JP6021052B2 - ノリの発育を促進する細菌を添加したノリ培養法 - Google Patents

Description

本発明は、ノリを養殖する技術に関わる。より具体的には、本発明は、制御された条件下でノリを培養する方法に関わる。

ノリは最もよく食用にされる海藻類の一つである。ノリのライフサイクルは複雑であり、大きく分けると、受精によって生じ２組の染色体を有する複相世代（２ｎ）と、減数分裂によって生じ１組の染色体を有する単相世代（１ｎ）とに分けられる。各世代はさらに、形状や大きさが異なる複数のステージを含んでおり、一般に食用に付されるのは単相世代のうち葉状体と呼ばれるステージである。葉状体において、雌雄生殖細胞にそれぞれ相当する造果器細胞および精細胞が形成され、これらが受精して複相世代に入り、接合胞子、糸状体、殻胞子と呼ばれる各ステージを経た後に、殻胞子発芽体と呼ばれるステージにおいて減数分裂が起こって再び単相世代に入り、単相の細胞から葉状体が生長する。以上で述べた１サイクルが完結するのにおおよそ１年かかる。

ノリを産業的に養殖することは従来から行われてきたが、糸状体を人為的に植えつけて上記のライフサイクルを養殖場において再現するという域を出るものではなかった。従って、従来のノリ養殖には例えば以下のような制限があった。
・葉状体を得るまでに数か月という長い時間がかかり、次のサイクルを開始できるまで１年ほどかかる。
・有用な品種を得るための掛け合わせは可能であるが、受精およびさらなる減数分裂を介するため、世代間の遺伝学的均一性（ひいては品質の均一性）を確保できない。
・殻胞子の放出という自然現象に依存するため、生産量に限りがある。
・糸状体から殻胞子を得るまでの作業は相当の時間と技術が必要である。

ライフサイクルの全てのステージを経由することなく、特に複相世代を経由することなく、葉状体から直接新たな葉状体を産生することができれば、養殖期間を短縮でき、望ましい品種の遺伝学的均一性も保たれる。そこで、本発明者らはプロトプラストに着目した。

プロトプラストとは、一般に、細胞壁を人為的に除去した細胞を意味する。ノリの葉状体組織から調製されたプロトプラストは、葉状体を再生する能力を有する場合もあることが知られている。単一のプロトプラストを成長させて得られる葉状体は、元のプロトプラストと同一の１組の染色体を有している。同様に、単一の葉状体から得られる個々のプロトプラストは、全て同一の１組の染色体を有しており、いわゆるクローンの関係にある遺伝学的に均一な個体を多数産生することができる。この場合、１つの葉状体からいくつの新たな葉状体を産生できるかは、葉状体組織からいくつのプロトプラストを分離して培養するかという人為的作業に依存しており、殻胞子の自然放出に依存する場合のような量的制約がない。また、単相・単細胞の組合せを体現しているプロトプラストは突然変異誘導や有用形質の同定・選別にも適している。その上、異なるプロトプラスト同士を細胞融合して新たな個体を産生することができることも知られている。従って、所望の形質を人為的に作製または選別し維持するという側面において、プロトプラストを介する技術は非常に大きな魅力と可能性を有する。

無菌状態でノリを培養すると、細胞分裂しなかったり、異常な細胞分裂をしたり、カルスを形成したりして、正常な形態形成や生長が進みにくくなることが知られている。これは、無菌化に使用される抗生物質がノリに直接悪影響を与えているという可能性に加え、海水中に生息する細菌類との共生関係がノリの正常な生育にとって重要である可能性も示唆している。従って、従来のノリの培養は雑多な細菌を含んだ天然の海水の使用に依存する部分が大きかった。しかしながら一言で海水と言っても含有微生物が大きく変動することがあり得る。例えば、無作為に採取した海水サンプルには、ノリの生育に必要な細菌が含まれていなかったり、あるいはノリにとってむしろ有害な細菌が含まれていたりする可能性がある。従って、天然海水の使用はノリの培養系に不確定要素をもたらし、安定した生育条件の理解および確保に支障をきたし得る。

従って、ノリの正常な生育を助ける特定の微生物種を同定し、いったん無菌状態にしたノリにその特定の微生物を添加することによってノリの育成を行うことができれば、安定性や再現性に優れた培養系が得られ、さらなる好適培養条件の理解や開発も促進されるため、非常に望ましい。また、無菌化と特定細菌添加とを組み合わせたそのような培養系をプロトプラストに適用できれば、培養条件的要素と遺伝学的要素の双方がコントロールされることになり、一層望ましい。また、天然海水への依存がなくなれば、衛生面の管理も容易になり、海から離れた工場や農場において産業的にノリを製造できる可能性も生まれる。

嵯峨らは、スサビノリの無菌の糸状体（２ｎ）から得られた殻胞子の形態形成と成長を促進する細菌の分離・同定を記述している（非特許文献１、２）。これらの細菌は分類学的にはプロトバクテリア綱アルファ亜綱に属する新種であった（非特許文献３）。いわゆるノリ以外の海藻については、無菌化処理したアオサ目の緑藻の形態形成と成長を助ける、Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroidesグループの細菌を分離・同定した松尾らの研究があり（特許文献１）、当該細菌において前記促進効果を担う特定の化合物を同定したことも報告されている（非特許文献４）。なお、これらの文献では、抗生物質の添加をもって無菌化とみなしているが、一般的に個々の抗生物質は必ずしもすべての細菌を抑制するわけではないことはよく知られており、これらの実験が厳密にどれほどの無菌化を達成しているかは不明である。

