KR101347694B1

KR101347694B1 - 탈염 용암해수의 발효물의 제조 방법과 그 방법에 의하여 얻어진 발효물 및 그 발효물을 이용한 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101347694B1
Application number: KR1020110110429A
Authority: KR
Inventors: 김병호; 김기주; 양원혁; 김진석; 강희곤; 이현정; 문상욱
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2014-01-10
Also published as: KR20130046082A

Abstract

본 발명은 탈염 용암해수의 발효물의 제조 방법과 그 방법에 의하여 얻어진 발효물 및 그 발효물을 이용한 화장료 조성물을 개시한다. 상기 탈염 용암해수 발효물은 발효 전의 탈염 용암해수에 비하여 미네랄 성분 및 함량에 있어서는 변화가 없으면서 용해도가 증진되고 세포 재생 활성, 항산화 활성, 항염 활성 등이 증진된 특성을 지님으로써 특히 화장품에 포함되어 사용될 수 있다.

Description

탈염 용암해수의 발효물의 제조 방법과 그 방법에 의하여 얻어진 발효물 및 그 발효물을 이용한 화장료 조성물{A Method for Preparing a Fermentation Product of Desalinized Magma Seawater, the Product Obtained Thereby and a Cosmetic Composition Using the Same}

본 발명은 탈염 용암해수의 발효물의 제조 방법과 그 방법에 의하여 얻어진 발효물 및 그 발효물을 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다.

제주에서도 동부지역(구좌읍, 성산읍 및 표선면)에만 분포하는 용암해수는 청정하고 수온이 연중 일정한 특성을 갖고 있으며 일반 염지하수나 해수에서 볼 수 없는 다양한 미네랄을 다량으로 함유하고 있는데, 문헌「고기원 등, 제주도 동부지역의 수문지질에 관한 연구(Ⅱ), 2003, 경원대학교」, 문헌「고기원 등, 제주도 동부지역의 지하 지질구조와 지하수위 변동 및 수질특성에 관한 연구, 1992, 제주도보건환경연구원보, 제3권, P.15~43」, 문헌「고기원 등, 제주도 서귀포층의 지하분포 상태와 지하수와의 관계, 1991, 지질학회지, 제27권 제5호, P. 552」 등을 포함한 기존의 자료로부터 용암해수의 생성은 다음과 같이 요약될 수 있다. 즉 외부 해양으로부터 해수가 지하의 용암층을 침투하여 유입하였고, 물의 이동이 어려운 불투수성 퇴적층인 서귀포층(또는 세화리층) 위에서 거대한 해수 수괴를 형성하게 되었다는 것이다. 용암해수는 서귀포층이 엷은 제주도 서부 및 남·북부의 경우는 발견되지 않고, 유일하게 서귀포층이 두터운 동부지역에서만 발견되고 있다는 사실이 이를 뒷받침한다.

제주도 동부지역 제주시 구좌읍 한동리에서 지하 150m를 굴착하여 지하(평균 해수면 기준), 44.35mm, 86.35m 및 126.35m에서 용암해수를 채수하고 한국화학시험연구원에 의뢰하여 얻은 수심별 미네랄 함량은 아래의 [표 1]과 같다.

제주 용암해수의 수심별 미네랄 농도(ppm)

시험항목	담수 1m	용암해수 44.35m	용암해수 86.35m	용암해수 126.35m
Na	146	11400	11400	10700
Mg	0.49	1510	1520	1390
Ca	9.20	460	490	431
K	38.5	643	540	621
Cu	0.00069	0.00157	0.00113	0.00080
Co	-	-	-	-
Sn	-	-	-	-
Mo	0.0014	0.011	0.012	0.011
V	0.013	3.28	3.53	0.01
Ge	0.00019	0.0032	0.003	0.0025
Br	-	-	-	-
Sr	0.05	1.18	1.31	1.30
Ti	-	-	-	-
Ni	-	-	-	-
Si(SiO₂)	1.21	7.23	6.19	1.21
Zn	0.001	0.0045	0.0039	0.0019
Fe	0.082	0.21	0.26	0.04
Mn	0.01	19.51	20.7	18.9
Cl^-	262	16629	18500	19900
B	0.15	3.35	3.73	0.15
Li	0.09	0.37	0.41	0.09
Ba	0.015	0.032	0.019	0.015
Pb	0.00091	0.004	0.0013	0.00065
F	-	-	-	-
As	-	0.01	-	-
Se	0.000049	0.00005	0.00124	0.00086
Hg	-	-	-	-
CN^-	-	-	-	-
Cr	-	-	-	-
Cd	-	-	-	-
Al	0.14	0.63	0.49	0.47
* 상기 담수는 전기전도도가 1186.58㎲/cm이고 염의 농도가 0.3 퍼밀리인 평균 해수면 하 1m의 지하수의 성분 분석 결과임

