WO2010140409A1 - 4'-デメチルノビレチン又は4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する神経突起伸張剤、記憶改善剤、抗アルツハイマー剤、並びに、その製造方法 - Google Patents

4'-デメチルノビレチン又は4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する神経突起伸張剤、記憶改善剤、抗アルツハイマー剤、並びに、その製造方法 Download PDF

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demethylnobiletin
demethyltangeretin
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崇一 草野
弘司 田村
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富士産業株式会社
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    • C07D311/30—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 2 only not hydrogenated in the hetero ring, e.g. flavones

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 4′-demethylnobiletin or 4′-demethyltangeretin, wherein a fermented product is obtained by fermenting the peel of a specific type of citrus with a specific type of koji mold.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical (neurite elongation agent, memory improving agent, anti-Alzheimer agent) containing the compound as an active ingredient.
  • the polymethoxyflavonoids nobiletin and tangeretin are citrus-specific flavonoids, but in recent years, various physiological functions such as cancer prevention, anti-aging, and anti-arteriosclerosis have become known. In addition, it has been reported that nobiletin has an Alzheimer-improving action (see Non-Patent Document 1) and a neurite extension action (see Patent Document 1). On the other hand, all the studies on the physiological effects of nobiletin and tangeretin have been conducted on nobiletin and tangeretin itself (unchanged), but recently they were absorbed from the intestinal mucosa and then metabolized into several demethylated forms. It has been reported that demethylation occurs partly in all six methoxy groups (see Non-Patent Document 2).
  • polymethoxyflavonoids with hydroxyl groups present in citrus two types of polymethoxyflavonoids obtained from orange with 5- or 3'-positions are hydroxyl groups (5-hydroxy 3,6,7,8,3 ', 4'
  • iNOS and COX-2 mRNA expression was strongly suppressed, and apoptosis of breast cancer cells was induced.
  • polymethoxyflavonoids are clearly enhanced in physiological function by partial substitution of methoxy groups with hydroxyl groups, and are expected to be used as functional components of demethylpolymethoxyflavonoids.
  • the present invention solves the above-mentioned problems and produces demethylpolymethoxyflavonoids having excellent physiological activity by a method that is easy to obtain and process the raw materials and is highly safe in terms of oral intake. With the goal.
  • the present inventors tried various bioconversions using citrus peels containing a large amount of polymethoxyflavonoids, and as a result, some of them were demethylated by fermentation with a specific type of Aspergillus oryzae. It was found that polymethoxyflavonoids were produced.
  • the molecular structure of the 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin substituted with a hydroxyl group at the 4′-position has an excellent cancer prevention effect.
  • the present inventors have also found for the first time that each of 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin has a neurite outgrowth action. Furthermore, it was found that the activity was clearly stronger than the unchanged forms of nobiletin and tangeretin. They also found that they have an excellent memory-improving action.
  • the present invention has been made based on these findings. That is, the present invention according to claim 1 is directed to one or more pericarps selected from citrus belonging to the citrus belonging to the citrus genus citrus subfamily or the first citrus subfamily Daidai, or an aqueous extract thereof; Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus saitoi, Aspergillus saitoi and Aspergillus sperm us It is related with the manufacturing method of 4'- demethyl nobiletin characterized by making fermented with a koji mold
  • the present invention according to claim 2 is characterized in that one or more pericarps selected from citrus belonging to the citrus group of the citrus genus genus Citrus subfamily or the first citrus subfamily Daidai ward, or an aqueous extract thereof; Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus saitoi, Aspergillus saitoi and Aspergillus sperm us It is related with the manufacturing method of 4'-demethyl tangeretin characterized by fermenting with a koji mold
  • the present invention according to claim 3 also relates to a neurite elongation agent containing 4′-demethylnobiletin as an active ingredient.
  • the present invention according to claim 4 relates to a neurite elongation agent containing 4′-demethyltangeretin as an active ingredient.
  • the present invention according to claim 5 relates to a neurite elongation agent containing 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin as active ingredients.
  • the present invention according to claim 6 relates to a memory improving agent or anti-Alzheimer agent containing 4′-demethylnobiletin as an active ingredient.
  • the present invention according to claim 7 also relates to a memory improving agent or anti-Alzheimer agent containing 4′-demethyltangeretin as an active ingredient.
  • the present invention according to claim 8 relates to a memory improving agent or an anti-Alzheimer agent containing 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin as active ingredients.
  • 4′-demethylnobiletin and 4 ′ which are excellent functional components, are obtained by performing fermentation using a specific koji mold using a specific citrus as a raw material (a method in which the raw material is obtained and the process is extremely easy). It makes it possible to produce '-demethyltangeretin easily and in large quantities.
  • the present invention makes it possible to provide safe 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin derived from natural edible plants.
  • the present invention also provides functional foods and beverages and pharmaceuticals (cancer preventive agents, neurite outgrowth agents, memory improving agents, and the like containing 4'-demethylnobiletin or 4'-demethyltangeretin as an active ingredient, It is possible to provide an anti-Alzheimer agent.
  • Example 1 it is a figure which shows the result of having performed the HPLC analysis before and after the koji mold fermentation.
  • FIG. 4 is a diagram showing the molecular structure of 4′-demethylnobiletin that was revealed in Example 4.
  • FIG. 6 is a view showing the molecular structure of 4′-demethyltangeretin, which was revealed in Example 5.
  • Example 6 it is the photographic image figure which compared the neurite expansion
  • Example 9 it is the graph which compared the voluntary alternation action rate (index showing spatial working memory) when a test substance is administered to a mouse.
  • the present invention relates to a method for producing 4′-demethylnobiletin or 4′-demethyltangeretin, wherein a fermented product is obtained by fermenting the peel of a specific type of citrus with a specific type of koji mold.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical (neurite elongation agent, memory improving agent, anti-Alzheimer agent) containing the compound as an active ingredient.
  • the raw material that can be used in the present invention is citrus 'peel' containing polymethoxyflavonoids (specifically, nobiletin, tangeretin).
  • polymethoxyflavonoids specifically, nobiletin, tangeretin
  • fruits whole fruit including fruit skin, fruit juice, pulp, seeds, etc.
  • any varieties and strains can be used as long as they belong to the late citrus subfamily Mikan-ku or the first citrus subfamily Daidai-ku of Citrus (aka Citrus).
  • genital citrus subfamily Mikan or Daikan citrus subfamily Daidai is defined by Tanaka Chozaburo's classification (Tanaka T., Bull. Univ. Osaka Pref., Ser. B. 21, 139-145 (1969)).
  • the mandarin oranges include mandarin orange, ponkan, mandarin (aka Mediterranean mandarin), tangerine (aka dancy tangerine), mandarin orange, tachibana, kishu mandarin, shikwasha, shikakan, kobenimikan, keraji, etc. It is.
  • Daidai Ward includes sweet orange, Valencia orange, Iyo, Huguanatu, Shunkoukan and so on.
  • Pangkang, Sikhwasha, Tangerine, Tachibana, etc. in the mandarin orange are preferable from the viewpoint of the content of polymethoxyflavonoids and the effective use of waste.
  • the citrus as the raw material used in the present invention is preferably raw or harvested and collected, and washed with water. However, it can be used even if it is dried, frozen, or stored for a long time. Further, in the present invention, the citrus as the raw material may be used as it is, but the citrus as the raw material may be cut, crushed, or crushed. desirable.
  • the process includes a wide range of actions, such as chopping citrus as the raw material into large pieces, chopping into small pieces, crushing, crushing, powdering, etc. . Preferably, it can be carried out by making a large chopped state of about 1 to several centimeters.
  • an extract extract, dry product obtained by previously extracting (especially water extraction) polymethoxyflavonoids from these raw materials, or a product isolated as pure polymethoxyflavonoids.
  • the solvent is added in an amount of 1 to 50 times (weight ratio), preferably 2 to 15 times, and the temperature condition of 0 ° C. to the boiling point of the solvent, preferably Can be extracted by dipping or shaking at room temperature to a temperature below the boiling point of the solvent for 5 minutes to 1 month, preferably 20 minutes to 1 week.
  • the extract (extract) obtained after the extraction can be used as it is for the koji mold fermentation described later, but it is desirable to remove solids (fruit peel residue, etc.) by filtration or centrifugation. It should be noted that the extraction efficiency can be increased by adding the solvent again to the removed solid and performing extraction a plurality of times.
  • the extract (extract) thus obtained can be dried to obtain a dried product (freeze drying, evaporator, etc.).
  • the present invention includes a step of obtaining a fermented product by performing koji mold fermentation using the fermentation raw material (fruit peel or water extract from the peel) prepared as described above as a substrate.
