WO2018194327A2 - 해양 유래 신규 미생물 및 이를 이용한 화장품 조성물 - Google Patents

해양 유래 신규 미생물 및 이를 이용한 화장품 조성물 Download PDF

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WO2018194327A2
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구창섭
서수경
김대현
장동일
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주식회사 콧데
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • the present invention relates to a novel strain and a cosmetic composition prepared using the same, and more particularly to a marine-derived novel Maritalea Myrionectae strain and a cosmetic composition prepared using the same.
  • Skin has a number of important functions, the most representative of which is the ability to suppress the production of melanin to protect the body from the ultraviolet rays of sunlight.
  • Melanin is produced from melanocytes, a kind of skin cells, and has a natural screening ability that is distributed on the surface of the skin to block ultraviolet rays harmful to the human body.
  • an enzyme called tyrosinase, which is synthesized in melanocytes. Tyrosinase generates dopaquinone via dopa (DOPA) using an amino acid called tyrosine as a substrate.
  • DOPA dopa
  • the condensation reaction produces melanin, a black pigment.
  • Ascorbic acid hydroquinone, kojic acid, arbutin and some extracts are already used as whitening cosmetics because they have tyrosinase inhibitory activity.
  • Ascorbic acid is defined as a carcinogenic substance, it is prohibited to use, and kojic acid and ascorbic acid are very unstable substances, and browning phenomenon occurs when a small amount of cosmetics are stored for several weeks at room temperature.
  • Arbutin is also known to cause cytotoxic safety issues.
  • the above-mentioned whitening cosmetics are poor in stability and are decomposed and discolored, or their use is limited due to odor occurrence, efficacy at the biological level, unclear effect and safety problems. Accordingly, there is a need for a cosmetic composition having an excellent inhibitory effect by culturing melanoma cells similar to the biological level.
  • inflammation causes oxidative stress such as ultraviolet rays, free radicals, and free radicals to activate inflammatory factors, causing various diseases and aging of the skin.
  • oxidative stress such as ultraviolet rays, free radicals, and free radicals to activate inflammatory factors, causing various diseases and aging of the skin.
  • Materials used as anti-inflammatory agents to date include non-steroidal flufenamic acid, ibuprofen, benzidamine, indomethacin, and indomethacin, and prednisolone as a steroid-based patent 10-1583541. prednisolone) and dexamethasone.
  • natural products are excellent in safety and include various beneficial ingredients, and thus a cosmetic composition having excellent skin whitening and anti-inflammatory effects using natural derived materials is required.
  • the active ingredient is stable, and above all, it has a superior effect of the skin whitening, anti-inflammatory and anti-atopic activity of skin whitening, anti-inflammatory and anti-atopy. Development is urgent desired.
  • An object of the present invention is to provide an anti-inflammatory, anti-atopic and skin whitening composition comprising myrionectae strains and fermented products thereof as an active ingredient.
  • the present invention is a new Maritalea derived from Jeju lava seawater entrusted with accession number KCTC13309BP Provide myrionectae strains.
  • the present invention is a marine-derived new Maritalea entrusted with accession number KCTC13309BP Using myrionectae strain, Hwangchil- tree, loquat leaf, camellia mistletoe, situation mushroom, night gateway (non-recovery), bunhacho (strawberry), linseed-root, barley leaf, bud (hand white), trailing root, sky root, crow middle It provides a fermentation composition fermented any one or more selected from the group consisting of swelling), mountain mulberry, grafting alley, dogwood, holly, Seokpo, Seokcho-cho, guava, Yeokduk and Dodol.
  • the present invention is a marine-derived new Maritalea entrusted with accession number KCTC13309BP Fermented Yellow Chilli , Fermented Camellia, Fermented Camellia Mistletoe, Fermented Strains of Mushrooms, Fermented Wheat Sprouts, Fermented Sprouts, Fermented Sprouts, Fermented Roots and Roots Water, Let fermented fermented product, trailed root root fermented product, sky root root fermented product, fermented product from horsetail, bark fermented product, mountain mulberry fermented product, grafted tree fermented product, dogwood fermented product, holly tree It provides a cosmetic composition comprising any one or more selected from the group consisting of fermented product, Seokchangpo fermented product, Seokchocho fermented product, guava fermented product, Yedok fermented product and extra stone fermented product as an active ingredient.
