CN115011547A - 自体子宫内膜提取干细胞的培养方法 - Google Patents

自体子宫内膜提取干细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了细胞培养技术领域，具体为：自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，包括如下操作步骤：S1：取出子宫内膜组织并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和0.9％的抗生素进行浸泡，浸泡完成后利用D‑Hanks溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗，S2：清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液进行消化，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液，通过上述过程可使得子宫内膜干细胞制备的成功率大大提高，缩短了子宫内膜干细胞培养的周期，也能使得子宫内膜干细胞分离成功率得到有效提高。

Description

自体子宫内膜提取干细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体为自体子宫内膜提取干细胞的培养方法。
背景技术
子宫内膜层是指构成哺乳类子宫内壁的一层。对雌激素和孕激素都起反应，因此可随着性周期(月经周期)发生显著的变化，子宫内膜分为功能层和基底层2层。内膜表面2/3为致密层和海绵层统称功能层，受卵巢性激素影响发生周期变化而脱落。基底层为靠近子宫肌层的1/3内膜，不受卵巢性激素影响，不发生周期性的变化。
干细胞是指一类具有高度增殖潜能、自我更新能力以及高度分化能力的早期未分化细胞。间充质干细胞是目前最受关注的干细胞成员，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，而子宫内膜干细胞是指具有自我更新、多向分化及无限增殖能力的未分化子宫内膜细胞，包括极少量的子宫内膜上皮细胞、子宫内膜间质细胞和大部分的子宫内膜血管内皮细胞。由于子宫内膜干细胞具有取材方便且不受道德及法律问题的限制，使其在实验研究和临床应用方面有着广泛的应用前景。子宫内膜干细胞治疗疾病的临床前研究和临床试验，已经被大量的研究，如治疗心肌梗死、中风、糖尿病、肝纤维化、肺纤维化、卵巢早衰、慢性缺血性疼痛、肌肉萎缩、骨关节炎。
但是，现有的子宫内膜干细胞提取过程中，子宫内膜的细胞提取的效率较低，且细胞增殖的过程中速率较低，导致细胞培养的效率较差。
因此需要研发自体子宫内膜提取干细胞的培养方法很有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，以解决上述背景技术中提出但是现有的子宫内膜干细胞提取过程中，子宫内膜的细胞提取的效率较低，且细胞增殖的过程中速率较低，导致细胞培养的效率较差的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，包括如下操作步骤：
S1：取出子宫内膜组织并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和0.9％的抗生素进行浸泡，浸泡完成后利用D-Hanks溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗；
S2：清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液进行消化，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液；
S3：接着取出步骤S1离心后的组织，接着利用破碎组织对初次消化后的子宫内膜组织破碎成2mm^3大小的组织块后放入250mL(外径70mm*口径30mm* 瓶高140mm)的蓝盖试剂瓶内；
S4：加入质量/体积比为0.1％的I型胶原酶50mL，并置于恒温振荡仪内持续消化5h得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液；
S5：利用D-Hanks溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，接着启用离心机以2000r/min离心5-10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培养基内进行培养；
S6：利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，并将接种瓶移植到CO2孵箱内培养；
S7：3天后全量换为MMSC Basal Medium培养液，弃去未贴壁的细胞与杂质，根据细胞生长情况，每2天换液一次；
S8：获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间，待胞质回缩，加含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化；
S9：将细胞悬液1000rpm离心3min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换为MesenPRORSa-MMedium培养液，P2代以后按1:8 的比例传代，直至细胞彼此融合。
作为本发明所述的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤S2中，所用的0.2％胰蛋白酶溶液与子宫内膜的体积比为1:2或者1:3。
作为本发明所述的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤S4中，恒温震荡仪在工作时设置的温度为37℃。
作为本发明所述的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤S5中，DMEMF/12培养基中的成分为FBS(胎牛清血)10％，3ug/ml两性霉素B，庆大霉素90U/ml或双抗1-3％，bFGF18ng/ml。
作为本发明所述的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤S6中，接种瓶内细胞的密度为103cm2～105cm2。
作为本发明所述的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤S6中，CO2孵箱的饱和湿度为100％，工作的温度为37℃，CO2的含量为5％。