海藻由来プロトプラストの作製および培養においては、そもそも無菌化を達成することに重点をおいてなされた研究がほとんどなく（非特許文献５）、ましてやプロトプラスト培養にとって有用な細菌があるかどうかは全く知られていない。またプロトプラストを無菌状態で培養したと言う記述があったとしても無菌性が厳密に検証されていないことが多いために培養における細菌の貢献度は不明であった。上述したように、ノリのプロトプラストの培養をよく管理された条件下で行うことは品質管理や生産性の点で非常に有利であると考えられ、プロトプラストの厳密な無菌化を行う方法や、プロトプラストの葉状体への再生を促進する細菌を同定し培養に利用することには大きな産業的価値がある。

特開２００３−１８９８４５

山崎綾乃、関田諭子、半澤直人、奥田一雄、嵯峨直恆 (2000) 海産紅藻スサビノリ無菌培養株の成長促進・形態形成回復要因、特に馴化培地中の共生細菌の影響について。東海大学海洋研究所研究報告 21:57-76 森俊介、山崎綾乃、芹沢（松山）和世、福田覚、水田浩之、嵯峨直恆 (2004) 無菌培養された海産紅藻スサビノリの成長に対する共生菌２株の効果。水産増殖52:239-244 Hanzawa N, Chiba SN, Miyajima S, Yamazaki A, Saga N (2010) Phylogenetic characterization of marine bacteria that induce morphogenesis in the red alga Porphyra yezoensis. Fish Genetics and Breeding Science 40:29-35 Matsuo Y, Imagawa H, Nishizawa M, Shizuri Y (2005) Isolation of an algal morphogenesis inducer from a marine bacterium. Science 307:1598 藤田雄二 (1991) ラボマニュアル マリンバイオテクノロジー（宮地重遠監修）第３．２章

本発明の目的は、厳密な無菌性を達成したノリのプロトプラストの作製法を確立すること、無菌プロトプラストの発育を促進する特定の細菌を単離・同定すること、前記細菌を用いて無菌プロトプラストからノリ葉状体を育成する方法を提供すること、を含む。

発明者らはまず、酸処理と酵素処理の組合せにより無菌のプロトプラストを分離する方法を確立した。発明者らはさらに、ノリ葉状体の表面や培養液中などから採集された多様な細菌を分離し、それぞれの細菌を無菌プロトプラスの培養に添加してスクリーニングを行うことにより、葉状体形成を促進する特定の細菌を同定した。以上の結果により、プロトプラストを管理された条件下で培養して葉状体を得るという、ノリの新たな養殖法が提供される。

従って、本発明は以下の項目を含む。
（１）ノリの葉状体由来プロトプラストを培養して新たな葉状体を産生する培養方法であって、前記プロトプラストに培地を添加し、さらにＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌を添加して培養を行うことを特徴とする方法。
（２）Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌がＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属である、１に記載の方法。
（３）Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属の細菌が、ＳＣＭ−２株、ＳＮＭ−１４株、ＬＮＭ−９株、ＬＮＭ−２１株、ＬＮＭ−２４株、ＳＮＭ１０−３株、ＳＮＭ１０−６株、ＳＮＭ１０−１２株、ＳＮＭ１０−１３株、ＳＮＭ１０−１６株、ＳＮＭ１０−１９株、ＬＮＭ１０−４株、ＬＮＭ１０−１６株からなる群から選択される１種以上である、２に記載の方法。
（４）Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌がＡｌｇｉｍｏｎａｓ属である、１に記載の方法。
（５）Ａｌｇｉｍｏｎａｓ属の細菌が、１４Ａ−８株、１４Ａ−２−１株、１４Ａ−２−４株からなる群から選択される１種以上である、４に記載の方法。
（６）ノリがスサビノリである、１〜５のいずれかに記載の方法。
（７）培地が無菌培地である、１〜６のいずれかに記載の方法。
（８）プロトプラストが、無菌プロトプラストである、１〜７のいずれかに記載の方法。
（９）ノリの葉状体由来プロトプラストからの葉状体の発育を促進するＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌である、ＳＣＭ−２株、ＳＮＭ−１４株、ＬＮＭ−９株、ＬＮＭ−２１株、ＬＮＭ−２４株、ＳＮＭ１０−３株、ＳＮＭ１０−６株、ＳＮＭ１０−１２株、ＳＮＭ１０−１３株、ＳＮＭ１０−１６株、ＳＮＭ１０−１９株、ＬＮＭ１０−４株、およびＬＮＭ１０−１６株。
（１０）ノリの葉状体由来プロトプラストからの葉状体の発育を促進するＡｌｇｉｍｏｎａｓ属の細菌である、１４Ａ−８株、１４Ａ−２−１株、および１４Ａ−２−４株。
（１１）以下の工程を含む、ノリ無菌プロトプラストの調製方法：
ａ．ノリの葉状体をクエン酸含有液で洗浄する工程
ｂ．葉状体をプロテアーゼ溶液で処理する工程
ｃ．葉状体をマンニトール含有液で洗浄する工程
ｄ．葉状体を細胞壁溶解酵素溶液で処理する工程
ｅ．細胞壁溶解により生じたプロトプラストを濾過する工程
ｆ．プロトプラストを遠心分離する工程
ｇ．プロトプラストをマンニトール含有液で洗浄する工程
（１２）プロテアーゼがパパインである、１１に記載の方法。
（１３）細胞壁溶解酵素が、アガラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼの混合物である、１１または１２に記載の方法。
（１４）ノリがスサビノリである、１１〜１３のいずれかに記載の方法。
（１５）無菌プロトプラストが、前記１１〜１４のいずれかの方法により調製された無菌プロトプラストである、８に記載の方法。
（１６）以下の工程を含む、ノリ葉状体由来無菌プロトプラストから葉状体への発育を促進する細菌をスクリーニングする方法：
ａ．複数の培養容器において、前記プロトプラストと、スクリーニングの対象となる個々の細菌株とを分注して、共培養する工程
ｂ．葉状体形成が生じた培養容器を特定し、その容器に適用した細菌株を特定する工程
（１７）スクリーニングの対象となる細菌株が、ノリ葉状体培養液またはノリ葉状体試料由来のものを含む、１６に記載の方法。
（１８）スクリーニングの対象となる細菌株が、抗生物質処理されたノリ葉状体由来のものを含む、１７に記載の方法。
（１９）ノリがスサビノリである、１６〜１８のいずれかに記載の方法。
（２０）無菌プロトプラストが、１１〜１４のいずれかの方法により調製された無菌プロトプラストである、１６〜１９のいずれかに記載の方法。

