KR101091165B1

KR101091165B1 - 마이코시놀 유도체를 유효성분으로 포함하는 ｎａｄ(ｐ)ｈ:퀴논 산화환원효소 유도용 조성물 및 그 용도

Info

Publication number: KR101091165B1
Application number: KR1020090009201A
Authority: KR
Inventors: 이충환; 김지영; 김정상; 윤정한; 임순성; 최정남
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-05
Filing date: 2009-02-05
Publication date: 2011-12-09
Also published as: KR20100089988A

Abstract

본 발명은 국화과 식물의 일종인 쑥갓(Chrysanthemum coronarium)으로부터 분리 한 항산화효소계 유도활성을 나타내는 화합물, 그 제조방법 및 이를 포함하는 조성물 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 쑥갓 추출물 및 단리된 화합물은 NAD(P)H: 퀴논 산화환원효소 유도 효과를 나타내므로 항산화활성 및 항암활성 으로 질병의 치료 또는 예방, 의약품 또는 식품 조성물로서 매우 유용하게 이용될 수 있다.

통하오수, 마이코시놀: 아세틸레이션, 쑥갓, NAD(P)H:퀴논 산화환원효소, 항암활성

Description

마이코시놀 유도체를 유효성분으로 포함하는 ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ:퀴논 산화환원효소 유도용 조성물 및 그 용도 {Composition containing the mycosinol derivatives for inducing NAD(P)H:quinone oxidoreductase and the use thereof}

본 발명은 국화과 식물의 일종인 쑥갓(Chrysanthemum coronarium)의 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 유도활성과 그 활성부의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 쑥갓을 메타놀(methanol)로 추출한 후, 에틸아세테이트(ethyacetate)가용부를 크로마토그래피로 분리, 정제함을 특징으로 쑥갓 추출물의 제조방법 및 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소를 유도함으로써, 항산화 및 항암활성을 가지는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 농림부의 바이오그린 21사업의 일환으로 수행된 연구로부터 도출된 것이다[과제 고유번호 : 20070301034039, 과제명: 2008 대사체 프로파일링 기법을 활용한 국내농산자원의 최적활성 조성 확립 및 대사규명].

우리 몸속에서는 산소 대사과정의 부산물로 Superoxide(O₂-), hydrogen peroxide 등 활성산소(유해산소)가 대사과정 중 에 발생하고 있다. 뿐만 아니라 스트레스나 다른 원인에 의해서 비정상적으로 증가하여 강력한 세포독성 나타내어 암의 주요 원인의 하나로도 여겨지고 있다. 이에 항산화효소는 활성산소가 생기면 이를 즉시 제거하여 활성산소의 산화작용으로 인한 질병과 노화를 예방한다. 이러한 발암 물질 대사 효소는 발암물질을 체내 대사 활성을 담당하는 제1상 효소계와 활성화된 중간산물을 체외로 배설하는 제 2상 효소계로 나뉜다. 여기에 관여하는 2상 항산화 효소계로는 SOD(Superoxide Dismutase),Catalase, Glutathione Peroxidate (GPX), Glutathione S-transferase(GST), Gamma glutamylcystene ligase, Glutathine reductase, NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 (NAD(P)H:quinone oxidoreductase1;NQO1) 등이 있다.

이들은 여러 가지 천연물에 의해 발현이 유도된다고 보고된 바 있으며(W.D. Holtzclaw et al. Advan. Enzyme Regul. 2004), 지금까지 천연물 유래 2상 효소 유도 성분으로 Oxidizable diphenols, Quinones, Michael reaction, Isothiocyanates, Polyenes 등의 계열들이 보고되었고(Prestera T et. al. Proc. Natl. Acad. Sci, 1993), 최근에는 발암과정을 효과적으로 억제하는 방어 기작이 제 2상 효소계의 활성과 밀접한 관련이 있는 것이 보고(De Long MJ et al. Proc. Natl. Acad. Sci, 1986, De Long MJ et. al. Carcinogenesis, 1987, Talalay et al. Proc. Natl. Acad. Sci, 1988)되고 있어 이들 2상 효소를 유도하는 성분들은 좋은 암예방 소재로 여겨지고 있다. 그러나 지금까지 진행되고 있는 암예방 지표효소 증가와 관련된 항암연구는 순수 정제된 성분을 사용하기보다는 유기용매나 열수추출액 정도의 수준에 그치고 있다. 즉, 구조가 정확히 밝혀진 특정 성분을 대상으로 한 연구는 드물고, 추출성분에 대한 효능 검정에 그치는 경우가 많다.

