CN113999288A - 一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽，是将鱼下脚料进行蒸煮后，匀浆液用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解；酶解液离心后，上清先用分子量不超过10kDa的膜进行过滤，过滤液再利用分子量不大于360Da的膜过滤，截留液即为本发明所提供的多肽溶液。本发明所提供的多肽来源于鱼加工下脚料，可以合理利用生物资源，减少浪费和环境污染，同时酶解法制备的多肽成本较低，营养价值高且安全易于吸收，可用于制备用于促进细胞增殖、生长的制品，如促细胞增殖的药品、食品、保健品或是作为原料来制备饲料。

Description

一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽
技术领域
本发明属于水产品加工技术领域，具体涉及一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽。
背景技术
我国具有丰富的渔业资源，水产品是深受消费者喜爱且具有较高营养价值的饮食佳品之一。在鱼类加工过程中会产生大量的副产物，又被称为下脚料，包括鱼皮、鱼鳞、鱼骨、鱼内脏等，这些副产物并没有得到充分利用，若直接丢弃，既浪费了大量的生物资源，又污染了环境。鱼内脏作为鱼类副产物蛋白质含量非常高，含有人体必需的氨基酸，是制备天然蛋白质的优秀原料，既可物以致用，又能避免浪费。
多肽因其优越的生物相容性、易吸收、安全、水溶性好、低分子量等优点，同时具有保护、修复损伤细胞、促进细胞生长功效，因此多肽作为促细胞增殖物质具有巨大的发展潜力。
多肽通过化学合成法制备，虽然功能明确有效，但无营养价值，而且合成过程繁琐，产率低，成本很高，只适合于合成短肽。蛋白酶酶解法相对简单、廉价，制备的多肽氨基酸种类丰富，保留了蛋白质的营养价值且易于吸收。
发明内容
本发明的目的是提供一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽，从而提高鱼下脚料的加工价值。
本发明所提供的多肽，是将鱼下脚料进行蒸煮后，匀浆液用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解；酶解液离心后，上清先用分子量不超过10kDa的膜进行过滤，过滤液再利用分子量不大于360Da的膜过滤，截留液即为本发明所提供的多肽溶液；
所述的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，作为实施例的一种具体记载，其酶活比为2:1；
所述的酶解，其一种具体条件是在50℃酶解3-5h；
所述的多肽，将制备的多肽溶液经过C18色谱柱后，再使用50％甲醇洗脱得到的多肽；
更进一步的，所述的多肽的，其中具体多肽的序列如下：
QQGQPQAQPQPQ(SEQ ID NO:1)、
SGYSSGGGYSSGGGFSGGSSGGY(SEQ ID NO:2)、AGGGGGRAGGGDLGIG(SEQ ID NO:3)、AGDTHLGGEDFDNR(SEQ ID NO:4)。
本发明所提供的多肽来源于鱼加工下脚料，可以合理利用生物资源，减少浪费和环境污染，同时酶解法制备的多肽成本较低，营养价值高且安全易于吸收，可用于制备用于促进细胞增殖、生长的制品，如促细胞增殖的药品、食品、保健品或是作为原料来制备饲料。
附图说明
图1：多肽分子量的标准曲线图；
图2：鱼下脚料多肽的分子量分布图；
图3：粗分离的不同组分的多肽对细胞增殖率的影响图；
图4：粗分离的多肽的不同活性部位多肽对养殖鱼增重率的影响图；
图5：粗分离的多肽的不同活性部位多肽对养殖虾增重率的影响图；
图6：精制活性部位多肽对细胞增殖率的影响图；
图7：EGFR与多肽分子对接结构图；
图8：合成多肽对细胞增殖率的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：制备多肽
1、鱼下脚料多肽的制备
将鱼下脚料用高速剪切机匀浆后，煮沸10min，匀浆液冷却至45-55℃后，按照干重3％的比例加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶(酶活比为2:1)，搅拌均匀，50℃酶解3-5h，酶解结束后，12000rpm离心，收集上清液，上清液利用10kDa的膜进行过滤，过滤液利用360Da的膜过滤，得到分子量在360Da-10kDa区间的多肽液，多肽液经真空减压干燥，得到多肽固体，经粉碎机粉碎，过80目筛网，得到鱼下脚料多肽粉末FBP(Fish byproduct peptide)。
2、鱼下脚料多肽分子量分布测定