  • the present invention is a marine-derived new Maritalea entrusted with accession number KCTC13309BP Among fermented products using myrionectae strain, Sukchangpo fermentation, non-leafed fermentation, Seokchocho fermentation, guava fermentation, situation mushroom fermentation, night view (non-repair) fermentation, Yeok-tree fermentation, grafting allotment, dog It provides a cosmetic composition with enhanced whitening effect by including any one or more selected from the group consisting of wood fermentation and holly fermentation as an active ingredient.
  • the present invention is a marine-derived new Maritalea entrusted with accession number KCTC13309BP seokwi second fermentation in a fermented water into effect using a myrionectae strain, guava fermentation, mallotus fermented product, in contact alley fermentation, any one selected from two wood fermentation, hwangchil wood fermented and doloe fermentation the group consisting of water It provides a cosmetic composition having the effect of improving atopic symptoms by the anti-inflammatory effect, including the above as an active ingredient.
  • composition containing myrionectae strain and fermented product of Jeju medicinal plant as an active ingredient shows excellent whitening effect by inhibiting melanin synthesis, and shows anti-inflammatory and anti-atopic effect by inhibiting expression of inflammatory chemokines (TARC, MDC) It can be usefully used as a composition.
  • Figure 1 is a marine microorganism No. 5 Maritalea derived from Jeju lava seawater A photograph of the culture of myrionectae strain.
  • Figure 2 shows the results of 16S rRNA phylogenetic tree of marine microorganisms 5 derived from Jeju deep seawater.
  • Figure 3 is a result of esculin fermentation test for five marine microorganisms derived from lava seawater, showing a positive result in strain 5.
  • FIG. 7 shows 17 kinds of pH changes before and after fermentation of marine microorganism No. 5 ( Maritalea myrionectae ) derived from Jeju lava seawater among 49 species of Jeju medicinal plants.
  • the present invention provides a novel Maritalea myrionectae strain derived from Jeju lava seawater, which was entrusted with accession number KCTC13309BP, using this strain Hwangchil wood, loquat leaf , camellia mistletoe, situation mushroom, night view (non-repair), baechocho (bran lettuce), jouleum- Roots, leaflets, buds, white leaves, trail roots, sky roots, crows, tree trunks, zelkovas, grafting trees, dogwoods, holly, stone spears, stone vines, guavas, cedars, and rocks It provides a fermentation composition fermented any one or more selected from the group consisting of and a cosmetic composition comprising the fermentation as an active ingredient.
  • fermented fermented soybean paste non-leafed fermented product, Seokchocho fermented product, guava fermented product, situation mushroom fermented product, night gateway (non-repaired) fermented product, Yeok wood fermented product, grafted alley fermented product, dogwood fermented product and holly tree fermented product
  • Cosmetic compositions comprising any one or more selected from the group consisting of as an active ingredient shows a very good whitening effect.
  • cosmetics comprising any one or more selected from the group consisting of Seokwicho fermented product, guava fermented product, Yeok fermented product, grafted tree fermented product, dogwood fermented product, Hwangchil fermented product and extra stone fermented product as active ingredients
  • the composition shows a very good effect of improving atopic symptoms by the anti-inflammatory effect.
  • Fermentation of the Jeju medicinal plants can be made through the inoculation of marine strains derived from marine Maritalea myrionectae using medicinal plant extracts
  • extraction in the present invention is a method widely known in the art to which the present invention belongs, such as hot water extraction, ethanol and the like Any extraction method well known to those skilled in the art, such as solvent extraction, can be used without particular limitation.
  • the cosmetic composition of the present invention may be blended with the fermented product as described above, and other ingredients normally formulated into cosmetics as needed.
  • Such blending components include oil-fat components, humectants, emollients, surfactants, organic and inorganic pigments, Organic powders, ultraviolet absorbers, preservatives, fungicides, antioxidants, pH adjusters, alcohols, pigments, fragrances, blood circulation accelerators, cooling agents, limiting agents, purified water and the like, but if the cosmetic formulation ingredients known in the art Available without any special restrictions.