상기 [표 1]로부터 용암해수는 염분, 칼슘, 마그네슘 등의 항목에서는 일반 염지하수와 유사한 점을 나타내지만, 바나듐, 게르마늄, 셀레늄 등의 미량원소 항목에서는 뚜렷한 차이를 보이고 있다.

일반적으로 미네랄을 이용한 유액, 크림, 화장수, 팩, 샴푸, 린스 등은 미네랄원으로서 각종 무기염류 또는 표층해수(예, 사해 소금 등)를 이용하고 있다. 이러한 미네랄의 이용은 보습 등의 효능에 초점이 맞추어지고 있는데, 무기염류의 이용에는 높은 순도의 단일 종의 무기염류 이용이 주가 되고 있고, 사해소금 등의 이용에는 극히 소량의 사용만이 이루어지고 있어, 풍부하고 다양한 미네랄의 공급에는 어려움이 내포되고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 최근에는 해양심층수로부터 제조된 미네랄의 사용이 이루어지고 있는데, 일반적으로 역삼투막, 전기투석 등의 방법을 이용하여 음이온과 나트륨 이온을 제거한 양이온 미네랄을 농축 및 동결건조 등의 방법으로 분말화하여 사용한다. 해수 중 미네랄은 약알칼리 상태에서도 양이온과 음이온의 평형을 유지하면서 이온화 상태로 용해되어 있으나, 상기 방법 등을 거쳐 분말화된 후 재차 물에 용해시킬 때는 다소 용해도가 떨어지는 단점이 나타난다. 일반적으로 건조 후 용해도가 다소 저하되는 이유로서는 이온성 물질들이 서로 결착되어 결정 상태로 존재하거나, 분말을 용해할 때 첨가되는 물 중에 함유된 수산이온에 의해 수화되어 일부 용해되지 않는 경우가 있기 때문이다.

현재 용암해수 미네랄 성분이 세포증식 활성, 항염증 활성 등이 보고되 있다(한국 특허 제0947637호).

본 발명은 탈염 용암해수를 젖산균 및/또는 효모에 의해 발효시킬 경우 미네랄 성분 중 유용 미네랄 성분의 함량이 증가하고, 용해도가 증진되며, 더불어 세포 재생 활성, 항염 활성, 항산화 활성 등이 증진됨을 확인함으로써 완성된 것이다.

본 발명의 목적은 탈염 용암해수의 발효물의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의하여 얻어진 탈염 용암해수의 발효물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 탈염 용암해수의 발효물을 이용한 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 탈염 용암해수 발효물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 탈염 용암해수 발효물의 제조 방법은 (a) 탈염 용암해수에 접종되는 미생물의 탄소원과 에너지원을 첨가하여 혼합하는 단계, 및 (b) 그 혼합물에 젖산균 및/또는 효모를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하여 구성된다.

아래의 실시예 및 실험예가 보여주듯이, 탈염 용암해수를 젖산균 및/또는 효모에 의하여 발효시킬 경우, 그 얻어진 발효물은 탈염 용암해수에 비하여 미네랄 성분 중 유용 미네랄 성분(Ge, Ba, Se 등) 함량이 증가하고, 용해도가 증진되며, 세포 재생 활성(즉 세포 증식 촉진 활성), 항산화 활성, 항염증 활성 등 생리활성이 증진되었다.

