CN114277077B - 一种具有协同功效的复合ace抑制肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于活性肽技术领域，具体涉及一种具有协同功效的复合ACE抑制肽及其制备方法和应用。本发明将豌豆肽和玉米肽按照1:0.75～1的比例复配，豌豆肽和玉米肽ACE活性协同增效。实施例结果表明，本发明的复合ACE抑制肽的IC50值为0.547～0.636mg/mL，显著优于同浓度下的单独豌豆肽和玉米肽的IC50值，具有良好的ACE抑制活性，并且必需氨基酸含量较高，能够更好地被人体吸收和利用，提高了豌豆蛋白和玉米蛋白的利用率。
Description
技术领域
本发明属于活性肽技术领域，具体涉及一种具有协同功效的复合ACE抑制肽及其制备方法和应用。
背景技术
高血压是冠心病、中风和终末期肾病发展的主要危险因素。据WHO统计，世界成人高血压患病率约30％，我国患病率为17.5％左右。我国每年约有300万人死于心血管疾病，约占总死亡率的40％。由此可见，高血压的预防与控制对于治疗心血管疾病有着极其重要的作用。血管紧张素转换酶(ACE；EC 3.4.15.1)是一种锌离子金属羧肽酶，能够催化血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，血管紧张素Ⅱ具有收缩血管的作用，导致血压升高。因此通过抑制血管紧张素转换酶或阻断血管紧张素(AT1)受体来调节肾素-血管紧张素系统是现阶段治疗高血压的主要方式。现在已有很多的降压药物用于人们的日常中，如卡托普利、依那普利等，但长期使用这些合成抑制剂对机体会产生一定的副作用，并对人体的健康造成潜在影响。
许多食品衍生肽已被确定为潜在的抗高血压药物。具有血管紧张素-I转换酶(ACE)抑制和抗高血压作用的生物活性肽一直是特别关注的焦点。它们已从多种食物来源中分离出来，并进行了生化表征。据研究表明，食物蛋白质来源的肽在体外具有ACE抑制活性，并且通过动物研究中而表明这些食源性生物活性肽具有潜在的降低血压的功效。然而，单一来源的活性肽虽具有一定的降压效果，但营养价值可能较低，通过不同生物来源的活性肽组合可能既提高ACE抑制活性，又具有良好的营养价值。但由于多肽间功效的相互影响，导致不同食物蛋白来源的多肽在复配后产生的效果差异显著，有必要提供一种复合ACE抑制肽，增大ACE抑制活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有协同功效的复合ACE抑制肽，显著提高单品种活性肽的ACE抑制活性。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种具有协同功效的复合ACE抑制肽，包括豌豆肽和玉米肽；
所述豌豆肽和玉米肽的质量比为1:0.75～1。
优选的，所述豌豆肽的分子量＜2.5kDa；所述玉米肽的分子量＜1kDa。
优选的，所述豌豆肽的制备方法包括：酶解豌豆蛋白后分离，得到所述豌豆肽；
所述玉米肽的制备方法包括：酶解玉米蛋白后分离，得到所述玉米肽。
优选的，所述酶解豌豆蛋白的时间为4～6h；所述酶解豌豆蛋白时，酶与豌豆蛋白的质量比为1.5～3:100。
优选的，所述酶解豌豆蛋白使用的酶包括风味蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种。
优选的，利用所述风味蛋白酶酶解时，酶解的温度为50℃～55℃，酶解的pH为6.95～7.05；
利用所述复合蛋白酶酶解时，酶解的温度为55℃～60℃，酶解的pH为6.95～7.05；
利用所述碱性蛋白酶酶解时，酶解的温度为50℃～55℃，酶解的pH为9.45～9.55。
优选的，所述酶解玉米蛋白的时间为4～5h；所述酶解玉米蛋白，酶与玉米蛋白的质量比为1.5～4:100。
优选的，所述酶解玉米蛋白使用的酶包括风味蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种；
利用所述风味蛋白酶酶解时，酶解的温度为50℃～55℃，酶解的pH为6.95～7.05；
利用所述复合蛋白酶酶解时，酶解的温度为55℃～60℃，酶解的pH为6.95～7.05；
利用所述碱性蛋白酶酶解时，酶解的温度为50℃～55℃，酶解的pH为9.45～9.55。
本发明还提供了上述具有协同功效的复合ACE抑制肽在制备降血压的食品、保健品或药品中的应用。
本发明还提供了一种固体饮料，按质量份计，包括上述具有协同功效的复合ACE抑制肽46～58份，赤藓糖醇18～22份，甜菊糖苷0.5～2.5份，苹果酸17～21份和麦芽糊精；所述芽麦糊精的质量份以使所有组分总量为100份计。
本发明提供了一种具有协同功效的复合ACE抑制肽，包括豌豆肽和玉米肽；所述豌豆肽和玉米肽的质量比为1:0.75～1。本发明将豌豆肽和玉米肽按照1:0.75～1的比例复配，ACE抑制活性显著提高，表明豌豆肽和玉米肽协同增效，复配后ACE的IC50值为0.547～0.636mg/mL，显著优于同浓度下的单独豌豆肽IC50值和玉米肽IC50值，显著提高了ACE抑制活性。
本发明采用特定的酶，分别酶解豌豆蛋白和玉米蛋白，制备豌豆肽和玉米肽，使豌豆肽和玉米肽在具有很好的ACE抑制率的同时，必需氨基酸比例较高，能够更好的被人体吸收和利用，提高了豌豆蛋白和玉米蛋白的利用率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1制备过程中风味蛋白酶酶解6h内水解度及ACE抑制率的变化；
图2为实施例2制备过程中复合蛋白酶酶解6h内水解度及ACE抑制率的变化；
图3为实施例3制备过程中碱性蛋白酶酶解6h内水解度及ACE抑制率的变化；
图4为实施例13不同浓度的分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽对EA.hy.926细胞细胞存活率的影响；
图5为实施例14制备ACE抑制肽过程中，不同酶解时间点所得肽ACE抑制活性；
图6为实施例15制备ACE抑制肽过程中，不同酶解时间点所得肽进行ACE抑制活性检测；
图7为实施例14风味蛋白酶酶解2h，复合蛋白酶酶解3h下，不同浓度的分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽对EA.hy.926细胞细胞存活率的影响；
图8为实施例13分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽与实施例14风味蛋白酶酶解2h，复合蛋白酶酶解3h下，分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽按照1:0.75的质量比复配后得到的豌豆-玉米复合ACE抑制肽对EA.hy.926细胞MDA含量的影响；
图9为实施例13分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽与实施例14风味蛋白酶酶解2h，复合蛋白酶酶解3h下，分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽按照1:0.75的质量比复配后得到的豌豆-玉米复合ACE抑制肽对EA.hy.926细胞ET-1含量的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种具有协同功效的复合ACE抑制肽，包括豌豆肽和玉米肽；所述豌豆肽和玉米肽的质量比为1:0.75～1。
