JP2002536423A

JP2002536423A - 未成熟及び成熟ジストロフィーレシピエントの神経組織内に移植された神経前駆細胞の統合

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Publication number: JP2002536423A
Application number: JP2000598189A
Authority: JP
Inventors: ヤング，マイケル，ジェイ．; ゲージ，フレッド，エイチ．; レイ，ジェソドハラ; ホワイトレイ，シモン，ジェイ．; クラッセン，ヘンリー
Original assignee: ザスキーペンズアイリサーチインスティテュートインコーポレイテッド; ザサルクインスティテュートフォアバイオロジカルスタディーズ
Priority date: 1999-02-11
Filing date: 2000-02-11
Publication date: 2002-10-29
Also published as: EP1154801A4; AU2878400A; WO2000047238A1; EP1154801A1; WO2000047238A9; CA2362476A1

Abstract

(57)【要約】本発明はヒト及びその他動物に於ける、損傷又は病気の網膜あるいは視神経の様なジストロフィー性の分化した神経組織を修復する方法を目的とする。具体的には、発明は成体由来神経前駆細胞を成体（成熟）動物を含む、異種移植性、同種又は同系である動物レシピエントのジストロフィー神経組織部位内に導入することに関する。これら成体由来神経前駆細胞は、成熟及び未熟両方のジストロフィー神経組織内に機能的及び形態学的に統合される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連特許の相互参照本出願は１９９９年２月１１日出願し、その全てがここに参照され組み込まれ
ている米国仮出願番号第６０／１１９，６４２号の利益を主張する。

【０００２】発明の背景成体齧歯類の海馬内に存在する増殖細胞は分離され、培養され、そして中枢神
経系（ＣＮＳ）内の各種部位に移植されている。これら細胞は、神経発生が起こ
ることが知られている部位に移植されると神経に分化することができる（Ｓｕｈ
ｏｎｅｎ１９９６，Ｓｈｉｈａｂｕｄｄｉｎ１９９７，Ｇａｇｅ１９
９５）。しかし成体哺乳動物のＣＮＳ内での病的細胞消失部位を再増殖すること
を目的とした移植神経の利用に関する従来の試みは、ドナーの神経細胞が宿主細
胞内に統合されないために大部分が失敗に終わっている。例えば神経を眼の中に
移植する試みは、宿主網膜との形態的統合を示さなかった（ｄｅｌＣｅｒｒｏ
１９９２，Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ１９９２，Ａｒａｍａｎｔ１９９４，
Ｂｅｒｓｏｎ＆Ｊａｃｏｂｉｅｃ１９９９）。

【０００３】中枢神経系の一部である網膜は、発生学的にも表現形的にも機能修復に関し脳
及び脊髄同様に不応である。遺伝的なものだけでも網膜神経の消失が関係する病
気は１００種類以上存在していることから、これは不幸なことである（Ｂｉｒｄ
，１９９５；ＳｉｍｕｎｏｖｉｃとＭｏｏｒｅ，１９９８）。

【０００４】病気の網膜神経の交換に関し試みられている方法の１つは、健康ドナーから網
膜組織を病気の宿主の網膜に移植することである（Ｇｏｕｒａｓら、１９９４；
ＳｉｌｖｅｒｍａｎとＨｕｇｈｅｓ、１９８９）。この様な研究の結果は移植体
の生存に関しては有望であるが、移植体と宿主との形態的及び機能的統合につい
てはまだ問題が多い。移植体−宿主の界面はしばしば組織学的に明確に区画され
ており、微細構造研究は両者をまたぐ神経繊維を殆ど持たない、周密性の神経膠
瘢痕の存在を示している（Ｉｖｅｒｔら、１９９８）。

【０００５】即ち従来所見は神経変性疾患、特に成体動物に於ける有効な解決法をもたらし
ていない。

【０００６】発明の要約本発明はヒト及びその他動物に於けるジストロフィー神経組織、特に傷害を受
けた、又は病気の分化神経組織を治療する方法を目的とする。神経前駆細胞は機
能的及び形態学的に移動し、成熟及び未成熟神経組織内に統合することができる
ことが分かっている。具体的には各種年齢の動物の神経組織内（例えばフィシャ
ーラットの未熟網膜内へのフィシャーラット由来ＡＨＰＣｓ）及び注目すべき同
種異系レシピエントの病気の成体網膜（例えばフィシャーラット由来ＡＭＰＣｓ
のジストロフィックロイヤルカレッジサージョン（ＲＣＳ）ラット）への神経前
駆細胞、例えば成体海馬前駆細胞（ＡＨＰＣｓ）に関する、初の安定した形態学
的統合例が開示されている。驚くべき事にＡＨＰＣｓが異種レシピエント内に上
手く統合すること、例えばジストロフィックｒｄ−１マウスの網膜内にラットＡ
ＨＰＣｓが統合することも見いだされている。

【０００７】即ち発明は、レシピエントがドナーにとって同系（同一種及び遺伝的株の）、
同種異系（同一種であるが異なる株）、又は異種（異なる種の）であるかにかか
わらず、成体由来神経前駆細胞をヒト又はその他動物レシピエントに導入するこ
とで、損傷を受けた、又は病気の分化した神経組織を修復し、交換し、増やし又
は救済する方法を包含する。具体的には、方法は健康ドナー由来の神経前駆細胞
を成体又は若年動物を含む動物レシピエントのジストロフィーを起こしている神
経組織内に導入することを含む。発明の実施態様の一つは、成体ドナー動物由来
の神経前駆細胞、例えばＡＨＰＣｓを動物レシピエントのジストロフィーを起こ
している眼に導入し、神経細胞を伴うジストロフィー性網膜又は視神経を増殖し
、または救済することを包含する。

【０００８】神経前駆細胞はレシピエントの中枢神経系、眼、視神経、又は硝子体内に設置
されることでジストロフィー性神経組織内に導入される。レシピエントは未熟（
若年）又は成熟（成体）動物のいずれでもよい。

【０００９】好都合には、神経前駆細胞は海馬又は脳室域の様な成体脳組織である。神経前
駆相棒は好ましくはクローン由来である。神経前駆細胞は、ジストロフィー神経
組織部位に導入される前に、神経増殖因子；ニューロトロフィン；マイトーゲン
；サイトカイン；増殖因子；ホルモン；及びその組み合わせより成るグループか
ら選択された少なくとも１種類の栄養因子を含む培養培地内にてインビトロ培養
されるだろう。

【００１０】発明の詳細な説明本発明はジストロフィー神経組織内に神経前駆細胞を成功裡に移植することに
関する。実際的には、発明は成体動物ドナーに由来する神経前駆細胞を動物レシ
ピエントのジストロフィー神経組織内に導入すること、例えば成体前駆細胞を障
害組織内に移植し、又は適用することを含むジストロフィー神経組織を治療する
方法を含む。

【００１１】レシピエントは若年（未熟）動物でも成体（成熟）動物でもよい。神経前駆細
胞ドナー及びレシピエントは異なる種（異種）でもよいだろう。ドナー−レシピ
エントの組み合わせの例には、ドナーがラットでありレシピエントがマウス、ド
ナーがマウスでありレシピエントがラット；ドナーがブタでありレシピエントが
ヒトであるものが含まれるが、これに限定されない。ドナー及びレシピエントは
同一種（例えばヒトからヒトへ、ラットからラットへ、マウスからマウスへ）で
も、同種異系（異なる株、即ち異なる組織適合性遺伝子を持つ）又は同系（同一
株、即ち同一の組織適合性遺伝子を持つ）であろう。

【００１２】発明により治療できるジストロフィー神経組織の例には中枢神経系（ＣＮＳ）
及び眼の神経組織、特に網膜又は視神経が含まれる。即ち実施態様の一つでは発
明は、成体ドナー（例えばＡＨＰＣｓ）由来神経前駆細胞を動物レシピエントの
ジストロフィー神経組織内に導入することを含む、神経細胞によるジストロフィ
ー網膜の再増殖又は救済を包含している。方法は特に視神経疾患、例えば緑内障
によるジストロフィー網膜組織の治療に特に有用である。