本発明により、管理された安定な条件下で、複相世代を経ることなく遺伝学的な均一性を維持したまま、単相の葉状体から直接新たな葉状体を効率よく迅速に産生することが可能となる。

本発明にかかる無菌プロトプラストの調製法の好ましい一実施態様を示す。 クエン酸処理しない場合およびした場合における、葉状体懸濁液およびプロトプラスト試料の無菌性の程度を示す。 ノリの培養液に抗生物質を添加した場合における細菌相の変化を示す。 接種した細菌の分類群の違いによるノリプロトプラストの葉状体形成率の違いを示す。 Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の各株による葉状体形成率を、他の科との比較として示す。 図５のグラフにさらにカルス形成細胞、不定形分裂細胞、未分化細胞のデータを加えて示したものである。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科との共培養により、葉状体形成率だけでなく全体的な生残率も上昇していることがわかる。 Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＮＭ１０−１６株を添加した場合と細菌無添加の場合とのプロトプラスト成長程度の違いを示す。３種類の異なる培地で同様の結果が得られることがわかる。 無菌プロトプラストをＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＮＭ１０−１６株と６週間共培養した後、さらに２週間培養して得られた葉状体を示す。

本発明はあらゆるノリの種類に適用し得るが、用いられるノリの種類としてはアマノリ類、特にスサビノリが好ましい。

本発明の一つの態様においては、ノリ葉状体から無菌プロトプラストを調製する方法が提供される（図１）。従来は、無菌ノリは糸状体等から出発して調製されることが普通であったが、それに対して無菌ノリをプロトプラストという形で得ることの利点としては、単相（１ｎ）であること、商品価値のある葉状体を直接の調製源とすること、簡便な操作で大量に得られること、成長促進細菌のスクリーニングが効率よく行えること、等が挙げられる。

本発明の無菌プロトプラスト調製法は、酸性液による洗浄と酵素処理を組み合わせたものであり、抗生物質の使用を必要としないが、抗生物質添加の可能性を排除するものではない。具体的には、まずノリ葉状体をクエン酸含有液（ｐＨ２．０〜２．３が好ましい）、例えばクエン酸含有海水で洗浄し、続いて滅菌液、例えば滅菌海水で洗浄する。なお、以下の無菌化操作において使用する全ての液はフィルター滅菌等で滅菌されたものであることが望ましいことは言うまでもない。クエン酸の濃度は当業者が適正な範囲を決定することができるが、例えば０．１〜５％（ｗ／ｖ）、特に０．５％が好ましい。図２はクエン酸処理の効果を示している。クエン酸含有液で洗浄することにより、葉状体の段階から大部分の細菌を除去することができ、プロトプラストの段階における無菌性をより確実にできることがわかる。洗浄した後の葉状体は、後の処理がしやすいように細断することが好ましい。

続いて葉状体をプロテアーゼで処理する。プロテアーゼの種類としてはパパインが特に好ましいが、同様の活性を有する他の酵素でも代用し得る。複数のプロテアーゼを組み合わせて使用してもよい。プロテアーゼは通常、溶液として使用され、濃度は例えば０．１〜１０％（ｗ／ｖ）であり、特に２％が好ましい。続いてマンニトール含有液、例えばマンニトール含有海水で少なくとも１度洗浄する。マンニトール（他の糖や浸透圧調製剤で代用し得る）の濃度は例えば０．１〜２Ｍの範囲であり、特に０．７Ｍが好ましい。次に細胞壁溶解酵素で葉状体を処理する。細胞壁を溶解できる酵素は当業者にはよく知られており、例としてはアガラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ等が挙げられ、これらを複数組み合わせて使用することが好ましい。酵素の適切な濃度や処理時間は当業者が適宜決定できる。好ましい態様では、酵素処理液８ｍｌあたりアガラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼを各０．１〜１０ユニット（より好ましくは８ｍｌあたり各酵素１ユニット）含ませ、６０〜９０分間葉状体サンプルに含浸させる。細胞壁の溶解に伴って葉状体組織はバラバラになり単細胞のプロトプラストが得られる。次にメッシュ（例えば２０μｍ）等で濾過して組織片その他の混在物を除去する。濾液を遠心分離処理してプロトプラストを沈殿させ、上記と同様のマンニトール含有海水またはその代替液で洗浄するという操作を、少なくとも１度行い、好ましくはこの遠心と洗浄の操作を数回繰り返し、プロトプラスト分離が完了する。遠心分離の条件は例えば５００〜５０００ｒｐｍで１分〜１時間とすることができ、１０００ｒｐｍ、５分が好ましいが、これらの数値は当業者が適宜変更できる。本発明の無菌プロトプラスト調製法の好ましい一態様を図１に示す。以上の作業は１日以内で完了できるものであり、例えば糸状体から殻胞子を得る作業と比べるとはるかに迅速であることは言うまでもない。