  • the fermentation raw material fruit peel or water extract from the peel
  • Aspergillus oryzae that ferment the raw material include Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus saito, Aspergillus saito -Usami (Aspergillus usamii) can be used. Moreover, you may mix and use these. Preferably, among Aspergillus oryzae, aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, 4'-demethylnoviretin and 4'-demethyltangeretin are high. It can be obtained by content.
  • the spores of the koji mold can be directly sprinkled on the fermentation raw material to adhere.
  • the microorganism fermentation conditions for inoculating the koji mold with the fermentation raw material are preferably aerobic conditions, and therefore, for example, a bottomed cylindrical bottom having a wide and shallow depth is suitable. It is advisable to spread the fermentation raw material uniformly on the bottom of such a container so that the contact area with air becomes large.
  • the fermentation raw material is a liquid, it is desirable to perform processing such as aeration and stirring.
  • the fermentation temperature is preferably 10 to 40 ° C., more preferably 20 to 40 ° C., and further preferably 25 to 32 ° C. as conditions suitable for the growth of the koji mold. In addition, it is preferable to ferment in the dark as a suitable condition for the growth of the koji mold.
  • the fermentation raw material is not liquid, it is preferable that the raw material contains a sufficient amount of water (for example, a water content of 25% or more).
  • the fermentation period for microbial fermentation for obtaining large amounts of 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin is preferably 2 to 21 days, more preferably 3 to 14 days, and even more preferably 4 to 12 days. It is.
  • polymethoxyflavonoid is demethylated and converted to demethylpolymethoxyflavonoid by an enzyme secreted from koji mold. Therefore, instead of performing koji mold fermentation, solution extraction is performed from the koji mold or a fermented material obtained after fermentation to obtain an enzyme solution containing an enzyme that demethylates polymethoxyflavonoid, and the enzyme reaction with the raw material is performed using the enzyme. It is also possible to obtain demethylpolymethoxyflavonoid by carrying out and obtaining a reaction material. Specifically, an enzyme reaction can be carried out by collecting a water lysate from the fermented product after the koji mold fermentation and using it as a crude enzyme solution.
  • 4′-demethylnobiletin is about 0.5 to 1.5% by mass (specifically, about 1% by mass) of 4′-demethyltangeretin per dry weight by fermenting the citrus raw material with koji mold.
  • the fermented koji mold obtained here is used as it is, or processed (eg, shredded, crushed, pulverized, dried, etc.) and used as a raw material for drugs and functional foods. It is also possible.
  • Solution extraction In view of purity, it is desirable to obtain an extract by performing solution extraction from the fermented material obtained after the koji mold fermentation.
  • the solution extraction step can be performed directly on the koji mold fermented product, but is obtained after the koji mold fermented product is further processed into any one of fragmentation, crushing, crushing, and powdering. It is desirable to do it for things.
  • water, a buffer solution, an organic solvent, or a water-containing solvent thereof can be used.
  • the organic solvent include lower aliphatic alcohols such as ethanol, methanol, isopropanol, and butanol, acetone, ethyl acetate, and chloroform.
  • water, ethanol or water-containing ethanol is particularly preferable in terms of extraction efficiency, ease of handling, and safety.
  • ethanol having a final concentration of 55% or higher, preferably a final concentration of 60% or higher, and more preferably 80% or higher, elution of polysaccharides as impurities can be suppressed.
  • the solvent is added in an amount of 1 to 50 times (weight ratio), preferably 2 to 15 times the raw material (preferably a fragmented product), and a temperature condition of 0 ° C. to the boiling point of the solvent, Extraction is possible by immersion or shaking, preferably at room temperature to a temperature below the boiling point of the solvent, for 5 minutes to 1 month, preferably 20 minutes to 1 week.
  • the obtained extract can be made into a concentrated dry product by drying using freeze drying or an evaporator. Further, the solution extraction step can be performed a plurality of times with a plurality of different solvents. In particular, when the first extraction is performed with water or a low-concentration hydrous alcohol, the extraction efficiency of demethylpolymethoxyflavonoid can be improved by performing extraction with ethanol at a specific concentration or higher. . And the extract (the said extract and concentrated dry solid) obtained by the above can be used as the raw material of a chemical
  • purification Moreover, purity can be further improved by performing a purification process on these.
  • high purity can be achieved by liquid-liquid separation extraction or column purification using silica gel, chemically modified silica gel, activated carbon, synthetic adsorption resin carrier or the like.
  • purification conditions for purifying demethylpolymethoxyflavonoid will be exemplified.
  • a porous synthetic adsorption resin specifically, Diaion HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) obtained by equilibrating the ethanol-removed liquid of the extract (specifically, the extract obtained through ethanol extraction) with water.
  • a highly purified demethylpolymethoxyflavonoid-containing composition can be obtained by recovering components eluted with 44 to 46% ethanol (specifically, 45% ethanol).
  • a composition containing a high content of demethylpolymethoxyflavonoid having a purity of 80% or more can be obtained by performing extraction and purification under the preferred conditions described above.
  • the demethylpolymethoxyflavonoid-containing composition obtained as described above was further subjected to ODS column chromatography (specifically, 45% methanol elution), thin layer chromatography (TLC) [specifically, hexane / ethanol. (7: 3)], and subjected to ODS-HPLC (specifically, 37% (V / V) acetonitrile / water mixed solvent) and collecting the target peak to obtain each demethylpolymethoxyflavonoid pure product Can be isolated.
  • ODS column chromatography specifically, 45% methanol elution
  • TLC thin layer chromatography
  • ODS-HPLC specifically, 37% (V / V) acetonitrile / water mixed solvent
  • the demethylpolymethoxyflavonoids obtained by the above are “4′-demethylnobiletin” (see the following chemical formula 1) and “4′-demethyltangeretin” (see the following chemical formula 2). These are monodemethyl bodies of nobiletin and tangeretin demethylated at the 4 ′ position. These become highly polar due to demethylation, and are superior in solubility in alcohol and water as compared with each unchanged form.
  • the 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin obtained as described above have an excellent “neurite outgrowth action” compared to these unchanged forms (nobiletin, tangeretin). Further, clinically, it has excellent “memory improvement action” and “anti-Alzheimer action”, and has effective treatment, improvement and prevention action for dementia and Alzheimer's disease. In addition, an effective improvement / prevention action can be achieved for the forgetting or forgetting of a healthy person. In addition to these, it is expected that an effective treatment / improvement / prevention action is expected for neurological diseases that are expected to be improved by the neurite outgrowth action.
  • 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin have an excellent “cancer preventive action” compared to these unchanged forms (nobiletin and tangeretin).
  • 4′-demethylnobiletin has a very strong activity (see Li S. et al .: Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007, 17: 5177).
  • the “cancer preventive action” is to suppress synthesis of nitric oxide (NO), inducible nitric oxide synthase (iNOS), and cyclooxygenase-2 (COX-2); Induction of apoptosis of breast cancer cells; prevents the development of cancer.
  • These compounds are demethylpolymethoxyflavonoids, which are demethylated polymethoxyflavonoids, so they are highly polar and are more soluble in water than unchanged polymethoxyflavonoids. is there. Therefore, when polymethoxyflavonoid is used, application to a form that is considered difficult to apply is also possible.
  • these compounds may be used so that only each compound may be included, and you may use it so that both compounds may be included.
  • the effective intake of 4'-demethylnobiletin and 4'-demethyltangeretin is 1 mg or more, preferably 10 mg or more per day for an adult with a body weight of 60 kg. Actions (particularly, neurite outgrowth action, memory improvement action, anti-Alzheimer action) can be obtained. Therefore, it is expected that the above-mentioned pharmacological action can be obtained by ingesting 4′-demethylnobiletin or 4′-demethyltangeretin in a form or ingestion method (number of times, amount) that can ensure this necessary amount. . However, it is desirable to determine appropriately depending on the age, weight, symptoms, intake schedule, formulation form, etc. of the subject.
  • the content to be contained in the drug or functional food or drink may be anything that can be contained so as to ensure the necessary intake, but specifically, 0.1% by mass or more, preferably 0.5% by mass More preferably, it can be contained so as to be 3% by mass or more. Moreover, as an upper limit, 50 mass% or less can be mentioned.
  • the form of the “drug” can be, for example, powder, fine granule, granule, etc.
  • it is mixed with the form of the solution dispersed in water, the excipient, etc. It can also be made into the form of the tablet obtained.
  • a 'functional food or drink' it is mixed with various food ingredients and used, for example, added to biscuits, snacks, gums, chewable tablets, soft drinks, drinks, soups, jellies, candy, etc. May be.
