CN102180945A - 一种鱿鱼内脏提取的小肽及其制备方法、组合物和作为海洋水产饲料蛋白源的用途 - Google Patents
一种鱿鱼内脏提取的小肽及其制备方法、组合物和作为海洋水产饲料蛋白源的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种鱿鱼内脏提取的小肽及其制备方法,特征是这种物质含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-,相对分子质量范围为1400~5800,并通过下述方法制得:将日本鱿鱼内脏酶解后用截留分子质量18000Da超滤膜过滤,再用凝胶色谱分离纯化,得到含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物质,然后加入山梨酸钾,搅匀,干燥。本发明还涉及一种组合物,由上述鱿鱼内脏提取的小肽6%~8%,豆粕粉50~60%,鱼粉3%~6%,玉米粉27%~33%和制粒用淀粉2%~5%组成。这种组合物可用作包括海洋鱼、虾、贝类等的海洋水产养殖的饲料蛋白源,特别适合海洋水产鱼类的饲料蛋白源。利用这种组合物养殖海洋鱼类,可大幅度的提高鱼类的摄食量,增加鱼类个体的单位重量。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的小肽物质,具体来说涉及一种鱿鱼内脏提取的小肽及其制备方法,还涉及这种物质的组合物以及该组合物作为海洋水产养殖中的饲料蛋白源的用途。
背景技术
随着我国远洋渔业的迅速发展,鱿鱼的捕获量逐年增加,2009年鱿鱼捕获量已超过30万吨,成为我国主要的水产品加工原料。但是我国的鱿鱼加工技术含量低,在加工处理获得鱼花、鱼干、咸鱿鱼、罐头及调味品等产品后,一般有20%~30%的废弃物(内脏、头、足、表皮和皮墨汁等),这些废弃物含有丰富的蛋白质、脂肪、多糖等营养物质,据珠海市出入境检验检疫局吴莉敏(《农产品加工》,2007(8):94-96)研究表明,每100g鱿鱼内脏中含脂肪21.15g,蛋白质21.24g,钙51.46mg,铁609.07μg和磷95.88μg等。但这些物质极易腐烂变质并且含有对人体有害的重金属镉。通常对这些废物的处理方法是就地掩埋,这样不但对渔业资源是巨大浪费,而且还存在着环境污染的隐患。因此,如何有效地处理鱿鱼废弃物并进行高值化综合利用越来越受到国民与社会的重视。
中国水产科学院黄海水产研究所的王彩理等(《水产养殖》,2003,24(5):40-41)研究鱿鱼内脏液化蛋白对南美白对虾的诱食性,发现鱿鱼内脏浆的诱食效果最佳,强于甜菜碱、牛磺酸和大蒜素。上海水产品加工技术开发中心的王建中等(《中国海洋药物》,1999,1:55-58)在对鱿鱼内脏的综合利用研究中,利用鱿鱼内脏及其它废弃物进行自生酶水解,开发了鱿鱼油、内脏水解液,并解决了从水解液中去除镉的难题。中国海洋大学水生生物制品安全性实验室的刘春娥等(《食品工业科技》,2004,9(25):83-86)在鱿鱼内脏蛋白质酶解工艺的研究中,以氨基酸得率为主要指标,采用不同蛋白酶对鱿鱼内脏蛋白质进行了水解工艺研究。研究表明,中性蛋白酶,碱性蛋白酶,胰蛋白酶和木瓜蛋白酶具有较好的分解效果,氨基酸转化率可达到50%以上。浙江工商大学的励建荣等人的专利:一种秘鲁鱿鱼内脏综合利用技术(申请号:200610053372.6),将鱿鱼内脏蒸煮,酶液化,加热,离心等步骤,得到的下层鱿鱼多肽制成用于水产动物饲料蛋白源的鱿鱼膏,对对虾的饲喂试验表明,添加鱿鱼膏能明显增加饵料的摄取量,提高幼虾的存活率和体重。福建融鑫海生物技术有限公司的苏祖凤的专利:一种用鱿鱼内脏制备水产饲料诱食剂的生产方法(申请号:200810071073.4),通过将鱿鱼内脏蒸煮、静置、自然酶解发酵,油料分离后的沉淀进行80~90℃和60~65℃两次低温真空浓缩。