無菌化操作の各段階において無菌化がどの程度達成されているかを調べるためには、適切な固形培地（例えばＺｏＢｅｌｌ２２１６Ｅ培地）上に懸濁液を塗布してインキュベートし、形成する細菌コロニーの数を計測することが好ましい。当業者に知られる他の方法で細菌を検出あるいは測定してもよい。最終的に達成されるプロトプラストの無菌化の程度は、試料１ｇあたりのＣＦＵ（コロニー形成単位）が１×１０²以下であることが好ましく、１×１０¹以下であることがさらに好ましく、計数限界以下であることが最も好ましい。本明細書では、１ｇあたりのＣＦＵが１×１０²以下であるものを無菌プロトプラストと呼ぶ。

本発明の別の態様においては、無菌プロトプラストの葉状体への成長を促進する細菌のスクリーニング方法が提供される。ここで用いられる無菌プロトプラストは、公知または非公知のいかなる調製法を用いて調製したものでもよいが、抗生物質はノリの生育に悪影響を及ぼし得ること、スクリーニング対象である細菌にも作用し得ること、一般に抗生物質の殺菌作用は完全ではなく場合によっては抗生物質の投与が特定の細菌群の繁殖を助長してしまうこと、を考慮すると、抗生物質に依存しない調製法が望ましい。特に、本発明の前記態様にかかる調製法による無菌プロトプラストを用いることが好ましい。

スクリーニングの対象となる細菌群としては、真の共生菌を同定するという観点からはノリ葉状体由来のものが望ましい。例えば、ノリの培養に使用した培養液（馴化培養液）、葉状体の表面、細胞壁試料、プロトプラスト試料等から細菌を採集することができる。しかしながら、本発明にかかるスクリーニング法は原理的にはいかなる採集源から得た細菌に対しても適用し得る。採集した細菌群から個々の細菌を単離する方法は当業者によく知られており、例えば固形培地プレートに細菌群含有液を播いてコロニーを単離することができる。

抗生物質の添加は試料中の菌相（すなわち、どのような細菌の種類がどれほどの割合で存在しているか）を変化させ得るので、スクリーニングのための菌の採集に際してあえて抗生物質を用いることも、より多様な菌コレクションを構築する上で有効である（図３）。その一方で、無菌化を達成するための手段としては抗生物質の添加は十分ではないこともわかる。例えば表１で示す実験例では、抗生物質の添加によって、むしろコントロールよりも細菌数が増えることもあり、プロトプラストにした段階における無菌性の程度もむしろ低下し得ることがわかる。

スクリーニングは以下の手順で行われる。まず、複数の培養容器の各々に、無菌プロトプラスト、スクリーニングの対象となる細菌、および適切な培地を分注する。一般的に細胞培養に利用されるシャーレやウェルプレートがこの用途に適している。以下、ウェルプレートを使用する場合を例にして説明する。スクリーニングに使用されるプロトプラストの個数（細胞数）は、１ウェルあたり１個が最低限必要であり、上限は特に限定されずウェルの大きさにもよるが、比較を公正にするためにはウェル間で個数のばらつきが少ないようにすることが望ましい。例えば１ウェルあたり１〜１０⁶のプロトプラストを入れることができる。２４ウェルプレートの場合ならば１ウェルあたり約１０²個のプロトプラストを入れることが特に好ましい。無菌プロトプラストと細菌と培地とを混合してからウェルに入れてもよいし、これらを別々にいずれかの順番でウェルに入れてもよい。なお、本明細書において、「プロトプラストに培地を添加し、さらに細菌を添加する」と言う場合、その意味するところは、プロトプラストと培地と細菌とをいずれか任意の順序で混合した場合およびこれらを同時に混合した場合の両方を含むものとする。つまり、前記表現は添加の順序を限定するものではない。ただし、「細菌をさらに添加する」という表現は、培地およびプロトプラストとは別個に細菌を添加することを意味するものとする。すなわち、もし培地自体（またはプロトプラスト自体）に初めから何らかの細菌が含まれていたとしても、本発明にかかる細菌を外部から「さらに」添加することを意味する。

培養液の容量は、例えば２４ウェルプレートならば１ウェルあたり１ｍｌ〜１．５ｍｌが適切である。細菌液の濃度は例えば１０¹〜１０⁹ＣＦＵ／ｍｌの範囲で適宜選択でき、１ウェルあたり約１０⁵〜１０⁶ＣＦＵが好ましく、培地１ｍｌにつきこの細菌液を例えば１μｌ〜１ｍｌ加えることができる。比較を公正にするためにはウェル間でＣＦＵのばらつきが少ないようにすることが望ましい。１ウェルにつき１種の細菌を入れるのが通常であるが、スクリーニングの効率を上げる目的や、細菌同士の相乗効果を試験する目的で、１ウェルに複数の細菌種を入れる態様も考えられる。