【００１３】ここで使用する用語“ジストロフィー神経組織”は、障害された、損傷を受け
た、又は病気の神経組織を含み、前記神経組織は分化した神経細胞を含む。即ち
本発明は神経単位又は神経疾患または損傷の治療に関する方法を提供する。“神
経単位疾患”又は“神経疾患”は、神経系が関係する疾患又は病気である。神経
単位疾患の１つのタイプは神経退行型疾患である。神経退行型疾患は（１）基底
神経節に影響する退行条件を含む中枢運動系の病気（例えばハンチントン病、ウ
イルソン病、線条体黒質退行、皮質基底神経節退行、トーレット症候群、パーキ
ンソン病、進行型上核麻痺、進行性眼球麻痺、家族性痙攣性対麻痺、脊髄筋肉萎
縮、ＡＬＳ及びその変形、歯状赤核小脳萎縮症、オリーブ橋小脳萎縮症、経産婦
新生物性脳退行、脳血管症（遺伝性及び散発性の両方））；（２）感覚神経に影
響する病気（例えばフリードリッヒ失調症、糖尿病、末梢神経症、網膜神経退行
）；（３）大脳辺縁系及び皮質系（例えば脳アミロイド症、ピック萎縮症、ロッ
ツ症候群；（４）複数の神経系及び／又は脳幹が関係する神経退行性病変（例え
ばアルツハイマー病、ＡＩＤＳ−関連痴呆、レイ病、拡散性レーヴィ小体病、て
んかん、多系萎縮症、ギラン−バレー症候群、リポフスチン沈着症の様なライソ
ゾーム保存障害、ダウン症候群の後期−退行ステップ、アルパーズ病、ＣＮＳ退
行の結果としての目眩；（５）年齢及び慢性アルコールあるいは薬物乱用に伴い
生じる病理（例えばアルコール中毒を伴う青班核、小脳、コリン作動性基底前脳
内部の神経細胞の退行、加齢による感覚及び運動障害をもたらす脳神経及び円錐
神経の退行；及び（６）発作、病巣部虚血、血管不全、低酸素−虚血性脳症、高
血糖症、低血糖症、又は直接外傷の様な病巣性損傷による病理学的変化。

【００１４】神経単位又は神経退行性疾患または損傷の存在は、痛みの様な主観的症状、感
覚低下、筋力低下、協調性障害、平衡障害、神経衰弱症、倦怠感、反応時間の低
下、振戦、混乱、記憶障害、非制御型運動、情動消失、強迫／強制行動、失語症
、失認症、視覚喪失症等を含む感覚の変化により指示されるだろう。医師又は医
療関係者により観察される客観的指標、あるいは兆候は主観的指標に重複するこ
とが多い。客観的指標には、医師による反応時間低下、筋肉拘束、振戦、硬直、
痙攣、筋力低下、協調不良、見当識喪失、失語症、失認症及び平衡障害の様な兆
候の観察が含まれる。更に、客観的兆候はポジトロンエミッション断層撮影（Ｐ
ＥＴ）又は機能的核磁気共鳴映像法ＭＲＩによる神経組織消失及び機能に関する
評価、血液試験、生検及び筋電図データの様な電気的試験を含むことができる。

【００１５】ジストロフィー神経組織を“治療すること”は、病気にかかり、又は損傷神経
組織を修復し、交換し、増加し、救済し、又は再増殖させること、又は神経組織
のジストロフィー状態を代償することを包含することを目的とする。

【００１６】ジストロフィー神経組織（例えば、損傷し、又は病気にかかった網膜又は視神
経）内への神経前駆細胞の“導入”は、移植及び注入を含む医療分野に知られる
いずれかの方法により達成できるが、これに限定されない。神経前駆細胞導入に
これら方法はまた、神経前駆細胞がジストロフィー部位に移動し、そして一体化
できることから、病気の又は損傷を受けた神経組織部位とは別の、及び／又は離
れた部位へそれらを置くこと、注入すること、又は移植することも含む。例えば
、ジストロフィー網膜又は視神経組織は、神経前駆細胞を眼の硝子体内に位置せ
しめることで治療することができる。

【００１７】発明に使用された神経前駆細胞は、健康成体動物ドナーに由来し、そして海馬
又は脳室域の様な脳組織に由来するだろう。好都合には、成体海馬前駆細胞（Ａ
ＨＰＣ）、特に増殖条件下にインビトロにて培養されたクローン性のＡＨＰＣｓ
が利用されるだろう。

【００１８】ここで使用する場合、用語“前駆細胞”は幹細胞、及び前駆細胞を含む分化能
力を持つ細胞を意味する。未分化細胞に対し分化細胞は、特定タイプの組織学的
メンバーの様にそれを規定する明瞭に規定された形態を持つ。細胞は哺乳動物細
胞だろう。別実施態様では、細胞はヒト細胞の様な霊長類細胞である。ここに用
いられる前駆細胞は、その系列子孫が適当な経路を経て完全な分化表現形を生ず
る未分化細胞、及び高度な増殖能力を示し、組織の原理的表現形を含む広範な分
化型子孫を生じ、自己更新能力を持ち、そしてそれら多系列能を長期間維持する
未分化細胞である胚性又はその他細胞系の両方を意味している（Ｇａｇｅら、（
１９９５）ＡｎｎｕＲｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１５９−１９２，
それぞれ参照されここに取り込まれている）。いずれの分化細胞も、その定義
によれば前駆型細胞を持っている。例えば神経芽細胞の様な“神経前駆細胞”は
神経単位の前駆細胞であり、生殖細胞のそれは胚細胞である。

【００１９】更に、前駆細胞が１つのタイプの細胞だけに分化するものでないことは容易に
理解される。例えば、神経前駆細胞は一次的には神経単位を生ずるが、しかしこ
れら細胞はまたアストロ細胞、神経膠細胞及び乏突起神経膠細胞も生ずる。当業
者は分化した細胞に関連する前駆細胞を容易に認識するだろう。幹細胞は分裂し
て異なる運命を持つ２嬢細胞を生ずる：１つは母細胞と同一の別の幹細胞であり
、もう一つは分裂しより分化した細胞を生ずるであろう系列前駆細胞である。成
体動物では、幹細胞は大部分の組織系に生じる。例えば骨髄は全ての血液細胞及
び筋肉を生じる。

【００２０】発明の治療上の利点は、治療を受ける状態の反応を指示する複数の主観的又は
客観的要素の幾つかにより評価され、又は算定される。その様な指標には、神経
又は神経単位の増殖増加、又は生存能領域のより一般的機能の測定が含まれる。
更に、侵襲的又は非侵襲的である発明の硬化を評価する巨視的方法を利用するこ
とができる。治療利益を証明する別の例には、客観的評価、治療前の処理速度に
対する規定タスク処理速度の増加、及び神経伝達速度試験を含む、認識機能の臨
床評価が含まれる。

【００２１】発明の別の観点では、神経前駆細胞は少なくとも１種類の栄養因子、またはそ
れら因子の組み合わせを含む培養培地中でインビトロ好ましく培養される。ここ
で使用される用語“栄養因子”は、それらの標的細胞の増殖、分化、移動、生存
及び／又は死（例えばアポトーシス）を促進し、及び／又は制御する栄養作用を
持つ化合物を意味する。この様な因子には、上皮成長因子、繊維芽細胞成長因子
、血小板由来成長因子、インシュリン様成長因子、毛様体神経栄養因子及び関連
分子、神経膠由来増殖因子とその関連分子、神経鞘腫由来増殖因子、神経膠増殖
因子、線条由来神経栄養因子、血小板由来増殖因子、肝細胞増殖因子、散乱因子
（ＨＧＦ−ＳＦ）、形質転換増殖因子ベータとその関連分子、神経伝達物質及び
ホルモンが含まれる。当業者は、本発明に利用可能な追加の栄養因子を認識する
だろう（例えばＡｅｂｉｓｃｈｅｒら、ＮｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃＦａｃｔ
ｏｒｓ（ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｈａｒｍａ
ｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３４）（ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，
１９９８）；Ｍｅｙｅｒｓ，Ｒ．Ａ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉ
ｃｉｎｅ：ＤｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆＤＮＡ− ＧｒｏｗｔｈＦａ
ｃｔｏｒｓ（ＶＣＨＦｕｂ，１９９６）；Ｍｅａｇｅｒ＆Ｒｏｂｉ
ｎｓｏｎ，ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ：ＥｓｓｅｎｔｉａｌＤａｔ
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＆Ｂｒｏｗｎ，ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓａｎｄＲｅｃｅｐｔｏ
ｒｓ；ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９８９）；Ｌｅｒｏｉｔｈ＆Ｂｏｎｄ
ｙ，ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓａｎｄＣｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎＨ
ｅａｌｔｈａｎｄＤｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ１Ａａｎｄ１Ｂ：Ａ
Ｍｕｌｔｉ−ＶｏｌｕｍｅＴｒｅａｔｉｓｅ（ＪＡＩＰｒ，１９９６）
；Ｌｅｎｆａｎｔら、ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓｏｆｔｈｅＶａｓ
ｃｕｌａｒａｎｄＮｅｒｖｏｕｓＳｙｓｔｅｍｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
：ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙｏｆＧｒｏｗ（Ｓ．ＫａｒｇｅｒＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
，１９９２を参照）。

【００２２】 “栄養因子”は広範囲の生物活性を持ち、その活性及び特異性は他因子との協
調により達成されるだろう。栄養因子は一般には極めて低濃度で活性であるが、
多分化能神経前駆細胞集団の増殖を誘導するためには、高細胞密度での高濃度マ
イトーゲンが求められることが多い。例えば、初期前駆細胞に関する増殖因子は
、前駆細胞の生存率を高めること、及び前駆細胞プールによる成熟細胞の更新に
より病気を治療することに有用であろう。

