCK 저해제를 배양 개시부터 예를 들어 15일 이내, 바람직하게는 10일 이내, 보다 바람직하게는 6일 이내 첨가한다. ROCK 저해제로서는, Y-27632 ((＋)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카복사미드 2염산) 등을 들 수가 있다. 접착 배양에 사용되는 ROCK 저해제의 농도는, 세포사를 억제할 수 있는 농도이다. 예를 들어, Y-27632에 대해, 이와 같은 농도는, 통상 약 0.1-200μm, 바람직하게는 약 2-50μm이다. ROCK 저해제의 농도를 첨가하는 기간 내에 변동시켜도 되고, 예를 들어 기간의 후반에 농도를 반감시킬 수 있다.
분산한 세포의 접착 배양에 있어서의 배양 온도, CO2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30-40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1-10%, 바람직하게는 약 5%이다.
접착 배양을 개시해, 2-3일 이내에, 파종한 세포는 배양 용기의 표면에 접착해, 신경돌기를 신장시키기 시작한다.
분산한 세포의 접착 배양의 기간은, 분산한 세포의 성숙한 해마 뉴런으로의 분화에 충분한 기간인 한, 특별히 한정되지 않지만, 통상 50일 이상, 바람직하게는 80일 이상, 보다 바람직하게는 100일 이상이다.
한 구현에 있어서, 분산한 세포의 접착 배양을, 성숙한 해마 뉴런이 출현할 때까지 실시한다. 성숙한 해마 뉴런의 출현은, 해마 뉴런 특이적 마커에 의해 확인할 수가 있다. 성숙한 해마 뉴런은, 예를 들어, Zbtb20 및 Foxg1 양성이며, 또한 MAP2 양성의 수상돌기를 갖는 세포로서 특정할 수 있다. 따라서, 한 구현에 있어서, Zbtb20 및 Foxg1 양성이며, 또한 MAP2 양성의 수상돌기를 갖는 세포의 출현이 확인될 때까지, 분산한 세포의 접착 배양을 실시한다.
상기 성숙한 해마 뉴런에는, 해마치상회의 과립 세포 (Prox1 양성, 원 형태로 비교적 작은 세포), 및 해마 CA3 영역의 피라미드 세포 (KA1 양성, 비교적 큰 세포)가 포함된다.
해마 뉴런에 추가해, Zbtb20 및 GFAP 양성의 아스트로사이트가 유도될 수 있다. 본 발명은, 당해 아스트로사이트의 제조 방법도 제공한다.
단일 세포로 분산한 세포는 작은 덩어리를 형성하기 쉽고, 유도된 성숙한 해마 뉴런간에 신경돌기가 신장된다.
이와 같이 하여 유도된 성숙한 해마 뉴런은 기능적이고, 전위 자극에 의한 나트륨 및 칼륨 전류 응답, 유발성 활동 전위, 및/또는 자발성 흥분성 시냅스 후 전류 (sEPSC)를 일으킨다. 이들의 신경 활동은, 패치 클램프법을 사용하여 확인할 수가 있다.
유도된 성숙한 해마 뉴런은, 그대로 기능 해석 등에 사용할 수도 있고 또는 적절한 세포 해리액으로 배양 용기로부터 박리해, 단리할 수도 있다.
(11) 세포 응집체, 단리된 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직의 용도
추가적인 국면에 있어서, 상기에 의해 얻어진 세포 응집체로부터 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직을 단리할 수 있다. 본 발명은 상기 본 발명 방법에 의해 얻어진 세포 응집체, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 및 그 선구 조직을 제공한다. 추가적인 양태에 있어서, 본 발명은 상기 본 발명 방법에 의해 얻어지는 해마 뉴런을 제공한다.
본 발명 방법에 의해 얻어진 세포 응집체, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 그들의 선구 조직, 및 해마 뉴런은, 이식 치료를 위해서 사용할 수 있다. 예를 들어, 종뇌 (대뇌피질, 대뇌 기저핵, 맥락막, 해마 등)의 장해에 따른 질환의 치료약으로서 혹은 종뇌 (대뇌피질, 대뇌 기저핵, 맥락막, 해마 등)의 손상 상태에 있어서, 해당하는 손상 부분을 보충하기 위해서, 본 발명 방법에 의해 얻어진 세포 응집체, 종뇌 혹은 그 부분 조직 (대뇌피질, 대뇌 기저핵, 맥락막, 해마 등), 그들의 선구 조직, 또는 해마 뉴런을 사용할 수 있다. 종뇌의 장해에 따른 질환, 또는 종뇌의 손상 상태의 환자에게, 본 발명에 의해 얻어진 세포 응집체, 종뇌 혹은 그 부분 조직 (대뇌피질, 대뇌 기저핵, 맥락막, 해마 등), 그들의 선구 조직, 또는 해마 뉴런을 이식함으로써, 종뇌의 장해에 따른 질환, 또는 종뇌의 손상 상태를 치료할 수 있다. 종뇌의 장해에 따른 질환으로서는, 파킨슨병, 헌팅턴 무도병, 알츠하이머 병, 허혈성뇌질환 (예를 들어, 뇌졸중), 간질, 뇌외상, 운동신경 질환, 신경 변성 질환 등을 들 수 있다. 나아가 이들 세포의 보충이 소망되는 상태로서는, 뇌 외과 수술 후(예를 들어, 뇌종양 적출 후)를 들 수 있다.
이식 치료에 있어서는, 조직 적합성 항원의 차이에 의한 거부가 자주 문제가 되지만, 이식의 수취인의 체세포로부터 수립한 다능성 간세포 (예, 유도 다능성 간세포)를 사용하여 당해 문제를 극복할 수 있다. 즉, 바람직한 양태에 있어서, 본 발명 방법에 있어서, 다능성 간세포로서 수취인의 체세포로부터 수립한 다능성 간세포 (예, 유도 다능성 간세포)를 사용하여, 당해 수취인에 대해 면역학적 자기의 종뇌 혹은 그 부분 조직, 그들의 선구 조직, 또는 해마 뉴런을 제조해, 이것이 당해 수취인에 이식된다.
나아가 본 발명에 의해 얻어진 세포 응집체, 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또 그들의 선구 조직, 또는 해마 뉴런을 약물의 스크리닝이나 평가를 위해 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 의해 얻어지는 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직은, 생체에 있어서의 종뇌 혹은 그 부분 조직, 또는 그 선구 조직과 매우 유사한 고차 구조를 가지므로, 종뇌의 장해에 따른 질환이나, 종뇌의 손상 상태의 치료약의 스크리닝, 의약품의 부작용 및 독성 시험 (예, 각막 자극 시험의 대체 시험), 종뇌에 있어서의 질환의 새로운 치료 방법의 개발 등에 적용할 수 있다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 실시예는 본 발명의 단순한 예시를 나타내는 것에 지나지 않고, 본 발명의 범위가 이제 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1]
인간 다능성 간세포 로부터의 선택적인 대뇌피질 선구 조직의 입체 형성
(방법)
인간 ES 세포 (KhES-1；종뇌 특이적 유전자 Foxg1에 형광 단백 유전자 Venus를 노크 인한 것)를 트립신 처리에 의해 단일 세포에 분산해, SFEBq법 (Nakano et al, Cell Stem Cell, 2012)에 준해 응집체를 형성해, 분화 유도를 위한 부유 응집체 배양을 37℃, 5% CO2 존재하에 실시했다. 분산한 9000개의 인간 ES 세포를, 저세포 흡착성의 표면 코트를 한 V 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 파종하고, 분화 유도용의 배양액으로, 성장 인자를 포함하지 않는 G-MEM 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 20%KSR (녹아웃 혈청 대체물), 0.1 mM 비필수 아미노산 용액 (Gibco/Invitrogen 사), 1 mM 피루브산 나트륨 용액 (Sigma사) 및 0.1 mM 2-메르캅토에탄올을 첨가한 것을 사용한다. 분화 유도의 최초의 3일간은 분산 야기성 세포사를 억제하기 위해서 ROCK 저해제 Y-27632를 20 μM첨가하고, 다음의 3일간은 그 농도를 반감시켜 작용시켰다. 분화 유도 개시 후 0일째부터 18일째까지 Wnt 시그널 저해제 IWR-1-엔도를 3 μm, TGFβ 시그널 저해제 SB431542 를 5 μM 첨가해 작용시켰다. 분화 유도 개시 후 18일째에, 이들의 응집체를 저세포 흡착성의 표면 코트를 한 9 cm 페트리접시로 옮겨, 부유 배양을 37℃, 5% CO2, 40% O2 존재하에 실시했다. 18일째부터 35일째까지는 DMEM/F12 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 1%의 N2 서플리먼트 (Gibco/Invitrogen 사), 1%의 지방질 농축물 (화학적으로 결정된 지방질 농축물, Gibco/Invitrogen 사)을 첨가한 것을 사용한다. 35일째 이후는, 이들의 배양액에, 나아가 10%FBS, 5 μg/ml의 헤파린, 1%의 마트리겔 그로스 팩터 리듀스드 (Matrigel growth factor reduced; BD Bioscience사)를 첨가한 것을 사용한다. 이들의 응집체는, 분화 유도 개시 후 1일째 및 34일째에 분석을 실시해, 42일째에 면역 조직 염색으로 해석했다.