따라서, 본 발명자들은 이 목적에 부합되는 항암효과를 나타내는 농산자원 및 그 성분들을 국화과 쑥갓으로부터 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 유도활성을 가지는 성분을 천연물로부터 탐색하여, 본 물질을 분리하였다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소계를 유도하는 활성으로서 우수한 항산화 효과 및 항암활성을 나타내는 화합물 및 그의 유도체, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 그의 용도를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 구성된 군으로부터 선택된 마이코시놀 유도체를 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

또 본 발명은 본 발명의 상기 마이코시놀 유도체를 유효성분으로 포함하는 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 유도용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 마이코시놀 유도체를 유효 성분으로 함유하 는 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 상기 마이코시놀 유도체를 유효 성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 상기 마이코시놀 유도체를 유효 성분으로 함유하는 간 보호용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 상기 마이코시놀 유도체를 유효성분으로하는 암 예방 및 간보호용 식품 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 "항암 "이라 함은, 암의 예방, 치료, 증상의 경감 및 완화 등을 모두 포괄하는 최광의의 의미이다.

또 본 명세서에서 "암 예방"이라 함은, 암의 개시단계, 촉진단계, 진행단계 및 전이단계 중 어느 하나 이상을 억제하는 것을 포함하는 최광의의 의미이다. 그 중 특히 암의 개시단계 및 촉진단계에서 암 발생을 억제하는 것을 가리킨다. 또한, 발암물질이 세포내 표적물과 반응하거나 목적물에 도달하는 것을 억제하는 블록킹

(blocking) 기전을 통해 암을 예방하는 것을 포함한다. 또한, 발암물질에 노출된 세포가 신생물(neoplasia)로 나타나는 과정을 억제하는 서프레싱(suppressing) 기전을 통해 암을 예방하는 것도 포함한다. 또한, 발암성 또는 전발암성 물질의 체외 배출을 촉진시킴으로써 암을 예방하는 것을 포함한다. 또한 전발암성 물질을 대사하여 암을 예방하는 것도 포함한다.

본 명세서에서 "쑥갓 추출물"이란 천연물인 쑥갓으로부터 유효성분을 추출하여 얻어진 것이라면 특별히 한정하지 않고 모두 포함한다. 예컨대, 쑥갓을 물이나 유기용매에 넣고 정치, 교반, 가압 또는 가열 등의 수단을 통해 유효성분을 용출함으로써 얻어진 결과물을 들 수 있다. 또한, 그와 같이 하여 얻어진 액상 추출물을 동결건조함으로써 얻어진 동결건조물을 포함한다. 또한, 그러한 동결건조물을 분쇄한 분말을 포함한다. 그 외에 도 유효성분을 추출하기 위해 가능한 수단이 무엇이든지 가리지 않고 추출된 모든 추출물을 포함하며, 추출된 후 동결 건조 등의 가공을 거친 것까지도 모두 포함된다. 기타, 중탕이나 상온에 의한 추출법과 같이 예로부터 전해 내려오거나, 한의서 또는 교과서에 기재되어 있는 통상적인 추출법에 의한 추출물을 포함한다. 또한, 특정 활성 화합물들을 분리하기 위한 특별한 추출방법인 Stass Otto 추출법이나 각종 칼럼 크로마토그래피 방법 등을 통하여 얻어진 분획 추출물을 포함한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산,나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 마이코시놀 유도체를 포함한 조성물은 1일 0.001 내지 1000 mg/kg 체중으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 그 투여량은 연령, 성별, 체중, 질병의 정도, 투여경로 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명의 화합물의 사료의 형태로 이용하기 위한 바람직한 투여량은 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 마이코시놀 유도체를 포함한 조성물은 1일 10 내지 5000 mg/kg 다이어트인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은, 심각한 독성 및 부작용은 없으므로 예방 목 적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 조성물은, 유효성분으로서 마이코시놀 유도체를 전체 조성물 중량 중 0.001 내지 99.9중량% 함유할 수 있다. 0.001중량% 이상이어야 효과를 기대할 수 있고, 불순물의 존재 등으로 인해 99.9중량%를 넘기 어렵기 때문이다.