  • Skin whitening, anti-inflammatory and anti-atopic cosmetic composition containing the fermented Jeju medicinal plant according to the present invention as an active ingredient can be prepared in any formulation commonly prepared in the art, solutions, suspensions, emulsions, pastes, Mist, Skin Softener, Skin Toner, Astringent, Lotion, Milk Lotion, Moisture Lotion, Nutrition Lotion, Massage Cream, Nutrition Cream, Moisture Cream, Hand Cream, Essence, Nutrition Essence, Oil, Paint, Pack, Soap, Shampoo, Cleansing Foam It may be formulated as a cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, emulsion, etc., but is not limited thereto.
  • Jeju lava seawater was filtered through a 0.2 ⁇ m filter (5L) and the membrane was cut out and placed in a 50mL tube, and then wetted with 1mL of deep ocean water for microbial preservation, and sent to the Korea microorganism preservation center, which is a medium for seawater conditions. Cultured in marine agar at 4 °C, 30 °C, 37 °C conditions.
  • five marine microorganisms were determined to have 99% homology with the Maritalea myrionectae strain.
  • the five marine microorganisms were identified as biomaterials of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on August 17, 2017. Entrusted to the center (KCTC), the accession number is KCTC13309BP (see Fig. 2).
  • Sample A 50ml Marine broth + Esculin 0.1% + strain culture 0.5% seeding
  • Sample B 50ml Marine broth + Esculin 0.05% + strain culture 0.5% seeding
  • Sample C 50ml Marine broth + Esculin 0.025% + strain culture 0.5% seeding
  • Liquid ratio 10 (3g / 30ml), extraction temperature: Autoclave (121 o C, 15min) after extracting Jeju medicinal plants, 40ml of marine broth mixed the extract 10ml, inoculated 0.5ml Maritalea myrionectae 30 o C, the fermentation was carried out for 96 hours under the conditions of 150rpm.
  • Maritalea myrionectae HPLC analysis was performed before and after fermentation to confirm the presence of bioconversion.
  • Example 3 marine microorganism no.5 from lava seawater in Jeju ( Maritalea myrionectae Jeju medicinal plants by Fermented product Whitening efficacy evaluation
  • Melanoma cell line B16F10 cells were purchased from Korean Cell Line Bank and Dulbecco's modified Eagle's containing 1% antibiotic (Gibco, USA) and 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Grand Island, USA) Medium (DMEM) medium was used to incubate in 37 ° C., 5% CO 2 incubator, and passaged once every two days.
  • DMEM fetal bovine serum
  • B16F10 cells incubated in DMEM medium is inoculated in a 24 well plate at 2.0 ⁇ 10 4 cells / well. After 24 hours of incubation at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator, the samples are prepared by concentration. In order to stimulate the sample and the cell at each concentration, the stimulant a-MSH is added at 200nM. After incubation for 48 hours at 37 °C, 5% CO 2 incubator to remove the culture medium and wash each well with phosphate buffer (pH 7.4). Add 100N of 1N NaOH and remove the cell and transfer to 1.5ml tube. After reacting at 80 ° C. for 1 hour, absorbance is measured at 490 nm of the spectrophotometer. Inhibition of melanin biosynthesis is indicated by the rate of absorbance decrease between the addition and the addition of the sample solution.
  • Example 4 Marine microorganism No. 5 from Jeju lava seawater ( Maritalea myrionectae 17 kinds of Jeju medicinal plants by Fermented product Anti-atopic dermatitis Efficacy Assessment
  • HaCaT cells a human keratinocyte cell line, were purchased from the Bank of Korea Cell Line and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium medium containing 1% antibiotic and 10% fetal bovine serum at 37 ° C and 5% CO 2 incubator. Passage culture was performed once.
  • HaCaT cells were incubated 18 hours in a 24 well plate at 3.0X10 5 cells / mL, and samples were prepared by concentration, and IFN- ⁇ and TNF-a were mixed at 10 ng / mL in the prepared samples and treated simultaneously with the cells. Incubate for 24 hours at 37 °C, 5% CO 2 incubator. Thereafter, the culture solution was transferred to a 1.5ml tube and centrifuged to measure the amount of chemonkines synthesized in the supernatant. All samples should be stored frozen until weighing. Inflammatory chemokines were quantified using the Human enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA ) kit (R & D Systems) r 2 value of the standard curve for the standard was at least 0.99.
