CN114561356A - 影响细胞因子分泌的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及光照在影响细胞因子分泌中的应用。具体地，本发明提供了全光谱LED光在促进眼周细胞分泌细胞因子中的应用，所述细胞因子包括CNTF、PEDF、多巴胺。

Description

影响细胞因子分泌的方法及应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及光照在影响细胞因子分泌中的应用。
背景技术
视网膜是眼球壁的最内一层，位于脉络膜的内侧，由一层色素细胞及多层神经细胞组成，可接受光线的刺激，为眼内感光成像的地方。
视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelium，RPE)细胞是位于神经视网膜和脉络膜之间的单层多边形细胞，RPE细胞在眼的发育和视觉功能中发挥着重要作用，例如：维持血-视网膜屏障、分泌多种生长因子、参与视循环代谢、吞噬视细胞脱落的外节盘膜等。因此，维持RPE细胞的完整性对正常的视网膜功能至关重要。视网膜病变多与RPE细胞的萎缩或细胞因子分泌功能异常有关。无论是体外培养的原代RPE还是多能干细胞诱导而来的RPE，都存在细胞因子分泌不足的问题。本发明的旨在提供促进RPE细胞分泌细胞因子的方法，并将处理后的RPE细胞移植治疗眼科及神经系统相关疾病。
虽然制备RPE细胞的来源不同，但其最终治疗方式都是将体外获得的外源RPE细胞植入患者视网膜黄斑区，以替代或补充患者萎缩受损的自身RPE细胞，恢复RPE细胞的生理功能，改善患者视力。外源RPE细胞治疗视网膜变性的机制包括：植入的外源RPE细胞能够分泌多种细胞因子，如转化生长因子(TGF)-β、胰岛素样生长因子(IGF)-1、睫毛神经营养因子(CNTF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)等，部分细胞因子进入宿主残存的感光细胞，发挥保护作用。同时RPE细胞可以分泌多巴胺，因此也可以达到改善神经系统疾病的目的。
目前已有技术主要是通过电转、脂质体或者病毒等方式基因改造RPE细胞，引入外源细胞因子相关基因，强制性表达RPE相关细胞因子，从而达到促进RPE的目的；但是基因改造的方式，改变了RPE的遗传信息，限制了RPE细胞在临床上的使用。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提供了通过光照刺激促进RPE细胞分泌细胞因子的技术方案；通过光照刺激细胞因子的分泌，不需要改变RPE细胞遗传信息，具有极高的临床使用价值。
方法
一方面，本发明提供了一种促进眼周细胞分泌CNTF(睫毛神经营养因子)、利用眼周细胞生产CNTF的方法，所述方法包括使用以下光照处理(也可称为“照射”)细胞：
1)全光谱LED光、
2)全光谱LED光+红光。
另一方面，本发明提供了一种促进眼周细胞分泌PEDF(色素上皮衍生因子)、利用眼周细胞生产PEDF的方法，所述方法包括使用以下光照处理细胞：
1)全光谱LED光、
2)红光、
3)全光谱LED光+红光。
另一方面，本发明提供了一种促进眼周细胞分泌多巴胺、利用眼周细胞生产多巴胺的方法，所述方法包括使用以下光照处理细胞：
1)荧光、
2)LED光(普通LED光)、
3)全光谱LED光、
4)红光、
5)全光谱LED光+红光。
优选地，本发明所述全光谱LED光可以是任何光照强度的，例如100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000(或100-2000)Lux，如本发明具体实施例所使用的全光谱LED光的光照强度是500、1500Lux。
另一方面，本发明提供了一种抑制眼周细胞分泌CNTF的方法，所述方法包括使用红光处理眼周细胞。
另一方面，本发明提供了一种提高眼周细胞的细胞因子分泌量的方法，所述方法包括提高光照强度；
优选地，所述方法包括提高全光谱LED光的光照强度，例如从500Lux提高到1500Lux；
更具体的，是在体外培养眼周细胞的情况下，提高全光谱LED光的光照强度。
优选地，所述细胞因子包括转化生长因子(TGF)-β、胰岛素样生长因子(IGF)-1、睫毛神经营养因子(CNTF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、多巴胺等。
优选地，上述方法是在体外培养细胞中进行的。