한편, 경구 투여의 목적으로 본 발명의 마이코시놀 유도체를 정제, 캡슐, 츄잉정, 작은 봉지, 과립, 분말, 액체 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 시럽 등의 제제로 제형화하는 경우에 있어서는, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세 결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산 이칼슘 또는 락토오즈와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 슈크로오즈 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있으며, 투여 단위 형이 캡슐제인 경우에는 상기 성분 외에도 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방유와 같은 액상 담체가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 마이코시놀 유도체 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류,과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.

이 때, 상기 식품 중의 상기 마이코시놀 유도체의 양은 전체 식품 중량의 0.001 내지 99.9 중량%로 가할 수 있으며, 음료 중에는 100 ㎖를 기준으로 0.001 내지 0.1 g, 더 바람직하게는 0.05 내지 0.1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 마이코시놀 유도체를 함유하는 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 마이코시놀 유도체를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료 의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택 되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 통하오수, 마이코시놀 유도체 또는 이들을 포함하는 쑥갓 추출물을 함유할 수 있으며 의약품 제조 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체가 첨가되어 약학적 조성물로 제조될 수도 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 우수한 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 활성유도 효과를 나타내는 화합물 및 그의 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화합물 및 그의 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염의 제조 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 화합물 및 그의 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 활성유도에 사용하는 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 화합물 및 그의 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효 성분으로 함유하는 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 활성유도용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 암예방 활성, 해독능력의 증강에 따른 간보호 활성 및 항산화활성 (산화적스트레스의 완화)을 나타내는 기능성 식품을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 국화과 식물의 일종인 쑥갓(Chrysanthemum coronarium)으로부터 분리 한 항산화효소계 유도활성을 나타내는 화합물, 그 제조방법 및 이를 포함하는 조성물 및 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 쑥갓의 줄기와 잎의 메탄올(methanol) 추출액 중 에틸아세테이트(ethyacetate) 가용부의 크로마토그래피(chromatography)에 의하여 단리된 마이코시놀 유도체로 표시되는 화합물, 그를 포함하는 약학적 조성물 및 이를 NAD(P)H: 퀴논 산화환원효소 유도활성으로 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 쑥갓 추출물 및 단리된 화합물은 NAD(P)H: 퀴논 산화환원효소 유도 효과를 나타내므로 항산화활성 및 항암활성 으로 질병의 치료 또는 예방, 의약품 또는 식품 조성물로서 매우 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 화합물 통하오수 또는 마이코시놀 유도체를 마우스 간암세포주인 hepa1c1c7과 BPRc1에 처치하고, 생육억제활성 및 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 유도 활성을 측정한 결과 본 발명의 통하오수, 마이코시놀 유도체가 매우 효과적으로 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소를 유도하며, 암세포의 생육을 억제하는 것을 확인하였다 (도1 및 표 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 통하오수 또는 마이코시놀 유도체의 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 유도활성 기전을 더욱 상세히 규명하기 위해, 루시퍼라아제를 마커로 사용하여 확인한 결과, 이들 화합물이 항산화반응인자(Antioxidant Response Element: ARE)에 작용하여 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소의 발현을 증가시키는 것으로 사료되었다 (도2 참조).

