CN105821108A - 混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及降压肽的制备方法技术领域，具体涉及一种中华鳖通过混合酶解‑膜过滤的方法制备降压肽，主要包括原料预处理、混合酶水解、灭酶、离心过滤、膜过滤、冻干等关键步骤，其中混合酶水解过程中混合酶的各配方质量百分数为：木瓜蛋白酶39‑44％、中性蛋白酶28‑33％、胰蛋白酶24‑28％。采用本发明混合酶水解方法制备，酶利用高，中华鳖降压肽转化率高，中华鳖降压肽的抑制率也较高，同时混合酶水解和膜过滤两个过程可以采用连续式进行，达到连续化的操作，易于工业化生产，提高生产效率。

Description

混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法
技术领域
本发明涉及降压肽的制备方法技术领域，具体涉及一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法。
背景技术
中华鳖(Pelodiscus sinensis)俗称甲鱼、团鱼，主要产于中国、日本及东南亚等国家和地区，中华鳖养殖业是我国淡水产养殖业的重要组成部分，也是水产养殖业中经济效益较高的养殖种类。中医药学认为，中华鳖有滋阳凉血、益肾壮阳、清热散结、益气健胃功效，中华鳖的肉、血、卵、胆、脂肪、甲、尿均可入药，适用于骨蒸劳热、久疟久痢、脱肛等疾病。中华鳖是传统的健康养生食品，经常食用有延年益寿功效，深得广大消费者的青睐。
血压是血液在血管内流动时对血管壁所施加的压力，高血压病是一种动脉血管压力升高的慢性疾病，它最大的危害在于对全身血管造成长期超极限的额外压力，导致血管的脆性损伤，最终引起血管的破裂、堵塞，各种心脑血管疾病、肾脏病、眼底疾病、神经系统疾病等都可由它引起，高血压病是导致中老年人死亡的罪魁祸首之一。据国际高血压学会发表的新闻公报(2009年)，全球大约有9.72亿人患高血压或血压偏高症，相当于世界成年(18周岁以上)人口的26.4％，中国成人高血压患病率为25.2％，其高患病率、致死率严重威胁着人类的健康。
降压肽最早是1965年由Ferriera首次从南美洲蝮蛇的毒液中发现。研究者证明，血管紧张素转换酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)通过对肾素-血管紧张素-醛固酮系统(ReninAngiotensin System，RAS)和血管舒缓激肽-激肽-前列腺素系统(Bradykinin Kinin System，BKS)的控制实现对人体血压进行调节，其生理过程如图1所示。
ACE抑制剂(ACEI)的作用是通过抑制ACE的活性，使血管紧张素Ⅱ的生成和激肽的破坏均减少，从而达到降低血压的目的。ACEI属于竞争性抑制剂，作用于ACE的活性区域，它们与ACE的亲和力比血管紧张素Ⅰ或舒缓激肽更强，而且也不易从ACE结合区释放，使得ACE失去其原有的活性，从而阻碍ACE催化水解舒缓激肽和血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ两种生化反应过程，起到降血压的作用。
目前，生物活性肽生产常用的方法有四种：(1)化学合成法、(2)酶解法、(3)重组DNA 技术、(4)发酵法。化学合成法广泛应用于生产高价值的中长肽缺点是成本高，而且在合成过程中可能产生对健康和环境有害的物质；重组DNA技术也被广泛应用，但这种方法需要昂贵的材料和设备，投资大，成本高，其安全性还需进一步检测，且多限于多肽的生产，而生物活性肽大都是短肽，所以重组DNA技术在这方面的应用是有限的；发酵法是选取微生物菌种进行发酵，在发酵过程中产生具有活性的肽序列，该方法生产活性肽安全易操作，但生产时间较长，该法在乳源性活性肽生产方面应用较多；酶法生产活性肽则有许多优点，该法可生产大量短肽，反应条件温和反应过程易于控制，生产时间短，且所用试剂和原料均是食品级的，安全性高。因此，活性肽的研究和生产主要采用酶解的方法进行。
然而传统酶法制备ACE抑制肽存在酶利用率不高、底物过度降解，以及操作不具备连续性等问题，而采用混合酶法-膜过滤使反应尽可能向产物方向进行，因而得到比传统制取工艺更高的转化率，从而制备中华鳖降压肽。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的上述不足，提供一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，该方法酶利用率高，混合酶有效提高了中华鳖降压肽转化率，同时制备出的中华鳖降压肽抑制作用也得到了提高。
