JP6859566B2

JP6859566B2 - ピロール系化合物

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Publication number: JP6859566B2
Application number: JP2019557215A
Authority: JP
Inventors: 誠一松郷; 敏夫坂本; 彩香西田; 和田　直樹; 直樹和田; 小西　徹也; 徹也小西
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Current assignee: Mycology Techno Corp
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Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2021-04-14
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Description

本発明は、新規なピロール系化合物に関する。より詳細には、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭＢＰ−１００１１の抽出組成物に含まれる新規物質であるピロール系化合物に関する。

古来きのこ類は、独特の風味や香りを有する食材として汎用されると共に、免疫力の向上、抗菌、体調リズムの調節、老化防止等の生理機能活性化作用等を有するとして、漢方薬又はある種の疾患の民間薬としても用いられてきた。また、きのこに関する薬効成分の研究も進歩してきており、抗菌・抗ウイルス作用、強心作用、血糖降下作用、コレステロール低下作用、抗血栓作用、血圧降下作用等を示す成分が見出されている。

本出願人は、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭＢＰ−１００１１（以下、「バシディオマイセテスＸ」という）の抽出組成物（以下、「バシディオマイセテスＸ抽出組成物」という。）について、以前に出願した（特許文献１参照）。バシディオマイセテスＸ抽出組成物は、多量の多糖類（β−Ｄ−グルカン）が含まれており、抗酸化力が高く、ＯＨラジカル消去活性を有しているため、老化防止等の効能が期待できるものであると共に、免疫調整効果を有しているため、免疫賦活剤等として用いて好適なものである。また、本出願人は、バシディオマイセテスＸ抽出組成物を用いた、アトピー性疾患の改善・予防に対して優れた効果を有するアトピー性疾患組成物についても、以前に出願した（特許文献２参照）。

国際公開第２００４／０９７００７号特開２００７−１０９４４９号公報

しかしながら、特許文献１，２に記載のバシディオマイセテスＸ抽出組成物には、新規物質が含まれている可能性があるところ、そのような化合物について特定されていない。また、バシディオマイセテスＸ抽出組成物に含まれる新規物質の特定により、かかる新規物質の用途開発にも道が開ける。

本発明は、このような実情に鑑み、バシディオマイセテスＸ抽出組成物に含まれる新規物質を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく誠意研究を重ねた結果、バシディオマイセテスＸ抽出組成物に新規物質が含まれていることを見出し、かかる新規物質の構造を特定すると共に、当該新規物質を単離・精製して本発明を完成させるに至った。

上記目的を達成する本発明の第１の態様は、下記式（１）で示されるピロール系化合物にある。

本発明によれば、バシディオマイセテスＸ抽出組成物に含まれる新規物質を提供することができる。

各抽出画分の総フェノール量を示したグラフである。各抽出画分のＤＰＰＨラジカル消去活性を示したグラフである。各抽出画分の鉄イオン還元力を示したグラフである。各抽出画分の銅イオン還元力を示したグラフである。各抽出画分の鉄イオンキレート活性を示したグラフである。検出波長が２６０ｎｍのときの有機層のＨＰＬＣクロマトグラムである。検出波長が２９０ｎｍのときの有機層のＨＰＬＣクロマトグラムである。有機層のＰＴＬＣクロマトグラムである。フラクション１のＨＰＬＣクロマトグラムである。フラクション２のＨＰＬＣクロマトグラムである。フラクション３のＨＰＬＣクロマトグラムである。フラクション４のＨＰＬＣクロマトグラムである。フラクション５のＨＰＬＣクロマトグラムである。フラクション３のＤＡＲＴ−ＭＳスペクトルである。フラクション３の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。フラクション３の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。フラクション１の分取ＨＰＬＣクロマトグラムである。フラクション１−３のＨＰＬＣクロマトグラム及びピーク１２の紫外可視吸収スペクトルである。フラクション１−３のＤＡＲＴ−ＭＳスペクトルである。フラクション１−３の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。フラクション１−３の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。

本発明は、新規なきのこであるバシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭＢＰ−１００１１（以下、「バシディオマイセテスＸ」という）の抽出組成物（以下、「バシディオマイセテスＸ抽出組成物」という。）に含まれる新規物質である。この新規物質の具体的な構造は、下記式（１）に示されるものである。即ち、本発明における新規物質とは、特定構造を有するピロール系化合物である。

