CN113403269A - 一种脂肪源性干细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物干细胞培养技术领域，特别是涉及一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括：将脂肪块与消化液震荡消化，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中密封离心，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液；滴加培养基使得培养瓶的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，恒温培养，即可。本发明解决了现有技术中组织贴壁法中由于脂肪油滴阻碍细胞贴壁从而导致细胞贴壁率低和细胞提取效率低的问题，利用培养瓶亲油的特性，通过预先在顶部吸附脂肪油滴，提高细胞贴壁率和细胞提取效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物干细胞培养技术领域，特别是涉及一种脂肪源性干细胞的培养方法。
背景技术
脂肪源性干细胞(adiposetissue-derived stem cells，ADSCs)，是一类可以自我更新、繁殖的干细胞，具有一般干细胞的多向分化潜能和稳定的体外多代增殖能力。不仅能在不同诱导因子的作用下分化成为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞等，而且还能分泌大量的、多类型的细胞因子及促进血管生成因子和凋亡因子，并能通过旁分泌作用于成纤维细胞促进其分泌I型胶原、III型胶原和纤连蛋白，促进胶原合成，可发挥抗炎、抗氧化、抗衰老、损伤修复等作用。此外脂肪组织储量丰富且获取简便，且无伦理争议，是组织工程研究中理想的种子细胞来源之一。
目前脂肪源干细胞的提取方式多采用机械法、酶消化和组织贴壁培养法。酶消化法和机械法的操作过程较繁琐；此外酶消化法消化时间长，消化后所得脂肪血管基质碎片，成分复杂。组织贴壁法操作步骤少，实验处理时间短，且不加入外源胶原酶、细胞因子等，成本较低，但在操作过程中脂肪油滴阻碍细胞贴壁，很难保证组织块全部贴壁，且换液时容易漂浮，细胞提取效率不高。此外平时使用的聚苯乙烯材料的无菌一次性培养瓶表面具有很强的亲油特性，用上述组织贴壁法提取脂肪源性干细胞，不可避免的会使得培养瓶底部沾染上消化出来的脂肪油滴，而沾染脂肪油滴的部位细胞就不能贴壁生长，因此培养瓶底部的“有效面积”大大减少，长出的细胞也会减少很多。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种脂肪源性干细胞的培养方法，解决了现有技术中组织贴壁法中由于脂肪油滴阻碍细胞贴壁从而导致细胞贴壁率低和细胞提取效率低的问题。本发明利用培养瓶亲油的特性，通过预先在顶部吸附脂肪油滴，从而避免培养瓶底面出现脂肪油滴，提高细胞贴壁率和细胞提取效率。
为实现上述目的及其他相关目的，
本发明提供一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：(0.8～1.2)混合，在30～40℃下震荡消化10～90min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在35～40℃下进行恒温培养，即可。
脂肪块与消化液混合后震荡消化，再将上层脂肪细胞液移入培养基中离心，再通过吹打即可制成脂肪源性干细胞悬液。将脂肪源性干细胞悬液接种在预先润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部充分接触，此时利用培养瓶亲油的特性，通过晃动的过程使得脂肪油滴吸附在培养瓶的顶部。通过180°旋转使得脂肪油滴依旧吸附在培养瓶的顶部，脂肪源性干细胞悬液可以铺到培养瓶的底面，从而避免培养瓶底面出现脂肪油滴，提高细胞贴壁率和细胞提取效率。
于本发明的一实施例中，所述步骤一中脂肪块与消化液的体积比为2：1。
于本发明的一实施例中，所述步骤一中消化液含有浓度为0.1～5mg/ml的I型胶原酶。
于本发明的一实施例中，所述步骤一中震荡消化的温度为35～39℃，时间为20～60min。
于本发明的一实施例中，所述步骤一中震荡消化的温度为37℃，时间为20～60min。
于本发明的一实施例中，所述步骤一中脂肪块的制作过程为：将脂肪组织采用D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
D-Hanks缓冲液采用不含酚红的D-Hanks缓冲液。
于本发明的一实施例中，所述培养基中含有复合生长因子。
于本发明的一实施例中，所述步骤二中培养瓶的材质为亲油疏水材料。
亲油疏水材料都可以实现吸附脂肪油滴的效果，但是一般采用聚苯乙烯材料的无菌一次性培养瓶。
聚苯乙烯材料的无菌一次性培养瓶，其顶面和侧面也是同样的材料，同样具备表面亲油特性，而这几个面在传统的细胞培养中是用不到的。所以，利用这一点，在“脂肪源性干细胞悬液接种到培养瓶中”这个步骤开始前，先只加很少量的培养基，让培养基湿润培养瓶的顶部，让脂肪油滴更容易被培养瓶的顶部(即顶面)吸附，然后将待接种的悬浮液接种到已湿润的培养瓶的顶部，轻晃培养瓶顶部，让脂肪源性干细胞悬液与顶面充分接触，然后翻转培养瓶180°，让几乎无油滴的脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶底面，进行孵育培养。
于本发明的一实施例中，所述步骤二中恒温培养的温度为37℃。
如上所述，本发明的一种脂肪源性干细胞的培养方法，具有以下有益效果：脂肪块与消化液混合后震荡消化，再将上层脂肪细胞液移入培养基中离心，再通过吹打即可制成脂肪源性干细胞悬液。将脂肪源性干细胞悬液接种在预先润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部充分接触，此时利用培养瓶亲油的特性，通过晃动的过程使得脂肪油滴吸附在培养瓶的顶部。通过180°旋转使得脂肪油滴依旧吸附在培养瓶的顶部，脂肪源性干细胞悬液可以铺到培养瓶的底面，从而避免培养瓶底面出现脂肪油滴，提高细胞贴壁率和细胞提取效率。
附图说明
图1中A为实施例1在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例1在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图2中A为实施例2在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例2在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图3中A为实施例3在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例3在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图4中A为实施例4在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例4在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图5中A为实施例5在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例5在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图6中A为实施例6在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例6在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图7中A为实施例7在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例7在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图8中A为实施例8在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例8在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图9中A为实施例9在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例9在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图10中A为实施例10在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例10在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图11中A为实施例5培养5d后在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例5培养5d后在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图12中A为实施例5培养6d后在