CN110170072A - 细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法 - Google Patents

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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract

一种细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法，它包含如下步骤：一、耳后皮肤组织的选择；二、提取耳后皮肤；三、细胞纤连蛋白的制备；四、细胞纤连蛋白的富集；五、真皮组织的修复；本发明所述的细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法，采用自体细胞，无免疫原性反应风险，活性高、效果明显，能有效利用自体组织，且制备成本低廉、可操作性强，突破皮肤吸收屏障，细胞纤连蛋白深度导入到皮下组织部位，迅速被肌肤组织吸收，发挥填充、嫩肤和修复皮肤作用，从而产生疗效；还能够准确地直接到达真皮层，同时又几乎没有创伤，具有准确、安全、高效、适应证广、并发症无等优点。

Description

细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法
技术领域
本发明涉及细胞应用技术领域，具体涉及一种细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法。
背景技术
纤连蛋白是一种细胞外基质中的高分子量糖蛋白，是一种主要的细胞粘附分子，在细胞纤维基质中发挥结构和粘附性作用。纤连蛋白可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平，缩短细胞生长时间，提高单克隆抗体制备技术中的细胞融合率等。纤连蛋白主要以三种形式存在，即由肝细胞或内皮细胞生成的血浆纤连蛋白，由成纤维细胞、早期间充质细胞分泌合成的细胞纤连蛋白，以及胎盘、羊膜组织中的胎儿纤连蛋白。
纤连蛋白广泛参与皮肤真皮细胞迁移、黏附、增殖、止血及衰老和受损皮肤组织修复等过程，调动血液中的单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有生长因子作用。纤连蛋白作为细胞培养的必要基质，可提高多种细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强，DNA、RNA及蛋白质合成速度显著提高。纤连蛋白促进细胞的集落率升高，促进原代培养成活率提高。将纤连蛋白负荷到微球载体上可以作为细胞大量生产的介质。
纤连蛋白FN不同于传统的美容因子如透明质酸、小分子肽、胶原肽、神经酰胺等，不仅可以修复受损真皮细胞，刺激细胞产生营养物质(胶原蛋白、透明质酸、小分子肽等)，促进真皮细胞新陈代谢，还可以调动身体其他部位的营养成分来营养细胞、清理细胞微环境。
因此，开发细胞纤连蛋白修复真皮组织应用于医美技术中的组织再生，可作为一种安全和有效的高科技医美技术和方案。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：它包含如下步骤：
一、耳后皮肤组织的选择：选择18-45岁健康人士，男女均可，首先体检，采集其外周血，用ELASA方法检测乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、EB病毒、嗜热T细胞病毒，为阴性即为合格；
二、提取耳后皮肤：用手术刀或者打孔的方法提取体检合格人士耳后0.8*0.5cm的耳后皮肤，立即压迫止血，贴上创可贴；将皮肤组织迅速放到含有庆大霉素的PBS缓冲液皮肤保存液中；
三、细胞纤连蛋白的制备：在cGMP制备层流室中用眼科剪将耳后皮肤组织剪碎，再将剪碎的耳后皮肤组织放到50毫升离心管中，加入10毫升的3mg/ml的胶原蛋白酶I和5毫升的0.25％胰酶消化180分钟，加入血清的DMEM/F12培养基终止消化，进行离心，弃掉上清，在细胞沉淀中加入20毫升无血清细胞培养基进行培养，每5天换液，第15-20天，观察到梭形细胞长出，且7-8个克隆的时候可以传代、冻存；梭形细胞的边缘细长拉丝处就是外分泌的细胞纤连蛋白；
四、细胞纤连蛋白的富集：取对数期细胞，2000转离心，取上清I，然后在37℃和-80℃中，反复冻融裂解，10000转离心10分钟，去除沉淀，取上清II，上清I和上清II按照2:1的比例混合，在-80℃冷冻储存，真皮修复使用时室温融化3分钟即可；
五、真皮组织的修复：洁面后敷医用麻膏30min，然后去除麻膏，医用碘伏消毒，PBS脱碘，采用0.8-1.2mm深度水光针将细胞纤连蛋白导入，及时用干棉签压迫；医用冷敷贴敷面15分钟，修复真皮组织；
进一步地，步骤二中的耳后皮肤在无菌状态下取得，并在放置在储存液中进行无菌运输，冷链运输，冷冻储存；
进一步地，步骤四中富集的细胞纤连蛋白包含外分泌的细胞纤连蛋白和内分泌的细胞纤连蛋白。
采用上述方案后，本发明有益效果为：本发明所述的细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法，采用自体细胞，无免疫原性反应风险，活性高、效果明显，能有效利用自体组织，且制备成本低廉、可操作性强，突破皮肤吸收屏障，