ここで、本発明でいうバシディオマイセテスＸとは、担子菌であり、嘴状突起（クランプ）は観察されるが、担子器形成能を有しないという特性を有しており、他の担子菌と区別される。即ち、培養しても、担子器を形成せずに、菌核（菌糸塊）を形成するだけである。かかるバシディオマイセテスＸは、菌を自然界から探索した結果得たものであり、単離し、バシディオマイセテスＸとして独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）ＮＩＴＥ特許生物寄託センターに寄託した（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１００１１）。

このバシディオマイセテスＸは、分生子を形成しない、即ち、無性世代を有しないものである。例えば、ポテトグルコース寒天培地で培養すると、培養菌糸は、クランプを有し、平滑であるが、分生子を形成せず、子実体を形成しない。コロニー表面の形状色調を観察すると、コロニー内に淡桃色の菌糸塊を形成しており、植菌部位から同心円状に生長したコロニー内に複数の菌糸塊を形成した場合、菌糸塊は相互に菌糸束により連結される。なお、コロニーの裏面の色調は、淡桃色である。また、グルコース・ドライイースト寒天培地で培養すると、培養菌糸はクランプを有し、平滑であるが、分生子を形成せず、子実体を形成しない。コロニー表面の形状色調を観察すると、コロニー内に淡桃〜白色の菌糸塊を形成し、植菌部位を中心とするように厚さ５ｍｍ〜６ｍｍの菌糸塊を形成している。なお、コロニーの裏面の色調は、淡桃〜白色である。

バシディオマイセテスＸの最適生育条件は、例えば、ｐＨ５．０〜６．０で、温度２２℃〜２６℃である。また、生育範囲は、例えば、ｐＨ４．０〜７．５で、温度５℃〜３０℃である。

また、バシディオマイセテスＸは、上述した一般的な培養方法により培養でき、培養方法は特に限定されるものではない。例えば、適当な栄養源を添加して滅菌した寒天培地、おがくず培地、液体培地等に、培養済の菌株又は種菌を無菌的に植菌し、適温条件下で培養することにより、バシディオマイセテスＸの菌糸塊（以下、「バシディオマイセテスＸ菌糸塊」という）を得ることができる。なお、バシディオマイセテスＸを培養すると、培養した環境に応じて菌糸塊を形成する。

このようなバシディオマイセテスＸ菌糸塊を、必要に応じて乾燥し、この乾燥物を粉末にする（以下、「バシディオマイセテスＸ乾燥粉末」という）。そして、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末から、本発明のピロール系化合物を抽出し、単離・精製することができる。

バシディオマイセテスＸ乾燥粉末から本発明のピロール系化合物を抽出する方法は、特に限定されない。例えば、バシディオマイセテスＸ菌糸塊から細胞内容物を効率よく抽出するには、好適には、必要に応じてバシディオマイセテスＸ菌糸塊を凍結する等して細胞壁に損傷を与えて解凍した後、ミキサー等により破砕し、抽出液（エキス）を抽出する。

エキスの抽出溶媒は特に限定されないが、水、低級アルコール等を用いることができる。この抽出溶媒に、更には、酸、アルカリ、その他の添加剤を添加したエキスを用いて、常温若しくは加熱条件下、又は加圧下にて抽出する。一般的には、熱水で煮出して抽出するか、又は、水若しくはアルコールやアルカリを添加した水と破砕物を混合した状態で、例えば、１００ＭＰａ〜７００ＭＰａ程度、好ましくは、３００ＭＰａ〜６００ＭＰａ程度加圧して抽出するのがよい。

ここで、エキスの抽出方法の一例を説明する。まず、凍結しているバシディオマイセテスＸ菌糸塊を常温解凍し、ミキサーを用いて破砕し、破砕したバシディオマイセテスＸ菌糸塊と抽出溶媒である水との割合を、例えば、１：５程度とし、破砕したバシディオマイセテスＸ菌糸塊５０ｇをガラス瓶に入れ、水２５０ｍＬを加えて蓋を締める。鍋の内底にタオルを敷き、その上に水を注ぎ、破砕したバシディオマイセテスＸ菌糸塊の入ったガラス瓶を置いて加熱・沸騰させる。沸騰してから９０分間加熱を継続し、冷却後固液分離し、エキス（バシディオマイセテスＸ抽出組成物）及び残渣（バシディオマイセテスＸ抽出残渣）を得る。エキスのｐＨは６．３〜６．５を示す。破砕したバシディオマイセテスＸ菌糸塊は、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末に替えてもよく、例えば、この場合、適宜これを水溶媒中で、撹拌しながら４時間〜６時間静置培養し、その後、固液分離し、エキス及び残渣を得ることができる。