無菌プロトプラストと細菌との混合物を、適切な培地（培養液）の存在下でウェルの中で培養する。培養に際しては明暗サイクルを設けることが好ましく、例えば１２時間明／１２時間暗、あるいは１０時間明／１４時間暗といったサイクルを採用できる。培地（培養液）としては例えばＮＰ培地（滅菌海水にＮａＮＯ₃（１００ｍｇ／ｌ）およびＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ（２０ｍｇ／ｌ）を加えたもの）が好ましいが、ノリの培養に使用される他の培地でもよい。他の好ましい培地の例としては滅菌海水をベースとした１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ培地（ＳＷＭ−ＩＩＩ培地（Ogata, E. (1970) Bull Jpn Soc Phycol 18, 171-173）からsoil extract、liver extract、tris、ビタミンを除き滅菌海水で１０倍希釈したもの）、ｆ／１０培地（ｆ培地（Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. (1962) Can. J. Microbiol., 8, 229-239）を滅菌海水で１０倍希釈したもの。Sigmaから購入したｆ／２培地から調製）、１／５ＮＰ培地等が挙げられる。これらの培地は液体として使用してもよいし寒天等を加えた固形培地として使用してもよい。まず固体培地で培養して途中から液体培地に移植してもよい。培地の組成や温度にもよるであろうが、例えば上記培地中で１７℃で培養した場合は、６週間程度で顕微鏡下で葉状体形成細胞が他の種類の細胞（未分化細胞、不定形分裂細胞、カルス）から区別できるようになる。ここで、「葉状体形成細胞」は、細胞壁を形成した後、１本の仮根および正常な細胞分裂が観察される細胞として定義した。「未分化細胞」は、細胞壁は形成するがそれ以上の形態形成は示さない細胞として定義した。「不定形分裂細胞」は、葉状体への形態形成過程で奇形化した細胞として定義し、「カルス」は未分化の細胞が凝集し細胞塊を形成したものと定義した。葉状体形成が見られたウェルに添加していた細菌が、「無菌プロトプラストの葉状体への発育を促進する細菌」であり、当該スクリーニングが探求していた目的物と言える。

発明者らは、上記の無菌プロトプラスト調製法および細菌スクリーニング法を実施することにより、無菌プロトプラストの葉状体への発育を促進する細菌を同定した。すなわち、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌と共に無菌プロトプラストを培養すると、他の科の細菌と共培養した場合や細菌無添加で培養した場合よりも有意にプロトプラストの生残率および葉状体形成率が高いことを見出した（図４〜７）。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の複数の属および複数の種において発育促進効果が確認され、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科細菌全般がこの発育促進効果を有することが示された。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌は公知であり、また実施例で示すように、ノリの葉状体由来の細菌（葉状体馴化培養液、葉状体表面等の採取源から採取されたもの）を無作為に分離すると、少なくとも数％（実施例では７％）の割合で当該分類に属する細菌が得られ、またこの数％のものはＰＣＲ等の手法で容易に識別することができる。そして、無作為に分離されたものでも当該分類に属する菌株ならば全て同様の効果を発揮することが示された（図６）。すなわち、本願発明の方法に有用なＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌は公知であり、かつ当業者が容易に入手でき、試行錯誤を経ずとも実施できるものである。

従って、本発明のもう一つの態様においては、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌を培地に添加することによりノリ葉状体由来のプロトプラストから直接新たな葉状体を培養する方法が提供される。ここで使用されるプロトプラストは、例えば上記の方法により得られた無菌プロトプラストであることが好ましい。しかしながら、無菌化していないプロトプラストに上記細菌を添加した場合でも、混在菌との相互作用で多少の効果程度の変化は起こり得るが、本質的に同様の葉状体形成促進効果が得られると考えられる。培地に関しても、無菌の培地（滅菌培地）、すなわち人為的に添加する上記の細菌以外の細菌は含まないものを使用することが原則であり、それが好ましい。人為的に細菌を加える前の培地の無菌の程度は、１ｍｌあたりのＣＦＵが１×１０²以下であることが好ましく、１×１０¹以下であることがさらに好ましく、計数限界以下であることが最も好ましい。本明細書では、１ｍｌあたりのＣＦＵが１×１０²以下であるものを無菌培地または滅菌培地と呼ぶ。無菌でない培地（例えば天然海水）を用いる場合であっても、混在菌との相互作用で多少の効果程度の変化は起こり得るが、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌を人為的にさらに添加することにより本質的に同様の葉状体形成促進効果が得られると考えられる。

本発明に係るプロトプラストの培養法に使用できるＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科細菌としては、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属およびＡｌｇｉｍｏｎａｓ属が好ましい。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属の例としては、ＳＣＭ−２株、ＳＮＭ−１４株、ＬＮＭ−９株、ＬＮＭ−２１株、ＬＮＭ−２４株、ＳＮＭ１０−３株、ＳＮＭ１０−６株、ＳＮＭ１０−１２株、ＳＮＭ１０−１３株、ＳＮＭ１０−１６株、ＳＮＭ１０−１９株、ＬＮＭ１０−４株、ＬＮＭ１０−１６株が挙げられる。ＬＮＭ１０−１６株は高い葉状体形成率を提供できるため特に好ましい。Ａｌｇｉｍｏｎａｓ属の例としては、１４Ａ−８株、１４Ａ−２−１株、１４Ａ２−４株が挙げられる。これらの他にも、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の他の任意の株、あるいは上記のスクリーニング法で同定される別の細菌をプロトプラスト培養に使用することもできる。

培養条件としては、上記スクリーニングにおける培養と本質的に同じものをスケールアップして使用できる。例えば、プロトプラスト懸濁液１ｍｌ（１０⁴細胞）にＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ ＬＮＭ１０−１６株の懸濁液１ｍｌ（１０⁸〜１０⁹ＣＦＵ）を加え、最初の４週間には１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ培地、ｆ／１０培地、１／５ＮＰ培地のいずれかの寒天培地を使用し、５週目以降から同様のものの液体培地（例えば１０〜１０００ｍｌ）に移植することができる。初めに添加した細菌はノリ組織上で生存するので、液体培地に新たに細菌を加える必要はない。追加の細菌添加を行うことも不可能ではない。当業者にはよく知られているように、振盪培養や通気培養を適宜行ってもよい。培地の組成や温度にもよるが、通常は、プロトプラストの培養を開始してから８週間ほどで少なくとも数センチの大きさのノリ葉状体が得られる（図８）。