作为本发明所述的用于治疗退行性关节炎的脐血干细胞的培养方法的一种优选方案，其中：所述0.9％的抗生素为庆大霉素，浓度为25mg/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明中，通过先对子宫内膜组织进行清洗和破碎，接着利用胶原酶对组织进行消化，消化后利用离心机进行分离，从而得到子宫内膜细胞，接着利再利用培养基对提纯的子宫内膜细胞进行培养，随后在接种至接种瓶内并通过CO2孵箱内进行培养，而待细胞融合百分之八十后，加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间，待胞质回缩，最后加含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，通过上述过程可使得子宫内膜干细胞制备的成功率大大提高，缩短了子宫内膜干细胞培养的周期，也能使得子宫内膜干细胞分离成功率得到有效提高。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供如下技术方案：自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，包括如下操作步骤：
S1：取出子宫内膜组织并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和0.9％的抗生素进行浸泡，而0.9％的抗生素为庆大霉素，浓度为25mg/L，设置的抗生素还可以采用链霉素、青霉素和两性霉素B，抗生素具有保持子宫内膜组织为无菌条件，有效避免子宫内膜组织的污染，浸泡完成后利用 D-Hanks溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗，Hanks溶液主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等，而D-Hanks相较于Hanks溶液来说不含有钙和镁离子，而虽然子宫内膜组织上的血液含量较低，但是会对后续细胞培养造成影响，因此对残留的血液进行去除；
S2：清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液进行消化，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液，而所用的0.2％胰蛋白酶溶液与子宫内膜的体积比为1:2或者1:3，胰蛋白酶为蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，在子宫内膜细胞培养的过程中能对子宫内膜组织上的胰蛋白进行消化，而离心机是利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的机械，离心机主要用于将悬浮液中的固体颗粒与液体分开，或将乳浊液中两种密度不同，又互不相溶的液体分开，在本发明中离心机可用来将子宫内膜组织与杂质液进行分离；
S3：接着取出步骤S1离心后的组织，接着利用破碎组织对初次消化后的子宫内膜组织破碎成2mm^3大小的组织块后放入250mL(外径70mm*口径30mm* 瓶高140mm)的蓝盖试剂瓶内；
S4：加入质量/体积比为0.1％的I型胶原酶50mL，并置于恒温振荡仪内持续消化5h得到消化液，I型胶原酶是一种蛋白酶，一种肽链内切酶，能够切割序列中性氨基酸和甘氨酸之间的肽键，胶原酶可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，胶原纤维广泛存在结缔组织内，而恒温震荡仪在工作时的设置的温度为37℃，然后利用100目筛网过滤消化液，恒温振荡仪是培养细胞组织生长的理想设备，恒温振荡仪采用电磁振荡原理，是通过电子线路板组成部分产生交变磁场、不锈钢材质容器即切割交变磁力线而产生交变的电流，涡流使容器壁铁分子高速无规则运动，分子互相碰撞、摩擦而产生热能，同时由于涡流存在，水分子受电磁力作用，带动玻璃容器内液体运动，达到震荡的效果，恒温振荡仪测量准确，免调试，测量范围线性度好，采用微处理器，比例调宽式加热原理，实现控温精度高、均匀性好，稳定性可靠，具有超温报警功能；
S5：利用D-Hanks溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，接着启用离心机以2000r/min离心5-10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培养基内进行培养而DMEMF/12培养基中的成分为FBS(胎牛清血)10％，3ug/ml两性霉素B，庆大霉素90U/ml或双抗1-3％，bFGF18ng/ml，在培养细胞过程中，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，胎牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必需的营养成分，是细胞贴壁培养基质上所需因子来源，提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害，而使用浓度适合的抗生素，可以防止污染以及污染引起的形态或生理变化，除了防止污染外，抗生素还用于筛选转染、基因修饰的细胞；
S6：利用培养基将细胞培养贴壁60％后吧培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，接种瓶内细胞的密度为103cm2～105cm2，并将接种瓶移植到 CO2孵箱内培养，而CO2孵箱的饱和湿度为100％，工作的温度为37℃，CO2的含量为5％，而孵箱是通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境，培养箱要求稳定的温度、稳定的CO2水平、恒定的酸碱度(pH 值：7.2-7.4)、较高的相对饱和湿度)，来对细胞/组织进行体外培养的一种装置，其广泛应用于细胞、组织培养和某些特殊微生物的培养；
S7：3天后全量换为MMSC Basal Medium培养液，弃去未贴壁的细胞与杂质，根据细胞生长情况，每2天换液一次；
S8：获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间，待胞质回缩，加含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化；
S9：将细胞悬液1000rpm离心3min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换为MesenPRORSa-MMedium培养液，而 MesenPRORSa-MMedium培养液是人脂肪干细胞优良的培养基，具有良好的细胞形态，在增殖速度，细胞集落等方面优越，P2代以后按1:8的比例传代，直至细胞彼此融合，在细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开，而1：8的传代比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。