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明。
本具体实施方式采用的技术方案是：它包含如下步骤：
一、耳后皮肤组织的选择：选择18-45岁健康人士，男女均可，首先体检，采集其外周血，用ELASA方法检测乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、EB病毒、嗜热T细胞病毒，为阴性即为合格；
二、提取耳后皮肤：用手术刀或者打孔的方法提取体检合格人士耳后0.8*0.5cm的耳后皮肤，立即压迫止血，贴上创可贴；将皮肤组织迅速放到含有庆大霉素的PBS缓冲液皮肤保存液中；
耳后皮肤在无菌状态下取得，并在放置在储存液中进行无菌运输，冷链运输，冷冻储存；
三、细胞纤连蛋白的制备：在cGMP制备层流室中用眼科剪将耳后皮肤组织剪碎，再将剪碎的耳后皮肤组织放到50毫升离心管中，加入10毫升的3mg/ml的胶原蛋白酶I和5毫升的0.25％胰酶消化180分钟，加入血清的DMEM/F12培养基终止消化，进行离心，弃掉上清，在细胞沉淀中加入20毫升无血清细胞培养基进行培养，每5天换液，第15-20天，观察到梭形细胞长出，且7-8个克隆的时候可以传代、冻存；梭形细胞的边缘细长拉丝处就是外分泌的细胞纤连蛋白；
四、细胞纤连蛋白的富集：富集的细胞纤连蛋白包含外分泌的细胞纤连蛋白和内分泌的细胞纤连蛋白；取对数期细胞，2000转离心，取上清I，然后在37℃和-80℃中，反复冻融裂解，10000转离心10分钟，去除沉淀，取上清II，上清I和上清II按照2:1的比例混合，在-80℃冷冻储存，真皮修复使用时室温融化3分钟即可；
五、真皮组织的修复：洁面后敷医用麻膏30min，然后去除麻膏，医用碘伏消毒，PBS脱碘，采用0.8-1.2mm深度水光针将细胞纤连蛋白导入，及时用干棉签压迫；医用冷敷贴敷面15分钟，修复真皮组织。
本具体实施方式所述的细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法，采用自体细胞制成细胞纤连蛋白，无免疫原性反应风险，具有活性高、效果明显等优点，并且能有效利用自体组织，且制备成本低廉、可操作性强；能够突破皮肤吸收屏障，细胞纤连蛋白深度导入到皮下组织部位，迅速被肌肤组织吸收，发挥填充、嫩肤和修复皮肤作用，从而产生疗效；还能够准确地直接到达真皮层，同时又几乎没有创伤，具有准确、安全、高效、适应证广、并发症无等优点。
细胞纤连蛋白有显著的填充、嫩肤和修复效果：能填充皮肤凹陷，促进松驰下坠的皮肤光滑收紧，恢复皮肤弹性，减少皮肤皱纹和色素沉着；经细胞纤连蛋白美容抗衰老获得的美容效果，修复各种衰老、受损组织细胞，从肌底细胞本源进行修复，让细胞重新得到年轻化生理能力，再生新的结蹄组织，面部真皮组织具备持久年轻活力，由内而外的淡化色斑、嫩肤、抹平细纹、皮肤重新焕发水嫩感，恢复紧致弹力，美白，提亮肌肤光泽，提升皮肤弹力，增加皮肤弹力，增加皮肤水分，减少皮肤油分。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法，其特征在于它包含如下步骤：
一、耳后皮肤组织的选择：选择18-45岁健康人士，男女均可，首先体检，采集其外周血，用ELASA方法检测乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、EB病毒、嗜热T细胞病毒，为阴性即为合格；
二、提取耳后皮肤：用手术刀或者打孔的方法提取体检合格人士耳后0.8*0.5cm的耳后皮肤，立即压迫止血，贴上创可贴；将皮肤组织迅速放到含有庆大霉素的PBS缓冲液皮肤保存液中；
三、细胞纤连蛋白的制备：在cGMP制备层流室中用眼科剪将耳后皮肤组织剪碎，再将剪碎的耳后皮肤组织放到50毫升离心管中，加入10毫升的3mg/ml的胶原蛋白酶I和5毫升的0.25％胰酶消化180分钟，加入血清的DMEM/F12培养基终止消化，进行离心，弃掉上清，在细胞沉淀中加入20毫升无血清细胞培养基进行培养，每5天换液，第15-20天，观察到梭形细胞长出，且7-8个克隆的时候可以传代、冻存；梭形细胞的边缘细长拉丝处就是外分泌的细胞纤连蛋白；
四、细胞纤连蛋白的富集：取对数期细胞，2000转离心，取上清I，然后在37℃和-80℃中，反复冻融裂解，10000转离心10分钟，去除沉淀，取上清II，上清I和上清II按照2:1的比例混合，在-80℃冷冻储存，真皮修复使用时室温融化3分钟即可；
五、真皮组织的修复：洁面后敷医用麻膏30min，然后去除麻膏，医用碘伏消毒，PBS脱碘，采用0.8-1.2mm深度水光针将细胞纤连蛋白导入，及时用干棉签压迫；医用冷敷贴敷面15分钟，修复真皮组织。
2.根据权利要求1所述的细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法，其特征在于步骤二中的耳后皮肤在无菌状态下取得，并在放置在储存液中进行无菌运输，冷链运输，冷冻储存。
3.根据权利要求1所述的细胞纤连蛋白的制备及修复真皮组织的方法，其特征在于步骤四中富集的细胞纤连蛋白包含外分泌的细胞纤连蛋白和内分泌的细胞纤连蛋白。
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