采用HPLC法测定鱼下脚料多肽分子量分布状况，配制浓度为5.0mg/mL的标准品甘氨酰肌氨酸(146Da)、甘氨酰甘氨酰酪氨酰-精氨酸(451Da)、杆菌肽(1422Da)、抑肽酶(6511Da)、细胞色素C(12327Da)以及鱼下脚料混合肽溶液，经0.22μm膜过滤，待用。色谱条件为TSK gel G2000 SWXL柱(7.8mm×300mm)，柱温30℃，进样量10μL，进样次数3次，流速1.0ml/min。流动相为含45％乙腈和0.1％三氟乙酸的超纯水溶液，采用等梯度洗脱，洗脱时间为20min，于214nm处测吸光度，以标准品分子量对数lg MW为纵坐标，保留时间t为横坐标建立标准曲线(图1)，采用手动积分的方式测定鱼下脚料多肽分子量分布比例。
通过公式计算：粗多肽得率/％＝提取物的质量/原料的质量×100％，得到FBP的得率为38.91％。通过凯氏定氮法测得含氮量为9.32％，其蛋白质含量为58.25％。
如图2所示，制备的FBP多肽粉末中360～1000Da的多肽占比最高，高达73.21％，1～5KDa的多肽占比为18.74％，5～10KDa的多肽占比为8.05％。
实施例2：多肽的粗制分离及组分效果分析
取实施例制备的鱼下脚料多肽粉末10g，溶于100mL纯水中，配成100mg/mL多肽溶液。利用制备液相色谱(Dubhe C18制备柱(250×20mm，10μm)，流速8mL/min，进样量1mL、100mg/mL，柱温为室温，检测波长220nm)对鱼下脚料多肽进行分离，分别收集5％甲醇洗脱部分作为F1，25％甲醇洗脱部分作为F2，50％甲醇洗脱部分作为F3，80％甲醇洗脱部分作为F4。收集的不同部分的产物烘干后进行成分分析和活性检测。
通过细胞增殖实验和水产动物养殖来筛选检测活性高的组分。
1、细胞增殖实验
将小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞以2×104个细胞/mL，每孔100μL接种于96孔板中，恒温培养24h后移去原培养基，随后分别将活性部位F1-F4配制系列浓度梯度的多肽溶液(0.1、0.5、2.0、3.0mg/mL)，以每孔200μL加入96孔板中，在温度为37℃，CO2和空气浓度分别为5％和95％的恒温培养箱中连续培养48h，空白组加入等体积培养基，MTT法测增殖率。
相对增殖率计算％＝A样品/A空白×100％
式中：A样品为样品溶液的吸光度；A空白为空白组溶液的吸光度。
如图3所示，将细胞在多肽浓度分别为0.1mg/mL，0.5mg/mL，2.0mg/L和3.0mg/mL的条件下分别培养48h，发现当浓度≤0.5mg/mL时，所有多肽均无显著促MC3T3-E1细胞增殖活性，F1、F2和F4甚至能抑制细胞增殖；在浓度为3.0mg/mL时，F3能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖，并且表现出剂量—效应关系，说明F3中可能包含有促进MC3T3-E1细胞增殖的多肽片段。
2、养殖鱼增殖实验检测
实验开始前，养殖容器在放入试验鱼前用高锰酸钾消毒，试验鱼随机分5组，每组10尾，每组设3个重复。配制含不同活性部位多肽的试验饲料(每千克饲料含多肽量)。试验周期为8周，期间每天投喂3次，分别是6：00、12：00、18：00。日投饵率为试验鱼体质量的3％～5％，按照水温变化调整。每天记录水温、投饵量、死亡鱼数量。试验鱼入池前和试验结束后，停止喂食24h，各试验组每个平行随机抽样5尾，每组共15尾，称体质量(g)，计算增重率。
增重率(WG％)＝100×(Wt-W0)/W0
Wt为终末鱼体质量，W0为初始鱼体质量。
由图4可见，基础饲料中添加不同活性部位的鱼下脚料多肽后，F1、F2和F4活性部位的多肽不能促进鱼增重；在浓度为200mg/kg(每公斤饲料含多肽量)时，F3能显著促进鱼的增重。
3、养殖虾增殖实验检测
试验时挑选规格一致的健康对虾，置于对虾循环水试验系统内，随机分5组，每组30尾，每组设3个重复，配制含不同活性部位多肽含量的试验饲料。每套系统由养殖池、水泵、过滤棉过滤装置、陶瓷生物过滤装置等组成，每个养殖池(直径500mm，高1 200mm，PE材料)。试验周期为10周，日投饵率为试验虾体质量的6％～10％，分四次投喂，其投喂时间为：6：00、10：30、18：00、22：00。试验虾入池前和试验结束后，停止喂食24h，各试验组每个平行随机抽样10尾，每组共30尾，称体质量(g)，计算增重率。
增重率(WG％)＝100×(Wt-W0)/W0
Wt为终末虾体质量，W0为初始虾体质量。
由图5可见，基础饲料中添加不同活性部位的鱼下脚料多肽后，F1、F2和F4活性部位的多肽不能促进虾增重，甚至抑制其生长；在浓度为100mg/kg(每公斤饲料含多肽量)时，F3能显著促进虾的增重。
实施例3：多肽的精制
将F3组分配置成100mg/mL多肽溶液，利用制备液相色谱(DubheC18制备柱(250×20mm，10μm)，流速8mL/min，进样量1mL、100mg/mL，柱温为室温，检测波长220nm)对鱼下脚料多肽进行精制，流动相为含0.1％三氟乙酸的水和甲醇，洗脱条件为：0min，5％甲醇；5min，5％甲醇；180min，80％甲醇。分别收集各组分Fn-1/2/3……，烘干后进行活性检测和成分分析。