  • 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin obtained as described above are recognized to be effective for mammals in general. Therefore, you may use it in the form suitable for the chemical
  • Example 1 Aspergillus awamori fermentation of Ponkan peel Poncan peel was used as a fermentation raw material.
  • Ponkan pericarp 500 g was chopped into small pieces, spread in a wide bottom container (bottomed cylindrical container) sterilized by autoclaving to improve air permeability, and a small amount of water was added and heated for 30 minutes.
  • Aspergillus awamori (manufactured by Bioc Co., Ltd.) was inoculated to the Ponkan peel obtained in this manner so as to spread throughout.
  • the microbial fermentation process Keroji mold fermentation
  • was performed aerobically for 10 days in the dark room in a 30 degreeC thermostat and the koji mold fermented material was obtained.
  • HPLC analysis was performed about these fermented materials. The results are shown in FIG.
  • FIG. 1 the result analyzed about the Ponkan peel before fermentation is shown to FIG. 1A, and the result analyzed about the fermented material obtained after the koji mold fermentation is shown to FIG. 1B.
  • Example 2 Preparation of demethylpolymethoxyflavonoid-rich composition 1 kg of the koji mold fermented product obtained in Example 1 above was crushed and crushed, and 5 L of ethanol was added and extracted at room temperature for 3 days. Obtained. Next, the obtained extract was filtered with a filter paper filter, and the filtrate was concentrated with a rotary evaporator to 1 L. Then, 5 L of water was added to obtain an aqueous solution. The resulting solution was applied to Diaion HP20 (porous synthetic adsorption resin column) equilibrated with water in advance, and after removing non-adsorbed components with 3 L of water, the components eluted with 2 L of 40% ethanol were further removed. . Next, a component eluting with 2 L of 45% ethanol was obtained. And the obtained elution component was concentrated and dried with the evaporator, and the composition which contains the said polymethoxyflavonoid converter 1 and 2) highly was obtained.
  • Example 3 Isolation and purification of demethylpolymethoxyflavonoid 2 g of the composition obtained in Example 2 above was dissolved in 20% methanol and ODS column chromatography (Wako Gel 50C18 was applied to a column with an inner diameter of 20 mm ⁇ and a length of 30 cm). 30 g packed). The component eluting with 40% methanol was removed to obtain the component eluting with 60% methanol. Subsequently, the obtained components were subjected to preparative TLC chromatography (silica gel 70PF 254 plate Wako, film thickness 0.75 mm, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) under the conditions of developing solvent hexane / ethanol 7: 3, and each converter was contained.
  • Table 1 shows a comparison result of the A ring carbon signal (ppm) between the polymethoxyflavonoid converter 1 and tangeretin.
  • the measurement results for 1 H and 13 C are shown in Table 2.
  • Table 2 also summarizes the chemical shift (CDCl 3 ) results of the polymethoxyflavonoid converter 1.
  • ⁇ H the symbol to the right of ⁇ H (ppm) represents the signal splitting pattern, “s” for singlet, “d” for doublet, “dd” for double doublet, and “m” for multiplet.
  • 1 H-NMR of de nobiletin (in deuterated chloroform-deuterated methanol) and 1 H-NMR of the transformant 1 were compared, six singlet signals considered to be methoxy were observed with nobiletin. The same 5 were observed in the demethylnobiletin. From these facts, the converter 1 was considered to be 'demethylnobiletin' in which one site was demethylated from the structure of nobiletin, and was assumed to have the molecular formula C 20 H 20 O 8 .
  • Example 3 From the above, it was revealed that the transformant 1 isolated in Example 3 was “4′-demethylnobiletin”.
  • Table 2 The results shown in Table 2 were compiled for 1 H and 13 C.
  • FIG. 2 shows a summary of molecular structural formulas and 1 H- 1 HCOSY and HMBC signals obtained comprehensively from the above analysis results.
  • Table 3 shows a comparison result of the A ring carbon signal (ppm) between the polymethoxyflavonoid converter 2 and tangeretin.
  • Table 4 shows the measurement results for 1 H and 13 C.
  • Table 4 also summarizes the results of chemical shift (CDCl 3 ) of the polymethoxyflavonoid converter 2.
  • ⁇ H the symbol to the right of ⁇ H (ppm) represents the signal splitting pattern, “s” for singlet, “d” for doublet, “dd” for double doublet, and “m” for multiplet.
  • 1 H-NMR of tangeretin (in heavy DMSO) and 1 H-NMR of the transformant 2 were compared, five singlet signals considered to be methoxy were observed with tangeretin, whereas the demethylated The same four were observed in tangeretin. From these facts, the converter 2 was considered to be “demethyltangeretin” in which one portion was demethylated from the structure of tangeretin, and was assumed to have the molecular formula C 19 H 18 O 7 .
  • Example 3 From the above, it was revealed that the transformant 2 isolated in Example 3 was “4′-demethyltangeretin”.
  • Table 4 The results shown in Table 4 were summarized for 1 H and 13 C.
  • FIG. 3 shows a summary of molecular structural formulas and 1 H- 1 HCOSY and HMBC signals obtained comprehensively from the above analysis results.
  • Example 6 Examination of neurite outgrowth action 4'-demethylnobiletin isolate which is the converter 1 obtained in Example 3 and 4'-demethyltangeretin isolate which is the converter 2 were obtained. Used to examine the neurite outgrowth effect.
  • Neuro2a was used as a nerve cell. First, Neuro2a cells were cultured in a DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) in a 5% CO 2 , 37 ° C. incubator. Subculture was performed every 3 days. Then, the cells were seeded on a 24-well cell culture plate using DMEM medium containing 5% FBS so as to be 2 ⁇ 10 4 / hole. Three hours after the passage, various specimens were added to 20 ⁇ M.
  • FBS fetal bovine serum
  • FIG. 4 shows a photographic image diagram comparing the neurite outgrowth effect exerted by various specimens in the culture medium.
  • Example 7 Aspergillus kawachi fermentation of Ponkan peel Aspergillus oryzae (as manufactured by Bioc Co., Ltd.) was used as the gonococcus as in Example 1, except that the fermentation period was 4 Day) to obtain a koji mold fermented product. And when HPLC analysis was performed on the obtained fermented product, nobiletin and tangeretin that existed before fermentation disappeared completely, and after fermentation, 4'-demethylnobiletin and 4'-demethyltangeretin The peak of the converter was shown.
  • Example 8 Fermentation of Aspergillus oryzae on Ponkan peel Aspergillus oryzae (manufactured by Bioc Co., Ltd.) as an Aspergillus oryzae fermentation (fermentation period 10 days) in the same manner as in Example 1
  • Fermentation period 10 days Fermentation period 10 days
  • Example 9 Examination of memory improving action (1) Preparation of test substance First, a demethylpolymethoxyflavonoid-rich composition was prepared in the same manner as in Example 2. 2 g of this composition was dissolved in 20% methanol and subjected to ODS column chromatography (inner diameter 20 mm ⁇ , 30 cm length packed with 30 g of Wako Gel 50C18) to remove the components eluted with 40% methanol. By eluting with% methanol, 250 mg of a mixture of 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin was obtained. Using this mixture, the effect on memory improvement was examined.
  • the mouse was placed at the tip of A, and the Y-maze was freely searched for 8 minutes, and the arm to which the mouse moved was recorded in order.
  • Count the number of movements to each arm total arm entries “total arm entries”) and the number of consecutively selected three different arms (number of replacement actions), and the number of replacement actions ⁇ (total arm selection number –2 )
  • ⁇ 100 alternation behavior (alternation behavior (%)), which was used as an index of spontaneous alternation behavior.
  • a Y-shaped maze test was performed at the start of the test, and divided into two groups (the test substance administration group and the control group) so that the alternation behavior rate was equivalent.
  • the test substance administration group 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin (suspended in a physiological saline containing 0.5% Tween 20) obtained above were added at 30 mg / kg body weight / Repeated oral administration at a daily rate.
  • physiological saline containing 0.5% Tween 20 was orally administered repeatedly.
  • 4′-demethylnobiletin and 4′-demethyltangeretin which are extremely useful functional components, can be easily and mass-produced using highly safe raw materials and methods. Therefore, the present invention is expected to be used in the food and beverage / pharmaceutical field.
  • the proportion of blurring and memory impairment is increasing with the aging of the population, and a great demand is expected in the modern society where the cause of death due to cancer is large.

