CN111961646B - 一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法，包括以下步骤：(1)将脐带血进行三次离心处理后，得到初次富集液；(2)将初次富集液进行冷藏处理30‑40min；(3)制备通道高度为55‑65μm二维叉指芯片，将冷藏处理后的初次富集液注入二维叉指芯片中，施加电压为7‑9V、电流为2.8‑3.2MHz的交流信号，富集处理20‑30秒后，得到脐血干细胞。本发明提供的一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法，操作简单，在富集的过程中不添加羟乙基淀粉，但是保证了富集的效率和质量，保证了脐血干细胞冻存后的质量。

Description

一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法
技术领域
本发明属于移植用脐带血的干细胞富集方法技术领域，具体涉及一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法。
背景技术
脐带血的保存是在-196的液氮中长期保存，应用时进行复苏，脐带血采集后在釆血袋保存，一般容量在80-150mL之间，在脐带血被冻存入液氮之前需要将脐带血进行减容并富集干细胞。目前干细胞的富集方法为：
1)根据脐带血的容量按照比例添加羟乙基淀粉(HES)；
2)按照一定离心转速进行离心富集，方案为：第一次离心RCF＝50g,离心时间6分钟，第二次离心RCF＝600g,离心5分钟，第三次离心RCF＝600g,离心5分钟。
现有的方案存在以下缺点：现有的方案需要添加HES，而HES使用后会对人体的健康存在着潜在的威胁，如在特定健康条件的患者(如严重脓毒血症、肝肾功能障碍、凝血功能异常等)中存在着死亡率升高、肾损害及过量出血等风险。HES类产品已不再应用于危重成人患者，包括败血症、脓毒血症、烧伤、收入ICU的患者。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷，本发明提供一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法，包括以下步骤：
(1)将脐带血进行三次离心处理后，得到初次富集液；
(2)将初次富集液进行冷藏处理30-40min；
(3)制备通道高度为55-65μm二维叉指芯片，将冷藏处理后的初次富集液注入二维叉指芯片中，施加电压为7-9V、电流为2.8-3.2MHz的交流信号，富集处理20-30秒后，得到脐血干细胞。
具体地，上述步骤(1)中，三次离心处理的具体操作为：第一次离心时的离心力大小为500-600g，离心时间230-250秒，第二次离心时的离心力大小为1300-1500g，离心时间280-320秒，第三次离心时的离心力大小为1300-1500g，离心时间280-320秒，脐带血第一次离心后，在本发明提供的离心力和离心时间下，脐血中的细胞会因为自身大小和密度的不同，沉降速度不同，从而形成分层，从上到下分别为血浆，有核细胞和血小板，红细胞三层，此步相对离心力较低，因此有核细胞会在上层血浆分布较广，有利于富集有核细胞；第二次离心，在此步离心中，在1300-1500g的相对离心力下，脐血也会分成三层，由于相对离心力较大，分层会比较清晰，有利于去除下层红细胞和控制有核细胞的体积；第三次离心，在此离心力和离心时间下，脐血也会分成三层，由于相对离心力较大，分层会比较清晰，有利于此步将血浆去除；本发明采用的是三次离心，若离心次数过少不利于有核细胞的富集，有核细胞回收率会过低，若离心次数过多会造成溶血，对脐血干细胞造成损伤。
具体地，上述步骤(2)中，冷藏处理时的温度为2-6℃。
具体地，上述步骤(3)中，二维叉指芯片在使用前，通道采用吐温20溶液润湿处理后，再采用去离子水进行清洗。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法，操作简单，在富集的过程中不添加羟乙基淀粉，但是保证了富集的效率和质量，保证了脐血干细胞冻存后的质量；
2、羟乙基淀粉在脐带血分离过程中的作用是中和红细胞表面的电荷，有利于红细胞聚集，加速红细胞沉降，本发明通过提高离心的相对离心力，加大红细胞的沉降，从而不使用HES,也能保证离心富集的质量，保证有核细胞(TNC)的回收率和红细胞的去除率，同时也保证最终的冻存体积，保证了在液氮中保存复苏后的复苏质量；
3、本发明将初次富集液进行冷藏处理后，低温能有效的避免电泳对脐血干细胞造成伤害，进而保证了脐血干细胞冻存后的质量；
4、本发明步骤(3)中采用的二维叉指芯片对脐血干细胞进行富集处理，可以对初次富集液进行进一步的富集，进一步的有针对性的提升了核细胞回收率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法，包括以下步骤：
