CN107034182A - 一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法 - Google Patents

一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法，它包含以下步骤：无菌条件下获取健康人的脂肪组织；将脂肪组织放入超净台中，用PBS反复冲洗干净剪成小碎块，放入离心管中，加入等体积的消化液震荡消化然后静止；吸出离心管中下层液体终止消化、封闭离心；弃上清，得脂肪干细胞团，制成细胞悬液，培养箱培养；观察细胞贴壁进行半量换液，然后传代；弃去旧培养基，加入PBS冲洗，加入消化液，使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液，并移至离心管中离心，弃上清，加入完全培养基，传代培养；充分裂解；混合；过滤除菌；分装；预冷，抽真空，制备成冻干粉。它具有科学合理的制备工艺，制备出的产品具有多种生物学活性，可用于生物医药、精细化工等领域。

Description

一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药或医学美容技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法。
背景技术
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、ADSC是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。主要具有恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容。同时也能使身体机能得到充分改善，可以有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。
研究证实，从皮下脂肪组织中可分离纯化得到大量脂肪间充质干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）。ADSCs具有其它类型干细胞如骨髓干细胞所没有的一些优势：脂肪组织来源广泛，取材方便，获取干细胞量大，易于分离纯化，供区损伤微小，且增殖速度快，具有稳定的群体倍增率，分化能力强，同时具有免疫相容性。因而，脂肪来源干细胞是一种很好的组织工程和再生医学“种子”细胞。
在证实ADSCs分泌的因子具有抗皮肤老化作用的前提下，开发利用这些细胞成分及因子来达到临床应用的目的，可能是一种更为可行的方法。因此，将培养基中的细胞成分或提纯的因子制成外用药物，将提高ADSCs用于皮肤保健的可行性。
脂肪干细胞的存在优势：
1）存在于脂肪中，被脂肪包埋，不易被破坏；
2）在脂肪的间充质中，营养丰富，生物活性最佳；
3）脂肪新陈代谢快，脂肪干细胞保持年轻态；
脂肪干细胞已经被临床应用并证实效果惊人，目前在皮肤美容、免疫力提升、性器官衰老对抗等方面均被临床应用，未来人类征服冠心病、糖尿病、脑血管病、老年痴呆等危害人类生命与健康的重大疾病，均可能需要脂肪干细胞充当“急先锋”。在将来，人类克隆心脏、肾脏的原料主要来源也可能是脂肪干细胞。
综上所述，脂肪干细胞无论应用优势、存在优势，是现实应用、潜力开发，都是其他细胞无法比拟的，所以被称之为“明星干细胞”。但目前，脂肪干细胞类的产品制备工艺复杂、生物学活性受各种外界条件限制，保存起来不方便。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法，它具有科学合理的制备工艺，制备出的产品具有多种生物学活性，可用于生物医药、精细化工等领域。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法，它包含以下步骤：
(1) 无菌条件下获取健康人的脂肪组织，放入预冷含1%双抗的PBS缓冲液中，密封，2-8℃的低温条件下送回实验室；
(2) 将脂肪组织放入超净台中，用PBS反复冲洗，直至无明显血污，将脂肪组织剪成1mm3×1mm3小碎块；
(3) 将剪碎的脂肪块放入离心管中，加入等体积的消化液，将试管密封，放入37℃恒温摇床中，180r×min-1，震荡消化30min；消化后从摇床上取出，静止5min，此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞层；
(4) 吸出离心管中下层液体移入含培养基的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500r×min-1，离心10min；
(5) 弃上清，得到离心管底部的脂肪干细胞团，加入1mL培养基，轻轻吹打10-20次制成细胞悬液，密度调整到1×105mL-1，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱培养；
(6) 观察细胞贴壁5-10天即可进行第一次半量换液，此后每3天换液，待细胞生长至融合后进行传代；
(7) 传代时，弃去旧的培养基，加入PBS冲洗2-3次后，加入2-3mL消化液；37℃培养箱内进行消化3-5min，倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化，用移液管轻轻地反复吹打瓶壁上的细胞，注意不要产生气泡，使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；将单细胞悬液移至离心管中，1000r×min-1，离心5min，弃上清，加入完全培养基，轻轻吹打混匀，按1:2传代培养；