优选地，本发明所述各种光照可以是持续光照或间断光照，具体地例如每日连续/间断光照10min、20min、30min、40min、50min、60min(即1小时)、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、1小0小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时。
优选地，本发明所述全光谱LED光+红光的处理方式是：每日给与全光谱光和红光照射；优选地，所述红光照射是多次间断给与；更优选地，红光照射时间共60分钟。
优选地，本发明所述眼周细胞是视网膜细胞(或称“组成视网膜的细胞”)。
本发明中，术语“视网膜”即视网膜视部，其为一层柔软而透明的膜，紧贴在脉络膜内面，有感受光刺激的作用。视网膜主要由色素上皮细胞、视细胞(感光细胞)、双极细胞、节细胞、水平细胞、无长突细胞、网间细胞和Muller细胞等组成。这些细胞及其突起排列有序，可据此将视网膜自外向内分为10层。①色素上皮层：由单层色素上皮细胞(亦称为“视网膜色素上皮细胞”，即retinal pigment epithelial cells，RPE)构成；②视杆视锥层：由视杆细胞和视锥细胞的外突构成；③外界膜：由Muller细胞的外突末端连接而成；④外核层：由视杆细胞和视锥细胞的细胞体组成；⑤外网层：由视杆细胞和视锥细胞的内突及双极细胞的树突构成；⑥内核层：由双极细胞、水平细胞、无长突细胞和Muller细胞的胞体构成；⑦内网层：由双极细胞的轴突和无长突细胞及节细胞的树突构成；⑧节细胞层：由节细胞的胞体组成；⑨神经纤维层：由节细胞的轴突组成；⑩内界膜：为Müller细胞的内突末端连接而成。
本发明所述视锥细胞、视杆细胞可统称为“感光细胞”，所述“感光细胞”还可称为视细胞、感受细胞或光感受器。
优选地，本发明所述视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)是由干细胞分化而来。
优选地，所述干细胞是多能干细胞。
更优选地，是在体外诱导条件下分化而来。
优选地，所述多能干细胞包括ESC、iPSC、拟胚体、细胞造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的一种或多种。
更优选地，所述多能干细胞是iPSC(诱导性多能干细胞)。
更优选地，本发明所述视网膜色素上皮细胞在任意合适的培养基中培养的，如DMEM、RPMI1640、MEM、DEME/F12、F10、CD293、medium231、medium106。具体如本发明具体实施例使用的是含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基。更优选地，培养条件是5％CO2。
光的应用
同时，本发明还提供了以下应用：
1)全光谱LED光在促进眼周细胞分泌CNTF中的应用；
2)红光和/或全光谱LED光在促进眼周细胞分泌PEDF中的应用；
3)荧光、LED光、全光谱LED光、红光中的一种或多种组合在促进眼周细胞分泌多巴胺中的应用。
本发明所述“荧光”是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。常见的荧光灯是灯管内部被抽成真空再注入少量的水银。灯管电极的放电使水银发出紫外波段的光。这些紫外光是不可见的，并且对人体有害。所以灯管内壁覆盖了一层称作磷(荧)光体的物质，它可以吸收那些紫外光并发出可见光。
本发明所述“LED光”即LED灯发出的光，也即发光二极管(LED)发出的光。当电子与空穴复合时能辐射出可见光，因而可以用来制成发光二极管；其由含镓(Ga)、砷(As)、磷(P)、氮(N)等的化合物制成，不同化合物会发出不同的光。由于灯具中发光材料的不同导致光谱有差异，本发明将所使用的LED光分为了“普通LED光”和“全光谱LED光”，灯具信息如本发明表1所示。
未特别说明时，本发明术语皆为本领域技术人员所熟知的概念。
本发明所述全光谱LED(Full Spectrum)：指的是光谱中包含紫外光、可见光、红外光的光谱曲线，并且在可见光部分中红绿蓝的比例与阳光近似，显色指数接近于100的光谱；其特征在于紫色芯片+蓝绿红荧光粉，短波蓝光比较多，能量高。
本发明所述“普通LED”：蓝色芯片+黄红荧光粉，短波蓝光相对少，蓝过度绿波段有尖锐峰值。
本发明所述“红光”即波长范围为620～760纳米的光。
产品