【００２３】本発明での利用を考える上で好ましい栄養因子は、前駆細胞、例えば脳より分
離された神経前駆細胞の増殖及び／又は継代を誘導する、繊維芽細胞増殖因子−
２（ＦＧＦ−２）の様な有糸分裂促進増殖因子（Ｇａｇｅ，Ｆ．Ｈ．，ら、１
９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１１
８７９−１１８８３）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｌｏｉｓ，Ｃ．，とＡ
ｌｖａｒｃｚ−Ｂｕｙｌｌａ，Ａ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（５）：２０７４−２０７７）である、
サイトカイン、ニューロトロフィン、成長因子、マイトーゲン、補助因子等が含
まれる。培養した単一細胞の研究は、ＦＧＦ−２（Ｇｒｉｔｔｉ，Ａ．ら、
１９９６、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：１０９１−１１００）及びＥＧＦ
（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｂ．Ａ．及びＷｅｉｓｓ，Ｓ．，１９９６，Ｄｅｖ
ｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．１７５：１−１３）が多分可能型神経幹細胞に関する
有糸分裂促進剤であり、他栄養因子と協調するらしいことを示した（Ｃａｔｔａ
ｎｅｏ，Ｅ．，ａｎＭｃＫａｙ，Ｒ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ
３４７：７６２−７６５；Ｓｔｅｍｐｌｅ，Ｄ．Ｌ．とＡｎｄｅｒｓｏｎ，
Ｄ．Ｊ．，１９９２，Ｃｅｌｌ７１：９７３−９８５）が、その内の幾
つかは特性を発揮するかについてはまだ未知である（Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ａ，
とＴｅｍｐｌｅ，Ｓ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ３７２：２６３−２６
６；Ｔｅｍｐｌｅ，Ｓ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３４０：４７１−
４７３；Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，Ｉ．Ｊ．，とＢａｒｔｌｅｔｔ，Ｐ．
Ｆ．，１９９３，Ｎｅｕｒｏｎ１０：２５５−２６５；Ｆａｌｍｅｒ，
Ｔ．Ｄ．ら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：３
８９−４０４）。

【００２４】ここで使用される場合、神経前駆細胞は栄養因子、又は栄養因子の組み合わせ
存在下に培養することができる。例えばこれら細胞は神経又は神経膠細胞の生存
率及び機能活性を促進する“ニューロトロフィン”（又は“神経栄養因子”）を
有し、神経分化を促進し、神経増殖を誘導し、シナプス機能に影響し、そして／
又は中枢及び末梢神経系発生の別の期間に正常では死ぬべき運命にある神経細胞
の生存を促進し含む培地中で培養することができる。ニューロトロフィンの例に
は毛様体神経栄養因子（ＣＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、繊維芽細胞増殖因
子（ＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（Ｎ
Ｔ−３）、神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）等が含まれる。これら因子
はそれらが持つ栄養作用、脳内でのそれらの発現パターン及びそれらの受容体及
び細胞内シグナル伝達経路の分子的観点により特徴付けられる。これまでに同定
された神経栄養因子にはＮＴ−４、ＮＴ−５、ＮＴ−６、ＮＴ−７、毛様体神経
栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経膠株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、及びプルプリ
ンが含まれる。神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）は神経生存因子であることが判
明している。神経栄養活性を持つものの通常はニューロトロフィン類に分類され
ない、広い範囲の機能を持つその他神経因子も発明での利用に関し考慮される。
これら因子には、上皮成長因子（ＥＧＦ）、へパリン結合神経突起−促進因子（
ＨＢＮＦ）、ＩＧＦ−２、α−ＦＧＦ及びｂ−ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、神経特異的エ
ノラーゼ（ＮＳＥ）及びアクチビンＡが含まれる。特に神経単位生存率に影響し
なく神経分化に影響し、且つ神経伝達物資表現形に影響するその他因子も特定さ
れている。成体ラットＳＶＺではＦＧＦ−２脳内投与は神経新生を促進すること
がしめされているが、成体ラット海馬中でのＦＧＦ−２単独の硬化は神経幹／前
駆細胞の増殖に対し限定的な効果しか有していない（Ｋｕｈｎら、（１９９７）
：Ｗａｇｎｅｒ（１９９９）ら、それぞれ参照されここに取り込まれている）。

【００２５】発明の好適実施態様では、本発明はａ−ＦＧＦ、ＦＧＦ−２の様なｂ−ＦＧＦ
ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６等を含むＦＧＦ及びＦＧＦ−様因子を利用する。神経
前駆細胞を培養するために特に有益な培地は以下の一つを含む；繊維芽細胞増殖
因子（ＦＧＦ）単独（特に塩基性ＦＧＦ又はＦＧＦ−２）、ＦＧＦ＋上皮増殖因
子（ＥＧＦ）、又はＦＧＦ＋ＥＧＦ＋有糸分裂促進因子であるヘパリン。

【００２６】例えば、神経前駆細胞は以下のステップにより誘導されるだろう：（ａ）新鮮神経前駆細胞を成体ドナー動物から分離すること；（ｂ）前記新鮮分離神経前駆細胞をポリオルニチン／ラミン−コート異質上に
て、ＦＧＦ−２単独、ＦＧＦ−２＋ＥＧＦ、及びＦＧＦ−２＋ＥＧＦ＋へパリン
から成るグループより選択された栄養因子を少なくとも１種類含む培養培地内に
て培養するステップ；（ｃ）同定される遺伝マーカーを前記培養前駆細胞内に取り込ませるステップ
；及び（ｄ）ステップ（ｃ）より得た培養細胞から個々の海馬前駆細胞系をクローニ
ングするステップ。

【００２７】発明の方法はレシピエント内に神経前駆細胞を導入する前に、クローナルに誘
導された海馬前駆細胞のサンプルを誘導することで、前記のクローナルに誘導さ
れた成体海馬前駆細胞の各クローンが、生細胞の培養体より取り出され、続いて
濾過された培地又は上清を意味する当分野用語である“コンディショニング培地
”中で分化できる系統能について確認することも更に含む。

【００２８】発明はまた以下を含む、成体ドナー動物由来の神経前駆細胞系統を産生するた
めのキットも包含する：（ａ）ポリオルニチン／ラミニン−コート基質（例えばコーティングされた組
織培養容器）；（ｂ）より、又はその組み合わせより成るグループから選択される栄養因子を
少なくとも１種類含む培養培地：（ｃ）成体動物より分離された海馬前駆体細胞（ＨＰＣ）内への取り込みに適
した、これら細胞を培養した上で同定する遺伝マーカーを含むベクター（例えば
グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ））：（ｄ）成体ドナー動物より分離された海馬前駆細胞由来の海馬前駆細胞系統の
少なくとも１つをクローニングすることに関する取り扱い説明書を含む製造者資
料。

【００２９】本発明の更に別の実施態様では神経疾患を治療する方法が提供され、前記方法
はジストロフィー組織内の成体前駆細胞のレベルを増加させることを含む。前駆
細胞はエクスビボ（インビトロで細胞を培養することにより）組織内に移植する
ことができるか、又はインビボに培養することができる。ここで意図する場合、
前駆細胞はジストロフィーに対し未変性のものであるが、インビボ又はインビト
ロに栄養因子を投与することで継代及び／又は増殖できる。本発明の好適実施態
様では、前駆細胞はインビトロにて継代又は増殖され、ジストロフィー組織内に
取り込まれるか、又は再取り込みされる。あるいは、栄養因子がジストロフィー
組織内に投与され、天然又は移植された前駆細胞のレベルを増加させることがで
きる。

【００３０】発明を以下、非限定実施例により更に説明される。

【００３１】実施例Ｉ：種間、同種網膜移植体遺伝的に緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を発現する様変更されたクローン性成体ラ
ット海馬前駆細胞（ＡＨＰＣｓ）を様々な年齢のジストロフィーＲＣＳラットの
眼に注射した。継続的に検査したところ、これら動物の網膜は、宿主網膜の全て
の層内に緑色蛍光蛋白質を発現している（ＧＦＰ^＋）ドナー細胞が広範囲に移動
していることを示した。移植された細胞は、移植後最低２ヶ月は顕著な免疫反応
を惹起することなく生存した。更に、ＧＦＲ＋細胞は既存の細胞構造に並列し、
網膜神経に関し適切な形状である突起状の形態を示した。同様の結果は未熟及び
明瞭に成熟しているレシピエント動物の両方について得られた。これら結果は、
同種ドナーからの成体由来神経前駆細胞系統を利用することで、ジストロフィー
網膜が実質的に再増殖したこと、及びこれら細胞が宿主神経網内にて顕著に樹状
突起形態を形成することから、これら細胞が機能的に統合されることを示してい
る。

