CN113692273B - 源自于熔岩海水的矿物质与源自于皮肤微生物的核苷酸的结合物的制造方法以及利用所述结合物的功能性皮肤微生物化妆品组合物 - Google Patents

源自于熔岩海水的矿物质与源自于皮肤微生物的核苷酸的结合物的制造方法以及利用所述结合物的功能性皮肤微生物化妆品组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质‑核苷酸结合物的制造方法，所述矿物质‑核苷酸结合物没有皮肤毒性且具有皮肤细胞再生、皮肤屏障强化、皮肤舒缓效果以及皮肤常居菌群维持功能，因此可以作为含有所述结合物的功能性化妆品组合物或皮肤外用剂等形态提供。

Description

源自于熔岩海水的矿物质与源自于皮肤微生物的核苷酸的结 合物的制造方法以及利用所述结合物的功能性皮肤微生物化 妆品组合物
技术领域
本发明涉及一种为了同时解决导致皮肤老化(skin aging)的内在因素(intrinsic factors)和外在因素(extrinsic factors)而利用天然矿物质的含量丰富的熔岩海水作为培养用水对有益皮肤微生物(dermabiotics)进行高浓度培养，接下来对菌体进行回收并通过熔岩海水矿物质浓缩水再培养而在菌体内生成大量的矿物质-核苷酸，然后通过热压提取法制造出热稳定性优秀的矿物质-核苷酸结合物(conjugate)的方法。此外，在本发明中提供一种在热压提取之后通过冷却离心分离选择性地将诱发皮肤细胞的炎症反应的菌体细胞壁成分(如细胞壁、脂多糖以及脂蛋白等)通过膜过滤法进行去除并借此对矿物质-核苷酸进行提纯的方法，而通过如上所述的方法制造出的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物具有热稳定性，而且具有对与皮肤屏障强化相关的功能性蛋白的表达以及第三皮肤层即皮肤微生物组的调节功能。
背景技术
皮肤是由表皮层、真皮层以及角质层等三重多层结构构成，其中，表皮层位于皮肤角质层的正下方，起到渗透屏障、先天性免疫、对紫外线的保护、伤口修复、维生素D的合成等功能，而真皮层是起到向表皮供应营养成分并实现皮肤再生的层，可以起到抑制病原体侵入、伤口修复、皮肤结构以及弹性的维持等功能。位于皮肤结构中的最外侧的角质层是由厚度约为0.5mm的极薄的层构成。由25～30个凋亡的皮肤细胞构成的角质层可以起到对人体皮肤进行保护的作用，角质形成细胞(keratinocyte)的分化由基底细胞的分裂-在棘细胞中的合成-在颗粒细胞中的自体溶解过程-在角质细胞中的重建过程等四个步骤构成并形成皮肤屏障。如上所述的形成皮肤屏障的过程，以年轻皮肤为基准发生大约四周的细胞再生(regeneration)。皮肤可以起到从来自于外部的物理、化学刺激保护人体的作用，但是当持续性地暴露在皮肤老化的代表性外在因素即紫外线时，会导致皮肤细胞的脱氧核糖核酸(DNA)的损伤以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，从而对皮肤的胶原蛋白合成进行抑制并促进其分解，最终导致皮肤老化并生成皱纹。皮肤老化的内在因素取决于从父母遗传下来的遗传因素，已经确定这是导致自然老化的原因，但是根据被称之为第三皮肤层的皮肤微生物组(skin microbiome)的变化，其皮肤老化的速度以及状态也将发生变化。
此外，已经有报告指出，通过统计学方式可以确认皮肤状态以及类型会根据地区、人种以及年龄而存在差异。Kompaore等(Skin Pharmacol.,1993；6:200-207)在报告中指出，对亚洲人、白人以及黑人的经皮水分损失量进行测定的结果表明，与白人以及亚洲人相比，黑人的经皮水分损失量更高，而Man等(Skin Pharmacol.Physiol.,200；22:190-199)在报告中指出，对中国男性以及女性的不同年龄段的皮脂量进行测定的结果表明，女性的额头与男性的额头相比其皮脂量较低，而且女性在30岁以后呈现出大幅减小的倾向，但男性在直至约50岁为止呈现出稳定的倾向之后再逐渐减小。Marrakchi等(Contactdermatitis,2007；57:28-34)在报告中指出，对由24～34岁构成的青年人群以及由66～83岁构成的老年人群的水分量、皮脂量等进行比较的结果表明，青年人群的额头、脸颊的水分量高于老年人群，而皮脂量在青年人群和老年人群之间并没有呈现出较大的差异。
不同国家皮肤特征库构建事业报告书指出，韩国人的女性皮肤类型的顺序为复合性>干性>中性>油性，而男性皮肤类型的顺序为油性>复合性>中性>干性。
最近备受关注的研究主题即皮肤微生物组(Skinmicrobiome)是指分布于皮肤的常居菌群的生态系统，有报告指出主要是如葡萄球菌(Staphylococcus)属、丙酸菌(Propionibacterium)属等存在于皮肤的微生物通过与皮肤细胞的相互作用而维持均衡并保持健康的皮肤状态。构成皮肤微生物组的常居菌群会根据年龄段、女性和男性、人种以及生活区域等而呈现出差异，有报告指出尤其是不同年龄段的皮肤优势种可以维持皮肤健康。
在最近的产业领域，开发出了利用微生物作为核心源材料使用的化妆品，尝试通过将微生物制造成裂解物形态(lysate)并适用于化妆品，可以规避因为微生物大小而导致的皮肤渗透问题、因为防腐剂而导致的凋亡问题以及竞争性抑制问题，从而通过与皮肤内部的免疫收容体直接反应而改善皮肤屏障。在市售的利用微生物的原材料中，将如双歧杆菌(Bifidobacterium)属或乳杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌作为适用于皮肤的原材料进行销售，其中，二裂酵母发酵浓缩物等作为代表性的示例，将乳酸菌细胞裂解物作为主要成分。但是，细胞壁包含细胞构成成分中已知与皮肤发生免疫反应的成分即肽聚糖(peptidoglycan)、脂多糖(lipopolysaccharide)、脂蛋白(lipoprotein)等，而在如上所述的成分过多时可能会导致如皮疹、特应性皮炎以及红斑等皮肤问题。此外，因为细胞质内的有效成分即微生物核苷酸(bacterial nucleotides)的热稳定性为以熔解温度(Tm)值(脱氧核糖核酸(DNA)双螺旋结构解开的温度)为基准的70～105℃，因此在适用可以完全破坏细胞壁的温度即121℃以上的温度时，会因为有效成分发生改性而无法起到改善皮肤屏障的帮助作用。此外，为了达成皮肤保护作用而应用微生物原材料时的另一个问题在于，在将细胞裂解物适用于皮肤时，因为对于皮肤常居菌群并不是选择性生长因子(growthfactors)，因此如果皮肤有害菌将其作为生长营养源使用，则会导致健康的皮肤微生物组的均衡的破坏。因为目前已经注册成为国际化妆品原材料的各种微生物细胞裂解物中含有大量的可能会对人类的皮肤微生物组造成影响的调整剂单位的成分，因此并不能解决皮肤微生物组的不均衡问题。
熔岩海水是一种海水在被玄武岩层以及砂泥质层自然过滤的同时渗入到地层深处的长时间陈化的水，是一种只有济州岛才有的独特的水资源，在济州自从1980年代开始就因为熔岩海水的低温性以及洁净性等特性而将熔岩海水积极地作为比目鱼养殖场的饲养用水使用，而且从5～6年前开始在健康以及美容等方面作为如桑拿浴等的用水使用并备受人们的关注。熔岩海水根据其使用目的，可以使用对盐分进行去除的脱盐熔岩海水或以原始采集状态直接使用。
熔岩海水与一般的海水、深层水或三多水相比，不仅含有更多的如钠、镁、钙以及钾等矿物质，还含有更多的一般有益矿物质成分(如铁、锰、锌、钼、硒等)。尤其是，熔岩海水中所含有的具有胰岛素分泌的稳定化或如糖尿病以及高血脂等的改善效果的钒，具有促进血液循环和强化免疫力以及抗癌作用的锗，具有脂肪的氧化作用抑制、维护心脏以及肝脏的相乘效应、自由基清除能力和抗癌、不孕不育、衰老以及胆固醇数值改善效果的硒，是海洋深层水中也未曾报告过的熔岩海水所独有的特征。进而，所述矿物质处于离子化的状态，而离子化的矿物质可以更加轻易地被人体或其他动物消化吸收。此外，熔岩海水是未曾检测出如大肠杆菌、硝态氮、正磷酸盐以及分类等的洁净的地下水资源，因为不会检测到如砷、汞以及镉等有害成分或只检测到极微量的铅，因此是在适用于产业化时没有任何阻碍因素的洁净原料。尤其是，熔岩海水中所包含的如镁以及钙等矿物质是皮肤微生物的增殖所必需的元素，也是推荐人体摄入的必需的营养成分。