［方法］
ノリの培養条件
モデルノリとしてスサビノリを使用した。スサビノリＵ−５１株の葉状体を、滅菌した改変１／２ＳＷＭ―ＩＩＩ培地（希釈率が２倍である以外は上記１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ培地と同じ）で培養した。培養条件は１７℃、明暗周期：１０時間明／１４時間暗、光強度５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^-2Ｓ^-1とし、換水は１週間おきに行った。試料採取１週間前に、培養液に抗生物質を加えない区、アンピシリン添加区（１０ｍｇ／ｌ）、およびネオマイシン添加区（１０ｍｇ／ｌ）の３つの試験区を設けた。

ノリプロトプラストの分離
３つの試験区からそれぞれプロトプラストを調製するために、培養５〜６週目の複数の葉状体を用い、湿重量５０〜１００ｍｇに調整した。葉状体からのプロトプラストの分離は、図１に示す方法によって行った。まず、０．５％クエン酸溶液（ｐＨ２．０〜２．３）を用いて葉状体を９０〜１８０秒間浸漬処理し、滅菌９０％海水で洗浄した。それから葉状体をカミソリで細断した。２％パパイン（ｐＨ７．５）を加え、３０分振盪した後、０．７Ｍマンニトール海水で数回洗浄した。次に、細胞壁溶解酵素液（アガラーゼ、キシラーゼ、マンナナーゼ各１ユニット／８ｍｌ）を加え６０〜９０分振盪した。これらの酵素はヤクルト薬品工業から購入した。酵素処理液を２０μｍメッシュで濾過し、メッシュ上に残った画分を「細胞壁試料」とした。濾過画分に対して１０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、得られたプロトプラストを０．７Ｍマンニトール海水で数回洗浄した後、最終的に０．７Ｍマンニトール海水を加えてプロトプラスト懸濁液（１０⁶細胞／ｍｌ）を作製した。

ノリ試料由来の細菌の培養
細菌採取のための試料として、葉状体を培養した後の（馴化）培養液、葉状体、細胞壁、およびプロトプラスト懸濁液を用いた。葉状体表面または細胞壁試料に付着した細菌を分離するためには、これらの試料にそれぞれ８ｍｌまたは１６ｍｌの滅菌７５％天然海水を加え、１分間激しく振盪し、懸濁液原液を得た。それぞれの液試料の１０倍希釈液列は、滅菌７５％天然海水で希釈することによって作製した。希釈液列から適当な数段階を選び、１００μｌをＭａｒｉｎｅ ａｇａｒ ２２１６培地（Ｄｉｆｃｏ；Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ ２２１６に寒天を加えたもの）に平板塗抹し、２０℃で２週間培養を行った。また、細胞壁およびプロトプラスト懸濁液の試料については、フィルタ捕集による培養とＭＰＮ法による増菌培養を行った。

分離細菌株の同定
培養液、葉状体表面、細胞壁、およびプロトプラスト懸濁液由来の細菌を培養した平板から、無作為に細菌集落を釣菌し、３回の純粋分離を行った。それぞれの分離株からゲノムＤＮＡを以下の方法により抽出した。細菌集落を１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えたＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）２００μｌに懸濁し、１００℃、５分間の加熱を行った。その後、クロロホルムとイソアミルアルコールの混合液（２４：１ ｖ／ｖ）を等量加え、激しく混合した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清をＤＮＡ試料とした。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の前半約７００ｂｐの領域の配列を決定するために、真正細菌のユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）および１４９２Ｒ（５’−ＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を用いたＰＣＲ増幅を行った。鋳型としてのゲノムＤＮＡ試料（２μｌ）、２７Ｆプライマー（０．５μＭ）、１４９２Ｒプライマー（０．５μＭ）、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（１×）、ｄＮＴＰミックス（各０．２ｍＭ）、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（０．５ユニット）（Ｔａｋａｒａ）、および滅菌蒸留水が混合された計２０μｌの反応液でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９５℃３分でＤＮＡを熱変性させた後、（熱変性９５℃３０秒→アニーリング５５℃３０秒→伸長反応７２℃１分）というサイクルを３０回繰り返し、最後に伸長反応を７２℃で７分間追加する、というものであった。本プライマーセットによる増幅産物の有無は、２．０％アガロースゲルを用いた電気泳動により確認した。この増幅産物を元にして、２７Ｆプライマーを用いたサイクル・シークエンシングにより、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定を行った。各試料につき、２０の細菌の配列のアラインメントをＣｌｕｓｔａｌ Ｘで作成し、ＭＥＧＡ５で系統解析を行った。距離行列を作成し、＞９８％の相同性を基準にグループ化した。さらに、それぞれの試料における代表株については、１６Ｓ ｓＲＮＡ遺伝子塩基配列のほぼ全長を決定した。

無菌プロトプラストと分離細菌株の混合培養
ノリの培養液、葉状体表面、細胞壁、およびプロトプラストから得られた合計２５９株から選抜した菌株を、プロトプラストへの添加試験に用いた。それぞれの供試菌株は、Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ ２２１６で培養し、滅菌７５％天然海水を用いて１０倍希釈した。培地としては、硝酸ナトリウム１００ｍｇ／ｌおよびリン酸水素二ナトリウム１２水和物２０ｍｇ／ｌを添加した滅菌９０％海水を使用した。ウェルプレートに、培地を１ｍｌ、およびプロトプラスト（１０³細胞／ｍｌ）を０．１ｍｌ加え（１０²細胞／ウェル）、その後、約１０⁷〜１０⁸ＣＦＵ／ｍｌの菌液を１０μｌずつ加えた（約１０⁵〜１０⁶ＣＦＵ／ウェル）。対照の細菌未接種区では、前記菌液の代わりに、滅菌７５％天然海水で１０倍希釈したＭａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ ２２１６を１０μｌ加えた。培養は、１７℃、１０時間明／１４時間暗という条件で６週間行った。選抜菌株については、上記の細菌接種試験を４回繰り返した。