【００３２】最近、成体齧歯動物海馬内に存在している増殖性細胞（ＡｌｔｍａｎとＤａｓ
，１９６５）を分離でき（Ｐａｌｍｅｒら、１９９７）、培養でき（Ｇａｇｅ
ら、１９９５と１９９８）、そしてＣＮＳ内にある各種部位に移植することがで
き、それらが各種神経単位に分化できることが示された（Ｇａｇｅら、１９９５
；Ｓｈｉｂａｂｕｄｄｉｎら、１９９７；Ｓｕｈｏｎｅｎら、１９９６）。本デ
ータは移植された成体海馬前駆細胞（ＡＨＰＣｓ）が網膜移植に関しより効果的
なドナー材料源を提供することを示した。具体的には、データはこれら細胞が網
膜退行に関する広範な研究モデルである成体ロイヤルカレッジオフサージョンズ
（ＲＣＳ）ラットのジストロフィー網膜内に移動できることを示している（Ｌａ
Ｖａｉｌら、１９７５；ＭａｔｔｈｅｓとＬａＶａｉｌ，１９９９：Ｖｉｌｌｅ
ｇａｓら、１９９８）。

【００３３】即ち、移植されたＡＨＰＣ細胞は神経退行の活動期の間に成熟網膜内に移動し
、その中で分化することができる。

【００３４】方法ドナー細胞系統：海馬前駆細胞は修飾型クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔ
ｏｒｉａ）増強緑色蛍光蛋白質ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を発現する様に遺伝的に改良
された成体フィシャー３４４ラットよりクローン的に得た。幾つかの例では、細
胞は移植前にＢｒｄＵ（例えば５μｍ、２日間、又はより好適には５０ｎｇ／ｍ
ｌ、３日間に３パルス）のパルス処理を受けた。具体的にはＡＨＰＣｓは以下の
様に培養され、分化した。一次成体海馬前駆細胞培養体は既報の如くにして３ヶ
月齢、雌フィシャー３４４ラットの海馬組織より調製された（Ｇａｇｅら、１９
９５ａ）。解離細胞はポリオルチニン／ラミニンコーティング皿上にて、Ｎ２（
ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））及び２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（ヒト組換え体、大腸
菌にて調製、Ａ．Ｂａｉｒｄより好意により提供された）が添加されたＤＭＥＭ
／Ｈａｍ’Ｆ−１２（１：１）混合液を用い培養された。個々の細胞は、ｔｅｔ
−オペレーター（ＮＴＴ−ＧＦＰ）に融合されたテトラサイクリンで制御可能な
最小ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモータよりＧＦＰを発現する複製欠損
レトロウイルスベクターを利用して遺伝的にマークされた。クローン化された培
養体はバルク注射培養体より得た。各ＡＨＰＣクローンはネオマイシンフォスフ
ォトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）及び増幅緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝
子を持っている。移植前に各クローンの系統能を確認するために、ＦＧＦ−２を
除き、そして０．５μＭの全トランス型レチノール酸及び０．５％の胎児牛血清
を添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎ２で１４日間処理することで、４ウエルチャ
ンバースライド内にてＡＨＰＣｓを２，５００細胞／ｃｍ^２の細胞密度で分化誘
導した。これら条件はこれまでに単一ウエル中での神経単位、アストロ細胞及び
乏樹状突起細胞の分化に好ましいことが示されている（Ｐａｌｍｅｒら、１９９
７）。ＡＨＰＣｓは以下の方法にて移植に備え調製された。培養ＡＨＰＣｓはト
リプシンにより集められ、高グルコースドルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のＰＢ
Ｓ（Ｄ−ＰＢＳ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））で洗浄され、１ｍｌ当たり２０ｎｇの
ＥＧＦ−２を含むＤ−ＰＢＳ中１μｌ当たり１００，０００細胞の密度に検濁さ
れた。

【００３５】レシピエント動物及び移植：日齢３−２８日の有色ジストロフィーＲＣＳラッ
ト（屠殺前移植期間；１週、ｎ＝２２；４週ｎ＝４１；１０週、ｎ＝６；１８週
、ｎ＝４；３６驟雨、ｎ＝９）及び白色ジストロフィーラット（移植期間：１週
、ｎ＝８；１０週、ｎ＝６）は全身（ケタミン／キシラジン）及び局所（プロパ
ラカイン）麻酔下、硝子体又は網膜下空間内にＡＨＰＣｓの注射を受けた。注射
は、立体外科用顕微鏡（Ｍｏｌｌｅｒ）を使い、同軸照明を利用して直接観察し
ながら、拡張された瞳孔（トロピカミド１％点眼剤）を通し実施された。注射は
５０μｌのハミルトン社製マイクロシリンジとＰＥチューブで接続された傾斜型
ガラスマイクロピペットを使い行われた。マイクロピペットの鋭利な先端により
、創傷部を自己密封しながら硝子体腔内に直接進入することが可能であり、侵入
点は角強膜接続部で硝子体化する。硝子体へのこのアプローチにより、毛様体及
びレンズの損傷を回避することができるが、間にあるブドウ膜及び末梢網膜に必
ず穿孔点が生ずる。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１−２μｌ中、合計５０，０００−１
００，０００個の細胞が注射された。コントロールとして、３回凍結融解（−７
０℃から）した細胞も注射された（ｎ＝６）。

【００３６】組織調製及び組織学：レシピエント動物は移植後１、２，４，８及び１６週後
に過剰量のペントバルツールナトリウムにより屠殺された。眼を取り出し、４％
パラフォルムアルデヒド中に４週間、４℃にて浸漬固定された。次に前部分及び
レンズが除かれ、後部分を３０％ショ糖／ＰＢＳ中に、一晩、４℃にて凍結保護
し、続いてＯＣＴ中に包埋、クライオスタットにて７−１４μｍでに切片化され
た。切片はヘマトキシリン及びエオシン、抗ＢｒｄＵ（１：４００）、抗シナプ
トフィシン（１：２００）及び抗ＧＦＰ（１：５００）、抗カルビンジン（１：
１０００）、抗ロドプシン（１：２００）又は抗ＮＦ−２００（１：４０）、抗
ＭＡＰ−５（１：５００）、抗ＧＦＡＰ（１：２００）で処理され、続いてＣｙ
３−標識二次抗体（１：１５０）に反応させ、移植されたＡＨＰＣｓ中に発現さ
れた内因性のＧＦＰとこれらマーカーを共存させた。特に興味深い材料のサブセ
ットに共焦点顕微鏡観察を実施した。

【００３７】形態：多数の移植細胞を含む網膜を分析し、移植４及び８週後のそれらの層局
在を決定した。移植齢（１、４及び１０週）についても比較した。各動物につい
て、中央及び末梢域の両方が含む様に選択された合計９の５０μｍ幅の切片化網
膜を分析した。

【００３８】結果：緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を発現する様に遺伝的に修飾され、かつ一部
はＢｒｄＵにより標識もされている成体フィシャー３４４ラット由来のクローン
性ＡＨＰＣｓをＲＣＳラットの未成熟（誕生３日後、Ｐ３）及び成熟（誕生４−
３６週）ジストロフィー眼内に移植した。移植後、ドナー由来細胞が高レベルの
ＧＦＰ発現を維持することが見いだされた。ＧＦＰ^＋細胞はＦＩＴＣ発光により
極めて明瞭であり、抗ＧＦＰ免疫反応性、抗ＢｒｄＵ免疫反応性、及び構成的Ｇ
ＦＰ発現（データ未提示）に基づき移植体起源であることが証明された。ＧＦＰ
＋細胞は極めて明瞭な外観を呈しており、その強度、形態、局在及び空間特異性
に基づきレシピエントの宿主光受容体外断片の自己蛍光と容易に区別することが
できた。従って続くドナー由来細胞も、ＧＦＰ蛍光のみに基づき同定され、Ｂｒ
ｄＵによる前標識又は抗ＧＦＰ抗体の利用は必要なかった。

【００３９】未成熟及び成熟ジストロフィーＲＣＳラットの硝子体内へのＡＨＰＣｓ注射４
週後、注射された細胞の少なくとも５０％が生存し、そして１，４，１０及び１
８週齢のレシピエントの約８０％で高レベルのＧＦＰ発現を維持されていたのに
対し、３６週齢のレシピエントでは生存細胞は認められなかった。

【００４０】移植１週間後には、既に移植されたＡＨＰＣｓの移植レシピエントの硝子体表
面又は宿主眼表眼への接着、宿主網膜内への移動、及び外核層を含む宿主の細胞
網膜層内への定着を認めることができた。幾つかの倍、移植された細胞は宿主の
光受容体層内に認められ、抗ＢｒｄＵを用い検査した場合、ＧＦＰとＢｒｄＵに
より二重染色されることが見いだされ、この細胞が移植されたＡＨＰＣｓに由来
することが確認された。凍結融解ＧＦＰ^＋ＡＨＰＣｓを注射した後、ドナー細胞
の生存又は宿主ＧＦＰ発現の証拠はなかった（陰性コントロール）ことから、参
照されここにとりこまれているＴａｋａｈａｓｈｉ１９９８が報告した観察が
確認された。