본 명세서에서, "용암해수"는 발명의 명칭이 "미네랄 조성물의 제조 방법 및 그 방법에 의하여 얻어진 미네랄 조성물"인 국내 특허 제0853244호(출원번호: 제10-2008-0027861호)에서 정의되고 설명된 바의 "제주도 동부지역에 부존하고 있는 염지하수"와 같은 의미이다. 구체적으로 '제주도 동부지역'은 행정구역상 제주도 구좌읍, 성산읍 및 표선면을 의미하며, '염지하수'는 일정량 이상 염분이 함유된 지하수를 의미하는데, 구체적으로는 고기원 등의 논문(고기원 등, 제주도 동부지역의 수문지질에 관한 연구(Ⅱ), 2003, 경원대학교; 본 명세서의 일부로서 간주된다)에서 사용한 염분 농도에 의거 제주도 지하수를 분류한 기준에 따라 저염지하수(전기전도도가 1,700㎲/cm ~17,350㎲/cm)와 염수지하수(전기전도도가 17,350㎲/cm 이상)를 모두를 포함하는 의미로서 이해될 있지만, 바람직하게는 전기전도도가 17,350 ㎲/cm 이상 또는 염의 농도가 30‰(permilliage) 이상(통상 해수의 염분 농도가 32 내지 35‰임)인 염수지하수를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

본 명세서에서 특별히 정의되지 아니한 용어는 당업계의 통상적인 의미를 따른다.

본 발명의 탈염 용암해수 발효물의 제조 방법에서, 상기 (a) 단계에서의 사용될 수 있는 탈염 용암해수는 탈염되고 탈수된 고형상의 용암해수와 탈염되고 탈수되어 농축된 액상의 용암해수 모두 사용될 수 있다. 고형상의 용암해수는 다양한 미네랄의 혼합 분말로 볼 수 있는데, 이를 사용할 경우에는 적당량의 수분을 첨가하여 사용하게 될 것이다. 여기서 적당량의 수분은 첨가되는 에너지원과 탄소원의 중량의 10배 내지 1,000배 범위이다.

한편 용암해수를 탈염시켜 탈염 용암해수를 얻는 것은 당업계에 알려진 임의의 기술을 적용하여 수행될 수 있는데, 그러한 기술로서는 플래시증발법, 해수동결법, 역삼투압법, 이온교환수지법, 전기투석법 등을 들 수 있다. 또한 하기 실시예에서 사용된 전기투석기와 같은 시중에 유통되는 염분제거장치 등을 사용하여 수행될 수도 있다.

또 발명의 탈염 용암해수 발효물의 제조 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서의 접종되는 미생물의 탄소원과 에너지원은 당업계에 잘 알려져 있고, 따라서 당업계에 알려진 임의의 것을 사용할 수 있는데, 통상은 올리고당, 유당, 포도당, 과당, 설탕, 이들의 혼합물 등이 사용될 것이다. 이러한 탄소원과 에너지원은 의도한 발효 시간, 발효 정도 등을 고려하여 임의의 범위로 첨가될 수 있다. 바람직한 첨가량은 탈염된 용암해수(또는 탈염되고 탈수되어 얻어진 고형상의 용암해수에 수분이 첨가된 경우) 100 중량부 기준 0.1 중량부 내지 10 중량부이다. 또한 최종적으로 얻어지는 발효물의 기능성 또는 풍미의 향상을 위해서 인삼, 대추, 은행, 영지, 운지, 두충, 당귀, 치커리, 컴프리, 오가피, 쑥, 질경이, 둥굴레, 삽주, 칡 등의 생약재 분말 또는 추출물, 토마토, 신선초, 당근 등의 야채 분말 또는 추출물 등이 첨가될 수 있다. 이들 첨가물은 탈염 용암해수 100 중량부 기준 0.1 중량부 내지 10 중량부의 범위로 첨가될 것이다.

또 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 젖산균이나 효모에는 특별한 제한이 없다.

젖산균의 경우 락토바실러스 속 젖산균(Lactobacillus sp .), 스트렙토코쿠스 속 젖산균(Streptococcus sp .), 페디오코쿠스 속 젖산균(Pediococcus sp .), 류코노스톡 속 젖산균(Leuconostoc sp .) 및 비피도박테리움 속 젖산균(Bifidobacterium sp.)으로 대별되는데, 본 발명의 방법에는 이러한 모든 젖산균이 사용될 수 있다. 구체적으로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 세레비세(Pediococcus cerevisiae), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 레코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 레코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 등이 모두 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

효모의 경우, 사카로마이세스 속 효모를 사용하는 것이 바람직하며, 이러한 효모로서는 예컨대 사카로마이세스 루시(Saccharomyces rouxii), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cereviciae), 사카로마이세스 오비폴미스(Saccharomyces oviformis), 사카로마이세스 스테이네리(Saccharomyces steineri) 등이 예시될 수 있다.