Abstract

　本発明は、優れた生理活性作用を有するデメチルポリメトキシフラボノイドを有効成分として含有する医薬品を、原料の入手や工程が容易であり且つ経口摂取の面での安全性の高い方法で、製造することを目的とする。　また本発明は、カンキツ属後生カンキツ亜族のミカン区または初生カンキツ亜族のダイダイ区に属するカンキツ類から選ばれる１以上の果皮、もしくは、その水抽出物を、；アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・サイトイおよびアスペルギルス・ウサミから選ばれる１以上の麹菌で発酵させて発酵物を得ることを特徴とする、4'-デメチルノビレチン又は4'-デメチルタンゲレチンの製造方法を提供する。また、前記化合物を有効成分として含有する神経突起伸張剤、記憶改善剤、抗アルツハイマー剤、を提供する。

Description

[規則91に基づく訂正 12.04.2010]　4'-デメチルノビレチン又は4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する神経突起伸長剤、記憶改善剤、抗アルツハイマー剤、並びに、その製造方法
[規則91に基づく訂正 12.04.2010]　
　本発明は、特定種類のカンキツ類の果皮を、特定種類の麹菌で発酵させて発酵物を得ることを特徴とする、4'-デメチルノビレチン又は4'-デメチルタンゲレチンの製造方法に関する。また、本発明は、前記化合物を有効成分として含有する医薬品（神経突起伸長剤、記憶改善剤、抗アルツハイマー剤）に関する。
　ポリメトキシフラボノイドであるノビレチン、タンゲレチンは、カンキツ特有のフラボノイドであるが、近年、がん予防、老化抑制、抗動脈硬化作用等さまざまな生理作用が知られるようになってきた。また、ノビレチンには、アルツハイマー改善作用（非特許文献１参照）、神経突起伸長作用（特許文献１参照）のあることが報告されている。
　一方、これらノビレチン、タンゲレチンの生理作用に関する研究はすべてノビレチン、タンゲレチンそのもの（未変化体）について実施されてきたが、最近、腸管粘膜から吸収されたのち、いくつかの脱メチル体へと代謝され、全部で６個のメトキシ基に一部、脱メチル化が起こることが報告されている（非特許文献２参照）。
　ノビレチンのがん抑制作用について研究した例では、炎症や発がんを促進する一酸化窒素（NO）や誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)、シクロオキシゲナーゼー２（COX-2）の合成を抑えてがんの発生を予防する強さは、ノビレチンそのものより、３種の脱メチル化されたデメチルノビレチン（3'-デメチルノビレチン、4'-デメチルノビレチン、3',4'-ジデメチルノビレチン）の方が圧倒的に上回ることをこれら合成した脱メチル体で明らかにされた。中でも4'-デメチルノビレチンは強い活性を有している（非特許文献３参照）。
　カンキツに存在する水酸基を有するポリメトキシフラボノイドとして、オレンジから得られた5位あるいは3'位が水酸基である２種のポリメトキシフラボノイド（5-ヒドロキシ3,6,7,8,3',4'ヘキサメトキシフラボン、3'-ヒドロキシ5,6,7トリメトキシフラボン）の生理作用に関する研究においてもiNOS、COX-2のｍＲＮＡの発現を強く抑制し、また、乳がん細胞のアポトーシスを誘発した。
　いずれにしてもポリメトキシフラボノイドではメトキシ基が一部水酸基に置換されることによって生理機能が明らかに強まることが示され、デメチルポリメトキシフラボノイドの機能性成分としての利用が期待されている。
　しかしながら、現在知られている天然物に存在するこのような一部が水酸基に置換されたポリメトキシフラボノイドの含有量は非常に低く、これらを原料として当該成分を抽出して利用することは現実的ではない。
特開２００２－６０３４０号公報
J Pharmacol Exp Ther. 2008 , 326:739 Koga N. et al.:Biol.Pharm.Bull.,2007,30:2317 Li S. et al.: Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007,17:5177
　本発明は、上記課題を解決し、優れた生理活性作用を有するデメチルポリメトキシフラボノイドを、原料の入手や工程が容易であり且つ経口摂取の面での安全性の高い方法で、製造することを目的とする。
　本発明者らはこのような状況を鑑み、ポリメトキシフラボノイドを多く含有するカンキツ類の果皮を用いて種々の生物変換を試みた結果、特定種類の麹菌で発酵することにより、一部がデメチル化されたポリメトキシフラボノイドが生成されることを見出した。そして、その分子構造は、優れたがん予防作用を有する、4'位が水酸基に置換された4'-デメチルノビレチンおよび4'-デメチルタンゲレチンであることを明らかにした。
　また、本発明者らは、4'-デメチルノビレチンと4'-デメチルタンゲレチンのそれぞれが、神経突起伸長作用を有することを初めて見出した。そしてさらに、未変化体のノビレチンとタンゲレチンに比べ、明らかに活性が強くなっていること見出した。また、これらが、優れた記憶改善作用を有することも見出した。
[規則91に基づく訂正 12.04.2010]　
　本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
　即ち、請求項１に係る本発明は、カンキツ属後生カンキツ亜族のミカン区または初生カンキツ亜族のダイダイ区に属するカンキツ類から選ばれる１以上の果皮、もしくは、その水抽出物を、；アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）およびアスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii)から選ばれる１以上の麹菌で発酵させて発酵物を得ることを特徴とする、4'-デメチルノビレチンの製造方法に関する。
　また、請求項２に係る本発明は、カンキツ属後生カンキツ亜族のミカン区または初生カンキツ亜族のダイダイ区に属するカンキツ類から選ばれる１以上の果皮、もしくは、その水抽出物を、；アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）およびアスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii)から選ばれる１以上の麹菌で発酵させて発酵物を得ることを特徴とする、4'-デメチルタンゲレチンの製造方法に関する。
　また、請求項３に係る本発明は、4'-デメチルノビレチンを有効成分として含有する神経突起伸長剤に関する。
　また、請求項４に係る本発明は、4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する神経突起伸長剤に関する。
　また、請求項５に係る本発明は、4'-デメチルノビレチン及び4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する神経突起伸長剤に関する。
　また、請求項６に係る本発明は、4'-デメチルノビレチンを有効成分として含有する記憶改善剤または抗アルツハイマー剤に関する。
　また、請求項７に係る本発明は、4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する記憶改善剤または抗アルツハイマー剤に関する。
　また、請求項８に係る本発明は、4'-デメチルノビレチン及び4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する記憶改善剤または抗アルツハイマー剤に関する。
[規則91に基づく訂正 12.04.2010]　
　本発明は、特定のカンキツ類を原料として特定の麹菌を用いて発酵を行うことで（原料の入手や工程が極めて容易な方法で）、優れた機能性成分である4'-デメチルノビレチンと4'-デメチルタンゲレチンを、容易に且つ大量に製造することを可能とする。
　また、本発明は、天然の食用植物由来の安全な4'-デメチルノビレチン、4'-デメチルタンゲレチンを提供することを可能とする。
　また、本発明は、前記4'-デメチルノビレチン又は4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有してなる機能性飲食品や医薬品（がん予防剤、神経突起伸長剤、記憶改善剤、抗アルツハイマー剤）を提供することを可能とする。
実施例１において、麹菌発酵前後におけるＨＰＬＣ分析を行った結果を示す図である。 実施例４において明らかになった4'-デメチルノビレチンの分子構造を示す図である。 実施例５において明らかになった4'-デメチルタンゲレチンの分子構造を示す図である。 実施例６において、各種被検物の神経突起伸長作用を比較した写真像図である。 実施例９において、被検物をマウスに投与したときの自発的交替行動率（空間作業記憶を表す指標）を比較したグラフである。
[規則91に基づく訂正 12.04.2010]　
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明は、特定種類のカンキツ類の果皮を、特定種類の麹菌で発酵させて発酵物を得ることを特徴とする、4'-デメチルノビレチン又は4'-デメチルタンゲレチンの製造方法に関する。また、本発明は、前記化合物を有効成分として含有する医薬品（神経突起伸長剤、記憶改善剤、抗アルツハイマー剤）に関する。
〔原料〕
　本発明に用いることができる原料は、ポリメトキシフラボノイド（具体的には、ノビレチン、タンゲレチン）を含有するカンキツ類の‘果皮’である。なお、果実（果皮、果汁、果肉、種子などを含む果実全体）を用いることもできるが、ポリメトキシフラボノイドの含有率、廃棄物の有効利用の観点から、果皮のみを用いることが望ましい。