이상과 같이 본 발명은 쑥갓으로부터 분리한 항산화효소계 유도 효과를 나타내는 물질로 통하오수, 마이코시놀 계열은 기존에 생물농약으로서 살충제로 이용하기 위해 대량합성과 더 강한 활성 발굴을 위한 아날로그 탐색 연구가 집중되고 있다 (Li Chen et. al. J. Agric. Food Chem, 2004). 뿐만 아니라, Nitric oixde 형성 저해나(Yoshikawa et. al. Chem. Pham.Bull,2000, 염증기작에 관여되는 NF-kB 활성 저해해에도 효과를 나타내는 것으로 보고 된 바 있다 (Calzado et. al. Biochem. Biophys. Acta. 2005). 그러나 아직까지 쑥갓의 Spiro enol ether 계열이 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 유도활성 효과는 보고된 적이 없는 새롭고도 진보적인 천연물물유래 항산화효소계 유도 활성 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 화학식 1 내지 화학식 3으로 구성된 군으로부터 선택된 본 발명의 마이코시놀 유도체는 다양한 식품 및 천연물 신약의 원료로 사용되어 암예방, 간보호, 항산화 효과를 나타낼 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 쑥갓에서 통하오수와 마이코시놀 유도체의 분리 및 정제

1-1) 통하오수(7Z)의 분리 및 정제

썹씨 95~100도에서 5~10분 동안 열처리 한 후 동결 건조 된 쑥갓의 잎과 줄기 500 g을 쇄절하여 5 리터 80% 메탄올을 48시간 2회 환류 추출하여 감압여과한 후 그 여액을 40℃에서 감압, 농축하여 물층으로 이행된 추출액을 얻는다.

농축된 물층 가용부를 분액여두에 넣은 후 1:1(v/v)비율의 에틸아세테이트을 넣고 진탕 추출하여 얻은 상등액을 회수하여 40℃에서 감압, 농축하여 에틸아세테이트 가용부 25 g를 얻었다. 에틸아세테이트 추출액은 1 mL의 메탄올에 용해시킨 후 솔리드 패이스 익스트랙션 (Solid Phase Extraction column, waters) 컬럼 크로마토그래피를 20% 메탄올, 50% 메탄올, 80% 메탄올 그리고 100% 메탄올을 단계별로 용출용매로 수행하여 활성분획을 모았다. 상기 분획 중 항산화효소 유도활성을 나 타내는 80% 메탄올 분획(1.05 g)을 YMC-ODSA-C18 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 이동상 용매로 40% 아세토니트릴을 이용하여 130 mg의 80% 메탄올 분획물을 용출시켜 전개 시작한 후, 23분에 분획을 분리하고 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사(residue)를 건조하여 통하오수(7Z)를 3.4 mg을 분리확보 하였다. 상기 통하오수(Z)로 표시되는 화합물을 질량분석, ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 2D NMR을 통해 확인하였다. 그 결과 하기와 같은 이화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다.

[통하오수(7Z);화학식 1]

1) 통하오수(7Z)로 표시되는 화합물

i) 물질 성상: 오일 ii) 분자량: 200

iii) 분자식: C₁₃H₁₂O₂iv) 질량분석치(M+H):m/z 201

2) 통하오수(7Z)로 표시되는 화합물의 ¹H NMR (500MHz, DMSO-d6) 결과

δ : 2.01 (3H,s), 2.07 (2H, m), 2.11 (2H, m), 3.90 (2H, m), 4.08 (2H, m), 4.8 (1H, s), 6.45 (1H, d, J=5.0Hz), 6.48 (1H, d, J=5.5Hz)

3) 통하오수(7Z)로 표시되는 화합물의 ¹³C-NMR (500MHz, DMSO-d6) 결과

δ :4.14 (C-6'), 24.14 (C-3), 35.02 (C-4), 64.87 (C-4'), 69.11 (C-2), 71.49 (C-2'), 77.15 (C-1'), 78.16 (C-3'), 81.75 (C-5'), 121.37 (C-5), 127.03 (C-8), 136.89 (C-9), 167.95 (C-7)

1-2) 통하오수(7E)의 분리 및 정제

상기 1-1에서 수득된 분획 중 전개 시작한 후, 38분 분획을 감압건조기로 건조시켜 용매를 제거하여 5.8 mg의 통하오수(7E)를 분리확보 하였으며, 상기 통하오수(7E)로 표시되는 화합물을 질량분석, ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 2D NMR을 통해 확인하였다. 그 결과 하기와 같은 이화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다.