  • ELISA Human enzyme-linked immnunosorbent assay

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Abstract

본 발명에 따른 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주 및 이를 이용한 제주 약용식물의 발효물을 유효성분으로 포함한 화장품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의한 발효물은 멜라닌 합성을 억제하여 우수한 미백 효과를 나타내며, 염증성 chemokines(TARC, MDC) 발현을 억제하여 항염증성 및 항아토피성의 효과를 나타내어 화장품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

해양 유래 신규 미생물 및 이를 이용한 화장품 조성물
본 발명은 신규 균주 및 이를 이용하여 제조되는 화장품 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주 및 이를 이용하여 제조되는 화장품 조성물에 관한 것이다.
피부는 여러 가지 중요한 기능을 가지고 있는데, 그 중에서도 대표적인 것이 태양광의 자외선으로부터 신체를 보호하기 위하여 멜라닌 생성을 억제하는 기능이 있다. 멜라닌은 피부 세포의 일종인 멜라노사이트에서 생성되고, 피부 표면에 분포되어 인체에 유해한 자외선을 차단하는 자연적인 스크리닝 능력을 가지고 있다. 멜라닌 생성 기저에는 멜라노사이트에서 합성되는 티로시나아제라는 효소가 있는데, 티로시나아제는 티로신이라는 아미노산을 기질로 하여 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논(Dopaquinone)을 생성시키며, 도파퀴논으로부터 여러 단계의 산화 축합 반응으로 흑색색소인 멜라닌이 생성된다.
이미 아스코르빈산(Ascorbic acid), 하이드로퀴논(Hydroquinone), 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 및 일부의 추출물 등이 티로시나아제 저해 활성을 가지고 있어 미백화장료로 이용되고 있으나, 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있으며, 코지산과 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질로서, 소량 함유한 화장료를 실온에서 수주일간 보관하면 갈변 현상이 발생한다. 알부틴도 세포독성을 일으키는 등 안전성 문제가 지적되고 있다.
따라서 상기의 미백 화장료들은 안정성이 좋지 못해 분해되어 착색되거나, 이취 발생, 생체레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 인하여 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 이에, 생체레벨과 유사한 멜라노마 세포(Melanoma cell) 배양에 의한 저해 효과가 우수한 화장료 조성물이 요구되고 있다.
또한, 염증은 자외선이나 활성산소, 자유라디칼 등의 산화적 스트레스 등이 염증성인자를 활성화 시켜 각종 질병 및 피부의 노화를 일으킨다. 현재까지 항염제로 이용되는 물질로는 비스테로이드계로 플루폐나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin) 등이 있고 스테로이드계통 등록특허 10-1583541으로 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손 (dexamethasone)등이 있다. 그 외 알란토인, 아즈엔, 하이드로코티손 등이 있으나, 이들 모두 피부에 대한 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 염증 완화 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.
이에 비해, 천연물들은 안전성이 뛰어날 뿐만 아니라 여러 가지 유익한 성분들을 포함하고 있으므로 천연 유래 물질을 이용하여 피부 미백 효과 및 항염증 효과가 우수한 화장료 조성물이 요구되고 있다.
따라서, 생체에 안전하고, 유효성분이 안정하며, 무엇보다도 기존에 존재하는 피부의 미백, 항염증 및 항아토피의 효과가 있는 물질보다 효과가 우수한 피부 미백, 항염증 및 항아토피의 활성을 지닌 성분의 개발이 절실히 요망되고 있다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기한 한계점을 극복하기 위한 것으로, 제주용암해수 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주 및 이의 발효물을 유효성분으로 포함한 항염증, 항아토피 및 피부 미백용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 제주 용암 해수 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주를 제공한다.
다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주를 이용하여 황칠나무, 비파엽, 동백겨우살이, 상황버섯, 야관문(비수리), 번행초(갯상추), 줄풀-뿌리, 자소엽, 부처손(권백), 가신새뿌리, 하늘타리뿌리, 까마중, 목통(으름덩쿨), 산뽕나무, 접골목, 개나무, 호랑가시나무, 석창포, 석위초, 구아바, 예덕나무 및 돌외로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 발효시킨 발효 조성물을 제공한다.