　なお、原料としては、カンキツ類の植物体の他の部分（例えば、葉、芽、茎、花、など）を含むものを用いてもよいが、ポリメトキシフラボノイドの含有率の点でこれらを含まないものであることが望ましい。
　カンキツ類の種類としては、カンキツ属（Citrus、別名：ミカン属）の後生カンキツ亜族ミカン区または初生カンキツ亜族ダイダイ区に属するカンキツ類であれば、如何なる品種、系統のものも用いることもできる。
　ここで後生カンキツ亜族ミカン区または初生カンキツ亜族ダイダイ区とは、田中長三郎の分類（Tanaka T., Bull. Univ. Osaka Pref., Ser. B. 21, 139-145(1969)）によって定義される分類群であり、ミカン区として温州ミカン、ポンカン、マンダリン（別名：地中海マンダリン）、タンジェリン（別名：ダンシータンジェリン）、地ミカン、タチバナ、紀州ミカン、シークワシャー、シカイカン、コベニミカン、ケラジなどが含まれる。
また、ダイダイ区としてはスィートオレンジ、バレンシアオレンジ、イヨ、ヒューガナツ、シュンコウカンなどが含まれる。
　特に、ミカン区のポンカン、シークワシャー、タンジェリン、タチバナなどは、ポリメトキシフラボノイドの含有率、廃棄物の有効利用の観点から好適である。
　本発明に用いる原料であるカンキツ類は、好ましくは、収穫・採取した生のもの、水洗いしたもの、を用いることが望ましいが、乾燥、凍結、長期保存したものなどであっても用いることができる。
　また、本発明では、前記原料であるカンキツ類を、そのままの形態で用いてもよいが、前記原料であるカンキツ類を刻むか、砕片化するか、擂潰するかのいずれかの処理を行うことが望ましい。
　当該工程は、前記原料であるカンキツ類を、いくつかの破片に大きめに刻むこと、細かい小片に細断すること、破砕すること、擂り潰すこと、粉末状にすること、等、幅広い行為を含むものである。好ましくは、1～数ｃｍ程度に大きめに刻んだ状態にすることによって、行うことができる。
　またさらには、これら原料から、予めポリメトキシフラボノイドを抽出（特に水抽出）して得た抽出物（エキス、乾燥物）や、純品のポリメトキシフラボノイドとして単離したものを用いることもできる。
　なお、水抽出物の条件としては、前記果皮に対して、前記溶媒を、1～50倍量（重量比）、好ましくは2～15倍量加え、0℃～溶媒の沸点の温度条件、好ましくは室温～溶媒の沸点以下の温度で、5分～1ヶ月、好ましくは20分～1週間の、浸漬もしくは振盪することにより、抽出することが可能である。
　また、特には、高温での水抽出（熱水抽出）を行うことが望ましい。具体的には、90℃以上（好ましくは沸騰状態）で、数分～数時間程度（例えば5分～5時間）抽出を行うことが望ましい。
　抽出後に得られた抽出液（エキス）は、そのまま後記の麹菌発酵に用いることができるが、濾過や遠心分離などを行って固形物（果皮の残渣等）を除去することが望ましい。
　なお、除去した固形物に対して、再度溶媒を加えて、複数回の抽出を行うことで、抽出効率を上げることもできる。
　このようにして得られた抽出液（エキス）は、乾燥処理（凍結乾燥やエバポレーター等）を行って、乾燥物とすることができる。
〔麹菌発酵〕
　本発明は、上記のようにして調製した発酵原料（果皮、もしくは、果皮からの水抽出物）を基質として麹菌発酵を行い、発酵物を得る工程を含むものである。
　なお、上記発酵原料は、麹菌発酵を行う前に、加熱処理を行って、原料中の雑菌を殺菌しておくことが好ましい。
　前記原料を発酵させる麹菌としては、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii)、を用いることができる。また、これらを混合させて用いてもよい。
　前記麹菌のうち好ましくは、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、を用いると4'-デメチルノビレチンおよび4'-デメチルタンゲレチンを高い含有率で得ることができる。
　発酵原料へ前記麹菌を接種する方法としては、麹菌の胞子を発酵原料に直接振りかけて付着させることができる。また、予め前記麹菌を液体培養により予備発酵した培地を、発酵原料全体に行き渡るように接種してもよい。
　前記麹菌を発酵原料に接種する場合の微生物発酵条件としては、好気的条件で行うことが望ましいことから、例えば有底円筒状の底部が広く深さが浅い容器が好適である。
　このような容器の底部に、発酵原料を万遍なく広げ、空気との接触面積が大きくなるようにするとよい。
　また、発酵原料が液体である場合には、通気、攪拌などの処理をすることが望ましい。
　発酵温度としては、前記麹菌の生育に好適な条件として、好ましくは10～40℃、より好ましくは20～40℃、さらに好ましくは25～32℃で行われる。加えて、前記麹菌の生育に好適な条件として、暗所で発酵させるのが好ましい。また、発酵原料が液体でない場合は、原料中に十分な水分が含まれている状態（例えば水分含量25％以上）であることが好ましい。
4'-デメチルノビレチンおよび4'-デメチルタンゲレチンを多量に得るための微生物発酵の発酵期間としては、好ましくは2～21日、より好ましくは3～14日、さらに好ましくは4～12日である。
　この発酵期間が2日未満の場合には、前記麹菌による微生物発酵がほとんど進行していないことから十分な4'-デメチルノビレチンおよび4'-デメチルタンゲレチンが得られない。また、逆に21日を超える場合には、微生物変換により生成された4'-デメチルノビレチンおよび4'-デメチルタンゲレチンの分解が進み、またカンキツ由来の好ましい芳香が消失する。
　また、本発明における当該麹菌発酵においては、麹菌から分泌される酵素によって、ポリメトキシフラボノイドがデメチル化され、デメチルポリメトキシフラボノイドへと変換させるものである。
　従って、麹菌発酵を行う代わりに、当該麹菌もしくは発酵後に得られる発酵物から溶液抽出を行ってポリメトキシフラボノイドをデメチル化する酵素を含む酵素液を得、当該酵素を用いて前記原料と酵素反応を行って反応物を得ることで、デメチルポリメトキシフラボノイドを得ることも可能である。
　具体的には、当該麹菌発酵後の発酵物からの水溶解物を回収し、粗酵素液として用いることで、酵素反応を行うことができる。
　本発明の麹菌発酵を行うことによって、前記カンキツ原料に含有されるポリメトキシフラボノイドであるノビレチン、タンゲレチンは、すべて4'-デメチルノビレチンおよび4'-デメチルタンゲレチンに変換される。
　具体的には、前記カンキツ原料を麹菌発酵することによって、4'-デメチルノビレチンが乾燥重量あたり約0.5～1.5質量％（具体的には、約１質量％）、4'-デメチルタンゲレチンが乾燥重量あたり0.25～0.75質量％（具体的には、約0.5質量％）という、高い含有率の麹菌発酵物を得ることができる。
　従って、ここで得られた麹菌発酵物を、得られたそのままの形態で、もしくは、加工（例えば、細片化、擂潰、粉末化、乾燥、など）して、薬剤や機能性食品の原料とすることも可能である。
〔溶液抽出〕
　なお、純度の点を鑑みると、前記麹菌発酵の後に得られる発酵物から溶液抽出を行って、抽出物を得ることが望ましい。
　当該溶液抽出工程は、前記麹菌発酵物に対して直接行うこともできるが、前記麹菌発酵物について、さらに細片化、破砕、擂潰、粉末化等のいずれかの処理を行った後に得られたものに対して行うことが望ましい。
　溶液抽出工程に用いる溶媒は、水、緩衝液、有機溶媒、またはそれらの含水溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノールのような低級脂肪族アルコールや、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム等が挙げられる。
　これらの溶媒の中でも、水、エタノールあるいは含水エタノールが抽出効率や取り扱いやすさ、安全性の面で特に好ましい。
　また、特には、終濃度55％以上、好ましくは終濃度60％以上、さらに好ましくは終濃度80％以上のエタノールを用いて抽出を行うことで、不純物である多糖類の溶出を抑制でき、デメチルポリメトキシフラボノイドの抽出効率を向上できるため好ましい。
　抽出条件としては、前記原料（好ましくは砕片化物）に対して、前記溶媒を、1～50倍量（重量比）、好ましくは2～15倍量加え、0℃～溶媒の沸点の温度条件、好ましくは室温～溶媒の沸点以下の温度で、5分～1ヶ月、好ましくは20分～1週間の、浸漬もしくは振盪することにより、抽出することが可能である。
　得られた抽出液は、凍結乾燥やエバポレーター等を用いて乾燥させることで、濃縮乾固物とすることができる。
　また、溶液抽出工程は、異なる複数の溶媒で、複数回行うこともできる。特に、一度目の抽出を水や低濃度の含水アルコールで行った場合、次に前記特定濃度以上のエタノールを用いた抽出を行うことで、デメチルポリメトキシフラボノイドの抽出効率を向上させることができる。
　そして、上記により得られた抽出物（前記抽出液や濃縮乾固物）は、薬剤や機能性食品の原料とすることができる。
〔精製〕
　また、これらに対して、精製工程を行うことによって、純度をさらに高めることができる。
　精製工程としては、液－液分離抽出や、シリカゲル、化学修飾シリカゲル、活性炭、合成吸着樹脂担体等によるカラム精製により、高純度化を行うことができる。
　例として、デメチルポリメトキシフラボノイドを高純度化するための精製条件を例示する。
　まず、抽出液（具体的にはエタノール抽出を経た抽出液）のエタノール除去液を、水で平衡化した多孔性合成吸着樹脂（具体的には、ダイヤイオンHP-20〔三菱化学社製〕）のカラムに供する。そして、水溶出する成分を除去した後、さらに39～41％エタノール（具体的には40％エタノール）で溶出される液を除去する。次に、44～46％エタノール（具体的には45％エタノール）で溶出される成分を回収することにより高純度化したデメチルポリメトキシフラボノイド含有組成物を得ることができる。