所洗脱出的脱氧核糖核酸(DNA)在分解要素中具有基于温度的改性值(熔解温度，melting Temperature，Tm)，这是指双链脱氧核糖核酸(Double strand DNA)转换成单链脱氧核糖核酸(single strand DNA)的温度变化中的中间值。在细胞裂解之后洗脱出的脱氧核糖核酸(DNA)的目前已知的熔解温度(Tm)值为70～105℃，在所述温度条件下会分解成核苷酸，而这是由嘌呤以及嘧啶构成，可以通过内部氢键结合而达成核苷酸之间的稳定化。但是所分解的核苷酸的构成要素中的磷酸基呈现出强负电荷，因此相互之间具有排斥力。在对具有如上所述的特征的核苷酸进行提取时，为了对细胞壁以及细胞质进行裂解，即使是在高于熔解温度(Tm)值即70～105℃的温度即121℃的热压条件下，核苷酸也需要维持稳定的状态。
为此，本发明人确认了从利用熔岩海水培养的皮肤微生物分离出的矿物质-核苷酸与源自于利用现有的一般培养基培养的皮肤微生物的核苷酸相比可以显著提升皮肤屏障强化以及皮肤损伤抑制功能，从而完成了本发明。
先行技术文献
专利文献
(专利文献1)大韩民国注册专利第10-1347694号(发明的名称：脱盐熔岩海水的发酵物的制造方法和通过所述方法获得的发酵物以及利用所述发酵物的化妆品组合物，申请人：财团法人济州科技园，注册日期：2013年12月27日)
(专利文献2)大韩民国注册专利第10-1693574号(发明的名称：作为有效成分包含间歇灭菌化乳酸菌死菌体的皮肤保湿或皱纹改善用组合物，申请人：韩国韩医学研究员，注册日期：2017年01月02日)
非专利文献
(非专利文献1)Zakostelska Z,Kverka M,Klimesova K,Rossmann P,Mrazek J,et al.(2011)Lysate of Probiotic Lactobacillus casei DN-114 001AmelioratesColitis by Strengthening the Gut Barrier Function and Changing the GutMicroenvironment.PLoS ONE 6(11)
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以将天然矿物质含量丰富的熔岩海水在不经过单独的前处理的情况下作为增殖皮肤微生物的培养用水使用，从而在皮肤微生物的细胞质内蓄积源自于熔岩海水的天然矿物质的同时诱导生成矿物质-核苷酸结合物的技术。
所述矿物质-核苷酸结合物是通过皮肤微生物的热压提取工程进行制造，因此其热稳定性优秀，而且可以借此实现更加优秀的皮肤屏障强化功能以及对紫外线的皮肤细胞的保护效果，并通过调节皮肤微生物组而对皮肤状态进行改善。
本发明涉及一种源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的制造方法，包括：
(第一步骤)通过利用将熔岩海水作为培养用水使用的培养基对皮肤微生物进行培养而获得第一次培养液的步骤；
(第二步骤)通过在从所述培养液对菌体进行回收之后利用熔岩海水矿物质浓缩水进行培养而获得第二次培养液的步骤；以及，
(第三步骤)通过对所述第二次培养液进行热压提取以及冷却提纯而对包含矿物质-核苷酸的上清液进行回收的步骤。
本发明的特征在于：所述第一步骤中的培养基，是作为构成成分包含葡萄糖、酵母提取物、大豆蛋白胨以及酪蛋白并在将所述构成成分溶解到包含30～70％(v/v)的熔岩海水的水中之后进行灭菌的培养基。较佳地，第一步骤中的培养基，可以是以总体积1l为基准包含1～5％(w/v)的葡萄糖、0.5～5％(w/v)的酵母提取物、0.5～5％(w/v)的大豆蛋白胨以及0.5～3％(w/v)的酪蛋白状态将各个成分溶解到包含30～70％(v/v)的熔岩海水的水中之后进行灭菌制备的增殖培养用培养基。
在所述第一步骤中进行培养时，可以采用通过滴入10至50％(w/v)的葡萄糖以及10至50％(w/v)的氢氧化钠混合溶解液而在培养过程中将pH维持在6.0～7.5的方法。所述混合溶解液，可以是分别将葡萄糖溶液以及氢氧化钠溶液以1:0.5至1:2的体积比进行混合的产物。
在所述第一步骤的培养中所适用的皮肤微生物，可以是由乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、乳球菌属(Lactococcus sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、片球菌属(Pediococcus sp.)、魏斯氏菌属(Weissella sp.)、酵母菌属(Saccharomyces sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)以及丙酸菌属(Propionibacterium sp.)构成的组中的一个以上的菌株。
本发明的特征在于：所述第二步骤中的熔岩海水矿物质浓缩水，是通过以每1L包含钙220mg以上、镁1,130mg以上以及硒0.013mg以上的状态对熔岩海水进行减压浓缩或渗透浓缩而获得的矿物质水。
所述第三步骤中的热压提取，可以在120～130℃、0.13～0.30MPa下执行15～200分钟。
所述第三步骤中的冷却提纯，可以通过在维持3～5℃的状态下以3,000～8,000rpm执行10～30分钟的离心分离的方式执行，接下来，可以通过利用具有200nm以下的气孔大小(pore size)的纳米膜的过滤工程对矿物质-核苷酸结合物进行收集。所述纳米膜的气孔大小较佳地可以是20～200nm。
所述第三步骤中的上清液内的核苷酸的浓度范围可以是200～2,000μg/ml。
在所述第三步骤中的上清液内的矿物质-核苷酸中，包含钙50～200mg/L、镁300～800mg/L以及硒0.001～0.01mg/L为宜。
本发明提供一种通过所述方法制造出的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物，并提供包含所述结合物的皮肤屏障强化用化妆品组合物。
本发明的特征在于：所述结合物或含有所述结合物的化妆品组合物通过增强丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT，Serine palmitoyl transferase)、丝聚合蛋白(Filaggrin)以及紧密连接相关蛋白-1(Claudin-1)的表达而强化皮肤屏障。
本发明的特征在于：所述结合物或含有所述结合物的化妆品组合物还具有对紫外线(UV)损伤的皮肤细胞的修复功效。本发明的特征在于：所述化妆品组合物通过增强过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α，Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α)的表达而达成皮肤细胞的修复功效。
所述结合物或含有所述结合物的化妆品组合物，还可以具有对皮肤微生物组的菌群进行调节的功效。尤其是，具有增加作为所述皮肤微生物组的皮肤常居菌群即表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)以及痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)的菌数或维持其稳定性的功效。
本发明涉及一种源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的制造方法，以及以含有所述结合物的方式制造出的皮肤屏障强化功能、皮肤微生物组调节功能以及热稳定性优秀的化妆品组合物。
为此，将没有进行脱盐的熔岩海水作为用于皮肤微生物培养的第一次培养用水使用，从而通过天然矿物质对皮肤微生物的高浓度增殖进行诱导，接下来对皮肤微生物菌群进行回收并利用熔岩海水矿物质浓缩水进行第二次培养。借此，可以在皮肤微生物细胞质内蓄积矿物质，增加细胞质内所存在的如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核糖体、内质网等细胞活性化物质即核苷酸以及构成体的物质量，并获得熔岩海水内的矿物质离子与核苷酸的结合物，并通过利用热压提取对其进行收集而以高浓度对热稳定性优秀的矿物质-核苷酸结合物进行收集。接下来，通过利用气孔大小为200纳米(nanometer)以下的纳米膜过滤器的过滤工程有效地去除对皮肤以及微生物组的毒性和原料的发酵气味生成造成影响的皮肤微生物的细胞壁、细胞质、蛋白质以及蛋白质盐成分，从而制造出经过提纯的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物，并将其作为没有皮肤毒性且可以实现皮肤细胞再生、皮肤屏障强化、皮肤舒缓效果以及皮肤常居菌群维持的化妆品组合物以及其他医药品的皮肤外用剂等使用。
附图说明
图1是对适用本发明的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的制造方法进行图示的工程图。