在本发明中，所述豌豆肽的分子量优选＜2.5kDa；所述玉米肽的分子量优选＜1kDa。本发明所述豌豆肽和玉米肽均具有ACE抑制活性，通过限定豌豆肽和玉米肽分子量的大小，将豌豆肽和玉米肽按照1:0.75～1的比例复配，二者协同增效，复配后对ACE的IC50值高达0.547～0.636mg/mL，显著低于同浓度下的单独豌豆肽IC50值和玉米肽IC50值，进一步提高了ACE抑制活性。在本发明的实施例中，可选择豌豆肽和玉米肽质量比1:0.75～1范围内任意比值，具体的可为1:0.75、1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95或1:1等。
在本发明中，所述豌豆肽的制备方法优选包括：酶解豌豆蛋白后分离，得到所述豌豆肽。本发明所述酶解豌豆蛋白的时间优选为4～6h。本发明酶解豌豆蛋白时，酶与豌豆蛋白的质量比优选为1.5～3:100。在本发明的实施例中，可选择酶与豌豆蛋白的质量比1.5～3:100范围内任意比值，具体的可为1.5:100、1.8:100、2:100、2.2:100、2.5:100、2.8:100或3:100等。本发明在具体实施过程中，利用酶对豌豆蛋白进行酶解时，均以豌豆蛋白原料的质量计算酶的用量。本发明对豌豆蛋白的来源没有严格要求，可自行制备，也可购买获得。本发明具体实施过程中，使用的豌豆蛋白购买于山东健源生物工程股份有限公司。
在本发明中，酶解豌豆蛋白所用的酶优选包括风味蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种。本发明所述风味蛋白酶的酶活优选为10～11万U/mL，所述复合蛋白酶的酶活优选为32～33万U/mL，所述碱性蛋白酶的酶活优选为24～25万U/mL。在本发明具体实施过程中，使用的酶购买自南宁东恒华道生物科技有限责任公司。
当利用风味蛋白酶酶解时，所述风味蛋白酶与玉米蛋白的质量比优选为1.5:100；所述酶解的温度优选为50℃～55℃，进一步优选为53～54℃，所述酶解的pH优选为6.95～7.05，进一步优选为7.00。当本发明利用复合蛋白酶酶解时，所述复合蛋白酶与玉米蛋白的质量比优选为1.5:100；所述酶解的温度优选为55℃～60℃，进一步优选为56～58℃，所述酶解的pH优选为6.95～7.05，进一步优选为7.00。当本发明利用碱性蛋白酶酶解时，所述碱性蛋白酶与玉米蛋白的质量比优选为1.5:100；所述酶解的温度优选为50℃～55℃，进一步优选为52～54℃，所述酶解的pH优选为9.45～9.55，进一步优选为9.50。本发明利用特定的酶在特定的温度和pH条件下酶解豌豆蛋白，豌豆蛋白的水解度高，得到的豌豆肽ACE抑制活性更强。
当利用碱性蛋白酶与复合蛋白酶酶解豌豆蛋白时，本发明优选先利用碱性蛋白酶酶解，再利用复合蛋白酶酶解。在本发明中，所述碱性蛋白酶与复合蛋白蛋白酶酶解的时间分配优选为1:2～2:1，进一步优选为1:2、1:1或2:1；本发明所述1:2～2:1比值的含义为，碱性蛋白酶与复合蛋白酶的总酶解时间为4～6h，选择1:2～2:1任意比值分配即可，例如，碱性蛋白酶与复合蛋白酶的总酶解时间为6h时，可选择碱性蛋白酶酶解2h，复合蛋白酶酶解4h；或碱性蛋白酶酶解3h，复合蛋白酶酶解3h；或碱性蛋白酶酶解4h，复合蛋白酶酶解2h。在本发明中，所述碱性蛋白酶和复合蛋白酶的质量和与玉米蛋白的质量比优选为3:100；所述碱性蛋白酶与复合蛋白蛋白酶的质量比优选为1:1。本发明利用碱性蛋白酶与复合蛋白酶复合酶解豌豆蛋白，严格控制碱性蛋白酶和复合蛋白酶的酶解时间，比单一碱性蛋白酶或复合蛋白酶酶解，豌豆蛋白的水解度高，豌豆肽ACE抑制活性更强。
当利用复合蛋白酶与风味蛋白酶酶解豌豆蛋白时，本发明优选先利用复合蛋白酶酶解，再利用风味蛋白酶酶解。在本发明中，所述复合蛋白酶与风味蛋白酶酶解的时间分配优选为1:2～2:1。本发明所述1:2～2:1比值的含义为，复合蛋白酶与风味蛋白酶的总酶解时间为4～6h，选择1:2～2:1任意比值分配即可，例如，复合蛋白酶与风味蛋白酶的总酶解时间为6h时，可选择复合蛋白酶酶解2h，风味蛋白酶酶解4h；或复合蛋白酶酶解3h，风味蛋白酶酶解3h；或复合蛋白酶酶解4h，风味蛋白酶酶解2h。在本发明中，所述复合蛋白酶和风味蛋白酶的质量和与玉米蛋白的质量比优选为3:100；所述复合蛋白蛋白酶与风味蛋白酶的质量比优选为1:1。本发明利用复合蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解豌豆蛋白，严格控制复合蛋白酶与风味蛋白酶的酶解时间，比单一复合蛋白酶或风味蛋白酶酶解，豌豆蛋白的水解度高，豌豆肽ACE抑制活性更强。
当利用碱性蛋白酶与风味蛋白酶酶解豌豆时，本发明优选先利用碱性蛋白酶酶解，再利用风味蛋白酶酶解；所述碱性蛋白酶与风味蛋白酶酶解的时间分配优选为1:2～2:1。本发明所述1:2～2:1任意比值的含义为，碱性蛋白酶与风味蛋白酶的总酶解时间为4～6h，选择1:2～2:1任意比值即可，例如，碱性蛋白酶与风味蛋白酶的总酶解时间为6h时，可选择碱性蛋白酶酶解2h，风味蛋白酶酶解4h；或碱性蛋白酶酶解3h，风味蛋白酶酶解3h；或碱性蛋白酶酶解4h，风味蛋白酶酶解2h。在本发明中，所述碱性蛋白酶和风味蛋白酶的质量和与玉米蛋白的质量比优选为3:100；所述碱性蛋白酶与风味蛋白蛋白酶的质量比优选为1:1。本发明利用碱性蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解豌豆蛋白，严格控制碱性蛋白酶与风味蛋白酶的酶解时间，比单一碱性蛋白酶或风味蛋白酶酶解，豌豆蛋白的水解度高，豌豆肽ACE抑制活性更强。
酶解豌豆蛋白时，本发明优选按照质量体积比1g:10mL，将豌豆蛋白与水混合，得到豌豆蛋白水溶液后进行酶解。酶解前，本发明优选对豌豆蛋白水溶液进行预处理，将豌豆蛋白水溶液的温度和pH调节至酶解所需温度和pH。本发明优选酶解过程中，实时监控豌豆蛋白水溶液的pH，保证酶解过程中pH不变。
当利用两种蛋白酶先后水解豌豆蛋白时，本发明优选在第一种酶酶解完成后，调节温度和pH值至第二种酶酶解的温度和pH，再次进行酶解，分离得到所述豌豆肽。本发明在具体实施过程中，利用第二种酶对豌豆蛋白进行酶解时，第二种酶的用量以豌豆蛋白原料的质量计算酶的用量。在本发明中，所述酶解优选在搅拌条件下进行，进一步优选为磁力搅拌；本发明对搅拌的具体实施方式没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可。本发明对调节pH值使用的试剂没有严格要求，可使用1mol/L的NaOH和/或1mol/L的HCl。
酶解后，得到豌豆蛋白酶解液；本发明优选对所述豌豆蛋白酶解液进行灭酶处理，冷却，分离得豌豆肽。在本发明中，所述灭酶处理的温度优选为90～115℃，进一步优选为100℃；灭酶处理的时间优选为10～20min，进一步优选为15min。本发明对豌豆蛋白酶解液进行灭酶处理能够确保酶的适度作用，不会因为酶对蛋白质的过度酶解，降低ACE抑制活性。本发明对所述冷却的方式没有严格要求，使用流动水冷却即可。在本发明中，所述分离优选包括离心和超滤。本发明所述离心的转速优选为4000r/min，所述离心的时间优选为15min。