　なお、上記に記載した好適な条件で抽出および精製を行うことにより、純度80％以上のデメチルポリメトキシフラボノイドを高含有する組成物を得ることができる。
　また、上記のように得られたデメチルポリメトキシフラボノイド含有組成物は、さらにＯＤＳカラムクロマトグラフィー（具体的には45％メタノール溶出）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）〔具体的にはヘキサン／エタノール（7：3）〕、ＯＤＳ－ＨＰＬＣ（具体的には37％（V/V）アセトニトリル・水の混合溶媒）に供し、目的ピークを採取することで、デメチルポリメトキシフラボノイドの純品を各々単離することができる。
　上記により得られるデメチルポリメトキシフラボノイドは、具体的には、「4'-デメチルノビレチン」（下記化学式１参照）と「4'-デメチルタンゲレチン」（下記化学式２参照）である。
　これらは、4'位が脱メチル化したノビレチン、タンゲレチンのモノデメチル体である。これらは脱メチル化により極性が高くなり、各々の未変化体に比べてアルコール、水への溶解性に優れる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
〔生理活性作用〕
　上記により得られる、4'-デメチルノビレチンと4'-デメチルタンゲレチンは、これら未変化体（ノビレチン、タンゲレチン）に比べて、優れた「神経突起伸長作用」を有するものである。また、臨床的には、優れた「記憶改善作用」と「抗アルツハイマー作用」を有するものであり、認知症やアルツハイマー病に対して有効な治療・改善・予防作用を奏するものである。なお、健常人の健忘や物忘れに対しても、有効な改善・予防作用を奏するものである。
　また、これら以外にも、神経突起伸長作用によって改善が期待される神経疾患に対しては、有効な治療・改善・予防作用を奏することが期待される。
　また、4'-デメチルノビレチンと4'-デメチルタンゲレチンは、これら未変化体（ノビレチン、タンゲレチン）に比べて、優れた「がん予防作用」を有するものである。特に4'-デメチルノビレチンは、極めて強い活性作用を有している（Li S. et al.: Bioorg. Med. Chem. Lett.,2007, 17:5177参照）。
　ここでの‘がん予防作用’とは、具体的には、一酸化窒素（NO）や誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)、シクロオキシゲナーゼー２（COX-2）の合成を抑えること、；乳がん細胞のアポトーシスの誘発、；によって、がんの発生を予防するものである。
〔薬剤・機能性飲食品〕
　上記により得られる、4'-デメチルノビレチンや4'-デメチルタンゲレチンは（具体的には、‘麹菌発酵物’、‘発酵後の溶液抽出物’、‘精製物’、‘単離物’として）、各種原料に混合することで、薬剤や機能性飲食品の有効成分として用いることができる。
　なお、これらの化合物は、ポリメトキシフラボノイドが脱メチル化した‘デメチルポリメトキシフラボノイド’であるため、極性は高く、未変化体のポリメトキシフラボノイドに比べて、水への溶解性も優れる物質である。従って、ポリメトキシフラボノイドを用いた場合では応用が難しいとされた形態への応用も可能となる。
　また、これら化合物は、それぞれの化合物だけを含むように用いてもよく、両方の化合物を含むように用いてもよい。
[規則91に基づく訂正 12.04.2010]　
　4'-デメチルノビレチンや4'-デメチルタンゲレチンの有効摂取量としては、体重60ｋｇの成人１日あたり、1ｍｇ以上、好ましくは10ｍｇ以上経口摂取することにより、上記のような優れた生理活性作用（特に、神経突起伸長作用、記憶改善作用、抗アルツハイマー作用）が得ることができる。
　従って、この必要量を確保できる形態や摂取方法（回数、量）で、4'-デメチルノビレチンや4'-デメチルタンゲレチンを摂取することで、前記薬理作用が得られることが期待される。ただし、対象の年齢、体重、症状、摂取スケジュール、製剤形態などにより、適宜決定することが望ましい。
　また、薬剤や機能性飲食品に含有させる含有量としては、上記必要な摂取量を担保できるように含有するものであればよいが、具体的には、0.1質量％以上、好ましくは0.5質量％以上、さらに好ましくは3質量％以上となるように含有させることができる。また、上限としては、50質量％以下を挙げることができる。
　‘薬剤’の形態としては、例えば、粉末状、細粒状、顆粒状、などとすることができ、カプセルに充填する形態の他、水に分散した溶液の形態、賦形剤等と混和して得られる錠剤の形態とすることもできる。
　また、‘機能性飲食品’としては、種々の食品原料と混合して、例えば、ビスケット、スナック菓子、ガム、チュアブル錠、清涼飲料水、ドリンク、スープ、ゼリー、キャンディ等、に添加して使用してもよい。
　なお、上記により得られる4'-デメチルノビレチンや4'-デメチルタンゲレチンは、哺乳類全般に対しても、有効であると認められる。そのため、慣用の手段を用いて、ペットや家畜に用いる薬剤に適した形態にして使用してもよい。また、飼料やペットフードの形態にして使用してもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
＜実施例１＞　ポンカン果皮の麹菌（アスペルギルス・アワモリ）発酵
　発酵原料としてポンカン果皮を用いた。ポンカン果皮500ｇを刻んで細片化し、オートクレーブ滅菌した底部の広い容器（有底円筒状の容器）に通気性の良くなるように万遍なく広げ、少量の水を加え30分間加熱した。
　このようにして得られたポンカン果皮に、全体に行き渡るようにアスペルギルス・アワモリ（（株）ビオック製）を接種した。そして、30℃の恒温室内で暗黒条件にて微生物発酵処理（麹菌発酵）を好気的に10日行うことで、麹菌発酵物を得た。
　そして、これらの発酵物について、ＨＰＬＣ分析を行った。結果を図１に示す。なお、図１において、発酵前のポンカン果皮について分析した結果を図１Ａに、麹菌発酵後に得られた発酵物について分析した結果を図１Ｂに示す。
　その結果、発酵前に存在したノビレチンとタンゲレチンが完全に消失し、発酵後には、これらが何らかの脱官能基化を受けたポリメトキシフラボノイド変換体（図１のピークが示す変換体１，２）へと変換されたことが示された。
　即ち、ポンカン果皮原料は麹菌発酵によって、図１で示すポリメトキシフラボノイド変換体を含有する組成物になることが示された。
＜実施例２＞　デメチルポリメトキシフラボノイド高含有組成物の調製
　上記実施例１で得られた麹菌発酵物1ｋｇを擂り潰して砕片し、エタノール5Ｌを加えて室温で3日間抽出し、抽出液を得た。
　次に、得られた抽出液を、ろ紙フィルターでろ過し、ろ液をロータリエバポレータで濃縮し1Ｌとした。そして、水5Ｌを加えて水溶性溶液を得た。
　得られた溶液をあらかじめ水で平衡化したダイヤイオンHP20（多孔性合成吸着樹脂カラム）に供し、3Ｌの水で非吸着成分を除いた後、さらに2Ｌの40％エタノールで溶出する成分を除いた。次いで、2Ｌの45％エタノールで溶出する成分を得た。
　そして、得られた溶出成分をエバポレータで濃縮乾固して、上記ポリメトキシフラボノイド変換体１および２）を高含有する組成物を得た。
＜実施例３＞　デメチルポリメトキシフラボノイドの単離精製
　上記実施例２で得られた組成物2ｇを20％メタノールに溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（内径20mmφ、長さ30cmカラムに和光ゲル50C18を30ｇ詰めた）に供した。40％メタノールで溶出する成分を除去し、60％メタノールで溶出する成分を得た。
　次いで、得られた成分について、展開溶媒ヘキサン/エタノール7：3の条件で分取ＴＬＣクロマトグラフィー（シリカゲル70PF254プレートワコー、膜厚0.75ｍｍ、和光純薬製）を行い、各々の変換体を含む画分を、ＵＶランプを用いて確認しながら採取した。
　そして、得られた各々の画分を、分取ＨＰＬＣカラム（TSK GEL ODS、東ソー社製、4.6mm×25cm）に供し、37％（v/v）アセトニトリルの移動層によって、各々純品のポリメトキシフラボノイド変換体１，２を単離した。
＜実施例４＞　変換体１（4'-デメチルノビレチン）の構造解析
　上記実施例３で得られたポリメトキシフラボノイド変換体１の単離物について、ＦＡＢマススペクトル(pos)（JMS-600Y）によって、分子量を測定した。
　また、1Ｈ-ＮＭＲ、13Ｃ-ＮＭＲにより構造解析を行った。測定装置としては、JNM-AL400（ＮＭＲ）（日本電子社製）を用いて、1Ｈ-ＮＭＲは400ＭＨｚで、13Ｃ-ＮＭＲは100ＭＨｚで、シグナルを検出することによって測定を行い、本物質の1Ｈと13Ｃについて、δＨ（ppm）とδＣ（ppm）を測定した。
　当該ポリメトキシフラボノイド変換体１とタンゲレチンとのＡ環炭素シグナル(ppm)の比較結果を表１に示す。
　また、1Ｈならびに13Ｃについての測定結果を表２に示す。また、表２は、当該ポリメトキシフラボノイド変換体１のケミカルシフト（CDCl3）の結果をまとめたものでもある。なお、表２において、δＨ（ppm）の数値右の記号は、シグナル分裂のパターンを表し、「s」はシングレット、「d」はダブレット、「dd」はダブルダブレット、「m」はマルチプレットを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　a, b: Signals are interchangeable.