[통하오수(7E);화학식 2]

1) 통하오수(E)로 표시되는 화합물

i) 물질 성상: 오일 ii) 분자량: 200

iii) 분자식: C₁₃H₁₂O₂iv) 질량분석치(M+H):m/z 201

2) 통하오수(7E)로 표시되는 화합물의 ¹H NMR (500MHz, DMSO-d6) 결과

δ : 2.01 (3H,s), 2.06 (2H, m), 2.14 (2H, m), 3.90 (2H, m), 4.07 (2H, m), 5.01 (1H, s), 6.55 (1H, d, J=2.0Hz), 6.68 (1H, dd, J=2.5, 3.5Hz)

3) 통하오수(7E)로 표시되는 화합물의 ¹³C-NMR (500MHz, DMSO-d6) 결과

δ :4.14 (C-6'), 24.15 (C-3), 35.02 (C-4), 64.86 (C-4'), 69.12 (C-2), 71.79 (C-2'), 76.04 (C-1'), 78.29 (C-3'), 80.83 (C-5'), 121.11 (C-5), 124.77 (C-8), 136.29 (C-9), 167.15 (C-7)

1-3) 마이코시놀:Ac(7E)의 분리 및 정제

상기 1-1에서 수득된 분획 중 전개 시작한 후, 30.8분 분획을 감압건조기로 건조시켜 용매를 제거하여 4.3 mg의 마이코시놀:Ac(7E)를 분리확보 하였으며, 상기 마이코시놀:Ac(7E)로 표시되는 화합물을 질량분석, ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 2D NMR을 통해 확인하였다. 그 결과 하기와 같은 이화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다.

[마이코시놀:Ac;화학식 3]

1) 마이코시놀:Ac(7E) or (7Z)로 표시되는 화합물

i) 물질 성상: 오일 ii) 분자량: 256

iii) 분자식: C₁₅H₁₂O₄iv) 질량분석치(M+Na): m/z 279

2) 마이코시놀:Ac(7E) or (7Z)로 표시되는 화합물의 ¹H NMR (500MHz, DMSO-d6) 결과

δ : 1.99 (3H, s), 2.01 (3H,s), 5.28 (1H, s), 5.31 (1H, dd, J=3.0, 2.5Hz ), 5.64 (1H, t, J=1.5, 2.5Hz), 6.76 (1H, d, J=1.6Hz), 6.78 (1H, d, J=1.6Hz), 6.88 (1H, m)

3) 마이코시놀:Ac(7E) or (7Z)로 표시되는 화합물의 ¹³C-NMR (500MHz, DMSO-d6) 결과

δ :4.09 (C-6'), 20.06 (C-4-OCH3), 70.60 (C-2'), 64.86 (C-4'), 69.12 (C-2), 70.60 (C-2'), 74.82 (C-4), 76.97 (C-3'), 81.15 (C-1'), 81.54 (C-5'), 100.88(C-3), 116.91 (C-5), 124.64 (C-8), 130.50 (C-9), 148.56 (C-2), 169.34 (C-7), 169.76 (C-4-CO)

실시예 2: 본 발명 화합물의 암세포에 대한 생육 억제활성 확인

상기 실시예 1에서 얻어진 쑥갓 SPE 컬럼 분획들과 분리된 단일활성물질들을 마우스 간암 세포주인 Hepa1c17 과 BPRc1에 처치하여 IC₅₀(세포증식을 50% 저해하는 농도)로 산출하여 상기 표 1에 나타내었다. 상기 표에서 알 수 있듯이, 쑥갓 추출물 메탄올 80% SPE 컬럼 분획물과 그 메탄올 80% 분획물에서 분리된 단일 활성 성분으로 통하오수(7Z), (7E), 그리고 마이코시놀:Ac는 마우스의 간암 세포주에서 뛰어난 세포증식 억제효과, 즉 항암활성을 나타냄을 확인 할 수 있었다.