本发明优选对离心后得到的豌豆蛋白酶解上清液进行超滤处理，得到所述豌豆肽。在本发明中，所述豌豆肽的分子量优选＜2.5kDa。本发明对所述超滤的方式没有严格要求，保证所得豌豆肽的分子量＜2.5kDa即可。本发明的实施例结果表明分子量<2.5kDa的豌豆肽ACE抑制率IC50值为1.141mg/mL，并且必需氨基酸、疏水氨基酸的比例较高，能够更好地被人体吸收和利用，提高了豌豆蛋白的利用率。
本发明优选对豌豆肽进行冷冻干燥处理，得豌豆肽粉末。本发明对干燥处理的方式没有严格要求，常规进行即可。本发明优选将得到的豌豆肽粉末置于-20℃下储存。
在本发明中，所述玉米肽的制备方法优选包括：酶解玉米蛋白后分离，得到所述玉米肽。
本发明所述玉米蛋白的制备方法优选包括对玉米黄粉进行去淀粉处理，得到所述玉米蛋白。在本发明中，所述去淀粉处理优选包括如下步骤：按照质量体积比1g:10mL，将玉米黄粉与水混合，得玉米蛋白悬液；利用α-淀粉酶酶解玉米蛋白悬液，灭酶处理后，分离得到所述玉米蛋白。本发明所述α-淀粉酶与玉米蛋白悬液的质量比优选为3:100。本发明所述α-淀粉酶酶解的温度优选为60℃～70℃，进一步优选为62～68℃，更优选为65℃；所述α-淀粉酶酶解的pH优选为6.0～6.5；所述α-淀粉酶酶解的时间优选为1.5h～2.5h，进一步优选为2h。在本发明中，所述灭酶处理的温度优选为90～115℃，进一步优选为100℃；灭酶处理的时间优选为10～20min，进一步优选为15min。本发明所述分离的方式优选为离心，所述离心的转速优选为7500r/min～8500r/min，进一步优选为7800r/min～8200r/min；所述离心的时间优选为20min～25min。本发明利用α-淀粉酶酶解玉米蛋白悬液能够去除玉米黄粉中的淀粉，得到的玉米蛋白纯度高，空间结构暴露更充分，易于酶解。
得到玉米蛋白后，本发明对所述玉米蛋白依次进行酶解和分离，得到所述玉米肽。本发明所述酶解的时间优选为4～5h。本发明进行酶解时，所述酶与玉米蛋白的质量比优选为1.5～4:100。在本发明的实施例中，可选择酶与玉米蛋白的质量比1.5～3:100范围内任意比值，具体的可为1.5:100、1.8:100、2:100、2.2:100、2.5:100、2.8:100或3:100等。本发明在具体实施过程中，利用酶对玉米蛋白进行酶解时，均以制备得到的玉米蛋白的总质量计算酶的用量。
在本发明中，酶解玉米蛋白所用酶优选包括风味蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种。本发明所述风味蛋白酶的酶活优选为10～11万U/mL，所述复合蛋白酶的酶活优选为32～33万U/mL，所述碱性蛋白酶的酶活优选为24～25万U/mL。在本发明具体实施过程中，使用的酶购买自南宁东恒华道生物科技有限责任公司。
当本发明利用风味蛋白酶酶解时，所述风味蛋白酶与玉米蛋白的质量比优选为1.5:100；所述酶解的温度优选为50℃～55℃，进一步优选为53～54℃，所述酶解的pH优选为6.95～7.05，进一步优选为7.00。当本发明利用复合蛋白酶酶解时，所述复合蛋白酶与玉米蛋白的质量比优选为1.5:100；所述酶解的温度优选为55℃～60℃，进一步优选为56～58℃，所述酶解的pH优选为6.95～7.05，进一步优选为7.00。当本发明利用碱性蛋白酶酶解时，所述碱性蛋白酶与玉米蛋白的质量比优选为1.5:100；所述酶解的温度优选为50℃～55℃，进一步优选为52～54℃，所述酶解的pH优选为9.45～9.55，进一步优选为9.50。本发明利用特定的酶在特定的温度和pH条件下酶解玉米蛋白，玉米蛋白的水解度高，得到的玉米肽ACE抑制活性更强。
当利用碱性蛋白酶与复合蛋白酶酶解玉米蛋白时，本发明优选先利用碱性蛋白酶酶解，得到第一酶解液后，再利用复合蛋白酶酶解。本发明所述碱性蛋白酶和复合蛋白酶的质量和与玉米蛋白的质量比优选为4:100；本发明所述碱性蛋白酶和复合蛋白酶的酶解的时间和优选为4～5h。在本发明中，当碱性蛋白酶与风味蛋白酶的总酶解时间为4～5h时，优选碱性蛋白酶酶解2h，复合蛋白酶酶解2～3h。本发明所述碱性蛋白酶与玉米蛋白的质量比优选为2.5:100；所述复合蛋白酶与所述玉米蛋白的质量比优选为1.5:100。
当利用复合蛋白酶与风味蛋白酶酶解玉米蛋白时，本发明优选先利用风味蛋白酶酶解，得到第一酶解液后，再利用复合蛋白酶酶解。本发明所述风味蛋白酶和复合蛋白酶的质量和与玉米蛋白的质量比优选为4:100；本发明所述风味蛋白酶和复合蛋白酶的酶解的时间和优选为4～5h。在本发明中，当风味蛋白酶与复合蛋白酶的总酶解时间为4～5h时，优选风味蛋白酶酶解2h，复合蛋白酶酶解2～3h。本发明所述风味蛋白酶与玉米蛋白的质量比优选为2.5:100；所述复合蛋白酶与所述玉米蛋白的质量比优选为1.5:100。本发明利用复合蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解玉米蛋白，严格控制复合蛋白酶与风味蛋白酶酶解玉米蛋白的酶解时间，比单一复合蛋白酶或风味蛋白酶酶解，玉米蛋白的水解度高，玉米肽ACE抑制活性更强。
酶解玉米蛋白时，本发明优选按照质量体积比1g:10mL，将玉米蛋白与水混合，得到玉米蛋白水溶液后进行酶解。酶解前，本发明优选对玉米蛋白水溶液进行预处理，将玉米蛋白水溶液的温度和pH调节至酶解所需温度和pH。本发明优选酶解过程中，实时监控玉米蛋白水溶液的pH，保证酶解过程中pH不变。
当利用两种蛋白酶先后水解玉米蛋白时，本发明优选在第一种酶酶解完成后，调节温度和pH值至第二种酶酶解的温度和pH，再次进行酶解，分离得到所述玉米肽。本发明在具体实施过程中，利用第二种酶对玉米蛋白进行酶解时，第二种酶的用量以本发明制备得到的玉米蛋白的质量计算酶的用量。在本发明中，所述酶解优选在搅拌条件下进行，进一步优选为磁力搅拌。本发明对调节pH值使用的试剂没有严格要求，可使用1mol/L的NaOH和/或1mol/L的HCl。
酶解后，得到玉米蛋白酶解液；本发明优选对所述玉米蛋白酶解液进行灭酶处理，冷却，分离得玉米肽。在本发明中，所述灭酶处理的温度优选为90～115℃，进一步优选为100℃；灭酶处理的时间优选为10～20min，进一步优选为15min。本发明对玉米蛋白酶解液进行灭酶处理能够确保酶的适度作用，不会因为酶对蛋白质的过度酶解，降低ACE抑制活性。本发明对所述冷却的方式没有严格要求，使用流动水冷却即可。在本发明中，所述分离优选包括离心和超滤。本发明所述离心的转速优选为7500rpm～8500r/min，进一步优选为7800～8200r/min；所述离心的时间优选为20min～25min。
本发明优选对离心后得到的玉米蛋白酶解上清液进行超滤处理，得到所述玉米肽。在本发明中，所述玉米肽的分子量优选＜1kDa。本发明对所述超滤处理的方式没有严格要求，保证得到的玉米肽中分子量＜1kDa即可。本发明的实施例结果表明分子量<1kDa的玉米肽ACE抑制率IC50值为0.765mg/mL，并且必需氨基酸比例较高，能够更好地被人体吸收和利用，提高了玉米蛋白的利用率。