由于现有的饲料蛋白源的制作工艺中主要采取酶解后高温蒸煮、浓缩的方式获得,这些工艺过程容易使蛋白质变性,产生胶原蛋白,不仅降低了营养成分,而且大大损害了产品对水产动物的诱食性。即使采用苏祖凤等人的方法,利用SJN2-2000二效蒸发器对酶解液进行二次浓缩,使蒸发温度控制在90℃以下,大大降低了浓缩温度,但是依然无法从根本上解决这一难题。
发明内容
本发明的目的在于摒弃高温蒸煮方法,利用超滤膜从鱿鱼内脏提取出一种新的小肽,另一目的是开发出该小肽的制备方法,又一目的是开发出含有该小肽的组合物及其用途。
我们将日本鱿鱼(Todarodes pacificus)内脏经有机溶剂脱脂后,用爱尔卡酶和胰蛋白酶酶解,然后用超滤膜过滤脱脂后的酶解液,再用凝胶色谱分离纯化,得到含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物质,加入山梨酸钾搅匀、干燥。将本发明小肽、豆粕粉、玉米粉、淀粉、鱼粉等按配比制粒,得到的组合物可用作海洋水产养殖饲料蛋白源,对鱼虾贝类等有非常好的诱食作用,从而实现了本发明的目的。
本发明的鱿鱼内脏提取的小肽,其特征是含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-,相对分子质量范围为1400~5800,并通过下述方法制备得到:(1)将日本鱿鱼内脏搅碎,加水搅匀,用石油醚或正己烷或石油醚和正己烷的混合溶剂脱脂,去除有机溶剂层,水层在室温下晾1~3小时,50~60℃下烘1~3小时,加入温度为50~60℃的水,调节pH值至8.0~8.5,然后在50~60℃保温状态下,按每克原料2000~3000单位的比例用爱尔卡酶酶解1~3小时后,再按每克原料2000~3000单位的比例用胰蛋白酶酶解1~3小时,去除不溶物质,得到酶解液;(2)将步骤(1)得到的酶解液用截留分子质量18000Da超滤膜过滤,再用凝胶色谱分离纯化,得到含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物质。
本发明的鱿鱼内脏提取的小肽还可以加入防腐剂,例如山梨酸钾,最好在步骤(2)得到的小肽物质每1000g中加入0.025~0.050g山梨酸钾,搅匀,干燥。在中试制备中,小肽物质的纯度值为51%~63%时有利于成本控制。
本发明的鱿鱼内脏提取的小肽的制备方法,其特征是包括以下的步骤:
(1)将日本鱿鱼内脏搅碎,加水搅匀,用石油醚或正己烷或石油醚和正己烷的混合溶剂脱脂,去除有机溶剂层,水层在室温下晾1~3小时,50~60℃下烘1~3小时,加入温度为50~60℃的水,调节pH值至8.0~8.5,然后在50℃~60℃保温状态下,按每克原料2000~3000单位的比例用爱尔卡酶酶解1~3小时后,再按每克原料2000~3000单位的比例用胰蛋白酶酶解1~3小时,去除不溶物质,得到酶解液;
(2)将步骤(1)得到的酶解液用截留分子质量18000Da超滤膜过滤,再用凝胶色谱分离纯化,得到含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物质。
本发明的鱿鱼内脏提取的小肽的制备方法,还可以在步骤(2)得到的小肽物质中加入防腐剂,例如山梨酸钾,最好在每1000g小肽物质中加入0.025~0.050g山梨酸钾,搅匀,干燥。