また、上記方法で得られたエキスを必要に応じて濃縮し、濃縮エキスとして用いてもよい。なお、エキスの濃縮方法は特に限定されないが、例えば以下のように行う。

得られたエキスをビーカーに移し、加熱・蒸発させて濃縮する。このとき、エキスは淡いベージュ色から褐色を呈するようになり、盛んに発泡をはじめるようになるが、更に蒸発・濃縮を継続し、例えば、ｐＨ４．９、密度１．２５ｇ／ｃｍ^３のタール状となった時点で、濃縮を終了させて濃縮エキスを得る。この濃縮エキスは、醤油様の芳香を発する。なお、この時点における、バシディオマイセテスＸ菌糸塊からの濃縮エキスの収率は平均１２％である。このように得た濃縮エキスは冷却するに従い、粘性が非常に高まるため、濃縮終了と同時に保存容器に移す必要がある。また、保存容器に移した濃縮エキスは、そのまま冷却後、冷凍・凍結保存とするのが好ましい。

得られたエキス又は濃縮エキス、即ちバシディオマイセテスＸ抽出組成物から、本発明のピロール系化合物を単離・精製することができる。かかる単離・精製方法は特に限定されず、一般的な手法を適用することができる。

バシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はその抽出組成物であるバシディオマイセテスＸ抽出組成物は、特許文献１に記載されているように、抗酸化力が高く、ＯＨラジカル消去活性を有しているため、老化防止等の効能が期待できるものであると共に、免疫調整効果を有しているため、免疫賦活剤等として用いて好適なものである。更に、特許文献２に記載されているように、アトピー性疾患の改善・予防に対して優れた効果を有しており、アトピー性疾患組成物としても有用である。

加えて、「２０１６年度越後白雪茸研究会総会第７回越後白雪茸研究会セミナー・研究報告会議」では、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はバシディオマイセテスＸ抽出組成物の、「非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ＮＡＳＨ）における越後白雪茸の効果」について公開されている。これによれば、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はバシディオマイセテスＸ抽出組成物は、ＮＡＳＨを改善することができ、また、ＮＡＳＨから肝硬変及び肝細胞癌への移行を予防することができる。

バシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はバシディオマイセテスＸ抽出組成物を、上述の老化防止、ＮＡＳＨの改善、ＮＡＳＨから肝硬変及び肝細胞癌への移行の予防等に用いる場合や、免疫賦活剤、アトピー性疾患組成物等として用いる場合には、乾燥粉末状又は抽出液状で用いてもよい。また、バシディオマイセテスＸ抽出組成物を必要に応じて乾燥し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状、ゲル状等の形態にし、又はバシディオマイセテスＸ乾燥粉末のままで用いてもよい。なお、上記の各形態におけるバシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はバシディオマイセテスＸ抽出組成物の含有割合は、用途に応じて適宜設定すればよく、特に限定されない。

バシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はバシディオマイセテスＸ抽出組成物は、上記の各形態から選択される何れかの形態で各種食品組成物や各種飲料組成物とすることができる。そして、必要に応じて加工を加えることにより、サプリメントや飲料等として提供することができる。なお、各種食品組成物や各種飲料組成物中のバシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はバシディオマイセテスＸ抽出組成物の含有割合は、必要に応じて適宜設定すればよく、特に限定されない。

また、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はバシディオマイセテスＸ抽出組成物を、アトピー性疾患やＮＡＳＨ等の予防及び治療又は、肝硬変や肝細胞癌等の予防に用いる場合には、これらの摂取方法に特に制限はなく、各種疾患の程度や各種疾患に由来する諸症状等に合わせて有効量を適宜決定し、内服することができる。日常生活において手軽に摂取可能であることから、経口摂取させることが好ましい。また、摂取条件としては、例えば、バシディオマイセテスＸ抽出組成物を乾燥して粉末化し、好ましくは２００ｍｇ〜３００ｍｇの錠剤としたものを、１日１回〜３回、好ましくは３回経口摂取する各種治療方法又は各種予防方法が挙げられる。服用期間は特に限定されないが、長期間とすることが好ましく、例えば、８週間以上が好ましく、特に１６週間以上が好ましい。或いは、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末を用いる場合には、例えば、そのまま錠剤にしたものを摂取してもよいし、シロップ等の液体に溶解して摂取してもよい。