(결과)
분화 유도 개시 18일 후부터, 응집체에 Foxg1::venus의 형광이 강하게 관찰되었다. 분화 유도 개시 26일 후에는, 90% 이상의 응집체에서 양호한 재현성으로 Foxg1::venus의 형광이 강하게 관찰되었다 (도 1 A). 분화 유도 개시 34일 후에는, 전체 세포의 75% 이상의 세포에서 Foxg1::venus의 형광이 관찰되었다. 또 모든 응집체는 Foxg1::venus 양성이었다 (도 1 B). Foxg1:venus 양성 응집체는, 내부에 뇌실-유사의 공동을 가진 반구상의 신경 표피-유사 구조 (가성중층 원기둥 표피)를 나타냈다. 이들의 신경 표피 구조는, 관강측에 Pax6 양성 및 Sox2 양성의 세포 밀도가 높은 세포층을 가지고 (도 1 D, E), 가장 안쪽의 부분에 인산화히스톤 H3 양성의 유사분열 세포가 나타났다 (도 1 F). 이들의 구조는 인간 임신 초기의 대뇌피질의 뇌실대에 유사한 것이다. 뇌실대에 유사한 세포층의 외측에는, 유사분열 후의 신경세포의 마커인 Tuj1가 발현하고, 대뇌피질의 초기 피질판 마커인 Ctip2와 Tbr1가 발현하고 있었다. 또 이들은, 대뇌피질의 제 1층의 신경세포인 Reelin 양성 Cajal-Retzius 세포를 포함하고, 표층 가까운 곳에는 Laminin를 많이 포함한 층을 가지고 있었다. 요컨대, 이와 같이 배양한 응집체 안에 대뇌피질 선구 조직이 형성되어 있음이 발견되었다. 이와 같이 인간 임신 초기의 대뇌피질 선구 조직을 자기 형성하는 것이 양호한 재현성으로 관측되었다.
[실시예 2]
인간 다능성 간세포 로부터의 대뇌 기저핵 선구 조직의 입체 형성
(방법)
분화 유도 35일째까지 실시예 1의 배양 조건과 마찬가지로 배양했다. 즉, 인간 ES 세포 응집체를 분화 유도 18일 후까지 V 바닥 96 구멍 플레이트에서 배양한 후, 부유 응집체를 세포 비흡착성의 페트리 디쉬 (직경 9 cm)로 옮겨, 분화 유도 18일부터 35일째까지 부유 배양을 37℃, 5% CO2, 40% O2 존재하에서 실시했다. 단, 실시예 1의 배양액에 15일째부터 21일째의 기간만, Sonic hedgehog (Shh) 시그널 작동약 SAG를 30 nM 또는 500 nM의 최종 농도로 첨가해 작용시켰다. 이들의 응집체는, 35일째에 면역 조직 염색으로 해석했다.
(결과)
Shh 시그널 작동약 SAG를 30 nM를 작용시켰을 경우, Foxg1::venus 양성의 종뇌 신경 표피에는, Gsh2를 발현하는 외측 기저핵 원기 (LGE)가 형성된다 (도 2 A, B의 화살표 머리). Gsh2 양성의 LGE 신경 표피는 이 조건하에 있어서 70% 이상의 응집체에서 양호한 재현성으로 관측되었다. 태아의 LGE는 GABA 작동성 신경세포인 선체 신경세포를 생성한다. 동일하게, 인간 ES 세포 유래의 LGE 신경 표피의 바로 아래에는, GAD65 양성의 GABA 작동성 신경세포가 관측되었다 (도 2 B).
한편, Shh 시그널 작동약 SAG 500 nM를 작용시켰을 경우, 응집체의 Foxg1::venus 양성의 종뇌 신경 표피는, Nkx2.1을 발현하는 내측 기저핵 원기 (MGE)를 형성했다 (도 2 C, D). Foxg1::venus 양성 및 Nkx2.1 양성의 MGE 신경 표피는 이 조건하에 있어서 80% 이상의 응집체에서 양호한 재현성으로 관측되었다. 태아뇌에서는, MGE는 담창구나 대뇌피질 인터뉴런의 선구 조직이다. 이와 같이, 본 배양법에 의해 대뇌 기저핵 선구 조직인 LGE나 MGE를 고효율로 유도할 수 있는 것이 나타났다.
[실시예 3]
대뇌피질과 대뇌 기저핵의 연속적인 입체 형성
(방법)
분화 유도 35일째까지 실시예 2의 배양 조건과 마찬가지로 배양했다. 즉, 인간 ES 세포 응집체를 분화 유도 18일 이후까지 V 바닥 96 구멍 플레이트에서 배양한 후, 부유 응집체를 세포 비흡착성의 페트리 디쉬 (직경 9 cm)로 옮겨, 분화 유도 18일부터 35일째까지의 부유 배양을 37℃, 5% CO2, 40% O2 존재하에서 실시했다. 분화 배양 15일째부터 21일째의 기간만, Shh 시그널 작동약 SAG를 30 nM의 농도로 배양액에 첨가했다. 이들의 응집체는, 35일째에 면역 조직 염색으로 해석했다.
(결과)
실시예 2에 나타낸 것처럼, Shh 시그널 작동약 SAG를 30 nM 작용시켰을 경우, 종뇌 신경 표피는 Foxg1::venus 양성이고, 외측 기저핵 원기 (LGE)의 마커인 Gsh2, GAD65를 발현했다 (도 3 A, B). 이들의 LGE 신경 표피는, Gsh2 에 음성이고 대뇌피질의 마커인 Pax6 양성의 대뇌피질 신경 표피와 연속해 형성되고 있었다 (도 3 C). 요컨대 이들의 결과는, 대뇌피질과 대뇌 기저핵이 하나의 응집체 안에 연속해 형성되어 있음을 나타내고 있다. 이와 같이, 대뇌피질과 대뇌 기저핵이 하나의 응집체 안에 연속해 자기 형성하는 것은, 50% 이상의 응집체에서 양호한 재현성으로 관측되었다.
[실시예 4]
인간 다능성 간세포 로부터의 선택적인 맥락막 조직의 입체 형성
(방법)
분화 유도 18일 이후까지 실시예 1의 배양 조건으로 V 바닥 96 구멍 플레이트에서 배양한 후, 부유 응집체를 세포 비흡착성의 페트리 디쉬 (직경 9 cm)로 옮겨, 부유 배양을 37℃, 5% CO2, 40% O2 존재하에서 실시했다. 배양액은, 18일째부터 42일째까지는, DMEM/F12 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 1% N2 서플리먼트 (Gibco/Invitrogen 사), 1% 지방질 농축물 (화학적으로 결정된 지방질 농축물, Gibco/Invitrogen 사), 10%FBS, 5 μg/ml 헤파린, 3 μm GSK-3β 저해제 CHIR99021, 0.5 nM BMP4를 더한 것을 사용하여 배양하고, 42일째에 면역 조직 염색으로 해석했다.
(결과)
상기의 조건으로 배양했을 경우, 분화 유도 개시 18일째 이후도 응집체에 Bf1(Foxg1)::venus의 강한 형광은 관찰되지 않았다. 이들의 응집체는 러플링된 상태의 단층 표피를 형성하여, 맥락막의 마커인 TTR, Lmx1a, Otx2를 발현하고 있는 (도 4 A, B) 것으로부터, 맥락막 조직이 유도된 것으로 생각되었다. 이 조건하에서 맥락막 조직을 자기 형성하는 것은, 80% 이상의 응집체에서 양호한 재현성으로 관측되었다.
[실시예 5]
인간 다능성 간세포 로부터의 선택적인 피질의 가장자리 ( 핌브리아 선구 조직)의 형성
(방법)
분화 유도 18일 이후까지 실시예 1의 배양 조건으로 V 바닥 96 구멍 플레이트에서 배양한 후, 부유 응집체를 세포 비흡착성의 페트리 디쉬 (직경 9 cm)로 옮겨, 부유 배양을 37℃, 5% CO2, 40% O2 존재하에서 실시했다. 배양액은, 18일째부터 42일째까지는, DMEM/F12 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 1% N2 서플리먼트 (Gibco/Invitrogen 사), 1% 지방질 농축물 (화학적으로 결정된 지방질 농축물, Gibco/Invitrogen 사), 10%FBS, 5 μg/ml 헤파린, 3 μm GSK-3β 저해제 CHIR99021(Wnt 시그널 증강제)를 더한 것을 사용하여 배양해, 42일째에 면역 조직 염색으로 해석했다.
(결과)
상기와 같이 18일째 이후 Wnt 시그널을 증강한 조건으로 배양했을 경우, 피질의 가장자리의 마커의 Lmx1a, Otx2가 발현하고 Foxg1::venus 약양성인 신경 표피가 주체인 응집체가 형성되었다 (도 5 A, B). 이 신경 표피는 맥락막 마커의 TTR를 발현하지 않았다 (도 5 A). 이들의 마커 발현 프로필로부터, 이 조건에서는 핌브리아의 선구 조직인 피질의 가장자리가 선택적으로 유도되었다고 생각된다. 이 조건하에서, 피질의 가장자리의 선택적인 형성하는 것은, 80% 이상의 응집체에서 양호한 재현성으로 관측되었다.