鱿鱼内脏提取的小肽的分子质量计算方法:
logMw=-b Kav+c;有效分配系数Kav是表示被排阻的程度,Mw表示物质的分子质量,b,c为常数与凝胶柱本身性质相关,可通过标准蛋白质样品计算b,c值。
凝胶色谱分离纯化和分子质量测定的操作包括:
(1)采用中大型凝胶色谱柱进行分离纯化。将日本鱿鱼内脏按上述本发明方法脱脂处理后进行酶解,截留分子质量18000Da超滤膜过滤鱿鱼内脏酶解液。采用中大型凝胶色谱进行分离,凝胶色谱型号:Sephadex G-25,柱型号:200×10cm,缓冲液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(含0.16mol/L NaCl),pH=7.0,溶剂流速10mL/min,柱床体积约12000mL,将样品配成浓度为50~100mg/mL的溶液,用0.45m微孔滤膜过滤,取500~1000mL进样分离纯化,采用下述步骤方法分析检测。
(2)采用小型凝胶色谱进行分子质量测定。分析条件选择:凝胶色谱型号:Sephadex G-25;柱型号:100×1cm,缓冲液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(含0.16mol/L NaCl),pH=7.0,溶剂流速0.20mL/min,检测波长280nm,柱床体积约60mL。
(3)将标准蛋白质样品配成浓度为5mg/mL的溶液,用0.30m微孔滤膜过滤,取0.5mL进样,获得(Kav,logMw)的对应点三个(28.5,4.16)、(53.7,3.13)、(74.9,2.26),通过计算获得公式:logMw=-0.041Kav+5.33(R2=0.9998)。
(4)将步骤(1)分离纯化的日本鱿鱼内脏酶解液经0.30m微孔滤膜过滤后,调整浓度至10mg/mL。采用小型凝胶色谱,取0.5mL进样,得出鱿鱼内脏提取的小肽在直线上的(Kav,logMw)点分别为(53.3,3.15)、(38.2,3.76),计算其对应分子质量为1400和5800。
本发明含有鱿鱼内脏提取的小肽的组合物,其特征是按总质量分数100%计,由鱿鱼内脏提取的小肽6%~8%,豆粕粉50%~60%,鱼粉3%~6%,玉米粉27%~33%和制粒用淀粉2%~5%组成。所用的豆粕粉,鱼粉,玉米粉和制粒用淀粉为水产饲料用,从市场购买。
本发明的组合物的制备方法,是按上述比例将鱿鱼内脏提取的小肽、豆粕粉、鱼粉和玉米粉搅匀,以配料∶水=1∶4(质量比)的比例加入适量的水,搅匀,喷雾干燥,得干膏粉;按配方比例向干膏粉中加入制粒用淀粉,制粒,晾干得到。
本发明的组合物可用作海洋水产养殖中的饲料蛋白源,包括海洋鱼、虾、贝类等的饲料蛋白源,特别适合海洋水产鱼类的饲料蛋白源。
本发明中鱿鱼内脏提取的小肽的制作过程中温度不超过60℃,干燥时采用喷雾干燥器进行干燥,时间短、效果好,保证了该物质不水解、不变性。本发明的组合物具有强的鱼类诱食性,其主要成分鱿鱼内脏提取的小肽具有浓郁的腥香味,是水产养殖饲料蛋白源的佳品。利用本发明提供的组合物养殖海洋鱼类,可大幅度的提高鱼类的摄食量,增加鱼类个体的单位重量。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,不是对本发明的限制。实施例中主要原材料、主要仪器设备、主要生物和化学试剂等如下:
主要原材料:
从广州市黄沙海产品市场收集日本鱿鱼(Todarodes pacificus)内脏,储存于-15℃下备用,使用前12小时在室温下解冻。“大江牌”常规鱼用配合饲料,上海大江(集团)股份有限公司。所用豆粕粉,玉米粉购自济宁双华工贸有限公司,所用鱼粉购自荣成新希望鱼粉有限公司。
主要仪器设备:
发酵罐:LABFORS实验室台式小型发酵罐,产地瑞士;匀浆机:予华A8G型,产地:河南巩义;落地式离心机:Bechman J2-Hs高速冷冻离心机,产地美国;中大型凝胶色谱型号:Sephadex G-25,柱型号:200×10cm,缓冲液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(含0.16mol/LNaCl),pH=7.0,溶剂流速50mL/min,柱床体积约12000mL;835-50氨基酸自动分析仪(日本Hitachi公司);色谱仪Waters 2690,质谱仪Waters Platform ZMD 4000。
主要生物和化学试剂:
胰蛋白酶:100万活力单位/g,大连保税区联合博泰生物技术有限公司,产品编号:RM00102。爱尔卡(Alcalase)蛋白酶:50万活力单位/g,诺维信公司。有机试剂:有机试剂购自广州试剂公司(分析纯)。无机试剂:无机试剂购自广州试剂公司(分析纯)。纯水:实施例中用水均为纯水,使用MiniQ纯水制备系统制备。
实施例1:
收集20kg日本鱿鱼内脏,予华A8G型匀浆机搅拌破碎,加入2L水,再加入20L沸程为60~90℃的石油醚搅拌脱脂,去除石油醚层,将水层在室温下晾3小时,50℃烘箱中烘3小时;加入温度为50℃的水8L,搅匀,用饱和NaOH溶液调节pH值至接近8.5,再用5mol/L浓度的NaOH溶液调节pH值至8.5,50℃保温状态下,将鱿鱼内脏放入发酵罐中,按3000单位/g原料加入6×107单位爱尔卡酶酶解3小时后,再按3000单位/g原料加入6×107单位胰蛋白酶酶解3小时;用Bechman J2-Hs高速冷冻离心机以5000转/分钟离心分离,去除不溶物质;利用截留分子质量18000Da超滤膜过滤脱脂后的酶解液,获得富含小肽的成分,再用中大型Sephadex G-25凝胶色谱分离纯化,获得含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物质,按每1000g小肽中加入0.025g山梨酸钾的配比加入0.0059g山梨酸钾;干燥后得鱿鱼内脏提取的小肽。
称取鱿鱼内脏提取的小肽80g,豆粕粉600g,鱼粉30g,玉米粉270g,加入4L水,搅拌均匀后喷雾干燥,得到干膏粉;再称取制粒用淀粉20g,制粒,晾干,得到组合物。
实施例2:
收集20Kg日本鱿鱼内脏,予华A8G型匀浆机搅拌破碎,加入12L水,再加入20L石油醚和正己烷混合溶剂(1∶1)搅拌脱脂,去除石油醚层,将水层在室温下晾1小时,60℃烘箱中烘1小时;加入温度为60℃的水8L,搅匀,用饱和NaOH溶液调节pH值至接近8.0,再用稀浓度的NaOH溶液调节pH值至8.0;60℃保温状态下,将鱿鱼内脏放入发酵罐中,加入4×107单位爱尔卡酶酶解1小时后,再加入4×107单位胰蛋白酶酶解1小时;用Bechman J2-Hs高速冷冻离心机以5000转/分钟离心分离,去除不溶物质;利用截留分子质量18000Da超滤膜过滤脱脂后的酶解液,获得富含小肽的成分,再用中大型Sephadex G-25凝胶色谱分离纯化,获得含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物质,按每1000g小肽中加入0.050g山梨酸钾的配比加入0.0078g山梨酸钾,干燥后得鱿鱼内脏提取的小肽。