本発明のピロール系化合物は、上述した通りバシディオマイセテスＸ抽出組成物から単離・精製することができるが、所定の方法で合成してもよい。例えば、本発明のピロール系化合物の類似化合物であって公知の化合物である、下記式（２）で示されるピロール系化合物、即ち「４−［ｆｏｒｍｙｌ−５−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌ−１−ｙｌ］ｂｕｔａｎｏｉｃａｃｉｄ」の合成方法を参照してもよい。なお、下記式（２）で示されるピロール系化合物の合成方法は、例えば、「Ｍ．Ｎｉｎｏｍｉｙａｅｔ．ａｌ，Ｂ．ＢＢ．，１９９２年，５６，ｐ．８０６−ｐ．８０７」、「ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔＳｏｕｒｃｅ」、「Ｙ．−Ｗ．Ｃｈｉｎｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００３年，１３，ｐ．７９−ｐ．８１」等の文献に開示されている。

上記式（１）で示されるピロール系化合物は、後述の方法により合成することができる。

まず、４−アミノブタン酸アミド（１９０．８ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）、Ｄ−グルコース（３５６．５ｍｇ，１．９８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２５０ｍｇ，２．４７ｍｍｏｌ）、シュウ酸（１９３．５ｍｇ，２．１５ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド５ｍＬに溶解させ、９０℃で３０分間撹拌しながら反応させた。室温まで冷却した後、水２０ｍＬを加えた後に、酢酸エチル２０ｍＬで３回抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧留去し得られた粗生成物を『ヘキサン：酢酸エチル：メタノール＝４：４：２（ｖ／ｖ）』を展開溶媒とする分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅｔｈｉｎｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製を行った。得られたアミド体は約７ｍｇであり、収率は約２％であった。このアミド体が本発明のピロール系化合物である。

以下、本発明のピロール系化合物を更に具体的に説明する。

（製造例１）
＜菌糸塊からの分離＞
（１）培地の調製
下記表１に示す配合で、ＰＳＡ培地及びＰＤＡ培地を調製し、試験管又は三角フラスコに分注した後、シリコセン（又は綿栓）を施しオートクレーブにより１２１℃２０分間高圧蒸気滅菌した。その後、試験管の場合は、滅菌後熱いうちに傾斜させてスラント（斜面）培地とし、三角フラスコの場合は、そのまま静置してプレート（平面）培地とした。

（２）菌糸塊からの分離
大きめのバシディオマイセテスＸ菌糸塊を手で割り、火炎滅菌したメスを冷却させてからバシディオマイセテスＸ断面より切片を切断し、火炎滅菌冷却後のピンセットで、（１）のＰＳＡ培地及びＰＤＡ培地スラントにバシディオマイセテスＸ切片を植菌した。なお操作は、無菌箱又はクリーンベンチ内の、無菌処理済み条件下で行った。

（３）菌糸塊生産のためのＡｇａｒ培地による培養
１ｃｍ角としたジャガイモ２００ｇを、精製水を用いて煮沸後２０分継続して冷却後、固液分離したジャガイモ浸出液、スクロース２０ｇ及びＡｇａｒ１ｇ（０．１％）に蒸留水を全量１Ｌとなるように加えて、Ａｇａｒ培地を調整した。なお、通常Ａｇａｒ培地は１．５〜２．０（培地１Ｌに対し、１５ｇ〜２０ｇ）のＡｇａｒを添加するが、培養後の菌糸塊と、Ａｇａｒ培地の分離を容易にするため、また液体培地ではバシディオマイセテスＸの切片が沈降しやすいため物理的強度を維持する目的で、０．１％添加することとした。この０．１％Ａｇａｒ培地を試験管に各５ｍＬに分注し、シリコセンを施した後オートクレーブにより１２１℃２０分間高圧蒸気滅菌した。その後、無菌処理済みの無菌箱内において、製造例１のスラントにて培養中のバシディオマイセテスＸ菌糸塊から切片を切除し、０．１％Ａｇａｒ培地に無菌操作により植菌した。２４℃条件下でインキュベーターにおいて培養させたところ、２４時間〜４８時間後には発菌した。発菌後、２４℃条件下で培養を継続すると、１４日間でＡｇａｒ培地上に菌糸が生育した。