图2是对利用实施例1以及比较例1的不同熔岩海水浓度的培养基进行培养的培养液内的皮肤微生物活菌数量以及从所述皮肤微生物提取出的核苷酸之间的相关关系进行比较的结果图表。
图3是对在作为培养用水利用熔岩海水30(v/v)％进行培养的第一次培养液中利用一般自来水或熔岩海水矿物质浓缩水执行差别化的第二次培养之后所获得的皮肤微生物在不同的热压提取时间下收集到的上清液内的核苷酸的浓度进行比较的结果图表。
图4是通过噻唑蓝比色法(MTT assay)对源自于利用熔岩海水培养的皮肤物生物的矿物质-核苷酸结合物直至5(v/v)％的处理浓度均没有细胞毒性进行确认的结果图表。
图5是通过JC-1染色(staining)测定对源自于利用熔岩海水培养的皮肤物生物的矿物质-核苷酸结合物借助于被中波紫外线(UVB)照射的成纤维细胞(fibroblast cell)的线粒体功能(mitochondrial function)的活性化而达成的细胞的修复效果通过基因表达进行确认的结果。
图6是对源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物在利用中波紫外线(UVB)进行处理的成纤维细胞(fibroblastcell)中增加在皮肤老化时所减少的过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)的表达的结果进行确认的图表。
图7是对源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物可通过神经酰胺(ceramide)合成相关酶丝氨酸棕榈先转移酶(Serine palmitoly transferase，SPT)基因表达(a)；丝聚合蛋白(filaggrin)基因表达(b)以及蛋白质表达(c)；以及对紧密连接蛋白(Tight Junction protein，TJ protein)的紧密连接相关蛋白-1(claudin-1)基因表达(d)；的促进功能达成的皮肤屏障强化功能进行确认的结果。
图8是对源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物对皮肤常居菌群的增殖效果进行确认的评估结果。
图9是利用现有技术的菌体裂解物内的核苷酸(制造例2)以及源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的大量生产样本照片。
图10a以及图10b是通过紫外线(UV)值对利用现有技术的菌体裂解物内的核苷酸(制造例2)以及源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的纯度进行测定的结果。
图11是利用可作为皮肤微生物适用的多种菌株制造出的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的丝聚合蛋白(filaggrin)基因表达比较对皮肤屏障强化功效进行确认的结果。
具体实施方式
本发明涉及一种源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的制造方法。
较佳地，所述制造方法，包括：
(a)利用熔岩海水的高浓度皮肤微生物生产步骤
通过准备将包含30～70％(v/v)的熔岩海水的水作为培养用水制造出的培养用培养基并接种菌体而获得1x1010CFU/ml单位以上的活菌培养液的第一次培养步骤；
(b)皮肤微生物菌体内的矿物质-核苷酸结合物形成步骤
在从所述培养液回收皮肤微生物菌体之后，将所回收的菌体悬浮在只含有熔岩海水矿物质浓缩水的有限培养基(包含钙220mg/L、镁1,130mg/L以及硒0.013mg/L以上)中并进行培养，从而在菌体内形成矿物质-核苷酸结合物的第二次培养步骤；
(c)通过热压提取、冷却提纯的矿物质-核苷酸结合物的回收步骤
通过将第二次培养液利用0.12MPa以上的热压提取条件对细胞进行裂解而洗脱出矿物质-核苷酸，接下来将裂解的菌体的细胞壁、细胞质内的蛋白质以及糖蛋白质成分在3～5℃下进行冷却沉淀并进行离心分离之后利用纳米膜进行过滤，从而制造出源自于利用高纯度的熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物。
所述(a)步骤中的培养基，较佳地，可以是可用于对皮肤微生物菌株进行培养的任意的培养基，更较佳地，可以是作为其构成成分包含葡萄糖、酵母提取物、大豆蛋白胨以及酪蛋白并将所述构成成分溶解到包含30～70％(v/v)的熔岩海水的水中之后进行灭菌制备的培养用培养基。
更较佳地，所述第一步骤中的培养基，可以是以总体积1l为基准包含1～5％(w/v)的葡萄糖、0.5～5％(w/v)的酵母提取物、0.5～5％(w/v)的大豆蛋白胨以及0.5～3％(w/v)的酪蛋白状态将各个成分溶解到包含30～70％(v/v)的熔岩海水的水中之后进行灭菌制备的增殖培养用培养基。所述培养基的灭菌，是在121～123℃下执行30分钟为宜。在所述第一步骤的培养中适用的皮肤微生物，可以是由乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、乳球菌属(Lactococcus sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、片球菌属(Pediococcus sp.)、魏斯氏菌属(Weissellasp.)、酵母菌属(Saccharomyces sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)以及丙酸菌属(Propionibacterium sp.)构成的组中的一个以上的菌株，较佳地可以从由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、两岐双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、屎链球菌(Streptococcus faecium)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、肉色明串珠球菌(Leuconostoc carnosum)、柠檬色明串珠球菌(Leuconostoc citreum)、伴气明串珠球菌(Leuconostoc gasicomitatum)、冷生明串珠球菌(Leuconostoc gellidum)、仁荷明串珠球菌(Leuconostoc inhae)、朝鲜泡菜明串珠球菌(Leuconostoc kimchii)、乳明串珠球菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠球菌(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)、类肠膜明串珠球菌(Leuconostocparamesenteroides)、食物魏斯氏菌(Weissella cibaria)、混淆魏斯氏菌(Weissellaconfusa)、韩国魏斯氏菌(Weissella koreensis)、土壤魏斯氏菌(Weissella soli)、绿色魏斯氏菌(Weissella viridescens)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、卡氏酵母菌(Saccharomycescarlsbergensis)、鲍氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)等构成的组中选择一个以上。所述第一步骤中的培养条件，为70～150rpm、30～40℃条件下的18～24小时为宜。
所述(b)步骤中的菌体回收，可以采用如离心分离以及超滤(ultrafiltration)等方式，较佳地采用离心分离并在5,000～8,000rpm下执行10～30分钟为宜。在将所回收的菌体利用灭菌蒸馏水进行两次洗涤(washing)之后最终悬浮到熔岩海水矿物质浓缩水(有限培养基)中。接下来，将悬浮到有限培养基中的菌体在30～45℃下进行15～20小时的第二次培养，从而形成矿物质-核苷酸。更较佳地，在接种菌体之后在37℃下进行16小时的培养。因为有限培养基是指不包含充分的增殖所需要的营养成分，而是其成分受到限定的培养基，因此在本发明的实施例中作为有限培养基，在将对熔岩海水通过减压或渗透浓缩方式进行浓缩的熔岩海水矿物质浓缩水灭菌之后作为有限培养基使用。
接下来，在有限培养基中还可以包含可在化妆品领域、高分子以及低分子功能性生物原材料等中使用的任意的功能性液状或粉末生物原材料。