工作原理：取出子宫内膜组织并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和0.9％的抗生素进行浸泡，浸泡完成后利用D-Hanks溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗，清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液进行消化，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液，接着取出离心后的组织，接着利用破碎组织对初次消化后的子宫内膜组织破碎成2mm^3大小的组织块后放入250mL(外径70mm*口径30mm*瓶高140mm)的蓝盖试剂瓶内，随后加入质量/体积比为0.1％的I型胶原酶50mL，并置于恒温振荡仪内持续消化5h得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液，过滤完成后利用D-Hanks溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，接着启用离心机以2000r/min离心5-10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培养基内进行培养，利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，并将接种瓶移植到CO2孵箱内培养，培养3天后全量换为MMSC Basal Medium培养液，弃去未贴壁的细胞与杂质，根据细胞生长情况，每2天换液一次，获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和 0.02％EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间，待胞质回缩，加含 10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，将细胞悬液1000rpm离心3min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换为MesenPRORSa-MMedium培养液，P2代以后按1:8的比例传代，直至细胞彼此融合。
虽然在上文中已经参考实施例对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施例中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (7)

1.自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，其特征在于：包括如下操作步骤：
S1：取出子宫内膜组织并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和0.9％的抗生素进行浸泡，浸泡完成后利用D-Hanks溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗；
S2：清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液进行消化，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液；
S3：接着取出步骤S1离心后的组织，接着利用破碎组织对初次消化后的子宫内膜组织破碎成2mm^3大小的组织块后放入250mL(外径70mm*口径30mm*瓶高140mm)的蓝盖试剂瓶内；
S4：加入质量/体积比为0.1％的I型胶原酶50mL，并置于恒温振荡仪内持续消化5h得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液；
S5：利用D-Hanks溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，接着启用离心机以2000r/min离心5-10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培养基内进行培养；
S6：利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，并将接种瓶移植到CO2孵箱内培养；
S7：3天后全量换为MMSC Basal Medium培养液，弃去未贴壁的细胞与杂质，根据细胞生长情况，每2天换液一次；
S8：获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间，待胞质回缩，加含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化；
S9：将细胞悬液1000rpm离心3min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换为MesenPRORSa-MMedium培养液，P2代以后按1:8的比例传代，直至细胞彼此融合。
2.根据权利要求1所述的自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤S2中，所用的0.2％胰蛋白酶溶液与子宫内膜的体积比为1:2或者1:3。
3.根据权利要求1所述的自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤S4中，恒温震荡仪在工作时设置的温度为37℃。
4.根据权利要求1所述的自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤S5中，DMEMF/12培养基中的成分为FBS(胎牛清血)10％，3ug/ml两性霉素B，庆大霉素90U/ml或双抗1-3％，bFGF18ng/ml。
5.根据权利要求1所述的自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤S6中，接种瓶内细胞的密度为103cm2～105cm2。
6.根据权利要求1所述的自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤S6中，CO2孵箱的饱和湿度为100％，工作的温度为37℃，CO2的含量为5％。
7.根据权利要求1所述的自体子宫内膜提取干细胞的培养方法，其特征在于：所述0.9％的抗生素为庆大霉素，浓度为25mg/L。
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