本发明优选对玉米肽进行冷冻干燥处理，得玉米肽粉末。本发明对干燥处理的方式没有严格要求，常规进行即可。本发明优选将得到的玉米肽粉末置于-20℃下储存。
本发明还提供了上述具有协同功效的复合ACE抑制肽在制备降血压的食品、保健品或药品中的应用。本发明所述具有协同功效的复合ACE抑制肽的IC50值为0.547～0.636mg/mL，玉米肽和豌豆肽协同增效，显著低于同浓度下的单独豌豆肽IC50值和玉米肽IC50值，进一步提高了ACE抑制活性，提高了降血压效果。
本发明还提供了一种固体饮料，按质量份计，包括上述复合ACE抑制肽46～58份，赤藓糖醇18～22份，甜菊糖苷0.5～2.5份，苹果酸17～21份和余量麦芽糊精。
以质量份计，本发明所述固体饮料包括46～58份复合ACE抑制肽，优选为48～56份，进一步优选为50～52份。在本发明中，所述固体饮料的复合ACE抑制肽优选为分子量＜2.5kDa的豌豆肽与分子量＜1kDa的玉米肽按照1:0.75～1的质量比复配得到。与同浓度下的单独豌豆肽和玉米肽相比，本发明所述的复合ACE抑制肽具有较强的ACE抑制活性，IC50值为0.547～0.636mg/mL。本发明所述固体饮料中复合ACE抑制肽优选为复合ACE抑制肽粉末。本发明在植被复合ACE抑制肽粉末时，可分别制备豌豆ACE抑制肽粉末和玉米ACE抑制肽粉末后混合，或者将豌豆ACE抑制肽与玉米ACE抑制肽混合得复合ACE抑制肽后再制备复合ACE抑制肽粉末。本发明对制备粉末的方式没有严格要求，进行冷冻干燥处理即可。
以所述复合ACE抑制肽的质量份数为基准，本发明所述固体饮料包括18～22份赤藓糖醇，优选为20份。本发明所述赤藓糖醇为固体饮料中的调味剂，热量低。
以所述复合ACE抑制肽的质量份数为基准，本发明所述固体饮料包括0.5～2.5份甜菊糖苷，优选为1.0～1.5份。本发明所述甜菊糖苷不会影响血糖水平或干扰胰岛素，同时不含任何卡路里，可以给糖尿病人在预算总摄入热量方面提供更多灵活选择，并有助于控制体重。
以所述复合ACE抑制肽的质量份数为基准，本发明所述固体饮料包括17～21份苹果酸，优选为18～20份。本发明所述苹果酸热量较低，无臭，带有刺激性爽快酸味，口感接近天然果汁并具有天然香味。
以所述复合ACE抑制肽的质量份数为基准，本发明所述固体饮料还包括余量的麦芽糊精。本发明所述余量的含义为当所述固体饮料的质量份数为100份时，除去复合ACE抑制肽、赤藓糖醇、甜菊糖苷和苹果酸质量份数后，剩余的质量份数。本发明所述麦芽糊精溶解性高，具有较低的热量与良好的流动性，易于人体吸收，可防止结块。
本发明用最佳ACE抑制活性的豌豆肽与最佳ACE抑制活性的玉米肽进行配比，作为原料组分制备固体饮料，使得到的固体饮料具有较好的降压效果，并且感官评分高，速溶性好，利于人体吸收，使豌豆和玉米中的氨基酸得到充分的利用。
本发明还提供了所述固体饮料的制备方法，优选包括将所述复合ACE抑制肽、赤藓糖醇、甜菊糖苷、苹果酸和麦芽糊精混合，得到固体饮料；进一步优选在混合后进行干燥杀菌和包装。
混合前，本发明优选对所述复合ACE抑制肽、赤藓糖醇、甜菊糖苷、苹果酸和麦芽糊精研磨、过筛，得复合ACE抑制肽粉末、赤藓糖醇粉末、甜菊糖苷粉末、苹果酸粉末和麦芽糊精粉末；本发明可以对复合ACE抑制肽、赤藓糖醇、甜菊糖苷、苹果酸和麦芽糊精分别进行研磨，也可以混合研磨。本发明对所述研磨的方式没有严格要求，保证研磨后的粒径大小为300nm即可。
本发明对所述混合和干燥杀菌的方式没有严格要求，常规进行即可。
本发明所述固体饮料的制备方法简便，制备得到的固体饮料感官评分高，速溶性好，具有较好的降压效果。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
豌豆ACE抑制肽的制备由以下步骤组成：
(1)取豌豆蛋白，按照料液比1g:10mL加入蒸馏水混合均匀，得到豌豆蛋白水溶液；
(2)将步骤(1)得到的豌豆蛋白水溶液预热至50℃，加入NaOH调节pH至7.0；
(3)加入风味蛋白酶，风味蛋白酶的质量为步骤(1)豌豆蛋白质量的1.5％，在温度50℃，pH为7.0的条件下，进行磁力搅拌酶解6h，酶解过程pH保持在7.0，温度保持在50℃，得到豌豆蛋白酶解液；
(4)取上述豌豆蛋白酶解液于100℃灭酶处理15min，灭酶后使用流动水冷却；
(5)将冷却后的酶解液在4000r/min条件下，离心15min得上清液，即为豌豆ACE抑制肽。
实施例2
豌豆ACE抑制肽的制备由以下步骤组成：
(1)取豌豆蛋白，按照料液比1g:10mL加入蒸馏水混合均匀，得到豌豆蛋白水溶液；
(2)将步骤(1)得到的豌豆蛋白水溶液预热至55℃，加入NaOH调节pH至7.0；
(3)加入复合蛋白酶，复合蛋白酶的质量为步骤(1)豌豆蛋白质量的1.5％，在温度55℃，pH为7.0的条件下，进行磁力搅拌酶解6h，酶解过程pH保持在7.0，温度保持在55℃得到豌豆蛋白酶解液；
(4)取上述豌豆蛋白酶解液于100℃灭酶处理15min，灭酶后使用流动水冷却；
(5)将冷却后的酶解液在4000r/min条件下，离心15min得上清液，即为豌豆ACE抑制肽。
实施例3
豌豆ACE抑制肽的制备由以下步骤组成：
(1)取豌豆蛋白，按照料液比1g:10mL加入蒸馏水混合均匀，得到豌豆蛋白水溶液；
(2)将步骤(1)得到的豌豆蛋白水溶液预热至50℃，加入NaOH调节pH至9.5；
(3)加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的质量为步骤(1)豌豆蛋白质量的1.5％，在温度50℃，pH为9.5的条件下，进行磁力搅拌酶解6h，酶解过程pH保持在9.5，温度保持在50℃，得到豌豆蛋白酶解液；
(4)取上述豌豆蛋白酶解液于100℃灭酶处理15min，灭酶后使用流动水冷却；
(5)将冷却后的酶解液在4000r/min条件下，离心15min得上清液，即为豌豆ACE抑制肽。
实施例4
豌豆ACE抑制肽的制备由以下步骤组成：
(1)取豌豆蛋白，按照料液比1g:10mL加入蒸馏水混合均匀，得到豌豆蛋白水溶液；
(2)将步骤(1)得到的豌豆蛋白水溶液预热至50℃，加入NaOH调节pH至9.5；
(3)加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的质量为步骤(1)豌豆蛋白质量的1.5％，在温度50℃，pH为9.5的条件下，进行磁力搅拌酶解2h，调节酶解过程pH保持在9.5，温度保持在50℃，得到豌豆蛋白第一酶解液；
(4)使用1mol/L的HCl调节将步骤(3)得到的豌豆蛋白第一酶解液pH至7.0；
(5)向豌豆蛋白第一酶解液加入复合蛋白酶，复合蛋白酶质量占步骤(1)豌豆蛋白质量的1.5％，在温度55℃，pH为7.0的条件下，进行磁力搅拌酶解4h，酶解过程pH保持在7.0，温度保持在55℃，得到豌豆蛋白酶解液；
(6)取上述豌豆蛋白酶解液于100℃灭酶处理15min，灭酶后使用流动水冷却；
(7)将冷却后的酶解液在4000r/min条件下，离心15min得上清液，即为豌豆ACE抑制肽。
实施例5
同实施例4，区别在于步骤(3)碱性蛋白酶酶解3h，步骤(5)复合蛋白酶酶解3h。
实施例6
同实施例4，区别在于步骤(3)碱性蛋白酶酶解4h，步骤(5)复合蛋白酶酶解2h。