(8) 显微镜下观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到80%-90%，收获1×106脂肪干细胞，加入20mL去离子水，反复冻融，使细胞充分裂解，加入2g甘露醇，充分溶解；
(9) 得到的混合液通过0.22μm滤膜过滤除菌；
(10) 将滤液无菌条件下分装至小瓶，每瓶1mL；
(11) 预冷至-45℃度后开始抽真空，真空控制在50-100pa，制备成冻干粉；
(12) 2-8℃长期保存，备用。
作为本发明的进一步改进；所述的步骤(3)中的消化液采用0.25%胰酶，0.1%I型胶原酶，以1:1比例混合配制而成。
作为本发明的进一步改进；所述的步骤(4)中的培养基为含10%胎牛血清的L-DMEM。
作为本发明的进一步改进；所述的步骤(7)中的消化液采用0.25%胰酶和0.04%EDTA，以1:1比例混合配制而成。
作为本发明的进一步改进；所述的步骤(10)中的小瓶为2mL西林瓶。
采用上述技术方案后，本发明具有以下有益效果：
具有科学合理的制备工艺，制备出的产品具有多种生物学活性，且保存起来方便，可应用于伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，或美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本具体实施方式采用以下技术方案：一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法，它包含以下步骤：
(1) 无菌条件下获取健康人的脂肪组织，放入预冷含1%双抗的PBS缓冲液中，密封，2-8℃的低温条件下送回实验室；
(2) 将脂肪组织放入超净台中，用PBS反复冲洗，直至无明显血污，将脂肪组织剪成1mm3×1mm3小碎块；
(3) 将剪碎的脂肪块放入离心管中，加入等体积的消化液(该消化液采用0.25%胰酶，0.1%I型胶原酶，以1:1比例混合配制而成)，将试管密封，放入37℃恒温摇床中，180r/min，震荡消化30min；消化后从摇床上取出，静止5min，此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞层；
(4) 吸出离心管中下层液体移入含培养基(含10%胎牛血清的L-DMEM)的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500r×min-1离心10min；
(5) 弃上清，得到离心管底部的脂肪干细胞团，加入1mL培养基，轻轻吹打10-20次制成细胞悬液，密度调整到1×105mL-1，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱培养；
(6) 观察细胞贴壁7天左右即可进行第一次半量换液，此后每3天换液，待细胞生长至融合后进行传代；
(7) 传代时，弃去旧的培养基，加入PBS冲洗2-3次后，加入2-3mL消化液(该消化液采用0.25%胰酶和0.04%EDTA，以1:1比例混合配制而成)；37℃培养箱内进行消化3-5min，倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化，用移液管轻轻地反复吹打瓶壁上的细胞，注意不要产生气泡，使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；将单细胞悬液移至离心管中，1000r×min-1，离心5min，弃上清，加入完全培养基，轻轻吹打混匀，按1:2传代培养；
(8) 显微镜下观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到90%左右，收获1×106脂肪干细胞，加入20mL去离子水，反复冻融，使细胞充分裂解，加入2g甘露醇，充分溶解；
(9) 得到的混合液通过0.22μm滤膜过滤除菌；
(10) 将滤液无菌条件下分装至小瓶（2mL西林瓶），每瓶1mL；
(11) 预冷至-45℃度后开始抽真空，真空控制在50-100pa，制备成冻干粉；
(12) 2-8℃长期保存，备用。
本发明具有科学合理的制备工艺，制备出的产品具有多种生物学活性，且保存起来方便，可应用于伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，或美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，它包含以下步骤：
(1) 无菌条件下获取健康人的脂肪组织，放入预冷含1%双抗的PBS缓冲液中，密封，2-8℃的低温条件下送回实验室；
(2) 将脂肪组织放入超净台中，用PBS反复冲洗，直至无明显血污，将脂肪组织剪成1mm3×1mm3小碎块；
(3) 将剪碎的脂肪块放入离心管中，加入等体积的消化液，将试管密封，放入37℃恒温摇床中，180r×min-1，震荡消化30min；消化后从摇床上取出，静止5min，此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞层；
(4) 吸出离心管中下层液体移入含培养基的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500r×min-1离心10min；
(5) 弃上清，得到离心管底部的脂肪干细胞团，加入1mL培养基，轻轻吹打10-20次制成细胞悬液，密度调整到1×105mL-1，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱培养；