分别收集各组分F3-1/2/3/4，采用MTT法测定MC3T3-E1细胞相对增殖率，如图6所示，将细胞在多肽浓度分别为2.0mg/mL，3.0mg/mL，4.0mg/L和5.0mg/mL条件下分别培养48h，发现F3-1和F3-4没有显著促进MC3T3-E1细胞增殖的活性，F3-2和F3-3能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖，在浓度为4.0mg/mL时，促增殖效果最好。
将精制的活性多肽组分，利用液相色谱-串联质谱(nano liquid chromatogram-mass spectrometry,nano LC-MS/MS)技术测定多肽的组成。
通过LC-MS技术对FBP-F3-2组分进行分析鉴定，得到了210条多肽序列。部分多肽序列如表1所示。
表1：部分多肽信息表
Figure BDA0003408965050000071
Figure BDA0003408965050000081
利用MOE软件，通过分子对接原理，预测鉴定的多肽对细胞促增殖效果。
EGFR是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族的成员，在无配体时，EGFR胞外域的第Ⅱ亚结构域和第Ⅳ亚结构域会形成分子内“铰链”，形成自抑制状态；当配体与胞外域结合后，EGFR构象改变并发生二聚化，启动下游信号通路，促进细胞增殖或分化。利用MOE软件，将得到的多肽进行模型构建，然后与PDB(worldwide protein databank)中的EGFR进行分子对接，以EGF为阳性对照，选取具有最佳对接效果的多肽进行后续实验。结果如图4所示，10个多肽序列与EGFR活性区域有明显的接触，且对接得分值较高(表2)，其中多肽AGDTHLGGEDFDNR的得分值最高，为-14.0754，推测这10个多肽具有促增殖作用。
表2：部分多肽与EGFR分子对接结果表
Figure BDA0003408965050000082
Figure BDA0003408965050000091
利用固相合成法，按照多肽的氨基酸序列进行合成，得到了合成肽，对合成肽的促增殖效果进行验证。将表2中列出的10条多肽进行合成，配制成浓度为0.2mg/mL的多肽溶液，检测其对细胞增殖活性的作用，结果发现，其中4条多肽(编号为3、4、6、10)能促进细胞增殖(图8)。
由此可见，通过酶解得到的鱼下脚料多肽具有显著促增殖作用，其主要通过多肽与EGFR结合，启动其下游通路，从而达到促增殖的效果。
序列表
<110> 山东省海洋科学研究院（青岛国家海洋科学研究中心）
<120> 一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Gln Gly Gln Pro Gln Ala Gln Pro Gln Pro Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gly Phe Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Tyr
20
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg Ala Gly Gly Gly Asp Leu Gly Ile Gly
1 5 10 15
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg
1 5 10

Claims (10)

1.一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽，其特征在于，所述的多肽，是将鱼下脚料进行蒸煮后，匀浆液用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解；酶解液离心后，上清先用分子量不超过10kDa的膜进行过滤，过滤液再利用分子量不大于360Da的膜过滤，截留液制备的多肽溶液。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活比为2:1。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的酶解，是在50℃酶解3-5h。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽溶液经过C18色谱柱后，再使用50％甲醇洗脱。
5.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
6.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
7.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
8.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
9.权利要求1-8任一项所述的多肽在制备饲料或食品中的应用。
10.一种饲料，其特征在于，所述的饲料中添加有权利要求1-8任一项所述的多肽。
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