（製造例２）
＜菌糸塊生産のためのおがくず培地による培養＞
（１）種菌の培養
おがくず１Ｌ、脱脂ぬか１５ｇ、ふすま１５ｇ及びサンパール（菌糸活性剤・日本製紙製）５ｇに、水を加えて十分に撹拌し、培地を強く握って水がにじむ程度（湿式含水率７０％程度）として、おがくず培地を調製した。この培地を三角フラスコに入れ、シリコセンを施した後、オートクレーブにより１２１℃４０分高圧蒸気滅菌した。滅菌後２４時間後に、無菌処理済みの無菌箱内において、製造例１のスラントにて培養中のバシディオマイセテスＸ菌糸を、無菌操作によっておがくず培地に植菌した。なお、植菌は滅菌三角刀でスラントの一部を切除するようにし、菌糸にダメージを与えないように行った。また、植菌の密度は、おがくず培地の表面積の２０％〜３０％とした。２４℃条件下で培養したところ３日後（遅くとも５日後）に発菌し、３０日後には三角フラスコおがくず培地に菌糸が充満した。

（２）菌糸塊の発生
（１）と同様にしたおがくず培地を調製し、この培地をポリプロピレン製ビンに入れ、フタをして、オートクレーブにより１２１℃４０分間高圧蒸気滅菌した。滅菌後２４時間後、無菌処理済みの無菌箱内において無菌操作により、（１）で培養した種菌をポリプロピレン製ビンのおがくず培地に植菌した。なお、植菌の密度は、おがくず培地の表面がほぼ覆われる程度とした。２４℃条件下で培養したところ、４８時間後に発菌し、６０日後にはポリプロピレン製ビン内のおがくず培地全体に菌糸が充満した。更に４０日〜５０日経過すると、ポリプロピレン製ビンの内壁に菌糸が展開し、菌糸束を形成、更に培養を継続すると菌糸塊を形成した。

（製造例３）
＜バシディオマイセテスＸ乾燥粉末の製造＞
菌糸の細胞壁に損傷を与え、細胞内容物が浸出することを容易にするため、製造例２で得られたバシディオマイセテスＸ菌糸塊を冷凍・凍結させ、凍結しているバシディオマイセテスＸ菌糸塊を常温解凍し、ミキサーを用いて破砕したものを乾燥して粉末に加工した（以下、「バシディオマイセテスＸ乾燥粉末」という）。

（実施例１）
製造例３で得られたバシディオマイセテスＸ乾燥粉末５０ｇを蒸留水５００ｍＬで抽出して水抽出物４３０ｍＬを得た（この水抽出物を凍結乾燥すると凍結乾燥物１６ｇが得られた）。次に、この水抽出物４３０ｍＬにエタノール１６０ｍＬを加えたところ、上清５４０ｍＬと沈殿１．７２ｇが得られた（上清５４０ｍＬを凍結乾燥すると固形物１２．４ｇが得られた）。次に、上清５４０ｍＬを酢酸エチル３６０ｍＬで２回抽出し、含水有機層を分離した。分離した含水有機層の有機層９２０ｍＬを濃縮・乾固して乾固物０．８４ｇが得られた。一方、水層２７０ｍＬを凍結乾燥すると固形物１０．６ｇが得られた。これらの各抽出画分（沈殿、有機層、水層）の回収量から、水抽出物を１００％としたときの各抽出画分の回収率を求め、下記表２に示した。