本发明所采取的技术方案是：一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，该方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：将中华鳖肉绞成肉糜，并加肉糜质量1-10倍的水匀浆，得到以中华鳖肉泥作为底物的底物溶液备用；
(2)混合酶水解：将步骤(1)制得的底物溶液置于温度50-60℃水浴中，调节底物溶液pH8-9.5，加混合酶搅拌酶解2-3小时，得酶解液；
(3)灭酶：将步骤(2)中的酶解液在95-100℃下持续15-20min灭酶处理，得到灭酶后的混合液体；
(4)离心过滤：将上述步骤(3)得到的液体，采用4500-5000r/min转速离心10-30min，得上清液；
(5)膜过滤：调步骤(4)的上清液pH 7-7.5，并在压力0.2-0.25MPa、温度20-30℃条件下，经超滤膜或纳滤膜超滤，收集分子量小于1000Da的超滤液；
(6)冻干：将步骤(5)中的超滤液进行冷冻干燥，即得到中华鳖降压肽。
所述混合酶水解和膜过滤过程可以同时连续进行的，连续操作的具体装置设计如图2所示，其中膜过滤组件包括调节pH、纳滤脱盐等步骤，同时在产品出口处截留的分子量大 的部分还可以回到原料液进行再次酶解，提高生产效率。
作为优选，步骤(2)中混合酶的各配方质量百分数如下：木瓜蛋白酶39-44％、中性蛋白酶28-33％、胰蛋白酶24-28％，因为ACE是小分子肽，通过混合酶的酶解作用更有利于获得小分子的短肽，混合酶的同时加入起到加快水解长链得到短肽的目的，同时混合酶生产出来的ACE抑制酶的活性较高。
作为优选，步骤(2)中将底物溶液加水调节质量分数为4-8％，混合酶加入量为底物总质量的1-3％，单个酶只能水解底物的某一部位，所以对于水解来说利用率不高，而混合酶同时切入的位点多，有利于得到较多的小片段肽，此时酶的水解作用最充分，水解能力最高，而且三种酶的利用率因其相互促进和协调也得到提升。
步骤(3)中酶解液在95-100℃下持续15-20min进行灭酶处理，使灭酶过程更彻底。
作为优选，在所述步骤(5)膜过滤之前，将步骤(4)得到的上清液中加水使其多肽浓度为2-3％，因为随着酶解作用的进行，溶液中多肽浓度逐渐升高，稀释上清液有利于在膜过滤中减小膜承受的压力，防止膜通道的堵塞，有利于后续的膜分离。
作为优选，所述步骤(5)得到超滤液后还包括纳滤脱盐：将步骤(5)得到的超滤液加水调节使其多肽浓度为2-3％，并在压力0.5-0.6MPa、温度20-30℃的条件下纳滤脱盐。因为在调整pH过程加入酸或碱导致溶液中有盐类物质残留，且酶解后有部分离子产生，纳滤脱盐步骤能够将脱盐和短肽的过滤浓缩同步进行，对低分子量降压肽和盐的分离有很好效果。优选当分子量5000Da左右的物质较多时，采用超滤膜过滤，然后再经过纳滤膜超滤；当分子量在1000Da左右的物质较多时，直接采用纳滤膜超滤。
采用以上制备方法后，本发明的一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法与现有技术相比具有以下优点：
1.本发明采用混合酶水解的制备方法，提高了中华鳖降压肽的抑制率，混合酶水解方法制备的降压肽转化率也较高，利用混合酶可生产大量短肽，反应条件温和、易于控制，所得产品品质好；
2.膜过滤组件的过滤过程兼具分离、浓缩、纯化和精制的功能，通过膜过滤的方法有效分离出小分子物质中华鳖降压肽，同时纳滤脱盐步骤提高最终降压肽产品的纯度，不仅使得降压肽品质更好，而且最终产品的得率也有所提高；
3.所述混合酶水解和膜过滤过程可以同时连续进行，连续操作的具体装置设计如图2所示，截留的分子量大的部分还可以回到原料液进行再次酶解。将混合酶水解和膜过滤两个过程可以采用连续的方式进行，达到连续化的操作，易于工业化生产，提高生产效率， 采用混合酶水解-膜过滤连续进行，由于产物也是连续采出，而使反应尽可能向产物方向进行，因而得到比传统制取工艺更高的转化率。同时可以回收部分原料继续水解，有利于节约材料。
附图说明
图1是本发明的ACE在肾素-血管紧张素和舒缓激肽-激肽系统中的作用示意图。