实施例7
豌豆ACE抑制肽的制备由以下步骤组成：
(1)取豌豆蛋白，按照料液比1g:10mL加入蒸馏水混合均匀，得到豌豆蛋白水溶液；
(2)将步骤(1)得到的豌豆蛋白水溶液预热至55℃，加入NaOH调节pH至7.0；
(3)加入复合蛋白酶，复合蛋白酶的质量为步骤(1)豌豆蛋白质量的1.5％，在温度55℃，pH为7.0的条件下，进行磁力搅拌酶解2h，酶解过程pH保持在7.0，温度保持在55℃，得到豌豆蛋白第一酶解液；
(4)向步骤(3)得到的豌豆蛋白第一酶解液加入风味蛋白酶，风味蛋白酶的质量为步骤(1)豌豆蛋白质量的1.5％，在温度50℃，pH为7.0的条件下，进行磁力搅拌酶解4h，酶解过程pH保持在7.0，温度保持在50℃，得到豌豆蛋白酶解液；
(5)取上述豌豆蛋白酶解液于100℃灭酶处理15min，灭酶后使用流动水冷却；
(6)将冷却后的豌豆蛋白酶解液在4000r/min条件下，离心15min得上清液，即为豌豆ACE抑制肽。
实施例8
同实施例7，区别在于步骤(3)复合蛋白酶酶解3h，步骤(5)风味蛋白酶酶解3h。
实施例9
同实施例7，区别在于步骤(3)复合蛋白酶酶解4h，步骤(5)风味蛋白酶酶解2h。
实施例10
豌豆ACE抑制肽的制备由以下步骤组成：
(1)取豌豆蛋白，按照料液比1g:10mL加入蒸馏水混合均匀，得到豌豆蛋白水溶液；
(2)将步骤(1)得到的豌豆蛋白水溶液预热至50℃，加入NaOH调节pH至9.5；
(3)加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的质量为步骤(1)豌豆蛋白质量的1.5％，在温度50℃，pH为9.5的条件下，进行磁力搅拌酶解2h，酶解过程pH保持在7.0，温度保持在50℃，得到豌豆蛋白第一酶解液；
(4)使用1mol/L的HCl调节步骤(3)得到的豌豆蛋白第一酶解液pH至7.0；
(5)向豌豆蛋白第一酶解液加入风味蛋白酶，风味蛋白酶的质量为步骤(1)豌豆蛋白质量的1.5％，在温度50℃，pH为9.5的条件下，进行磁力搅拌酶解4h，酶解过程pH保持在7.0，温度保持在50℃，得到豌豆蛋白酶解液；
(6)取上述豌豆蛋白酶解液于100℃灭酶处理15min，灭酶后使用流动水冷却；
(7)将酶解液在4000r/min条件下，离心15min得上清液，即为ACE抑制肽。
实施例11
同实施例10，区别在于步骤(3)碱性蛋白酶酶解3h，步骤(5)风味蛋白酶酶解4h。
实施例12
同实施例10，区别在于步骤(3)碱性蛋白酶酶解4h，步骤(5)风味蛋白酶酶解2h。
测试例1
利用pH-sata法和Folin-酚法分别测定实施例1～3酶解6h内的水解度及可溶蛋白含量的变化情况。
利用Cushman紫外分光光度法对实施例1～3酶解6h的ACE抑制肽进行ACE抑制活性检测，反应在2mL的PE管中进行，反应总体积110μL。依次加入10μL豌豆ACE抑制肽、40μL5mmol/L HHL溶液(HHL溶液pH8.3，用含有0.3mol/LNaCI的0.1mol/L硼酸缓冲液配制)和50μL的去离子水。在37℃下预热5min，然后加入10μLACE(0.1U)启动反应，37℃恒温水浴30min；加入140μL l mol/L HCl终止反应；加入750μL冷(-20℃)的乙酸乙酯，混合15s后，萃取反应生成的马尿酸；于3500r/min离心5min后，将500μL酯层移入试管中；在100℃的沸水中将乙酸乙酯蒸去，再在90℃烘箱中烘干(约10min)，加入200μL的去离子水振荡2min，以溶解马尿酸；最后在228nm处测定吸光值OD，记为实验组。对照组不加入豌豆ACE抑制肽(用等量去离子水代替豌豆ACE抑制肽)，其余操作与实验组管完全相同；空白组除在反应前先加入140μLl mol/L HCl以终止反应外，其余操作与实验组管完全相同。抑制率如以下计算：
抑制率(％)＝(ODA-ODB)/(ODA-ODC))
其中：ODA为对照组的吸光值；ODB为实验组的吸光值；ODC为空白组的吸光值。
实施例1检测结果如图1所示，实施例2检测结果如图2所示，实施例3检测结果如图3所示。
根据图1～3可以看出，利用风味蛋白酶、复合蛋白酶或碱性蛋白酶进行单一酶解得到的ACE抑制肽都具有ACE抑制活性，抑制率高达50％以上。
测试例2
1.利用Cushman紫外分光光度法对采用实施例4～12制备ACE抑制肽过程中，不同酶解时间点所得肽的ACE抑制肽进行ACE抑制活性检测，检测方法同测试例1。
(1)实施例4～6(碱性蛋白酶+复合蛋白酶)检测结果如下表1所示。
表1碱性蛋白酶与复合蛋白酶协同酶解对ACE抑制率的影响
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表1中An-Pn(n为0、1、2、3或4)代表的是碱性蛋白酶与复合蛋白酶的酶解时间，具体的以实施例4为例进行说明，A2-P0组表示总酶解时间为2h，具体为碱性蛋白酶酶解2h；A2-P1组表示总酶解时间为3h，具体为碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解1h；A2-P2组表示总酶解时间为4h，具体为碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解2h；A2-P3组表示总酶解时间为5h，具体为碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解3h；A2-P4组表示总酶解时间为6h，具体为碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解4h。
根据表1可以看出，利用碱性蛋白酶与复合蛋白酶协同酶解得到的ACE抑制肽都具有ACE抑制活性，抑制率高达50％以上。利用碱性蛋白酶与复合蛋白酶协同酶解时，碱性蛋白酶酶解2h后利用复合蛋白酶酶解2h的条件下，得到的豌豆ACE抑制肽对ACE的抑制活性最高，达96.49％。
(2)实施例7～9(复合蛋白酶+风味蛋白酶)检测结果如下表2所示。
表2复合蛋白酶与风味蛋白酶协同酶解对ACE抑制率的影响
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表2中Pn-Fn(n为0、1、2、3或4)代表的是复合蛋白酶与风味蛋白酶的酶解时间，具体的以实施例7为例进行说明，P2-F0组表示总酶解时间为2h，具体为风味蛋白酶酶解2h；P2-F1组表示总酶解时间为3h，具体为复合蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解1h；P2-F2组表示总酶解时间为4h，具体为复合蛋白酶酶解2h后，风味蛋白酶酶解2h；P2-F3组表示总酶解时间为5h，具体为复合蛋白酶酶解2h后，风味蛋白酶酶解3h；P2-F4组表示总酶解时间为6h，具体为复合蛋白酶酶解2h后，风味蛋白酶酶解4h。
根据表1可以看出，利用复合蛋白酶与风味蛋白酶协同酶解得到的ACE抑制肽都具有ACE抑制活性，抑制率高达70％以上。利用复合蛋白酶与风味蛋白酶协同酶解时，复合蛋白酶解3h后利用风味蛋白酶酶解1h的条件下，得到的豌豆ACE抑制肽对ACE的抑制活性最高，达88.59％.