（実施例２）
実施例１の各抽出画分について、５つのアッセイ系で抗酸化能力をそれぞれ評価し、これらの評価結果について図１〜５に示した。図１は、各抽出画分の総フェノール量を示したグラフである。総フェノール量は、各抽出画分を１．２５ｍｇ／ｍＬの溶液に調整し、没食子酸（別名：３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）を検量線用の標準物質として用いて測定した。図２は、各抽出画分のＤＰＰＨラジカル消去活性を示したグラフである。ＤＰＰＨ（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル）ラジカル消去活性は、各抽出画分を２．５ｍｇ／ｍＬに調整し、トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ、６−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，５，７，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ）を検量線用の標準物質として用いて測定した。図３は、各抽出画分の鉄イオン還元力を示したグラフである。鉄イオン（Ｆｅ^３＋）還元力は、各抽出画分を２．０ｍｇ／ｍＬに調整し、トロロックスを検量線用の標準物質として用いて測定した。図４は、各抽出画分の銅イオン還元力を示したグラフである。銅イオン（Ｃｕ^２＋）還元力は、各抽出画分を２．５ｍｇ／ｍＬに調整し、尿酸を検量線用の標準物質として用いて測定した。図５は、各抽出画分の鉄イオンキレート活性を示したグラフである。鉄イオン（Ｆｅ^２＋）キレート活性は、各抽出画分を１５ｍｇ／ｍＬに調整し、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）を検量線用の標準物質として用いて測定した。なお、図１〜５に記載の各エラーバー（Ｅｒｒｏｒｂａｒ）は、標準誤差（Ｓ．Ｅ．：ＳｔａｎｄａｒｄＥｒｒｏｒ）を表している。また、図１〜５の何れかに記載の「＊」印は、水抽出物に対する他の抽出画分が０．０５水準で有意差のあることを表しており、「＊＊」印は、水抽出物に対する他の抽出画分が０．００１水準で有意差のあることを表している。図１〜５の結果に基づき、水抽出物に対する各抽出画分の相対活性を算出し、下記表３に示した。

上記表３に示した通り、有機層が、ＤＰＰＨラジカル消去活性、Ｆｅ^３＋還元力及びＣｕ^２＋還元力について高い数値を示し、抗酸化能力が大きいことが確認された。ただし、Ｆｅ^２＋キレート活性については、沈殿や水層と比較して有機層の数値は低く、抗酸化能力が小さいことが確認された。

（試験例１）
実施例２の評価結果を踏まえて、抗酸化能力の大きな有機層に含まれる化合物の数及び相対量を調べるために、有機層の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による解析を行った。このとき、検出波長を２６０ｎｍ及び２９０ｎｍとし、溶出時間を０〜５０分とした。試験例１における解析結果について、図６，７に示した。図６は、検出波長が２６０ｎｍのときの有機層のＨＰＬＣクロマトグラムである。図７は、検出波長が２９０ｎｍのときの有機層のＨＰＬＣクロマトグラムである。図６，７に示した通り、それぞれ少なくとも１９種類のピークが確認され、これらのピークの中で比較的大きな強度を示したものは、ピーク１２とピーク１８であった。

（試験例２）
試験例１の解析結果を踏まえて、有機層に含まれる化合物の単離・精製を行うために、有機層の薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅｔｈｉｎｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による分離を行った。具体的には、少量の有機層をＰＴＬＣプレート上に滴下し、以下に示した条件で展開方向における各画分に分離し、その結果を図８に示した。図８は、有機層のＰＴＬＣクロマトグラムである。図８に示した通り、概ね５つのパート（フラクション１〜５）に分離できることが確認できた。

［ＰＴＬＣ条件］
・ＰＴＬＣプレート：ＰＬＣＳｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｆ_２５４、２ｍｍ、２０×２０ｃｍ、メルク社製
・展開溶媒：クロロホルム１２０ｍＬ／メタノール８０ｍＬ
・検出波長：紫外線２５４ｎｍ
・サンプル量：１００ｍｇ／ｍＬメタノール（１ｍＬ）

また、図８の結果に基づき、各フラクションのＲ_ｆ値、有機層の回収量及びその回収量から算出した有機層を１００％としたときの各フラクションの回収率を求め、下記表４に示した。

図８及び上記表４に示した通り、フラクション１，３は、他のフラクション２，４，５と比較して、多くの化合物が存在していることが確認できた。

（試験例３）
試験例２の解析結果を踏まえて、各フラクションのＨＰＬＣによる解析を行った。試験例３では、有機層が各フラクションに分離する過程で化合物が分解している可能性を考慮し、試験例１で示された各ピークに対応する化合物における相対量の測定を行った。このとき、検出波長を２６０ｎｍとし、溶出時間を０〜５０分とした。試験例３における解析結果について、図９〜図１３に示した。図９〜図１３は、それぞれフラクション１〜フラクション５のＨＰＬＣクロマトグラムである。図９〜図１３に示した通り、フラクション１にはピーク１２に対応する化合物（化合物１２）が、フラクション３にはピーク１８に対応する化合物（化合物１８）が、それぞれ顕著に多く含まれていることが確認できた。

図９〜図１３のＨＰＬＣクロマトグラムについて、各ピークのスペクトル解析を行い、各フラクションにおいて、各ピークに対応する化合物の溶出時間、極大吸収波長（λ_ｍａｘ）及びショルダー（肩ピーク）を求め、その結果を下記表５に示した。