(6) 观察细胞贴壁5-10天即可进行第一次半量换液，此后每3天换液，待细胞生长至融合后进行传代；
(7) 传代时，弃去旧的培养基，加入PBS冲洗2-3次后，加入2-3mL消化液；37℃培养箱内进行消化3-5min，倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化，用移液管轻轻地反复吹打瓶壁上的细胞，注意不要产生气泡，使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；将单细胞悬液移至离心管中，1000r×min-1，离心5min，弃上清，加入完全培养基，轻轻吹打混匀，按1:2传代培养；
(8) 显微镜下观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到80%-90%，收获1×106脂肪干细胞，加入20mL去离子水，反复冻融，使细胞充分裂解，加入2g甘露醇，充分溶解；
(9) 得到的混合液通过0.22μm滤膜过滤除菌；
(10) 将滤液无菌条件下分装至小瓶，每瓶1mL；
(11) 预冷至-45℃度后开始抽真空，真空控制在50-100pa，制备成冻干粉；
(12) 2-8℃长期保存，备用。
2. 根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的消化液采用0.25%胰酶，0.1% I型胶原酶，以1:1比例混合配制而成。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的培养基为含10%胎牛血清的L-DMEM。
4. 根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤(7)中的消化液采用0.25%胰酶和0.04% EDTA，以1:1比例混合配制而成。
5.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤(10)中的小瓶为2mL西林瓶。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108272643A (zh) * 2018-02-01 2018-07-13 伯仕利生物科技发展（盐城）有限公司 一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法
CN109453200A (zh) * 2018-11-29 2019-03-12 云南研灵生物科技有限公司 多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法
CN111607560A (zh) * 2019-02-22 2020-09-01 深圳安吉赛尔生物科技有限公司 一种脂肪干细胞的培养方法及其在关节炎中的应用
CN113403269A (zh) * 2020-03-16 2021-09-17 上海泉眼生物科技有限公司 一种脂肪源性干细胞的培养方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002133A (zh) * 2014-04-23 2015-10-28 宋阳 人体脐带血干细胞提取物及其制备方法和应用
CN106554941A (zh) * 2016-12-01 2017-04-05 济南万泉生物技术有限公司 一种治疗脱发的脂肪间充质干细胞

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002133A (zh) * 2014-04-23 2015-10-28 宋阳 人体脐带血干细胞提取物及其制备方法和应用
CN106554941A (zh) * 2016-12-01 2017-04-05 济南万泉生物技术有限公司 一种治疗脱发的脂肪间充质干细胞

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRUCE A. BUNNELL ET AL.: "Adipose-derived Stem Cells: Isolation, Expansion and Differentiation", 《METHODS》 *
国家食品药品监督管理总局: "《化妆品安全技术规范》", 30 November 2015 *
陈冲 等: "人脂肪来源间充质干细胞的制备及其质量检验方法", 《武警医学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108272643A (zh) * 2018-02-01 2018-07-13 伯仕利生物科技发展（盐城）有限公司 一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法
CN109453200A (zh) * 2018-11-29 2019-03-12 云南研灵生物科技有限公司 多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法
CN111607560A (zh) * 2019-02-22 2020-09-01 深圳安吉赛尔生物科技有限公司 一种脂肪干细胞的培养方法及其在关节炎中的应用
CN113403269A (zh) * 2020-03-16 2021-09-17 上海泉眼生物科技有限公司 一种脂肪源性干细胞的培养方法

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