本发明的特征在于：为了对所形成的矿物质-核苷酸进行回收，所述(c)步骤中的热压提取条件为可对皮肤微生物细胞进行裂解的15～200分钟的时间、120～130℃的温度以及0.12～0.30MPa的压力条件。在所述条件下对熔岩海水矿物质-核苷酸结合物(conjugate)外的细胞壁、细胞质内的蛋白质成分进行热改性，接下来将经过热改性的成分以3～5℃进行冷却沉淀并在3,000～8,000rpm下进行10～30分钟的离心分离而对矿物质-核苷酸进行回收，然后利用纳米膜对残余成分进行去除，从而制造出源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物。通过如上所述的过程，可以对在适用于皮肤时可能会诱发皮疹、红斑以及特应性皮炎的源自于菌细胞壁、细胞质以及微生物的蛋白质进行去除，从而减少对皮肤以及皮肤常居菌的副作用。在所述离心分离中，作为可去除通过热压提取条件裂解的细胞壁、细胞质中所包含的球粒的条件，例如可以采用3,000～8,000rpm，而作为纳米膜利用200纳米(nanmoter)以下的膜过滤器进行过滤，从而提供仅对源自于皮肤微生物的矿物质-核苷酸进行提纯的制造方法。
在本发明中，较佳地提供一种具有皮肤屏障强化、皮肤活力提升以及皮肤伤口治愈特性的皮肤改善用皮肤微生物化妆品组合物。
本发明可以提供一种通过如上所述的本发明的制造方法制造出的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物。
在所述化妆品中，可以包含通常所使用的任意成分。例如，可以包含如乳化剂、增稠剂、乳剂、表面活性剂、润滑剂、醇类、水溶性聚合物、胶凝剂、稳定剂、维生素、无机盐类、乳化剂以及香料等一般的辅助成分。所述成分可以根据其剂型或使用目的，在不破坏化妆品的固有效果的范围内选择其添加量。例如，所述成分的添加量可以是相对于组合物总重量的0.1～100重量％，较佳地可以是0.1～30重量％，但是并不限定于此。
此外，化妆品的种类并不受到特殊的限定，例如可以是如化妆水、乳液、凝胶、面霜、精华液、面膜、安瓿、洗液、清洁剂、香皂、身体用产品类、香皂、经由等皮肤护理化妆品；如口红、粉底等彩妆化妆品；护发化妆品等，但是其剂型并不受到特殊的限定。
接下来，为了帮助更加轻易地理解本发明，将对本发明的较佳实施例进行详细的说明。但是，在此进行说明的比较例以及实施例只是用于对本发明进行例示，本发明的范围并不应该解释为因此而受到限定。相反，只是为了向相关从业人员更加充分地传递本发明的思想，从而使得在此进行介绍的内容更加彻底和完整。
<制造例1：在包含一般自来水的基本培养基中的皮肤微生物培养液的制造>
在本发明中，作为用于对皮肤微生物菌株进行培养的基本培养基(一般自来水培养基)，将各个成分以每1l包含葡萄糖3％(w/v)、酵母提取物2％(w/v)、大豆蛋白胨2％(w/v)以及酪蛋白1％(w/v)的状态溶解到水(蒸馏水)中并在121～123℃下进行了30分钟的灭菌。
利用如上所述的经过灭菌的一般自来水培养基，将皮肤微生物物种培养液接种到发酵槽的经过灭菌的基本培养基中，并在100rpm以及37℃的条件下进行20小时的培养，其中，通过按照一定的时间间隔滴入将40％(w/v)的葡萄糖以及40％(w/v)的氢氧化钠以1:1的体积比进行混合的水溶液(接下来，称之为葡萄糖-氢氧化钠溶解液)而在将pH维持在5.0～7.5的状态下进行了培养(执行补料分批培养(Fed-batch culture))。*皮肤微生物物种培养液：下述内容中的皮肤微生物物种培养液是指将乳酸菌即植物乳杆菌菌株在乳酸杆菌MRS肉汤(Lactobacilli MRS Broth，BD)中在37℃条件下进行24小时培养的产物。
<制造例2：源自于皮肤微生物的核苷酸的制造>
通过对在制造例1中获得的皮肤微生物培养液进行离心分离(6,000rpm、20分钟)而仅对菌体进行回收之后利用灭菌自来水(蒸馏水)进行洗涤(washing)，并重复执行一次所述过程。
接下来，将菌体悬浮到经过灭菌的自来水中，并在37℃下进行16小时的第二次培养。接下来，通过以121℃的温度以及0.15MPa的压力条件执行120分钟的热压提取而对皮肤微生物细胞进行裂解，并在4℃下进行冷却(chilling)之后将皮肤微生物裂解液利用离心分离(6,000rpm、20分钟)的方式对源自于皮肤微生物的核苷酸进行回收。
<制造例3：源自于皮肤微生物的核苷酸的提纯物的制造>
通过对在制造例1中获取的皮肤微生物培养液进行离心分离(6,000rpm、20分钟)而仅对菌体进行回收之后利用灭菌自来水(蒸馏水)进行洗涤(washing)，并重复执行一次所述过程。
接下来，将菌体悬浮到经过灭菌的自来水中，并在37℃下进行16小时的第二次培养。接下来，通过以121℃的温度以及0.15MPa的压力条件执行120分钟的热压提取而对皮肤微生物细胞进行裂解，并在4℃下进行冷却(chilling)之后将皮肤微生物裂解液利用离心分离仅对最终上清液进行回收。将所回收的上清液利用200纳米(nanomiter)以下的纳米膜过滤器进行最终过滤，从而对源自于皮肤微生物的核苷酸提纯物进行回收。
<实施例1：不同熔岩海水浓度的皮肤微生物的培养液的制造>
准备包含熔岩海水10～90％(v/v)的熔岩海水混合液或熔岩海水本身(100％)作为培养用水，并利用所述培养用水替代在制造例1中使用的基本培养基制造条件中的水(熔岩海水为0％的状态)。利用如上所述的包含不同浓度的熔岩海水的培养用水，按照与制造例1相同的方式对培养基进行灭菌。
接下来，按照与制造例1相同的方式将皮肤微生物物种培养液接种到经过灭菌的熔岩海水培养基中，并在100rpm以及37℃的条件下通过按照一定的时间间隔滴入葡萄糖-氢氧化钠溶解液而在将pH维持在5.0～7.5的状态下进行了20小时的培养(执行补料分批培养(Fed-batch culture))。
<实施例2：源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的制造>
通过将实施例1中的利用熔岩海水培养的皮肤微生物培养液进行离心分离(6,000rpm、20分钟)而仅对菌体进行回收之后利用灭菌自来水(蒸馏水)进行洗涤(washing)，并重复执行一次所述过程。接下来，在将菌体悬浮到通过将熔岩海水浓缩至1/10体积以上而制造出的矿物质浓缩水(钙220mg、镁1,130mg以及硒0.013mg以上)之后，在37℃下进行16小时的第二次培养。接下来，通过以121℃的温度以及0.15MPa的压力条件执行120分钟的热压提取而对皮肤微生物细胞进行裂解，并在4℃下进行冷却(chilling)之后将皮肤微生物裂解液利用离心分离(6,000rpm、20分钟)的方式仅对最终上清液进行回收。将所回收的上清液利用200纳米(nanomiter)以下的纳米膜过滤器进行最终过滤，从而对源自于皮肤微生物的矿物质-核苷酸进行回收。
<试验例1：不同熔岩海水浓度的皮肤微生物活菌数量以及核苷酸含量的确认>
取制造例1以及实施例1中的培养液并利用生理食盐水进行稀释，接下来将稀释液向有盖培养皿(petridish)分株1ml并混合经过灭菌的乳酸杆菌MRS琼脂(LactobacilliMRS Agar，BD，USA)20ml而进行固化。通过对在37℃的静置培养器中培养48小时的菌落(colony)进行计数而对皮肤微生物活菌数量进行确认，其结果如图2所示(接下来，称之为皮肤微生物活菌数量测定法)。
与此同时，对制造例1以及实施例1的培养液进行离心分离(6,000rpm、20分钟)并仅对菌体进行回收之后利用灭菌自来水(蒸馏水)进行洗涤(washing)，并重复执行一次所述过程。接下来，将菌体悬浮到经过灭菌的自来水中，并在37℃下进行16小时的第二次培养。接下来，通过以121℃的温度以及0.15MPa的压力条件执行120分钟的热压提取而对皮肤微生物细胞进行裂解，并在4℃下进行冷却(chilling)之后将皮肤微生物裂解液进行离心分离(6,000rpm、20分钟)，然后利用200纳米(nanomter)以下的纳米膜过滤器对残余成分进行最终过滤，从而对核苷酸进行了确认。
对利用不同的熔岩海水浓度的皮肤微生物培养液制造出的核苷酸的紫外线(UV)波长吸收度(230nm、260nm、280nm)进行确认，其核苷酸的浓度如图2所示(接下来，称之为源自于皮肤微生物的核苷酸测定法)。
在图2中，熔岩海水浓度0％是指利用在制造例1中获得的培养液进行培养的皮肤微生物活菌数量或源自于皮肤微生物的核苷酸。