(1)将脐带血进行三次离心处理后，得到初次富集液，其中，三次离心处理的具体操作为：第一次离心时的离心力大小为500g，离心时间230秒，第二次离心时的离心力大小为1300g，离心时间280秒，第三次离心时的离心力大小为1300g，离心时间280秒；
(2)将初次富集液进行冷藏处理30min，冷藏处理时的温度为2℃；
(3)制备通道高度为55μm二维叉指芯片，将冷藏处理后的初次富集液注入二维叉指芯片中，施加电压为7V、电流为2.8MHz的交流信号，富集处理20秒后，得到脐血干细胞，其中二维叉指芯片在使用前，通道采用吐温20溶液润湿处理后，再采用去离子水进行清洗。
实施例2
一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法，包括以下步骤：
(1)将脐带血进行三次离心处理后，得到初次富集液，其中，三次离心处理的具体操作为：第一次离心时的离心力大小为550g，离心时间240秒，第二次离心时的离心力大小为1400g，离心时间300秒，第三次离心时的离心力大小为1400g，离心时间300秒；
(2)将初次富集液进行冷藏处理35min，冷藏处理时的温度为4℃；
(3)制备通道高度为60μm二维叉指芯片，将冷藏处理后的初次富集液注入二维叉指芯片中，施加电压为8V、电流为3.0MHz的交流信号，富集处理25秒后，得到脐血干细胞，其中二维叉指芯片在使用前，通道采用吐温20溶液润湿处理后，再采用去离子水进行清洗。
实施例3
一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法，包括以下步骤：
(1)将脐带血进行三次离心处理后，得到初次富集液，其中，三次离心处理的具体操作为：第一次离心时的离心力大小为600g，离心时间250秒，第二次离心时的离心力大小为1500g，离心时间320秒，第三次离心时的离心力大小为1500g，离心时间320秒；
(2)将初次富集液进行冷藏处理40min，冷藏处理时的温度为6℃；
(3)制备通道高度为65μm二维叉指芯片，将冷藏处理后的初次富集液注入二维叉指芯片中，施加电压为9V、电流为3.2MHz的交流信号，富集处理30秒后，得到脐血干细胞，其中二维叉指芯片在使用前，通道采用吐温20溶液润湿处理后，再采用去离子水进行清洗。
对比例1
初次富集液不经过冷藏处理，其余操作步骤与实施例1完全相同。
对比例2
不采用步骤(2)和步骤(3)的操作步骤，直接三次离心后得到脐血干细胞。
对比例3
直接将脐带血采用步骤(3)的方案进行处理，电泳富集后得到脐血干细胞。
将一份脐带血平均分成6份，分别用各实施例和对比例的方法对脐带血进行富集分离，富集分离的效果如表1所示：
表1脐血干细胞的富集分离效果
Figure BDA0002660480140000061
由表1中的实施例1和对比例1的数据可知，将初次富集液进行冷藏处理后，低温能有效的避免电泳对脐血干细胞造成伤害，进而保证了脐血干细胞冻存后的质量；由表1中的实施例2和对比例2中的数据可知，在离心后进行电泳富集处理，可以进一步的提升脐血干细胞的富集的效果。由表1中的实施例3和对比例3的数据可知，直接采用电泳的方法对脐血干细胞的富集效果较差，本发明中的三次离心操作能有效的提升脐血干细胞的富集效率和质量。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (3)

1.一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将脐带血进行三次离心处理后，得到初次富集液；
(2)将初次富集液进行冷藏处理30-40min；
(3)制备通道高度为55-65μm二维叉指芯片，将冷藏处理后的初次富集液注入二维叉指芯片中，施加电压为7-9V、电流为2.8-3.2MHz的交流信号，富集处理20-30秒后，得到脐血干细胞；
上述步骤(1)中，三次离心处理的具体操作为：第一次离心时的离心力大小为500-600g，离心时间230-250秒，第二次离心时的离心力大小为1300-1500g，离心时间280-320秒，第三次离心时的离心力大小为1300-1500g，离心时间280-320秒。
2.根据权利要求1所述一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法，其特征在于，上述步骤(2)中，冷藏处理时的温度为2-6℃。
3.根据权利要求1所述一种不添加沉降剂的脐血干细胞富集方法，其特征在于，上述步骤(3)中，二维叉指芯片在使用前，通道采用吐温20溶液润湿处理后，再采用去离子水进行清洗。
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