또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주를 이용하여 발효시킨 황칠나무 발효물, 비파엽 발효물, 동백겨우살이 발효물, 상황버섯 발효물, 야관문(비수리) 발효물, 번행초(갯상추) 발효물, 줄풀-뿌리 발효물, 자소엽 발효물, 부처손(권백) 발효물, 가신새뿌리 발효물, 하늘타리뿌리 발효물, 까마중 발효물, 목통(으름덩쿨) 발효물, 산뽕나무 발효물, 접골목 발효물, 개나무 발효물, 호랑가시나무 발효물, 석창포 발효물, 석위초 발효물, 구아바 발효물, 예덕나무 발효물 및 돌외 발효물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 활성 성분으로 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 화장품 조성물에 있어서, 본 발명은 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주를 이용하여 발효시킨 발효물 중에서 석창포 발효물, 비파엽 발효물, 석위초 발효물, 구아바 발효물, 상황버섯 발효물, 야관문(비수리) 발효물, 예덕나무 발효물, 접골목 발효물, 개나무 발효물 및 호랑가시나무 발효물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 활성 성분으로 포함하여 미백 효과가 증진된 화장품 조성물을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 화장품 조성물에 있어서, 본 발명은 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주를 이용하여 발효시킨 발효물 중에서 석위초 발효물, 구아바 발효물, 예덕나무 발효물, 접골목 발효물, 개나무 발효물, 황칠나무 발효물 및 돌외 발효물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 활성 성분으로 포함하여 항염 효과에 의한 아토피 증상 개선 효과를 가지는 화장품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주 및 이를 이용한 제주 약용식물의 발효물을 유효성분으로 포함한 조성물은 멜라닌 합성을 억제하여 우수한 미백 효과를 나타내며, 염증성 chemokines(TARC, MDC) 발현을 억제하여 항염증성 및 항아토피성의 효과를 나타내어 화장품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 제주용암해수 유래 해양미생물 5번 Maritalea myrionectae 균주의 배양된 모습을 촬영한 사진이다.
도 2는 제주해양심층수 유래 해양미생물 5의 16S rRNA phylogenetic tree 결과를 나타낸다.
도 3은 제주용암해수 유래 해양미생물 5종에 대한 esculin 발효실험 결과로서, 5번 균주에서 positive한 결과를 나타낸다.
도 4는 제주용암해수 유래 해양미생물 5번(Maritalea myrionectae)에 대한 esculin 발효실험에 따른 HPLC 크로마토그램상에서의 성분변화 결과를 나타낸다.
도 5는 제주용암해수 유래 해양미생물 5번(Maritalea myrionectae)에 대한 제주약용식물 49종을 나타낸다.
도 6은 제주용암해수 유래 해양미생물 5번(Maritalea myrionectae)에 대한 제주약용식물 49종의 발효실험 과정을 나타낸다.
도 7은 제주약용식물 49종 중 제주용암해수 유래 해양미생물 5번(Maritalea myrionectae)에 대한 발효 전후의 pH변화가 현저한 17종을 나타낸다.
도 8은 제주용암해수 유래 해양미생물 5번(Maritalea myrionectae)에 의한 제주약용식물 발효물의 미백 효능 평가를 위한 melanin 생합성 저해 활성 측정 결과를 나타낸다.
도 9은 제주용암해수 유래 해양미생물 5번(Maritalea myrionectae)에 의한 제주약용식물 발효물의 항아토피 효능 평가를 위한 TARC 억제 활성 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 제주용암해수 유래 해양미생물 5번(Maritalea myrionectae)에 의한 제주약용식물 발효물의 항아토피 효능 평가를 위한 MDC 억제 활성 측정 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 제주 용암 해수 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주를 제공하며, 이 균주를 이용하여 황칠나무, 비파엽, 동백겨우살이, 상황버섯, 야관문(비수리), 번행초(갯상추), 줄풀-뿌리, 자소엽, 부처손(권백), 가신새뿌리, 하늘타리뿌리, 까마중, 목통(으름덩쿨), 산뽕나무, 접골목, 개나무, 호랑가시나무, 석창포, 석위초, 구아바, 예덕나무 및 돌외로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 발효시킨 발효 조성물 및 이 발효물을 활성 성분으로 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.