另一方面，本发明提供了经过上述方法处理得到的眼周细胞、或其分泌的CNTF/PEDF/多巴胺(“/”代表“或”)。
优选地，所述眼周细胞是高CNTF/PEDF/多巴胺分泌量的眼周细胞。
所述高分泌量可以是相较于比非光照处理的细胞的分泌量高出10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
另一方面，本发明提供了包含上述眼周细胞、或其分泌的CNTF/PEDF/多巴胺的组合物。
优选地，所述组合物是药物组合物，所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明所述药物组合物以前述方法处理得到的眼周细胞和/或其分泌的细胞因子(如本发明举例的CNTF、PEDF、多巴胺)作为主要活性成分。根据本发明具体实施例中所举例的，本发明所提供的眼周细胞具有高CNTF/PEDF/多巴胺分泌量。
产品的应用
另一方面，本发明提供了经过上述方法处理得到的眼周细胞、CNTF、PEDF、多巴胺在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用，以及在制备修复神经损伤疾病的药物中的应用。
本发明所述CNTP即ciliary neurotrophic factor，睫毛神经营养因子，其是白介素6型细胞因子家族的成员，CNTF在神经元、少突胶质细胞、肌细胞、骨细胞、脂肪细胞和视网膜细胞中有营养性和调节活性；CNTF可以作为神经元损伤后活化的内源性神经营养因子发挥作用，在视网膜色素变性(RP)、视神经损伤、青光眼以及全色盲等眼部疾病中发挥神经保护作用。
本发明所述PEDF即pigment epithelium-derived factor，色素上皮衍生因子，其是一种分泌蛋白，相对分子量为50000，属于丝氨酸超家族的一员。近年来大量研究发现PEDF具有多种生物学功效，包括抗新生血管、神经营养及神经保护功能。PEDF是最有效的内源性眼部新生血管抑制物。PEDF对于治疗血管增生性疾病及视网膜变性疾病具有广阔的前景。
本发明所述多巴胺(DA)是中枢神经递质之一，多巴胺受体根据其对腺苷酸环化酶活力的不同影响及具有专一性配体分为D1样和D2样两型。DA在视网膜信息传递、光刺激的反应以及视网膜缺血性损伤等病变中起着重要的作用。视网膜的突触传递是通过直接接触和轴突神经递质释放两种途径进行的。电生理研究表明多巴胺是一种与神经节细胞放电率有关的抑制性神经递质，一般认为多巴胺在视网膜神经元发挥抑制性作用。
本发明所述“视网膜退行性疾病”包括：视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)，色素性视网膜炎，莱伯先天性黑矇，遗传性或获得性黄斑变性，年龄相关的黄斑变性(AMD)，Best病，视网膜脱落，回旋状萎缩，无脉络膜症，模式性营养不良，RPE营养不良，Stargardt病，Sorby黄斑营养不良，由光、激光、感染、辐射、新血管或创伤性损伤中的任何一种引起的视网膜损害。
本发明所述“神经损伤疾病”包括帕金森症、早老性痴呆症(Alzheimer'sdisease)、亨廷顿舞蹈症(Huntington chorea)、脊髓小脑变性(Spinocerebellardegeneration)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、多发性神经病变、脊髓损伤、脑血管障碍(cerebrovascular disorders)等。
优选地，本发明所述药物包括细胞移植治疗(或称再生性疗法、细胞疗法)所使用的细胞。
治疗方法
另一方面，本发明提供了一种治疗视网膜退行性疾病的方法，所述方法包括使用上述方法处理得到的眼周细胞、CNTF、PEDF、多巴胺。
本发明所述“治疗”是指递送有效量的眼周细胞、组合物以达成预防任何症状或疾病病况产生的目的或达成预防或延迟进展、减轻、改善或消除已产生的此类症状或疾病病况的目的。
附图说明
图1是不同光照条件下细胞增殖情况的统计结果图。
图2是不同光照条件下RPE细胞分泌CNTF情况的统计结果图。
图3是不同光照条件下RPE细胞分泌PEDF情况的统计结果图。
图4是不同光照条件下RPE细胞分泌多巴胺情况的统计结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
表1.本发明所使用的材料及设备
Figure BDA0003537556680000071
Figure BDA0003537556680000081
