CN109161521A - 一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法，其包括如下操作步骤：1)分离培养人脂肪干细胞；2)条件培养基制备：取传代培养中的P3至P6代次人脂肪干细胞，加入无血清培养基继续培养48h后收集细胞培养基上清液，对上清液进行离心处理20min，用0.22μm滤器过滤后获得人脂肪干细胞条件培养基。本发明的人脂肪干细胞条件培养基可以极显著地提高衰老的人皮肤成纤维细胞的活力，初步证实该条件培养基具有延缓皮肤衰老的作用，可将其应用于美容护肤品行业，且该条件培养基不含血清等复杂成分，在应用中降低了出现过敏反应的可能性，有利于在生产实际中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法。
背景技术
在细胞培养过程中，细胞会分泌活性物质到培养基中，其中细胞因子是主要的活性物质之一，这种含有细胞分泌物的培养基就叫做条件培养基。利用条件培养基可有效提高细胞或组织体外培养的成功率，促进细胞增殖。脂肪干细胞(adipose-derived stemcells，ADSCs)是脂肪组织中一类多能干细胞，其含量丰富，易于分离，供区易被患者接受，被认为是有极大应用前景的干细胞。研究表明ADSCs能够增强细胞增殖、迁移的活力，提高受损细胞生命力、拮抗细胞凋亡，在抗衰老方面具有显著的作用，且具有旁分泌功能，合成分泌多种类型细胞因子和成分，包括表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)等，可促进成纤维细胞增殖及胶原的分泌，使真皮内胶原含量增加，分泌大量新的细胞外基质成分，从而修复原有的真皮层弹性纤维断裂，重建、修复皮肤结构，达到皮肤真皮变厚、皮肤弹性增加，从而改善皮肤质地。
皮肤衰老是组织结构变化的外在表现，皮肤的表皮层、真皮层以及皮肤附属器的组织均会随着机体年龄的增长而发生相应改变，最具有特征性的变化是真皮层成分的变化。真皮层成分变化的内因是成纤维细胞衰老，延缓或抑制成纤维细胞的老化是治疗和预防皮肤衰老的关键。“爱美之心人皆有之”，为了保持年轻的肌肤状态，越来越多的消费者开始使用具有抗衰老功效的化妆品或采用面部提拉手术、透明质酸充填、肉毒素注射等年轻化技术，这些方法可以达到一定的效果。但这些方法都只是在皮肤外观上达到美化的作用，并不能真正从生理上达到抗皮肤衰老的作用。
脂肪干细胞具有抗衰老作用，但考虑伦理问题，成体干细胞具有潜在的致癌性，注射细胞并不是最理想的方法。研究表明，脂肪干细胞分泌的因子具有抗衰老作用，所以脂肪干细胞条件培养基有望拥有脂肪干细胞对皮肤的修复重建功能，其亦是避免伦理问题、致癌性、过敏反应的最有效工具。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法，其包括如下操作步骤：
1)分离培养人脂肪干细胞：取人脂肪组织，PBS溶液清洗、离心处理5min，取下层脂肪组织，加入Ⅰ型胶原蛋白酶溶液消化，离心处理，去除上层油脂和下层胶原酶溶液，然后用PBS溶液重悬沉淀，吹散后用200目细胞滤网过滤，离心处理10min，弃上清，加入完全培养基重悬，接种于培养板中传代培养；
2)条件培养基制备：取传代培养中的P3至P6代次人脂肪干细胞，待人脂肪干细胞生长至75～85％培养基时，弃去培养基，PBS溶液清洗，加入无血清培养基继续培养48h后收集细胞培养基上清液，对上清液进行离心处理20min，用0.22μm滤器过滤后获得人脂肪干细胞条件培养基，4℃保存备用。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中所述完全培养基为含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养基。
作为上述方案的进一步改进，步骤2)中所述无血清培养基为含有双抗的DMEM/F12基础培养基。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中所述Ⅰ型胶原蛋白酶溶液为等体积现配的预热后浓度为0.1％的Ⅰ型胶原蛋白酶溶液。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中所述消化的时间为60min，温度为37℃。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中所述离心处理的离心速度为2000rpm。
作为上述方案的进一步改进，步骤2)中所述离心处理的离心速度为3000rpm。
本发明的有益效果是：本发明的人脂肪干细胞条件培养基可以极显著地提高衰老的人皮肤成纤维细胞的活力，初步证实该条件培养基具有延缓皮肤衰老的作用，可将其应用于美容护肤品行业，且该条件培养基不含血清等复杂成分，在应用中降低了出现过敏反应的可能性，有利于在生产实际中的应用。
附图说明
图1是实施例1所培养的人脂肪干细胞的细胞形态图(其中图1A是原代培养5d的细胞形态图，可见细胞呈长梭形生长；图1B为传代培养细胞，细胞形态均呈梭形生长，汇合的细胞呈漩涡状或网状排列)；
图2是实施例2的人脂肪干细胞表面抗原流式检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
实施例1
一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于：