プロトプラストの形態観察
ウェルプレート内のプロトプラストの生細胞数を倒立顕微鏡で計測し、形態に基づいて生残細胞を葉状体形成細胞、未分化細胞、不定形分裂細胞、およびカルスの４つに分類した。生残率（％）は、生残細胞数を接種細胞数で除して算出し、葉状体形成率（％）は、葉状体形成細胞数を接種細胞数で除して算出した。

接種細菌の再分離
プロトプラストとの６週間の混合培養後、接種細菌が再分離・培養されるかを確認するために、培養系内の細菌の再分離を行った。混合培養試験終了の６週目に、ウェルプレートから培養液をループで採取し、Ｍａｒｉｎｅ ａｇａｒ ２２１６上で２０℃で２週間、細菌を培養した。４回の再現性試験において、それぞれのウェルから得られた細菌集落のうち３個の集落を釣菌し、純粋分離を繰り返し、保存した。

Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の特異的検出ＰＣＲ法の開発と再分離株への応用
再分離したＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌を同定するために、本菌に特異的なＰＣＲ検出法を開発した。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長配列を、ノリから分離された他のグループに属する代表株のものと比較した。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属に特異的な配列領域を見出し、本領域に対応するプライマーＨｙｐｈｏＦ１（５’−ＴＴＴＣＡＣＴＡＣＧＧＡＡＴＡＧＣＴＣＴＴ−３’）およびＨｙｐｈｏＲ１（５’−ＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＣ−３’）を設計した。次に、代表株のゲノムＤＮＡ（３μｌ）を鋳型とし、ＨｙｐｈｏＦ１プライマー（０．５μＭ）、ＨｙｐｈｏＲ１プライマー（０．５μＭ）、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（１×）、ｄＮＴＰミックス（各０．２ｍＭ）、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（０．５ユニット）（Ｔａｋａｒａ）、および滅菌蒸留水が混合された計２０μｌの反応液でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９５℃３分でＤＮＡを熱変性させた後、（熱変性９５℃３０秒→アニーリング５５℃３０秒→伸長反応７２℃１分）というサイクルを３０回繰り返し、最後に伸長反応を７２℃で５分間追加する、というものであった。本プライマーセットによる増幅産物（４８９ｂｐ）の有無は、２．０％アガロースゲルを用いた電気泳動により確認した。ＨｙｐｈｏＦ１−ＨｙｐｈｏＲ１のプライマーセットの特異性が確認された後、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属の細菌を接種したウェルから再分離した菌株について、上記の特異的検出ＰＣＲ法による同定を行った。

プロトプラストから葉状体への成長試験
寒天包埋法において、ＮＰ寒天培地、ｆ／２寒天培地、および１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ寒天培地の３種類の培地を用いた。９０％天然海水および１％低融点アガロース（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を基礎培地とし、ＮＰ、ｆ／２（Ｇｕｉｌｌａｒｄ’ｓ（ｆ／２）海水栄養液、Ｓｉｇｍａ）、１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩの各成分を加えた後、滅菌し、４５℃で保温した。プロトプラスト懸濁液１ｍｌ（１０⁴細胞）を用い、細菌添加区では滅菌７５％天然海水で１０倍希釈したＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＮＭ１０−１６株の菌液１ｍｌ（３．８×１０⁸ＣＦＵ）を、細菌無添加区では滅菌７５％天然海水で１０倍希釈したＭａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈを１ｍｌ添加した。シャーレ上に加えた後、寒天培地で包埋し、１７℃、１０時間明／１４時間暗の条件で４週間培養した。培養後、シャーレの１／４区画をセルスクレイパーで切り取り、希釈した１／５ＮＰ培養液、ｆ／１０培養液、および１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ培養液７５ｍｌで２週間、振盪培養した。その後、１０個の葉状体細胞を選抜し、ＮＰ培養液、ｆ／２培養液、および１／２ＳＷＭ−ＩＩＩ培養液で、２週間、通気培養し（１週間に１度、全換水）、葉状体の葉長および葉幅を測定した。

［結果］
ノリ由来分離細菌株の同定
ノリ葉状体由来の各試料から採取して分離し、プロトプラストへの添加試験に用いた２５９の細菌株を１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列によりグループ化したところ、１７のグループに分けられた。さらに、代表株のほぼ全長の配列を決定し、データベース上の既知の標準株と比較した。その結果、Ａｌｐｈａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの１２グループ（グループ１〜１２）、Ｇａｍｍａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの３グループ（グループ１３〜１５）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの２グループ（グループ１６〜１７）に分けられた。Ａｌｐｈａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのグループ１および２はＭａｒｉｔａｌｅａ属（Hyphomicrobium科）、グループ３はＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属（Hyphomonas科）、グループ４および５はＡｌｇｉｍｏｎａｓ属（Hyphomonas科）、グループ６はＡｈｒｅｎｓｉａ属（Rhodobacter科）、グループ７はＡｎｔａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒ属（Rhodobacter科）、グループ８はＴｒｏｐｉｃｉｂａｃｔｅｒ属（Rhodobacter科）、グループ９はＲｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ属（Rhodobacter科）、グループ１０および１１はＳｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒ属（Rhodobacter科）、グループ１２はＳｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ属（Sphingomonas科）に近縁であった。Ｇａｍｍａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのグループ１３はＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属（Alteromonas科）、グループ１４および１５はＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ属（Alteromonas科）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓのグループ１６はＫｏｒｄｉａ属（Flavobacteria科）、グループ１７はＰｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ属（Flavobacteria科）に近縁であった。