삭제

본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 발효는 접종된 미생물의 생장이 최대에 이를 때까지 발효시키는 것이 바람직하다. 접종된 미생물이 생장이 최대에 이르는 시점은 발효 온도, 발효 원료(상기 (a) 단계의 혼합물로서, 즉 탈염 용암해수와 미생물의 탄소원과 에너지원의 혼합물임)의 양, 접종되는 미생물의 양 등에 따라 결정될 것이다. 당업자는 그의 통상의 능력 범위 내에서 발효 온도, 발효 원료의 양, 접종되는 미생물의 양 등을 고려하여 접종된 미생물의 생장이 최대에 이르는 시점이 어느 시점인가를 결정할 수 있다. 본 발명자의 경험에 의할 때, 아래의 실시예가 보여주듯이 발효 온도가 25℃이고, 탈염 용암해수가 10kg이고 포도당과 과당 등이 50g인 경우에 미생물을 5%(w/v)로 접종하였을 때, 접종된 미생물의 생장이 최대에 이르기까지 3일 정도가 소요되었다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 발효 온도는 15℃~45℃의 범위 내에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 20℃~40℃의 범위 내에서 이루어질 수 있다. 발효 온도가 위 범위보다 낮을 경우 발효 속도가 느려질 수 있고 또한 원하지 않는 발효 산물이 생겨날 수 있으며, 발효 온도가 위 범위보다 높을 경우도 발효 미생물의 사멸에 따라 마찬가지로 발효 속도가 느려지거나 원하지 발효 산물이 생겨날 수 있다.

또한 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계 후에 숙성 단계가 추가로 포함될 수 있다. 이러한 숙성 단계는 접종된 미생물의 생장이 정지된 후에도 미생물에 의한 발효 산물이 안정화되기 위한 것인데, 이러한 숙성 단계는 5일 내지 12개월 정도 수행될 수 있다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계 후에 살균 단계가 추가로 포함될 수 있다. 이러한 살균 단계는 열 처리, 자외선 방사 등 당업계에 공지된 통상의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 발효 후에 발효물 중의 고형물의 제거를 위하여 여과 단계를 수행할 수 있으며 발효물 중의 수분을 제거하기 위하여 건조 단계를 수행할 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 전술한 바의 방법에 의하여 얻어진 탈염 용암해수 발효물에 관한 것이다.

본 발명의 탈염 용암해수 발효물은 최초에는 고형물, 수분 및 미네랄의 혼합 형태로 얻어질 것이나, 전술한 바와 같이 여과, 건조 등에 의하여 고형물과 수분 성분을 제거함으로써 미네랄 성분이 주가 된 형태로 가공될 수 있다. 이 발효물은 전술하였듯이 발효 전의 탈염 용암해수에 비하여 미네랄 성분 중 유용성분의 함량이 증가하고, 용해도가 증진되며, 세포 재생 활성(즉 세포 증식 촉진 활성), 항산화 활성, 항염증 활성 등 생리활성이 증진된 특성을 가져 식품, 화장품 특히 화장품에 첨가제로 사용될 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 전술한 탈염 용암해수 발효물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은 탈염 용암해수 발효물을 포함함으로써 세포 재생 활성, 항산화 활성, 항염증 활성 등에 있어서 발효 전의 탈염 용암해수에 비하여 증진된 활성을 보이기 때문에, 피부 탄력 증진 용도, 염증의 일종인 여드름, 아토피성 피부염 등의 개선 용도, 피부 노화 방지 용도 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 탈염 용암해수 발효물은 고형물이 제거되고 또 수분이 제거된 고형상의 발효물 중량을 기준으로 할 때, 화장품의 전체 중량 100 중량% 기준 0.1 중량% 내지 10.0 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물로 파악될 경우, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 탈염 용암해수 발효물 이외에 화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장료 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 90.0 중량 % 내지 약 99.9 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 화장료의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에 공지되어 있는 임의의 피부 보습 활성 물질, 임의의 항아토피성 피부염 활성 물질, 임의의 항여드름 활성 물질, 임의의 미백 활성 물질, 임의의 피부 탄력 증진 활성 물질 등 기능성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.