(3)实施例10～12(碱性蛋白酶+风味蛋白酶)检测结果如下表1所示。
表3碱性蛋白酶与复合蛋白酶协同酶解对ACE抑制率的影响
表3中An-Fn(n为0、1、2、3或4)代表的是碱性蛋白酶与风味蛋白酶的酶解时间，具体的以实施例10为例进行说明，A2-F0组表示总酶解时间为2h，具体为碱性蛋白酶酶解2h；A2-F1组表示总酶解时间为3h，具体为碱性蛋白酶酶解2h后，风味蛋白酶酶解1h；A2-F2组表示总酶解时间为4h，具体为碱性蛋白酶酶解2h后，风味蛋白酶酶解2h；A2-F3组表示总酶解时间为5h，具体为碱性蛋白酶酶解2h后，风味蛋白酶酶解3h；A2-F4组表示总酶解时间为6h，具体为碱性蛋白酶酶解2h后，风味蛋白酶酶解4h。
根据表3可以看出，利用碱性蛋白酶与风味蛋白酶协同酶解得到的ACE抑制肽都具有ACE抑制活性，抑制率高达60％以上。利用碱性蛋白酶与风味蛋白酶协同酶解时，碱性蛋白酶酶解2h后利用风味蛋白酶酶解2h的条件下，得到的豌豆ACE抑制肽对ACE的抑制活性最高，达89.13％。
2.利用pH-sata法和Folin-酚法分别测定实施例实施例4，实施例7和实施例10制备ACE抑制肽过程中，酶解时间4h的水解度及可溶蛋白含量的变化情况，测定结果如下表4。
表4双酶协同水解的酶解效率与ACE抑制活性的影响
由表4可以看出，利用碱性蛋白酶与复合蛋白酶，或者利用复合蛋白酶与风味蛋白酶，或者利用碱性蛋白酶与风味蛋白酶能够实现玉米蛋白的酶解，其中利用碱性蛋白酶与复合蛋白酶协同酶解4h，酶解的水解度最高，可溶性蛋白的含量最低。
实施例13
同实施例4，区别在于步骤(3)碱性蛋白酶酶解2h，步骤(5)复合蛋白酶酶解2h。
测试例3
对实施例13得到豌豆ACE抑制肽进行超滤处理，分别得到分子量＞10kDa的豌豆ACE抑制肽，分子量8～10kDa的豌豆ACE抑制肽，分子量5～8kDa的豌豆ACE抑制肽，分子量2.5～5kDa的豌豆ACE抑制肽和分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽。测定酶解产物不同超滤分子量肽段的ACE抑制活性以及氨基酸的种类和含量(测定方法参照GB/T 18246-2000)，检测方法同测试例1，不同超滤分子量肽段的ACE抑制活性检测结果如下表5，不同超滤分子量肽段的氨基酸的种类和含量如下表6。
表5豌豆ACE抑制肽超滤分级结果
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注：蛋白质的回收率＝分级后的总蛋白含量/与超滤前的酶解产物的蛋白含量×100％
表6豌豆ACE抑制肽中不同分子量的氨基酸组成对比
注：必需氨基酸/非必需氨基酸指分级后的蛋白酶解液中必需氨基酸含量与非必需氨基酸含量的比值。
由表5和表6可以看出，分子量<2.5kDa的豌豆肽具有较高的ACE抑制率，并且必需氨基酸比值与疏水氨基酸比例也高，能够更好的被人体吸收和利用，提高了豌豆蛋白的利用率。
测试例4
对实施例13得到的豌豆ACE抑制肽进行超滤处理，得到分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽，检测不同浓度的ACE抑制肽对EA.hy.926细胞细胞存活率的影响。
检测方法如下：
人脐静脉内皮细胞的培养：对EA.hy.926细胞(由中国科学院上海生科院细胞库提供)采用高糖DMEM+FBS+双抗(青霉素-链霉素)培养基(DMEM：FBS：双抗＝9:1:0.1)进行培养。培养流程如下：复苏后的细胞置于含5％CO2培养箱中，37℃培养，24小时后换液，等到细胞生长融合至能覆盖瓶底85％以上时，利用胰酶消化，按照1:2的比例进行传代。取对数生长期的EA.hy.926细胞作为实验材料。
将对数生长期生长状态良好的EA.hy.926细胞按照1.0×105个/mL接种于96孔板中，180μl/孔，置于5％CO2培养箱中，37℃培养24小时后，吸出样品孔中培养基，加入180μL终浓度分别为5、10、25、50、100、200、250、500、1000μg/mL的分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽，置于5％CO2培养箱中，37℃培养24小时后加入20μLMTT溶液，37℃培养4h后吸出上清液，加入150μLDMSO，37℃避光震荡10min使反应均匀，酶标仪上测定OD490 nm值，测定细胞相对存活率，检测结果如图7。
根据图4可以看出，本发明实施例13得到的分子量＜2.5kDa的ACE抑制肽能够提高EA.hy.926细胞活力，当浓度为200μg/mL时，活力最高，为91.667％。
实施例14
(1)取经挤压膨化、去淀粉、蒸煮等预处理后玉米黄粉，加入10倍体积蒸馏水进行搅拌，制成玉米蛋白悬液；
(2)向步骤(1)玉米蛋白悬液中加入α-蛋白酶进行去淀粉酶解，α-蛋白酶的质量为步骤(1)玉米蛋白悬液质量的3％；
(3)调整上述溶液的pH至6.5，在65℃条件下磁力搅拌酶解2h；
(4)取步骤(3)酶解后所得溶液100℃灭酶处理15min，冷却；
(5)取上述溶液4000r/min离心15min，去除上清液；
(6)取离心后的沉淀，蒸馏水水洗3次，去除色素，保留沉淀，水洗3次后自然晾干，得到玉米蛋白；
(7)取玉米蛋白，按照料液比1g:10mL加入蒸馏水混合均匀，得到玉米蛋白水溶液；
(8)加入风味蛋白酶，风味蛋白酶的质量为步骤(6)玉米蛋白质量的2.5％，在温度50℃，pH为7.0的条件下，进行磁力搅拌酶解2h，调节pH保持在7.0，温度保持在50℃；得到玉米蛋白酶第一解液；
(9)向步骤(8)得到的玉米蛋白酶解液中加入复合蛋白酶，复合蛋白酶的质量为步骤(6)玉米蛋白质量的1.5％，进行磁力搅拌酶解3h，调节pH保持在7.0，温度保持在50℃，得到玉米蛋白酶液；
(10)取步骤(9)得到的玉米蛋白酶解液100℃灭酶处理15min，冷却；
(11)取冷却后的玉米蛋白酶液，4000r/min离心25min取上清液，得到玉米ACE抑制肽。
测试例5
利用Cushman紫外分光光度法对采用实施例14制备ACE抑制肽过程中，不同酶解时间点所得肽进行ACE抑制活性检测，检测方法同测试例1。检测结果如下图5，图5横坐标代表的时间为风味蛋白酶与复合蛋白酶协同酶解时间的总和，酶解2.5h，其含义为风味蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解0.5h；酶解3h，其含义为风味蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解1h；酶解3.5h，其含义为风味蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解1.5h；酶解4h，其含义为风味蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解2h；酶解4.5h，其含义为风味蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解2.5h；酶解5h，其含义为风味蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解3h。当进行具体的检测时，每次酶解结束后，进行实施例14步骤(10)和步骤(11)，检测酶解液中ACE抑制活性。
根据图5记载的内容可以看出，利用风味蛋白酶与复合蛋白酶协同酶解能够增大酶解液ACE抑制活性，抑制率在95％以上。
实施例15
同实施例14，区别在于(8)加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的质量为步骤(6)玉米蛋白质量的2.5％，进行磁力搅拌酶解2h，调节pH保持在9.5，温度保持在50℃；碱性蛋白酶酶解结束后，使用1mol/L的HCl调节pH至7.0。
测试例6
利用Cushman紫外分光光度法对采用实施例15制备ACE抑制肽过程中，不同酶解时间点所得肽进行ACE抑制活性检测，检测方法同测试例1。检测结果如下图6，图6横坐标代表的时间为碱性蛋白酶与复合蛋白酶协同酶解时间的总和，酶解2.5h，其含义为碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解0.5h；酶解3h，其含义为碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解1h；酶解3.5h，其含义为碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解1.5h；酶解4h，其含义为碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解2h；酶解4.5h，其含义为碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解2.5h；酶解5h，其含义为碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解3h。当进行具体的检测时，每次酶解结束后，进行实施例14步骤(10)和步骤(11)，检测酶解液中ACE抑制活性。