실시예 3: 본 발명 화합물의 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 유도 활성의 확인

상기 실시예 1에서 얻은 쑥갓 유래 단일 활성 성분 3가지와 과성 대조군으로 항산화제인 t-BHQ(tertiary butylhydroquinone) 을 마우스 간암 세포주인 Hepa1c1c7에 처치하고, 음성대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 군을 이용하여 세포 주 내의 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소의 활성을 각각 측정하였다 (도1).

도 1에서, 통하오수(7Z)는 25 ug/mL 의 농도에서 음성대조군과 비교하였을 때, 약 4배, 통하오수(7E)는 10 ug/mL농도에서 2.5배 정도의 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소를 유도하였다. 뿐만 아니라, 마이코시놀:AC를 처리한 경우 10 ug/mL 농도에서 음성대조군과 비교 시 약 3.3배 이상 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소를 유도하였다.

그러므로, 본 발명의 통하오수 (7Z), (7E) 그리고 마이코시놀:AC 는 매우 효과적인 간암 세포주 Hepa1c17에서 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소를 유도함을 알 수 있었다.

뿐만 아니라, 마우스 간암 세포주 BPRc1 세포는 아틸탄화수소수용체핵전위자(arylhydrocarbon receptor nuclear translocator; ARNT)가 결여된 암세포주이다. 이는 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 활성 유도하는 것이 1상 효소계와 2상 효소계 모두 유도 할 수 있는 두 가지 기능을 가진 유도제(bifunctional inducer)로 작용하는 것이 아니라, 단일 기능성 유도제(monofunctional inducer)로 작용하여 1상 효소계는 유도하지 않으면서 항암효소계로 알려진 2상 효소계만 유일하게 유도함을 의미한다. 음성대조군과 비교 시, 통하오수 (7Z)는 약 4.1배, 마이코시놀:Ac는 약 3.3배 정도의 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 활성을 유도하는 것으로 나타났다. 이는 특히 항암제로서 바람직한 특성을 가짐을 의미한다.

실시예 4: 본 발명 화합물의 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 유도 기전 확인

본 발명의 화합물들이 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 활성 기전이 항산화반응인자인 (Antioxidant Response Element; ARE) 전사활성화 시스단위와의 연관성을 확인하기 위해 ARE-루시퍼레라아제 조립체로 형질전환된 HepG2-C8 세포주를 이용하여 상기 분획물들을 처리하였다. 그 결과 리포터 유전자인 루시퍼라아제의 발현정도를 양성대조군 t-BHQ와 비교시, 20 uM의 농도에 비해 통하오수 (7Z) 25 ug/mL 은 약 1.3배, 마이코시놀:Ac 10 ug/mL 은 약 3.7배 정도로 증가시키는 것으로 확인 되었다. (도 2)

따라서, 본 발명의 화합물들은 루시퍼라아제를 고도로 발현시키는 것으로 보아, 항산화반응인자에 작용하여 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소의 발현을 증가시키는 것으로 사료된다.

도 1은 본 발명의 통하오수, 마이코시놀:Ac를 포함하는 쑥갓 분획들을 마우스 간암 세포주(Hepa1c1c7)에 처치하였을때 발현된 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 활성을 나타낸 것이다.

도 2는 통하오수, 마이코시놀:Ac를 포함하는 쑥갓 분획들을 ARE-루시퍼라제 조립체로 형질전환된 HepG2-C8 세포에 처치시 루시퍼라제의 발현정도를 대조군인 t-HBQ와 비교하여 나타낸 것이다.

Claims

하기 화학식 3의 마이코시놀 유도체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.

[화학식 3]
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하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 구성된 군으로부터 선택된 마이코시놀 유도체를 유효성분으로 포함하는 간 보호용 기능성 식품 조성물.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]
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