전술한 바의 본 발명에 따르면, 미네랄 성분 중 유용성분의 함량이 증가하고 용해도가 증진되며 세포 재생 활성(즉 세포 증식 촉진 활성), 항산화 활성, 항염증 활성 등 생리활성이 증진된 용암해수 발효물을 제조할 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 상기 용암해수 발효물은 피부 탄력 증진 용도, 염증의 일종인 여드름, 아토피성 피부염 등의 개선 용도, 피부 노화 방지 용도 등으로 화장품에 첨가되어 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 탈염 용암해수의 발효물 제조

<실시예 1> 탈염 용암해수의 발효물 제조예 1

제주도 동부지역 제주시 구좌읍 한동리에서 지하 150m를 굴착하여 지하(평균 해수면 기준), 44.35mm, 86.35m 및 126.35m에서 용암해수를 채수하였다. 채수한 용암해수를 한국화학시험연구원(대한민국, 서울 소재)에 의뢰하여 성분을 분석한 결과를 상기 [표 1]에서 확인할 수 있다. 그리고 상기 채취한 용암해수의 전기전도도 및 염분 농도를 측정한 결과 지하 44.35m에서 채수한 용암해수는 전기전도도가 48516.41㎲/cm이고 염분 농도는 14.4‰(permilliage), 지하 86.35m에서 채수한 용암해수는 전기전도도가 50618.4㎲/cm이고 염분 농도는 34.1‰(permilliage)이며, 지하 126.35m에서 채수한 염지하수는 전기전도도가 50474.3㎲/cm이고 염분 농도는 34.1‰(permilliage)로 나타났다.

상기 지하 86.35m에서 채수한 염지하수를 0.2㎛의 필터로 걸러낸 후, 전기투석기(ASTOM CO. LTD, 일본)에 의하여 이온 교환막을 이용 1가 이온을 제거함으로써 탈염 과정을 거쳤다. 탈염 과정을 거친 염지하수를 20ℓ 용량의 진공감압농축기를 이용하여 원시료의 10배 정도로 농축시켜 탈염 용암해수(탈염 용암해수는 탈염 미네랄수와 같은 의미가 된다)를 제조하였다.

탈염 용암해수 10kg에 당(포도당과 과당 그리고 올리고당의 혼합물) 50g 첨가하고 당이 첨가된 시료에 MRS 액체배지를 이용하여 전배양한 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 배양액(10⁷ cell/ml)을 5%(w/w) 되게 첨가하여 혼합한 후 25℃에서 3일 동안 배양하였다. 배양 후 4㎛의 여과지로 여과하여 고형물을 제거하고 액상의 발효물을 얻었다. 액상의 발효물을 동결건조시켜 최종적으로 분말상의 발효물을 얻었다.

<실시예 2> 탈염 용암해수의 발효물 제조예 2

상기 <실시예 1>과 동일한 탈염 용암해수를 사용하고 여기에 당을 첨가하여 동일 공정으로 탈염 용암해수를 발효시키되, 접종 미생물은 YM 액체배지를 이용하여 전배양한 효모인 사카로마이세스 세리비시에(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하였으며, 접종량은 상기 효모 배양액(10⁷ cell/ml) 5%(w/w) 되게 접종하였으며 25℃에서 5일 동안 배양하였다. 배양 후 4㎛의 여과지로 여과하여 고형물을 제거하고 액상의 발효물을 얻었다. 상기 <실시예 1>과 마찬가지로 액상의 발효물을 동결건조시켜 최종적으로 분말상의 발효물을 얻었다.

<실시예 3> 탈염 용암해수의 발효물 제조예 3

상기 <실시예 1>과 동일한 탈염 용암해수를 사용하고 여기에 당을 첨가하여 동일 공정으로 탈염 용암해수를 발효시키되, 접종 미생물은 효모인 사카로마이세스 세리비시에(Saccharomyces cerevisiae)와 젖산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 사용하였으며, 접종량은 상기 효모 배양액 및 상기 젖산균 배양액 혼합액을 5%(w/w) 되게 접종하였으며 25℃에서 5일 동안 배양하였다. 배양 후 4㎛의 여과지로 여과하여 고형물을 제거하고 액상의 발효물을 얻었다. 상기 <실시예 1>과 마찬가지로 액상의 발효물을 동결건조시켜 최종적으로 분말상의 발효물을 얻었다.

< 실험예 > 미네랄 성분의 분석, 용해도 측정, 세포 재생 활성, 항염 활성 및 항산화 활성 실험

<실험예 1> 미네랄 성분의 분석

발효 전후의 미네랄 함량의 변화를 보기 위하여 탈염 용암해수의 젖산균 및 효모에 의한 액상의 발효물(<실시예 3>에서 얻어진 발효물)과 발효 전의 탈염 용암해수 자체의 성분 분석을 실시하여 아래의 [표 2]에 나타내었다.