【００４１】移植後の各種時間に於いて、移植されたＡＨＰＣｓが宿主網膜内に移動し、形
態学的に統合されることが認められた。ＧＦＰ＋細胞は１，４，１０及び１８週
齢時に移植された動物のそれぞれ６０％、３５％、４８％及び６０％に認められ
た。移植８週後では、移植時１週齢であったレシピエントの８０％、そして同４
週齢であったものの５０％に於いて、網膜内ＧＦＰ＋細胞が見いだされた。

【００４２】表Ｉ

【００４３】表１は代表的な１、４、及び１０週齢レシピエント内に移動したＡＨＰＣｓの
層分布を示す。大部分の移植細胞はガラス体内に残り、網膜内に進入し、各種層
内に移動した。移植細胞は神経節細胞及び内顆粒層内にも見いだすことができる
が、それらは外網膜、特に外顆粒層、網膜下壊死組織域及び光受容体要素の介在
層（一括して“ＯＮＬ／ＳＲＳ”と命名）に偏向性を示した。より遅い時点（注
射８週後）でもＯＮＬ／ＳＲＳ内の細胞数はまだ多かった。ＧＥＦ＋細胞は損傷
を受けていない硝子体表面を通り半径方向に直接移動するか、又はより多数は末
梢注射され続いて側部に移動し、網膜に達すると考えられた。後者では、細胞が
神経網膜の長軸方向域の６０％以上に移動進入することができる。ＡＨＰＣｓの
移動経路を問わず、ＧＦＰ＋細胞は宿主網膜の全ての層内に見いだされるが網膜
色素上皮、脈絡膜又は強膜内には見いだされない。

【００４４】図１ａ−ｆは各種年齢のラットに於ける特異的網膜層に移植されたＡＨＰＣｓ
の局在を描写している（４週（ａ−ｄ）；１０週（ｅ）、及び１８週（ｆ））。
細胞（緑）は４週（ａ−ｄ）、１０週（ｅ）及び１８週（ｆ）齢ラットのガラス
体内に移植され、４週後に検査した。網膜強膜は抗シナプトフシン／Ｃｙ３抗体
（赤）で標識され、宿主網膜のシナプス及び細胞層を区定し、ＦＩＴＣ及びＣｙ
ｓ蛍光発光の下視覚化された。図１ａの矢印は図１ｂ内により大きな倍率で示さ
れる細胞を示す；図１ｃ内の矢印は、図１ｄ内に高倍率で示される細胞を示す（
ｖｉｔ、ガラス体；ｇｏｌ、神経節細胞層；ｉｐｉ、内網状層；ｏｎｌ、外顆粒
球層；ｓｒｓ、網膜下壊死細胞及び変性光受容体要素）。

【００４５】図１では、神経形態を示す多くのＧＦＰ＋細胞が認められた。これら細胞は宿
主網膜のいずれの細胞層にも見いだされるが、より内網状層（特に内網状層）で
強い傾向を示し、そこでは軸をより密に発達させている。更に、移植された細胞
から延びる神経突起の形状は正常な網膜神経単位の形状に似ることが多かった；
神経突起は側部（即ち水平方向又は無軸策細胞に似て）又は半径方向（即ち、呂
極性細胞突起に似て；図１ｂ参照）。これは外因性又は内因性発生因子を反映し
たものであるか、又は単純に局所の網膜細胞構造に組み込まれた制限の帰結であ
るかは定かではない。

【００４６】更に、発明の方法により処理されたレシピエント動物の更なる研究（移植時１
週齢の）からは、移植された細胞が移植８週前後に視神経内へ軸策成長を示すこ
とが表されている。

【００４７】多くのマーカーを評価し、移植された細胞が成熟神経表現形に適合しているか
決定した。結果は図２ａ−ｉに示されている。図２ａ−ｉは、移植されたＡＨＰ
Ｃｓによる神経マーカーの発現の共焦点イメージを描写する。図２ａ−ｃは４週
齢に移植され、移植４週後に検査された動物に関する；構成的ＧＦＰ発現（ａ）
、抗カルビンジン／Ｃｙ３免疫反応性（ｂ）、及び統合画像である。矢印は、こ
れら標識体を共発現している２細胞を示す。図２ｄは１０週齢に移植され、移植
４週後に検査された動物の図であり：構成的ＧＦＰ発現（ｄ）、ＭＡＰ−５／Ｃ
ｙ３免疫反応性（ｅ）、統合画像（ｆ）。矢印はこれら標識対を発現する２細胞
を示す。図２ｇ−Ｉは、１６週齢時に移植され、移植１週間後に検査したもので
あり：構成的ＧＦＰ発現（ｇ）、抗ＮＦ−２００／Ｃｙ３免疫応答性（ｇ）、及
び統合画像（ｉ）。矢印はこれら標識体を共発現する２細胞を示す。

【００４８】ＧＦＰ＋細胞の亜集団は、幾つかの網膜間神経単位に見いだされるマーカーで
あるカルビンジンを発現することが見いだされているが（図２ａ−ｃ）、その他
は神経マーカーＭＡＰ−５（図２ｄ−ｆ）又はＮＦ−２００（図２ｇ−Ｉ）を共
発現する。これらの結果は、正常動物の発生中の眼に移植されたＡＭＰＣｓが神
経マーカーを発現できないという初期報告と対照的であった（Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉ、１９９８）。これらマーカーは網膜特異的ではないが、網膜として新規部位
に移植されるとそれらは成熟神経単位表現形を生ずることができる海馬由来前駆
細胞である。これらマーカーの発現は内顆粒層内に移植されたＡＭＰＣｓに限定
されたカルピンジン発現を伴い、位置的にも適切であり、ＮＦ−２００の発現は
主に神経節細胞層に認められた。明らかに移植されたＡＨＰＣｓはＧＦＡＰ発現
又はアストロ細胞の形態発生の証拠を示さず、変性網膜の微小環境内での神経分
化に関する偏向性を示唆している。

【００４９】ＧＦＰ＋細胞は精巧な神経突起をしばしば発生させることから、ドナー神経突
起とシナプトフィシン発現との関連性が研究された。網膜全体に広く分散するも
のの、大部分のシナプトフィシンは宿主起源に一致し網状層に局在した。細胞層
に於けるそれらの位置より、移植された細胞はしばしばこれらの層の中に明らか
に方向性を持って突起を伸ばしている。

【００５０】図３ａ−ｈは、内網状層（ａ−ｄ）又は外網状層（ｅ−ｈ）（４週時に移植さ
れ、移植４週後に検査された）内に突起を送る移植ＡＨＰＣｓ（緑）を示す抗シ
ナプトフィシン／Ｃｙ３（赤）抗体で処理された移植細胞の共焦点画像を描いて
いる。図３ａ−ｂでは、細胞は統合的（ａ）及び構成的に示され（ｂ）、全神経
突起軸が示されている。図３ｃ−ｈでは、ＡＨＰＣｓは神経突起を内網状層（ｃ
、ｄで高倍率拡大）及び外網状層（ｅ＋ｇ、それぞれｆ＋ｈで高倍率拡大）。こ
れら突起は相互に絡み合い、宿主のシナプトフィシン陽性プロフィールに接する
様に見える。

【００５１】図３ａ−ｄでは、大型ＧＦＰ＋細胞は宿主内網状層内に神経突起を伸ばすこと
が観察されるが、図３ｅ−ｈは宿主外網状層と絡み合う精緻な軸を持つ細胞を示
す。図３ａ−ｂはＧＦＰ＋軸の形状が熱網状層の方向性を反映する方法の１例を
提供している。１つの突起はＩＮＬ／ＩＦＬ界面に沿って走るが、ＩＬＰ内の偏
り位置よりデル別の突起はそれに続く層界面を欠くものの反対方向に平衡に走る
と予想される。共焦点分析は、ＧＦＲ＋突起の大部分が宿主シナプトフィシン＋
プロフィール（図３ｅ−ｈ；４週齢宿主内への移植４週後）に直接付加されるこ
とを確認する。

【００５２】移植されたＡＨＰＣｓは突起を宿主視神経内に伸ばすこともできる。神経節細
胞内にある移植細胞は大型成長円錐を持つ神経突起を伸ばすが、これは１週齢の
宿主への移植４週後には、強膜出口レベルで入り込むことはないが近接する（図
４ａ−ｂ）。図４ａ−ｃは移植４週後の宿主視神経繊維層を通り、視神経頭内に
伸びるＧＦＰ＋神経突起の共焦点イメージを示す。これら繊維は大型の成長円錐
を持つ（図４ａ内の矢印、及び図４ｂに拡大図）が、これは１週齢宿主内へ移植
４週後に強膜出口（”ｓｃ”と印されている）を通過しないが、これに接近する
。動物を移植８週後に検査すると、多くの成長円錐を先端に持つ突起が神経細胞
内に入り込むことが認められ、強膜を越えて３００μｍ以上延びることが見いだ
されている（図４ｃ）。