优选地，本发明中所述“荧光”即以上荧光灯所发出的光，“普通LED光”即普通LED灯所发出的光，“全光谱LED光”全光谱LED灯所发出的光，“红光”即红光灯所发出的光。
实施例1、不同光照条件对RPE细胞分泌细胞因子的影响
细胞处理方法：
1)细胞培养iPSC诱导来源的人视网膜色素上皮细胞RPE，用含10％胎牛血清的DMEM-F12培养液培养在含有5％CO2的细胞孵育箱中，细胞每2天换一次液，3天传一代，传代比例为1:3。
2)在细胞培养箱内建立光照系统，将体外培养的RPE细胞分别在不同处理生长环境下进行细胞培养，六组不同处理方式分别是：组(group)1：无光照(对照组)、组2：荧光灯组、组3：普通LED灯组、组4：全光谱LED-500Lux组、组5：全光谱LED-500Lux组+红光组、组6：全光谱LED-1500Lux组光照环境中进行培养，连续光照24h、48h后进行检测(总结如下表2)。
表2.不同组的处理方式
Figure BDA0003537556680000082
Figure BDA0003537556680000091
各组处理中除组5：全光谱LED-500Lux组+红光组外，其他组均为连续光照。而组5：全光谱LED-500Lux组+红光组的处理方式是每天抽出下午4小时时间，(15分钟红光+45分钟白光)*四次，其他时间为LED白光照射(即全光谱照射)。全光谱LED-500Lux是指设定光照强度为500Lux全光谱LED-1500Lux是指设定光照强度为1500Lux。
用照度计测量细胞生长平面的光照强度，细胞生长平面温度为36.5±0.5摄氏度。
3)WST-1法检测细胞增殖：RPE细胞以4.5×103个/孔的浓度接种于96孔板上，用含10％FBS的DMEM-F12培养液在CO2孵育箱中培养。24h后弃上清，用不含钙离子的PBS洗涤细胞2次，换成含2％FBS的无酚红无光敏介质的DMEM-F12培养液，放入光照箱中进行光照，对照组用锡箔纸避光培养。分别于24、48h光照结束后，加人WST-1反应液，37摄氏度继续孵育4h，在酶联免疫检测仪上选择488nm为激发波长，测定各孔光吸收值，计算增殖倍率。每个处理组下设有6个样本，每个样本有2个复孔，设空白对照组(不加细胞，只加培养液)。实验重复3次，每次实验的结果均做散点图，去除极端值。
4)检测细胞因子含量：将RPE细胞以3×l05个的浓度种植在35mm的培养皿里，在CO2孵育箱中培养24h后弃上清，用不含钙离子的PBS洗涤细胞2次，换成含2％FBS的无酚红无光敏介质的DMEM-F12培养液，放入光照箱中进行光照，对照组用锡箔纸避光培养。分别于24、48h光照结束后收集细胞培养液，1000r/min离心5min后弃沉淀，取上清液在-80摄氏度保存。采用Elisa试剂盒检测CNTF、多巴胺、PEDF分泌水平含量。
实验结果1：
对细胞增殖能力的检测结果统计如图1所示，根据检测结果可知，不同光照不影响细胞增殖。
实验结果2：
对CNTF的检测结果统计如图2所示，根据图2中组1(无光照)、组2(荧光灯组)比较，荧光照射不影响RPE细胞分泌CNTF；
组1(无光照)和组3(普通LED灯组)比较，普通LED照射不影响RPE细胞分泌CNTF；
组1(无光照)和组4(全光谱LED-500Lux组)、group6(全光谱LED-1500Lux组)比较，全光谱LED照射促进RPE细胞分泌CNTF；且光照强度越强，RPE细胞分泌CNTF越多。
组4(全光谱LED-500Lux组)和组5(全光谱LED-500Lux组+红光组)比较，红光照射 抑制RPE细胞分泌CNTF。
实验结果3：
对PEDF的检测结果统计如图3所示，根据图3中组1(无光照)和组2(荧光灯组)比较，荧光照射不影响RPE细胞分泌PEDF；
组1(无光照)和组3(普通LED灯组)比较，普通LED照射不影响RPE细胞分泌PEDF；
组1(无光照)和组4(全光谱LED-500Lux组)、group6(全光谱LED-1500Lux组)比较，全光谱LED照射促进RPE细胞分泌PEDF，且光照强度越强，RPE细胞分泌PEDF越多；
组4(全光谱LED-500Lux组)和组5(全光谱LED-500Lux组+红光组)比较，红光照射 促进RPE细胞分泌PEDF。
实验结果4：
对多巴胺的检测结果统计如图4所示，根据图4中组1(无光照)和组2(荧光灯组)比较，荧光照射促进RPE细胞分泌多巴胺；
组1(无光照)和组3(普通LED灯组)比较，普通LED照射促进RPE细胞分泌多巴胺；