특히. 석창포 발효물, 비파엽 발효물, 석위초 발효물, 구아바 발효물, 상황버섯 발효물, 야관문(비수리) 발효물, 예덕나무 발효물, 접골목 발효물, 개나무 발효물 및 호랑가시나무 발효물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 활성 성분으로 포함하는 화장품 조성물은 미백 효과가 매우 우수한 결과를 보인다.
또한, 석위초 발효물, 구아바 발효물, 예덕나무 발효물, 접골목 발효물, 개나무 발효물, 황칠나무 발효물 및 돌외 발효물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 활성 성분으로 포함하는 화장품 조성물은 항염 효과에 의한 아토피 증상 개선 효과가 매우 우수한 결과를 보인다.
상기 제주 약용식물의 발효는 약용식물 추출물을 이용해 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주 접종을 통해 이루어질 수 있으며, 본 발명에서의 추출은 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려진 방법으로서, 열수 추출, 에탄올 등의 유기 용매 추출 등 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 추출방법이라면 특별한 제한 없이 이용가능하다.
본 발명의 화장품 조성물에는 상기의 발효물과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있으며, 이러한 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있으나, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 화장료 배합 성분이라면 특별한 제한 없이 이용 가능하다.
본 발명에 따른 제주 약용식물 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백, 항염증 및 항아토피용 화장료 조성물은 당업계에서 통상 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 미스트, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양 에센스, 오일, 도포제, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액 등으로 제형화 될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이어서 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다. 실시예의 구체적인 예시는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이에 한정되는 것이 아니고, 특허청구범위와 발명의 상세한 설명의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하며, 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.
실시예 1: 신규 균주의 분리 동정
본 발명자들은 기능성 화장품 조성물로 사용 가능한 새로운 균주를 발굴하기 위해 제주용암해수에서 다양한 균주를 분리하였다. 구체적으로, 제주용암해수를 0.2μm filter에 여과하여 (5L) membrane을 오려내어 50mL tube에 넣은 후, 미생물 보존을 위해 다시 해양심층수로 1mL 정도 적셔주고, 한국 미생물 보존센터에 보내어 바닷물 조건의 배지인 marine agar 에서 4℃, 30℃, 37℃의 조건으로 배양하였다. 그 결과 다른 양상의 7개의 colony를 확인하였으며, 7개의 colony에 대하여 염이 없는 배지인 Nutrient agar에서 배양하여 안정화한 후 잘 자라는 colony와 잘 자라지 않는 colony를 구분하여 해양 미생물의 확률을 높이는 실험을 진행하였다.
결과적으로, 7개의 colony 중에서 5개의 colony가 NA agar에서 자라지 않음을 확인하였으며, 5개의 colony에 대하여 해양 미생물일 수 있다는 확률을 가지고 균주로부터 16S rDNA를 분리하여, 이에 대한 핵산 서열을 결정하였고, 해당 서열과 종래의 알려진 서열과의 상동성을 비교한 결과 5개의 colony 모두 해양 미생물임을 확인하였다.
상기 5개의 해양 미생물 중 5번 해양 미생물(도 1 참조)이 Maritalea myrionectae 균주와 99%의 상동성을 가진 것으로 판정되었으며, 이 5번 해양 미생물을 2017년 8월 17일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁하였으며, 그 수탁번호는 KCTC13309BP이다(도 2 참조).
실시예 2: 발효실험
제주용암해수 유래 해양미생물 5종에 대하여 발효능을 알아보기 위해 Esculin 시험을 통해 당가수분해 능력을 평가하는 시험을 수행하였다.
그 결과, 5종의 해양 미생물 1: Oceanicola flagellatus(도 3의 1번째), 2: Marinobacter algicola(도 3의 2번째), 3: Marixanthomonas ophiurae(도 3의 3번째), 4: Oceanicola flagellatus(도 3의 4번째), 5: Maritalea myrionectae(도 3의 5번째) 중 5번 균주인 Maritalea myrionectae 에서 발효가 잘 이루어지는 것을 확인하였다.
2-1: 제주 용암 해수 유래 해양미생물 5번( Maritalea myrionectae )에 대한 esculin 발효실험
50ml Marine broth에 5번 균주 2.5ml을 접종하여 30oC, 150rpm에서 3일 동안 배양하였다. 그 후, 하기의 조건에서의 HPLC 크로마토그램상에서의 성분변화를 확인하였다(표 1, 도 4 참조).