【００５３】移植８週後での検査では、成長中の神経突起の大部分が強膜出口を横断し、視
神経内に少なくとも３００μｍの長い突起を伸ばす（図４ｃ）。時間経過に伴う
ＧＦＰ^＋突起の密度の顕著な増加は、ＡＨＰＣｓが少なくとも移植８週間、神経
様経路に沿って発達することを示している。

【００５４】免疫学的拒絶、細胞生存率の低下、又は遺伝子発現の低下の証拠は本研究に関
しては観察されなかった。様々な宿主での移植体生存率及びの取り込み率の範囲
（移植時１０週齢までの動物への高レベルの取り込み、１８週齢レシピエント内
に見られる低レベル取り込み、３６週齢レシピエントでの無生存）は、ＲＣＳ網
膜内に起こる進行性の退行（３週齢に始まる）が、この生存率に関係しているこ
とを示している。誕生３週終了前にラット網膜は発生を完了することから、４週
及び１０週時に見られた広範な取り込みは、発生の成熟が病気の哺乳動物網膜に
よるＡＨＰＣｓの受け取りの障害にならないことを示している。考察

【００５５】本研究は、成体の分化した神経組織に由来する神経前駆細胞が（例えば海馬）
が、幾つかの例では光受容体層を含む成熟動物のジストロフィー神経網膜の全層
中に移動できることを示している。

【００５６】移動後、移植されたＡＨＰＣｓは局所の層構造を尊重し、元の網膜細胞型を示
唆する形態学的特徴を持った神経単位に分化するという驚くべき能力を示した。

【００５７】網膜内のＡＨＰＣｓにより伸びた細胞突起は、両極性又は水平細胞を示唆する
内網状層内に於ける下層特異的分岐を含む特異的網膜神経単位の神経単位プロフ
ィールに似る傾向にある（Ｄｏｗｌｉｎｇ、１９７０）。更に、これら下層域に
沿って拡散性のＧＦＰ−由来蛍光の明瞭なバンドが存在することから、宿主神経
網内での微細末端のネットワークが示唆される。

【００５８】これらデータは、ＡＨＰＣｓの様な神経前駆細胞が１０週齢までの動物の網膜
内に機能的に統合できること、そしてＲＣＳ網膜が激しく変性し他の介入が向こ
うになる年齢である１８週齢レシピエントへの取り込みが制限されることを示し
ている。しかし３６週齢では、ＡＨＰＣｓは網膜内に進入できないだけでなく、
生存細胞も殆ど無く、重要な栄養作用の消失がジストロフィーの経過を遅らせた
ことを示唆している。

【００５９】ガラス体から網膜内への移動すると、移植されたＡＨＣＰｓは相互に接着した
ままでなく胚性神経移植体に典型的に見られる如くに宿主組織内に拡散する。存
居場所を確保した後、これら細胞は神経（神経膠とは反対に）系に分化し、宿主
網状層内に突起を伸ばす。更に、これら突起の多くの方向は、網膜の無樹状細胞
の樹枝分岐パターンを想起させる。神経節細胞層内のＡＨＰＣｓは神経突起を視
繊維層及び視神経内に伸ばす。

【００６０】ごく最近、神経前駆細胞は造血細胞系列細胞に分化することが見いだされたと
報告されており（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ１９９９）、海馬の網膜運命への移行は捨
てきれないことが示唆された。形態学的には、ＡＨＰＣ樹枝分岐は内部海馬の発
生プログラムを優先しながら外部網膜に反応するらしい。最終的にはここに報告
された移植体由来の神経突起が究極的に宿主シナプフシンプロフィールと結合す
るという所見はシナプス形成を決定的には示していないが、最近行われた同一Ａ
ＨＰＣ細胞系列を用いた別の研究はインビトロでのシナプス形成に関する電子顕
微鏡による証拠、並びに興奮性後シナプス電位を示している（Ｔｏｄａ１９９
９）。

【００６１】これらの結果は、ここで達成された神経再増殖法が単なる細胞浸潤又は無作為
な移動及び神経突起伸張ではなく、形態学的及び機能的統合を示しているとする
結論を支持している。

【００６２】ＡＨＰＣｓの様な神経前駆細胞は新生児の非ジストロフィー型同系フィシャー
ラット宿主内に移動し、統合する（Ｔａｋａｈａｓｉ１９９８，参照されここ
に取り込まれる）。ＡＨＣＰｓはまた機械的損傷を受けた成体同系宿主の網膜及
び成熟した、同種ＲＣＳラット宿主の疾患網膜内にも容易に移動する。

【００６３】前記結果は、幹細胞又は前駆細胞が病理の存在に反応するというごく最近の研
究と一致する。例えば、放射線照射を受けたマウスの血流に移植された神経幹細
胞は骨髄を再増殖する（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ１９９９）が、新生児戦慄マウスの
脳室内に移植された同様の細胞は失われた乏突起神経膠細胞の替わりになる（Ｙ
ａｎｄａｖａ、１９９９）。神経前駆細胞は高度な可塑性を明瞭に持っており（
Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ１９９９，ｆｌａｘ１９９８，Ｂｒｕｓｔｌｅ１
９９８，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ１９９９）、神経発生及び退行のメカニズムの研
究に適した新規ツールを提供する。

【００６４】今回示したデータは、病気の成熟網膜内に移植された細胞の生存、移動及び神
経分化に関する最初の決定的証拠を提供する。本研究は、神経前駆細胞が成熟哺
乳動物の中枢神経系内に存在する神経統合に関する障害の多くを解決できること
を示している。

【００６５】同種異系条件下での広範な形態学的統合に関する本観察はまた、移植された前
駆細胞の移動と分化を促進する上で、宿主網膜の特異的環境が重要であることも
立証している。同じ事が、ＡＨＰＣｓが統合された他の特異化した、又は分化し
た神経組織についても期待される。

【００６６】本発明は最終的な目標である、眼中への回復性神経移植の達成；新規光受容体
の導入を可能にするだろう。データは、ＡＨＰＣｓの様な神経前駆細胞が神経単
位に似た細胞を伴うジストロフィー網膜の外顆粒層を再増殖できることを示して
いる。病気の眼に移植されたＡＨＰＣｓが示す驚くべき可塑性は、数年前まで不
可能と思われていた神経前駆細胞を使った光受容体細胞を持つ眼の再増殖は今や
現実的な目標であることを示している。

【００６７】神経移植分野の当業者は、本発明をどの様に利用し、ＡＨＰＣｓ及びその他神
経前駆細胞をどの様に操作して、機能能力、宿主免疫寛容、及び移植の長期的帰
結（例えば移植体の生存を促進すること、及び不要な増殖を制御すること）の様
な因子に答えさせるか認識するだろう。ジストロフィー性同種環境に於いて少な
くとも２ヶ月間生存することが示されたことは、病気の中枢神経系に前駆細胞を
移植することが最終免疫学的に成功したことを示している。

【００６８】ＡＨＰＣｓの様な神経前駆細胞は、網膜のあらゆる層に達し、局所の表現形上
の特徴を持つ細胞に分化できる。これら細胞は哺乳動物種に於ける網膜発生の研
究及び操作に関する待望の新規ツールを表す。神経前駆細胞はインビトロ中で継
代でき、移植後には明らかに成熟した動物において活動性に変性している網膜を
大きく再増殖できることから、これら細胞は神経細胞消失を含む網膜疾患の治療
にも有用であろう。ここに考察した結果の展望では、ＡＨＰＣｓ及びその他神経
前駆細胞は、それら前駆細胞がインビボで移植されたその他神経部位に適した神
経細胞系列に分化できると考えることは合理的である。従って、ＡＨＰＣ移植は
神経損失又は損傷を含む他神経疾患及び障害の治療にも有用であろう。

【００６９】実施例ＩＩ：異種移植性網膜移植ジストロフィーマウス網膜内に移植された成体ラット由来の海馬神経前駆細胞
の生存率を調べた。これら移植細胞はマウス宿主網膜内に統合し、前駆細胞内に
挿入された緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子の発現を維持することができる。

【００７０】方法成体フィシャー３４４ラットの海馬から培養された新生児前駆細胞を前述同様
に遺伝的に変更してＧＦＰを発現させ、クローン細胞系列を分離した。次にこれ
ら細胞を、免疫抑制せずに７日齢の“ｒｄ−１”マウスのガラス体中に移植した
（１μｌ中に５０，０００細胞）。移植２−４週後、眼を取り出し、切片を作製
した。

【００７１】結果と考察いずれの生存期間についても（移植後２週及び４週）、宿主マウスのガラス体
中には多くのＧＦＰ^＋細胞が認められた。多くの細胞が網膜の内側表面に接着し
、そこで長い、軸策様の突起を伸ばした。幾つかの例では、細胞は宿主網膜内に
移動し、そこでそれらは神経様表現形を表し、宿主神経網内に数多くの突起を伸
ばした。