通过对图2中的结果进行分析可以得知，在对实施例1以及制造例1的利用不同浓度的熔岩海水培养的皮肤微生物活菌数量以及源自于皮肤微生物的核苷酸含量进行确认时，利用实施例1中的适用30～70(v/v)％的熔岩海水的培养基培养的皮肤微生物活菌数量以及源自于所述皮肤微生物的核苷酸与完全没有适用熔岩海水的通过制造例1培养的菌体相比有所增加，而在利用适用80(v/v)％以上的熔岩海水的培养基培养的皮肤微生物活菌数量以及源自于所述皮肤微生物的核苷酸呈现出了与通过制造例1培养的皮肤微生物类似的结果。
借此可以得知，并不可以通过增加熔岩海水的添加量而无条件地增加所培养的皮肤微生物，而且在因为熔岩海水而导致盐浓度提升到80(v/v)％以上时，反而会对皮肤微生物培养性造成阻碍。借此，可以得知熔岩海水内的适当的矿物质浓度对于皮肤微生物的培养以及核苷酸的形成来讲属于重要的要素。
此外，在所述的结果中作为可以实现最佳的皮肤微生物活菌数量增加以及核苷酸形成的高浓度增加效果的条件，作为第一次培养的培养基用培养用水使用熔岩海水30～70(v/v)％为宜，尤其是可以确认使用30(v/v)％是最佳的条件。
<试验例2：在不同的第二次发酵用水以及热压提取时间下的源自于皮肤微生物的核苷酸以及矿物质含量的确认>
在本试验中，在从利用熔岩海水作为培养用水培养的皮肤微生物培养液通过离心分离对皮肤微生物进行回收之后，对根据接下来的第二次培养条件回收到的核苷酸的量进行了比较。
为此，通过将在实施例1中获得的利用30(v/v)％浓度的熔岩海水培养的皮肤微生物培养液进行离心分离(6,000rpm、20分钟)而仅对菌体进行回收之后利用灭菌自来水(蒸馏水)进行洗涤(washing)，并重复执行一次所述过程。接下来，在将菌体分别悬浮到一般自来水以及熔岩海水矿物质浓缩水(钙220mg/L、镁1,130mg/L以及硒0.013mg/L以上)之后，在37℃下进行16小时的第二次培养。接下来，以121℃的温度以及0.15Mpa的压力条件进行热压提取，其中为了对最佳的热压提取条件进行确认而将热压提取时间分为30分钟以及120分钟执行。
在通过执行热压提取而对皮肤微生物细胞进行裂解之后，将裂解液在4℃下进行冷却(chilling)并利用离心分离(6,000rpm、20分钟)的方式仅对最终上清液进行回收。将所回收的上清液利用200纳米(nanomiter)以下的纳米膜过滤器进行最终过滤，从而对源自于皮肤微生物的核苷酸或矿物质-核苷酸进行回收。对于不同条件下的核苷酸含量，利用Nanodrop 2000(Thermo，USA)对紫外线(UV)波长吸收度进行确认，不同的第二次发酵用水以及热压提取条件下的源自于皮肤微生物的核苷酸含量浓度如图3所示。
通过图3中的结果可以确认，在对利用熔岩海水矿物质浓缩水进行第二次培养的源自于皮肤微生物的核苷酸含量进行确认时，与利用自来水进行第二次培养的情况相比，核苷酸的含量增加了大约1.5倍，这表明通过利用熔岩海水矿物质浓缩水有限培养基进行第二次发酵，可以通过使得矿物质诶吸收到细胞内部而生成了大量的矿物质-核苷酸。所述结果，将通过后续的表1再次进行说明。
此外，可以得知通过如上所述的方式形成的矿物质-核苷酸在热压处理时间为120分钟时可以提取出最多的量，这表明在利用熔岩海水矿物质浓缩水进行第二次培养以及热压提取时，皮肤微生物细胞内外的矿物质离子可以借助于加热而提升其反应性，从而在细胞内外密集地对细胞质以及细胞壁进行裂解以及结合成矿物质-核苷酸，并借此呈现出热稳定性。即，可以说熔岩海水矿物质浓缩水对于皮肤微生物的培养以及细胞裂解来讲属于重要的要素，而且热压提取时间也属于重要的要素。
接下来，为了对从熔岩海水移入并结合到核苷酸的矿物质浓度进行确认，对通过所述方法制造的样本的矿物质含量进行分析。在将约0.1～1g范围的无机质(钙、镁、硒)标准试剂进行滴定以及稀释(硝酸)之后，作为标准溶液使用。利用硝酸对通过所述方法制造出的样本进行稀释。利用微波(microwave)对标准溶液以及样本进行一小时的分解之后冷却，接下来利用50mL的三次蒸馏水进行充填(fill-up)并利用ICPOES(PerkinElmerprecisely optical Emission spectrometer，Optima 5300DV)与标准溶液一起进行分析，其矿物质含量如表1所示。
【表1】
如表1所示，可以确认在利用熔岩海水矿物质浓缩水进行第二次培养时，与皮肤微生物内的核苷酸结合的矿物质的量会显著增加。此外，通过重复试验按照本发明的方法执行第二次培养时，可以获得包含钙50～200mg/L、镁300～800mg/L以及硒0.001～0.01mg/L的矿物质-核苷酸的上清液。
<试验例3：源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的皮肤细胞毒性的确认>
在本试验例中，尝试证明通过利用200纳米(nanometer)以下的纳米膜过滤器有效地去除对皮肤以及微生物组的毒性和原料的发酵气味生成造成影响的皮肤微生物的细胞壁、细胞质、蛋白质以及蛋白质盐成分，可以改善源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的细胞毒性。
为此，将通过利用30(v/v)％熔岩海水进行第一次培养并利用熔岩海水矿物质浓缩水进行第二次培养而获得的源自于皮肤微生物的矿物质-核苷酸作为实施例2的代表样本使用，并称之为源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物或源自于在熔岩海水中培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物。
此外，将在制造例2中获得的核苷酸称之为源自于利用一般自来水培养的皮肤微生物的核苷酸或源自于在一般自来水中培养的皮肤微生物的核苷酸。
此外，为了在制造所述结合物时赋予保存性，通过分别利用保存剂即2.5(v/v)％的1,2-己二醇(1,2-hexanediol)进行处理的方式制造，因此在对照组(Control)中同样为了在皮肤细胞毒性试验时作为空试验组而在经过灭菌的自来水中利用1,2-己二醇(1,2-hexanediol)进行处理并作为对照组适用，在制造例3中也同样适用了相同浓度的1,2-己二醇(1,2-hexanediol)。
噻唑蓝比色法(MTT assay)是通过对存活的细胞数量进行测定而普遍适用于细胞增殖或毒性的试验方法，所采用的是存活状态的细胞的线粒体内的琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase或mitochondrial dehydrogenase)可以将水溶性的黄色的盐即噻唑蓝(MTT，3-[4,5-dimethlythiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)还原成水不溶性的蓝色的甲瓒(formazan)衍生物的原理。
为此，将成纤维细胞(human fibroblast)以及角质细胞(Human keratinocyte)在24孔板(well plate)中稀释成1.5×105细胞/孔(cells/well)的密度，接下来利用包含10％(v/v)的牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco's Modified EagleMedium，Welgene，Korea)在37℃、5％CO2培养基中进行一天的培养。在培养之后去除所有的培养基并更换成不含有牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，接下来在分别以不同的浓度添加试验样本之后进行一天的培养。
接下来，去除培养基并利用0.25㎎/ml的噻唑蓝(MTT)溶液进行处理，并在37℃下进行4小时的反应。接下来，通过向去除噻唑蓝(MTT)溶液的细胞中添加二甲亚砜(DMSO，dimethyl sulfoxide)而对噻唑蓝甲瓒(MTT formazan)进行溶解之后，在570nm下通过吸光度进行测定。
与其相关的结果如图4a以及图4b所示，可以发现在源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物制造液(上清液)的浓度达到5(v/v)％之前没有观察到细胞毒性，而在没有通过200纳米(nanometer)以下的纳米膜过滤器进行过滤的源自于利用一般自来水培养的核苷酸从3％(v/v)处理组开始呈现出细胞毒性。※从图4至图8为止的样本浓度％均表示(v/v)％。
即，可以确认在制造例2的样本中，因为包含诱发皮肤炎症的细胞结构体即细胞壁、细胞质、蛋白质以及蛋白质盐成分而没有对其进行提纯，因此在皮肤基本毒性评估中利用3％(v/v)以上的样本进行处理时，在皮肤成纤维细胞以及皮肤角质细胞中均发生了细胞凋亡。