图2是本发明的混和酶-膜过滤连续操作的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
实施例1
一种中华鳖降压肽的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料预处理：先将中华鳖宰杀后，除去脂肪，再用开水烫15秒，去除中华鳖皮膜，去除中华鳖的内脏、骨、壳清洗干净；将得到的中华鳖肉组织采用高速组织捣碎机进行搅碎处理，并加5倍的水匀浆后备用；
(2)混合酶解：加水调节(1)中底物溶液的质量分数为4％，在50℃的水浴锅中，调节pH为8，加入底物总质量1％的混合酶，搅拌酶解2小时，得酶解液，其中混合酶各配方质量百分数：木瓜蛋白酶39％、中性蛋白酶33％、胰蛋白酶28％；
(3)灭酶：95℃下持续20分钟进行灭酶处理；
(4)离心过滤：将灭酶后的液体，4500r/min转速离心30分钟，得到的上清液，加水调节使酶解液中的多肽浓度为2％，待膜过滤；
(5)膜过滤：上述调整多肽浓度后的酶解液在压力0.2MPa、pH 7、温度20℃条件下微滤膜过滤，收集超滤液，加水调节超滤后的酶解液中多肽浓度为2％，并在压力0.5MPa、温度20℃的条件下纳滤脱盐，得到分子质量在1000Da以下的产物；
(6)冻干：将(5)最后得到的液体进行冷冻干燥，即可得到降压肽的产品。
实施例2
一种中华鳖降压肽的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料预处理：先将中华鳖宰杀后，除去脂肪，再用开水烫20秒，去除中华鳖皮膜，去除中华鳖的内脏、骨、壳清洗干净；将得到的中华鳖肉组织采用高速组织捣碎机进行搅碎处理，并加10倍的水匀浆后备用；
(2)混合酶解：加水调节(1)中底物溶液的质量分数为6％，在55℃的水浴锅中，调节pH为9，加入底物总质量2％的混合酶，搅拌酶解2小时，得酶解液，其中混合酶各配 方质量百分数：木瓜蛋白酶42％、中性蛋白酶30％、胰蛋白酶28％；
(3)灭酶：100℃下持续15分钟进行灭酶处理；
(4)离心过滤：将灭酶后的液体，5000r/min转速离心10分钟，得到的上清液，加水调节使酶解液中的多肽浓度为2.5％，待膜过滤；
(5)膜过滤：上述调整多肽浓度后的酶解液在压力0.25MPa、pH 7.5、温度25℃条件下微滤膜过滤，收集超滤液，加水调节超滤后的酶解液中多肽浓度为2.5％，并在压力0.6MPa、温度25℃的条件下纳滤脱盐，得到分子质量在1000Da以下的产物；
(6)冻干：将(5)最后得到的液体进行冷冻干燥，即可得到降压肽的产品。
实施例3
一种中华鳖降压肽的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料预处理：先将中华鳖宰杀后，除去脂肪，再用开水烫30秒，去除中华鳖皮膜，去除中华鳖的内脏、骨、壳清洗干净；将得到的中华鳖肉组织采用高速组织捣碎机进行搅碎处理，并加3倍的水匀浆后备用；
(2)混合酶解：加水调节(1)中底物溶液的质量分数为8％，在60℃的水浴锅中，调节pH为9.5，加入底物总质量3％的混合酶，搅拌酶解3小时，得酶解液，其中混合酶各配方质量百分数：木瓜蛋白酶44％、中性蛋白酶32％、胰蛋白酶24％；
(3)灭酶：100℃下持续15分钟进行灭酶处理；
(4)离心过滤：将灭酶后的液体，5000r/min转速离心30分钟，得到的上清液，加水调节使酶解液中的多肽浓度为3％，待膜过滤；
(5)膜过滤：上述调整多肽浓度后的酶解液在压力0.25MPa、pH 7.5、温度30℃条件下微滤膜过滤，收集超滤液，加水调节超滤后的酶解液中多肽浓度为3％，并在压力0.6MPa、温度30℃的条件下纳滤脱盐，得到分子质量在1000Da以下的产物；
(6)冻干：将(5)最后得到的液体进行冷冻干燥，即可得到降压肽的产品。
实施例4
(1)原料预处理：先将中华鳖宰杀后，除去脂肪，再用开水烫30秒，去除中华鳖皮膜，去除中华鳖的内脏、骨、壳清洗干净；将得到的中华鳖肉组织采用高速组织捣碎机进行搅碎处理，并加6倍的水匀浆后备用；
(2)混合酶解：加水调节(1)中底物溶液的质量分数为5％，在55℃的水浴锅中，调节pH为9，加入底物总质量3％的混合酶，搅拌酶解3小时，得酶解液，其中混合酶各配方质量百分数：木瓜蛋白酶44％、中性蛋白酶28％、胰蛋白酶28％；
(3)灭酶：100℃下持续20分钟进行灭酶处理；
(4)离心过滤：将灭酶后的液体，4500r/min转速离心25分钟，得到的上清液，加水调节使酶解液中的多肽浓度为2％，待膜过滤；