【００７２】免疫抑制無しに異種移植性環境内に移植されたラットの成体神経前駆細胞は、
少なくとも４週間生存しＧＦＰマーカーの発現を維持できる。これら細胞は宿主
網膜内にも移動でき、そこでそれらは神経様表現形を表す。異種移植性多分化能
前駆細胞を移植プロトコールにてドナー組織源として利用することは、神経発生
及び神経組織可塑性を研究し、操作し、そして損傷を受けた中枢神経系（ＣＮＳ
）組織を修復するための有用な新規技術を提供する。ヒトの疾患では、本技術は
ブタ由来の神経前駆細胞の様な異種移植性の神経組織を使い、網膜及びその他神
経学的疾患及び神経消失を伴う傷害の治療することができるだろう。

【００７３】実施例ＩＩＩ：神経前駆細胞移植体を受領したラットに於ける生理学的改善ＡＨＰＣｓの様な神経前駆細胞は、盲齧歯動物の視力回復能力を持つ。最近の
実験は、ＲＣＳラットの目の中のＡＨＰＣｓ移植体が視覚性運動眼振（ＯＫＮ）
反射テストにより測定された様に、行動回復をもたらすことを示している。ＯＫ
Ｎは回転するコントラスト回折格子に対する反応を生む視力レベルに基づく不随
意反射である。これら回折格子は強度、コントラスト及び周波数により変えるこ
とができ、視力を正確に決定できる。ＡＨＰＣｓが移植された動物はＯＫＮ反応
を有することができ、一方コントロールの動物は反応を示さなかった。この視覚
行動２つの仮説メカニズムで説明できる：

【００７４】１）移植されたＡＨＰＣｓが能動的に網膜細胞構造体の中に統合され、何
らかの形で光受容体、内部神経単位、及び／又は網膜神経節細胞の様な視覚経路
に作用すること；及び／又は

【００７５】２）移植されたＡＨＰＣｓが宿主光受容体を救済した。もし後者が正しい
とすれば、ＡＨＰＣ移植は移植された細胞が宿主網膜内に好適様式にて統合でき
ることから、増大しつつある増殖因子供給の分野に関し大いに期待でき、インビ
トロで修飾して宿主内に特異分子を分泌することができるだろう。

【００７６】参考文献

【００７７】各種疾患での細胞交換に適した多分化能神経幹／前駆細胞のその他利用ＡＨＰＣｓは成体ラット海馬内に移植されると、そこで歯状回内の神経単位内
に移動し、分化する（Ｇａｇｅら、１９９５）。部位特異的移動及びこれら細胞
の統合は、嗅球に至る頭側移動経路内にそれらを移植することで試験される（Ｓ
ｕｈｏｎｅｎら、１９９７）。細胞はＲＭＰに沿って移動し、続いて側部の顆粒
細胞及びグロメラー細胞層に移動する。顆粒球細胞層に移動した細胞はカルビン
ジン／ＮｅｕＮ^＋細胞となり、またグロメラー細胞層に移動した細胞はトリプシ
ンヒドロキシラーゼ^＋神経単位になる（これらを起源とする細胞の典型的な表現
形）。同様に、新生児の眼に移植されたＡＨＰＣｓのクローン化集団は様々な層
に移動し、それら層に存在する細胞に特徴的な形態を取った。しかし、それら細
胞はいずれの眼細胞特異的なマーカーも発現しなかった（Ｔａｋａｈａｓｈｉら
、１９９８）、更に、成体脊髄由来前駆細胞は、脊髄内に移植された場合には、
神経膠細胞のみを生ずることが知られている。これに対し、海馬ではこれら細胞
は同様にしてＡＨＰＣｓに移動し、歯状回内において神経単位にのみ分化する（
Ｓｈｉａｂｕｄｄｉｎ，Ｈｏｒｎｏｒ，ＲａｙとＧａｇｅ、未発表の結果）
。これら結果は、ＡＨＰＣｓが可塑性であり、それらの最終運命が器官特異的領
域内にある外部刺激によって誘導されるのであり、それら細胞の内部プログラミ
ングによるものではないことを示している。これら観察は、この様な細胞がそれ
ら起源とは大きく異なる器官への移植に利用できることを示唆している。この仮
説は最近、成体マウス脳由来の幹細胞／前駆細胞を放射線照射されたマウスに移
植すると、各種タイプの血液細胞を生じることを示す報告により確認された（Ｂ
ｊｏｒｎｓｏｎら、１９９９）。ラット胚又はマウス新生児に移植されたヒト胎
児由来の神経幹細胞が正常発生に参加することを示す報告が２例ある。移植され
た細胞は移動し、脳の全ての主要コンパートメント内に取り込まれ、多数の発生
学的にも場所的にも適切である細胞型に分化する（Ｆｌａｘら、１９９８、Ｂｒ
ｕｓｔｌｅら、１９９８）。これらデータは、レシピエント種の多分化能神経幹
／前駆細胞の異種移植体は単に生き残るだけでなく、レシピエント種の内因性の
細胞同様に行動することを示している。移植された細胞の最終運命は、特定脳内
領域に存在する内因性の刺激により決定される。

【００７８】各種病気及び障害の再構築を目的とした、各種臓器内への多分化能神経幹／前駆細胞の移植。ラット、マウス及びヒト由来の多分化能神経幹／前駆細胞はその可塑性及び多
能性より、病気又は傷害により失われた細胞を置換し、又は矯正するのに利用可
能な細胞源としての利用に関する理想的な候補である。これら細胞の移植への利
用性は、以下の疾患モデルで試験できる。

【００７９】肝臓疾患：肝臓は多くの遺伝性代謝疾患の病理生理に於いて中心的役割を果た
している。成体肝臓には傷害後再生するという特別な能力があるものの、肝臓は
細胞治療の重要な標的の一つである。動物が幹細胞を損傷又は殺滅する誘導副産
物を生ずる２種類のトランスジェニックマウスモデルが確立されている。アルブ
ミン−ウロキナーゼ（Ａｌｂ−ｕＰＡ）トランスジェニックマウスでは、肝毒性
トランス遺伝子の幹細胞を標的とした発現が肝機能不全をもたらし、これが肝臓
増殖を慢性的に刺激する（Ｒｈｉｍら、１９９４）。劣性肝臓疾患であるヒト遺
伝性肝臓疾患、Ｉ型チロシン血症（ＨＴＩ）に関する第２のマウスモデルは、フ
マリルアセトアセテートヒドロキシラーゼ（ＦＡＨ）の欠損が原因である。正常
動物由来の幹細胞を成体トランスジェニック動物の脾臓に移植すると、移植され
た細胞が病気の肝臓を８０−９０％再増殖できる。我々は成体ラットの海馬由来
前駆細胞（ＡＨＰＣｓ）又は成体マウス脳由来前駆細胞（ＡＭＰＣｓ）、あるい
は胎児又は成体ヒト脳由来前駆細胞をこれら動物モデル内に移植し、脳由来前駆
細胞が脾臓の局所環境に反応し、幹細胞になることができるか、そして死滅細胞
を置換し病気の表現形を矯正できるか決定することを提案する。

【００８０】糖尿病：病気の自然発生又はトランスジェニックモデルを使った免疫及び内分
泌研究の最近の実験データは、自己免疫インシュリン依存型（１型）糖尿病（Ｉ
ＤＤＭ）の病理に於けるランゲルハンス島、特にベータ細胞の役割を強調してい
る。ＩＤＤＭは膵臓島のインシュリン産生ベータ細胞が破壊され生ずる慢性疾患
である。その初期には、Ｔリンパ細胞及びその他炎症性細胞が島を侵し、それを
破壊する。病理的帰結は動物のグルコース恒常性の維持不能である。遺伝的デー
タに加え、ＩＤＤＭの病理生理に生ずる初期発生、免疫及び内分泌学的事象に関
する連続研究に有用であると考えられている、この病気の自然発生モデルである
非肥満型糖尿病（ＮＯＤ）マウスに、多くの研究が焦点を当てている。ＩＤＤＭ
に於いて認識される天然自己抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を過剰発現
しているトランスジェニック系統が開発されている。膵臓より分離された生島細
胞が糖尿病動物に移植され、低血糖症の完全な回復をもたらしている（Ｔｈｏｍ
ａｓら、１９９０）。ＡＨＰＣｓ、ＡＭＰＣｓ、又は胎児あるいは成体ヒト脳由
来前駆細胞をＮＯＤ又はトランスジェニックマウスの膵臓内に移植し、損傷細胞
の移植細胞による置換により低血糖症が補正できるか知ることができる。