[실시예 6]
맥락막과 해마 선구 조직과 대뇌피질 선구 조직의 연속적인 입체 형성
(방법)
분화 유도 18일 이후까지 실시예 1의 배양 조건으로 V 바닥 96 구멍 플레이트에서 배양한 후, 부유 응집체를 세포 비흡착성의 페트리 디쉬 (직경 9 cm)로 옮겨, 부유 배양을 37℃, 5% CO2, 40% O2 존재하에서 실시했다. 배양액은, 18일째부터 35일째까지는, DMEM/F12 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 1% N2 서플리먼트 (Gibco/Invitrogen 사), 1% 지방질 농축물 (화학적으로 결정된 지방질 농축물, Gibco/Invitrogen 사), 10%FBS, 5 μg/ml 헤파린을 더한 것을 사용하여 배양했다. 단, 18일째부터 21일째의 기간만, 이들의 배양액에 3 μm GSK-3β 저해제 CHIR99021, 0.5 nM BMP4를 첨가해 작용시켰다. 이들의 물질은, 실시예 4 및 5에 보여지듯이, 맥락막 및 피질 가장자리에 대한 분화를 촉진하지만, 실시예 6의 배양에서는, 이들의 작용을 3일간으로 한정해, 21일째 이후의 배양으로부터는 이들을 제거했다. 이들의 응집체는 35일째에 면역 조직 염색으로 해석했다.
(결과)
상기와 같이, 일과성으로 Wnt 시그널과 BMP 시그널을 증강해, 그 후에 그것들을 제거한 조건으로 배양했을 경우, 배양 21-27일째의 응집체에는, Foxg1::venus 양성의 신경 표피와 Foxg1::venus 음성의 신경 표피의 양자가 형성되고(도 6 A), 그것들은 연속한 신경 표피를 구성하고 있었다. 이와 같은 Foxg1::venus 양성과 음성의 신경 표피의 양자를 인접해 포함하는 상태는, 80% 이상의 응집체에서 양호한 재현성으로 관측되었다. Foxg1::venus 음성의 신경 표피는, 응집체로부터 밖에 돌출하는 구조를 취하고, 그 선단은 반구모양의 구조를 가지고 있었다. 분화 유도 개시 35일째에 있어서, 이들의 응집체에서는, Lmx1a에 양성이고 Foxg1::venus에 음성인 맥락막 영역, Lmx1a, Otx2를 발현하고 Foxg1::venus 약양성인 피질의 가장자리의 영역, Lef1 양성이고 Foxg1::venus가 양성의 해마 선구 조직의 영역, Lef1 에 음성이고 Foxg1::venus 양성의 대뇌피질 선구 조직이 연속적으로 형성되고 있었다 (도 6 B, C). 이와 같이, 맥락막과 해마 선구 조직과 대뇌피질 선구 조직이 하나의 응집체 안에 연속해 자기 형성하는 것은, 80% 이상의 응집체에서 양호한 재현성으로 관측되었다.
[실시예 7-1]
해마 조직내의 각 영역의 연속적인 입체 형성
(방법)
분화 유도 18일 이후까지 실시예 1의 배양 조건으로 V 바닥 96 구멍 플레이트에서 배양한 후, 부유 응집체를 세포 비흡착성의 페트리 디쉬 (직경 9 cm)로 옮겨, 부유 배양을 37℃, 5% CO2, 40% O2 존재하에서 실시했다. 배양액은, 18일째 이후는, 하기의 2개 배지중 어느 하나를 사용하여 배양을 실시했다.
1) DMEM/F12 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 1% N2 서플리먼트 (Gibco/Invitrogen 사), 1% 지방질 농축물 (화학적으로 결정된 지방질 농축물, Gibco/Invitrogen 사), 10%FBS 및 5 μg/ml 헤파린을 더한 것
2) Neurobasal 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 비타민 A-프리의 2% B27 서플리먼트 (Gibco/Invitrogen 사), 2 mM L-글루타민 및 10% FBS를 더한 것.
단, 실시예 6과 마찬가지로, 18일째부터 21일째의 기간만, 이들의 배양액에 3 μm GSK-3β 저해제 CHIR99021 및 0.5 nM BMP4를 첨가해 작용시켰다. 이들의 응집체는 61일째 및 75일째에 면역 조직 염색으로 해석했다.
(결과)
상기의 1) 및 2)의 어느 배양액을 사용한 배양에서도, 61일째까지 계속해 배양했을 경우, 응집체에는 해마 선구 조직 마커인 Lef1 양성 및 Foxg1::venus 양성의 신경 표피가 형성된다 (도 7 A, B). 이들의 신경 표피는 해마 선구 조직 마커인 Nrp2 양성의 신경세포를 많이 포함하고 있었다 (도 7 D). 또 신경 표피는 해마 신경세포 및 선구 세포의 마커인 Zbtb20 양성의 세포도 많이 포함하고 있었다 (도 7 C). 태아의 해마 선구 조직에서는, 신경 표피의 뇌실대 및 뇌실하대의 Zbtb20의 발현은 치상회 (맥락막이나 피질의 가장자리에 인접하는 부분)의 선구 조직에서 강하고, Ammon 뿔 (맥락막이나 피질의 가장자리로부터 먼 부분)의 선구 조직에서 약한 발현 강도의 구배를 볼 수 있다. 동일하게, 인간 ES 세포로부터 형성한 Lef1 양성 신경 표피에서도 Zbtb20의 발현은 맥락막 (Lmx1a 양성, Foxg1::venus는 음성) 및 피질의 가장자리 (Lmx1a 양성, Foxg1::venus는 약양성)의 영역과 인접하는 부분에서 강하고, 이들로부터 멀어짐에 따라 약해진다고하는 발현 강도의 구배를 볼 수 있었다 (도 7 A, B, C). 추가로 배양을 동조건으로 75일째까지 계속하면, 치상회 신경세포에 특징적인 Zbtb20와 Prox1를 함께 발현하는 영역 (도 7 E, DG)이, Zbtb20 약양성의 Ammon 뿔 영역 (도 7 E, CA)과 피질의 가장자리 (도 7 E, hem) 및 맥락막 (도 7 E, CP)의 사이에 형성됨이 확인되었다. 이들은 해마 조직내에 있어서 치상회 조직 및 Ammon 뿔 조직이 될 수 있는 영역이 연속적으로 형성되어 있음을 나타내고 있다.
[실시예 7-2]
해마 조직내의 각 영역의 연속적인 입체 형성 및 분산 배양에 의해 수득 가능한 성숙한 해마 뉴런
(방법)
실시예 7-1의 방법에 의해 연속한 해마 조직을 유도해, Day60-90의 사이에 얻어진 세포 응집체를 파파인 효소액 (SUMITOMO BAKELITE, MB-X9901)등의 세포 해리액에서 단일 세포로 분산시켜, 그 세포를 유리제의 디쉬나 슬라이드 등에 파종해 평면 배양을 실시했다. 배양을 실시하기 전에 유리의 표면을 폴리-D-리신 200μg/ml로 4℃에서 하룻밤, 라미닌 20μg/ml/피브로넥틴 8μg/ml로 37℃에서 하룻밤 코팅했다.
배양액은 Neurobasal 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 비타민 A-프리의 2% B27 서플리먼트 (Gibco/Invitrogen 사), 2 mM L-글루타민 및 10% FBS를 더한 것을 사용한다. 이들의 평면 조건으로 배양한 세포는, 분산 후 2-3일 이내에 유리의 표면에 붙어, 신경돌기를 늘리기 시작했다. d140로부터 d197의 사이에 면역 조직 염색으로 해석했다.
(결과)
단일 세포로 분산한 세포는 작은 응집체를 형성하기 쉽고, 그 뉴런간에 신경돌기가 신장되고 있었다 (도 8 A). 대부분의 세포가 해마 마커인 Zbtb20는 양성이며 (도 8 B), Foxg1::venus도 Day197 시점에서 양성이었다 (도 8 B). MAP2 양성의 수상돌기를 가지는 뉴런 이외에 산재하는 세포가 보여졌지만, 이들의 세포 또한 Zbtb20(+)로, 세포의 형태는 신경교 세포와 같고, GFAP 양성으로, 아스트로사이트인것이 시사되었다 (도 8 C). Zbtb20 양성 세포 안에는, 해마의 치상회 마커인 Prox1 양성 세포와 해마의 CA3 영역 마커인 KA1 양성의 세포를 볼 수 있고, Prox1 양성 세포는 과립 세포를 시사하는 원 형태로 비교적 작은 세포인 한편, KA1 양성 세포는 비교적 큰 피라미드 세포-유사의 형태를 하고 있었다 (도 8 D-E). 이것은 생체내에서 볼 수 있는, 치상회에는 과립 세포가, CA 영역에서는 피라미드 세포가 형성되는 것과 일치한다고 생각되었다. Zbtb20 양성의 세포 비율은 80% 전후로, 이 발현율은 양호한 재현성으로 관측되었다.
이들의 결과, 즉 마커의 발현과 세포 형태로부터, 해마치상회의 과립 세포 및 해마 CA3 영역의 피라미드 세포를 유도 가능함이 시사되었다.
[실시예 7-3]
3 차원에서 유도한 해마 조직을 분산 배양하여 수득 가능한 성숙한 해마 뉴런의 기능 해석
(방법)
실시예 7-1과 동일한 방법에 의해, 연속한 해마 조직을 분산 배양했다. 본시험에 있어서는 유리제 혹은 플라스틱 제의 디쉬나 슬라이드 등에 파종해 평면 배양을 실시했다. 배양에는 유리 혹은 플라스틱의 표면을 폴리-D-리신 100μg/ml로 37℃에서 3시간, 라미닌 20μg/ml/피브로넥틴 8μg/ml로 37℃에서 하룻밤 코팅했다.