分離菌株の各グループによるプロトプラストの葉状体形成率の比較
２５９株の分離株をプロトプラストに接種し、系統グループごとの平均葉状体形成率を算出した（図４）。細菌を接種しなかったプロトプラストでは、未分化の細胞およびカルスが観察され、葉状体形成率は０％であった。これまでに分離した計２５９の菌株をプロトプラストにそれぞれ接種したとろ、系統グループにより葉状体形成率が異なることがわかった。グループ２のＭａｒｉｔａｌｅａ属、グループ１３のＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属、またはグループ１４のＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ属を接種した場合、葉状体形成細胞は観察されなかった。これらの細菌は、ノリのプロトプラストの成長を促進しない細菌、あるいは成長促進をむしろ阻害する細菌であると考えられる。それに対して、グループ３のＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌を接種したとき、葉状体形成率は３．７％であり最も高かった。同じＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科に分類されるグループ５のＡｌｇｉｍｏｎａｓ属でも比較的高い葉状体形成率１．９％が示された（図４）。

選択菌株を用いたプロトプラストの生残細胞率および葉状体形成率の比較
全２５９菌株のうち葉状体形成率が高かった株を選択し、計４回の再現性試験を行った（図５、図６）。細菌未接種区のプロトプラストの生残率および葉状体形成率はそれぞれ、３．６％および０．０６％であり、最も低かった。それに対して、グループ３のＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属、グループ５のＡｌｇｉｍｏｎａｓ属の生残率はそれぞれ１４．４〜２４．３％、および１７．４〜２１．４％であり、葉状体形成率を含めた全般的な細胞分裂促進作用が高かった。グループ３のＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の葉状体形成率は２．９〜７．３％で、グループ５のＡｌｇｉｍｏｎａｓ属細菌の葉状体形成率は２．９〜３．３％で、他の菌群と比較して高い傾向が観察された。これらＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌は、葉状体形成率だけでなくプロトプラストの生残率全般を高めるという作用を有することも、例えばプロトプラスト由来細胞の保持や貯蔵や利用という観点から有用となり得る（図６）。

Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の特異的検出ＰＣＲ法の開発と同定
グループ３のＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌を、スサビノリからこれまでに分離された他の１６グループの菌株から区別するために、本菌の特異的検出用プライマーセットＨｙｐｈｏＦ１−ＨｙｐｈｏＲ１を設計した。次に本プライマーセットの特異性を調べたところ、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の１３株のみを特異的に増幅することができた。また、本検出法を用いて、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属の１３株との混合培養後に再分離された計１５６菌株を解析したところ、これらの再分離株のほぼ全てがＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌であることが確認された。

Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌を用いたプロトプラストから葉状体への成長試験
Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＮＭ１０−１６株を添加することによって、プロトプラストから葉状体まで成長させることを、３種類の寒天培地を用いて試験した。その結果、寒天培地で４週間の静置培養後の細菌無添加区では生残細胞が観察されなかったのに対して、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＮＭ１０−１６株を添加した３つのいずれの培地においても葉状体形成細胞が観察された。その後、２週間の振盪培養後においても、細菌無添加区では生残細胞が観察されなかった（図７）。一方で、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＮＭ１０−１６株を添加したｆ／１０培養液、１／５ＮＰ培養液および１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ培養液では、多くの正常分裂細胞の塊や多くの葉状体様細胞が観察され、培養液の種類に関わらず細菌添加の効果が認められた（図７）。さらに無作為に１０の細胞を選抜し、２週間の通気培養を行ったところ、ｆ／２培養液および１／２ＳＷＭ−ＩＩＩ培養液では、それぞれ、平均葉長１２．９ｃｍおよび平均葉幅１．２ｃｍ（ｎ＝１０）、並びに平均葉長１５．０ｃｍおよび平均葉幅０．８ｃｍ（ｎ＝１０）に成長した（図８）。すなわち、葉状体からのプロトプラスト調製からわずか８週間で新たな成熟葉状体を産生することができた。

［寄託生物材料への言及］
Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属ＬＮＭ−９株およびＳＮＭ１０−１３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターに寄託されている（それぞれ、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３２１およびＮＩＴＥ Ｐ−１３２２）。
［当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所］
独立行政法人 製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ） 特許微生物寄託センター
郵便番号292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
［上記寄託機関に生物材料を寄託した日付］
平成２４年４月１８日
［上記寄託機関が寄託について付した受託番号］
ＮＩＴＥ Ｐ−１３２１ （ＬＮＭ−９株について）
ＮＩＴＥ Ｐ−１３２２ （ＳＮＭ１０−１３株について）

Claims (9)

1. ノリの葉状体由来プロトプラストを培養して新たな葉状体を産生する培養方法であって、前記プロトプラストに培地を添加し、さらにＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌を添加して培養を行うことを特徴とする方法。
2. Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌がＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属である、請求項１に記載の方法。
3. Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌がＡｌｇｉｍｏｎａｓ属である、請求項１に記載の方法。
4. ノリがスサビノリである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 培地が無菌培地である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. プロトプラストが、無菌プロトプラストである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 無菌プロトプラストが、以下の工程を含む調製法により調製されたものである、請求項６に記載の方法：
   １．ノリの葉状体をクエン酸含有液で洗浄する工程
   ２．葉状体をプロテアーゼ溶液で処理する工程
   ３．葉状体をマンニトール含有液で洗浄する工程
   ４．葉状体を細胞壁溶解酵素溶液で処理する工程
   ５．細胞壁溶解により生じたプロトプラストを濾過する工程
   ６．プロトプラストを遠心分離する工程
   ７．プロトプラストをマンニトール含有液で洗浄する工程
8. プロテアーゼがパパインである、請求項７に記載の方法。
9. 細胞壁溶解酵素が、アガラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼの混合物である、請求項７または８に記載の方法。