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例5培养6d后在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图13中A为实施例5培养8d后在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例5培养8d后在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图14中A为实施例5培养11d后在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例5培养11d后在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图15中A为实施例9培养5d后在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例9培养5d后在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图16中A为实施例9培养6d后在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例9培养6d后在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图17中A为实施例9培养9d后在400倍放大倍数下的细胞分布图，B为对比例9培养9d后在400倍放大倍数下的细胞分布图。
图18显示为实施例细胞数量均值和对比例细胞数量均值在6d、8d和9d的柱状图。
图19显示为对比例1采用倒置显微镜下拍摄的培养瓶内表面图。
图20显示为对比例2采用倒置显微镜下拍摄的培养瓶内表面图。
图21显示为对比例3采用倒置显微镜下拍摄的培养瓶内表面图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：0.8混合，其中消化液含有浓度为0.5mg/ml的I型胶原酶，在35℃下震荡消化30min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在35℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
对比例1
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：0.8混合，其中消化液含有浓度为0.5mg/ml的I型胶原酶，在35℃下震荡消化30min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的底部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的底部，在35℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
实施例2
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：0.9混合，其中消化液含有浓度为1mg/ml的I型胶原酶，在36℃下震荡消化40min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在35℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
对比例2
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：0.9混合，其中消化液含有浓度为1mg/ml的I型胶原酶，在36℃下震荡消化40min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的底部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的底部，在35℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
实施例3
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1.2混合，其中消化液含有浓度为3mg/ml的I型胶原酶，在38℃下震荡消化60min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在38℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
对比例3
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1.2混合，其中消化液含有浓度为3mg/ml的I型胶原酶，在38℃下震荡消化60min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的底部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的底部，在38℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
实施例4
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1.1混合，其中消化液含有浓度为4mg/ml的I型胶原酶，在39℃下震荡消化30min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在39℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
对比例4
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1.1混合，其中消化液含有浓度为4mg/ml的I型胶原酶，在39℃下震荡消化30min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的底部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的底部，在39℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
实施例5
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1.1混合，其中消化液含有浓度为3mg/ml的I型胶原酶，在38℃下震荡消化40min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在38℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
对比例5
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1.1混合，其中消化液含有浓度为3mg/ml的I型胶原酶，在38℃下震荡消化40min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的底部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的底部，在38℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
实施例6
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1.2混合，其中消化液含有浓度为5mg/ml的I型胶原酶，在32℃下震荡消化60min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在35℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
对比例6
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1.2混合，其中消化液含有浓度为5mg/ml的I型胶原酶，在32℃下震荡消化60min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的底部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的底部，在35℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
实施例7
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1混合，其中消化液含有浓度为3mg/ml的I型胶原酶，在34℃下震荡消化60min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在38℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
对比例7