배양액은 분산 1-2일째는 Neurobasal 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 비타민 A-프리의 2% B27 서플리먼트 (Gibco/Invitrogen 사), 2 mM L-글루타민, 1% FBS, 20 ng/ml BDNF, 20 ng/ml NT-3, 및 10μm Y-27632를 더한 것을 사용한다. 배양 3일째 이후는, Neurobasal 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 비타민 A-프리의 2% B27 서플리먼트 (Gibco/Invitrogen 사), 2 mM L-글루타민, 10% FBS, BDNF 20 ng/ml, 및 NT-3 20 ng/ml를 더한 배지를 사용하여, 반량 배지 교환을 3일마다 1회 실시하였다. 분산 후 30-60일의 사이에, 세포를 fluo4-Am (life technologies, F-14201) 5μm 중에서 37℃에서 45분 인큐베이트해, 배지로 세정 후에 LCM를 사용한 칼슘 이미징에 의한 기능 해석을 실시했다. 또, 같은 방법으로 분산 배양한 세포로 패치 클램프법에 의한 전기 생리적 해석을 실시했다. 측정은 전체 세포 패치 클램프로 행해, 유리 전극 (전극 저항값 3-6 MΩ) 내를 내액용 버퍼(120 mM K-글루코네이트, 10 mM KCl, 10 mM EGTA, 및 10 mM Hepes 함유 버퍼를 KOH로 pH 7.2로 조정)으로, 챔버 내를 외액용 버퍼 (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM 글루코스, 1 mM NaH2PO4, 및 10 mM Hepes 함유 버퍼를 NaOH로 pH 7.4로 조정)으로 채운 후 유리 전극을 사용했다. 측정은 EPC10 (HEKA)로 실시했다. 모든 시험은 실온으로 실시했다. 막용량 성분 보정을 실시해, 직렬 저항값은 전극 저항값의 3배 이내가 되는 조건하에서 시험을 실시했다. 전위 의존성의 나트륨, 칼륨 전류는, -60 mV로 전위를 유지해, -80 mV로부터 +60 mV 까지 -10 mV씩의 자극에 따라 측정을 실시했다. sEPSC는 -60 mV로 전압을 유지했을 때의 시간 경과에 따른 전류를 측정하고, 약제는 DNQX (sigma, D0540)를 종농도 10μM로 사용했다. 활동 전위는 과분극 자극을 실시했을 때의 막전위를 측정했다.
(결과)
분산 후 30-31일 경과 후의 칼슘 이미징에서는, 많은 신경이 칼슘 유입에 수반하는 발화 활동을 나타내고 있고 (도 9 A, A'), 각 세포의 다양한 시간 경과적 활동 패턴을 확인할 수 있었다 (도 9 B). 분산 후 53일째에 시행한 패치 클램프에서는, 전위 자극에 의한 나트륨, 칼륨 전류 응답, 유발성 활동 전위, 및 자발성 흥분성 시냅스 후 전류 (spontaneous excitatory postsynaptic current; sEPSC)가 관측되었다 (도 9 C-E). 이 sEPSC는 AMPA형 글루타민산 수용체 안타고니스트인 DNQX에 의해 저해되는 것으로 확인되었다 (도 9 F).
이들의 실험에 의해, 실시예 7로 얻어진 신경세포에서는 자발적인 신경 활동을 볼 수 있고 또한 그 세포에서는 자극에 따른 활동을 나타내고 있어 시냅스 네트워크도 갖는 기능적인 신경을 얻을 수 있는 것이 시사되었다.
[실시예 8]
인간 다능성 간세포 로부터의 임신 중기형의 다층 구조를 가지는 대뇌피질의 입체 형성
(방법)
분화 유도 35일째까지 실시예 1의 배양 조건과 마찬가지로 배양했다. 즉, 인간 ES 세포 응집체를 분화 유도 18일 이후까지 V 바닥 96 구멍 플레이트에서 배양한 후, 부유 응집체를 세포 비흡착성의 페트리 디쉬 (직경 9 cm)로 옮겨, 분화 유도 18일째 이후의 부유 배양을 37℃, 5% CO2, 40% O2 존재하에서 실시했다. 장기간에 있어서 응집체를 건강하게 유지하기 위해서 35일째 이후는, 2주마다 1번 응집체를 반분하여, 실시예 1에 기재한 배양액으로 배양을 계속했다. 분화 유도 56일째 이후는, 산소 투과성의 높은 세포 비흡착성 배양 디쉬 (직경 6 cm, SARSTEDT사)에 세포덩어리를 옮겨 배양을 계속했다. 분화 유도 70일째 이후는, 마트리겔 그로스 팩터 리듀스드 (BD Bioscience사)의 농도를 2%로 변경해 배양을 계속했다. 이들의 응집체는, 70일째 및 91일째에 면역 조직 염색으로 해석했다.
(결과)
상기의 조건으로 배양했을 경우, 분화 유도 개시 70일째에 응집체는 형태적으로 분명한 층 구조를 나타냈다 (도 10 A-B'). 이 층 구조의 가장 표층에는 라미닌이 축적하고, Reelin 양성의 Cajal-Retzius 세포를 포함한 변연대가 형성되고 있었다 (도 10 C, C'). 변연대의 바로 아래에는 Tbr1 양성, Ctip2 양성의 심부 피질판의 신경세포를 포함하는 피질판이 관찰되었다 (도 10 D, D'). 이 시점에서는 천부 피질판의 마커인 Satb2를 발현한 신경세포는 적었다 (도 10 E). 세포 밀도가 높고 Pax6 양성 및 Sox2 양성의 신경 선구 세포를 포함한 세뇌실대 (도 10 F, F')와 그 위에 Tbr2 양성의 세포를 포함한 뇌실하대가 관강측에 형성되고 있었다 (도 10 G). 피질판과 뇌실하대의 사이에는 세포가 드물고, 임신 중기의 중간대와 잘 닮은 영역이 발달하고 있었다. 피질판의 바로 아래에는 Calretinin 양성 및 MAP2 양성의 신경돌기를 포함한 세포층이 형성되고 있었다 (도 10 H, H'). 이 세포층은 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 (CSPG)의 축적이 관찰되므로 (도 10 H"), 서브플레이트의 형성이 시사되었다. 분화 유도 개시 91일째에는, 이 다층 구조를 가진 대뇌피질 조직은 한층 더 두꺼워져 (도 10 I), 이 시기에 있어서도 발달한 Sox2 양성 또한 Pax6 양성의 뇌실대 및 Tbr2 양성의 뇌실하대를 가지고 있었다 (도 10 J, K, M). 피질판도 동일하게 두꺼워져 (도 10 I), Tbr1 양성, Ctip2 양성의 심부 피질판의 신경세포 뿐만이 아니라, Satb2 양성, Brn2 양성의 천부 피질판의 신경세포도 많이 포함되어 있는 것이 밝혀졌다 (도 10 L-O). 이 시점에 있어서도 Calretinin 양성의 서브플레이트는 피질판의 바로 아래에 관찰되었다 (도 10 P). 이와 같이, 본 배양법에 의해, 도 10 Q에 나타낸 바와 같은 표층-심부 축으로 따라 인간 임신 중기의 대뇌피질에서 보여지는 다층 구조를 갖는 조직을 입체 형성하는 것이 가능해졌다.
[실시예 9]
대뇌피질의 자발축형성과 그 외인성 제어
(방법)
분화 유도 42일째까지 실시예 1의 배양 조건과 마찬가지로 배양했다. 즉, 인간 ES 세포 응집체를 분화 유도 18일 이후까지 V 바닥 96 구멍 플레이트에서 배양한 후, 부유 응집체를 세포 비흡착성의 페트리 디쉬 (직경 9 cm)로 옮겨, 분화 유도 18일부터 42일째까지의 부유 배양을 37℃, 5% CO2, 40% O2 존재하에서 실시했다. 배양액은 실시예 1과 같은 것을 사용한다. 외인성 인자의 영향을 검토하고자 24일째부터 42일째에 이 배양액에 200 ng/mL의 FGF8b를 첨가해 작용시켰다. 어느 조건에 있어서도, 응집체는 42일째에 면역 조직 염색으로 해석했다.
(결과)
임신 초기의 대뇌피질 뇌실대에 있어서 발현이 후미측으로부터 문측에 걸쳐 구배를 형성하는 후미측 마커로서 CoupTF1나 Lhx2가 알려져 있다. 한편, 역의 구배를 나타내는 문측 마커로서 Sp8가 알려져 있다. 외인성 인자를 작용시키지 않는 경우에는, 인간 다능성 간세포로부터 유도한 대뇌피질 뇌실대에서도 후미측 마커의 CoupTF1가, 한쪽 편에서는 보다 강하고, 반대측에서는 약하게 발현하고 있었다 (도 11 A). 문측 마커인 Sp8의 발현은 CoupTF1와 역의 구배를 나타내고 (도 11 A), 다른 후미측 마커인 Lhx2의 발현은 CoupTF1와 같은 구배를 나타냈다 (도 11 B, C). 생체내의 종뇌조직에서는 대뇌피질의 후미측은 피질의 가장자리에 인접하고, 인간 다능성 간세포로부터 유도한 대뇌피질 뇌실대도, 후미측 마커의 CoupTF1나 Lhx2가 강하게 발현하는 영역이 피질의 가장자리 마커인 Zic1나 Otx2를 발현하는 영역과 인접해 형성되어 있었다 (도 11 D, E). 이들은, 이 조건하에 있어서 인간 다능성 간세포로부터 유도한 대뇌피질은 자발적으로 후미측으로부터 문측에 대한 극성을 자체 조직화적으로 획득한 것을 시사한다.