Sample A : 50ml Marine broth + Esculin 0.1% + 균주배양액 0.5% seeding
Sample B : 50ml Marine broth + Esculin 0.05% + 균주배양액 0.5% seeding
Sample C : 50ml Marine broth + Esculin 0.025% + 균주배양액 0.5% seeding
반응시간 Sample A Sample B Sample C
0 6.28 6.36 6.43
24 6.30 6.35 6.42
48 6.32 6.58 6.68
72 7.33 7.29 7.44
96 7.92 7.76 7.93
168 8.27 8.12 8.20
실험결과, 제주용암해수 유래 해양미생물 5번(Maritalea myrionectae)은 발효율이 100%임을 확인하였다.
2-2: 제주 용암 해수 유래 해양미생물 5번( Maritalea myrionectae )에 의한 제주 약용식물 49종의 발효실험
도 5와 같이 제주약용식물 49종에 대해서 도 6과 같은 실험과정으로 해양 미생물 Maritalea myrionectae의 발효실험을 수행하였다.
액비 : 10 (3g/30ml), 추출온도 : Autoclave (121oC, 15min)의 조건으로 제주약용식물을 추출한 후, Marine broth 40ml에 상기 추출물 10ml을 혼합하고, Maritalea myrionectae 0.5ml을 접종하여 30oC, 150rpm의 조건하에 96시간 동안 발효를 진행하였다.
그 후, Maritalea myrionectae 발효 전과 후를 HPLC 분석하여 Bioconversion 유무를 확인하였다.
그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, 제주 약용 식물 49종 중 황칠나무, 비파엽, 동백겨우살이, 상황버섯, 야관문(비수리), 번행초(갯상추), 줄풀-뿌리, 자소엽, 부처손(권백), 가신새뿌리, 하늘타리뿌리, 까마중, 목통(으름덩쿨), 산뽕나무, 접골목, 개나무 및 호랑가시나무 17종에서 pH 변화가 현저함을 확인하였다.
또한, pH 에서는 현저한 변화가 없었으며 미백 활성, 항염 활성, 항아토피 활성의 증가를 보인 것으로는 석창포, 석위초, 구아바, 예덕나무, 돌외가 확인되었다.
실시예 3: 제주 용암 해수 유래 해양미생물 5번( Maritalea myrionectae )에 의한 제주 약용식물 발효물의 미백 효능 평가
1) 세포배양
Melanoma cell line인 B16F10 cell을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic (Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Grand Island, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 2일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.
2) melanin 생합성 저해 활성 측정
DMEM 배지로 배양된 B16F10 세포를 24 well plate에 2.0X104 cells/well로 접종한다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양 후 시료를 농도별로 준비한다. 각각의 농도별 시료와 cell에 자극하기 위하여 자극제인 a-MSH를 200nM로 혼합하여 첨가한다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 동안 배양한 후에 배양액을 제거한 후 인산완충액(pH 7.4)으로 각 well을 세척한다. 1N NaOH를 100ul씩 가하여 cell을 떼어낸 후 1.5ml tube에 옮겨준다. 80℃에서 1시간 반응시킨 후 분광광도계 490 nm에서 흡광도를 측정한다. melanin 생합성 저해는 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타낸다.
도 8에서 확인할 수 있듯이, B16F10 cell에 a-MSH 200ng으로 자극함과 동시에 Maritalea myrionectae와 제주 약용식물을 동시 배양하여 배양 전과 후의 배양액 샘플에 대하여 5%의 농도로 처리한 후 48시간 배양하여 melanin 저해 활성을 확인하였다. 대조군으로는 arbutin을 사용하였다. melanin 생합성률(%)은 a-MSH 단독 처리군 대비로 계산하여 그래프를 나타내었다. 실험 결과 석창포와 비파엽, 석위초, 구아바, 상황버섯, 야관문(비수리), 예덕나무잎, 접골목, 개나무, 호랑가시나무에서 배양 전과 배양 후를 비교했을 때 melanin 생합성 저해 활성 효과가 배양전보다 배양 후에 증가한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 제주 용암 해수 유래 해양미생물 5번( Maritalea myrionectae )에 의한 제주 약용식물 17종 발효물의 항아토피 효능 평가
1) 세포배양
Human keratinocyte cell line인 HaCaT cell을 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic과 10% fetal bovine serum이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.