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1混合，其中消化液含有浓度为3mg/ml的I型胶原酶，在34℃下震荡消化60min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的底部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的底部，在38℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
实施例8
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1混合，其中消化液含有浓度为2mg/ml的I型胶原酶，在38℃下震荡消化20min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在38℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
对比例8
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1混合，其中消化液含有浓度为2mg/ml的I型胶原酶，在38℃下震荡消化20min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的底部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的底部，在38℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
实施例9
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1混合，其中消化液含有浓度为2mg/ml的I型胶原酶，在37℃下震荡消化45min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在37℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
对比例9
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1混合，其中消化液含有浓度为2mg/ml的I型胶原酶，在37℃下震荡消化45min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的底部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的底部，在37℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
实施例10
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1混合，其中消化液含有浓度为1mg/ml的I型胶原酶，在37℃下震荡消化30min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在37℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
对比例10
一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：1混合，其中消化液含有浓度为1mg/ml的I型胶原酶，在37℃下震荡消化30min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶(聚苯乙烯材料)的底部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的底部，在37℃下进行恒温培养，即可。定期(3d)更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部。
具体地，将脂肪组织采用不含酚红的D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，再将脂肪组织剪碎，即得脂肪块。
具体地，所述培养基中含有复合生长因子。
将实施例1～实施例10以及对应的对比例1～对比例10的细胞经过一定时间收集到的细胞数量，其结果如表格1所示。细胞数量采用显微镜结合血球计数板进行测量，用胰酶消化收集细胞制备为细胞悬液，用血球计数板测量其浓度，与体积的乘积即为细胞的总数。
表格1
从表1的数据中可以看出，每个实施例的细胞数量都比对应的对比例的细胞数量多。由此可见，利用培养瓶亲油的特性，通过预先在顶部吸附脂肪油滴，可以提高细胞贴壁率和细胞提取效率。
将实施例1～实施例10以及对应的对比例1～对比例10的细胞放至显微镜下观察。每个实施例和对应的对比例在相同时间进行取样，在400倍放大倍数下获得图1～图10的图片。从图1～图10中可以看出，每个实施例在相同放大倍数的显微镜下细胞数量都比对应的对比例的细胞数量多。由此亦可佐证，利用培养瓶亲油的特性，通过预先在顶部吸附脂肪油滴，可以提高细胞贴壁率和细胞提取效率。
分别将实施例5和对比例5的细胞培养5d、6d、8d、11d后放至显微镜下观察，在400倍放大倍数下获得图11～图14的图片。从图11～图14中可以看出，实施例5在相同培养时间、相同放大倍数的显微镜下细胞数量都比对应的对比例5的细胞数量多。
分别将实施例9和对比例9的细胞培养5d、6d、9d后放至显微镜下观察，在400倍放大倍数下获得图15～图17的图片。从图15～图17中可以看出，实施例9在相同培养时间、相同放大倍数的显微镜下细胞数量都比对应的对比例9的细胞数量多。
分别将实施例1～实施例10培养6d、8d和9d后的细胞数量进行测定，将对应时间段的实施例1～实施例10的细胞数值进行加和平均，即得对应6d、8d和9d的实施例细胞数量均值。分别将对比例1～对比例10培养6d、8d和9d后的细胞数量进行测定，将对应时间段的对比例1～对比例10的细胞数值进行加和平均，即得对应6d、8d和9d的对比例细胞数量均值。从图18中可以看出，实施例细胞数量均值和对比例细胞数量均值在6d、8d和9d均有显著性差异。
分别采用倒置显微镜下拍摄对比例1、对比例2和对比例3在培养过程中培养瓶内表面，记做图19～图21，在图19～图21中均可看出明显的脂肪油滴沾染培养瓶内表面使得该处无法生长细胞。
综上所述，本发明将脂肪源性干细胞悬液接种在预先润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部充分接触，此时利用培养瓶亲油的特性，通过晃动的过程使得脂肪油滴吸附在培养瓶的顶部。通过180°旋转使得脂肪油滴依旧吸附在培养瓶的顶部，脂肪源性干细胞悬液可以铺到培养瓶的底面，从而避免培养瓶底面出现脂肪油滴，提高细胞贴壁率和细胞提取效率。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一种脂肪源性干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：(0.8～1.2)混合，在30～40℃下震荡消化10～90min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；
步骤二、滴加培养基使得培养瓶的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在35～40℃下进行恒温培养，即可。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪源性干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤一中脂肪块与消化液的体积比为2：1。
3.根据权利要求2所述的一种脂肪源性干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤一中消化液含有浓度为0.1～5mg/ml的I型胶原酶。
4.根据权利要求1所述的一种脂肪源性干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤一中震荡消化的温度为35～39℃，时间为20～60min。
5.根据权利要求4所述的一种脂肪源性干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤一中震荡消化的温度为37℃，时间为20～60min。
6.根据权利要求1～5任一项所述的一种脂肪源性干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤一中脂肪块的制作过程为：将脂肪组织采用D-Hanks缓冲液清洗后剪碎，即得脂肪块。
7.根据权利要求1所述的一种脂肪源性干细胞的培养方法，其特征在于：所述培养基中含有复合生长因子。
8.根据权利要求1所述的一种脂肪源性干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤二中培养瓶的材质为亲油疏水材料。
9.根据权利要求1或8所述的一种脂肪源性干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤二中恒温培养的温度为37℃。
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2020
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