생체내에 있어서 대뇌피질의 문측의 특이성의 획득에는 FGF8가 중요하다는 것이 알려져 있다. 응집체의 배양에 외인성 인자를 작용시키지 않는 경우, 후미측 마커 CoupTF1의 발현이 약한 문측에서 FGF 시그널에 의해 유도되는 인산화 Erk가 강하게 축적했다 (도 11 F). 한편, 외인성의 FGF8b를 작용시킨 경우에는, CoupTF1의 발현이 전체적으로 희박화해, 반대로 Sp8의 발현이 뇌실대 전체에 걸쳐 상승했다 (도 11 G-I). 이들은, 외인성 시그널을 부가하는 것으로, 대뇌피질의 등배축 혹은 전후축에 따른 전두엽과 후두엽등의 영역성을 선택적으로 제어해, 유도할 수 있는 것을 시사한다.
[실시예 10]
(방법)
hESC의 유지 배양과 분화
인간 ES 세포 (KhES-1)는 일본 정부의 hESC 연구 지침에 따라 사용했다. hESC는 마이토마이신 C에 의해 불활성화된 MEF 세포를 피더로서 DMEM/F12 (Sigma)에 20% (vol/vol) 녹아웃 혈청 대체물 (KSR, Gibco/Invitrogen 사), 2 mM 글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산 용액 (Gibco/Invitrogen 사), 5 ng/ml 인간 재조합 bFGF (Wako), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (2-ME), 50 U/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신을 더한 것을 배지로서 사용하여, 37℃, 2% CO2 존재하에서 배양을 실시했다. 세포의 계대는, hESC를 0.25% 트립신, 0.1 mg/ml 콜라게나제 IV, 20% KSR, 1 mM CaCl2를 포함하는 PBS로 37℃에서 7분간 반응시켜, 덩어리인 채 피더 세포로부터 벗겨내었다. 벗긴 hESC의 덩어리는, 부드럽게 피펫팅해 작은 세포의 덩어리 (수십개의 세포)로 분쇄했다. 세포의 계대는 1:3 - 1:4 스플릿 비율로 실시했다.
SFEBq 배양을 위해, hESC를 0.05 mg/ml DNase I (Roche)와 10 μm Y-27632를 포함한 TrypLE Express (Gibco/Invitrogen 사)로 단일 세포에 분산해, 20 μm Y-27632를 포함한 대뇌피질 분화용 배지를 사용하여 저세포 흡착성의 표면 코트를 한 V 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 파종해 응집체를 형성했다. 대뇌피질 분화용 배지는, G-MEM 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 20%KSR (녹아웃 혈청 대체물), 0.1 mM 비필수 아미노산 용액 (Gibco/Invitrogen 사), 1 mM 피루브산 나트륨 용액 (Sigma사), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신을 첨가한 것을 사용한다. SFEBq 배양을 개시한 날을 0일째로 해, IWR1e (Wnt 저해제) 및 SB431542 (TGFβ 저해제)를 각각 3 μm 및 5 μm가 되도록 배양 0일째부터 18일째에 첨가했다.
hESC로부터 유도한 대뇌피질 신경 표피는, 다음의 조건으로 배양을 실시했다. 배양 18일째에, 세포 응집체를 저세포 흡착성의 표면 코트를 한 9 cm 페트리접시로 옮겨, DMEM/F12 배지 (Gibco/Invitrogen 사)에 1%의 N2 서플리먼트 (Gibco/Invitrogen 사), 1%의 지방질 농축물 (화학적으로 결정된 지방질 농축물, Gibco/Invitrogen 사), 0.25 mg/mL의 Fungizone, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신을 첨가한 것을 사용하여 37℃, 5% CO2, 40% O2 존재하에서 배양했다. 배양 35일째부터는, 10%FBS, 5 μg/ml의 헤파린, 1%의 마트리겔 그로스 팩터 리듀스드 (BD Bioscience사)를 배지에 추가했다. 세포 응집체의 중심부 분의 세포사를 억제하기 위해서, 배양 35일째 이후는 2주간 마다 실체 현미경하에서 예리한 핀셋을 사용하여 절반 크기로 절단하고, 56일째 이후는 lumox 배양 디쉬 (SARSTEDT; O2 투과성)를 사용하여 배양하였다. 배양 70일째 이후는, 마트리겔의 농도를 증가시키고 (최종 2%), B27 첨가물 (Gibco/Invitrogen 사)을 배지에 추가했다.
대뇌피질 신경 표피의 전방 유도화는, 배양 24-42일의 사이에 인간 재조합 FGF8b (Gibco, 200 ng/mL)를 첨가함으로써 실시했다. 세포 응집체는, 배양 42일째에 고정했다.
대뇌피질 신경 표피의 복측화는, 배양 15-21일의 사이에 헤지혹 작동약 SAG (30 nM 또는 500 nM)를 첨가함으로써 실시했다. 세포 응집체는, 배양 35일째에 고정했다.
(결과)
자체 조직화한 대뇌피질 NE 중 피질내 극성
개선된 SFEBq 배양법을 위해서 (도 18 A 및 A'), 분리한 9000개의 hESC를, 저세포 흡착성의 V 바닥 96 웰 플레이트 (문헌 15)의 각 웰에 파종해, Rho-키나아제 저해제 (Y-27632) (문헌 16)를 포함한 GMEM-KSR 배지로 배양을 실시했다 (도 18 A). 그 후, 세포덩어리를 저세포 흡착성 9 cm 배양접시로 옮겨, 40% O2 존재하에서 배양했다. 지방질 농축물 (18일째), 10%FBS, 헤파린, 저농도의 마트리겔 (1%) (35일째)의 첨가하여 뇌실대의 장기간의 유지 배양이 되도록하고, 최초의 18일간의 TGFβ 저해제 (SB43152)와 Wnt 저해제 (IWR1e)의 첨가는 종뇌영역의 효율적인 유도를 위해서 첨가했다.
본 개선한 배양 조건하에 있어서, 모든 hESC 유래 세포덩어리는 배양 26일째에는 foxg1::venus(종뇌 마커) (문헌 2) 양성의 신경 표피를 가지고 (도 12 A 및 도 18 B), 배양 34일째에는 전세포의 75% 이상의 세포가 foxg1::venus를 발현했다. 한편, 이전의 방법에서는 foxg1::venus 양성 세포는 전세포의 30-40%의 효율이었다 (도 12 B 및 도 18 C). foxg1::venus 양성의 신경 표피는, 내부에 뇌실-유사의 공동을 가진 반구상의 신경 표피-유사 구조 (가성중층 원기둥 표피)를 나타냈다 (도 12 C; 배양 42일째). 이들의 신경 표피 구조는, 관강측에 Pax6 양성 및 Sox2 양성의 세포 밀도가 높은 세포층을 가지고 (도 12 D 및 E), 가장 안쪽의 부분에 인산화 히스톤 H3 양성의 유사분열 세포가 발견되었다 (도 12 F). 이들의 구조는 인간 임신 초기의 대뇌피질의 뇌실대와 유사하다. 이 뇌실대에 유사한 세포층의 외측에는, 유사분열 후의 신경세포의 마커인 Tuj1를 발현하고 (CP; 도 12 G), 대뇌피질의 초기 피질판 마커인 Ctip2와 Tbr1를 발현하고 있다 (문헌 1, 2) (도 12 H 및 도 18 D). 또 이들의 신경세포층은 Reelin 양성 Cajal-Retzius 세포를 포함해 (도 12 I), 표층 가까운 곳에는 Laminin를 많이 포함한 층을 가지고 있었다 (도 12 J). 요컨대 hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피내에, 자체 조직화한 층 구조가 발생되었다.
흥미롭게도, 자체 조직화한 대뇌피질 신경 표피는 고빈도로 축 극성을 가지고 있었다. 태아뇌에 있어서 후미측으로부터 문복측에 발현 구배를 나타내는 (도 18 E 및 F) CoupTF1의 뇌실대에서의 발현은, hESC 유래의 신경 표피의 한쪽 편에서 발현이 높고, 반대로 문복측의 마커인 Sp8의 발현은, CoupTF1와는 상반되는 발현 구배를 나타냈다 (도 12 K, 흰색). 이 현상과 일치하게, Lhx2의 발현 (생체내에서는 등측으로부터 배측에 걸쳐 (dorsal-to-ventral) 발현 구배를 나타낸다)도 CoupTF1와 같은 측에서 강한 발현을 나타냈다 (도 12 L 및 도 18 G). CoupTF1와 Sp8가 상반되는 발현 구배는 배양 35일째에는 이미 관찰되고 있었다. 마우스 태아에서는, 대뇌피질의 후미측은, 장래 해마 영역의 핌브리아를 생성하는 피질의 가장자리에 인접하고 있다 (도 18 H-J). 이 현상과 일치하게, 피질 마커인 Otx2와 Zic1는 대뇌피질 신경 표피의 CoupTF1가 강하게 발현하는 측에 인접하는 영역에서 발현하고 있었다 (도 12 M 및 도 18 K).