2) 염증성 chemokines (TARC, MDC) 생성 억제 활성 측정
HaCaT cell을 3.0X105 cells/mL로 24 well plate에 18시간 전 배양하고, 시료를 농도별로 준비한 후 준비된 시료에 IFN-γ 와 TNF-a 를 각각 10ng/mL 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다. 이후 배양액을 1.5ml tube에 옮겨 원심 분리하여 얻어진 상층액의 chemonkines 합성량을 측정한다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 한다. 염증성 chemokines는 Human enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다.
- TARC 억제 활성 측정
도 9에서 확인할 수 있듯이, HaCaT cell에 TNFa 10ng/ml과 IFNγ 10 ng/ml로 자극함과 동시에 Maritalea myrionectae와 제주약용식물 27종을 동시 배양하여 배양 전과 후의 배양액 샘플에 대하여 5 %의 농도로 처리한 후 24시간 배양하여 TARC 발현 억제 활성을 확인하였다. 실험 결과 석위초와 구아바, 예덕나무, 접골목, 개나무에서 배양 전과 배양 후를 비교했을 때 TARC 발현 억제 활성 효과가 배양 전 보다 배양 후에 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- MDC 억제 활성 측정
도 10에서 확인할 수 있듯이, HaCaT cell에 TNFa 10ng/ml과 IFNγ 10 ng/ml로 자극함과 동시에 Maritalea myrionectae와 제주 약용식물 27종을 동시 배양하여 배양 전과 후의 배양액 샘플에 대하여 5%의 농도로 처리한 후 24시간 배양하여 MDC 발현 억제 활성을 확인하였다. 실험 결과 황칠나무와 돌외, 석위초, 구아바, 예덕나무, 접골목, 개나무에서 배양 전과 배양 후를 비교했을 때 MDC 발현 억제 활성 효과가 배양 전 보다 배양 후에 증가한 것을 확인할 수 있었다.

Claims (5)

  1. 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 제주 용암 해수 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주.
  2. 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주를 이용하여 황칠나무, 비파엽, 동백겨우살이, 상황버섯, 야관문(비수리), 번행초(갯상추), 줄풀-뿌리, 자소엽, 부처손(권백), 가신새뿌리, 하늘타리뿌리, 까마중, 목통(으름덩쿨), 산뽕나무, 접골목, 개나무, 호랑가시나무, 석창포, 석위초, 구아바, 예덕나무 및 돌외로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 발효시킨 발효 조성물.
  3. 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주를 이용하여 발효시킨 황칠나무 발효물, 비파엽 발효물, 동백겨우살이 발효물, 상황버섯 발효물, 야관문(비수리) 발효물, 번행초(갯상추) 발효물, 줄풀-뿌리 발효물, 자소엽 발효물, 부처손(권백) 발효물, 가신새뿌리 발효물, 하늘타리뿌리 발효물, 까마중 발효물, 목통(으름덩쿨) 발효물, 산뽕나무 발효물, 접골목 발효물, 개나무 발효물, 호랑가시나무 발효물, 석창포 발효물, 석위초 발효물, 구아바 발효물, 예덕나무 발효물 및 돌외 발효물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 활성 성분으로 포함하는 화장품 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주를 이용하여 발효시킨 발효물 중에서 석창포 발효물, 비파엽 발효물, 석위초 발효물, 구아바 발효물, 상황버섯 발효물, 야관문(비수리) 발효물, 예덕나무 발효물, 접골목 발효물, 개나무 발효물 및 호랑가시나무 발효물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 활성 성분으로 포함하여 미백 효과가 증진된 화장품 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 수탁번호 KCTC13309BP로 수탁된 해양 유래 신규 Maritalea myrionectae 균주를 이용하여 발효시킨 발효물 중에서 석위초 발효물, 구아바 발효물, 예덕나무 발효물, 접골목 발효물, 개나무 발효물, 황칠나무 발효물 및 돌외 발효물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 활성 성분으로 포함하여 항염 효과에 의한 아토피 증상 개선 효과를 가지는 화장품 조성물.
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