탈염 용암해수 및 그 발효물의 미네랄 함량

시험항목	용암해수 탈염수	용암해수 탈염수 발효물
Na	1050	9104
Mg	1318	1201
Ca	345	420
K	18.9	34.1
Cu	0.0054	0.002
Co	-	-
Sn	0.003	0.003
Mo	0.003	0.020
V	0.013	0.100
Ge	0.005 이하	0.008
Br	ND	ND
Sr	7.04	7.28
Ti	-	-
Ni	-	-
Si(SiO₂)	16.3	9.30
Zn	0.151	0.200
Fe	0.0047	0.030
Mn	0.001이하	0.082
Cl^-	6450	3100
B	0.50	0.60
Li	0.014	0.048
Ba	0.017	0.021
Pb	0.0074	0.0010
F	ND	ND
As	0.005이하	ND
Se	0.051	0.072
Hg	0.001이하	ND
CN^-	ND	ND
Cr	0.007	ND
Cd	0.001이하	ND
Al	0,005이하	0.005이하

[표 2]의 결과를 보면, 발효 전후의 미네랄 함량은 전반적으로 큰 차이는 없으나, 발효 후 Na과 Cl의 농도가 다소 감소하였고 이외의 유용미네랄(Ge, Ba, Se 등)의 농도는 약간 증가한 것으로 나타났다. 이것은 탈염수에 함유된 미네랄과 더불어 발효 균주 내 존재하는 미네랄 등이 부가되어 증가한 것으로 판단되었다.

<실험예 2> 용해도 측정

상기 실시예의 발효에 사용된 탈염 용암해수(발효 전의 탈염 용암해수임)를 동결건조하여 얻은 분말상의 미네랄 조성물과 상기 실시예에서 얻은 분말상의 발효물(<실시예 3>에서 얻어진 것임)의 용해도를 비교 평가하였다.

발효 전후의 용암해수 탈염수에 함유된 미네랄 조성 및 농도는 [표 2]와 같으며, 이들 발효 전후의 탈염 용암해수를 동결건조한 후 분말화 하였다. 각 함유된 미네랄에 따라서 물에 녹는 용해도가 각기 다르게 나타나기 때문에 높은 온도(70-80℃)에서 잘 녹인후 냉장온도(4℃)까지 냉각하고 여과하여 석출된 물질의 양을 기준으로 상대적인 용해도로 나타내었다. 구체적으로 각 건조분말 1g을 10ml의 증류수에 녹인 후 높은 온도(70-80℃)에서 10분간 교반 후 냉장고(4℃)에서 냉각하였다. 30분 후 시료를 꺼내어 여과(Whatman사, GF/C)하고, 여지를 건조기(60℃)에서 건조한 후 불용성 미네랄의 중량을 측정하여 상대적인 용해도로 환산하였다. 환산식은 다음과 같다.

용해도(%) = [전체 미네랄 중량(g) - 불용미네랄 중량(g)]/[전체미네랄 중량(g)] x 100

용암해수 탈염수 발효 전후 미네랄 용해도

발효 전 용해도(%)	발효 후 용해도(%)
96.9	98.7

평가 결과 발효 후의 용해도가 발효 전의 용해도보다 뚜렷하게 높은 것으로 나타났는데, 이는 양이온으로 나타나는 용암해수에 함유된 미네랄들이 발효에 따른 유기산, 아미노산 등의 대사산물과의 반응에 의해 안정적인 형태로 변환된 것에 기인하는 것으로 판단되었다.

<실험예 3> 세포 재생 활성 실험, 항염 활성 실험 및 항산화 활성 실험

<실험예 3-1> 실험 방법

<1> 세포 배양

본 연구에서는 생쥐대식세포주 RAW 264.7 세포와 CHO 세포(chinese hamster overy) 세포들을 세포주은행(서울)로부터 공여받아 사용하였다. RAW 264.7는 penicillin (100 unit/mL), streptomycin (100 ㎍/mL) 그리고 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 액을, CHO 세포는 Ham's F-12 배양액을 사용하였으며, 5% CO₂ 및 37℃가 유지되는 배양기에서 배양되었다. 세포는 T75 배양용기에서 배양된 후 우태아혈청이 제거된 serum-free 배양액에서 일정시간 동안 전배양(serum-starvation)하고 난 뒤 시료의 처리실험에 사용하였다.