相反，可以确认在实施例2的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的处理组中，因为通过200纳米(nanometer)以下的纳米膜过滤器对所述炎症诱发因子进行去除，因此即使是利用5％(v/v)浓度对各个皮肤细胞进行处理也不会呈现出细胞毒性，从而可以确认其皮肤安全性(skin safety)。通过如上所述的结果可以确认，源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物，即使是通过利用30％(v/v)熔岩海水进行培养而制造成皮肤微生物活菌数量达到2.0x1010CFU/ml的高浓度状态也不会呈现出细胞毒性，从而可以实现更多的使用量并借此达成皮肤健康功效的极大化。
此外，为了对纳米膜过滤工程前/后的样本进行比较，利用制造例2、制造例3以及实施例2对皮肤成纤维细胞进行处理并对其细胞毒性进行确认，其结果如下述表2所示。为了进行比较，制造出在实施例2的制造方法中没有利用200纳米(nanometer)以下的纳米膜进行过滤的样本并作为对照组使用。
通过其结果可以确认，为了按照本发明的方法制造出源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸，只有执行纳米膜过滤工程才可以制造出几乎没有细胞毒性的样本。
【表2】
<试验例4：源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的细胞活性效果的确认>
为了对线粒体的细胞膜电位变化进行验证，在将成纤维细胞(human fibroblast)分株到35mm板(plate)中并进行24小时的稳定化之后，更换成无血清培养基(serum-freemedium)并利用样本(实施例2以及制造例3)进行处理。
接下来，将在制造例3中获得的核苷酸称之为源自于利用一般自来水培养的皮肤微生物的核苷酸提纯物或源自于在一般自来水中培养的皮肤微生物的核苷酸提纯物。
在经过一小时之后利用盐类缓冲溶液(HBSS)进行洗涤，接下来在向板(plate)中投入与细胞培养液相同量的盐类缓冲溶液之后照射中波紫外线(UVB)直至总照射量达到50mJ/cm2。在照射中波紫外线(UVB)之后将培养基更换成无血清培养基(Serum-freemedium)，接下来利用样本(实施例2以及制造例3)进行处理并在37℃、5％CO2恒温箱(incubator)中进行24小时的培养。在去除培养基之后利用1μg/ml的JC-1溶液(solution)进行处理，并在37℃、5％CO2恒温箱(incubator)中以无光照的状态进行2小时的反应，接下来去除培养基并利用荧光显微镜进行观察。
通过如上所述的利用JC-1溶液(solution)的染色，在健康的线粒体(mitochondria)的状态下可以观察到的红色:绿色(red:green)的比例为1:1，而在受到可能会诱发线粒体功能障碍(mitochondrial dysfunction)的应激(stress)的状态或诱发细胞损伤或凋亡的状态下，红色:绿色(red:green)比例将呈现出如0.5:1等绿色(green)值无变化但红色(red)值显著减少的状态。
因此，通过图5可以确认，源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的处理组可以对因为中波紫外线(UVB)的照射而导致线粒体受损增加的细胞进行修复，从而使得线粒体维持与没有进行中波紫外线(UVB)处理的对照组水准的健康状态。但是，源自于利用一般自来水培养的皮肤微生物的核苷酸提纯物的值却无法提升至对照组水准，表明线粒体的修复状态较为缓慢。
<试验例5：通过源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的线粒体生物发生学(Mitochondrial biogenesis)诱导的细胞修复效果>
将成纤维细胞(human fibroblast)分株到35mm板(plate)中并进行24小时的稳定化之后，更换成无血清培养基(serum-free medium)并利用样本进行处理。在经过一小时之后利用盐类缓冲溶液(HBSS)进行洗涤，接下来在添加盐类缓冲溶液之后照射中波紫外线(UVB)50mJ/cm2。将培养基更换成无血清培养基(Serum-freemedium)，接下来利用样本(实施例2以及制造例3)进行处理并在37℃、5％CO2恒温箱(incubator)中进行24小时的培养。利用1ml的Lysis reagent(Qiagen)对培养之后的细胞进行收集，接下来利用氯仿(chloroform)、2-丙醇(2-propanol)以及乙醇(ethanol)对核糖核酸(RNA)进行提取。在将所提取出的核糖核酸(RNA)投入到利用焦碳酸二乙酯(DEPC)进行处理的纯净水中之后，利用Qubitflorometer(Invitrogen，USA)以及Qubit RNA BR Assay kit(Invitrogen，USA)进行定量，接下来合成出互补脱氧核糖核酸(cDNA)并执行实时聚合酶链式反应(real-timePCR)。互补脱氧核糖核酸(cDNA)的合成是使用high capacity RNA-to-cDNA kit(AppliedBiosystems，USA)执行，并按照试剂盒(kit)的方法执行了试验。实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)是使用kit(qPCRBIO SyGreen Blu Mic Lo-ROX，PCRBIOSYSTEMS，London，UK)执行，并按照试剂盒(kit)的方法执行了试验，接下来在利用applied Biosystems7500FAST Real-Time PCR System对基因进行扩增之后对扩增产物进行了定量分析。在聚合酶链式反应(PCR)中使用的引物(premer)如表3所示，是由COSMOGENETECH(KOREA)合成后使用。
【表3】
如图6中所示的结果，为了在利用中波紫外线(UVB)进行处理的细胞中对受损的细胞进行修复，源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物在5(v/v)％的相同浓度下与源自于利用一般自来水培养的皮肤微生物的核苷酸提纯物相比，皮肤老化时所减少的氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)的表达增加16％，借此可以确认源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物呈现出皮肤受损细胞的修复以及皮肤活力效果。
<试验例6：源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的皮肤屏障强化效果>
将角质细胞(human keratinocyte)接种到细胞培养皿(cell culture dish)并进行24小时的培养。接下来，更换成无血清(serum-free)Epilife(gibco)培养基并在利用样本(实施例2以及制造例3)进行处理之后进行3天的培养。利用1ml的QIAzolTMLysis reagent(Qiagen)对培养之后的细胞进行收集，接下来利用氯仿(chloroform)、2-丙醇(2-propanol)以及乙醇(ethanol)对核糖核酸(RNA)进行提取。在将所提取出的核糖核酸(RNA)投入到利用焦碳酸二乙酯(DEPC)进行处理的提纯水中之后，利用Qubit florometer(Invitrogen，USA)以及Qubit RNA BR Assay kit(Invitrogen，USA)进行定量，接下来合成出互补脱氧核糖核酸(cDNA)并执行实时聚合酶链式反应(real-time PCR)。互补脱氧核糖核酸(cDNA)的合成是使用high capacity RNA-to-cDNA kit(Applied Biosystems，USA)执行，并按照试剂盒(kit)的方法执行了试验。实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)是使用kit(qPCRBIO SyGreen Blu Mic Lo-ROX，PCRBIOSYSTEMS，London，UK)执行，并按照试剂盒(kit)的方法执行了试验，接下来在利用applied Biosystems 7500FAST Real-Time PCRSystem对基因进行扩增之后对扩增产物进行了定量分析。在聚合酶链式反应(PCR)中使用的引物(premer)如表4所示，是由COSMOGENETECH(KOREA)合成后使用。
【表4】