이들의 결과는, hESC 유래의 신경 표피는 피질내의 후미측으로부터 문복측의 극성을 자발적으로 획득하는 것을 나타내고 있다. 마우스 태아에서는, FGF8가 대뇌피질의 문측화를 유도한다 (문헌 17). 흥미롭게도, 인산화 Erk (FGF 시그널의 하류에서 기능한다)의 강한 시그널이, hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피에서는 CoupTF1의 발현과 반대측에서 관찰되었다 (도 12 N). 또, hESC 유래의 대뇌피질에 외인성의 FGF8를 작용시키면, CoupTF1의 발현 대신 Sp8의 발현이 광범위하게 유도되었다 (도 12 O 및 P 및 도 18 L). 이들의 결과는 FGF-MAPK 시그널이 이 자체 조직화에 관여하고 있음을 나타내고 있다.
자체 조직화한 대뇌피질 신경 표피의 영역 특이적 만곡을 수반하는 형태 변화
hESC 유래의 신경 표피 (N-cadherin 양성 또한 Sox2 양성)에 있어서, 종뇌 마커 Foxg1의 발현은 배양 18-20일 정도에 관찰되기 시작한다. 신경 표피의 정단측 (aPKC 양성)은 세포덩어리의 표면에 위치했다 (도 13 A, 아래). 배양 21일째에는 이 신경 표피는 부분적으로 비연속화하여 몇개의 큰 신경 표피로 나누어졌다 (도 13 A). 그 후, 이들의 분할된 대뇌피질 신경 표피는 정단측에서 오목의 만곡을 나타냈다 (도 13 B-D 및 도 19 A, 위).
대뇌피질 신경 표피의 각각의 분할된 부분은 비대칭성의 만곡 구조를 나타냈다. 신경 표피의 한쪽 편은 회전단 (rolling shaped end)의 특징을 소유하고 (도 13 B-D, 화살표), 다른 한 편은 무딘 특징이 있다. 활성화 미오신 (인산화 MLC2로 나타낸다)은 대뇌피질 영역의 정단측의 표층에 무딘 쪽도 포함해 균일하게 축적했다 (도 13 C). 라이브 이미징에서는, 대뇌피질 영역의 회전단이 반대측에 가까워져, 최종적으로 접촉했다 (도 13 E 및 F). 이 과정에 있어서 대뇌피질 영역 신경 표피의 본체는 회전단과 같은 방향으로 움직이고 있었다 (도 13 E-H). 이러한 라운딩의 형태 변화는 최종적으로 배양 27일째에 관강을 가지는 반구상의 대뇌피질 구조를 형성했다 (도 13 I 및 도 19 A, 아래).
대뇌피질 영역의 회전을 수반하는 형태 변화는, 정단측의 수축에 필요한 Rho-ROCK-미오신 경로의 저해제인 Rock 저해제의 첨가에 의해 억제되었다 (도 13 J-L). 회전단의 신경 표피에서는 후미측 마커 (Otx2 및 CoupTF1; 도 13 M 및 N)가 발현하는 것으로부터, 회전단은 대뇌피질 신경 표피의 후미측이라고 생각되었다.
신경 표피를 헤지혹 작동약 (배양 15-20일째에 30 nM SAG를 작용시킨다)으로 약하게 복측화 (ventralized)하면 (문헌 18, 19), foxg1::venus를 발현하는 신경 표피가 많은 부분이 LGE 마커인 Gsh2 (문헌 20)를 발현했다 (도 13 O, 화살표 머리, 및 도 19 B). 생체내에서 볼 수 있듯이, 다량의 GAD65 양성 GABA 작동성 신경세포가 LGE 신경 표피의 바로 아래에 유도된다 (문헌 19) (도 11 P, 빨강). 한편, 종뇌 신경 표피의 나머지의 영역은 대부분 대뇌피질의 마커인 Pax6 양성이었다 (도 13 Q). 고농도의 SAG 첨가에 의해, Pax6나 Gsh2의 발현이 억제되어 MGE 마커인 Nkx2.1이 유도되었다 (도 19 B 및 C). 중요하게도, 약한 SAG를 작용시킨 신경 표피는, 생체내에서 볼 수 있듯이, 대뇌피질 (Pax6 양성)과 LGE(Gsh2 양성)의 영역이 연속적으로 형성되며, 이는 개선한 배양 조건하에서는, 자체 조직화에 의해, 하나의 응집체 중에서 팔리알-서브팔리알 (pallial-subpallial) 구조가 연속적으로 형성될 수 있음을 제시한다. 이 연속한 신경 표피에서, 대뇌피질 신경 표피의 회전단 (도 13 O-Q, 화살표)은 대뇌피질-LGE 연결부와는 반대 측에 위치해, 이것은 회전단 및 비회전단이 각각 대뇌피질 신경 표피의 등측 (dorsal side)과 배측 (ventral side)에 상당하는 것과 일치한다.
태아에서는, 팔리알 신경 표피의 강한 만곡에 의해 발생중의 대뇌피질이 반전되지만, 태아의 팔리알은, 다른 조직에 의해 고정되고 있기 때문에 움직이지 않는다. 태아 신경 표피의 내측 팔리움 (해마 영역)으로부터 대뇌피질 등측의 영역의 만곡은 특히 강력하다 (도 17 A). 본 입체 배양계에서는, hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피의 후미측이 고정되지 않고 움직일 수가 있으므로 라운딩을 수반하는 형태 변화를 일으킨다. 이것은 태아의 대뇌피질 등측의 강한 만곡 작용을 반영하는 것으로 추측될 수가 있다 (도 19 D).
이들의 결과는, hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피가 자발적으로 수득한 후미로부터 문복축을 따른 비대칭적인 라운딩을 수반하는 형태 변화를 일으키는 것으로 돔 모양의 신경 표피를 자발적으로 형성하는 것을 나타내고 있다. 이와 같은 형태 변화에 의해, 신경 표피의 정단측 표면이 대뇌피질 반구의 내측에 위치하게 된다. 라이브 이미징에서는, 신경간세포가 핵의 상하 운동을 반복하면서 관강면에서 빈번하게 분열하고 있었다 (도 13 R, 및 도 19 E; 이 시기의 분열은 대부분이 대칭 분열이었다.).
3개의 피질 신경세포대의 형태적인 분리
개선한 배양 조건하에서는, hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피는 배양 42일 이후에도 성장을 계속했다. 배양 70일에 hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피의 두께는 200μm 이상이 되었다 (도 14 A 및 A'). 이 시기가 되면, 신경 표피는 형태적으로 뇌실대, 뇌실하대, 중간대, 피질판, 변연대로 형태적으로 층상화되었다 (도 14 B-G 및 도 20 A 및 B). 변연대의 최표층에는 라미닌이 축적하고, Reelin 양성의 세포 (CR세포)를 포함하고 있었다 (도 14 C 및 C'). 변연대의 바로 아래에는 피질판이 형성되어 Tbr1 양성, Ctip2 양성의 심부 피질판의 신경세포를 포함하고 있었다 (도 14 D 및 D'). 이 시기에는 천부 피질판의 마커인 Satb2 (문헌 21)를 발현한 신경세포는 적었다 (도 14 E). 관강측의 뇌실대는, 배양 70일째에는 약 100μm의 두께로, Pax6 양성 및 Sox2 양성의 신경간 세포/선구 세포 (도 14 F 및 F'), 또는 방사상 글리어 (문헌 22)로 불리는 세포를 포함하고 있었다. 나아가, 그 상부에 Tbr2 양성의 세포를 포함하는 뇌실하대가 형성되고 있었다 (도 14 G).
이 시기가 되면, 피질판과 뇌실하대의 사이는 세포가 드문, 임신 중기의 중간대와 잘 닮은 영역이 발달하고 있었다. 피질판의 바로 아래에는 Calretinin 양성으로, 중간대로 많은 MAP2 양성의 신경돌기를 신장한 세포층이 형성되고 있었다 (도 14 H 및 H' 및 도 20 C 및 D). 이들의 특징은, 인간의 태아의 대뇌피질에서 현저하게 볼 수 있는 서브플레이트에 있는 신경세포 (시상과 대뇌피질을 연결하는 초기 파이오니아 신경세포) 와 유사하다 (문헌 23-25). 태아의 서브플레이트와 그 바로 아래의 중간대에는 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸(CSPG)의 축적이 관찰된다 (도 20 F, 아래 우측, 괄호) (문헌 26). 동일하게, hESC 유래 대뇌피질 신경 표피의 같은 영역에도 강한 CSPG의 축적이 관찰되었다 (도 14 H" 및 도 20 E). 이들의 결과는 hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피가, 피질판이나 변연대 뿐만이 아니라 서브플레이트나 중간대도, 태아와 같이 정단-기저 (apico-basal) 순서로 자체 조직화할 수 있는 것을 나타내고 있다. 이 시기에는, 대뇌피질에서의 실질적인 분명한 GAD65 양성의 인터뉴런이나 TAG1 양성의 피질 하행성의 신경축색의 축적은 관찰되지 않았다 (도 20 G).