<2> 배양세포 내 활성산소물질( Reactive Oxygen Species , ROS )의 측정

ROS의 측정을 위해서 세포막 투과성 ROS 탐색자(probe)인 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (H₂DCFDA)를 사용하여 세포질 내 ROS의 생성과 축적을 측정하였다. 배양이 끝난 세포를 PBS로 세척한 후 1mM의 H₂DCFDA를 함유한 phenol red-free D-Mem/F-12 배양액에서 37℃, 15분 및 30분간 배양한 후 multiwell 형광측정기(Tecan, Austria)를 이용하여 485nm/535nm의 파장에서 형광의 강도를 측정하였다.

<3> Lactic dehydrogenase ( LDH ) 활성도 측정

세포에 대한 비특이적(nonspecific) 상해의 지표가 되는 LDH 활성도를 측정하여 시료가 배양세포에 독성을 나타내는 지를 조사하였다. 시료처리가 끝난 세포배양액과 LDH assay reagent (Takara, Japan)를 동량으로 섞어 10분간 상온에서 반응시킨 뒤 492 nm에서의 흡광도를 측정하였으며 이때 기저흡광도는 배양에 사용하지 않은 배양액으로부터 측정하고 각 실험군의 흡광도로부터 기저흡광도를 제한 값을 실제 LDH 활성도로 계산하였다.

<4> MTT assay

세포독성 또는 세포의 생존능은 mitochondria의 활성을 측정하기 위하여 MTT 측정법을 사용하였다. 시료의 처리가 끝난 뒤 세포 배양액과 동량의 MTT reagent(1 mg/ml in D-Mem)를 섞어 37℃에서 30분 동안 더 배양한 후 상층액을 제거하고 200 ㎕ isopropanol을 넣어 발색반응을 유도하였으며 흡광도는 570-690nm에서 측정하였다.

<5> Nitric Oxide ( NO ) 측정

RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 배양액 내 농도는 Sigma 사의 Griess regent를 사용하여 측정하였다. 표준용액 및 배양액을 동량의 Griess regent를 섞어 10분간 반응시킨 뒤 ELISA reader(Tecan, Austria)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

<실험예 3-2> 실험 결과

<1> CHO - IR 세포를 이용한 세포 재생 활성 실험 결과

CHO-IR 세포는 serum-free 배양액에서 24시간 이상 배양하면 영양결핍성으로 세포사멸이 유발되어 LDH의 분비가 증가하며, 인슐린이 처리되면 세포사멸이 억제되어 결과적으로 LDH 분비가 억제된다(Park D., et al., Biochemistry 2000, 39:12513-12521).

따라서 CHO-IR 세포를 serum-free 배양액에서 3 시간 동안 전배양한 후에 인슐린(10nM)(양성대조군) 또는 상기 실시예에서 얻어진 분말상의 발효물(<실시예 3>에서 얻어진 것임)(0.125 및 0.25 mg/mL)을 처리하고 1일 동안 배양하여 LDH 활성도를 측정하였다.

결과를 [표 4]에 나타내었다. [표 4]를 참조하여 보면, 양성대조군인 인슐린(Ins)이 처리되었을 경우 세포사멸이 억제되어 LDH 분비가 억제됨을 확인할 수 있으며, <실시예 3>의 발효물이 처리될 경우 대체적으로 농도 의존적으로 LDH 분비가 억제됨을 알 수 있다. 그리고 비발효 탈염 용암해수(동결건조하여 얻은 분말상의 미네랄 조성물임)는 탈염 용암해수 발효물과 비교하여 상대적으로 약한 세포사멸 억제 효과를 보임을 알 수 있다.

탈염 용암해수 발효물의 세포 재생 실험 결과

시료	LDH활성(%)
대조구	100
인슐린 처리구	40
비발효 탈염미네랄 처리구(0.125mg/ml)	90
비발효 탈염미네랄 처리구(0.25mg/ml)	88
발효 탈염미네랄 처리구(0.125mg/ml)	88
발효 탈염미네랄 처리구(0.25mg/ml)	75

<2> CHO - IR 세포를 이용한 항산화 활성의 측정

배양 중인 CHO-IR 세포에 상기 실시예에서 얻어진 분말상의 발효물(<실시예 3>에서 얻어진 것임)(0.125, 0.25, 0.5 및 1.0 mg/mL)을 30분 동안 전처리하고 이어서 강력한 활성산소종의 일종인 2mM의 과산화수소와 활성산소종의 형광표지인자인 10μM의 H₂DCFDA를 처리하였다. 15분 후에 H₂DCFDA가 ROS 의존적으로 가수분해되면서 발생하는 형광의 강도를 측정하여 [표 5]에 나타내었다.