根据图6记载的内容可以看出，利用碱性蛋白酶与复合蛋白酶协同酶解能够增大酶解液ACE抑制活性，但是当碱性蛋白酶酶解2h后，复合蛋白酶酶解3h时，其抑制率低于25％，其余酶解时间ACE抑制率在40％以上。
测试例7
对实施例14风味蛋白酶酶解2h，复合蛋白酶酶解3h下得到玉米ACE抑制肽进行超滤处理，分别得到分子量＞10kDa的玉米ACE抑制肽，分子量8～10kDa的玉米ACE抑制肽，分子量5～8kDa的玉米ACE抑制肽，分子量2.5～5kDa的玉米ACE抑制肽、分子量1～2.5kDa的玉米ACE抑制肽和分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽。测定酶解产物不同超滤分子量肽段的ACE抑制活性，检测方法同测试例1，不同超滤分子量肽段的玉米ACE抑制活性检测结果如下表7。
表7豌豆ACE抑制肽超滤分级结果
注：蛋白质的回收率＝分级后的总蛋白含量/与超滤前的酶解产物的蛋白含量×100％
由表4可以看出，分子量<1kDa的豌豆肽具有较高的ACE抑制率，并且蛋白回收率低，能够更好的被人体吸收和利用，提高了玉米蛋白的利用率。
测试例8
检测不同浓度的测试例7超滤处理得到的分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽，对EA.hy.926细胞细胞存活率的影响。
检测方法同测试例4，检测结果如图7。
根据图7可以看出，本发明实施例14风味蛋白酶酶解2h，复合蛋白酶酶解3h下得到的分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽能够提高EA.hy.926细胞活力，当浓度为200μg/mL时，活力最高，为93.304％。
测试例9
对实施例13得到豌豆ACE抑制肽进行超滤处理，得分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽；对实施例14风味蛋白酶酶解2h，复合蛋白酶酶解3h下得到的玉米ACE抑制肽进行超滤处理，得分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽；将分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽和分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽按照1:1、1：0.75、1：0.5和1：0.25的质量比进行复配，探究豌豆-玉米复合ACE抑制肽对ACE的抑制效果，检测方法同测试例1，检测结果如下表8。
表8豌豆肽与玉米肽不同复配比例对ACE抑制活性的影响
由表8数据可以知晓，当豌豆肽和玉米肽的复配比例为1:0.75～1时，豌豆肽和玉米肽表现为协同增效的作用，能够进一步提高ACE抑制效果，都能够复配比例低于1:1或者高于1:0.75时，豌豆肽和玉米肽复配后表现为拮抗作用，反而会使ACE抑制活性降低。
测试例10
检测不同ACE抑制肽的不同浓度对EA.hy.926细胞MDA含量的影响，方法如下：
1.人脐静脉内皮细胞的培养：EA.hy.926采用高糖DMEM+FBS+双抗(青霉素-链霉素)培养基(DMEM：FBS：双抗＝9:1:0.1)进行培养。培养流程如下：复苏后的细胞置于含5％CO2培养箱中，37℃培养，24小时后换液，等到细胞生长融合至能覆盖瓶底85％以上时，利用胰酶消化，按照1:2的比例进行传代。取对数生长期的EA.hy.926作为实验材料。
2.实验分组及处理：取对数生长期的EA.hy.926细胞，弃去培养基，PBS洗涤两遍，胰酶消化，2.4×105/孔接板，随机分组如下：
(1)空白对照组：不加任何试剂处理细胞；
(2)ACE抑制肽低剂量组：加入肽终浓度为50μg/mL；
(3)ACE抑制肽中剂量组：加入肽终浓度为100μg/mL；
(4)ACE抑制肽高剂量组：加入肽终浓度为200μg/mL；
(5)卡托普利(Cap)组：加入Cap终浓度为1.75μg/mL；
(6)血管紧张素∥组：加入Ang-∥终浓度为2.221μmol/L。
其中，高剂量组、低剂量组和中剂量组分别包括测试例7得到的分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽，分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽和将分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽与分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽按照1：0.75的质量比复配后得到的豌豆-玉米复合ACE抑制肽。
3.MDA含量的测定：试剂盒采用ELISA法。丙二醛(MDA)产生于高水平的ROS而作为常用的评价细胞氧化应激水平的指标，反映了机体被自由基攻击的严重程度。细胞接种后按照上述步骤2，将细胞分组处理，1000r/min离心10min收集细胞后，用细胞超声破碎仪破碎细胞，制备细胞匀浆，按试剂盒说明书测定MDA含量，检测结果如图8。
由图8可以看出，本发明复配后的豌豆-玉米复合ACE抑制肽能够降低EA.hy.926细胞MDA含量，并且作用效果优于单一豌豆肽和玉米肽，本发明豌豆-玉米复合ACE抑制肽中豌豆肽和玉米肽具有协同增效的作用。
测试例11
检测不同ACE抑制肽的不同浓度对EA.hy.926细胞ET-1含量的影响，检测样品同测试例8，ET-1含量的测定方法为：试剂盒采用ELISA法。往预先包被内皮素1(ET-1)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，经过恒温孵育并彻底洗涤。用底物四甲基联苯胺(TMB)显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色物质，并在酸的作用下转化成最终的黄色物质。颜色的深浅和样品中的内皮素1(ET-1)含量呈现正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，作标准曲线，计算样品浓度。根据标准曲线的曲线方程计算各样本浓度值，检测结果如图9。
由图9可以看出，本发明复配后的豌豆-玉米复合ACE抑制肽能够降低EA.hy.926细胞ET-1含量含量，并且高剂量作用效果优于单一豌豆肽和玉米肽，本发明豌豆-玉米复合ACE抑制肽中豌豆肽和玉米肽具有协同增效的作用。
实施例16
对实施例13得到的豌豆ACE抑制肽进行超滤处理，得分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽，进行冷冻干燥，得到豌豆ACE抑制肽粉末；对实施例16得到的玉米ACE抑制肽进行超滤处理，得分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽，进行冷冻干燥，得到玉米ACE抑制肽粉末；将分子量＜2.5kDa的豌豆ACE抑制肽粉末与分子量＜1kDa的玉米ACE抑制肽粉末按照1:0.75的质量比复配，得豌豆-玉米复合ACE抑制肽；
按照以下质量份备料：复配肽46份，赤藓糖醇20份、甜菊糖苷2份、苹果酸18份、麦芽糊精14份。
具体的：复配肽46g，赤藓糖醇20g、甜菊糖苷2份、苹果酸18份、麦芽糊精14g。
将上述原料研磨粉碎过筛，用混合机将主辅料混合均匀，干燥杀菌，袋装包装得固体饮料。
实施例17
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽58份，赤藓糖醇20份、甜菊糖苷2份、苹果酸18份、麦芽糊精2份。
实施例18
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽50份，赤藓糖醇20份、甜菊糖苷2份、苹果酸18份、麦芽糊精10份。
实施例19
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇18份、甜菊糖苷2份、苹果酸18份、麦芽糊精7份。
实施例20
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇22份、甜菊糖苷2份、苹果酸18份、麦芽糊精3份。
实施例21