(5)膜过滤：上述调整多肽浓度后的酶解液在压力0.25MPa、pH 7.5、温度28℃条件下微滤膜过滤，收集超滤液，加水调节超滤后的酶解液中多肽浓度为2％，并在压力0.6MPa、温度25℃的条件下纳滤脱盐，得到分子质量在1000Da以下的产物；
(6)冻干：将(5)最后得到的液体进行冷冻干燥，即可得到降压肽的产品。
下面通过相关的试验验证本发明混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法的效果。
1.混合酶的优化实验
为了进一步说明混合酶的效果，混合酶比采用scheffe多项式模型建立混料的配比得回归方程的方法：表1列出了采用混料设计进行混合酶研究的试验方案、试验结果及其预测值，如表1所示，对响应值进行Scheffe多项式(不完全三次式)拟合分析，得回归模型方程：I＝0.43X1+0.33X2+0.31X3+0.39X1X2+0.35X1X2+0.36X2X3+3.02X1X2X3，其中X1表示木瓜蛋白酶的质量百分比，X2表示中性蛋白酶的质量百分比，X3表示胰蛋白酶的质量百分比。经分析，得到最优的配方为：X1＝39％、X2＝33％、X3＝28％，即实施例1中的混合酶配方。
表1混合酶的scheffe多项式模型分析表
2.对照试验
混合酶法连续制备的降压肽与单一酶(试剂推荐条件：木瓜蛋白酶，60℃，pH 7.0；中性蛋白酶45℃，pH 7.0；胰蛋白酶pH 7.5，45℃)方法制备的降压肽对血管紧张素转换酶抑制作用的对照试验：本发明混合酶法采用上述实施例1中的试验条件，单一酶法除pH和温度采用酶推荐条件外，其它条件与采用混合酶水解法相同。对照试验结果如表2所示，很明显，混合酶比单一酶生产出的降压肽抑制率提高4.43-20.86％。
表2采用不同酶水解方法制备的降压肽抑制率
以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体方案允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，该方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：将中华鳖肉绞成肉糜，并加肉糜质量1-10倍的水匀浆，得到以中华鳖肉糜作为底物的底物溶液备用；
(2)混合酶水解：将步骤(1)制得的底物溶液置于温度50-60℃水浴中，调节底物溶液pH8-9.5，加混合酶搅拌酶解2-3小时，得酶解液；
(3)灭酶：将步骤(2)中的酶解液在95-100℃下持续15-20分钟灭酶处理，得到灭酶后的混合液体；
(4)离心过滤：将上述步骤(3)得到的液体，采用4500-5000r/min转速离心10-30分钟，得上清液；
(5)膜过滤：调步骤(4)的上清液pH 7-7.5，并在压力0.2-0.25MPa、温度20-30℃条件下经超滤膜或纳滤膜超滤，收集分子量小于1000Da的超滤液；
(6)冻干：将步骤(5)中的超滤液进行冷冻干燥，即得到中华鳖降压肽。
2.根据权利要求1所述的混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，其特征在于：所述步骤(2)中混合酶的各配方质量百分数如下：木瓜蛋白酶39-44％、中性蛋白酶28-33％、胰蛋白酶24-28％。
3.根据权利要求1所述的混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，其特征在于：所述步骤(2)中底物溶液加水调节使底物的质量分数为4-8％，混合酶加入量为底物总质量的1-3％。
4.根据权利要求1所述的混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，其特征在于：在所述步骤(5)膜过滤之前，将步骤(4)得到的上清液中加水使其多肽浓度为2-3％。
5.根据权利要求1所述的混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法，其特征在于：所述步骤(5)得到超滤液后还包括纳滤脱盐：将步骤(5)得到的超滤液加水调节使其多肽浓度为2-3％，并在压力0.5-0.6MPa、温度20-30℃的条件下纳滤脱盐。
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