组1(无光照)和组4(全光谱LED-500Lux组)、group6(全光谱LED-1500Lux组)比较，全光谱LED照射促进RPE细胞分泌多巴胺，且光照强度越强，RPE细胞分泌多巴胺越多；
组4(全光谱LED-500Lux组)和组5(全光谱LED-500Lux组+红光组)比较，红光照射 促进RPE细胞分泌多巴胺。

Claims (10)

1.一种促进眼周细胞分泌睫毛神经营养因子、利用眼周细胞生产睫毛神经营养因子的方法，所述方法包括使用以下光照处理细胞：
1)全光谱LED光、
2)全光谱LED光+红光；
优选地，所述全光谱LED光的光照强度是100-2000Lux；
优选地，所述全光谱LED光的光照强度是500-1500Lux。
2.一种促进眼周细胞分泌色素上皮衍生因子、利用眼周细胞生产色素上皮衍生因子的方法，所述方法包括使用以下光照处理细胞：
1)全光谱LED光、
2)红光、
3)全光谱LED光+红光；
优选地，所述全光谱LED光的光照强度是100-2000Lux；
优选地，所述全光谱LED光的光照强度是500-1500Lux。
3.一种促进眼周细胞分泌多巴胺、利用眼周细胞生产多巴胺的方法，所述方法包括使用以下光照处理细胞：
1)荧光、
2)普通LED光、
3)全光谱LED光、
4)红光、
5)全光谱LED光+红光；
优选地，所述全光谱LED光的光照强度是100-2000Lux；
优选地，所述全光谱LED光的光照强度是500-1500Lux。
4.一种抑制眼周细胞分泌CNTF的方法，所述方法包括使用红光处理细胞。
5.一种提高眼周细胞的细胞因子分泌量的方法，所述方法包括提高光照强度；
优选地，所述方法包括提高全光谱LED光的光照强度；优选地，是在体外培养眼周细胞的情况下，提高全光谱LED光的光照强度；更优选地，光照强度从500Lux提高到1500Lux。
6.如权利要求1-5任意所述的方法，其特征在于，所述眼周细胞是视网膜细胞；所述视网膜细胞包括：色素上皮细胞、感光细胞、双极细胞、节细胞、水平细胞、无长突细胞、网间细胞和Muller细胞；所述感光细胞包括视锥细胞、视杆细胞；
优选地，所述眼周细胞是色素上皮细胞；
优选地，所述色素上皮细胞是由干细胞分化而来；
优选地，所述干细胞是多能干细胞；
优选地，所述多能干细胞包括ESC、iPSC、拟胚体、细胞造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的一种或多种；
更优选地，所述多能干细胞是iPSC。
7.一种应用，其特征在于，所述应用选自以下任意一种：
1)全光谱LED光在促进眼周细胞分泌CNTF中的应用；
2)红光和/或全光谱LED光在促进眼周细胞分泌PEDF中的应用；
3)荧光、LED光、全光谱LED光、红光中的一种或多种组合在促进眼周细胞分泌多巴胺中的应用；
优选地，所述全光谱LED光的光照强度是100-2000Lux；
优选地，所述全光谱LED光的光照强度是500-1500Lux；
优选地，所述眼周细胞是色素上皮细胞；
优选地，所述色素上皮细胞是由干细胞分化而来；
优选地，所述干细胞是多能干细胞；
优选地，所述多能干细胞包括ESC、iPSC、拟胚体、细胞造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的一种或多种；
更优选地，所述多能干细胞是iPSC。
8.一种产品，所述产品是权利要求1-5任意所述方法处理得到的眼周细胞或其分泌的CNTF、PEDF、多巴胺；
优选地，所述眼周细胞是CNTF、PEDF、多巴胺中的一种或多种分泌量高的眼周细胞。
9.包含权利要求8所述产品的组合物；
优选地，所述组合物包括细胞移植治疗中使用的药物组合物。
10.权利要求8所述的产品、权利要求9所述的组合物在制备治疗视网膜退行性疾病、神经损伤疾病的药物中的应用；
优选地，所述视网膜退行性疾病包括：视网膜色素变性，色素性视网膜炎，莱伯先天性黑矇，遗传性或获得性黄斑变性，年龄相关的黄斑变性，Best病，视网膜脱落，回旋状萎缩，无脉络膜症，模式性营养不良，RPE营养不良，Stargardt病，Sorby黄斑营养不良，由光、激光、感染、辐射、新血管或创伤性损伤中的任何一种引起的视网膜损害；
优选地，所述神经损伤疾病包括帕金森症、早老性痴呆症、亨廷顿舞蹈症、脊髓小脑变性、肌萎缩侧索硬化症、多发性神经病变、脊髓损伤、脑血管障碍。
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