如图7a所示，对源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物在起到相当于皮肤屏障(brick and mortar)功能中的水泥(mortar)(脂质，lipids)作用的神经酰胺(ceramide)合成相关酶即丝氨酸棕榈酰转移酶(Serine palmitoyltransferase，SPT)的效果进行确认的结果表明，在利用5(v/v)％的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物进行处理时，与源自于利用一般自来水培养的皮肤微生物的核苷酸提纯物相比高53％，其皮肤屏障强化效果卓越。
如图7b中的结果所示，对作为末端分化标记(terminally differentiationmarker)之一，在构成皮肤屏障的同时作为天然保湿因子(Natural MoisturerizingFactor)转录组之一的丝聚合蛋白(filaggrin，FLG)的功效进行确认的结果，源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物与源自于利用一般自来水培养的皮肤微生物的核苷酸提纯物相比，在5(v/v)％的处理浓度下丝聚合蛋白(filaggrin，FLG)的表达量高大约3.5倍。
此外，以如上所述的结果为基础执行丝聚合蛋白目标(filaggrin target)免疫荧光细胞染色。免疫荧光细胞染色采用如下所述的方法。
将人正常角质形成细胞(human normal keratinocyte)接种到细胞培养皿(cellculture dish)并进行一天的培养，接下来在更换成无血清(serum free)Epilife(gibco)培养基之后利用样本(实施例2以及制造例3)以不同的浓度进行处理并进行三天的培养。为了对细胞进行固定而利用4％(w/v)的甲醛溶液(formaldehyde solution)进行处理之后，利用0.1％(v/v)的曲拉通(Triton)X-100溶液(solution)进行处理并进行10分钟的培养。接下来，更换成1％的牛血清白蛋白溶液(BSA solution)并在经过一小时之后利用2μg/ml的丝聚合蛋白抗体(filaggrin antibody，Invitrogen)进行处理和反应。接下来，利用Alexa488conjugate antibody(Invitrogen)进行处理和反应，接下来在投入1μg/ml的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，sigma)之后进行拍照。
通过其结果可以确认，与上述内容中的结果相同，源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物在5％(v/v)的处理浓度下，通过肉眼评估以及蛋白质荧光染色在细胞形态学(cell morphology)上观察到了最清晰的分化形状，而对其结果进行数值化的结果如图7c所示。
借此可以确认，源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物在5(v/v)％的浓度下与源自于利用一般自来水培养的皮肤微生物的核苷酸提取物相比对丝聚合蛋白(FLG)以及丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)呈现出了更加优秀的功效，这表明在可以在为敏感皮肤带来湿润感并强化屏障的水分屏障(moisture barrier)方面呈现出更加卓越的功效。
此外，通过图7d中的结果可以确认，源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物可以对用于调节水(water)以及离子(ion)的通道(passage)并参与皮肤屏障强化功能的紧密连接蛋白(tight junction protein，TJ)的紧密连接相关蛋白(claudin-1)基因进行表达。
通过试验结果可以确认，在相应的条件(处理(treatment)24小时)下，对于紧密连接相关蛋白(claudin-1)基因的表达，与作为对照组的源自于利用一般自来水培养的皮肤微生物的核苷酸提纯物相比，在5(v/v)％处理组中呈现出了最明显的协同功效。即，熔岩海水矿物质-核苷酸皮肤微生物与一般自来水相比可以诱导紧密连接蛋白(TJ protein)的紧密连接相关蛋白(claudin-1)基因的表达增加45％，从而强化皮肤屏障功能。
<试验例7：源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的皮肤微生物组调节功能>
为了对源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的与皮肤微生物组的均衡调节相关的稳定性(hemeostasis)进行比较，对与皮肤常居菌即表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)以及痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)相关的增殖影响性进行了评估。
具体来讲，在胰酪胨大豆肉汤(trypticase soy broth，TSB)分别接种1％(v/v)的各个皮肤常居菌甘油保管溶液并在37℃下进行18～20小时的振荡培养，接下来利用生理食盐水对培养完成液进行稀释而调节值O.D.600nm＝0.02～0.04(大约1x107CFU/ml)，然后向生理食盐水分别添加3(v/v)％的实施例2以及制造例3的样本，接下来向9.9ml的按照浓度进行稀释的试验稀释溶液分别接种100μl的皮肤微生物组菌培养稀释液(最终菌数为x105CFU/ml)，并对接种之后的第0天、第3天、第6天的活菌数量进行10倍多段稀释，接下来通过分别接种1ml至胰酪胨大豆肉汤(trypticase soy agar，TSA)而制造出倾注平皿(pour-plate)并在37℃下进行培养。
通过图8可以确认，伴随着时间的经过，通过源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物，皮肤常居菌即表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)以及痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)发生增殖并维持其稳定性，但是源自于利用一般自来水培养的皮肤微生物的核苷酸提纯物难以对所述菌群的稳定性进行调节。
<试验例8：源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的大量生产>
通过所述实施例2的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物制造工艺以及制造例2的制造工艺，分别以100L规模(scale)执行了各个样本的大量生产，其结果如图9所示。此外，在大量生产之后通过皮肤微生物核苷酸分析法对其纯度进行测定，其结果如图10所示。
如图9所示，在包含利用现有技术即制造例2的核苷酸的上清液(微生物裂解物)中包含各种细胞壁成分和脂蛋白以及糖蛋白质等，因此在进行热压提取的期间发生了焦糖化反应(caramellization)，从而导致其颜色变化成深褐色，而且还生成了异常的发酵气味。相反，在适用本发明的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物制造方法(执行熔岩海水培养、微生物裂解、离心分离以及膜分离工程)时，制造出了透明且没有异常的发酵气味的稳定原材料。
关于大量生产的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物原材料的纯度(purity)，只要吸光度比值(Absorbance ratio)260/280达到2.0～2.2、吸光度比值(Absorbance ratio)260/230达到1.8～2.0就可以视为是纯净(pure)。
通过皮肤微生物核苷酸分析法对其进行测定的结果表明，如图10以及表5所示，通过核苷酸的高浓度浓缩，在紫外线(UV)的各个波长下测定到的浓度较高，并通过比例(ratio)对其纯度进行了确认。尤其是，通过对制造工程中混入的蛋白质等杂质进行去除，可以维持图表的统一性。
【表5】
<试验例9：利用多种不同的皮肤微生物菌株制造出的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物功效比较>