上記表５に示した通り、各ピークに対応する化合物のスペクトルにより、相互間の構造の近似性が明らかとなった。特に、化合物１２，１８のスペクトルには、最大吸収波長及びショルダーによって、構造の近似性が認められた。

（参考例１）
試験例３において、フラクション３において含有量が多かった化合物１８について、構造解析を行った。まず、試験例２と同様の条件でＰＴＬＣにより有機層を各フラクションに分離した後、フラクション３をさらにＨＰＬＣで精製し化合物１８を得た。質量分析法（ＭＳ：ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により化合物１８の分子量を決定し、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ：ｎｕｃｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅ）により化合物１８の構造を確定した。

化合物１８の分子量の決定には、ＦＡＢ−ＨＲＭＳ解析及びＤＡＲＴ−ＭＳ解析を行った。ＦＡＢ−ＨＲＭＳ解析では、高分解能質量分析装置（ＨＲＭＳ：ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用い、イオン化には高速原子衝撃法（ＦＡＢ：ｆａｓｔａｔｏｍｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を適用した。また、ＤＡＲＴ−ＭＳ解析では、質量分析装置において、イオン化にＤＡＲＴイオン源（ＤＡＲＴ：ｄｉｒｅｃｔａｎａｌｙｓｉｓｉｎｒｅａｌｔｉｍｅ）を用いた。ＦＡＢ−ＨＲＭＳ解析の結果を下記表６に示し、ＤＡＲＴ−ＭＳ解析の結果を図１４に示した。図１４は、フラクション３のＤＡＲＴ−ＭＳスペクトルである。下記表６及び図１４に示した通り、化合物１８の分子量はＭ＋１(Ｈ相当)であり１マス多く出ていた。しかしながら、エラー率が小さいので、分子式は「Ｃ_１０Ｈ_１４Ｏ_４Ｎ」であると判断した。なお、下記表６のミリマスユニット（ｍｍｕ：ｍｉｌｌｉｍａｓｓｕｎｉｔ）において、「１ｕ＝１Ｄａ」の関係が成立する。ダルトン（Ｄａ）は、統一原子質量単位であって自然単位系（ＳＩ併用単位）である。

化合物１８の構造の確定には、核磁気共鳴分光計を用い、ＮＭＲ測定用重水素化溶媒として重メタノール（ＣＤ_３ＯＤ）を用いた。ＮＭＲによる構造解析の結果を図１５，１６に示した。図１５は、フラクション３の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図１６は、フラクション３の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。図１５，１６に示した通り、化合物１８の構造式は、下記式（２）で示されるものであることが判明した。即ち、この化合物１８は、「４−［ｆｏｒｍｙｌ−５−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌ−１−ｙｌ］ｂｕｔａｎｏｉｃａｃｉｄ」である。

（実施例３）
試験例３において、フラクション１において含有量が多かった化合物１２について、構造解析を行った。まず、試験例２と同様の条件でＰＴＬＣにより有機層を各フラクションに分離した後、フラクション１について逆相ＨＰＬＣで精製し、各フラクションに分離した。その結果を図１７に示した。逆相ＨＰＬＣの条件は、以下に示す通りである。また、図１７は、フラクション１の分取ＨＰＬＣクロマトグラムである。図１７に示した通り、分離した３つのフラクション（Ｆｒ１−１，Ｆｒ１−２，Ｆｒ１−３）のピークが大きく、中でもフラクション１−３（Ｆｒ１−３）のピークが最大であった。

［逆相ＨＰＬＣ条件］
・カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ、孔径５μｍ、直径１４ｍｍ×１５０ｍｍ、ジーエルサイエンス社製
・試料：フラクション１ｉｎ３０％メタノール水溶液
・インジェクション量：２００μＬ
・流速：５．５ｍＬ／分
・検出波長：２６０ｎｍ
・溶離液：３０％メタノール水溶液（０．１％酢酸）

（実施例４）
実施例３の結果を踏まえて、フラクション１−３についてＨＰＬＣによる解析を行い、その結果を図１８に示した。ＨＰＬＣの条件は、以下に示す通りである。また、図１８は、フラクション１−３のＨＰＬＣクロマトグラム及びピーク１２の極大吸収波長を示したグラフである。図１８に示した通り、フラクション１−３の鋭いピークは、試験例１で検出されたピーク１２に相当することが判明した。また、ピーク１２の吸収スペクトルは、波長２９７ｎｍにおいて最大吸収を示す化合物であることがわかった。