[표 5]를 참조하여 보면, 과산화수소의 처리로 증가한 형광의 강도가 실시예의 발효물(FM01)의 처리로 대체적으로 감소하는 경향을 보임을 알 수 있다.

한편 발효 전의 탈염 용암해수(동결건조하여 얻은 분말상의 미네랄 조성물임)는 실시예의 발효물보다는 약한 항산화 활성을 보였다.

탈염 용암해수 발효물의 항산화 활성

시료	활성산소(ROS)활성(%)
대조구	29
비첨가구(0mg/ml)	100
비발효 탈염미네랄 처리구(0.12mg/ml)	90
비발효 탈염미네랄 처리구(0.25mg/ml)	88
비발효 탈염미네랄 처리구(0.5mg/ml)	82
비발효 탈염미네랄 처리구(1.0mg/ml)	82
발효 탈염미네랄 처리구(0.12mg/ml)	71
발효 탈염미네랄 처리구(0.25mg/ml)	63
발효 탈염미네랄 처리구(0.5mg/ml)	55
발효 탈염미네랄 처리구(1.0mg/ml)	55

<3> RAW 264.7 세포를 이용한 항염 활성의 측정

RAW 264.7 세포를 혈청이 제거된 배양액에서 3시간 동안 전배양한 후 실시예의 발효물(<실시예 3>에서 얻어진 것임)(0.125 및 1.0 mg/mL)을 30분간 처리하였으며 LPS와 IFN-g를 12시간 동안 처리한 후에 NO 농도를 측정하였다.

결과를 [표 6]에 나타내었는데, LPS의 처리로 증가한 NO의 농도가 실시예의 발효물의 처리로 대체적으로 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있다. 한편 발효 전의 탈염 용암해수(동결건조하여 얻은 분말상의 미네랄 조성물임)의 경우는 실시예의 발효물보다는 약한 항염 활성을 보였다.

탈염 용암해수 발효물의 항염 활성

시료	MTT assay	NO농도(μmoles/l)
대조구(serum-free)	98.7	36.5
무첨가구(LPS단독처리구)	100.4	46.8
비발효 탈염미네랄 처리구(0.125mg/ml)	104.5	45.8
비발효 탈염미네랄 처리구(1.0mg/ml)	107.4	45.1
발효 탈염미네랄 처리구(0.125mg/ml)	112.4	43.1
발효 탈염미네랄 처리구(1.0mg/ml)	117.8	39.5

참고로 MTT assay에 의한 세포독성 결과를 [표 6]에 함께 나타내었다. [표 6]에서 보여지듯이 실시예 발효물의 항염 활성은 세포 독성에 의한 결과가 아님을 알 수 있다.

Claims

(a) 탈염 용암해수에 접종되는 미생물의 탄소원과 에너지원을 첨가하여 혼합하는 단계, 및
(b) 그 혼합물에 젖산균 및 효모로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 미생물을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하되,
상기 젖산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이고,
상기 효모는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cereviciae)인 것을 특징으로 하는 탈염 용암해수 발효물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 접종되는 미생물의 탄소원과 에너지원은 올리고당, 유당, 포도당, 과당, 설탕 또는 이들의 혼합물이고, 그것의 첨가량은 탈염 용암해수 100 중량부 기준 0.1 중량부 내지 10 중량부인 것을 특징으로 하는 탈염 용암해수 발효물의 제조 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서
상기 (b) 단계의 발효는 20℃~40℃의 온도 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 탈염 용암해수 발효물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계 후에 발효물 중의 고형물의 제거를 위하여 여과 단계 및 발효물 중의 수분을 제거하기 위하여 건조 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 탈염 용암해수 발효물의 제조 방법.
제1항, 제2항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항 기재의 방법에 의하여 얻어진 탈염 용암해수 발효물.
제10항 기재의 탈염 용암해수 발효물을 포함하는 화장료 조성물.