　マススペクトル解析の結果、測定分子量[Ｍ-Ｈ]＋はm/z=389であり、分子量は388と考えられた。
　また、ノビレチンの1Ｈ-ＮＭＲ（重クロロホルム－重メタノール中）と当該変換体１の1Ｈ-ＮＭＲを比較したところ、メトキシと考えられるシングレットシグナルが、ノビレチンで６本観測されるのに対し、当該デメチルノビレチンでは同５本が観測された。これらのことから、当該変換体１はノビレチンの構造から１箇所が脱メチル化した‘デメチルノビレチン’と考えられ、分子式Ｃ20Ｈ20Ｏ8と推定された。
　次に、1Ｈ-ＮＭＲ、13Ｃ-ＮＭＲ、ＨＭＱＣスペクトルより、特徴的なメトキシプロトンの帰属を行い、これらからＨＭＢＣ解析を行ったところ、メトキシの根元に当たる炭素を同定できた。
　これらのうち、Ｃ-5，Ｃ-6，Ｃ-7，Ｃ-8については、表１が示すように、タンゲレチンＡ環を構成する炭素シグナルと良く一致し、メトキシ基のシグナルについてもタンゲレチンと一致した。
　このことから、Ａ環について当該デメチルノビレチンは、ノビレチン、タンゲレチンと共通の構造であると推定された。そして、このことから、当該デメチルノビレチンでは、Ｂ環において脱メチルを受けていることが示唆された。
　また、ＣＯＳＹスペクトルより、7.53ppmは隣接する7.04ppmとカップリング（Ｊ＝8.29Ｈｚ）すると共に、7.40ppmと遠隔カップリング（Ｊ＝2.20Ｈｚ）していた。
　これらのプロトンについてＨＭＢＣスペクトルを解析すると、7.40ppmならびに7.53ppmが、Ｃ-2（161.2ppm）にシグナルを持つことから、それぞれの位置が2'位、6'位と決定された。
　また、Ｂ環を構成する147.0ppmおよび149.0ppmの各炭素に対し、2'-Ｈ、並びに、5'-Ｈは、これらの双方にHMBCが観測されたが、6'-Ｈからは149.0ppmのみの観測にとどまった。
　これらのことから、147.0ppmおよび149.0ppmの各炭素は、それぞれ、Ｃ-3'、及び、Ｃ4'-と帰属された。ここで、Ｃ-3'（147.0ppm）は、メトキシプロトン（3.99ｓ）からＨＭＢＣが観測される炭素であることから、残る4'位がデメチル部位であると決定された。
　以上より、実施例３で単離された変換体１は、「4'-デメチルノビレチン」であることが明らかになった。また、1Ｈならびに13Ｃについて、表２で示す結果がまとめられた。そして、上記の解析結果から総合的に得られた分子構造式および1Ｈ-1ＨＣＯＳＹおよびＨＭＢＣシグナルについてまとめたものを図２に示す。
＜実施例５＞　変換体２（4'-デメチルタンゲレチン）の構造解析
　上記実施例３で得られたポリメトキシフラボノイド変換体２の単離物について、ＦＡＢマススペクトル(pos)（JMS-600Y）によって、分子量を測定した。
　また、1Ｈ-ＮＭＲ、13Ｃ-ＮＭＲにより構造解析を行った。測定装置としては、JNM-AL400（ＮＭＲ）（日本電子社製）を用いて、1Ｈ-ＮＭＲは400ＭＨｚで、13Ｃ-ＮＭＲは100ＭＨｚで、シグナルを検出することによって測定を行い、本物質の1Ｈと13Ｃについて、δＨ（ppm）とδＣ（ppm）を測定した。
　当該ポリメトキシフラボノイド変換体２とタンゲレチンとのＡ環炭素シグナル(ppm)の比較結果を表３に示す。
　また、1Ｈならびに13Ｃについての測定結果を表４に示す。また、表４は、当該ポリメトキシフラボノイド変換体２のケミカルシフト（CDCl3）の結果をまとめたものでもある。なお、表４において、δＨ（ppm）の数値右の記号は、シグナル分裂のパターンを表し、「s」はシングレット、「d」はダブレット、「dd」はダブルダブレット、「m」はマルチプレットを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　a, b: Signals are interchangeable.