称取鱿鱼内脏提取的小肽60g,豆粕粉500g,鱼粉60g,玉米粉330g,加入4L水,搅拌均匀后喷雾干燥,得干膏粉;再称取制粒用淀粉50g,制粒,晾干,得到组合物。
实施例3:
称取实施例1的鱿鱼内脏提取的小肽65g,豆粕粉535g,鱼粉30g,玉米粉330g,加入4L水,搅拌均匀后喷雾干燥,得干膏粉;再称取制粒用淀粉40g,制粒,晾干,得到组合物。
实施例4:
称取实施例2的鱿鱼内脏提取的小肽75g,豆粕粉575g,鱼粉50g,玉米粉280g,加入4L水,搅拌均匀后喷雾干燥,得干膏粉;再称取制粒用淀粉20g,制粒,晾干,得到组合物。
实施例5:
氨基酸组成分析:
将实施例1和2获得的鱿鱼内脏提取的小肽分别置于水解管中,加入6mol/L的盐酸溶液,真空封口。在110℃下水解24h,冷却后定容、过滤和蒸干,再加入0.02mol/L的盐酸溶液在空气中放置30min,采用835-50氨基酸自动分析仪(日本Hitachi公司),测除色氨酸以外的氨基酸含量,结果得到:
I∶L∶G∶S∶D∶P∶K∶H∶Y∶T=1.05∶1.02∶3.01∶0.96∶0.98∶1.00∶0.97∶0.98∶0.95∶1.00。
采用液质联用(LC-MS)仪测分子质量:
液相色谱条件:色谱仪Waters 2690,检测器:Waters 996,分析柱Lichrospher C-18(2.6×250mm),流动相:甲醇-水-0.5%乙酸梯度洗脱,检测波长220nm,柱温30℃,进样量,10μL,流速0.3mL/min;质谱条件:质谱仪Waters Platform ZMD 4000,离子方式ESI+,毛细管电压4.80kV,锥孔电压32V,Gas Flow:4.2L/h,离子源温度120℃,脱溶剂气温度250℃,质量范围:1000~8000m/z,光电倍增器电压670V,Analyser Vacuum2.6e~5mBar。
采用液质联用仪测定小肽分子质量时没有发现其分子离子峰,只得到其脱去部分基团后的碎片峰。
氨基酸序列测定:采用Edman降解法测鱿鱼小肽的氨基酸序列。序列分析表明小肽具有-ILGGSDPKHYTG-顺序结构链接。
通过对鱿鱼内脏提取的小肽的氨基酸进行氨基酸组成分析、凝胶色谱分析、小肽分子质量测定和氨基酸序列测定,结果得到其中含有-ILGGSDPKHYTG-小肽结构片段,相对分子质量在1400至5800之间。
实施例6:
鲻鱼的饲喂实验,2009年4月,取1龄鲻鱼50尾,分成不添加本发明饲料蛋白源的对照组(10尾)、按10%添加实施例1~3的组合物的实验组(各10尾)和按10%添加鱿鱼内脏鲜液的实验组(10尾),而且都喂养相同的普通饲料(“大江牌”常规鱼用配合饲料)。把鱼放入5个1.5立方米左右的池中,前一个月每天换水1/5,后半个月每天换水1/3,记录其7天、15天、30天和45天后的总体重和相应时间间隔内饲料消耗总量,分析他们的重量变化情况和饲料消耗情况。其中第17天对照组鲻鱼死亡1尾,数据是按10尾换算后的数据。结果见表1,鱿鱼内脏鲜液为鱿鱼内脏经过自生酶解3小时后获得的末经加工的物质。从表1可以清楚看到:与不添加本发明饲料蛋白源的对照组和添加一般鱿鱼内脏酶解鲜液的实验组相比,含鱿鱼内脏提取的小肽的本发明组合物作为饲料蛋白源可大幅度的提高鲻鱼的摄食量,增加鲻鱼个体的单位重量。
表1 实施例1~3的组合物,鱿鱼内脏鲜液和对照组对鲻鱼生长的影响
实施例7:
鲈鱼的饲喂实验,2009年8月,取出生45天的大口黑鲈鱼50尾,分成不添加本发明饲料蛋白源的对照组(10尾)、按10%添加实施例1-3的组合物的实验组(各10尾)和按10%添加鱿鱼内脏鲜液的实验组(10尾),而且都喂养相同的普通饲料(“大江牌”常规鱼用配合饲料)。把各组鱼放入5个1.5立方米左右的池中,前一个月每天换水15%,后一个月每天换水20%,记录其7天、15天、30天和60天后的总体重和相应时间间隔内饲料消耗总量,分析他们的重量变化情况和饲料消耗情况。其中第5天对照组鲈鱼死亡1尾,数据是按10尾换算后的数据。结果见表2。鱿鱼内脏鲜液为鱿鱼内脏经过自生酶解3小时后获得的末经加工的物质。从表2可以清楚看到:与不添加本发明饲料蛋白源的对照组和添加一般鱿鱼内脏酶解鲜液的实验组相比,含鱿鱼内脏提取的小肽的本发明组合物作为饲料蛋白源可大幅度的提高鲈鱼的摄食量,增加鲈鱼个体的单位重量。
表2 实施例1-3的组合物,鱿鱼内脏鲜液和对照组对鲈鱼生长的影响
Claims (6)
1.一种鱿鱼内脏提取的小肽,其特征是含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-,相对分子质量范围为1400~5800,并通过下述方法制备得到:(1)将日本鱿鱼Todarodes pacificus内脏搅碎,加水搅匀,用石油醚或正己烷或石油醚和正己烷的混合溶剂脱脂,去除有机溶剂层,水层在室温下晾1~3小时,50~60℃下烘1~3小时,加入温度为50~60℃的水,调节pH值至8.0~8.5,然后在50~60℃保温状态下,按每克原料2000~3000单位的比例用爱尔卡酶酶解1~3小时后,再按每克原料2000~3000单位的比例用胰蛋白酶酶解1~3小时,去除不溶物质,得到酶解液;(2)将步骤(1)得到的酶解液用截留分子质量18000Da超滤膜过滤,再用凝胶色谱分离纯化,得到含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物质。
2.根据权利要求1所述的一种鱿鱼内脏提取的小肽,其特征是在步骤(2)得到的小肽物质每1000g中加入0.025~0.050g山梨酸钾,搅匀,干燥。
3.一种鱿鱼内脏提取的小肽的制备方法,其特征是包括以下的步骤:
(1)将日本鱿鱼Todarodes pacificus内脏搅碎,加水搅匀,用石油醚或正己烷或石油醚和正己烷的混合溶剂脱脂,去除有机溶剂层,水层在室温下晾1~3小时,50~60℃下烘1~3小时,加入温度为50~60℃的水,调节pH值至8.0~8.5,然后在50~60℃保温状态下,按每克原料2000~3000单位的比例用爱尔卡酶酶解1~3小时后,再按每克原料2000~3000单位的比例用胰蛋白酶酶解1~3小时,去除不溶物质,得到酶解液;
(2)将步骤(1)得到的酶解液用截留分子质量18000Da超滤膜过滤,再用凝胶色谱分离纯化,得到含有氨基酸结构片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物质。
4.根据权利要求3所述的一种鱿鱼内脏提取的小肽的制备方法,其特征是在步骤(2)得到的小肽物质每1000g中加入0.025~0.050g山梨酸钾,搅匀,干燥。
5.一种权利要求1所述的鱿鱼内脏提取的小肽的组合物,其特征是按总质量分数100%计,由权利要求2所述的鱿鱼内脏提取的小肽6%~8%,豆粕粉50%~60%,鱼粉3%~6%,玉米粉27%~33%和制粒用淀粉2%~5%组成。
6.权利要求5所述的组合物作海洋水产饲料蛋白源的应用。
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