为了对利用多种不同的皮肤微生物菌株制造源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物时的功效进行确认，利用下述表6中所记载的皮肤微生物并适用实施例2的源自于利用30(v/v)％的熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物制造工艺进行制造。
【表6】
菌株编号 菌株名称
1 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
2 长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)
3 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)
4 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)
5 粪肠球菌(Enterococcus faecalis)
6 戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)
7 食物魏斯氏菌(Weissella cibaria)
8 酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)
9 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
10 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)
11 痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)
接下来，对试验例6的方法中的丝聚合蛋白(Filaggrin)基因表达进行确认的结果表明，如图11所示，与作为阳性对照组的1.2mM的氯化钙(CaCl2)相比其整体上的丝聚合蛋白(Filaggrin)基因的表达有所增加，而且本发明的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的制造方法是一种可以从多种不同的皮肤微生物实现皮肤屏障强化等功效的特化的制造方法。
<化妆品制剂例1.柔肤化妆水的制造>
按照如下述表7所示的组成，通过一般的方法制造出了包含含有实施例2的矿物质-核苷酸结合物的上清液的柔肤化妆水(面霜，100g)。
【表7】
原料 含量(g)
含有实施例2的矿物质-核苷酸结合物的上清液 3.0
甘油 3.0
丁二醇 2.0
丙二醇 2.0
聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油 1.0
乙醇 10.0
三乙醇胺 0.1
防腐剂 微量
色素 微量
香料 微量
纯净水 余量
<化妆品制剂例2.营养化妆水的制造>
在利用70(v/v)％乙醇水溶液对含有实施例2的矿物质-核苷酸结合物的上清液进行提取之后获得去除溶剂的浓缩液，接下来通过一般的方法制造出了按照如8所示的组成含有所述浓缩液的营养化妆水(护肤水，100g)。
【表8】
原料 含量(g)
含有实施例2的矿物质-核苷酸结合物的上清液 1.0
谷甾醇 1.7
聚甘油-2油酸酯 1.5
鲸蜡硬脂醇聚醚 1.2
胆固醇 1.5
双十六烷基磷酸酯 0.4
浓缩甘油 5.0
葵花籽油 10.0
羧乙烯基聚合物 0.2
黄原胶 0.3
防腐剂 微量
香料 微量
纯净水 余量
<化妆品制剂例3.营养霜的制造>
按照如下述表9所示的组成，通过一般的方法制造出了包含含有实施例2的矿物质-核苷酸结合物的上清液的营养霜(100g)。
【表9】
原料 含量(g)
含有实施例2的矿物质-核苷酸结合物的上清液 5.0
谷甾醇 4.0
聚甘油-2油酸酯 3.0
神经酰胺 0.7
鲸蜡硬脂醇聚醚-4 2.0
胆固醇 3.0
双十六烷基磷酸酯 0.4
浓缩甘油 5.0
葵花籽油 22.0
羧乙烯基聚合物 0.5
三乙醇胺 0.5
防腐剂 微量
香料 微量
纯净水 余量
如上所述，参阅所述制造例、实施例以及试验例对本发明进行了详细的说明，但所述内容仅为示例性目的，具有本发明所属技术领域之一般知识的人员应该可以理解，本发明可以通过各种变形以及均等的其他实施例实现。因此，本发明的真正的技术保护范围应通过素服的权利要求书的技术事项做出定义。

Claims (9)

1.一种源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的制造方法，其特征在于，包括：
(第一步骤)通过利用将熔岩海水作为培养用水使用的培养基对皮肤微生物进行培养而获得第一次培养液的步骤；
(第二步骤)通过在从所述培养液对菌体进行回收之后利用熔岩海水矿物质浓缩水进行培养而获得第二次培养液的步骤；以及，
(第三步骤)通过对所述第二次培养液进行热压提取以及冷却提纯而对包含矿物质-核苷酸的上清液进行回收的步骤，
所述第一步骤中的培养基，是作为构成成分包含葡萄糖、酵母提取物、大豆蛋白胨以及酪蛋白并在将所述构成成分溶解到包含30～70％v/v的熔岩海水的水中之后进行灭菌的培养基，
所述第一步骤中的皮肤微生物，是由乳杆菌属(Lactobacillussp.)、双歧杆菌属(sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、乳球菌属(Lactococcus sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、片球菌属(Pediococcus sp.)、魏斯氏菌属(Weissella sp.)、酵母菌属(Saccharomyces sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)以及丙酸菌属(Propionibacterium sp.)构成的组中的一个以上的菌株，
所述第二步骤中的浓缩水，是每1L包含钙220mg以上、镁1,130mg以上以及硒0.013mg以上的状态的矿物质浓缩水，是通过对熔岩海水进行减压浓缩或渗透浓缩的方式获得，
作为所述第三步骤中的热压提取条件，是在120～130℃、0.12～0.30MPa下执行15～200分钟，
所述第三步骤中的冷却提纯，是通过在维持3～5℃的状态下以3,000～8,000rpm执行10～30分钟的离心分离之后利用具有200nm以下的气孔大小的纳米膜的纳米膜过滤工程对包含矿物质-核苷酸的上清液进行收集的方式执行。
2.根据权利要求1所述的源自于利用熔岩海水培养的皮肤微生物的矿物质-核苷酸结合物的制造方法，其特征在于：
所述第三步骤中的上清液内的核苷酸的浓度范围为200～2,000μg/ml。
3.一种矿物质-核苷酸结合物，其特征在于：
通过根据权利要求1所述的方法进行制造。
4.一种皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于：
包含根据权利要求3所述的矿物质-核苷酸结合物。
5.根据权利要求4所述的皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于：
所述组合物增强从由丝氨酸棕榈酰转移酶、丝聚合蛋白以及紧密连接相关蛋白-1构成的组中选择的1种以上的基因或蛋白质的表达。
6.根据权利要求4所述的皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于：
所述组合物还具有对紫外线损伤的皮肤细胞的修复功效。
7.根据权利要求6所述的皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于：
所述组合物具有增强过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的表达的功效。
8.根据权利要求4所述的皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于：
所述组合物具有维持或增加皮肤常居菌即表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的总菌数的功能。
9.根据权利要求4所述的皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于：
所述组合物具有维持或增加皮肤常居菌即痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)的总菌数的功能。
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