　マススペクトル解析の結果、測定分子量[Ｍ-Ｈ]＋はm/z=359であり、分子量は358と考えられた。
　また、タンゲレチンの1Ｈ-ＮＭＲ（重DMSO中）と当該変換体２の1Ｈ-ＮＭＲを比較したところ、メトキシと考えられるシングレットシグナルが、タンゲレチンで５本観測されるのに対し、当該デメチルタンゲレチンでは同４本が観測された。これらのことから、当該変換体２はタンゲレチンの構造から１箇所が脱メチル化した‘デメチルタンゲレチン’と考えられ、分子式Ｃ19Ｈ18Ｏ7と推定した。
　次に1Ｈ-ＮＭＲ、13Ｃ-ＮＭＲ、ＨＭＱＣスペクトルより、当該デメチルタンゲレチンで特徴的なメトキシプロトンの帰属を行い、これらからＨＭＢＣ解析を行ったところ、メトキシの根元に当たる炭素を同定できた。
　これらのうち、Ｃ-5，Ｃ-6，Ｃ-7，Ｃ-8については、表３が示すように、タンゲレチンＡ環を構成する炭素シグナルと良く一致し、メトキシ基のシグナルについてもタンゲレチンと一致した。
　このことから、Ａ環について当該デメチルタンゲレチンは、ノビレチン、タンゲレチンと共通の構造であると推定された。そして、このことから、当該デメチルタンゲレチンでは、Ｂ環において脱メチルを受けていることが示唆された。
　また、6.60ppmのプロトン（3-Ｈ）について解析すると、Ｃ環を構成する162.1ppm（Ｃ-2）、178.1ppm（Ｃ-4），114.6ppm（Ｃ-10）に加え、123.0ppmにＨＭＢＣが観測された。この結果から、123.0ppm炭素はＢ環1'位と考えられた。
　また、13Ｃ-ＮＭＲより116.4ppmならびに128.1ppmの炭素は、それぞれ２炭素分のシグナル強度を示し、フェノール基の存在を示唆していた。ＨＭＱＣスペクトルから、116.4ppmならびに128.1ppm炭素に結合する水素シグナルは、それぞれ7.04ppmおよび7.80ppmと帰属でき、これらの水素シグナル間では相互カップリング（Ｊ＝8.78Ｈｚ）が確認された。
　ここで、7.80ppmプロトンについてＨＭＢＣスペクトルを解析するとＣ-2（161.1ppm）にシグナルが確認されることから、その位置が2'-Ｈと帰属され、隣接する7.80ppmプロトンは3'-Ｈと帰属された。その結果、2'-Ｈ、及び、3'-Ｈの双方から、ＨＭＢＣの観測される160.1ppm炭素が4'位と帰属され、デメチル部位であると決定された。
　以上より、実施例３で単離された変換体２は、「4'-デメチルタンゲレチン」であることが明らかになった。また、1Ｈならびに13Ｃについて、表４で示す結果がまとめられた。そして、上記の解析結果から総合的に得られた分子構造式および1Ｈ-1ＨＣＯＳＹおよびＨＭＢＣシグナルについてまとめたものを図３に示す。
＜実施例６＞　神経突起伸長作用の検討
　上記実施例３で得られた変換体１である4'-デメチルノビレチン単離物、変換体２である4'-デメチルタンゲレチン単離物を用い、神経突起伸長作用を調べた。神経細胞としてNeuro2aを用いた。
　まず、5％ＣＯ2、37℃インキュベータ中において、10％牛胎児血清（FBS）含有DMEM培地でNeuro2a細胞を培養した。3日毎に継代培養を行った。
　そして、24穴細胞培養プレートに2×104/穴になるよう5％FBS含有DMEM培地を用いて細胞を撒いた。継代して3時間後に各種披検物を20μＭになるように添加した。被検物としてエタノールに溶解した4'-デメチルノビレチン（実施例３製造物）、4'-デメチルタンゲレチン（実施例３製造物）、ノビレチン（比較対照）、タンゲレチン（比較対照）を用いた。対照としてエタノールのみを用いた。
　そして、各種被検物添加2日後に、顕微鏡下で神経突起伸長作用を観察した。培養液中の各種被検物が奏する神経突起伸長作用を比較した写真像図を図４に示す。
　図が示すように、比較対照であるノビレチン、タンゲレチンに比べて、モノデメチル体である4'-デメチルノビレチン、4'-デメチルタンゲレチンでは、顕著に神経突起伸長作用が有することが明らかになった。
　また、Gu H.ら（Neurosci Lett. 2009,453,204）によると、神経突起伸長作用を有する神経栄養因子を投与された痴呆モデルにおいて、記憶改善作用や抗アルツハイマー作用を有することが示されている。従って、本実施例の結果から、4'-デメチルノビレチン、4'-デメチルタンゲレチンは、記憶改善作用や抗アルツハイマー作用を有することが強く示唆される。
＜実施例７＞　ポンカン果皮の麹菌（アスペルギルス・カワチ）発酵
　麹菌としてアスペルギルス・カワチ（（株）ビオック製）を用いたことを除いて、実施例１と同様にして麹菌発酵（ただし発酵期間は4日間）を行い、麹菌発酵物を得た。
　そして、得られた発酵物について、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、発酵前に存在したノビレチンとタンゲレチンが完全に消失し、発酵後には、4'-デメチルノビレチン、4'-デメチルタンゲレチンへの変換体のピークが示された。
＜実施例８＞　ポンカン果皮の麹菌（アスペルギルス・オリゼ）発酵
　麹菌としてアスペルギルス・オリゼー（（株）ビオック製）を用いたことを除いて、実施例１と同様にして麹菌発酵（発酵期間10日間）を行い、麹菌発酵物を得た。
　そして、得られた発酵物について、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、発酵前に存在したノビレチンとタンゲレチンが完全に消失し、発酵後には、4'-デメチルノビレチン、4'-デメチルタンゲレチンへの変換体のピークが示された。
＜実施例９＞　記憶改善作用の検討
（１）被検物の調製
　まず、実施例２と同様にして、デメチルポリメトキシフラボノイド高含有組成物を調製した。
　この組成物2ｇを20％メタノールに溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（内径20mmφ、長さ30cmカラムに和光ゲル50C18の30ｇを詰めた）に供し、40％メタノールで溶出する成分を除去した後、60％メタノールで溶出することにより、4'-デメチルノビレチンと4'-デメチルタンゲレチンの混合物250ｍｇを得た。この混合物を用いて記憶改善への効果を検討した。
（２）動物試験
　記憶改善のための評価系として、スコポラミン誘発空間記憶障害に対するＹ字型迷路装置を用いた空間記憶試験を行った。本試験は、動物が直前に進入したアームを避けて新しいアームに進入する行動特性（交替行動）を利用した試験法で、空間作業記憶（spatial working memory）能力を調べるために繁用されている試験である。
　本試験で用いるマウスＹ字型迷路装置はアクリル製黒色台形アーム（床幅：3cm、側壁高さ：12cm、解放天井幅：10cm、長さ：40cm）を用いた。３つあるアームをそれぞれＡ，Ｂ，Ｃとし、まずＡの先端にマウス置き、8分間にわたってＹ字迷路内を自由に探索させて、マウスが移動したアームを順番通りに記録した。各アームへの移動回数（総アーム選択数「total arm entries」）と、連続して異なる３本のアームを選択した数（交替行動数）を数え、交替行動数÷（総アーム選択数－２）×100＝交替行動率（alternation behavior (%)）とし、これを自発的交替行動の指標とした。
　本試験には、ddYマウス（雄性、体重25～30ｇ,n=6）を用いた。まず、試験開始時にＹ字迷路試験を実施し、交替行動率が同等となるよう２群（被検物投与群と対照群）に分けた。
　そして被検物投与群には、上記より得られた4'-デメチルノビレチンと4'-デメチルタンゲレチン（0.5％Tween20を含む生理食塩水に懸濁したもの）を、30mg/体重kg/１日の割合で反復経口投与した。なお、対照群には、0.5％Tween20を含む生理食塩水を反復経口投与した。
　そして、１週間反復投与の後、それぞれのマウスにスコポラミンを0.6mg/kgの用量（生理食塩水に溶解）で皮下投与し、投与30分後に再度Ｙ字型迷路試験を実施した。
　結果を図５に示す。（なお、図５において「＊＊」が示す有意差は、危険率１％以下を示すものである。）
　その結果、対照群（0.5％Tween20を含む生理食塩水のみ投与）では、スコポラミンの投与によって、試験開始前に比べて顕著に交替行動率が低下した。
　それに対して、被検物投与群（4'-デメチルノビレチンと4'-デメチルタンゲレチン投与）においては、試験開始前と比べて有意に高い交替行動率を示した。
　このことより、4'-デメチルノビレチンと4'-デメチルタンゲレチンには、スコポラミン誘発空間記憶障害改善作用があり、記憶改善作用や抗アルツハイマー作用を有することが強く示唆された。
　本発明により、極めて有用な機能性成分である4'-デメチルノビレチン、4'-デメチルタンゲレチンを、安全性の高い原料と方法により、容易に且つ大量に製造することを可能とする。
　従って、本発明は、飲食品・医薬品分野において利用されることが期待される。また、高齢化に伴いボケや記憶障害の割合が増加しつつあり、がんによる死因が大きな割合を占める現代社会において、大きな需要が期待されるものである。

Claims (8)

  1. 　カンキツ属後生カンキツ亜族のミカン区または初生カンキツ亜族のダイダイ区に属するカンキツ類から選ばれる１以上の果皮、もしくは、その水抽出物を、；アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）およびアスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii)から選ばれる１以上の麹菌で発酵させて発酵物を得ることを特徴とする、4'-デメチルノビレチンの製造方法。
  2. 　カンキツ属後生カンキツ亜族のミカン区または初生カンキツ亜族のダイダイ区に属するカンキツ類から選ばれる１以上の果皮、もしくは、その水抽出物を、；アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）およびアスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii)から選ばれる１以上の麹菌で発酵させて発酵物を得ることを特徴とする、4'-デメチルタンゲレチンの製造方法。
  3. [規則91に基づく訂正 12.04.2010]　
    　4'-デメチルノビレチンを有効成分として含有する神経突起伸長剤。
  4. [規則91に基づく訂正 12.04.2010]　
    　4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する神経突起伸長剤。
  5. [規則91に基づく訂正 12.04.2010]　
    　4'-デメチルノビレチン及び4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する神経突起伸長剤。
  6. 　4'-デメチルノビレチンを有効成分として含有する記憶改善剤または抗アルツハイマー剤。
  7. 　4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する記憶改善剤または抗アルツハイマー剤。
  8. 　4'-デメチルノビレチン及び4'-デメチルタンゲレチンを有効成分として含有する記憶改善剤または抗アルツハイマー剤。
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