배양 91일째에는, 대뇌피질 신경 표피의 두께는 300-350μm가 되었으나 아직까지 발달한 뇌실대를 가지고 있었다 (도 14 I-K 및 도 20 H 및 I). 피질판도 두꺼워지고 (150μm정도；도 14 I), Tbr1 양성, Ctip2 양성의 심부 피질판의 신경세포 뿐만이 아니라, 천부 신경세포 (Satb2 양성, Brn2 양성)도 많이 포함하고 있었다 (도 14 L-N 및 도 20 J). 서브플레이트의 신경세포 (Calretinin 양성)는 이 시기에도 피질판의 바로 아래에 관찰되었다 (도 14 O).
장기간 배양함으로써 볼 수 있던 형태적인 층 구조의 분리 (도 14 P에 요약)는, 인간 태아 대뇌피질의 이른 임신 중기에 볼 수 있는 조직과 유사하다 (문헌 25, 27). 나아가 hESC 유래의 피질판내에서, 표층 신경세포 (Satb2 양성, Brn2 양성)가 심층 신경세포 (Tbr1 양성, Ctip2 양성)보다 우선적으로 표층측에 위치하고 있었다 (도 15 A-H). 나아가 배양 50일째에 EdU 및 70일째에 BrdU를 사용하여 세포를 1일 라벨링하면, 배양 91일째에는 EdU와 BrdU로 라벨링된 세포가 우선적으로 각각 심층과 표층 측에 위치하고 있었다 (도 15 I-L). 이들의 결과는 태아의 대뇌피질 발생시의 인사이드-아웃 패턴(문헌 5, 6), 요컨대 늦게 발생된 대뇌피질 신경세포는 외측에, 빨리 발생된 대뇌피질 신경세포는 내측에 위치하는 이른바 인사이드-아웃 패턴에 유사한, 신경세포의 위치 편중 경향을 가지고 있는 것을 나타내고 있다. 이 생각과 일치하게, 배양 112일에, 성숙한 신경세포의 마커인 CaMKIIα가 보다 우선적으로, hESC 유래의 대뇌피질 관강 2/3 영역에서 관찰되며, 그 영역은 Satb2가 아닌 Tbr1를 주로 발현하고 있었다 (도 15 M-O 및 도 20 K). 실제, 세포 레벨에서도, CaMKIIα 양성의 신경세포의 대부분은 Satb2가 아닌 Tbr1를 공발현하고 있었다 (도 20 L 및 M; 도 15 P에 요약).
oSVZ에 있어서의 인간 특이적 신경간 세포/선구 세포의 출현
마지막으로, 장기간 배양한 hESC 유래 대뇌피질에 있어서의 대뇌피질 신경간 세포/선구 세포의 동태를 검토했다. 과거의 in vivo 연구에 의해, 보다 진행되었던 시기에서는 관강측의 신경간세포의 비수직의 분열이 증가하고, 비대칭적인 분열에 의해 정단측의 신경 선구 세포가 만들어지는 것이 밝혀지고 있다 (문헌 28, 29). 본 배양에 있어서, 배양 70일에서의 증식 관광 신경간세포는 수직의 분열면 (60-90번)으로 우세하게 분열하였고 (도 16 A-C), 관강 표면에 평행한 낭세포의 분열을 초래한다. 한편, 배양 91일에 증식 신경간세포 (인산화 Vimentin 양성)는 비수직의 분열을 보다 고빈도로 나타냈다 (도 16 D-F).
배양 70 및 91일 모두에서, SVZ에는 Tbr2 양성, Sox2 음성, Pax6 음성의 많은 중간 선구세포가 포함되어 있었다 (도 14 G 및 M). 흥미롭게, 배양 91일에, SVZ의 외측에 인산화 Vimentin 양성 또한 Tbr2 음성, Sox2 양성, Pax6 양성인 신경간 세포/선구 세포가 축적하고 있었다 (도 16 G-G" 및 도 21 A-C). 이런 종류의 세포는 배양 70일에서의 비율은 비교적 작고, 배양 91일에 현저하게 되었다 (도 16 H). 배양 91일에는, 이 Tbr2 에 음성이고 Sox2 양성의 세포는 보다 정단측에 위치하고, 한편 Tbr2 양성 또한 Sox2 음성의 중간 선구세포는 보다 관강측에 위치하고 있었다 (도 16 I, 오른쪽). 흥미롭게, 이들 두개의 신경간 세포/선구 세포는, 조기의 신경 분화를 유도함으로써 관강측의 신경간 세포/선구 세포를 강력하게 감소시키는 Notch 시그널 저해제에 대해 상이한 반응성을 나타냈다. Notch 시그널 저해제는 Tbr2 양성 또한 Sox2 음성의 중간 선구세포를 증가시켰지만, Tbr2 에 음성이고 Sox2 양성의 세포는 그 처리 후에는 거의 남지 않았었다 (도 21 D-F).
최근의 연구에서는, 후기 단계의 시기의 인간 대뇌피질 형성 oSVZ에는 Tbr2 양성의 중간 선구세포와는 종류의 상이한 Tbr2 음성, Sox2 양성, Pax 6 양성의 신경간 세포/선구 세포가 축적이 보고되었다 (도 21 G) (문헌 11, 12). oRG (또는 OSVZ 간세포)로 불리는 이들의 신경간 세포/선구 세포 (문헌 11, 12)는, 인간 대뇌피질에 특징적인 표층 신경세포의 방대한 생성에 기여하는 것으로 생각되고 있다. 이 oRG 세포는 정단측 표층으로 향한 돌기를 갖고, 관강의 선구세포와는 상이하게 관강 돌기는 가지고 있지 않다. 유사하게 배양 91일째의 hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피의 Tbr2 음성, Sox2 양성, Pax6 양성의 신경간 세포/선구 세포는 정단측의 돌기를 가지지만, 관강 돌기는 가지고 있지 않다 (도 16 J-K' 및 도 21 H, H', 및 I). 이들의 세포는 SVZ의 체세포에 존재하는 pericentrin 양성의 기저체를 가지며 (도 21 J), 이것은 관강 표면 근처에 기저체가 존재하는 관강 신경간세포와는 상이하다. 생체내의 oRG 와 마찬가지로, hESC 유래의 oRG-유사의 세포는 수평으로 분열하는 경향을 나타냈다 (도 16 L 및 M). Tbr2 양성의 세포 (인산화 Vimentin 양성)는, 생체내의 중간 선구세포와 마찬가지로 정단측 돌기는 가지고 있지 않았다 (도 21 K-K").
정리하면, 이들의 결과는 자체 조직화된 대뇌피질 신경 표피는 인간의 대뇌피질 형성의 진행된 발생 시기에 보여지는, oRG-유사의 세포의 출현을 포함한 신경간 세포/선구 세포의 동태를 모방함을 나타내고 있다.
이 연구에서, 인간 태아뇌에서 볼 수 있는 축 패턴과 다층 구조의 분리를 자체조직화하는 내재성 프로그램을, hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피가 실시할 수 있는 것이 나타났다. 본 발명의 배양계에서는, hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피를 13주 이상의 장기간에 있어서 부유 배양 조건하에서 건강하게 성장시킬 수가 있다. 그리고, 피질 신경세포가 약 350μm의 두께가 되어, 인간 임신 중기 (태생 11주부터)의 태아 대뇌피질에서 볼 수 있는 다층 구조를 갖는다 (문헌 30). 이는, 종전의 3 차원 배양의 한계, 요컨대 인간 임신 초기에 상당하는 성숙 조직까지 밖에 대뇌피질 신경 표피를 유지할 수 없었던 것과 분명하게 상이하다. 본 발명의 배양법은, 인간 임신 중기의 대뇌피질 발생에 특징적인 현상, 즉 배양 91일 (13주)에서의 oRG-유사의 신경간 세포/선구 세포의 출현까지도 구현할 수가 있었다. 이들의 결과는, 본 발명 방법에 있어서의 자체 조직화한 조직의 발생 스피드는, 태아의 뇌의 발생과 거의 동등한 것도 시사한다.
이 배양의 중요한 효과의 하나는, 긴 배양 기간에 있어서 지속적으로 연장되는 신경 표피 중안에서도, 내재적으로 프로그램된 대뇌피질의 발생이 진행된다고하는 것이다. 피질내에서의 극성 형성이 자발적으로 형성되는 메커니즘은 장래의 연구를 위해 흥미로운 문제이다. 나아가, hESC 유래의 대뇌피질 신경 표피의 회전을 수반하는 형태 변화는, 자발적으로 형성된 극성에 따른 비대칭성의 움직임을 나타낸다.
대뇌피질 신경 표피의 극성에 추가해, 본 발명의 배양계는 종뇌 전체의 등-배 특정화에 관한 연구에 대해서도 사용될수 있다. 특히 부분적으로 복측화시킨 조건하에 (도 13 O-Q), hESC 유래의 신경 표피의 자체 조직화에 의해, 생체내에서 볼 수 있듯이 대뇌피질과 LGE (striatum anlage)를 인접한 위치 관계로 재현하고 한편으로는 보다 강력한 헤지혹 시그널에 의해 MGE의 형성이 유도된다.