【００８１】筋肉疾患：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、最終的には致死的
な心臓呼吸器不全に至る脚部及び心臓呼吸器筋肉にてゆっくり進行する筋肉衰弱
を特徴とする。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは細胞骨格蛋白質であるジスト
ロフィンの遺伝子に影響する突然変異の結果生ずる。ジストロフィンが完全に無
いものからその存在レベルが低下し、または部分的に機能する端部切断型が存在
するものまで、重症から極めて軽度な型の病気を起こす複数のタイプの突然変異
が報告されている（Ｇｉｌｉｓ、１９９６）。ジストロフィンを完全に消失して
いるｍｄｘマウスはＤＭＤのモデルとして利用されており、細胞治療に関し試験
されている。正常筋芽細胞もまたＤＭＤ患者の筋肉内に移植されている。基底膜
蛋白質であるラミニン／メロシンのａ２サブユニットの欠損を原因とする先天性
ジストロフィーは、メロシン欠損先天性筋ジストロフィー（ＭＣＭＤ）と呼ばれ
ている。ＭＣＭＤの患者の多くは歩行することができない。ヌル変異であるｄｙ
ｗマウスが作製されている（Ｋｕｎｇら、１９９８）。ｄｙｗマウスの骨格筋内
にヒトＬＡＭＡ２遺伝子を発現させると、これら動物の筋肉疾患を劇的に改善す
る。Ｍｄｘマウス及びｄｙｗマウスは共に筋肉内へＡＨＰＣｓ、ＡＭＰＣｓ又は
胎児あるいは成体ヒト脳由来前駆細胞の移植し、これら細胞が筋原細胞になり、
退行中の筋肉細胞を置換することができるか決定することができる。

【００８２】心臓血管病：心臓血管機能の制御は複雑であり、一定の空間的様式で相互作用
する多くの因子に依存している。心筋の完全性を維持するのに必要なデスミンを
欠くノックアウトマウスは心筋症を発症する（Ｌｉｅら、１９９６；Ｍｉｌｎｅ
ｒら、１９９６、Ｔｈｏｒｎｅｌｌら、１９９７）。ＡＨＰＣｓ、ＡＭＰＣｓ又
は胎児あるいは成体ヒト脳由来前駆細胞はこれらマウス心筋内に移植し、移植細
胞が病気の細胞を置換し、心機能を改善できるか決定できる。

【００８３】肺疾患（嚢胞性繊維症）：嚢胞性繊維症は、最も一般的な常染色体性の遺伝性
疾患であり、Ｃｆｔｒ遺伝子の毛損により生じる。相同的組み換えにより、複数
のグループがＣｆｔｒ遺伝子を破壊している。全てのヌル変異マウスが嚢胞性繊
維症の症状を発症した（Ｄｏｒｉｎら、１９９２）。ＡＨＰＣｓ、ＡＭＰＣｓ、
又は胎児あるいは成体ヒト脳由来前駆細胞をこれら変異マウスの肺に移植し、こ
れら細胞がイオンチャンネルの欠損を有する病気の細胞を置換し、正常肺機能を
回復できるか決定することができる。

【００８４】参考文献

【図面の簡単な説明】

【図１ａ−ｆ】様々な年齢（４週齢（ａ−ｄ）；１０週齢（ｅ）及び１８週齢
（ｆ））のレシピエントラットに於ける特異的網膜層に移植されたＡＨＰＣｓの
位置を例示す。

【図２ａ−ｉ】４週時に移植され、移植４週後に検査した（ａ−ｃ）；１０週
時に移植され、移植４週後に検査された（ｄ−ｆ）；１６週時に移植され、移植
１週後に検査された（ｇ−Ｉ）動物に見られる移植ＡＨＰＣｓによる神経マーカ
ー発現を病巣に重ね合わせた像を例示している。

【図３ａ−ｈ】４週時に移植し、移植４週後に検査した動物に於ける抗シナプ
トフィジシン／Ｃｙ３（赤）抗体処理された移植細胞の病巣重ね合わせ像を例示
する。

【図４ａ−ｃ】移植４週後の、宿主視神経層を介し視神経頭内に伸びているＧ
ＦＰ＋軸索突起の病巣重ね像を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/02 １０１Ａ６１Ｐ 25/02 １０１ 25/08 25/08 25/14 25/14 25/16 25/16 25/28 25/28 25/30 25/30 25/32 25/32 25/36 25/36 27/02 27/02 27/06 27/06 (72)発明者ヤング，マイケル，ジェイ．アメリカ合衆国 01930 マサチューセッツ州グロースターザハイツ 1002 (72)発明者ゲージ，フレッド，エイチ．アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア州ラ・ホラカミニトハミテージ 6668 (72)発明者レイ，ジェソドハラアメリカ合衆国 92130 カリフォルニア州サンディゴコーテ・ド・ラ・シエナ 4184 (72)発明者ホワイトレイ，シモン，ジェイ．アメリカ合衆国 02174 マサチューセッツ州アーリントンナンバー１ティールストリート 48 (72)発明者クラッセン，ヘンリーアメリカ合衆国 92662 カリフォルニア州ニューポートビーチオパルアベニュー 206 Ｆターム(参考） 4C087 AA01 AA02 BB45 CA04 MA67 MA70 NA05 NA14 ZA02 ZA03 ZA11 ZA16 ZA18 ZA20 ZA33 ZA36 ZA94 ZC35 ZC39 ZC55

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】成体動物ドナー由来の神経前駆細胞を動物レシピエント中
のジストロフィー神経組織内に導入することを含む、ジストロフィー神経組織を
治療する方法。
【請求項２】成体動物ドナー由来の神経前駆細胞を動物レシピエント中
のジストロフィー網膜又は視神経組織内に導入することを含む、神経細胞を持つ
ジストロフィー網膜又は視神経を再増殖し、又は救済する方法。
【請求項３】前記神経前駆細胞がレシピエントの中枢神経系（ＣＮＳ）
内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記神経前駆細胞が眼、視神経及びガラス体より成るグル
ープから選択される部位内に配置される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】前記神経前駆細胞がクローンに由来する、請求項１又は２
に記載の方法。
【請求項６】前記神経前駆細胞が脳組織に由来する、請求項１又は２に
記載の方法。
【請求項７】前記神経前駆細胞が海馬又は脳室域に由来する、請求項１
又は２に記載の方法。
【請求項８】前記レシピエントが未熟又は若年動物である、請求項１又
は２に記載の方法。
【請求項９】前記レシピエントが成体である、請求項１又は２に記載の
方法。
【請求項１０】前記レシピエントがヒトである、請求項１又は２に記載
の方法。
【請求項１１】前記ドナー及び前記レシピエントが異なる種である、請
求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】前記ドナー及びレシピエントの組が、以下の組より成る
グループから選択される請求項１１に記載の方法：ラットドナーとマウスレシピ
エント；マウスドナーとラットレシピエント；ブタドナーとヒトレシピエント。
【請求項１３】前記ドナー及び前記レシピエントが同一種である、請求
項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】前記ドナー及び前記レシピエントが同種である、請求項
１３に記載の方法。
【請求項１５】前記ドナー及び前記レシピエントが同系である、請求項
１３に記載の方法。
【請求項１６】前記ジストロフィー網膜組織が視神経症の結果である、
請求項２に記載の方法。
【請求項１７】前記ジストロフィー網膜組織が緑内障の結果である、請
求項２に記載の方法。
【請求項１８】前記神経前駆細胞が少なくとも１種類の栄養因子を含む
培養培地中にてインビトロ培養される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１９】少なくとも１種類の栄養因子が神経増殖因子；ニューロ
トロフィン；マイトーゲン；サイトカイン；増殖因子；ホルモン；及びその組み
合わせから成るグループより選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】前記培養培地が繊維芽細胞増殖因子単独；繊維芽細胞増
殖因子及び上皮増殖因子；及び繊維芽細胞増殖因子と上皮増殖因子及びへパリン
から成るグループから選択されるメンバーを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】前記神経前駆細胞が以下のステップを実施することで得
られる請求項１又は２に記載の方法；（ａ）新鮮神経前駆細胞を成体ドナー動物から分離するステップ；（ｂ）前記新鮮分離神経前駆細胞をポリオルニチン／ラミン−コート異質上に
て、ＦＧＦ−２単独、ＦＧＦ−２＋ＥＧＦ、及びＦＧＦ−２＋ＥＧＦ＋へパリン
から成るグループより選択された栄養因子を少なくとも１種類含む培養培地内に
て培養するステップ；（ｃ）同定される遺伝マーカーを前記培養前駆細胞内に取り込ませるステップ
；及び（ｄ）ステップ（ｃ）より得た培養細胞から個々の海馬前駆細胞系をクローニ
ングするステップ。
【請求項２２】少なくとも１種類の栄養因子が神経増殖因子；ニューロ
トロフィン；マイトーゲン；サイトカイン；増殖因子；ホルモン；及びその組み
合わせよりなるグループから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】前記神経前駆細胞が脳組織に由来する、請求項２０に記
載の方法。
【請求項２４】神経前駆細胞が海馬又は脳室域に由来する、請求項２０
に記載の方法。
【請求項２５】前記神経前駆細胞を動物レシピエント内に導入する前に
、前記クローン由来神経前駆細胞のサンプルを誘導してコンディション培地内で
分化させることで、神経前駆細胞の各クローンの系統能力を確認することを更に
含む、請求項５に記載の方法。