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21份、甜菊糖苷0.5份、苹果酸18份、麦芽糊精5.5份。
实施例22
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21份、甜菊糖苷2.5份、苹果酸18份、麦芽糊精3.5份。
实施例23
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21份、甜菊糖苷2份、苹果酸17份、麦芽糊精5份。
实施例24
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21份、甜菊糖苷2份、苹果酸21份、麦芽糊精1份。
实施例25
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.5份、甜菊糖苷2份、苹果酸21份、麦芽糊精1.5份。
实施例26
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21.5份、甜菊糖苷2份、苹果酸21份、麦芽糊精0.5份。
实施例27
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21.5份、甜菊糖苷1.954份、苹果酸18.5份、麦芽糊精3.046份。
实施例28
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.764份、甜菊糖苷1.5份、苹果酸17.5份、麦芽糊精5.326份。
实施例29
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.5份、甜菊糖苷2.5份、苹果酸18.5份、麦芽糊精3.5份。
实施例30
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.5份、甜菊糖苷1.887份、苹果酸17.892份、麦芽糊精4.721份。
实施例31
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21.5份、甜菊糖苷1.5份、苹果酸18.023份、麦芽糊精3.977份。
实施例32
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21.048份、甜菊糖苷1.94份、苹果酸18.448份、麦芽糊精3.563份。
实施例33
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.5份、甜菊糖苷1.5份、苹果酸18.5份、麦芽糊精4.5份。
实施例34
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21.379份、甜菊糖苷1.5份、苹果酸17.5份、麦芽糊精4.621份。
实施例35
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21.048份、甜菊糖苷1.940份、苹果酸18.448份、麦芽糊精3.563份。
实施例36
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21.5份、甜菊糖苷2.5份、苹果酸18份、麦芽糊精3份。
实施例37
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.5份、甜菊糖苷1.887份、苹果酸17.892份、麦芽糊精4.721份。
实施例38
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.975份、甜菊糖苷2.5份、苹果酸18.5份、麦芽糊精3.025份。
实施例39
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21.425份、甜菊糖苷2.135份、苹果酸17.5份、麦芽糊精3.940份。
实施例40
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.849份、甜菊糖苷2.027份、苹果酸18.015份、麦芽糊精4.109份。
实施例41
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21.009份、甜菊糖苷2.5份、苹果酸17.970份、麦芽糊精3.521份。
实施例42
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.5份、甜菊糖苷2.5份、苹果酸17.5份、麦芽糊精4.5份。
实施例43
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.849份、甜菊糖苷2.027份、苹果酸18.015份、麦芽糊精4.109份。
实施例44
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇21.5份、甜菊糖苷2.5份、苹果酸18.5份、麦芽糊精2.5份。
实施例45
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：复配肽55份，赤藓糖醇20.764份、甜菊糖苷1.5份、苹果酸17.5份、麦芽糊精5.236份。
实施例46
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：豌豆肽25份，玉米肽25份，赤藓糖醇20份、甜菊糖苷2份、苹果酸18份、麦芽糊精10份。
实施例47
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：豌豆肽21份，玉米肽29份，赤藓糖醇20份、甜菊糖苷2份、苹果酸18份、麦芽糊精10份。
对比例1
同实施例16，区别在于按照以下质量份备料：豌豆肽29份，玉米肽21份，赤藓糖醇20份、甜菊糖苷2份、苹果酸18份、麦芽糊精10份。
测试例11
对实施例27～47以及对比例1得到的固体饮料进行感官评价和速溶性评价，评价标准如表9，评价结果如表10。
表9感官评定标准
表10固体饮料进行感官评价和速溶性评价
/>
注：速溶性表示在25℃水浴，磁力搅拌器中等转速匀速搅动的条件下，每100mL蒸馏水完全溶解10g固体饮料所用时间。
由表10可知，本发明采用复合ACE抑制肽为原料制备得到固体饮料，制备工艺简便、感官评分高，速溶性好，具有良好的降压效果。
由以上实施例可知本发明提供的复合ACE抑制肽ACE的IC50值为0.547～0.636mg/mL，具有很好的ACE抑制率，并且必需氨基酸和疏水氨基酸的比例也高，能够更好的被人体吸收和利用，提高了豌豆蛋白和玉米蛋白的利用率。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (5)
1.一种具有协同功效的复合ACE抑制肽，其特征在于，包括豌豆肽和玉米肽；
所述豌豆肽和玉米肽的质量比为1:0.75~1；
所述豌豆肽的分子量＜2.5kDa；所述玉米肽的分子量＜1kDa；
所述豌豆肽的制备方法包括：在温度50℃，pH为9.5的条件下，利用碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白2h，得到豌豆蛋白第一酶解液；在温度55℃，pH为7.5的条件下，利用复合蛋白酶酶解所述豌豆蛋白第一酶解液2h，得到豌豆蛋白酶解液后分离，得到所述豌豆肽；
所述玉米肽的制备方法包括：在温度50℃，pH为7.0的条件下，利用风味蛋白酶酶解玉米蛋白2h，得到玉米蛋白第一酶解液；在温度50℃，pH为7.0的条件下，利用复合蛋白酶酶解所述玉米蛋白第一酶解液3h，得到玉米蛋白酶解液后分离，得到所述玉米肽。
2.根据权利要求1所述的具有协同功效的复合ACE抑制肽，其特征在于，制备所述豌豆肽时，所述碱性蛋白酶与豌豆蛋白的质量比为1.5:100；
所述复合蛋白酶与豌豆蛋白的质量比为1.5:100。
3.根据权利要求1所述的具有协同功效的复合ACE抑制肽，其特征在于，制备所述玉米肽时，所述风味蛋白酶与玉米蛋白的质量比为2.5:100；
所述复合蛋白酶与玉米蛋白的质量比为1.5:100。
4.权利要求1~3任一项所述的具有协同功效的复合ACE抑制肽在制备降血压的保健品或药品中的应用。
5.一种固体饮料，其特征在于，按质量份计，包括权利要求1~3任一项所述的具有协同功效的复合ACE抑制肽46~58份，赤藓糖醇18~22份，甜菊糖苷0.5~2.5份，苹果酸17~21份和麦芽糊精；所述芽麦糊精的质量份以使所有组分总量为100份计。
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