이 시험에서 나타낸 개선된 배양계로, 대뇌피질의 복잡한 층 형성, 요컨대 뇌실대, 뇌실하대, 중간대, 서브플레이트, 피질판, 변연대의 형성도 재현하는 것이 가능하게 되었다. 서브플레이트는 영장류에서는 특히 우위인 구조 (가끔, VII층으로 불린다)로, 대뇌피질 내의 초기 발생 신경 (early born neuron)으로 형성된다고 생각되고 있다 (즉, 파이어니어 신경) (문헌 24, 25). 서브플레이트는 태아뇌에서는 일시적으로 출현하는 구조이나, 그 유도체 일부가 성체 뇌의 백질의 간질 신경세포로 존재한다 (문헌 33). 서브플레이트는 생후에는 없어져 버리기 때문에, 그 연구는 특히 인간에 있어서는 용이하지 않고, 그러므로 본 시스템은 이해가 진행되지 않은 신경세포층의 연구에서는 중요하다. 나아가 본 배양계는, 뇌회결손의 병리를 포함해, 인간 태아 대뇌피질의 인사이드-아웃의 층 형성의 연구에도 응용할 수 있을 것이다.
마지막으로, 본 발명의 배양계는, 인간의 대뇌피질 형성에서의 oRG 신경간 세포/선구 세포의 역할을 연구하는데 있어서 큰 이점을 가지고 있다. 자이렌세팔릭 (gyrencephalic) 인간의 대뇌피질에 있어, 몇 번이나 분열을 반복하면서 많은 표층 신경세포를 낳는 이 신경간 세포/선구 세포를 갖는 것은, 아마 큰 이점이라고 생각된다. 지금까지, oRG라고 정의되기 위한 특이적 마커는 보고되어 있지 않고, oRG와 관강측의 신경간세포 (모두 Sox2 양성, Pax6 양성, Tbr2 음성)의 구별은 그 세포 형태와 그 움직임과 장소에 주로 의존하였다. 그러므로, 위치 관계가 없는 분리 배양에 있어서의 oRG의 연구의 범위는 매우 한정적이었다. 그러나, 본 발명의 배양계는, 발달하는 인간의 대뇌피질의 3 차원의 구성을 갖는 것으로부터 큰 이점을 가지고 있다. 매우 최근에, 인간 다능성 간세포 유래의 다층화 대뇌피질 조직 중에서, 유사한 oRG 발생이 관측되었음이 보고되었다 (문헌 34). 이 연구는 확률론적으로 뇌영역의 특이성을 수득하는 비선택적인 분화 방법을 사용한다 (본원은 재현성의 대뇌피질 특이적 분화법이다).
본 발명을 바람직한 양태를 강조해 설명해 왔지만, 바람직한 양태가 변경될 수 있는 것은 당업자에게 있어 자명하다. 본 발명은, 본 발명이 본 명세서에 상세하게 기재된 이외의 방법으로 실시될 수 있는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 첨부의 「청구의 범위」의 정신 및 범위에 포함되는 모든 변경을 포함하는 것이다.
여기서 진술된 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 여기에 인용된 것에 의해, 그 모두가 명시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 혼입되는 것이다.
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산업상 이용 가능성
본 발명에 의하면, 생체내의 종뇌와 동일한 고차 구조를 갖는 종뇌 혹은 그 부분 조직 (대뇌피질, 대뇌 기저핵, 해마, 맥락막 등), 혹은 그 선구 조직을, 인비트로에 있어서 다능성 간세포로 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 뇌신경 영역에 있어서의 재생 의료의 실시에 유용하다.
본 출원은 일본으로 출원된 일본 특허출원 2013-242394(출원일：2013년 11월 22일)를 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

Claims (20)

  1. 다능성 간세포의 응집체를, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 존재하에서 부유 배양 (suspension culture)함으로써, 종뇌 마커 양성 응집체를 얻는 것, 및 그 종뇌 마커 양성 응집체를, 20% 초과의 산소 분압 조건하에서 추가로 부유 배양하는 것을 포함하는, 종뇌, 대뇌피질, 대뇌피질 선구 조직, 대뇌 기저핵, 대뇌 기저핵 선구 조직, 해마, 해마 선구 조직, 맥락막, 또는 맥락막 선구 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법으로서,
    Wnt 시그널 저해제가 IWR-1-엔도(4-[(3aR, 4S, 7R, 7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드), IWP-2, XAV939, Dkk1, 세르베루스(Cerberus) 단백질, Wnt 수용체 저해제, 가용형 Wnt 수용체, Wnt 항체, 카세인 키나아제 저해제, 및 도미넌트 네거티브 Wnt 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    TGFβ 시그널 저해제가 SB431542 (4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드), LY-364947, SB-505, 및 A-83-01로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 세포 응집체의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 산소 분압 조건이 30 내지 60%의 산소 분압인, 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 20% 초과의 산소 분압 조건하에서의 부유 배양을, Wnt 시그널 증강제의 존재하에서 실시하고,
    Wnt 시그널 증강제가 GSK-3β저해제, 재조합 Wnt3a, Wnt 작동약, Dkk, 및 R-스폰딘(R-Spondin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 20% 초과의 산소 분압 조건하에서의 부유 배양을, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 존재하에서 실시하고,
    Wnt 시그널 증강제가 GSK-3β저해제, 재조합 Wnt3a, Wnt 작동약, Dkk, 및 R-스폰딘(R-Spondin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질이 BMP2, BMP4, BMP7, 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
  5. (I) 다능성 간세포의 응집체를, Wnt 시그널 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 존재하에서 부유 배양함으로써, 종뇌 마커 양성 응집체를 얻는 것,
    (II) (I)에서 얻어진 그 종뇌 마커 양성 응집체를, Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 존재하에서 추가로 부유 배양하는 것, 및
    (III) (II)에서 얻어진 세포 응집체를 Wnt 시그널 증강제 및 골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 부재하에서 추가로 부유 배양하는 것
    을 포함하는, 종뇌, 대뇌피질, 대뇌피질 선구 조직, 대뇌 기저핵, 대뇌 기저핵 선구 조직, 해마, 해마 선구 조직, 맥락막, 또는 맥락막 선구 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법으로서,
    Wnt 시그널 저해제가 IWR-1-엔도(4-[(3aR, 4S, 7R, 7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드), IWP-2, XAV939, Dkk1, 세르베루스(Cerberus) 단백질, Wnt 수용체 저해제, 가용형 Wnt 수용체, Wnt 항체, 카세인 키나아제 저해제, 및 도미넌트 네거티브 Wnt 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    TGFβ 시그널 저해제가 SB431542 (4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드), LY-364947, SB-505, 및 A-83-01로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    Wnt 시그널 증강제가 GSK-3β저해제, 재조합 Wnt3a, Wnt 작동약, Dkk, 및 R-스폰딘(R-Spondin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    골형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질이 BMP2, BMP4, BMP7, 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 세포 응집체의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 제조된 세포 응집체가, 연속한 신경 표피 중에, 대뇌피질 조직 또는 대뇌피질 선구 조직, 맥락막 조직 또는 맥락막 선구 조직, 및 해마 조직 또는 해마 선구 조직을 포함하는, 제조 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 제조된 세포 응집체가, 연속한 신경 표피 중에, 치상회 조직 또는 그 선구 조직, 및 Ammon 뿔 조직 또는 그 선구 조직을 포함하는 해마 조직 또는 해마 선구 조직을 포함하는, 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 해마 조직 또는 해마 선구 조직이, 연속한 신경 표피 중에, 피질의 가장자리 (hem)를 추가로 포함하는, 제조 방법.
  9. 제 5 항에 있어서, 제조된 세포 응집체가, Ammon 뿔 조직 또는 그 선구 조직을 포함하는, 제조 방법.
  10. 제 5 항에 있어서, (II) 및 (III)에 있어서의 부유 배양을 20% 초과의 산소 분압 조건하에서 실시하는, 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 산소 분압 조건이 30 내지 60%의 산소 분압인, 제조 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 세포 응집체를, shh 시그널 작동약으로 처리하는 것을 포함하는, 제조 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 세포 응집체를, FGF8로 처리하는 것을 포함하는, 제조 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 얻어진 세포 응집체가, 표층부에서 심부로 향해, 변연대, 피질판, 서브플레이트, 중간대, 뇌실하대 및 뇌실대를 포함하는 다층 구조를 갖는, 대뇌피질 조직 또는 대뇌피질 선구 조직을 포함하는, 제조 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 얻어진 세포 응집체가, 대뇌 기저핵 또는 그 선구 조직을 포함하는, 제조 방법.
  16. 제 13 항에 있어서, 얻어진 세포 응집체가, 문측 (rostral) 대뇌피질 또는 그 선구 조직을 포함하는, 제조 방법.
  17. 제 1 항 내지 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 간세포가 배성 간세포 또는 유도 다능성 간세포인, 제조 방법.
  18. 제 1 항 내지 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 간세포가 인간 유래인, 제조 방법.
  19. 제 1 항 내지 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 부유 배양을 피더 세포의 비존재하에서 실시하는, 제조 방법.
  20. (I) 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 해마 또는 해마 선구 조직을 포함하는 세포 응집체를 제조하는 것,
    (II) (I)에서 얻어진 세포 응집체를 분산하는 것, 및
    (III) 분산한 세포를 추가로 접착 배양해, 그 세포로부터 성숙한 해마 뉴런을 유도하는 것을 포함하는, 성숙한 해마 뉴런의 제조 방법.
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