1)分离培养人脂肪干细胞：取人脂肪组织，PBS溶液清洗、2000rpm离心处理5min，取下层脂肪组织，加入等体积现配的预热后浓度为0.1％的Ⅰ型胶原蛋白酶溶液，37℃温度条件下消化处理60min，离心处理，去除上层油脂和下层胶原酶溶液，然后用PBS溶液重悬沉淀，吹散后用200目细胞滤网过滤，离心处理10min，弃上清，加入含有10％胎牛血清的低糖DMEM完全培养基重悬，接种于培养板中传代培养，其培养得到的人脂肪干细胞的细胞形态图如附图1所示；
2)条件培养基制备：取传代培养中的P3至P6代次人脂肪干细胞，待人脂肪干细胞生长至75～85％培养基时，弃去培养基，PBS溶液清洗，加入含有双抗的DMEM/F12无血清培养基继续培养48h后收集细胞培养基上清液，对上清液进行3000rpm离心处理20min，用0.22μm滤器过滤后获得人脂肪干细胞条件培养基，4℃保存备用。
实施例2：人脂肪干细胞表面抗原检测
1)取实施例1中P5代次的脂肪干细胞，弃去培养基，用PBS溶液清洗一次，再用0.25％含有EDTA的胰酶进行消化，调节细胞浓度为1×106个/ml；
2)1200r/min条件下离心处理5min，细胞沉淀重悬于100μl的PBS中；
3)分别加入抗体CD73、CD90、CD105、CD44、CD34、CD45、HLA-ABC、HLA-DR及同型对照IgG1、IgG2的单克隆抗体，室温下避光孵育30min；
4)1200r/min条件离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2次，用500μL PBS重悬后上机检测。
实施例2的人脂肪干细胞表面抗原检测结果如附图2所示，其中IgG1、IgG2均为同型对照，结果显示，人脂肪干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105，低表达HLA-ABC，不表达CD34、CD45、HLA-DR，表现为间充质干细胞典型表型，可证明其为人脂肪干细胞。
实施例3：人脂肪干细胞条件培养基对皮肤成纤维细胞的作用
1)人皮肤成纤维的培养：所培养的人皮肤成纤维细胞为细胞系，传至45代以下，为自然衰老细胞。其完全培养基为含有10％胎牛血清的DMEM/F12，培养于37℃，5％CO2培养箱中；
2)将皮肤成纤维细胞消化离心后，重悬细胞沉淀，按每孔2×103个细胞接种于96孔板中，于37℃、5％CO2条件下培养24h后，更换培养基并分组培养，组别分别为无血清培养基、含25％ADSC-CM的培养基、含50％ADSC-CM的培养基、含75％ADSC-CM的培养基和100％ADSC-CM，分别于三个时间点即24h、48h、72h检测96孔板的吸光度；检测时弃去孔内培养基，每孔加入CCK-810ul和无血清DMEM 100ul的混合液，细胞培养箱中孵育2.5h，酶标仪下检测波长450nm处的吸光度。下表1是实施例3中分别于24h、48h、72h三个时间点，对人皮肤成纤维细胞进行CCK-8检测所获得的OD值。结果显示，在这三个时间点，含不同浓度ADSC-CM的培养基组别的OD值均高于无血清培养基组，具有极显著性差异(P<0.001)，并且随着ADSC-CM浓度的升高，OD值呈线性上升。结果可表明ADSC-CM可以提高人皮肤成纤维细胞的活力，达到延缓皮肤衰老的作用。
表1 CCK-8检测所得的OD值
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
Claims (7)
1.一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于包括如下操作步骤：
1)分离培养人脂肪干细胞：取人脂肪组织，PBS溶液清洗、离心处理5min，取下层脂肪组织，加入Ⅰ型胶原蛋白酶溶液消化，离心处理，去除上层油脂和下层胶原酶溶液，然后用PBS溶液重悬沉淀，吹散后用200目细胞滤网过滤，离心处理10min，弃上清，加入完全培养基重悬，接种于培养板中传代培养；
2)条件培养基制备：取传代培养中的P3至P6代次人脂肪干细胞，待人脂肪干细胞生长至75～85％培养基时，弃去培养基，PBS溶液清洗，加入无血清培养基继续培养48h后收集细胞培养基上清液，对上清液进行离心处理20min，用0.22μm滤器过滤后获得人脂肪干细胞条件培养基，4℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述完全培养基为含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述无血清培养基为含有双抗的DMEM/F12基础培养基。
4.根据权利要求1所述的一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述Ⅰ型胶原蛋白酶溶液为等体积现配的预热后浓度为0.1％的Ⅰ型胶原蛋白酶溶液。
5.根据权利要求1所述的一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述消化的时间为60min，温度为37℃。
6.根据权利要求1所述的一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述离心处理的离心速度为2000rpm。
7.根据权利要求1所述的一种人脂肪干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述离心处理的离心速度为3000rpm。
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