［ＨＰＬＣ条件］
・カラム：Ｃｏｓｍｏｓｌ１５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、孔径５μｍ、直径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ナカライテスク社製
・インジェクション量：２０μＬ
・流速：０．６０ｍＬ／分
・検出波長：２６０ｎｍ
・溶離液Ａ：０．１％酢酸-水溶液
・溶離液Ｂ：０．１％酢酸-メタノール溶液
・Ｇｒａｄｉｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：０〜２５分溶離液Ａ７０％、溶離液Ｂ３０％の組成で流し、２５〜３０分リニアグラジエントで溶離液Ｂ３０％から１００％に変化させ(溶離液Ａ７０％から０％)、３０〜４０分溶離液Ｂ１００％で流し、４０〜４５分リニアグラジエントで溶離液Ｂ１００％から０％に変化させ(溶離液Ａ０％から１００％)、４５〜５０分溶離液Ａ１００％、５５〜５７分溶離液Ａ１００％から７０％に変化させ(溶離液Ｂ０％から３０％)、５７〜６７分溶離液Ａ７０％、溶離液Ｂ３０％で流した。

（実施例５）
実施例４のピーク１２由来の化合物について、参考例１と同様にＤＡＲＴ−ＭＳ解析を行い、当該化合物の分子量を求め、その結果を図１９に示した。図１９は、フラクション１−３のＤＡＲＴ−ＭＳスペクトルである。図１９に示した通り、フラクション１−３のＤＡＲＴ−ＭＳスペクトルは、化合物１８のＤＡＲＴ−ＭＳスペクトル（図１４参照）と比較すると、１マス少ない化合物であることが判明した。

（実施例６）
実施例４のピーク１２由来の化合物について、参考例１と同様に核磁気共鳴分光法によりフラクション１−３の各ＮＭＲスペクトルを測定し、その結果を図２０，２１に示した。なお、ＮＭＲ測定用重水素化溶媒として、重アセトニトリル（ＣＤ_３ＣＮ）を用いた。図２０は、フラクション１−３の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図２１は、フラクション１−３の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。図２１に示した通り、化合物１２は炭素数が１０であることが判明した。また、図２０に示した^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと併せて各スペクトルのピークの帰属を行った。

（実施例７）
実施例６の結果を踏まえて、実施例４のピーク１２由来の化合物について、参考例１と同様にＦＡＢ−ＨＲＭＳ解析行い、その結果を下記表７に示した。下記表７に示した通り、図１９〜図２１の結果を勘案すると、実施例４のピーク１２由来の化合物は、「Ｃ_１０Ｈ_１５Ｎ_２Ｏ_３」の分子式に合うことが明らかとなった。

次に、図１５のフラクション３の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び図１６のフラクション３の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルと、図２０のフラクション１−３の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び図２１のフラクション１−３の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルとを比較した。各スペクトルについて、下記表８，９に示した。下記表８，９に示した通り、両化合物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは非常によく似ており、化学構造の類似性を強く示すものであった。

以上のことから、化合物１２の構造式は、下記式（１）で示されるものであることが判明した。かかる構造の基本骨格は化合物１８（上記式（２）参照）と同一であるが、化合物１８の末端のカルボン酸がカルボン酸アミドに変換された構造を有していることが明らかとなった。

本発明のピロール系化合物を含んだバシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はバシディオマイセテスＸ抽出組成物は、天然由来のものであり、長期投与による副作用を懸念することがない安全性の高いものである。即ち、これらを老化防止、ＮＡＳＨの改善、ＮＡＳＨから肝硬変及び肝細胞癌への移行の予防等に用いる場合や、免疫賦活剤、アトピー性疾患組成物等として用いる場合には、薬剤だけではなく、例えば日常生活で使用可能なサプリメント等の食品や飲料に含有して長期間経口摂取させることが可能であり、その投与方法も安全かつ簡便なものである。従って、本発明のピロール系化合物は、上述の医薬や食品等の各分野において、極めて有用である。

バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ
ＢＰ−１００１１

微生物への言及
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター
寄託機関のあて名：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２０号室
寄託機関に寄託した日付：２００３年２月２７日
寄託機関が寄託について付した受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１００１１

Claims

下記式（１）で示されるピロール系化合物。